Masarykova univerzita Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie Oddělení fyziologie živočichů a imunologie
Protilátky krevního systému AB0 Bakalářská práce
Brno 2006
Jana Kamarýtová
OBSAH 1. Úvod …………………………………………………………………………………………..
5
2. AB0 systém …………………………………………………………………………………..
6
2.2. Krevní skupiny AB0 systému …………………………………………………………….
9
2.1. Historie …………………………………………………………………………………… 2.2.1. Skupina A a její podskupiny ……………………………………………………….
6
10
2.2.2. Skupina B a její podskupiny ……………………………………………………….
11
2.2.4. Skupina AB ………………………………………………………………………...
11
2.2.3. Skupina 0 …………………………………………………………………………..
2.2.5. Substance A, B a H na trombocytech ………………………………………………
11
11
2.2.6. Distribuce krevních skupin ………………………………………………………… 12
2.3. Tvorba protilátek ………………………………………………………………………….
14
2.4.1. Interakce Ag/Ab in vivo ……………………………………………………………
15
2.4. Reakce antigen-protilátka …………………………………………………………………
15
2.4.2. Interakce Ag/Ab in vitro …………………………………………………………… 15 2.4.3. Průkaz reakce Ag/Ab ………………………………………………………………. 16
2.5. Dědičnost AB0 systému …………………………………………………………………..
18
3.1. Erytrocyty …………………………………………………………………………………
20
3. Složky AB0 systému …………………………………………………………………………
20
3.2. Antigeny …………………………………………………………………………………..
22
3.3. Protilátky ………………………………………………………………………………….
24
3.2.1. Struktura molekuly antigenu AB0 systému ………………………………………... 22 3.3.1. Charakteristika protilátek …………………………………………………………..
24
3.3.3. Anti-A a anti-B ……………………………………………………………………..
29
3.3.2. Struktura protilátek ………………………………………………………………… 3.3.4. Anti-A,B ……………………………………………………………………………
25
30
3.3.5. Anti-H ……………………………………………………………………………… 30
4. Monoklonální protilátky AB0 systému …………………………………………………….. 31 4.1. Charakteristika monoklonálních a polyklonálních protilátek …………………………….. 31 4.2. Výhody monoklonálních protilátek ………………………………………………………. 32 4.3. Příprava monoklonálních protilátek ………………………………………………………
4.4. Humanizované monoklonální protilátky …………………………………………………. 4.5. Monoklonální protilátky systému AB0 …………………………………………………...
32
34
34
4.6. Využití monoklonálních protilátek ……………………………………………………….
35
5. Poruchy a choroby závislé na AB0 systému ……………………………………………….. 36
5.1. Krevní transfuse …………………………………………………………………………... 36 5.2. Hemolytické onemocnění novorozenců (HON) ………………………………………….. 37
5.3. Rejekce transplantátu ……………………………………………………………………... 38
6. Závěr …………………………………………………………………………………………. 40
Tabulka distribuce krevních skupin na světě ……………………………………………………. 41 Použitá literatura ………………………………………………………………………………… 43 Seznam zkratek ………………………………………………………………………………….. 44 Seznam obrázků a tabulek ……………………………………………………………………….
45
Prohlašuji, že jsem tuto písemnou rešerši vypracovala sama na základě uvedené použité
literatury. Zároveň bych chtěla poděkovat za spolupráci a ochotu Mgr. Janě Benešové a Mgr. Monice Duškové, Dr.
1.ÚVOD Krevní systém AB0 jako prvně objevený krevní systém člověka patří v současnosti stále
k nejdůležitějším – především při transfusích a transplantacích.
AB0 systém je základní imunohematologickou charakteristikou člověka, jeho specifita je
určena antigeny na erytrocytech a protilátkami v séru. Tyto protilátky mají své specifické
charakteristiky a vlastnosti, které se budu snažit v této rešerši objasnit spolu s charakteristikou antigenů, erytrocytů a jednotlivých krevních skupin AB0 systému. A protože se v současné době v lékařské praxi a vědeckém výzkumu používají především tzv. monoklonální protilátky, bude část práce věnována právě jim. Původní předpoklad, že
protilátky systému AB0 jsou vrozené, tedy tělu vlastní, je
v současné době již překonán. Struktury podobné antigenům AB0 se vyskytují v celé přírodě – ať už na površích bakterií, u různých živočichů či rostlin. Nastává tedy otázka – proč mají někteří jedinci v krvi protilátky anti-A a druzí protilátky anti-B? Proč vzniklo toto rozdělení a
důmyslné mechanismy proti cizí krvi s ním spojené, když možnost kontaktu s cizí krví připadá v úvahu
víceméně jen při umělém převodu krve, tedy při transfusích? Na tyto
otázky zatím neexistují jednoznačné odpovědi, ale studium a pochopení těchto mechanismů může výrazně přispět k objasnění problému. Díky studiu antigenů a protilátek byly umožněny úspěšné krevní transfuse, které dříve, díky inkompatibilitě krve, končívaly smrtí, dále
transplantace orgánů a v některých případech i úspěšnost donošení dítěte matkou. Proto část této práce budu věnovat právě této problematice.
-5-
2. AB0 SYSTÉM 2.1 HISTORIE ABO SYSTÉMU Prvním objeveným krevně skupinovým systémem u člověka byl systém ABO. Nezávisle
na sobě jej objevili Landsteiner (1901), Janský (1907) a Moss (1910) (Malaska, 1957). Landsteiner
svůj
objev
zveřejnil
v práci
Agglutinationsercheinungen
normaler
menschlicher Blute – zde popsal podle aglutinačních vlastností určené tři krevní skupiny – A,
B a C. Rozdělení dosáhl na základě mísení krvinek a séra vyšetřovaných osob. U skupiny A
sérum aglutinovalo, tj. shlukovalo krvinky skupiny B, naopak u skupiny B sérum aglutinovalo krvinky skupiny A. Vlastní krvinky se sérem neaglutinovaly. U skupiny C nedošlo k aglutinaci vůbec.
V roce 1902 Descatello a Sturli prokázali čtvrtou skupinu, ve které byly krvinky
aglutinovány séry všech ostatních skupin. Tato skupina byla nazvána AB. To, že Landsteiner
neurčil čtvrtou základní krevní skupinu, bylo zřejmě způsobeno tím, že žádná z jeho vyšetřovaných osob neměla tuto krevní skupinu (Daniels, 2002).
Kompletně stanovili čtyři základní krevní skupiny podle aglutinačních vlastností Janský
(1907) a Moss (1910). Tyto skupiny označili římskými číslicemi I, II, III a IV. Moss je označil v opačném pořadí než Janský.
Dr. Janský označil jako skupinu I tu krev, kde se krvinky neaglutinovaly žádným sérem a
její sérum aglutinovalo krvinky všech ostatních skupin. Krvinky skupiny IV se naopak aglutinovaly všemi séry, ale jejich sérum neaglutinovalo jiné krvinky. Sérum, které označil
skupinou II, aglutinovalo krvinky skupin III a IV. Sérum skupiny III aglutinovalo krvinky skupin II a IV (Malaska, 1957).
Moss se lišil v označení tak, že zaměnil skupinu I a skupinu IV.
Toto různé označení bylo po řadu let příčinou mnoha nesrovnalostí, a proto v roce 1921
výbor amerických vědeckých společností doporučil na základě priority objevu označení Janského. Ve 30. letech 20. století se krevní skupiny začaly označovat písmeny A, B, AB a 0 (která nahradila C) podle Landsteinera, tj. tzv. mezinárodní klasifikací (Malaska, 1957).
-6-
Tabulka 1 : Vzájemný vztah mezi označením Janského, Mosse a mezinárodní klasifikací. (podle Základy imunohematologie a krevní transfuse, Malaska, 1957) Mezinárodní klasifikace 0
A B
AB
Janský Moss I
IV
III
III
II
IV
Erytrocyt
- aglutinogen
Sérum
- aglutinin
-
anti-A, anti-B
B
anti-A
II
A
I
A,B
anti-B -
V roce 1911 von Dungern a Hirschfeld potvrdili, že krevní skupiny jsou děděny, jak už
ukázali Ottenberg s Epsteinem, a že pro ně platí Mendlovy zákony dědičnosti.
V roce 1924 Bernstein zveřejnil svoji teorii tří alel, tzn. že pouze tři alely na jednom
lokusu jsou nezbytné pro vyjádření AB0 dědičnosti. Thomsen a kol. později rozšířili tuto teorii o čtvrtou alelu, neboť zjistili, že někteří lidé skupiny A produkují protilátku (aglutinin),
který aglutinuje krvinky skupiny A jiných lidí. Skupina A tak byla rozdělena na dvě
podskupiny – A1 a A2. Čtyři alely, které určují základní krevní systém AB0, jsou tedy A1, A2,
B a 0. Dnes už jsou identifikovány další podskupiny v rámci skupin A a B (Daniels, 2002).
K intenzivnímu studiu chemické struktury a biosyntézy AB0 systému došlo začátkem
50. let 20 .století. Studie se prováděly hlavně na sekrečních glykoproteinech, neboť isolace
aktivních antigenů z erytrocytárních membrán byl značně obtížný. Zejména studie (Morgan, 1960, Watkinsová, 1980, Kabat, 1956) prováděné se skupinovými substancemi izolovanými
z tekutého obsahu lidských ovariálních cyst a z koňské a vepřové žaludeční sliznice, jasně
formulovaly vztah mezi sekvencí cukrů v oligosacharidovém řetězci glykoproteinu a odpovídající skupinovou specifitou. Na základě těchto prací vyplynuly i dva důležité závěry a
to, že mezi antigeny krevní skupiny H a A nebo B platí souvislost charakteru prekurzorkonečný produkt, a že primárním genovým produktem skupinového systému AB0 a Lewis jsou
glykosyltransferasy,
podílející
se
na
biosyntéze
skupinově
specifického
oligosacharidového řetězce. Enzymatický základ syntézy skupinových antigenů byl později potvrzen (Vaňák,1988).
Koncem 50. a začátkem 60. let 20. století byla využita tenkovrstvá
chromatografie
k purifikaci glykolipidových komponent erytrocytárních membrán se skupinovou specifitou a tím objasňovány jejich chemické vlastnosti a struktura.
