Masarykova univerzita Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie Oddělení fyziologie a imunologie ţivočichů

Masarykova univerzita Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie Oddělení fyziologie a imunologie ţivočichů

Studium biochemických parametrů krve koček (Felis catus) ve vztahu k některým zoonózám (leptospiróza, borrelióza) Diplomová práce

Brno 2011

Autor: Bc. Petra Celá Vedoucí práce: Mgr. Monika Dušková, Ph.D.

Prohlašuji, ţe jsem tuto diplomovou práci vypracovala zcela samostatně, pouze s pouţitím uvedené literatury. V Brně dne:

Podpis:

Úvodem bych ráda poděkovala především vedoucí této práce, Mgr. Monice Duškové, Ph.D. za cenné rady, čas, ochotu a podporu. Velký dík patří také MVDr. Pavlu Schánilcovi a jeho kolektivu za poskytnutí vzorků kočičí krve a sér, prof. MVDr. Františku Tremlovi CSc. za provedení mikroskopického aglutinačního testu, a také doc. RNDr. Aleně Ţákovské Ph.D. a Mgr. Pavlíne Opatové za provedení metody ELISA. Ráda bych poděkovala Mgr. Janě Benešové za podílení se na zpracování vzorků a doc. RNDr. Ladislavu Duškovi, Dr. za pomoc se statistickým vyhodnocením. Díky patří také všem milým lidem z Oddělení fyziologie a imunologie ţivočichů, kteří se na této práci jakkoli podíleli. V neposlední řadě děkuji svým rodičům, kteří mě podporovali v průběhu celého mého studia. Vypracování této diplomové práce bylo podpořeno grantem MUNI/E/0086/2009.

OBSAH ABSTRAKT ............................................................................................................................. 6 ABSTRACT ............................................................................................................................. 7 1. ÚVOD ................................................................................................................................ 8 2. KREVNÍ OBRAZ KOČKY ............................................................................................. 9 2.1.

Erytrocyty .................................................................................................................. 9

2.2.

Hemoglobin ............................................................................................................. 10

2.3.

Hematokrit ............................................................................................................... 12

2.4.

Sedimentace erytrocytů ........................................................................................... 12

2.5.

Leukocyty ................................................................................................................ 13

2.5.1. Neutrofilní granulocyt ....................................................................................... 14 2.5.2. Eozinofilní granulocyt ....................................................................................... 16 2.5.3. Bazofilní granulocyt .......................................................................................... 17 2.5.4. Lymfocyty .......................................................................................................... 19 2.5.5. Monocyty ........................................................................................................... 20 3. VYBRANÉ BIOCHEMICKÉ PARAMETRY ............................................................. 22 3.1.

Bilirubin ................................................................................................................... 22

3.2.

Enzymy .................................................................................................................... 23

3.2.1. Alaninaminotransferáza (ALT) ......................................................................... 24 3.2.2. Alkalická fosfatáza (ALP)................................................................................. 25 4. LYMESKÁ BORRELIÓZA A LEPTOSPIRÓZA U KOČKY DOMÁCÍ ................ 27 4.1.

Leptospiróza............................................................................................................. 27

4.1.1. Etiologie a epidemiologie.................................................................................. 27 4.1.2. Patogeneze a klinické projevy onemocnění ..................................................... 29 4.2.

Lymeská borrelióza ................................................................................................. 30

4.2.1. Etiologie a epidemiologie.................................................................................. 30 4.2.2. Patogeneze a klinické projevy onemocnění ..................................................... 32 5. CÍLE DIPLOMOVÉ PRÁCE ......................................................................................... 34 6. MATERIÁL A METODY.............................................................................................. 35 6.1.

Biologický materiál ................................................................................................. 35

6.2.

Pouţité chemikálie .................................................................................................. 35

6.3.

Technická zařízení ................................................................................................... 35

6.4.

Metody ..................................................................................................................... 36

6.4.1. Stanovení počtu erytrocytů v Bürkerove komůrce .......................................... 36 6.4.2. Stanovení sedimentace krve .............................................................................. 36 6.4.3. Stanovení hematokritu ....................................................................................... 37 6.4.4. Stanovení koncentrace hemoglobinu ................................................................ 37 6.4.5. Stanovení počtu leukocytů v Bürkerove komůrce ........................................... 39 6.4.6. Krevní diferenciál leukocytů ............................................................................. 39 6.4.7. Katalytická koncentrace alaninaminotransferázy (ALT) ................................ 40 6.4.8. Katalytická koncentrace alkalické fosfatázy (ALP) ........................................ 42 6.4.9. Celkový bilirubin ............................................................................................... 43 6.4.10. Detekce specifických protilátek proti B. burgorferi s. l. metodou ELISA ... 46 6.4.11. Mikroskopický aglutinační test (MAT) .......................................................... 46 7. VÝSLEDKY ................................................................................................................... 48 7.1.

Výskyt antiborreliových a antileptospirových protilátek v jednotlivých

souborech zvířat v závislosti na prostředí......................................................................... 48 7.2.

Srovnání

hematologických

a

biochemických

parametrů

v jednotlivých

souborech ............................................................................................................................ 49 7.3.

Vliv pozitivity (co se týče sledovaných protilátek) na hematologické

a biochemické parametry ................................................................................................... 51 7.4.

Porovnání naměřených a referenčních hodnot ...................................................... 52

7.4.1. Grafické znázornění výsledků........................................................................... 53 7.4.2. Shrnutí získaných výsledků: ............................................................................. 57 8. DISKUZE ........................................................................................................................ 58 9. ZÁVĚR ............................................................................................................................ 63 10.

SEZNAM POUŢITÝCH ZKRATEK ........................................................................ 64

11.

SEZNAM POUŢITÉ LITERATURY ....................................................................... 65

Přílohy..................................................................................................................................... 71

ABSTRAKT Kočka domácí (Felis catus) můţe být napadena původci onemocnění Lymeská borrelióza a leptospiróza, které patří k nejrozšířenějším zoonózám na světě. Teoretická část předkládané práce zahrnuje problematiku těchto chorob (etiologii, epidemiologii, patogenezi a klinické projevy) se zaměřením na kočku domácí. V praktické části byly hodnoceny vybrané hematologické a biochemické parametry krve koček (hematokrit, sedimentace, počet erytrocytů, leukocytů,

krevní

diferenciál,

koncentrace

hemoglobinu,

bilirubinu,

aktivita

alaninaminotransferázy a alkalické fosfatázy). Byl také hodnocen výskyt specifických protilátek tříd IgM a IgG proti Borrelia burgdorferi sensu lato a specifických protilátek proti Leptospira interrogans sensu lato ve vzorcích kočičích sér. Výzkum byl prováděn celkem na 357 kočkách, které byly rozděleny do tří souborů, a to na kočky – pacienty veterinární kliniky, kočky umístěné v útulku a kočky odchycené v ulicích Brna. Bylo zjištěno, ţe u pacientů je nejvyšší podíl antiborreliových protilátek třídy IgM (18 %) i antileptospirových protilátek (11,3 %). Nejvyšší výskyt antiborreliových protilátek třídy IgG vykazují kočky z útulku (9,3 %). V rámci hodnocení výsledků měřených hematologických a biochemických parametrů mezi jednotlivými soubory bylo pozorováno, ţe kočky z útulku dosahují vyšších hodnot v aktivitě ALP oproti pacientům z veterinární kliniky. Dále kočky z útulku dosahují vyšších hodnot oproti odchyceným kočkám v hematokritu, koncentraci hemoglobinu, počtu erytrocytů, leukocytů, lymfocytů a monocytů. Odchycené kočky mají niţší hodnoty aktivity ALT oproti pacientům z veterinární kliniky a vyšší sedimentaci oproti kočkám z útulku. Bylo také zjištěno, ţe kočky pozitivní na antiborreliové protilátky třídy IgG dosahují vyšší hodnoty hematokritu a počtu erytrocytů neţ zvířata negativní.

6

ABSTRACT Domestic cat (Felis catus) can be infected with Lyme borreliosis and leptospirosis, which belong among the most common zoonoses all over the world. The theoretical part of presented thesis comprehends the broad issue of mentioned diseases (etiology, epidemiology, pathogenesis, clinical displays) with a view to domestic cat. The practical part analyses selected haematological and biochemical parameters of the cats’ blood (haematocrit, sedimentation rate, erythrocyte count, leukocyte count, blood differential, haemoglobin concentration, bilirubin concentration, alaninaminotransferasa activity, alkaline activity). It also interprets the abundance of specific IgM and IgG antibodies against Borrelia burgdorferi sensu lato and specific antibodies against Leptospira interrogans sensu lato in the samples of feline serum. The research was carried out on total of 357 felines divided into three following sets: feline patients of veterinary clinic, cats from shelter and cats captured in the streets of Brno. The results were following: feline patients have the highest level of anti-borrelia IgM (18 %) and anti-leptospira antibodies (11,3 %). The highest level of anti-borrelia IgG (9,3 %) have shelter cats. The analysis of the results of measured haematological and biochemical parameters among individual sets demonstrates higher levels in ALP activity within shelter cats than veterinary patients. Shelter cats are also reaching higher levels in haematocrit, haemoglobin concentration, erythrocyte, leukocyte, lymphocyte and monocyte count than captured cats. Captured cats have lower levels of ALP activity than veterinary patients and higher sedimentation rate than shelter cats. The research also discovered that felines, who tested positive for anti-borrelia IgG, reach higher levels of haematocrit and erythrocyte count than animals, who tested negative.

7

1. ÚVOD Obliba kočky jako domácího zvířete v posledních desetiletích velmi vzrostla, coţ má sociologické i demografické příčiny. V některých zemích bezpochyby jednoznačně překonala psa, co do počtu, tak zájmu veřejnosti. Bohuţel z veterinárního hlediska zůstává v popředí zájmu pes, i co se týče výzkumu Lymeské borreliózy a leptospirózy. Ty patří k celosvětově nejrozšířenějším zoonózám a v rámci infekčních spirochetálních onemocnění domácích zvířat mají z veterinárně-medicínského hlediska největší význam. Studie na kočkách v této oblasti se objevují jen zřídka. Moţná je to dáno tím, ţe kočky mají přirozenou rezistenci k zoonózám v důsledku častého styku s patogeny. Jeví se tedy jako málo vnímavé a většinou u nich nejsou popisovány klinické známky onemocnění. Přesto je třeba zmínit, ţe kočky přicházejí často do styku jak s klíšťaty, které jsou u nás nejčastějším přenašečem Lymeské borreliózy, ale jako aktivně lovící masoţravci zejména s hlodavci, jeţ jsou zase zdrojem leptospirózy. Pravděpodobnost nákazy koreluje s výskytem infikovaných ţivočichů v dané oblasti. Ten bohuţel stále narůstá a jeho příčiny jsou jak klimatické změny, tak lidský faktor. Civilizace proniká do původně izolovaných lesnatých oblastí, jeţ jsou začleňovány do sídlištních komplexů. Zvířata se ocitají v novém biotopu a na mnoha místech dochází k jejich přemnoţení. Lidé, stejně jako jejich mazlíčci, mají pak vyšší šanci přijít do styku se zdrojem nákazy. Ačkoli kočky nehrají důleţitou roli v celkové epidemiologii těchto chorob, jsou u nich měřeny příslušné protilátky v krvi. Séroprevalence u koček dokumentovaná v českých publikacích se pohybuje u leptospirózy do 25 % a u Lymeské borreliózy aţ do 37 %, coţ rozhodně není zanedbatelný počet. V ČR ale neexistuje ţádný konkrétní výzkum z hlediska výskytu těchto zoonóz u koček, proto by tato práce měla alespoň zčásti přispět k lepšímu prostudování dané problematiky.

8

2. KREVNÍ OBRAZ KOČKY Krevní buňky kočky se z hlediska fyziologie neliší od ostatních savců, ale co se týče morfologie a kvantity buněk, mají svá specifika. Tato kapitola pojednává o hlavních součástech krevního obrazu u kočky a podrobně popisuje kaţdý parametr, který byl měřen v praktické části.

2.1. Erytrocyty Erytrocyt savců je vysoce specializovaná bezjaderná buňka. Má tvar plochého, bikonkávního disku o průměru 2,5 - 8 m a tloušťce 2 m (Doubek et al., 2003) Asi 60 % objemu erytrocytů tvoří voda, 33 - 36 % hemoglobin a zbytek elektrolyty (Dellmann et Eurell, 1998). Erytrocyt je adaptovaný na přenos kyslíku a oxidu uhličitého. Tato funkce je spojena s krevním barvivem – hemoglobinem. Ten se syntetizuje během vývoje erytrocytu. Ve zralé buňce jiţ kvůli nepřítomnosti organel tvorba hemoglobinu neprobíhá. Mnoţství hemoglobinu určuje vazebnou kapacitu pro kyslík. Erytrocyt obsahuje 2,3-difosfoglycerát, který svou vazbou na hemoglobin ovlivňuje afinitu krve ke kyslíku (viz dále) (Donner, 1985). Erytrocyt získává energii především z anaerobní glykolýzy. Ta je vyuţita především k zachování integrity membrány a udrţení redukované formy hemoglobinu nezbytné pro přenos kyslíku (Young et al., 2006). Na povrchu membrány erytrocytů jsou exprimovány antigeny krevních skupin. Prostřednictvím membránově vázaných enzymů je v membráně ukotven cytoskelet, jehoţ hlavním proteinem je spektrin. Bikonkávní tvar je dán cytoskeletem a obsahem vody v buňce (Young et al., 2006). U koček však vydutost není tolik výrazná jako u jiných zvířat, coţ se projevuje i na krevním roztěru nevýrazným centrálním projasněním (Dellmann et Eurell, 1998). Bikonkávní tvar je významný tím, ţe zvětšuje plochu erytrocytu pro krevní plyny (20 - 30 krát) a společně s vlastnostmi membrány umoţňuje deformovatelnost, která je důleţitá pro jeho průchod kapilárami (Young et al., 2006). Erytrocyty koček mají tendenci adherovat na sebe navzájem a tvoří tak dlouhé řetízky zvané rouleaux (Obr. 1). U kočky se mohou v erytrocytech fyziologicky vyskytovat i Heinzova nebo Howell-Jollyho tělíska. Heinzova tělíska jsou shluky denaturovaného hemoglobinu (Day et al., 2000; Thrall et al., 2006). U koček se nacházejí běţně aţ u 5 % erytrocytů (Doubek et al., 2003). Howell-Jollyho tělíska jsou zbytky jádra ve formě 1 - 3 malých, kulatých, excentricky lokalizovaných útvarů (Dellmann et Eurell, 1998). U koček se pozorují aţ u 1 % erytrocytů bez chorobných příznaků (Day et al., 2000).

9

Obr. 1: Penízkovatění (rouleaux) pozorované v kočičí krvi (URL 1) Průměrná ţivotnost erytrocytů, tedy od uvolnění z kostní dřeně po jejich zánik, je druhově specifická a u koček činí 66 - 79 dní (Dellmann et Eurell, 1998). Při stárnutí erytrocytů dochází k mnoha změnám. Zmenšuje se objem, obsah vody, draslíku, osmotická odolnost, zvyšuje se obsah vápníku, sodíku a rigidita. Sniţuje se aktivita enzymů. Při poklesu koncentrace ATP pod 10 % se buňka zakulacuje (Donner, 1985). Zánik erytrocytů je spojen s oxidačním poškozením. Dochází k dezintegraci membrány, sníţení deformability erytrocytu a jeho záchytu zejména ve slezině, kde je fagocytován. K tomu dochází v menší míře také v kostní dřeni a v játrech. Malá část erytrocytů zaniká přímo v cévách, jejich hemoglobin se rozpadá na --dimery a váţe se na glykoprotein haptoglobin. Tyto komplexy jsou vychytávány mononukleárním fagocytárním systémem a rozloţeny (Doubek et al., 2003). Mnoţství erytrocytů koček činí 5 - 10 *1012 v litru krve (Doubek et al., 2007). Bylo zjištěno, ţe počet erytrocytů u koček je dědičný (Lawler et al., 2006). Mladé kočky mají niţší počet erytrocytů neţ dospělá zvířata (Dürr et al., 2001; Horzinek et al., 2003). Změny v počtu erytrocytů jsou způsobeny poklesem či nárůstem krvetvorby, zvýšeným rozpadem erytrocytů nebo ztrátami krve. U kočky můţe dojít k rychlému nárůstu mnoţství erytrocytů díky silně kontraktilní slezině (Doubek et al., 2003). Počet erytrocytů bývá často zvýšen v důsledku stresu při odběru krve (O'Brien et al., 1998). Samotný počet erytrocytů má omezenou výpovědní hodnotu (Doubek et al., 2003).

2.2. Hemoglobin Podíl hemoglobinu na hmotnosti erytrocytu činí asi 34 %. Hemoglobin je hemoprotein sloţený z vlastního barviva hemu (4 %) a bílkoviny globinu (96 %). Globin je uspořádán do 4 řetězců (2 , 2 ). Aminokyseliny řetězce globinu se stáčejí do charakteristické prostorové

10

struktury, přičemţ v dutině kaţdého řetězce je vázána molekula hemu (Obr. 2). Základem hemu je protoporfyrin, který má v centru molekuly dvojmocné ţelezo, na které se váţe kyslík. Prostor pro vazbu kyslíku mezi řetězci globinu se mění v závislosti na stavu oxygenace. Po uvolnění kyslíku vzniká deoxyhemoglobin a je zde navázán 2,3-difosfoglycerát (2,3-DPG). Po opětovném navázání kyslíku (tedy v oxygenovaném stavu) je 2,3-DPG uvolněn a tento prostor se zmenší. 2,3-DPG tak sniţuje afinitu deoxygenovaného hemoglobinu ke kyslíku. Nezbytnými enzymy pro transport kyslíku jsou methemoglobinreduktázy, které stabilizují ţelezo v redukované formě. Oxidované ţelezo schopnost přenosu kyslíku nemá. 1 g hemoglobinu váţe 1,34 ml kyslíku. Pro výměnu CO2, na jehoţ transportu se hemoglobin také podílí, je důleţitý enzym karbonátdehydratáza. Hemoglobin také v menší míře udrţuje pH krve jako nárazník (Donner, 1985; Doubek et al, 2003).

Obr. 2: Schéma hemoglobinu (upraveno podle URL 2) Savčí hemoglobin je diferencován do několika typů, které mají odlišné řetězce a liší se i v některých vlastnostech, například afinitě ke kyslíku. Nejvíce zastoupené jsou fetální hemoglobin a hemoglobiny dospělého typu (Doubek et al., 2003). U koček je fetální hemoglobin nahrazen adultním typem během prenatálního vývoje (Kaneko et al., 1997). Degradace hemoglobinu probíhá v několika krocích. Nejprve vznikají globinové řetězce a hemové skupiny. Globin se stává součástí zásoby bílkovin a můţe být odbourán aţ na aminokyseliny, a pak znovu vyuţit k syntézám. Hem podléhá oxidačnímu štěpení (za katalytického působení hemoxygenázy). Ţeleznatý kation se oxiduje na ţelezitý, a v této formě se uvolní z vazby. Dochází k otevření tetrapyrrolového kruhu a vzniká lineární, zeleně zbarvený biliverdin. Ten vstupuje do redukční reakce, jejímţ produktem je ţlutý bilirubin (Schneiderka et al., 2004). Většina ţeleza je plazmě navázána na transferin, částečně se nachází v zásobní

11

bílkovině feritinu. Ţelezo je odváděno do kostní dřeně k nové syntéze hemoglobinu, nebo je ve formě feritinu či hemosiderinu ukládáno v kostní dřeni, játrech a slezině (Dürr et al., 2001). Koncentrace hemoglobinu u zdravé kočky by se měla pohybovat v rozmezí 80 - 150 g/l (Doubek et al., 2007). Stejně jako počet erytrocytů, tak i mnoţství hemoglobinu je u koček dědičné (Lawler et al., 2006). V prvních týdnech ţivota je koncentrace hemoglobinu niţší neţ u dospělých koček (Dürr et al., 2001). Určením mnoţství hemoglobinu zjistíme, jak jsou erytrocyty zásobeny krevním barvivem. Stanovené mnoţství hemoglobinu pak umoţňuje posoudit případný druh anémie. Změny v obsahu hemoglobinu jsou způsobeny poklesem či nárůstem krvetvorby, zvýšeným rozpadem erytrocytů nebo ztrátami krve (Doubek et al., 2003; Dürr et al., 2001).

2.3. Hematokrit Hematokrit udává podíl korpuskulárních sloţek k celkovému mnoţství krve. Závisí na počtu a objemu erytrocytů a na objemu plazmy. Vzhledem k nízkému počtu leukocytů a trombocytů, které se nacházejí v tenkých vrstvičkách nad sloupcem červených krvinek, je tento ukazatel vnímán pouze jako podíl erytrocytů (Dürr et al., 2001). Při centrifugaci zůstane mezi erytrocyty i malé mnoţství plazmy, které je však zanedbatelné (asi 3 %) (Horzinek et al., 2003). Hodnota hematokritu se udává v procentech a u koček činí 24 - 45 % (Doubek et al., 2007). Hematokrit po narození dosahuje hodnot dospělých jedinců, v prvních měsících klesá pod referenční rozmezí a teprve s nástupem pohlavní zralosti odpovídá poměrům dospělých koček (Horzinek et al., 2003). Zvýšení hematokritu značí zvýšení počtu erytrocytů, které můţe být jak absolutní, a to v důsledku hypoxie, nebo relativní, z důvodu dehydratace. Sníţení hematokritové hodnoty znamená ve většině případů anémii (Doubek et al., 2007; Dürr et al., 2001).