-7-
Další zpřesnění analýzy antigenů přinesly metody jako mikrometylace s hmotovou
spektrometrií či aplikace exo- a endoglykosidas specificky štěpících sacharidové řetězce. Od konce 80. let 20. století se používají monoklonální protilátky, které postupně nahradily používané polyklonální protilátky. Tyto protilátky se získávají hybridomovou technologií
publikovanou v roce 1975 Köhlerem a Milsteinem (Vaňák, 1988). V posledních letech se uplatňují v různých odvětvích vědy, diagnostiky a léčby, téměř vytlačily polyklonální (přirozené) protilátky.
-8-
2.2. KREVNÍ SKUPINY AB0 SYSTÉMU Jednotlivé krevní skupiny AB0 systému jsou charakterizovány přítomností antigenů na
erytrocytech a tvorbou protilátek. Jejich antigenní vlastnosti se projevují již u plodu 37 dní
starého, na jehož erytrocytech jsou už prokazatelné antigeny (aglutinogeny) A a B. K tvorbě
vlastních protilátek (aglutininů) dochází až po narození. Specifita AB0 systému tedy spočívá
na antigenech, které jsou přítomny na erytrocytech, a na protilátkách, které jsou přítomné v séru. Pokud smícháme dvě kapky krve, každou od jiného dárce s jinou krevní skupinou,
dojde k tomu, že protilátky jedné skupiny budou shlukovat (aglutinovat) erytrocyty druhé skupiny na základě jejich antigenů.
Každý krevní systém potřebuje ke svému určení specifická diagnostická séra. Jde o séra
lidská (přirozená, nebo připravená imunizací jedince) nebo zvířecí séra. Využití
diagnostických sér je jednoduchým postupem určování krevních skupin. Séra k určování AB0
systému se nazývají sanguitesty. Podstata reakce spočívá v tom, že na erytrocytech vázaný antigen je schopen tyto erytrocyty aglutinovat protilátkou krevního séra jiné krevní skupiny
než je antigen. Na základě aglutinací vyšetřované krve pak zjistíme její krevně skupinovou charakteristiku (obr. 1) (Malaska, 1957).
Obrázek 1 : Určování AB0 skupin pomocí diagnostických sér.
(podle Základy imunohematologie a krevní transfuse, Malaska, 1957) Diagnostická séra Krevní skupina 0 A B AB A B
AB 0
vysvětlivky :
… proběhla aglutinace
… neproběhla aglutinace
Sekretorství. Substance A, B a H nacházíme nejen vázané v membránách erytrocytů,
nýbrž i volně v různých sekretech (jako jsou sliny) a v jiných tělních tekutinách (seminární
tekutina).. Tyto substance mají povahu glykoproteinů a jsou v solubilní formě. Substance A, -9-
B a H se v sekretech nacházejí pouze u některých lidí, tzv. sekretorů – ti tvoří asi 80%
populace. Sekrece krevně skupinových substancí A, B a H je řízena genovým systémem Sese. Sekretoři mají genotyp SeSe nebo Sese, nonsekretoři pak sese (Strejček a Lokaj, 1985).
2.2.1. Skupina A a její podskupiny Krevní skupina A je nejvíce zastoupenou krevní skupinou u evropské populace. Na jejich
erytrocytech se nachází antigen A. Erytrocyty této skupiny jsou aglutinovány protilátkami
anti-A, vyskytující se u skupin B a 0. A antigeny jsou cukerné determinanty glykoproteinů. Terminálním
imunodominantním
monosacharidem
glykoproteinu
antigenu
N-acetylgalaktosamin. Sérum této skupiny obsahuje protilátky anti-B (Daniels, 2002).
A
je
Bylo zjištěno, že někteří jedinci skupiny A produkují protilátky, které aglutinují erytrocyty
jiných jedinců skupiny A. Vznikly tak dvě základní podskupiny, a to A1 a A2. Podskupina A1 obsahuje vedle antigenu A ještě jeden antigen – A1 (viz tabulka 2) (Daniels, 2002). Tabulka 2 : Podskupiny A1 a A2.
(podle Human Blood Groups, Daniels, 2002) anti-A (sérum skupiny B) Podskupina Antigeny anti-A anti- A1 A1 A, A1 + + A2 A + -
Co se týká genotypu těchto podskupin, alela A1 je dominantní nad alelou A2, takže
heterozygot A1/A2 dá vznik podskupině A1.
Do současné doby bylo objeveno velké množství dalších podskupin. Jmenujme např.A3,
která aglutinuje s anti-A1, či Ax, Aend a Am, které většinou neaglutinují s anti-A (Daniels, 2002).
- 10 -
2.2.2. Skupina B a její podskupiny Antigeny skupiny B aglutinují své erytrocyty aglutininy anti-B, vyskytující se u skupin
A a 0. Cukernou determinantou antigenu B je na rozdíl od antigenu A galaktosa. Sérum této skupiny obsahuje protilátky anti-A.
I u skupiny B existují podskupiny. Jejich výskyt je však na rozdíl od skupiny A vzácnější,
a proto se i hůře klasifikují. Můžeme uvést např. B3, Bx, Bm nebo Bel. B podskupiny byly také
definovány podle aglutinace s anti-B na B60, B20 a B0, kde indexy odpovídají procentům aglutinace (Daniels, 2002).
2.2.3. Skupina 0 Krevní skupina 0 je považována za původní krevní skupinu, z níž se v průběhu evoluce
vyvinuly zbývající skupiny. Je charakteristická tím, že obsahuje ve svém séru jak protilátky
anti-A, tak i anti-B. Tyto protilátky se vyznačují křížovou reaktivitou, a někdy se proto souhrnně označují jako anti-A,B.Erytrocyty této skupiny obsahují prekurzorem pro antigen A a B (Daniels, 2002).
antigen H, který je
2.2.4. Skupina AB Krevní skupina AB je na rozdíl od skupiny 0 považována za nejmladší krevní skupinu,
důkazem toho je její nejnižší zastoupení ve světové populaci. V séru nejsou obsaženy žádné protilátky, zato na erytrocytech nacházíme dva typy antigenů – antigen A a antigen B.
Díky těmto antigenům vznikají u skupiny AB podskupiny, mezi nejdůležitější patří A1B a
A2B (Daniels, 2002).
2.2.5. Substance A, B a H na trombocytech Substance A, B a H se také vyskytují na trombocytech (krevních destičkách). Myslelo se,
že exprese AB0 antigenů na erytrocytech a trombocytech je stejná, ale Coolingová a jeho - 11 -
kolegové zjistili , že to není pravda. Hustota antigenu A u skupiny A2 je na erytrocytech nižší
než skupiny A1. Trombocyty skupiny A2 dokonce tento antigen postrádají nebo je ho zde jen
nepatrné množství. Trombocyty skupiny A2 totiž postrádají prekursorový antigen H. Z toho
vyplývá, že exprese AB0 antigenů na trombocytech je primárně determinována aktivitou
H-glykosyltransferasy
narozdíl
od
erytrocytů,
kde
B-glykosyltransferasy (Cooling a kol., Stroncek, 2005).
jde
o
aktivitu
A-
nebo
2.2.6. Distribuce krevních skupin V celosvětovém měřítku není distribuce krvních skupin rovnoměrná. Krevní skupina může
být i charakteristickým znakem národa či kmene. Podle její distribuce lze, do jisté míry, usuzovat na příbuznost etnických skupin, které se během historického vývoje geograficky značně rozrůznily.
Tabulka 3 : Zastoupení krevních skupin v populaci USA.
(podle Základní a klinická imunologie, Stites a Terr, 1994) Krevní skupina 0 A B AB
Frekvence výskytu (%) v populaci USA Američtí Asiati Běloši Černoši indiáni 45 49 79 40 40 27 16 28 11 20 4 27 4 4 1 5
Tabulka 4 : Výskyt AB0 skupin ve střední Evropě.
(podle Imunohematologie a transfúzní lékařství, Eckstein, 1994) skupina výskyt (%) 0 39 A 48 B 9 AB 4
podskupina výskyt (%) 0 39 A1 38 A2 10 B 9 A1B 3 A2B 1
- 12 -
Tabulka 11 na konci tohoto pojednání udává současnou distribuci krevních skupin AB0
ve světě. Velká variabilita v rozložení se vyskytuje jak u obyvatel světadílů, tak i mezi jednotlivými národy.
U některých národů, které žijí izolovaně, např. na ostrovech, a nedochází u nich tedy
k míšení genů s jinými národy, se vyskytuje pouze skupina 0. Jde o národy Bororo, Shompen či o peruánské indiány. Krevní skupina 0 je považována za původní krevní skupinu,
ze které se postupnými mutacemi a následným křížením národů vyvinuly ostatní skupiny. Nejméně zastoupenou a pravděpodobně „nejmladší“ krevní skupinou je skupina AB, která má
ve všech uvedených národech nejmenší zastoupení, snad s výjimkou japonských Ainu, kde
odpovídá zastoupení krevní skupiny 0. Evropské národy jsou charakteristické nízkou distribucí skupiny B, ale naopak vysokou distribucí skupiny A. U asijských národů je vysoká distribuce jak A, tak i B skupiny.
Krevní skupina také ovlivňuje náchylnost k různým nemocem. Antigeny krevního systému
AB0 lze považovat za autoantigeny, tedy struktury tělu vlastní, na které je navozena imunologická tolerance. Imunitní systém tedy musí mít schopnost kvalitativně i kvantitativně
omezit tvorbu protilátek proti původcům chorob s podobnými antigenními vlastnostmi jako
mají jeho vlastní ABO antigeny. Jako příklad lze uvést virus neštovic, který svou antigenní strukturou napodobuje antigen A. Skutečně u nosičů krevní skupiny A je prokázáno, že mají signifikantně častější výskyt a horší průběh neštovic, než nosiči jiných krevních skupin. V
indických centrech pro epidemii neštovic je krevní skupina A svými 10% nosičů skutečně
řídká (Eckstein, 1994).
Původce moru Jersinia pestis vykazuje antigenní příbuznost s krevním antigenem H. Je
známo, že nosiči krevní skupiny 0 vykazují vyšší úmrtnost na mor a tato krevní skupina je vzácnější ve velmi starých centrech moru centrální a přední Asie, stejně jako severní Afriky (viz tabulka 5).