2.4. Sedimentace erytrocytů V nesráţlivé krvi dochází vlivem gravitace k pozvolné sedimentaci erytrocytů (Svoboda, 2008). Krev je poměrně stálou suspenzí specificky těţších erytrocytů ve specificky lehčí viskózní plazmě. Důleţitým činitelem, který tuto suspenzi udrţuje, je negativní elektrický náboj erytrocytů, oproti němuţ stojí volné pozitivní náboje částic krevní plazmy. Kaţdý erytrocyt je tedy obklopen dvojvrstvou elektrických nábojů, která napomáhá rozptýlení a vznášení erytrocytů v plazmě, i kdyţ jsou specificky těţší (Bičík, 1992). Sedimentace erytrocytů je ovlivňována zejména následujícími faktory (Bičík, 1992): 12

 Sloţením bílkovin krevní plazmy, přičemţ albuminy sedimentaci zpomalují, zatímco globuliny a fibrinogen ji podstatně zrychlují, neboť sniţují negativní elektrický náboj erytrocytů  Velikostí povrchu sedimentujících částic. Erytrocyty mají tendenci vytvářet válečkovité agregáty (rouleaux) o velkém objemu a poměrně malém povrchu. Jejich tvorba je ovlivňována také globuliny a fibrinogenem. Při tzv. penízkovatění se poměr hmoty k velikosti povrchu zvyšuje a erytrocyty klesají ke dnu s větší rychlostí  Počet erytrocytů. Čím je erytrocytů méně, tím rychleji sedimentují. V opačném případě je sedimentace pomalejší, protoţe vzájemné odpuzování je větší  pH krevní plazmy, přičemţ alkalóza můţe sedimentaci poněkud zrychlovat  Tuky krevní plazmy, kdy cholesterol sedimentaci o něco zrychluje, lecitin zpomaluje Rychlost sedimentace je u zdravých jedinců poměrně stálá a mění se za chorobných stavů. Sedimentace se vyjadřuje v mm za časovou jednotku. Patologicky se sedimentace zrychluje při zánětlivých onemocněních, a to u všech akutních i chronických infekcí, kdy v plazmě přibývá globulinů. Je zrychlena i při mnoha nádorových procesech a za chorobných stavů, kdy ubývá erytrocytů, např. anémii. Sníţení sedimentace můţe znamenat zvýšení počtu erytrocytů nebo dehydrataci (Bičík, 1992; Doubek et al., 2007; Dürr et al., 2001). U kočky má hodnota sedimentace malý diagnostický význam (Svoboda, 2008).

2.5. Leukocyty Leukocyty hrají důleţitou roli v obraně organizmu. Dle výskytu barvitelných granul v cytoplazmě je rozdělujeme na granulocyty (neutrofily, eozinofily a bazofily) a agranulocyty (monocyty a lymfocyty). Granulocyty mají segmentované jádro, někdy se také označují pojmem polymorfonukleární leukocyty. Agranulocyty bývají pro své kompaktní jádro někdy označovány jako mononukleáry. Agranulocyty mají také azurifilní granula, která však nejsou zřetelná a nebarví se (Young et al., 2006). Počet leukocytů u koček by se měl pohybovat v rozmezí 7 - 17 *109 v litru krve (Doubek et al., 2007). Celkový počet leukocytů je vyšší u zvířat do 3 měsíců věku, většinou jako důsledek zvýšení počtu lymfocytů (Day et al., 2000). Odchylky v počtu leukocytů můţou zahrnovat změnu v rychlosti jejich produkce a uvolňování z kostní dřeně, distribuce mezi marginálním a cirkulujícím poolem (viz dále) nebo míru odchodu leukocytů do tkání (Dürr et al., 2001)

13

Zvýšení celkového počtu leukocytů nad horní hranici referenčních hodnot se nazývá leukocytóza. K fyziologické leukocytóze při námaze, pohybu, stresu a strachu v důsledku uvolnění adrenalinu dochází u koček velmi často. Stresová leukocytóza bývá častá u koťat do 1 roku. K nárůstu počtu leukocytů dochází velmi rychle, ale dočasně, k normálním hodnotám se vrací během 30 minut po odstranění stimulu (Day et al., 2000; Horzinek et al., 2003). Patologická leukocytóza má spoustu příčin: infekční choroby (především bakteriálního původu), diabetes mellitus, intoxikace (olovo, rtuť), přítomnost cizích proteinů (sérová injekce, transfúze), choroby centrální nervové soustavy (tumory, encefalitidy) atd. (Dürr et al., 2001). Kočky reagují na zmíněné stimuly masivním zvýšením počtu leukocytů. Hodnoty nad 50 000 leukocytů v l krve se vyskytují bez toho, aniţ by šlo o leukémii (Horzinek et al., 2003). Sníţení počtu leukocytů pod spodní hranici referenčních hodnot značíme jako leukocytopénii (leukopénii). Přirozeně niţší hodnoty počtu leukocytů mají kočky nad 10 let věku (Campbell et al., 2004). Patologické příčiny leukopenie mohou být virové infekční choroby (Wexler – Mitchell, 2004), šok, zvýšená potřeba leukocytů při některých zánětlivých onemocněních či podání léků (cytostatika, chloramfenikol) (Dürr et al., 2001).

2.5.1. Neutrofilní granulocyt Neutrofily jsou u koček nejběţnějším typem leukocytů. Jejich buňka má okrouhlý tvar a dosahuje velikosti 12 aţ 15 m v průměru. Podle stupně vyzrávání rozlišujeme mladou neutrofilní tyč s jádrem ve tvaru tyčinky, nebo segmentovaný neutrofil (Obr. 3), jehoţ segmenty jsou spojeny prouţkem jaderného chromatinu a bývá jich 3 - 5. Chromatin je tmavý, hutný, seskupený v hrudkách (Dellmann et Eurell, 1998). U samic savců je někdy na segmentu neutrofilu patrné paličkovité Barrovo tělísko, coţ je kondenzovaný chromozom X (Young et al., 2006). Organely přítomné v cytoplazmě jsou mitochondrie, polyribozomy, malé Golgiho komplexy a téţ glykogen (Dellmann et Eurell, 1998). Aţ u 30 % neutrofilů koček můţeme pozorovat Döhleho tělíska, coţ jsou zbytky endoplazmatického retikula (Day et al., 2000). Neutrofily jsou vysoce pohyblivé buňky prostřednictvím tvorby panoţek. Motilita a endocytární aktivita neutrofilů jsou uskutečněny díky vysokému obsahu kontraktilních proteinů: aktinu, myozinu, tubulinu a proteinů asociovaných s mikrotubuly (Young et al., 2006).

14

Obr. 3: Kočičí neutrofil (URL 3) Neutrofily obsahují různé typy granul, které uvolňují svůj obsah exocytózou nebo fúzí s fagozómem obsahujícím pohlcené částice (Young et al., 2006). Během vývoje neutrofilů se nejdříve objevují primární granula, která obsahují především obsahují myeloperoxidázu, defensiny, proteázy a lysozym. Početnější jsou granula sekundární, která jsou o něco menší, obsahují lysozym, ţelatinázu, kolagenázu, laktoferin a NADPH oxidázu. Dalším typem jsou ţelatinózní granula uvolňující ţelatinázu, jeţ slouţí k degradaci tkání, jelikoţ štěpí extracelulární matrix (Borregaard et al., 2007; Young et al., 2006). Při kumulaci a vysoké aktivitě neutrofilů můţe docházet aţ k poškození tkání (Doubek at al., 2003) Neutrofily mají také sekreční granula, která

slouţí

jako

zásobárna

membránově

vázaných

receptorů

potřebných

pro adhezivní funkce neutrofilů při zánětu (Young et al., 2006). Neutrofily se vyskytují v krvi asi 6 - 14 hodin, pak migrují do tkání, kde jejich ţivotnost závisí na funkčním zapojení. Neutrofily tvoří první linii obrany proti patogenům. Hrají důleţitou roli při fagocytóze bakterií a modulaci zánětlivých procesů. Fagocytóza probíhá v několika krocích. Neutrofil v cirkulaci je lákán chemotaktickými faktory uvolněnými z poškozených tkání a bakterií. Nejsilnějším chemotaktickým faktorem pro neutrofily je sloţka komplementu C5a. Stimulované neutrofily exprimují na svém povrchu adhezivní molekuly, které umoţní vazbu na endoteliální buňky a prostup neutrofilů do tkání. Opsonizace mikroorganizmu protilátkami nebo komplementem zvyšuje fagocytární aktivitu neutrofilů. Mikroorganizmus je obklopen panoţkami

a

uzavřen

do

endocytického

váčku

zvaného

fagozóm.

Ten

splývá

s cytoplazmatickými granulemi, mikroorganizmus je tak vystaven směsi antimikrobiálních proteinů a k jeho zničení dochází především díky generování peroxidu vodíku a superoxidu v procesu oxidativního vzplanutí. Neutrofily hrají také roli v koagulaci, fibrinolýze, aktivaci lymfocytů a cytotoxicitě (Dellmann et Eurell, 1998; Doubek et al., 2003; Young et al., 2006). Ačkoliv má neutrofil několik organel pro syntézu proteinů, má omezenou kapacitu pro obnovu sekretovaných proteinů a specifických enzymů, které jsou spotřebovány během

15

fagocytární aktivity. Neutrofil tak nemůţe dále vykonávat svou funkci, degeneruje a stává se součástí hnisu (Doubek et al., 2003). Ve slezině, játrech a kostní dřeni jsou neutrofily fagocytovány makrofágy. Jsou vylučovány ve slinách, močí, v gastrointestinálním traktu a také v plicích (Day et al., 2000). Funkce neutrofilů pochopitelně vyţadují energii. Přítomnost mitochondrií a velký obsah glykogenu odráţí důleţitost aerobního metabolismu. Neutrofily se často vyskytují v zánětlivých loţiscích a nekrotických tkáních, kde je nedostatečné cévní zásobení. Za těchto okolností pochází energie z anaerobní glykolýzy, a dovoluje tak neutrofilům přeţívat v nízce okysličeném prostředí poškozených tkání (Dellmann et Eurell, 1998; Doubek et al., 2003). Počet zralých neutrofilů se u koček pohybuje v rozmezí 3,6 – 12 *10 9 v litru krve (Doubek et al., 2007). U koček jsou neutrofily distribuovány mezi 2 tzv. pooly: marginálním a cirkulujícím. Marginální pool tvoří neutrofily, které jsou zachyceny na endotelu kapilár, hlavně ve slezině, plicích a břišních útrobách. U koček je zde dvakrát aţ třikrát větší počet neutrofilů neţ v cirkulaci. Neutrofily marginálního poolu se mohou rychle mobilizovat v odpovědi na fyziologické - stres, vzrušení, nebo patologické stimuly - zánět, infekce. Absolutní počet neutrofilů závisí na jejich tvorbě v kostní dřeni, vstupu do cirkulace, posunu buněk mezi 2 pooly a odchodu do tkání. Zvýšení počtu neutrofilů nad referenční hodnoty, tedy neutrofilii, způsobuje nejčastěji stres, vzrušení, záněty, infekce nebo nekrózy. Sníţení mnoţství neutrofilů, neutropenie, nastává v důsledku zkráceného přeţívání neutrofilů při bakteriální infekci (Day et al., 2000).

2.5.2. Eozinofilní granulocyt Eozinofily jsou oproti neutrofilům o něco větší, o průměru 12 aţ 17 m. Mají okrouhlý tvar a segmentované, dvojlaločnaté jádro (Obr. 4). Cytoplazma je světlá a obsahuje specifická granula barvící se eozinem (Young et al., 2006). Granula jsou uniformní velikosti a obsahují především kationické proteiny: hlavní bazický protein, eozinofilní bazický protein, eozinofilní peroxidázu a neurotoxin (Abu-Ghazaleh et al., 1992). Eozinofily koček mají velká granula tyčinkovitého tvaru, barvitelná oranţovošedě (Dellmann et Eurell, 1998). V cytoplazmě se nachází i granula primární, z organel pak mitochondrie, ribozomy, Golgiho komplex a endoplazmatické retikulum. Na membráně eozinofilů jsou imunoglobulinové a komplementové receptory (Young et al., 2006). Nízká hustota těchto receptorů na povrchu eozinofilů udává nízkou fagocytární aktivitu (Dellmann et Eurell, 1998). Bylo prokázáno, ţe eozinofily mohou být antigen prezentujícími buňkami, protoţe

16

exprimují MHC II (major histocompatibility komplex) a kostimulační molekuly, které jsou nezbytné pro aktivaci T-lymfocytů (Shi, 2004).