- 13 -
Tabulka 5 : Častost výskytu krevní skupiny 0 v centrech moru a v západní Evropě. (podle Imunohematologie a transfúzní lékařství, Eckstein, 1994) Častost výskytu krevní skupiny 0 v centrech moru v západní Evropě národ % národ % Burjati 33 Irové 52 Kirgizové 31 Islanďané 56 Kalmici 26 Sardini 50 Uzbeci 28 Welšani 60 Peršané 31 Norové 38 Arméni 31 Italové 40 Egypťané 32 Němci 39
2.3. TVORBA PROTILÁTEK AB0 protilátky jsou označované jako isohemaglutininy nebo také přirozené protilátky.
Vznikají jako odpověď na opakovaný styk s antigeny A a B ve střevě, neboť tyto substance se vyskytují u mnoha živočichů a rostlin, sloužících jako potrava. Rovněž jsou součástí mikrobiálních buněk.
Většina novorozenců nemá při narození v séru žádné průkazné isohemaglutininy. Vytvářet
se u nich začnou až během prvních měsíců života. Lze je poprvé zjistit u dětí ve věku 3 – 6
měsíců. Nejvíce isohemaglutininů je v těle kolem 5 – 10. roku života, poté jejich množství s věkem klesá (Eckstein, 1994).
Novorozenci mohou mít ojediněle protilátky anti-A nebo anti-B od matky, ale tyto
protilátky jsou třídy IgG (imunoglobulin typu G). Protilátky IgG se do krve plodu dostávají při hemolytickém onemocnění novorozenců transplacentární cestou.
Tvorba protilátek je přirozený důsledek činnosti specifických imunitních mechanismů.
Erytrocyt obsahující antigen je rozeznán BCR-receptorem (jde o membránově vázaný IgM) zralého B-lymfocytu, na který se antigen naváže příčně. Touto vazbou se indukuje signál
k úpravě antigenu na peptidové fragmenty, dále signál ke sdružení těchto peptidů s molekulami MHC II a k syntéze receptoru CD40. MHC II se zanořenými antigenními
peptidy se vnoří do membrány B-lymfocytu, kde je rozeznán Th2 pomocným lymfocytem. Zde se antigen naváže na receptor TCR a dojde tak k aktivaci syntézy ligandu CD40L. Ten
interaguje s receptorem CD40 na B-lymfocytu. To je podnět pro syntézu receptorů pro cytokiny na B-lymfocytu, které jsou produkovány Th2 lymfocytem. Jejich vazbou na - 14 -
receptory vzniká signál k proliferaci a diferenciaci B-lymfocytů na plazmatické a paměťové
buňky. Tvorba plazmatických je indukována cytokinem IL-1 (interleukin 1) a CD23. Plazmatické buňky poté produkují protilátky (Rosypal, 1999).
Molekulární podstatou tvorby protilátek je přeskupování subgenů jednotlivých
strukturních genů pro těžké a lehké řetězce imunoglobulinů (viz dále). Těmito subgeny jsou L,V, D, J a C subgeny. Geny kódující lehké a těžké řetězce imunoglobulinů se tvoří podle vývojového programu organismu
během
diferenciace
B-lymfocytů
v kostní
dřeni
přeskupováním subgenů do různých kombinací, které u genů pro těžké řetězce začíná v raných proB-lymfocytech a u genů pro řetězce lehké malých preB-lymfocytech. Přičemž
každý B-lymfocyt obsahuje jeden strukturní gen pro lehký řetězec a jeden pro těžký řetězec (Rosypal, 1999).
2.4. REAKCE ANTIGEN/PROTILÁTKA Pro vznik imunologické odpovědi, tj. obrany těla proti tělu cizím látkám, je důležitá
reakce antigenu s protilátkou (nebo také uváděná jako reakce Ag/Ab). K této reakci může docházet jak in vivo, tedy uvnitř těla jedince, tak i in vitro, tedy v laboratorních podmínkách.
Produkovaná protilátka proti danému antigenu nebo ta, která je již v krvi obsažena, jak je
tomu u AB0 systému, nasedá svým vazebným místem ve variabilní oblasti na antigenní determinantu a spojuje se s ní nikoli vazbou kovalentní, ale silami Coulombovými, dále prostřednictvím vodíkových můstků, hydrofobní vazbou a silami van der Walsovými. Mezi
antigenní determinantou a vazebným místem protilátky nemusí být naprostá shoda. Proti každé determinantě tělo tvoří totiž tzv. polyklonální protilátky, tj. řadu protilátek, které s ní
korespondují více méně věrně. Protilátka se také může kombinovat s antigenem, který její
tvorbu nevyvolal – jde o tzv. zkřížené reakce, přičemž síla těchto vazeb je pochopitelně různá (Strejček a Lokaj, 1985).
2.4.1. Interakce Ag/Ab in vivo Její biologický význam závisí především na specifické eliminaci antigenního materiálu.
Protilátkové molekuly jsou schopny neutralizovat „toxiny“ tím, že se vážou na antigenní determinanty uvnitř nebo v blízkosti aktivního toxického místa, a tím brzdí reakci toxinu - 15 -
s jeho substrátem. Protilátky jsou tak schopny aglutinovat nejrůznější korpuskulární antigeny
(např. antigeny cizí krevní skupiny) a usnadňovat tak jejich fagocytosu. Schopnost protilátek eliminovat antigen je často spjata s mechanismy nespecifické imunity, tím že antigenní
materiál opsonizují a tím umožňují jeho fagocytosu. Po navázání protilátky na antigen dochází k aktivaci komplementu, a to klasickou cestou aktivace (Strejček a Lokaj, 1985).
2.4.2. Interakce Ag/Ab in vitro Zde reakce probíhá ve dvou fázích. Primární fáze je reakce specifická a sekundární je
vlastní reakce sérologická, která je určena fyzikálním stavem komplexu antigen/protilátka a
jeho biologickými následky. Někdy se k této reakci využívá metoda imunoprecipitace. V tomto případě se smíchá antigen s protilátkou a za vhodných podmínek, jako je např.
optimální kvantitativní poměr Ag/Ab, vznikají imunokomplexy, které nejsou dostatečně hydrofilní a proto jsou schopny precipitace, tj. tvorby nerozpustné sraženiny (Strejček a Lokaj, 1985).
2.4.3. Průkaz reakce Ag/Ab Průkaz Ag/Ab je podstatou celé řady imunologických metod. Reakci Ag/Ab používáme
pro určení neznámého Ag nebo pro průkaz přítomnosti známého Ag (v tomto případě musíme
mít k dispozici známou Ab),a nebo pro určení neznámé Ab nebo pro průkaz přítomnosti známé Ab (v tomto případě musíme mít k dispozici známý Ag). Při určování krevních skupin se ke krvi jedince, obsahující příslušný Ag, přidá známá Ab.
Vazbu Ag/Ab lze prokazovat přímo – jestliže je viditelná prostým okem, a nebo nepřímo –
pak hodnotíme turbidimetricky, pomocí značení (např. značení fluoreskujícím barvivem či
radioizotopem) jedné ze složek reakce nebo na základě druhotných jevů reakce. Při určování krevních skupin je tímto druhotným jevem aglutinace.
K základním metodám přímého průkazu reakce Ag/Ab patří precipitace (tvorba
nerozpustné sraženiny). Ta se provádí v gelu, roztoku nebo agaru. Při precipitaci v gelu lze analyzovat několik systémů Ag/Ab současně, neboť jednotlivé složky směsi difundují jedna po druhé (Strejček a Lokaj, 1985).
Metodou přímé fluorescence lze za použití známé značené Ab přesně lokalizovat Ag ve
tkáni nebo zjistit jeho přítomnost na povrchu buňky. K dalším metodám přímého průkazu - 16 -
patří značení složek radioaktivními izotopy, jako je např. radiojód nebo tritium (metoda RIA), kompetice enzymaticky značeného a neznačeného Ag o vazbu na Ab (metoda EIA) nebo zakotvením Ag nebo Ab na pevnou fázi (metoda ELISA) (Strejček a Lokaj, 1985).
Typickým nepřímým průkazem reakce Ag/Ab jsou aglutinační reakce. Při těchto reakcích
se vazba Ag/Ab uskutečňuje na povrchu částic, např. erytrocytů. Protilátky mají dvě nebo pět vazebných míst pro antigen, závisí na typu těžkého řetězce (viz dále). Tak se může jedna molekula Ab navázat na dvě (respektive až pět) částice současně. Poté dochází ke shlukování
částic, tedy k jejich aglutinaci. Při aglutinaci dochází k zesítění částic (erytrocytů) pomocí precipitovaných antigenů a protilátek, které se na antigen dané částice navázaly (viz obr. 2). Obrázek 2 : Aglutinace erytrocytů.
(zdroj : www.bmb.leeds.ac.uk)
Přímá aglutinace se používá k určování krevních skupin, ale také k diagnostice některých
infekčních chorob. Při pasivní aglutinaci se antigeny uměle vážou na povrch erytrocytů, který byl pozměněn účinkem taninu (Boydova metoda), nebo na povrch částic z umělé hmoty
prostou adsorpcí. Takové erytrocyty či jiné částice jsou pak aglutinovány specifickou - 17 -
protilátkou. Při reakcích inhibice aglutinace nedochází k aglutinaci účinkem specifické protilátky, jestliže tato Ab byla předem vysycena příslušným Ag obsaženém v použitém biologickém materiálu (Strejček a Lokaj, 1985).
2.5. DĚDIČNOST AB0 SYSTÉMU Dědičnost všech dosud známých krevně-skupinových systémů, a tedy i AB0 systému,
probíhá přesně podle Mendlových zákonů dědičnosti.
Krevně-skupinové vlastnosti jsou pro každého člověka geneticky determinovány a po celý
život se nemění, nedochází tedy u nich k žádným kvalitativním ani kvantitativním změnám.
Přecházejí podle zákonů dědičnosti z rodičů na děti. Příklady dědičnsoti krevních skupin AB0 systému jsou uvedeny v tabulce 6.
Tabulka 6 : Dědičnost krevních skupin z rodičů na děti.
(podle Základy imunohematologie a krevní transfuse, Malaska, 1957) Matka Otec Dítě Fenotyp Genotyp Fenotyp Genotyp Genotyp Fenotyp A1A1 A1 A1A1 A1A1 A1 A2 1 2 1 2 A1 A1 A2 A2 A2 AA AA A10 A10 A10 0 00 A1A2 A1A1 A10, A1 A2A2 2 2 1 2 A1 AA A2 AA A2 A20 A10 00, 0 2 A0 2 2 A A A2A2 A2A2 A2 2 A0 A2 A2 A20 A20 0 00 A1 B A1B A2B A2B 1 1 AA BB A10 A1 A1 A1 A2 B B0 A20 A2 1 A0 B0 B 00 0 2 A B A 2B A2A2 BB 2 A0 A2 A2 B A20 B0 B0, 00 B,0 - 18 -
Známe čtyři základní alely : A1, A2, B a 0. Alely A1, A2 a B se dědí kodominantně,
zatímco alela 0 je vůči nim recesivní. Gen 0 je tak nezasahuje do syntézy antigenních znaků.
Pokud považujeme za základní alely pouze A, B a 0, pak máme šest základních genotypů (AA, A0, BB, B0, 00, AB), ale jen čtyři základní fenotypy (A, B, 0, AB).
AB0 systém je podmíněn geny A1, A2, B a 0, které jsou na devátém chromosomu, a geny
H a h, které jsou na chromosomu 19. Dále existuje vzájemný vztah genů Se a se, které jsou
též na chromosomu 19. Nosiči genové kombinace SeSe a Sese vylučují AB0 substance
ve svých tělních tekutinách (tzv. sekretoři, 80% všech lidí), zatímco sese homozygoti (20% všech lidí) jsou nonsekretoři (Eckstein, 1994).
Antigeny krevních skupin jsou buď přímými (proteiny), nebo nepřímými (sacharidy)
produkty alel, které se vyskytují na témže lokusu nebo na lokusech, mezi nimiž je crossing
over extrémně vzácný, neboť jsou velmi blízko u sebe. Pro každý antigen tak platí, že v kódovacím lokusu je přítomna jen jedna alela (Daniels, 2002).
Geny A a B řídí pouze poslední stupeň syntézy substancí A a B ze substance prekursorové,
kterou označujeme H. Substance H je až na jedinou níže uvedenou výjimku obsažena ve všech lidských erytrocytech. Na její množství má vliv skupina AB0. Nejvíce je jí
v erytrocytech 0 (protože gen 0 je amorfní, syntéza krevně-skupinových znaků se zastavuje u substance H, která se tudíž nespotřebuje), nejméně v erytrocytech A1B. Substance H vzniká
z prekursorové substance vlivem genu H – při genotypu hh se substance H nesyntetizuje vůbec a výsledek je vzácný genotyp 0h (běžným vyšetřením zde diagnostikujeme skupinu 0,
ale v erytrocytech chybí substance H, takže tyto erytrocyty nejsou aglutinovány sérem anti-H) (Strejček a Lokaj,1985).
19
3. SLOŽKY AB0 SYSTÉMU 3.1. ERYTROCYTY Erytrocyty jsou krevní elementy, které neobsahují jádro a mají bikonkávní tvar. Tento tvar
jim nejlépe zajišťuje pružnost a umožňuje tak procházet kapilárami o menším průsvitu než je
jejich průměr. Díky obsaženému krevnímu barvivu hemoglobinu jsou schopné vázat a přenášet kyslík a oxid uhličitý.
Erytrocyty mají na základě jejich negativního náboje na své membráně dvojitou iontovou
vrstvu. Vnitřní, tvořená positivními ionty, je pevně vázána na negativní vrstvu povrchu
erytrocytu. Potenciál mezi těmito vrstvami tzv. zeta-potenciál způsobuje, že se erytrocyty vzájemně odpuzují a za normálních okolností zachovávají fyziologickou vzdálenost, která je určena právě jejich iontovými vrstvami. Tato vzdálenost může být překlenuta na základě velikosti molekul protilátek (Eckstein, 1994).
Na svém povrchu mají sacharidové epitopy - antigenní struktury, které určují jejich
krevně-skupinovou charakteristiku. Tím se podílí na imunitě organismu, neboť antigeny na povrchu jsou rozeznávány protilátkami jiných krevních skupin. K tomu může dojít pouze při krevní transfusi.
Počet erytrocytů řádově převyšuje počet buněk imunitního systému. Na jeden leukocyt
připadá asi 700 erytrocytů. Na povrchu je vedle antigenů krevního systému AB0 exprimováno mnoho jiných membránových molekul s rozmanitými funkcemi. Jde o molekuly, které mají
adhezní funkci, která jim umožňuje prostup cévními vlásečnicemi. Tak zabraňují prostupu leukocytů z postižené tkáně a tím může dojít k jejich případné aktivaci. Dále jde o receptory
pro chemokinové molekuly. Prostřednictvím membránových molekul mohou vstupovat do erytrocytu mnohá infekční agens (Krejsek a Kopecký, 2004).
Erytrocyty jsou výsledkem diferenciace myeloidních elementů, zadaných do vývoje
v červenou řadu krevních buněk. Vývoj začíná hemopoetickou kmenovou buňkou, která se
diferencuje na progenitorovou myeloidní buňku. Na úrovni erytroblastu dochází ke ztrátě
buněčného jádra. Zralé erytrocytární elementy již tedy neobsahují nukleové kyseliny. Pro diferenciaci erytrocytů i pro jejich funkce jsou důležité adhezní molekuly, které jsou ve
značné míře na povrchu buněk červené řady vyjádřeny (Krejsek a Kopecký, 2004). Erytrocyty vznikají až do poloviny zárodečného života v játrech, poté se přidává slezina a kostní dřeň.
Asi ve třetím týdnu po narození probíhá krvetvorba pouze v kostní dřeni. Krvetvorba (obr. 3) 20
je řízena hormonem erytropoetinem, který vzniká v ledvinách. Ten stimuluje proliferaci
časných stádií erytroblastu i uvolňování zralých erytrocytů ze dřeně do krevního oběhu (Bičík, 1992).
Změny v membránové struktuře jsou charakteristické pro stárnoucí erytrocyty, které jsou
z oběhu odstraňovány retikulo-endotelovým systémem sleziny. Jejich identifikaci umožňuje velké množství na povrch adsorbovaných IgG. Obrázek 3 : Krvetvorba.
(upraveno podle Klinická imunológia, Buc, 1997)
21
3.2. ANTIGENY Molekuly A, B a H jsou z imunologického hlediska antigeny. Jde o struktury fylogeneticky
velmi staré, pravděpodobně přešlé z prokaryontů na eukaryonty. Tyto biologicky velmi konzervované struktury jsou hojně rozšířeny v přírodě. Jde o substance, které stimulují u
cizího organismu imunitní systém (podle stupně cizosti a antigenní síly) k tvorbě specifických protilátek.
Antigeny můžeme rozdělit na kompletní a nekompletní. Kompletní antigen neboli
imunogen se skládá z nosiče, haptenu a epitopu. Hapten je specifický nosič, který způsobuje vlastní imunogenitu antigenu. Antigeny, které neobsahují epitopy, nejsou tedy imunogenní, plní pouze strukturní funkci a nazýváme je nekompletní antigeny. Právě epitop je na antigenu rozeznáván při jeho setkání s protilátkou.
Podle původu můžeme antigeny dělit do pěti základních skupin. Xenogenní (heterologní)
antigeny pocházející od jiného jedince jiného druhu. Allogenní pocházející od jiného jedince
stejného druhu. Autologní pocházející od jednoho jedince. Isogenní pocházející od jiného
jedince se stejnou genetickou výbavou, jedná se např. o jednovaječná dvojčata, a syngenní, které pochází z inbredních linií.
3.2.1. Struktura molekuly antigenu AB0 systému Základními antigeny AB0 systému jsou A, A1, B a H. Antigeny A a A1 jsou vlastní krevní
skupině A1, zatímco antigen A1 jako samostatný je vlastní pro A2. Antigen B se vyskytuje u
krevní skupiny B, antigen H jako prekursor ostatních antigenů je vlastní skupině 0. Krevní skupina AB obsahuje jak antigen A, tak i B.
AB0 antigeny jsou sacharidové struktury. Oligosacharidové řetězce jsou obecně spojeny
s polypeptidy do formy glykoproteinů nebo s ceramidy do formy glykosfingolipidů.
Oligosacharidy jsou syntetizovány kaskádovým způsobem, připojení každého monosacharidu je katalyzováno specifickou glykosyltransferasou. Nejméně 100 glykosyltransferas se podílí
na syntéze známých lidských sacharidů. Geny produkující mnohé z nich jsou klonovány a sekvenovány, včetně těch pro krevní systém AB0 a pro sekreci H antigenu.
Dvě hlavní třídy sacharidových řetězců na glykoproteinech AB0 antigenů jsou N- glykany
(velice rozvětvené struktury navázané na asparagin N-acetylglukosaminem) a O-glykany (samostatné
nebo
komplexní
struktury
22
navázané
na
serin
nebo
treonin
N-acetylgalaktosaminem). Glykosfingolipidy obsahují sacharidové řetězce navázané na ceramid. Jsou klasifikované jako lakto-, globo- a nebo gangliosérie podle původu sacharidového řetězce (Daniels,2002). Obrázek 4 : AB0 antigeny.
(podle Klinická imunológia, Buc, 1997)
23
3.3. PROTILÁTKY 3.3.1. Charakteristika protilátek Protilátky (aglutininy) jsou součástí globulinové frakce séra. Protilátky systému AB0
řadíme k imunoglobulinům třídy M (IgM). Pro svou velkou molekulovou hmotnost je jejich
výskyt omezen na krevní plasmu. Do tělních tekutin se dostávají velmi zřídka. Koncentrace IgM klesá v závislosti na věku či pohlaví.
Protilátky systému AB0 se označují jako tzv.přirozené protilátky neboli isohemaglutininy
(někdy také jen isoaglutininy). Jde o protilátky pravidelné, tzn. že se vždy vyskytují u dané
krevní skupiny, a kompletní – lze je prokázat ve fyziologickém prostředí, neboť jejich
molekuly jsou dostatečně velké, aby překlenuly minimální vzdálenost mezi erytrocyty (danou jejich zeta-potenciálem) a tím „umožnily“ jejich aglutinaci.
Vzácně se mohou v séru objevovat tzv. nepravidelné protilátky, jako je např. anti-A1 u
nosičů skupiny A2 nebo anti-H u nosičů skupiny A1. Tyto protilátky jsou účinné pouze
v chladu (tj. při nižší než pokojové teplotě). Výjimečně mohou způsobovat aglutinaci až do teploty 37˚C (Daniels, 2002).
Protilátky anti-A a anti-B způsobují aglutinaci erytrocytů, za přítomnosti komplementu
mohou působit i jako hemolysiny. Pokud přirozená protilátka funguje jako hemolysin, je
spouštěcí látkou k aktivaci komplementu, kterým jsou rozloženy aglutinované erytrocyty. (Průkazem proběhnutí hemolysy je „vylití“ hemoglobinu z rozrušených erytrocytů.)