Obr. 4: Kočičí eozinofil (URL4) Eozinofily cirkulují v krvi asi 8 - 12 hodin, poté vstupují z kapilár do tkání pod vlivem chemotaktických látek. Za normálních podmínek se eozinofily nacházejí především ve slezině, lymfatických uzlinách a gastrointestinálním traktu. Do dalších tkání vstupují, pokud zde probíhá chorobný proces, nejčastěji při zánětu ve sliznici nebo alergické reakci. Klíčovým chemotaktickým faktorem eozinofilů je histamin. Hrají významnou roli v obraně proti mnohobuněčným parazitům, která je zprostředkována uvolněním bazických proteinů granulí, ale i leukotrienů. Eozinofily jsou schopné modulovat místní imunitní odpověď produkcí a uvolňováním cytokinů. Jsou důleţité v regulaci zánětlivých a alergických procesů (Day et al., 2000; Young et al., 2006) Degranulace eozinofilů nastává po pohlcení cizí částice, opsonizované bakterie, imunokomplexu a po kontaktu s mnohobuněčným parazitem. Eozinofily přeţívají ve tkáních několik dní, kde potom umírají apoptózou a jsou odstraněny lokálními makrofágy (Dellman et Eurell, 1998). Počet eozinofilů u zdravých koček by neměl překročit 0,9 *109 v litru krve (Doubek et al., 2007). Počet kolísá během dne, nejvíce jich je zrána a nejméně odpoledne (Young et al., 2006). Zvýšený počet eozinofilů, eozinofilie, je nejčastějším znakem parazitárních infekcí a hypersenzitivních reakcí. Sníţený počet eozinofilů provází různé akutní infekce, záněty a metabolické poruchy (Day et al., 2000; Wexler – Mitchell, 2004). Také kočky nad 10 let vykazují niţší počty eozinofilů (Campbell et al., 2004).

2.5.3. Bazofilní granulocyt Velikost bazofilů se pohybuje v rozmezí 14 aţ 16 m v průměru. Jádro můţe být nepravidelné, dvojlaločnaté nebo segmentované (Young et al., 2006). Bazofily jsou charakteristické velkými bazofilními cytoplazmatickými granulemi. Tato granula jsou ve vodě rozpustná, během barvení proto můţe docházet k degranulaci, a pak jsou bazofily těţko

17

rozpoznatelné. Granula obsahují heparin, histamin, kyselinu hyaluronovou, chondroitin sulfát, serotonin, hydrolytické enzymy a další zánětlivé a vazoaktivní mediátory (Delmann et Eurell, 1998). Bazofilní granula koček jsou světlejší (Obr. 5), barvící se růţově aţ oranţovošedě (Bacha et Bacha, 2000; Dellmann et Eurell, 1998). V cytoplazmě se dále nachází mitochondrie, Golgiho komplex a endoplazmatické retikulum (Young et al., 2006).

Obr. 5: Kočičí bazofil (URL 5) Bazofily hrají hlavní roli v alergických a zánětlivých reakcích. V omezené míře jsou také fagocytujícími buňkami. Reagují chemotakticky na bakteriální produkty, sloţky komplementu a některé cytokiny. Na svém povrchu mají vysoce afinitní Fc-receptor pro imunoglobuliny třídy IgE, jehoţ prostřednictvím jsou zde tyto molekuly vázány. Receptor je schopen rozeznat určité antigeny (především povrchové molekuly mnohobuněčných parazitů). Jakmile se na povrch bazofilu naváţe příslušný antigen, dojde k agregaci několika molekul receptoru, coţ má za následek vylití obsahu granul z bazofilu. Uvolněné látky přímo poškozují parazita a přispívají k rozvoji dalších obranných mechanizmů. Granula jsou uvolňována exocytózou a bazofily jsou schopny jejich obnovy. Degranulace nastává během několika minut po stimulaci a můţe trvat i 72 hodin. Během několika dní dochází k syntéze nových cytoplazmatických granul (Day et al., 2000; Dellmann et Eurell, 1998). Po antigenní stimulaci syntetizují bazofily také eozinofilní chemotaktický faktor. Spolu s uvolněním histaminu to vede k lokální akumulaci eozinofilů, které jsou těmito látkami přilákány (Day et al., 2000). Bazofily se uplatňují také v metabolismu lipidů a koagulaci (Dellmann et Eurell, 1998). Bazofily by neměly u koček přesáhnout 0,1 *10 9 v litru krve (Doubek et al., 2007). V krvi zdravých koček se bazofily vyskytují výjimečně, proto kaţdý jejich nález bývá známkou onemocnění. Zvýšení počtu bazofilů, bazofilie, má tendenci výskytu společně s eozinofilií a má i podobné příčiny (Day et al., 2000).

18

2.5.4. Lymfocyty Lymfocyty jsou nejmenšími leukocyty kolujícími v krvi. Rozeznáváme lymfocyty malé, střední a velké. Jejich velikost se většinou pohybuje od 6 do 15 m v průměru. U koček převládají malé lymfocyty (Dellmann et Eurell, 1998). Tvar lymfocytu je okrouhlý, zřídka lehce nepravidelný. Jádro je velké, kulaté, oválné či na straně vpáčené. Bývá uloţené excentricky a cytoplazmatický lem při okraji buňky je pak různě široký (Obr. 6). Chromatin má hrubou strukturu a můţeme zde najít jadérko. V lehce bazofilní cytoplazmě bývá několik azurofilních granul (Bacha et Bacha, 2000; Day et al., 2000), dále mitochondrie, endopazmatické retikulum a ribozomy (Dellmann et Eurell, 1998).

Obr. 6: Kočičí lymfocyt (URL 6) Malé lymfocyty jsou klidovým stadiem, velké jsou aktivní. Antigenní stimulací lymfocytů dochází ke změnám v jejich morfologii: zvětšují se, jádro se stává nepravidelné, lze rozeznat jadérka, roste podíl cytoplazmy, zvyšuje se také počet azurofilních granul. Tyto lymfocyty jsou nazývány také reaktivními lymfocyty (Doubek et al., 2003). Většina lymfocytů ţije několik měsíců, paměťové buňky i po celý ţivot jedince. Hlavní funkcí lymfocytů je účast na imunitních reakcích. Dělí se na T a B lymfocyty. Antigenní stimulací B-lymfocytů vznikají plazmatické buňky, které syntetizují a uvolňují protilátky. B-lymfocyty také nesou imunoglobuliny na svém povrchu. T-lymfocyty jsou důleţité pro antigenně

specifické

buněčně

zprostředkované

i

protilátkové

imunitní

reakce.

TC-buňky mají schopnost cytotoxicky zabíjet jiné buňky (infikované či abnormální). TH-buňky se podle cytokinů, které produkují, rozdělují na T H1 a TH2. TH1 -buňky stimulují makrofágy k přeměně v aktivované makrofágy. Základní funkcí T H2 -buněk je spolupráce s B-lymfocyty. Část B a T-lymfocytů se po setkání s antigenem diferencuje v paměťové buňky, zodpovědné za tzv. imunologickou paměť (Hořejší et Bartůňková, 2005). V krvi se nachází asi 70 % T-buněk, 20 % B-buněk a 10 % připadá na zbylé typy (Day et al., 2000). U zdravé kočky by se mělo mnoţství lymfocytů pohybovat v rozmezí 1 – 6 *109 v litru krve (Doubek et al., 2007). Zvýšení počtu lymfocytů, lymfocytóza, můţe být fyziologická, se stejnými příčinami jako neutrofilie. Lymfocytóza je také častá u mláďat. Patologickou příčinou 19

zvýšení počtu lymfocytů bývají chronické infekce (Day et al., 2000). Ke sníţení mnoţství lymfocytů, lymfopenii, dochází u koček nad 10 let (Campbell et al., 2004). Patologickými příčinami lymfopenie jsou stres, akutní virové infekce nebo imunodeficity (Doubek et al., 2007).

2.5.5. Monocyty Monocyty jsou největší buňky v periferní krvi, jejichţ velikost se pohybuje mezi 15 - 20 m v průměru. Monocyt má kulatý nebo vejčitý tvar, často nepravidelný s pseudopodiemi (Obr. 7). Jádro je poměrně velké, excentricky uloţené, laločnaté či ledvinovité. Barví se méně intenzivně neţ u jiných leukocytů. Chromatin je řídce uspořádán (Bacha et Bacha, 2000; Young et al., 2006). Aktivované monocyty mají často několik velkých vakuol a mnoho jemných, nejasných granul v cytoplazmě. Granula monocytů obsahují myeloperoxidázu, kyselou fosfatázu, elastázu a katepsin G (Dellmann et Eurell, 1998). Mezi organely vyskytující se v monocytech patří ribozomy, polyribozomy, mitochondrie, endoplazmatické retikulum a Golgiho aparát (Young et al., 2006). Na membráně jsou exprimovány receptory pro komplement a imunoglobuliny, coţ usnadňuje fagocytózu opsonizovaných buněk (Day et al., 2000).

Obr. 7: Kočičí monocyt (URL 7) V periferní krvi se monocyty vyskytují 3 - 4 dny, poté vstupují do tkání a diferencují se ve tkáňové makrofágy. Přeměna na makrofágy je spojena se zvětšením buněčné velikosti, obsahem proteinů a lipidů, zvýšením metabolizmu, expresí povrchových proteinů a fagocytární aktivitou. Makrofágy jsou dlouho ţijící fagocytující buňky a patří mezi ně Kupferovy buňky jater, mikroglie v centrální nervové soustavě, Langerhansovy buňky v kůţi, alveolární makrofágy v plicích, osteoklasty v kostech a antigen prezentující buňky lymfatických orgánů. Makrofágy přítomné v pojivové tkáni se nazývají histiocyty. Dále makrofágy najdeme ve slezině, pobřišniční a pohrudniční dutině (Dellmann et Eurell, 1998; Young et al., 2006). Makrofágy fagocytují intracelulární organizmy, transformované buňky a buněčné zbytky (Doubek et al., 2003). Krevní monocyty a tkáňové makrofágy jsou společně označovány jako mononukleární fagocytární systém (Young et al., 2006). Hrají důleţitou roli v nespecifické 20

imunitě, ale i v antigenně specifické části imunitního systému, protoţe působí jako důleţité antigen prezentující buňky T-lymfocytům. Produkují mnoţství biologicky aktivních látek, jako jsou cytokiny. Jsou tedy zahrnuty například v regulaci granulopoézy a erytropoézy (Dellma nn et Eurell, 1998). Počet monocytů by u koček neměl překročit 0,6 *10 9 buněk v litru krve (Doubek et al., 2007). Zvýšení počtu monocytů nad referenční hodnoty, monocytóza, je znakem probíhající zánětlivé reakce nebo akutní infekce, kdy se mononukleární fagocyty hromadí v místě zánětu (Dürr et al., 2001). Ke sníţení počtu monocytů, monocytopenii, můţe docházet při akutních zánětech (Doubek et al., 2007).