Aglutininy úplně chybí u osob skupiny AB, často u novorozenců a jen velmi zřídka
u zdravých jedinců ostatních skupin. Zde hovoříme o tzv. defektních krevních skupinách. S velmi nízkým titrem isohemaglutininů nebo s jejich úplným chyběním se setkáváme u agamaglobulinémií, které patří mezi tzv. imunodeficience (Strejček a Lokaj, 1985).
24
3.3.2. Struktura protilátek Molekuly protilátek se nazývají imunoglobuliny (Ig). Jde o hybridní molekuly, jejichž
systém je pod kontrolou několika genů. Exprese imunoglobulinových genů je omezena vždy
na jednu alelu chromozomového páru. Proto v příslušném B-lymfocytu se vyjádří syntézou
imunoglobulinového řetězce jen jedna alela pro těžký řetězec a jen jedna alela pro řetězec lehký. Tento jev se nazývá alelická exkluze. Kromě toho existuje ještě izotypická exkluze, což znamená, že v každém klonu B-lymfocytů se syntéza řetězců typu κ a λ (viz dále) vzájemně vylučuje, tj. tvoří se v něm jen jeden typ lehkého řetězce (Rosypal, 1999).
Všechny Ig mají stejnou základní strukturu (viz obr. 5). Jsou složeny minimálně ze čtyř
polypeptidických řetězců – ze dvou lehkých řetězců L o stejné primární struktuře a ze dvou těžkých řetězců H také o stejné primární struktuře. Vzájemné spojení těchto řetězců je umožněno kovalentními disulfidickými vazbami a vodíkovými můstky.
Těžké řetězce obsahují přibližně 430 aminokyselinových zbytků, zatímco lehké asi jen 214
aminokyselinových zbytků. Každý řetězec sestává ze dvou oblastí – konstantní C a variabilní V. Ve variabilních úsecích se těžké nebo lehké řetězce navzájem liší. Těžké i lehké řetězce vytváří tzv. globulární domény (Rosypal, 1999).
Proteolytickými enzymy lze molekulu imunoglobulinu rozštěpit. V případě štěpení
papainem se tvoří na dva fragmenty Fab (s protilátkovou specificitou, tj. schopností vázat se
na antigen) a jeden fragment Fc, který je tvořen zbývající částí těžkého řetězce. Při štěpení
pepsinem vznikají také Fab fragmenty, ale ty zůstavají spojené, označují se jako F(ab)2, protože pepsin štěpí pod místem disulfidických vazeb mezi oběma těžkými řetězci. Místo Fc fragmentu tak vznikjí pouze peptidové fragmenty (Buc, 1997). ¨
25
Obrázek 5 : Základní struktura molekuly imunoglobulinu.
(upraveno podle Základy molekulární biologie, Rosypal, 1999)
Variabilní úseky. U variabilních úseků se primární sekvence aminokyselin liší podle
specificity protilátek. Pouze asi 15 aminokyselin se podílí na vlastním vazebném místě pro antigen. Celé variabilní úseky se přitom skládají asi ze 100 aminokyselin. Každý tento úsek je
složen ze tří hypervariabilních úseků = CDR (complementarity determining regions) a čtyř úseků základní struktury = FR (framework region, kostrové úseky). Hypervariabilní úseky
jsou v primární struktuře značně proměnlivé, a jsou tedy základem specificity protilátky, tvoří vazebné místo pro antigen. Více aminokyselinových zbytků vázajících se na antigen je ve variabilních doménách těžkých řetězců (Rosypal, 1999).
Konstantní úseky. Část konstantního úseku těžkého řetězce je flexibilní. Jde o tzv.
pantovou
oblast,
která
umožňuje
změnu
konformace
imunoglobulinu
vzhledem
k determinantám na molekule antigenu. U polymerního IgM, kam patří protilátky AB0
systému, a IgA se tato pantová oblast nevyskytuje. Místo ní je zde specifický J-řetězec. Ten se skládá ze 118 – 125 aminokyselin a ze 7 – 8 cukerných zbytků, přičemž je zde nápadná přítomnost cysteinu. Je nazýván také spojovacím polypeptidem, neboť spojuje dva těžké řetězce. Sám je zpevněn jednou disulfidickou vazbou. Gen, který J-řetězec kóduje, je u
26
člověka na chromosomu 4 a u myši na chromosomu 5. Do Ig se dostává posttranslačně ještě před sekrecí z buňky (Rosypal, 1999).
Konstantní úseky, především Fc fragment, se neúčastní přímé vazby na antigen, zato
zajišťují zapojení nespecifických mechanismů imunity. Na Fc fragmentu je např. místo, které je schopno vázat a aktivovat komplement či místo, které se komplementárně váže na Fc
receptor fagocytů. Struktura Fc fragmentu také umožňuje transplacentární přestup protilátek (především třídy IgG).
Imunoglobuliny jsou také často glykosylovány, tzn. připojují se na ně oligosacharidy
N-glykosidovou vazbou. Tato glykosylace probíhá na různých místech těžkého řetězce.
Lehké řetězce. Existují dva typy lehkých řetězců – typ κ a λ. Jejich poměr v
zastoupení u člověka je asi 60% : 40%. Ig se stejným typem těchto řetězců se liší ve
variabilních úsecích, ale jejich konstantní úseky jsou stejné. Tyto úseky se označují Vκ, Vλ, Cκ
a Cλ, přičemž se vždy spojuje Vκ a Cκ nebo Vλ a Cλ . Molekulární hmotnost lehkých řetězců je asi 23 000.
Těžké řetězce. Rozlišujeme pět základních typů těžkých řetězců - γ, α, µ, δ a ε. Typ γ má
čtyři podtypy a typ α má dva (platí u lidí). Ig se stejným typem těchto řetězců se liší ve
variabilních úsecích, ale jejich konstantní úseky jsou stejné. Podle typu těžkých řetězců rozdělujeme Ig do pěti základních tříd – třídy IgG, IgA, IgM, IgD a IgE (viz tabulka 7).
Každá tato třída nebo její podtřída přitom může obsahovat buď lehký řetězec typu κ nebo typu λ (Buc, 1997).
27
Tabulka 7 : Klasifikace lidských a myších imunoglobulinů.
(upraveno podle Úvod do molekulární biologie, Rosypal, 1999)
Třída
IgG IgA
IgM IgD IgE
Podtřída
Lehký řetězec (L)
Těžký řetězec (H)
Počet H a L řetězců v molekule člověk myš
člověk myš člověk myš člověk myš IgG1 IgG1a γ1 γ1 IgG2 IgG2a γ2 γ2a L2H2 IgG3 IgG2b γ3 γ2b IgG4 IgG3 γ4 γ3 κ nebo λ L2H2 nebo L2H2 IgGA1 α1 α (L2H2)2 IgGA2 α2 IgGM µ µ (L2H2)5 δ δ L2H2 ε ε L2H2 -
Domény. Těžké a lehké řetězce vytvářejí tzv. domény. Ty sestávají z β-skládaných listů,
které jsou navzájem antiparalelní a jsou spojeny různě dlouhými smyčkami. Celá struktura domény je stabilizována vodíkovými vazbami, které přes skupiny –NH a –CO spojují
sousední řetězce skládaného listu. V řetězcích se střídají hydrofobní a hydrofilní
aminokyselinové zbytky, jejichž postranní řetězce jsou seřazeny kolmo k rovině β-skládaného listu tak, že hydrofobní aminokyseliny jsou orientovány dovnitř a hydrofilní vně
(Rosypal,1999). Lehký řetězec je tvořen jednou konstantní a jednou variabilní doménou. Těžký řetězec tvoří jedna variabilní doména a tři domény konstantní. U tříd IgM a IgE jsou čtyři konstantní domény těžkého řetězce.
Typy řetězců, ať už těžkých nebo lehkých, můžeme označit jako izotypové determinanty,
jež jsou právě podkladem pro rozdělení Ig do tříd. Mimoto můžeme na Ig rozlišit ještě další dva typy determinant, a to determinanty allotypové, přítomné u některých jedinců na řetězcích
typu γ, α a κ., a determinanty idiotypové, které jsou výrazem unikátního uspořádaní aminokyselin ve vazebném místě protilátky.
IgM. Protilátky AB0 systému patří do třídy IgM (tabulka 10), která tvoří asi 5 – 10%
z celkového obsahu imunoglobulinu v krevním séru. Jako monomer se váže na B-lymfocyty, kde funguje obsahující
jako receptor pro antigen. V séru se pak ale vyskytuje jako pentamer
J-řetězec, v této podobě funguje jako protilátka (obr.6). Každá podjednotka
polymerního IgM je tvořena dvěma lehkými řetězci typu κ nebo λ a dvěma těžkými řetězci 28
typu µ. Vyznačuje se tak sice deseti vazebnými místy, ale díky sférické zábraně se na něj může navázat maximálně pět antigenů. Těžký řetězec obsahuje čtyři konstantní domény. Právě čtvrtá konstantní doména CH4 je místem pro vazbu komplementu. Díky své velikosti
není schopen přecházet přes placentu a je přítomen pouze intravaskulárně. IgM je časově první jak v ontogenezi tak i fylogenezi. Obrázek 6 : Pentamer IgM.
(upraveno podle Immunobiology, Janeway a kol., 2005)
Tabulka 8 : Porovnání vlastností lidských IgM a IgG.
(upraveno podle Imunologie v klinické praxi, Strejček a Lokaj, 1985) J-řetězec Molekulární formule Molekulová hmotnost % cukrů Poločas v plasmě (dny) Prostup placentou Aktivace komplementu Koncentrace v séru (g/l)
IgM IgG + (µ2κ2)5-J γ2κ2 (µ2λ2)5-J γ2λ2 900 000 150 000 - 950 000 12 3 5
21
-
+
+
+
1,0
11,0
3.3.3. Anti-A a anti-B Anti-A a anti-B protilátky se většinou vyskytují v séru jedinců, kterým chybí odpovídající
antigen na jejich erytrocytech. S výjimkou novorozenců jsou odchylky od tohoto pravidla velmi vzácné. Velmi zřídka může již plod produkovat protilátky typu IgM.