21

3. VYBRANÉ BIOCHEMICKÉ PARAMETRY 3.1. Bilirubin Bilirubin je organický anion (Zima, 2002), který je konečným produktem odbourávání hemu, především hemoglobinu erytrocytů. Podíl hemoglobinu na vznikajícím bilirubinu činí asi 80 %. Zbylé mnoţství bilirubinu vzniká z myoglobinu, cytochromu, peroxidázy a katalázy. Protoţe tyto hemoproteiny mají kratší ţivotnost neţ erytrocyty, objevuje se také bilirubin z nich vzniklý v krvi dříve a nazývá se zkratový bilirubin (Schneiderka et al., 2004). Bilirubin je uvolněn z makrofágů, a protoţe je jeho molekula hydrofobní, v krvi se váţe na albumin - je nekonjugovaný. Krví je transportován do jater, kde se uvolní z vazby na protein, a poté vstupuje do hepatocytu (Kaneko et al., 1997). Na krevním pólu jaterní buňky se bilirubin váţe na transportní systém, který přenáší bilirubin do hladkého endoplazmatického retikula. Jedná se o protein ligandin a protein Z. Ligandin je kationická forma enzymu glutation-S-transferázy (Schneiderka et al., 2004). Zabraňuje zpětnému úniku bilirubinu do krve. V hepatocytu je bilirubin konjugován s cukernou skupinou - kyselinou glukuronovou (Kaneko et al., 1997). Konjugace je katalyzována membránově vázaným enzymem UDP-glukosiduronáttransferázou (Thrall et al., 2006). Vznikají konjugované sloučeniny bilirubinmonoglukosiduronát, posléze bilirubindiglukosiduronát (Schneiderka et al., 2004). U koček je schopnost konjugace sníţená (Doubek et al., 2007). Většina konjugovaného bilirubinu je aktivně vylučována se ţlučí do tenkého střeva prostřednictvím kanalikulárního transportéru. Přenos je energeticky náročný, energie je získávána štěpením ATP. Konjugáty se při alkalickém pH za katalýzy střevními -glukosiduronatázami hydrolyticky štěpí. Zdrojem těchto enzymů je střevní epitel, játra a bakterie. Díky střevní anaerobní mikrobiální flóře se uvolněný bilirubin redukuje na bezbarvé tetrapyrrolové

sloučeniny

sterkobilinogen,

mesobilinogen,

urobilinogen

(souhrnně

urobilinogeny). Z nich asi 80 % je oxidováno na sterkobilin, mesobilin, urobilin (urobiliny) a stolicí odchází z těla ven (Schneiderka et al., 2004). Zbývajících 20 % je reabsorbováno a přechází do krve. Větší část urobilinogenu vstupuje do hepatocytů a je znovu metabolizována (enterohepatální oběh), zbylé mnoţství cirkuluje do ledvin a je vyloučeno močí. Část konjugovaného bilirubinu v krvi je však navázána na protein a označuje se jako delta bilirubin. Ten není vyloučen ledvinami a zůstává v oběhu dlouhou dobu (Rebar et al., 1999; Thrall et al., 2006). Ze stanovení koncentrace sérového bilirubinu je moţné získat informace o absorpční i sekreční aktivitě jaterní buňky, které jsou však velmi nespecifické. Bilirubin se na světle

22

odbourává, proto by se měl vyšetřit do 4 hodin po odběru krve (Horzinek et al., 2003). Díky velké kapacitě mononukleárního fagocytárního systému a schopnosti jater zpracovávat bilirubin, hyperbilirubinémie můţe nastat pouze při značně zvýšené produkci nebo sníţené exkreci bilirubinu (Nelson et al., 2003). Ke zvýšení hladiny bilirubinu dochází v důsledku hemolýzy, lipémie, dlouhé komprimace při odběru krve a také po aplikaci různých léků (sulfonamidy) (Horzinek et al., 2003). Koncentarce bilirubinu v séru by u kočky neměla překročit 7 µmol/l (Doubek et al., 2007). Bilirubin je oranţovoţluté barvivo, které v nadbytku zbavuje krevní sérum, a pokud se dostane do intersticia, vyvolává ţluté zbarvení sliznic a kůţe (ţloutenka) (Musil, 1994). Ke klinické manifestaci ţloutenky dochází u kočky mezi 17 - 34 mol/l i více (Horzinek et al., 2003).

3.2. Enzymy Enzymatické aktivity v krvi jsou výsledkem syntézy, bazální intrahepatální aktivity, uvolňování v rámci přirozené obnovy buněk, poločasu rozpadu a eliminace (Horzinek et al., 2003). K sérovým hodnotám enzymových aktivit tudíţ nejvíce přispívají buňky orgánů s rychlým metabolickým obratem (játra) (Musil, 1994). Specifita enzymu pro určitý orgán vyplývá buď z jeho vysoké bazální aktivity v tomto orgánu, nebo z velmi krátkých poločasů rozpadu izoenzymů, které pocházejí z jiných tkání, tudíţ se nepodílejí na celkové aktivitě enzymu v krevní plazmě. Změny sérových aktivit enzymů slouţí jako citlivý indikátor poruch buněčné integrity a viability, které jsou vyvolané chorobnými procesy. Zvýšená aktivita enzymu v krvi můţe být vyvolaná vratným poškozením membrán, prostřednictvím nichţ potom enzymy unikají do cirkulace, dále zánikem buněk, nebo také zvýšenou syntézou v důsledku enzymové indukce (Horzinek et al., 2003; Nelson et al., 2003). Zvýšené aktivity enzymů jsou měřitelné uţ před nástupem funkčních nebo histologických změn (Horzinek et al., 2003). Hodnota enzymatické aktivity v plazmě závisí na několika faktorech (Kaneko et al., 1997; Musil, 1994): 

Velikost molekul enzymu (enzymy jako vysokomolekulární látky, které se nedostanou přes neporušenou membránu)



Příčiny zvyšující permeabilitu membrán pro molekuly enzymů



Distribuce enzymů v tkáních (buňky v témţe orgánu nemají stejný charakter, mohou mít jiné sloţení i funkci, např. hepatocyty tvoří jen 72 % objemu jater)



Vnitrobuněčná lokalizace enzymů (cytoplazmatický/vázaný na membránu)

23



Způsob uvolňování enzymů z buněk do krve (ovlivňuje dobu, za kterou se při poškození zvýší jeho aktivita v krvi)



Míra odstraňování enzymů z oběhu (nespecifická endocytóza enzymů, způsobena odlišným sloţením enzymů, a tedy i různě rychlá doba degradace)



Rychlost enzymové inaktivace



Indukce syntézy některých enzymů účinkem léčiv



Existence izoenzymů Po opuštění nebo exkreci buňkami jsou enzymy degradovány nebo vylučovány z těla.

Některé molekuly mohou ztratit svou aktivitu a nemůţou být před vyloučením detekovány. Rychlost ztráty aktivity, degradace a exkrece určují čas, během něhoţ je enzymatická aktivita detekovatelná v séru po jeho uvolnění z buněk. Na výsledek měření aktivity enzymu mohou mít vliv vzorky s hemolýzou, hyperbilirubinémií či lipémií. (Horzinek et al., 2003). Nespecifický vzestup aktivity všech jaterních enzymů způsobují u koček hypertyreózy nebo diabetes mellitus. Indukce enzymů léky nehrají u koček významnou úlohu (Horzinek et al., 2003; Nelson et al., 2003).

3.2.1. Alaninaminotransferáza (ALT) Alaninaminotransferáza je cytoplazmatický enzym, jehoţ úlohou je přenos aminoskupiny z alaninu na oxoglutarát za vzniku glutamátu a pyruvátu. Jeho kofaktorem je pyridoxal-5´-fosfát – tvoří holoenzym. ALT apo i holoenzym jsou obsaţeny v séru v různé míře (Kaneko et al., 1997). ALT je u koček povaţován za jaterně specifický enzym, ačkoli pochází i z jiných zdrojů (srdce, ledviny a svaly). Ty jsou však přítomny v nízkých koncentracích nebo je jejich poločas v séru velmi krátký (Villiers et Blackwood, 2005). I kdyţ je aktivita ALT v svalech mnohem niţší, jejich celkový objem oproti játrům je větší, a tak jsou svaly významným zdrojem ALT v krvi (Thrall et al., 2006). ALT dosahuje v hepatocytech koncentrace aţ 10 000 krát vyšší neţ v plazmě (Villiers et Blackwood, 2005) Je to citlivý indikátor prostupnosti membrány (Schneiderka et al., 2004). Při jaterním poškození dochází ke změnám v membráně a uvolnění váčků s cytoplazmou. V séru potom dojde ke zvýšení hladiny ALT. Interpretace hodnot aktivity ALT je závislá na dynamice enzymu v cirkulaci (Rebar et al., 1999). Sérové aktivity se zvyšují asi 12 hodin po poškození

24

a vrcholí 1. - 2. den (Thrall et al., 2006). Biologický poločas ALT činí u kočky asi 3 dny (Horzinek et al., 2003). U kočky by měla aktivita ALT dosahovat hodnot mezi 0,1 - 1 kat/l (Doubek et al., 2007). Stupeň zvýšení aktivity tohoto enzymu neudává příčinu, typ či závaţnost poškození hepatocytů, ale souvisí s počtem postiţených buněk (Rebar et al., 1999). Zvýšení aktivity ALT nastává buď v důsledku nekrózy buněk, změny buněčného metabolismu nebo unikání enzymu přes membránu s pozměněnou propustností. ALT má tendenci zvyšovat se více v akutním neţ při chronickém onemocnění. V posledním stadiu onemocnění jater můţe být aktivita ALT v referenčním rozmezí prostřednictvím několika hepatocytů, které uvolňují tento enzym (Villiers et Blackwood, 2005). Při těţkém poškození jaterního parenchymu (nekrózy, tumory) tedy můţe zůstat aktivita ALT nezměněná, nebo být dokonce sníţená (Doubek et al., 2007). Zatímco pád aktivity ALT je špatným prognostickým znakem odráţejícím ztrátu hepatocytů, postupný pokles aktivity během akutního poškození obvykle značí dobrou prognózu. Ke zvýšení aktivity ALT dochází v některých případech nádorového onemocnění jater (Villiers et Blackwood, 2005) Zvýšení aktivity ALT provází také závaţné poškození svaloviny (Thrall et al., 2006).

3.2.2. Alkalická fosfatáza (ALP) ALP je skupina zinkových metaloenzymů (Kaneko et al., 1997), které katalyzují hydrolýzu fosfátových esterů v alkalickém prostředí (Zima, 2002). Reakční optimum leţí v oblasti pH 9 - 10 (Dürr et Kraft, 2001). Enzymy jsou lokalizovány v membráně a jsou odpovědné za transportní procesy (Kaneko et al., 1997). ALP byla prokázána téměř ve všech tkáních organismu v různých aktivitách. V krevním séru jde o směs izoenzymů pocházejících z kostí (osteoblastů), jater (ţlučového kanálku), ledvin (proximálního tubulu), trávicího traktu (enterocytů) a v těhotenství také z placenty (Kaneko et al., 1997; Thrall et al., 2006). Nejvyšší aktivitu v séru má však ALP pocházející z jater a v menší míře také z kostí (Birchard et Sherding, 2006; Nelson et al., 2003). I přesto je aktivita jaterního izoenzymu u koček niţší neţ například ve srovnání s aktivitou ALP u psů. Stejně tak i poločas cirkulujícího enzymu je kratší (Rebar et al., 1999), u koček činí jen 6 hodin (Birchard et Sherding, 2006). Ostatní izoenzymy mají biologický poločas velmi krátký. Například poločas střevního izoenzymu je pouze 2 minuty. Z tohoto důvodu nejsou izoezymy ze střev, ledvin a placenty povaţovány u kočky za moţné zdroje zvýšení aktivity sérového ALP (Thrall et al., 2006). U koček se také narozdíl od psů nevyskytuje steroidy indukovaný izoenzym (Villiers et Blackwood, 2005).