Isohemaglutininy jsou třídy IgM, ale mohou být i třídy IgG či IgA. IgM je však plně
dominantní. Titr IgG narůstá po stimulaci lidskými antigeny A a B. IgA se objevuje až
postimunizačně. Následující tabulka podává charakteristiku AB0 protilátek (tabulka 9) (Daniels, 2002).
29
Tabulka 9 : Charakteristika IgM, IgG a IgA AB0 protilátek.
(upraveno podle Human Blood Groups, Daniels, 2002) Charakteristika IgM IgG IgA výskyt v séru ANO NĚKDY VZÁCNĚ neimunizovaných donorů výskyt v séru ANO OBVYKLE OBVYKLE imunizovaných donorů aglutinované erytrocyty ANO ANO ANO zvýšený titr NE ANO ANO v antiglobulinovém testu teplotní optimum 4°C 4 - 37°C výskyt v kolostru NĚKDY NE ANO
Z pohledu krevní transfuse je krevní skupina 0 obvykle považována za tzv. universálního
donora a transfuse krve skupiny 0 příjemcům skupiny A a B (tedy s protilátkami anti-B a anti-
A) se považuje za kompatibilní transfuzi. Anti-A a anti-B jsou příčinou rejekce ledvin, jater a srdce při inkompatibilních transplantacích. 3.3.4. Anti-A,B Séra krevní skupiny 0 neobsahují protilátky anti-A a anti-B jako oddělené, ale jako křížově
reagující protilátku zvanou anti-A,B. Když je eluát vyroben z erytrocytů skupiny A (nebo B) inkubovaných v séru skupiny 0, protilátky v eluátu budou aglutinovat erytrocyty skupiny A i
B. Takovýto efekt nezískáme, pokud pro vytvoření anti-A,B použijeme oddělené protilátky anti-A a anti-B a smícháme je. Tato křížová reaktivita je však často asymetrická. U jedinců
skupiny 0, kteří byli imunizováni erytrocyty skupiny A nebo A-substancí, křížově reagující protilátka obvykle pro aglutinaci preferuje erytrocyty skupiny A než skupiny B. Bylo
prokázáno, že protilátky produkované donory krevní skupiny 0 závisí jak na antigenu A, tak i na antigenu B (Daniels, 2002). 3.3.5. Anti-H Protilátky anti-H detekují prekursor A a B antigenů, tzv. H-antigen.
30
Charakteristicky více aglutinují erytrocyty skupiny 0 a A2 než erytrocyty skupiny A1 a B.
Anti-H nejsou u sekretorů, vyskytují se obvykle v séru nesekretorů s H-deficientem. Pokud ale produkujeme monoklonální anti-H, toto anti-H často nebývá inhibováno sekretory, jako je tomu v případě polyklonálního („přirozeného“) anti-H. Protilátky anti-H se produkují na
mnoha zvířatech (jako jsou myši či kuřata) imunizací erytrocyty skupiny 0 nebo purifikovanými substancemi H (Daniels, 2002).
4. MONOKLONÁLNÍ PROTILÁTKY AB0 SYSTÉMU 4.1. CHARAKTERISTIKA MONOKLONÁLNÍCH A POLYKLONÁLNÍCH PROTILÁTEK
Převratnou změnou v imunologii, imunohematologii i dalších biologických oborech,
zejména pak v medicíně, vyvolala možnost přípravy monoklonálních protilátek.
Protilátky, které vznikají jako přirozená odpověď organismu na antigen, jsou polyklonální.
Jsou zaměřené proti různým epitopům antigenu, vznikají polyklonální imunitní odpovědí na
komplexní antigen. Jsou tvořeny mnoha klony B-lymfocytů. Z hlediska svých vlastností jsou tedy heterogenní. Naproti tomu monoklonální protilátky (MoAb) jsou produktem pouze
jednoho klonu B-lymfocytů a jsou přísně specifické proti jedinému epitopu antigenu (proti jednomu antigenu tak může existovat několik různých MoAb). Jsou tedy čistě homogenní ve svých vlastnostech. To z nich činí nástroj přesné diagnostiky a následně i cílené léčby. Homogennost MoAb je způsobeno strukturou protilátek, jejichž domény existují a fungují relativně samostatně. Tyto jsou připravovány pomocí hybridomové technologie (viz dále).
Tělo produkuje i jakési „přirozené“ monoklonální protilátky. Jde o monoklonální Ig, které
se v těle vyskytují při nádorovém bujení a jsou považovány za nejdůležitější nádorový marker, který je analyzován v klinických laboratořích. Jde o tzv. paraproteiny neboli myelomové proteiny. Předpokládá se, že všechny monoklonální imunoglobuliny mají
protilátkovou aktivitu. Je jisté, že jsou produktem jednoho klonu proliferující B-lymfocytové řady a jsou homogenní. Mohou to být celé Ig nebo jen fragmenty Ig (Tichý, 1997).
31
4.2. VÝHODY MONOKLONÁLNÍCH PROTILÁTEK
Výraznou výhodou MoAb oproti polyklonálním protilátkám je jejich specifita proti jen
jednomu epitopu daného Ag. Výhodou je tedy samotná monoklonalita těchto protilátek. Není
to však jen jejich monoklonalita, která může někdy být i nevýhodou, ale fakt, že jsou produkovány in vitro.
Hybridomová technologie umožňuje spojit výhodné vlastnosti nádorových buněk (rychlý
růst, nesmrtelnost) s potřebnými funkcemi (produkce protilátek dané specifiky). Klony
hybridomů tak můžeme relativně neomezeně pěstovat v in vivo i in vitro podmínkách .
Odstraňuje se tak nutnost imunizace lidských dobrovolníků z důvodů získání potenciálních reagentů (Vaňák, 1988).
4.3. PŘÍPRAVA MONOKLONÁLNÍCH PROTILÁTEK Monoklonální protilátky se připravují metodou hybridomové technologie. Jde o somati-
ckou hybridizaci buněk produkujících protilátky s buňkami nádorových linií. Tato metoda byla popsána v roce 1975 Köhlerem a Milsteinem. Tímto způsobem můžeme získat protilátky prakticky v neomezeném množství, které mají danou specifiku.
Hybridomy lze připravit fúsí buněk nádorové linie se splenocyty (buňkami sleziny) nebo
lymfocyty získanými od imunizované myši nebo krysy (obr. 7). Nádorová buněčná linie
vybraná pro fúsi s buňkami produkujícími protilátky je charakterizována dvěma významnými
vlastnostmi – nemá vlastní produkci Ig a nemá aktivitu hypoxantin fosforibosyl transferasy. Vlastní fúse jednotlivých buněk se provádí působením polyetylenglykolu. Po fúzi zůstávají
v kultuře tři různé populace buněk : splenocyty, myelomové buňky a buňky hybridní (Stites a Terr, 1994).
32
Obrázek 7 : Tvorba hybridomu a monoklonálních protilátek. (zdroj : www.uccs.edu)
Hybridní buňky jsou po fúsi kultivovány např. v médiu HAT, které obsahuje hypoxantin,
aminopterin (jde o antagonistu kyseliny listové) a thymidin. Splenocyty a myelomové buňky
v průběhu této kultivace odumírají. Hybridní buňky velmi rychle rostou, jejich počet se
zdvojnásobuje v průběhu 24 – 48 hodin, dochází k rychlé tvorbě buněčných kolonií. Ty se pak klonují metodami limitního ředění a v supernatantech se testuje protilátková aktivita (metodami RIA nebo ELISA). Reklonací je získána skutečná monoklonální linie, hybridom,
jehož produkty – protilátky jsou imunochemicky a fyzikálně-chemicky charakterizovány (Stites a Terr, 1994).
Hybridomová technologie umožňuje při imunizaci použít komplexní antigeny, které
obsahují množství determinant. Tato skutečnost je využívána i v přípravě MoAb proti AB0
skupinám, kdy častým imunogenem jsou intaktní erytrocyty. Vzhledem ke složitosti erytrocytární membránové struktury, kdy není překvapující silná imunitní odpověď pokusných zvířat proti dalším, vysoce frekventovaným Ag, se obvykle používají i jiné
imunizační materiály – sekreční glykoproteiny, purifikované membránové glykolipidy a
syntetické oligosacharidy. Tvorbu protilátek proti AB0 antigenům vyvolává rovněž imunizace
nádorovými buňkami, na jejichž membránách jsou tyto skupinové determinanty nezřídka exprimovány (Vaňák, 1988).
33
Nyní se provádí i přípravy lidských či mezidruhových hybridomů. Značná pozornost je
věnována právě těm lidským – tzv. humanizovaným protilátkám.
4.4. HUMANIZOVANÉ MONOKLONÁLNÍ PROTILÁTKY MoAb jsou ve své podstatě myší protilátky, imunitní systém je jako cizí rozpoznává a
začne si proti nim vytvářet vlastní (anti-myší) protilátky. To zejména při opakované aplikaci MoAb snižuje jejich účinnost, vyvolává riziko navození přecitlivělosti. Dalšími problémy
myších MoAb jsou : afinita pro Ag může být nízká, jednotlivé typy MoAb neochotně aktivují
komplement nebo aglutinují Ag in vitro a je složité využít je in vivo u lidí. Vyhnout se tomuto problému je možné tak, že zavedeme in vitro zpracovaný gen pro Ab do myelomových buněk. Tento proces se nazývá transfekce a získané hybridomy pak transfektomy. Jde o integraci
donorové DNA do buněčných chromosomů. Postrádají-li recipientní buňky genetický rys zakódovaný v DNA donora, tak tento rys získají. Mohou se tak produkovat zcela nové rodiny
přizpůsobených MoAb, které nazýváme chimerické nebo také rekombinantní MoAb (Elgert, 1996).
Cílem tohoto procesu je především získat tzv. humanizované MoAb. Připravují se tak, že
se z molekuly myší protilátky izoluje pouze část variabilní oblasti lehkého řetězce, komplementární k epitopu (vazebné místo protilátky). Ta je spojena s konstantní částí molekuly lidského Ig. Podíl lidské bílkoviny v protilátce je pak asi 95%, podíl myší je velmi
malý. Proti takto humanizované MoAb pak lidský imunitní systém odpovídá jen slabě (redukuje se tedy jejich imunogennost), jejich specifičnost je zachována a mohou se tak lépe využívat v terapeutické praxi (URL 1).