25

Potenciál kočičích jater tvořit ALP je menší neţ u jiných zvířat. V důsledku to znamená, ţe při stejném jaterním poškození bude mít kočka niţší aktivitu ALP neţ ostatní zvířata. Z toho plyne, ţe i malé zvýšení sérové ALP je u koček více významné neţ u jiných zvířat (Rebar et al., 1999; Thrall et al., 2006). Bylo zjištěno, ţe hodnota aktivity ALP, stejně jako aktivita ALT, jsou u kočky dědičné (Lawler et al., 2006). Důvodem vyšších hodnot ALP u mladých jedinců je větší aktivita kostního izoenzymu, který odráţí činnost osteoblastů (Kaneko et al., 1997). Pro kočky jsou proto věkově specifické intervaly referenčních hodnot (Obr. 8). Sérovou aktivitu ALP také pochopitelně zvyšují nádory kostí nebo probíhající proliferace osteoblastů (např. hojení zlomenin) (Birchard et Sherding, 2006; Thrall et al., 2006). U koček s hyperfunkcí štítné ţlázy, kdy dochází ke zvýšení kostního metabolizmu, se rovněţ zvyšuje aktivita kostního izoenzymu (Archer et Taylor, 1996). Dalšími příčinami zvýšení aktivity ALP jsou onemocnění jater, ţlučníku a ţlučových cest (Thrall et al., 2006). ALP je právě vyuţíván jako indikátor přerušení ţlučových cest (Rebar et al., 1999). Dochází pak k vzrůstu intrabiliárního tlaku, coţ vede k vyšší produkci ALP hepatocyty a snad i epiteliálními buňkami ţlučovodu. Hromadění ţluči ve ţlučových cestách má za následek solubilizaci molekul ALP připojených k membráně a jejich zvýšené uvolňování do krve. Při přerušení ţlučových cest roste aktivita ALP v krvi dříve neţ koncentrace bilirubinu (Thrall et al., 2006). Zvýšení ALP také můţe nastat buď s nebo bez souběţného zvýšení aktivity ALT (Rebar et al., 1999).

Obr. 8: Závislost aktivity ALP na věku (podle Dürr et al., 2001). S věkem sérová aktivita ALP klesá, coţ je způsobeno postupným poklesem aktivity kostního izoenzymu v průběhu růstu.

26

4. LYMESKÁ BORRELIÓZA A LEPTOSPIRÓZA U KOČKY DOMÁCÍ Lymeská borrelióza a leptospiróza patří mezi infekční zoonotická onemocnění tj. onemocnění přenášená z jednoho zvířete na druhé nebo na člověka. Existence přirozeně přenosných onemocnění závisí na nepřetrţité interakci pěti předpokladů spojených s konkrétní krajinou. Jsou to: zvířecí donor (zdroj nákazy), vektor (přenašeč), recipient (hostitel), patogenní původce (agens) v infekčním stavu a vliv faktorů vnějšího prostředí, které přispívají k neomezenému přenosu infekce z jednoho organismu do druhého (Hubálek et Rudolf, 2007).

4.1. Leptospiróza 4.1.1. Etiologie a epidemiologie Leptospiróza je nejrozšířenější zoonóza na světě (Adler et de la Peña Moctezuma, 2010). Jejím původcem je spirochetální bakterie Leptospira interrogans sensu lato. Je to tenká, vláknitá, vysoce pohyblivá bakterie o rozměrech 6 - 20 x 0,1 - 0,2 m (Obr. 9). Tvar je spirálovitý, s háčkovitým zakončením (Greene, 2006; Svoboda et Pospíšil, 1996). Buňka má typickou strukturu: cytoplazmatická membrána a buněčná stěna jsou úzce spojeny a jsou překryty vnější membránou (Cullen et al., 2004). Pohyblivost je umoţněna díky dvěma periplazmatickým bičíkům lokalizovaným v periplazmatickém prostoru (Picardeau et al., 2001). K imunologicky významným antigenům vnější membrány patří lipoproteiny LipL (leptospiral lipoprotein), zejména LipL41, a protein vnější membrány OmpL1 (outer membrane protein) (Cullen et al., 2004). Pro virulenci leptospir je klíčovým antigenem Loa22 (OmpA-Like protein of leptospira) (Ristow et al., 2007). Oblast antigenní variability a patogeneze leptospir není zcela objasněna, a proto je v poslední době intenzivně zkoumána. V rámci komplexu Leptospira interrogans sensu lato dnes rozlišujeme přes 200 antigenně odlišných sérovarů, které patří do 23 sérologických skupin (Greene, 2006; Svoboda et Pospíšil, 1996). Nejméně 10 sérovarů je významných u koček a psů (Greene, 2006). Leptopspiróza u koček bývá nejčastěji způsobena sérovary Icterohaemorrhagiae, Canicola, Grippotyphosa, Pomona a Bataviae (Nelson et al., 2003; Songer et Post, 2005).

27

Obr. 9: Leptospira spp. Fotografie ze skenovacího elektronového mikroskopu. (Adler et de la Peña Moctezuma, 2010). Leptospiróza je nebezpečná zoonóza s přírodní ohniskovostí. Přirozený zdroj nákazy v prostředí se označuje termínem rezervoár (Greene, 2006). Rozšíření rezervoárového druhu pak udává i ohnisko tohoto sérovaru. Hlavním rezervoárem sérovaru Icterohaemorrhagiae jsou potkani, kteří jsou svým výskytem vázáni na lidskou společnost. Leptospiry jsou na svého hostitele adaptovány, aniţ by potkan klinicky váţněji onemocněl. Potkan vylučuje leptospiry ve velké míře močí, coţ napomáhá udrţování nákazy v ohnisku. Kdyţ pak leptospiry infikují hostitele, jenţ na ně není adaptován, propuká u něj infekce, která můţe mít váţný klinický průběh. Dalším významným sérovarem je Grippotyphosa, jejímţ hlavním rezervoárem jsou hraboši, zejména hraboš polní. Ohniskem je tedy především zemědělská krajina, ale i trávníky na sídlištích. I u dalších sérovarů je důleţitá vazba na rezervoárové hostitele z řad drobných savců, především hmyzoţravců a hlodavců (Svoboda et Pospíšil, 1996). Vhodným prostředím pro přeţívání leptospir jsou stojaté nebo mírně tekoucí vody. Mohou přeţívat několik měsíců i ve vlhké půdě, kde však musí být neutrální nebo mírně zásadité pH (Greene, 2006). Leptospiry jsou odolné vůči nízké teplotě, jsou však citlivé na vysychání, UV záření a znečištění prostředí. Nejvyšší riziko nákazy je koncem léta a na podzim, kdy dochází k pomnoţení rezervoárových hostitelů a kdy je také ideální teplota a pH v prostředí. Onemocnění je rozšířeno po celém světě, nejvíce však v teplých a vlhkých oblastech, a v místech s častými sráţkami nebo záplavami. Leptospiróza se přenáší přímým kontaktem s infikovanými ţivočichy, jejich močí, skrz poranění, nebo při ulovení a pozření rezervoárového hostitele, coţ je u koček velmi časté (Greene, 2006; Svoboda et Pospíšil, 1996). Zejména ty kočky, co se pohybují venku, mohou přijít do styku s močí jak divokých zvířat, tak i infikovaných psů ve svém okolí (Songer et Post, 2005). Všecky sekrety a exkrety infikovaných zvířat mohou být zdrojem nákazy (Fox et al., 2002). Přenos je moţný i transplacentárně, pohlavními cestami nebo mlékem při kojení. Ačkoli existují důkazy o tom, ţe spirochety krátkodobě přeţívají ve hmyzu a jiných bezobratlých, úloha členovců jako vektorů není dosud objasněna. K nepřímé nákaze nejčastěji dochází při pití vody 28

z louţí kontaminovaných močí infikovaných hlodavců, dále půdou, krmivem nebo vegetací (Greene, 2006; Svoboda et Pospíšil, 1996). Co se týče rizika pro chovatele koček, u lidí nebyla popsána nákaza způsobena kontaktem s kočkou (Brown et al., 2005). 4.1.2. Patogeneze a klinické projevy onemocnění Leptospiry aktivně pronikají do hostitele neporušenými mukozními membránami úst, očí, nosu, nebo v místě zraněné nebo vodou změkčené kůţe (Greene, 2006). V krvi se leptospiry objevují 4. - 12. den po infekci (Svoboda et Pospíšil, 1996) a rychle se zde mnoţí. Během několika dní se šíří se do mnoha tkání, především ledvin, jater, sleziny, centrální nervové soustavy, očí a pohlavního traktu. Stupeň poškození orgánů je závislý na virulenci a dávce příslušného agens, a také na náchylnosti hostitele (Greene, 2006). K faktorům patogenity patří u leptospir hemolyziny, lipázy a toxiny způsobující nekrózu tkání (Svoboda et Pospíšil, 1996). U většiny zvířat leptospiry osídlují ledviny, kde se mnoţí zejména v epitelu proximálních tubulů (Birchard et Sherding, 2006). Od 7. – 8. dne nákazy se leptospiry objevují v moči nakaţeného jedince. Močí mohou být vylučovány aţ 4 roky (Svoboda et Pospíšil, 2006). Leptospiry penetrují renální kapiláry a vstupují do intersticia. Poškození endotelu malých cév v ledvinách pak můţe vést k ischemii. Navíc lipopolysacharid z leptospir stimuluje adhezi neutrofilů a aktivaci destiček, coţ můţe přispět k zánětlivým a koagulačním abnormalitám (Greene, 2006). Právě v renálních tubulech, ale také v očích a centrální nervové soustavě, unikají leptospiry imunitnímu systému hostitele (Svoboda et Pospíšil, 2006). Leptospiry zde mohou přeţívat roky (Songer et Post, 2005). Jaký mechanizmus umoţňuje leptospirám přeţívat např. renálních tubulech, není stále zcela objasněno. Předpokládá se sníţená exprese specifických povrchových antigenů nebo absence komplementu (Monahan et al., 2009). V játrech leptospiry způsobují akutní zánět jater s intrahepatální cholestází či nekrózu hepatocytů. Leptospiry mimo to poškozují také mozkové pleny, oči, srdce, plíce a gastrointestinální systém (Svoboda et Pospíšil, 1996). Narušení placenty můţe způsobit potrat nebo narození slabých mláďat (Songer et Post, 2005). V klinickém obraze můţeme pozorovat řadu změn. Hematologickým vyšetřením se prokazuje neutrofilie s velkým mnoţstvím neutrofilních tyčí, a také leukocytóza (Greene, 2006). V pozdějších stadiích se objevuje i lymfocytóza. Biochemické vyšetření poukazuje na onemocnění jater (Birchard et Sherding, 2006; Svoboda et Pospíšil, 1996). Velmi vysokých hodnot můţe dosahovat hladina bilirubinu (200 - 300 mol/l), přičemţ převládá konjugovaný bilirubin. Co se týče jaterních enzymů, nejnápadnějšího vzrůstu aktivity dosahuje ALP. ALT se výrazně nezvyšuje, maximálně do 10 kat/l. Stoupá i aktivita dalších enzymů v důsledku poškození orgánů. 29

Většina leptospirálních infekcí u koček však probíhá subklinicky, i kdyţ dochází k histologickým změnám v ledvinách a játrech. Kočky vylučují leptospiry močí (Svoboda et Pospíšil, 1996). Z klinických forem onemocnění se nejčastěji uvádí horečka, ţloutenka nebo zhoršení celkového zdravotního stavu (Horzinek et al., 2003). Ve výzkumu, který provedli Agunloye et al. (1996) byl nejčastěji pozorovaným klinickým znakem ascites (hromadění tekutiny v břišní dutině).