4.5. MONOKLONÁLNÍ PROTILÁTKY SYSTÉMU ABO
První MoAb v rámci AB0 systému byla protilátka anti-A. Tato protilátka vznikla
z imunizované myši a lidských lymfocytů tonsil. Předpokládalo se, že tato anti-A může být
užitečná v určování krve, ale později bylo prokázáno, že postrádá dostatečnou potenci k A2 a
A2B buňkám (Daniels, 2002).
Množství dalších monoklonálních anti-A brzy následovalo : některé byly produkovány
záměrně pomocí imunizovaných myší s erytrocyty krevní skupiny A nebo purifikované látky, jiné náhodně pomocí imunizace s rakovinnými buněčnými liniemi, jinými buňkami nebo
epidermálním růstovým faktorem. Některé MoAb chovající se jako anti-A1 byly poté
zveřejněny.
34
Lidské monoklonální anti-A a anti-A1 byly získány transformací EBV-viru lymfocytů
získaných z hyperimunizovaných dárců nebo z tkáně sleziny po in vitro stimulaci s erytrocyty skupiny A (Daniels, 2002).
Každá MoAb se váže pouze s jedním „místem“ na Ag, a tak může být několik MoAb,
které reagují se stejným Ag. Některé monoklonální anti-A se tak mohou přednostně vázat k A-terminálnímu trisacharidu, zatímco jiné detekují epitop obsahující oligosacharidovou páteř.
Monoklonální anti-B byly získány následující imunizací myší s B nebo AB erytrocyty,
purifikované B-látky nebo chemicky syntetizovaného B-trisacharidu.
Několik MoAb, které reagují s A i B erytrocyty (anti-A,B), byly produkovány po
imunizování myší s A-substancí, skupinou A nebo AB erytrocyty. Některé z těchto protilátek reagují silněji s A erytrocyty než s B erytrocyty (Daniels, 2002). 4.6. VYUŽITÍ MONOKLONÁLNÍCH PROTILÁTEK MoAb se dnes v široké míře používají jak k diagnostice tak i k léčbě. První léčebnou
aplikací se stala inhibice transplantačních reakcí, používají se tedy jako specifická
imunosupresiva. V laboratořích klinické imunologie jsou MoAb využívány k průkazu buněčných a rozpustných Ag metodami RIA, ELISA a IFA. U AB0 systému se tedy používají
ke stanovení krevních skupin. MoAb se ukázaly neocenitelné pro studium rozmanitých typů sacharidových řetězců určujících A-aktivitu (Stites a Terr, 1994).
Již mnoho let je studována možnost využít MoAb jako nosiče pro jiné léky, které by Ab
měla dopravit do nádorové tkáně, jejíž buňky nesou znak odpovídající specifičnosti Ab.
Mohou se také používat jako imunoreagens. Další využití v diagnostice a terapii uvádí
tabulka 10.
35
Tabulka 10 : Využití monoklonálních protilátek v diagnostice a terapii.
(podle Základní a klinická imunologie, Stites a Terr, 1994) charakteristika znaků leukocytů stanovení podtříd lymfocytů průkaz myozinu při infarktu myokardu detekce Ag HLA
v diagnsotice průkaz nádorově specifických Ag v terapii detekce virů a jejich subtypizace identifikace parazitů
typizace leukémií a lymfomů průkaz mikroorganismů
protinádorová terapie
Ab proti individuálním nádorovým znakům anti-idiotypové Ab proti povrchovým Ig B buněčných lymfomů
imunosuprese při transplantaci orgánů imunosuprese v terapii autoimunitních chorob kontrola fertility
5. PORUCHY A CHOROBY ZÁVISLÉ NA AB0 SYSTÉMU 5.1. KREVNÍ TRANSFUSE S krevním systémem AB0 je především v povědomí lidí spojena krevní transfuse.
První historicky doložená krevní transfuse se uskutečnila v roce 1665, kdy šlo o převod
krve mezi dvěma psy anglickým fyziologem Richardem Lowerem. O dva roky později provedl transfusi u člověka Jean Baptiste Denis, přičemž použil krev jehněte. Dnes je zřejmé,
že transfuse zvířecí krve lidem má mnoho vedlejších účinků a pravděpodobně vždy končívaly smrtí příjemce. I proto byly na konci 17. století v Evropě zakázány. Až v roce 1816 přistoupil
odpovědně ke studiu transfuse krve fyziolog a porodník James Blundell, který provedl svou první transfusi v roce 1819. Později vydal knihu, v níž zejména zdůraznil správnou zásadu, že člověku lze převádět pouze krev lidskou (URL 2).
Z praktického hlediska musíme při transfusích pečlivě přihlížet ke krevním systémům (a to
především k AB0 systému a systému Rh), protože při inkompatibilitě mezi krví dárce a
příjemce může vzniknout akutní hemolýza. Naproti tomu antigenní vlastnosti leukocytů, trombocytů a plasmatických bílkovin mají z hlediska krevní transfuse
význam mnohem
menší. Pro malé množství a tedy i nízkému obsahu isohemaglutininů, mohou 0 trombocytární 36
koncentráty být též transfundovány příjemcům A, B a AB. Častá praxe aplikovat trombocyty
bez ohledu na AB0 systém má za následek častý nevyhovující posttransfusní efekt (Eckstein, 1994), způsobený mimo jiné MHC I glykoproteiny na trombocytech (Krejsek a Kopecký, 2004).
Posttransfusní imunohematologické reakce. V souvislosti s transfusí se může vyvinout
posttransfusní reakce. Některé z nich mají imunologickou povahu. Jde např. o posttransfusní imunohemolytické reakce. Jsou to akutní nebo subakutní hemolytické reakce, nimž dochází
právě při inkompatibilitě krví mezi dárcem a příjemcem. Tato inkompatibilita je způsobena
buď přirozenými nebo imunitními protilátkami. K hemolýze erytrocytů dárce přirozenými isohemaglutininy dohází v tom případě, že byla chybně určena krevní skupina AB0 systému,
kdežto hemolýza erytrocytů příjemce se vyskytuje při převodu tzv. univerzálního dárce skupiny 0, který má vysoký titr isohemaglutininů. Hemolytická příhoda způsobená imunitními protilátkami se může vyskytnout v případě, že Rh-negativní příjemce dostane krev
Rh-positivního dárce. Protilátky, které za přítomnosti komplementu vyvolávají okamžitou hemolýzu in vitro (anti-A, anti-B), vyvolávají in vivo intravaskulární hemolýzu.
Akutní hemolytická reakce se může dostavit již po transfusi 10 ml krve. Projevuje se
šokovým stavem. Uvolněný hemoglobin se filtruje a může způsobit nekrózu tubulů ledvin.
Současně se hemoglobin přeměňuje na bilirubin, který může být ve vyšších koncentracích toxický (=hemoglobinurénie) zejména pro nervové buňky (Strejček a Lokaj, 1985). 5.2. HEMOLYTICKÉ ONEMOCNĚNÍ NOVOROZENCŮ (HON) HON je těžká hemolytická anémie indukovaná protilátkami, která často vede ke smrti.
Předpokladem pro výskyt HON je od otce plodem zděděný Ag erytrocytů, který matce chybí. Dále musí matka mít nebo tvořit proti tomuto Ag protilátky. Tyto protilátky se poté musí
dostat do krevního oběhu plodu, musí reagovat s jeho erytrocyty a předčasně je odbourávat. K HON mohou vést jen takové antigenní rozdíly, jimiž je indukována tvorba protilátek typu IgG, protože jen takové protilátky mohou projít placentou. Při těžkém průběhu onemocnění může vést tento stav až k potratu (Eckstein, 1994).
Podle příčin můžeme HON rozdělit do tří skupin : HON u klasické Rh inkompatibility,
u AB0 inkompatibility a u jiných skupinových inkompatibilit.
HON s Rh protilátkami vzniká při Rh-negativitě matky a Rh-positivitě plodu (tedy Rh-
positivitě otce). V prvním těhotenství je matka imunizována, vytvořené protilátky vstupují do 37
oběhu matky především při porodu nebo při umělém přerušení těhotenství. HON pak může projevit u dalšího těhotenství. Naproti tomu HON s AB0 protilátkami se HON vyskytuje již
při prvním těhotenství. Zároveň tato inkompatibilita nastává mnohem častěji než Rh inkompatibilita. Obyčejně jde v tomto případě o mírnější průběh onemocnění, takže případy
vyžadující transfusi jsou vzácné. Tyto HON bývají totiž spontánně reversibilní. Tento průběh je způsoben slabě vyvinutou A a B antigenností novorozeneckých erytrocytů.
HON při inkompatibilitě AB0 přichází výhradně u matek skupiny 0, které mají děti A1
nebo B, přičemž daleko častější je inkompatibilita 0/A1 než 0/B. Konstelací A/B, A/AB, B/A1 a B/A1B způsobené erytroblastosy jsou řídké. Erytroblastosa je důsledek HON – po hemolysy
erytrocytů plodu na základě protilátek od matky dochází k rychlé krvetvorbě a následnému vyplavení nezralých erytrocytů – erytroblastů. Předpokladem pro vývoj AB0 HON je
přítomnost imunních isohemaglutininů v matčině těle, protože běžné anti-A a anti-B zásluhou
své IgM povahy nemohou přestoupit bariéru placenty. Imunní isohemaglutininy jsou typu
IgG. Ty jsou indukovány v přírodě široce rozšířenými ABH podobnými substancemi a také průnikem cizích Ag z okolí do mateřského organismu (Eckstein, 1994).
V určitých situacích může současná inkompatibilita v AB0 a v Rh mezi matkou a plodem
zabránit destruktivnějším účinkům isoimunizace Rh. Přirozeně se vyskytující anti-A nebo anti-B u matky skupiny 0, Rh negativní budou účinně destruovat erytrocyty Rh positivní
přicházející přes placentu, jestliže je plod také skupiny A nebo B. Rychlé odstranění těchto buněk mateřským imunitním systémem, již předem připraveným, by udělalo senzibilizace proti faktoru Rh vysoce nepravděpodobnou (Stites a Terr, 1994)
Pokud je u novorozence nutná transfuse krve, převádí se omyté erytrocyty skupiny 0
resuspendované v plasmě skupiny AB, která neobsahuje žádné isohemaglutininy. 5.3. REJEKCE TRANSPLANTÁTU
Při transplantaci orgánů u člověka je nejdůležitější kompatibilita v krevním systému AB0
případně v systému HLA. Antigeny AB0 systému totiž nejsou jen na povrchu erytrocytů, ale i
na mnoha dalších tělních buňkách, a mohou se podílet na rejekci (odvržení) transplantovaného orgánu.