4.2. Lymeská borrelióza 4.2.1. Etiologie a epidemiologie Borrelióza je nejběţnější klíšťaty přenášené infekční onemocnění na severní polokouli (Aberer, 2007). Má charakter přírodně ohniskové nákazy. Geografické rozšíření zahrnuje především Evropu, Severní Ameriku a Východní Asii. Původcem onemocnění je gramnegativní spirochetální bakterie Borrelia burgdorferi sensu lato. Dosahuje délky 7 - 20 m a průměru 0,2 0,3 m (Svoboda et Pospíšil, 1996). Dlouhá vláknitá struktura této bakterie umoţňuje pohyblivost v prostředí o vysoké viskozitě jako je extracelulární matrix nebo kůţe (Shaw et Day, 2005).

Buňka

borrelie

(Obr.

10)

je

tvořena

protoplazmatickým

válcem

krytým

protoplazmatickou membránou. K ní přiléhá buněčná stěna, nad níţ je periplazmatický prostor. Povrch

buňky

pokrývá

vnější

membrána

(Rosa

et al., 2005). V terminální

části

protoplazmatického válce je lokalizováno 7 - 12 osových bičíků, díky nimţ je bakterie vysoce pohyblivá (Bojar, 1996; Svoboda et Pospíšil, 1996). Z hlediska antigenní variability hrají hlavní roli proteiny vnější membrány (outer surface proteins – Osp). Nejvýznamnější z nich jsou OspA a OspC (Schaechter et al., 1999). Tato variabilita umoţňuje borrelii překonat hostitelův imunitní systém a způsobit perzistentní infekci (Birchard et Sherding, 2006). Taktéţ hlavní komponenta bakteriálního bičíku, flagellin, je vysoce imunogenní (Shaw et Day, 2005).

30

Obr. 10: Struktura a morfologie buňky borrelie (upraveno podle Rosa et al., 2005). Fotografie ze a) skenovacího a a) transmisního elektronového mikroskopu. c) Schéma spirochetální buňky. V terminální části protoplazmatického válce jsou lokalizovány bičíky, jejichţ svazky se vinou okolo protoplazmatického válce. d) Detailní schéma bičíku. Bičík je včleněn do cytoplazmatické membrány a prochází buněčnou stěnou do periplazmatického prostoru.

31

Z veterinárního a medicínského hlediska mají význam 3 genospecie komplexu Borrelia burgdorferi sensu lato: Borrelia burdorferi sensu stricto, B. garinii a B. afzelii (Greene, 2006; Svoboda et Pospíšil, 1996). Krevsající způsob ţivota činí mnoho členovců důleţitým vektory infekčních nemocí kočky (Shaw et Day, 2005). Borrelie byly zjištěny u 13 druhů roztočů, 15 druhů dvoukřídlých a 2 druhů blech. Hlavním vektorem jsou ale klíšťata (Ixodidae), konkrétně v Evropě Ixodes ricinus a Ixodes persulcatus (Greene, 2006; Svoboda et Pospíšil, 1996). Kočky bývají při volném pohybu v biotopech klíšťat napadeny především na jaře, kdy začnou být tito členovci aktivní, dále v pozdním létě a na podzim. Larvy a nymfy se vyskytují na kočkách vzácně. Jsou napadeny převáţně dospělými samičkami, s místem přisátí na hlavě, krku, šíji nebo hrudi (Horzinek et al., 2003). Kočka bývá nejčastěji nakaţena borreliemi z klíštěte, které se ţivilo během larválního vývoje na infikovaném hlodavci (Shaw et Day, 2005). Infikované kočky nemohou přímo nakazit člověka. Můţou ale přinést infikované klíště do domácnosti, ale je nepravděpodobné, ţe by bylo zdrojem infekce u člověka (Birchard et Sherding, 2006; Brown et al., 2005). K nákaze ale můţe dojít při nevhodném odstraňování přisátého klíštěte z kočky, kdy člověk přijde do přímého kontaktu s klíštětem (Rabinowitz et al., 2007). Rezervoárem onemocnění mohou být různé druhy volně ţijících obratlovců. Infekce byla popsána asi u 31 druhů volně ţijících drobných savců, z domácích zvířat u psů, koček, skotu, ovcí a koní. Není dostatečně prostudováno, jak se domácí zvířata podílejí na šíření infekce (Svoboda et Pospíšil, 1996). Také ptáci jsou významným rezervoárem, zejména migrující druhy, které mohou šířit patogeny na velké vzdálenosti (Birchard et Sherding, 2006). Infikovaná zvířata vylučují borrelie různými sekrety a exkrety (Svoboda et Pospíšil, 1996). V tomhle ohledu se kočky nejeví jako hrozba přenosu pro člověka, protoţe nevylučují borrelie v moči ve značném mnoţství (Greene, 2006).

4.2.2. Patogeneze a klinické projevy onemocnění Borrelie jsou adaptované na přenos členovci. Spirocheta vyţaduje 24 - 48 hodin pro přenos z klíštěte do hostitele (Colville et Berryhill, 2007). Během této doby se bakterie v klíštěti namnoţí, proniká přes střevní epitel do hemolymfy, diseminuje do slinných ţláz, odkud slinami infikuje hostitele. OspA exprimovaný na vnějším povrchu borrelie umoţňuje její adhezi k epiteliálním buňkám střeva. Během příjmu a trávení krve, dochází ke sníţené expresi OspA a zvýšené expresi OspC (Greene, 2006; Shaw et Day, 2005). Tato změna je zčásti podmíněna právě přísunem krve a její teplotou (Schwan et al., 1995). Zvýšená exprese OspC koreluje s migrací borrelie ze střeva hemolymfou do slinných ţláz. OspC usnadňuje adhezi k buňkám

32

ţlázy a také ke tkáni hostitele, uplatňuje se tedy v počáteční fázi infekce hostitele. Borrelie se mnoţí v kůţi na místě napadení klíštětem a odsud se šíří do okolních tkání kůţí, krví nebo lymfou (Greene, 2006; Schaechter et al., 1999). Schopnost narušit extracelulární matrix přispívá k šíření ve tkáních (Aberer, 2007). Borrelie nevyţadují dostatek ţeleza, coţ je moţná adaptace na jejich lokalizaci v pojivové tkáni, kde je omezený přístup krve (Shaw et Day, 2005). Borrelie jsou eliminovány fagocyty a komplementem (Colville et Berryhill, 2007). Co se týče specifické imunity, nejdříve se rozvíjí tvorba protilátek třídy IgM indukovaná především bičíkovými antigeny, později se začnou tvořit protilátky třídy IgG, jejichţ hladina přetrvává po řadu měsíců (Bojar, 1996). Spirochety se však mohou vyhýbat imunitnímu systému dlouhou dobu, a to v kůţi, kloubech, pojivové a nervové tkáni (Greene, 2006). Hlavní ochranný mechanizmus borrelií spočívá v interakci mezi různými membránovými proteiny borrelií (adheziny) a strukturami v extracelulární matrix. Mezi tyto adheziny patří Dbp A (decorinbinding protein) a proteiny, co váţou např. glykosaminoglykan nebo fibronektin. Konkrétně v kloubech a kůţi borrelie adherují na proteoglykan decorin, který je zde ve velké míře exprimován (Liang et al., 2004). Studie ukazují, ţe borrelie jsou schopné modifikovat i svůj kompletní tvar. Za nepříznivých podmínek dokáţou během minut změnit svůj tvar na kulatý. Mohou tak přeţívat několik dní a do své původní podoby se navrátí se zlepšením podmínek. U koček byla popsána přirozeně i experimentálně indukovaná borrelióza (Greene, 2006). Např. Shaw et Day (2005) uvádí, ţe experimentálně infikované kočky měly lymfocytózu a eozinofilii. Magnarelli et al. (1990) v klinické studii 30 přirozeně infikovaných koček pozorovali u 24 % zvířat onemocnění kloubů nebo končetin a u 22 % koček nechutenství, horečku nebo únavu, ale chyběly známky postiţení končetin. Colville et Berryhill (2007) také zmiňují, ţe se u koček můţe objevit kulhání, horečka nebo anorexie. Horzinek et al. (2003) však upozorňuje, ţe tyto klinické příznaky nelze u kočky s jistotou spojovat s touto nákazou. Většina autorů pak uvádí, ţe u koček probíhá borrelióza bez klinických příznaků (Burgess, 1992; Greene, 2006; Shaw et Day, 2005). Hematologické vyšetření nepřináší ţádné odchylky od referenčních hodnot. Mohou se vyskytovat nekrotická loţiska v játrech, srdci a ledvinách, pravděpodobně v důsledku proliferativní zánětlivé reakce (Svoboda et Pospíšil, 1996).

33

5. CÍLE DIPLOMOVÉ PRÁCE  U

sledovaných

souborů

zvířat

zhodnotit

míru

výskytu

antiborreliových

a antileptospirových protilátek a srovnat ji mezi jednotlivými soubory  Stanovit a vyhodnotit následující hematologické (z čerstvé krve) a biochemické (ze séra) parametry krve koček: 1. Počet erytrocytů 2. Sedimentace krve 3. Hematokrit 4. Koncentrace hemoglobinu 5. Počet leukocytů 6. Krevní diferenciál leukocytů 7. Aktivita alaninaminotransferázy 8. Aktivita alkalické fosfatázy 9. Celkový bilirubin 10. Antiborreliové protilátky třídy IgM a IgG 11. Antileptospirové protilátky  Porovnat výsledné hodnoty měřených parametrů mezi sledovanými soubory zvířat  Zjistit, zda pozitivita na antiborreliové a antileptospirové protilátky má vliv na měřené parametry  Srovnat získané výsledky měření hematologických a biochemických parametrů s referenčními hodnotami uváděnými v literatuře

34

6. MATERIÁL A METODY 6.1. Biologický materiál  Čerstvá kočičí krev a) Zvířata odchycená Městskou policií ČR za účelem kastrace b) Zvířata z útulku Tibet (Marefy u Bučovic) za účelem testování na FIV a FeLV (FIV= virus kočičí imunodeficience, FeLV= virus kočičí leukémie) Krev byla odebrána z vena jugularis v případě koček z útulku, a z vena ceplhalica u odchycených koček. Nesráţlivá krev byla odebírána do zkumavek s definovaným mnoţstvím EDTA zabraňujícím sráţení a zpracována do dvou hodin po odběru.  Kočičí sérum Z jiţ jmenovaných souborů zvířat byla také zvlášť odebrána sráţlivá krev do zkumavek s obsahem granul urychlujících sráţení. Tyto zkumavky byly převezeny na Oddělení fyziologie a imunologie ţivočichů, kde byla krev skladována nejméně dvě hodiny v chladu. Séra byla poté získána centrifugací (1500 ot/min/30 min) a zamraţena při -20 °C. Největší část vzorků sér byla získána od kočičích pacientů Kliniky malých zvířat VFU, tyto byly jiţ dodávány zamraţené. Vzorky byly zamraţeny maximálně po dobu 6 měsíců, poté zpracovány.