Kompatibilita mezi dárcem a příjemcem orgánu (nebo štěpu orgánu) musí být plně
zajištěna vzhledem k pravidelnému výskytu isohemaglutininů. Jinak štěp či transplantát znekrotizuje velmi rychle ještě během operace – tzn. není přijat imunitním systémem
příjemce, který má proti němu protilátky. Nejlépe přežívá transplantát od dárce skupiny 0. 38
V některých případech lze tolerovat skupinu 0 jako universálního dárce a skupinu AB jako universálního příjemce.
39
6. ZÁVĚR Touto rešerší jsem se snažila podat stručnou a srozumitelnou charakteristiku komponent
AB0 systému. Podrobně jsem se seznámila s historií objevů tohoto systému, strukturou jeho antigenů, polyklonálních i monoklonálních
protilátek, jejich vzájemnými reakcemi a
využitím v praxi. Cílem bylo vypracovat souhrnnou literární rešerši, ze které se bude dále
vycházet při realizaci diplomové práce. Z tohoto důvodu má bakalářská práce spíše obecný charakter. Samotný AB0 systém byl objeven přibližně před 100 lety, v současné době nepatří
k nejstudovanějším oblastem a tudíž nových literárních zdrojů obecnějších charakteru je poměrně málo. Většina aktuální literatury k tomuto tématu je specializovaná spíše na oblast molekulární biologie a genetiky.
Zvýšený zájem o problematiku AB0 systému přinesl objev monoklonálních protilátek
v 70. letech minulého století. Jejich použití nachází široké uplatnění v mnoha oborech
medicíny. Další významné objevy v této oblasti lze jistě očekávat na molekulárně genetické
úrovni. Shrneme-li současné i očekávané budoucí poznatky, lze konstatovat, že AB0 systém stále patří k nejdůležitějších krevně skupinovým systémům.
40
Tabulka 11 : Distribuce krevních skupin ve světě. (zdroj : www.bloodbook.com) Etnikum Abordžinci
Abyssiniané
Ainu (Japonci) Albánci
Angličané Arabové Arméni
Asiaté (v USA - obecně) Bantuové Barmánci Baskové
Belgiačané
Blackfoot (severoameričtí Indiáni) Bororo
Brazilci Bulhaři
Buryaté Češi
Číňané-Kanton Číňané-Peking
Čuvačové Dánové
Egypťané
Krevní skupina AB0 systému 0
A
B
AB
61
39
0
0
43
27
25
5
17
32
32
18
38
43
13
6
47
42
9
3
34
31
29
6
31
50
13
6
40
28
27
5
46
30
19
5
36
24
33
7
51
44
4
1
47
42
8
3
17
82
0
1
100
0
0
0
47
41
9
3
32
44
15
8
33
21
38
8
30
44
18
9
46
23
25
6
29
27
32
13
Eskymáci (Aljaška)
Eskymáci (Grónsko) Estonci
Filipinci Finové
Francouzi
Grand Andamanese Havajci
Hindové (Bombay) Holanďané
Indiáni (USA - obecně)
Indové (Indie - obecně) Irové
Islanďané
Italové (Milan) Japonci
Kalmukové
Kikuyu (Keňa) Korejci
Křováci
Laponci Litevci
41
30
29
33
7
41
44
11
4
33
36
24
8
38
44
13
5
54
36
23
8
34
36
23
8
45
22
27
6
34
41
18
7
43
47
7
3
9
60
23
9
37
61
2
1
32
29
28
11
45
43
9
3
79
16
4
1
37
22
33
7
52
35
10
3
56
32
10
3
46
41
11
3
30
38
22
10
26
23
41
11
60
19
20
1
28
32
31
10
56
34
9
2
29
63
4
4
40
34
20
6
Lotyši
Maďaři
Májové
Malajsinci Maorové Moros
Navajo (S.Am. indiáni) Němci
Nicobarese (Nicobars) Norové
Obyvatelé Fidži
obyvatelé Georgie
Obyvatelé Sardinie
Papuánci (Nová Guinea) Peršané
Peru (indiáni) Poláci
Portugalci
Rakušané
Romové (Maďarsko) Rumuni Rusové
32
37
24
7
36
43
16
5
98
1
1
1
62
18
20
0
46
54
1
0
64
16
20
0
73
27
0
0
41
43
11
5
74
9
15
1
39
50
8
4
44
34
17
6
46
37
12
4
50
26
19
5
41
27
23
9
38
33
22
7
100
0
0
0
33
39
20
9
35
53
8
4
36
44
13
6
29
27
35
10
34
41
19
6
33
36
23
8
Řekové
Severní Afričané
Shompen (Nicobars) Skoti
Slováci Srbové
Sudánci
Španělé
Švédové Švýcaři Tataři
Thajci
Turkové
Ukrajinci
USA (běloši)
USA (černoši) Velká Británie Vietnamci
Židé (Německo) Židé (Polsko)
42
40
42
14
5
45
40
11
4
100
0
0
0
51
34
12
3
42
37
16
5
38
42
16
5
62
16
21
0
38
47
10
5
38
47
10
5
40
50
7
3
28
30
29
13
37
22
33
8
43
34
18
6
37
40
18
6
45
40
11
4
49
27
20
4
47
42
8
3
42
22
30
5
42
41
12
5
33
41
18
8
POUŽITÁ LITERATURA ● Bičík, V. : Základy hematologie a hematoimunologie. Univerzita Palackého, Olomouc, 1992, 1. vydání, 52 str.
● Buc, M. : Klinická imunológia. Slovenská akademie ved, Bratislava, 1997, 1. vydání, 363 str.
● Cooling, L. L. W., Kelly, K., Barton, J., Hwang, D., Koerner, T. A. W., Olson, J. D. : Determinants of ABH expression on human blood platelets. Blood. 2005; 105; 3356-3364. ● Daniels, G. : Human Blood Groups. Blackwell Science, 2002, 2.vydání, 560 str.
● Eckstein, R. : Imunohematologie a transfuzní lékařství. Východočeská tiskárna, s.r.o., Pardubice, 1994, 1.vydání, 173 str.
● Elgert, K. D. : Immunology : understanding the immune system. Wiley-Liss, Inc., 1996, 468 str.
● Fučíková, T. : Klinická imunologie v praxi. Galén, Praha, 1997, 2. vydání, 343 str.
● Janeway Jr., C. A., Travers, P., Walport, M., Schlomchik, M. : Immunobiology. Garland Science Publishing, 2005, 6. vydání, 823 str.
● Krejsek, J., Kopecký, O. : Klinická imunologie. Nukleus HK®, 2004, 1. vydání, 968 str.
● Malaska, Z. : Základy imunohematologie a krevní transfuse (Příručka pro zdravotnické pracovníky). Státní zdravotnické nakladatelství, Praha, 1957, 1. vydání, 207 str.
● Rosypal, S. : Úvod do molekulární biologie, 2. díl. Masarykova univerzita v Brně, 1999, 3. vydání, 300 str.
● Stites, D. P., Terr, A. I. : Základní a klinická imunologie. Victoria Publishing, a.s., 1994, 744 str.
● Strejček, J., Lokaj, J. : Imunologie v klinické praxi. Avicenum, Praha, 1985, 1. vydání, 293 str.
● Stroncek, D. : Universal platelets : „A“ change in dogma. Blood. 2005; 105; 3008.
● Tichý, M. : Laboratorní analýza monoklonálních imunoglobulinů (paraproteinů). Finidr, Český Těšín, 1997, 96 str.
● Vaňák, J. : Monoklonální protilátky proti antigenům krevních skupin A, B. Jejich
podrobnější specifikace a využití v imunohistochemii.(Kandidátská disertační práce).Ústav sér a očkovacích látek, Olomouc, 1988, 152 str.
43
Internetové zdroje :
URL 1 :www.zdrava-rodina.cz/med/med0400/med0400-16.html URL 2 : www.nemocnice-vs.cz/oddeleni/Hematologie/historie www.bloodbook.com
www.bmb.leeds.ac.uk/mbiology/ug/ugteach/micr1010/agglutination.gif www.sciam.com/media/inline
www.uccs.edu/~rmelamed/MicroFall2002/Chapter%2017/Monoclonal%Antibodies.jpg
SEZNAM ZKRATEK Ab
protilátka
Ag
antigen
CD40
receptor na B-lymfocytech
Ag/Ab CD40L CDR
komplex antigen/protilátka
ligand na Th2 lymfocytech
hypervariabilní úsek řetězce Ig
DNA
deoxyribonukleová kyselina
HLA
major histocompability complex u lidí
FR
úsek základní struktury řetězce Ig
HON
hemolytické onemocnění novorozenců
IgA
imunoglobulin třídy A
Ig
imunoglobulin
IgG
imunoglobulin třídy G
IL-1
interleukin 1
MoAb
monoklonální protilátky
IgM
MHC-II Th2-lymfocyty
imunoglobulin třídy M
major histocompatibility complex typu II
pomocné T-lymfocyty typu 2
44
SEZNAM OBRÁZKŮ A TABULEK Seznam obrázků .
Obrázek 1 : Určování AB0 skupin pomocí diagnostických sér. Obrázek 2 : Aglutinace erytrocytů. Obrázek 3 : Krvetvorba.
Obrázek 4 : AB0 antigeny.
Obrázek 5 : Základní struktura molekuly imunoglobulinu. Obrázek 6 : Pentamer IgM.
Obrázek 7 : Tvorba hybridomu a monoklonálních protilátek. Seznam tabulek Tabulka 1 : Vzájemný vztah mezi označením Janského, Mosse a mezinárodní klasifikací.
Tabulka 2 : Podskupiny A1 a A2.
Tabulka 3 : Zastoupení krevních skupin v populaci USA. Tabulka 4 : Výskyt AB0 skupin ve střední Evropě.
Tabulka 5 : Častost výskytu krevní skupiny 0 v centrech moru a v západní Evropě. Tabulka 6 : Dědičnost krevních skupin z rodičů na děti.
Tabulka 7 : Klasifikace lidských a myších imunoglobulinů. Tabulka 8 : Porovnání vlastností lidských IgM a IgG.
Tabulka 9 : Charakteristika IgM, IgG a IgA AB0 protilátek.
Tabulka 10 : Využití monoklonálních protilátek v diagnostice a terapii. Tabulka 11 : Distribuce krevních skupin ve světě.
45