6.2. Pouţité chemikálie Byly pouţity běţné chemikálie ze skladu Masarykovy univerzity.

6.3. Technická zařízení 

Destičkový spektrofotometr Sunrise (Tecan, Švýcarsko)



Destičkový spektrofotometr Rainbow reader (Schoeller instruments, s.r.o., Německo)



Spektrofotometr Spekol 21 (Carl Zeiss Jena, Německo)



Termostat Brutschrank (Melag, Německo)



Hematokritová centrifuga (Hettich, Německo)



Mikrotitrační destičky (Merci, Brno)



Hemometr (Marienfeld, Německo) 35



Běţné laboratorní vybavení

6.4. Metody 6.4.1. Stanovení počtu erytrocytů v Bürkerove komůrce Reagencie: Hayemův roztok:

chlorid rtuťnatý 0,5 g chlorid sodný 1g síran sodný 5g doplněno destilovanou vodou do 200 ml

Postup: Pro počítání erytrocytů bylo třeba čerstvou krev 200 krát naředit: -

Do zkumavky bylo napipetováno 3980 l Hayemova roztoku

-

Bylo přidáno 20 l krve a řádně promícháno

-

Bürkerova komůrka byla naplněna zředěnou krví přiloţením pipety z boku tak, aby se dokonale a rovnoměrně překrylo celé počítací pole. Zbroušené krycí sklíčko musí pevně přiléhat na postranní nosné plochy, aby mezi ním a podloţním sklem vznikla štěrbina o dané velikosti (0,1 mm)

-

Erytrocyty byly počítány ve 20 obdélnících

Výpočet: Výpočet byl proveden podle následujícího vzorce: Počet erytrocytů v 1 l krve = p . č . h . z / y p = počet napočítaných buněk č = reciproká hodnota plochy políčka (100) h = reciproká hodnota výšky komůrky (10) z = zředění (200) y = počet políček, ve kterých se počítalo (20)

6.4.2. Stanovení sedimentace krve Z důvodu pomalu sedimentujících kočičích erytrocytů je k měření vhodná šikmá poloha kapiláry (Durr et al., 2001).

36

Postup: -

Heparinizovaná kapilára o objemu 60 µl byla naplněna do 4/5 krví a zatavena nad kahanem

-

Kapilára byla postavena do stojánku o sklonu 45°

-

Po

10

minutách

byla

odečítána

hematokritovým

měřičem

výška

sloupečku

sedimentovaných krvinek ku sloupečku celé krve -

Výsledek se uvádí v procentech

6.4.3. Stanovení hematokritu Pro stanovení hematokritu byla pouţita metoda mikrohematokritová.

Postup: -

Heparinizovaná kapilára o objemu 60 µl byla naplněna do 4/5 krví a zatavena nad kahanem

-

Centrifugace 3 minuty při 12 000 ot/min

-

Na hematokritovém měřiči byla odečtena výsledná hodnota v procentech

6.4.4. Stanovení koncentrace hemoglobinu Princip: Mnoţství hemoglobinu bylo stanoveno kolorimetricky měřením intenzity absorbance, která je přímo úměrná koncentraci hemoglobinu. Barva oxygenovaného či deoxygenovaného hemoglobinu není stabilní, mění se podle nasycení kyslíkem. Proto je nutné převést veškerý hemoglobin na stabilní barevnou formu jeho oxidací (URL 8). Přidání kyseliny chlorovodíkové (HCl) ke vzorku krve způsobí hemolýzu a uvolněný hemoglobin oxiduje na barevně stálý kyselý hematin (chlorhemin) hnědé barvy (Bičík, 1992).

Reagencie: 0,1 M roztok HCl (8,6 ml 36 % HCl do 1000 ml deionizované vody) a) Spektrofotometrické stanovení Postup: -

Do zkumavky s 2,25 ml 0,1 M HCl bylo přidáno 10 l nesráţlivé krve

37

-

Po promíchání a po 30 minutách byla měřena absorbance proti blanku (0,1 M HCl) při 530 nm na spektrofotometru Spekol 21 (Carl Zeiss Jena, Německo) b) Sahliho kolorimetrická metoda Pro stanovení koncentrace hemoglobinu byl pouţit vizuální zřeďovací kolorimetr –

Sahliho hemometr (Marienfeld, Německo).

Postup: -

Do měřící zkumavky v hemometru bylo napipetováno 0,1 M HCl po značku 2 na stupnici

-

Hematologickou mikropipetou bylo přidáno 20 μl krve

-

Mikropipeta byla propláchnuta opakovaným nasáváním a vypouštěním kyseliny ve zkumavce

-

Po uplynutí 3 minut byla po kapkách přidávána pipetou destilovaná vodu tak dlouho, aţ se barva roztoku ve zkumavce shodovala s barvou skleněných standard

-

Výška hladiny roztoku ve zkumavce udává na stupnici mnoţství hemoglobinu v gramech ve 100 ml krve

U všech vzorků krve byla změřena absorbance na spektrofotometru, která byla hodnocena pomocí kalibrační křivky (Obr. 11) sestavené pomocí Sahliho metody.

Obr. 11: Závislost absorbance hemoglobinu na jeho koncentraci Nutno podotknout, ţe Sahliho metoda je pouze orientační a při subjektivním posuzování zabarvení hematinu a standard je moţná chyba výsledku aţ ± 10 % (Bičík, 1992).

38

6.4.5. Stanovení počtu leukocytů v Bürkerove komůrce Reagencie: Türckův roztok:

1 ml ledové kyseliny octové 1 ml 1 % roztoku gentiánové violeti Doplnit 100 ml destilované H2O

Erytrocyty podléhají hemolýze, dochází ke zviditelnění leukocytů díky gentiánové violeti, která barví jejich jádra (Bičík, 1992).

Postup: Pro počítání leukocytů byla třeba krev 20 krát ředit: -

Do 380 l Türckova roztoku bylo napipetováno 20 l krve a řádně promícháno

-

Bürkerova komůrka byla naplněna zředěnou krví

-

Buňky byly počítány v 50 velkých čtvercích

Výpočet: Výpočet byl proveden podle následujícího vzorce: Počet leukocytů v 1 l krve = p . č . h . z / y p = počet napočítaných buněk č = reciproká hodnota plochy políčka (25) h = reciproká hodnota výšky komůrky (10) z = zředění (20) y = počet políček, ve kterých jsme počítali (50)

6.4.6. Krevní diferenciál leukocytů Krevní diferenciál leukocytů vyjadřuje procentuální zastoupení leukocytů v krvi. S jeho pomocí byl pak vypočítán celkový počet jednotlivých druhů leukocytů.

Postup: Z čerstvé krve byl zhotoven krevní nátěr. Po zaschnutí byly nátěry obarveny pomocí soupravy Leukodif (Erba Lachema, Brno). Oschlá sklíčka byla pozorována pod optickým mikroskopem s imerzí. U nátěru bylo hodnoceno 100 buněk a z nich vypočteno procentuální zastoupení jednotlivých druhu leukocytů.

39

6.4.7. Katalytická koncentrace alaninaminotransferázy (ALT) Pro analýzu byla pouţita souprava BIO-LA-TEST® ALT-UV 1000 P (Erba Lachema, Brno). Jedná se o soupravu činidel pro přípravu 10x 100 ml (ALT-UV 1000 P) pracovního roztoku ke stanovení katalytické koncentrace ALT v séru či plazmě v UV oblasti.

Princip metody: V séru je v různé míře přítomen ALT apo i holoenzym. K získání maximální transferázové aktivity musí být stanoveny obě formy enzymu, proto je do reakce přidán koenzym pyridoxal-5-fosfát. Z inaktivního apoenzymu tak vzniká kompletní holoenzym (Kaneko et al., 1997). 1. krok: Alaninaminotransferáza obsaţená v séru katalyzuje přeměnu alaninu na pyruvát L-alanin + oxoglutarát  pyruvát + L-glutamát Produkt nebyl měřen přímo, to je učiněno v druhé reakci, která zahrnuje konverzi NADH na NAD+. Dochází tedy ke spřaţení transaminázové reakce s dehydrogenázovou. 2. krok: Redukce pyruvátu na laktát prostřednictvím laktátdehydrogenázy Do reakce přidán NADH, který se současně oxiduje na NAD+ Pyruvát + NADH + H+  laktát + NAD+ NADH postupně ubývá, dochází tak k poklesu absorbance. Stanovení bylo provedeno kontinuální spektrofotometrií, kdy byla měřena změna absorbance při 340 nm. (Kaneko et al., 2007, Schneiderka et al., 2004). Katalytická koncentrace ALT je úměrná poklesu absorbance. Činidla: 1. Enzym - NADH LD  2,5 kat NADH  21,6 mol/lahvička 2. Startér 2-oxoglutarát: 180 mmol/l Azid sodný: 0,1 % 3. Pufr – substrát 40

Tris: 120 mmol/l L-alanin: 800 mmol/l Azid sodný: 0,1 % 4. Aktivátor Pyridoxal-5-fosfát: 6 mol/tableta Sloţení inkubační směsi: Trisový pufr, pH 7,2 (37 °C): 100 mmol/l L-alanin: 660 mmol/l Laktátdehydrogenáza (LD):  25 kat/l NADH:  180 mol/l 2-oxoglutarát: 15 mmol/l Pyridoxal-5-fosfát: 100 mol/l Objemový poměr sérum/inkubační směs: 1/12 Příprava pracovního roztoku: Obsah lahvičky s činidlem 1 byl rozpuštěn ve 100 ml roztoku činidla 3. Po rozpuštění byly přidány 2 tablety činidla 4.

Kalibrace: Ke kalibraci byl pouţit BIO-LA-TEST® LYONORM KALIBRÁTOR (Erba Lachema, Brno)

Postup: Nehemolytické sérum, pracovní roztok a činidlo 2 byly pipetovány dle schématu na mikrotitrační destičku. K měření aktivity ALT byl pouţit spektrofotometr Rainbow reader (Schoeller instruments, s.r.o., Německo)

Schéma pipetování na destičku:

pracovní roztok

100 l

sérum

10 l

promíchá se a inkubuje 10 minut při 37 °C a přidá se: 10 l

činidlo 2

41

Po promíchání byla destička inkubována 2 minuty při 37 °C. Poté byla měřena absorbance při 340 nm v 1 minutových intervalech po dobu 3 minut. Byla vypočtena průměrná změna absorbance za 1 min (A). Výpočet: ALT (kat/l)= (A) x 31,7

6.4.8. Katalytická koncentrace alkalické fosfatázy (ALP) Pro

provedení

metody

byla

pouţita

souprava

BIO-LA-TEST®

ALKALICKÁ

FOSFATASA AMP LIQUID 500 (Erba Lachema, Brno). Jedná se o soupravu činidel pro stanovení katalytické koncentrace alkalické fosfatázy v séru či plazmě.

Princip metody: Alkalická fosfatáza štěpí v alkalickém prostředí substrát 4-nitrofenylfosfát na ţlutý 4nitrofenol a fosfát. Mírou katalytické koncentrace enzymu je mnoţství uvolněného 4 -nitrofenolu, který se stanovuje fotometricky kinetickým postupem (Schneiderka et al., 2004). 4-nitrofenylfosfát → 4-nitrofenol + fosfát Činidla: R1 pufr 2-amino-2-metyl-1-propanol, pH 10,4 (30 °C): 434 mmol/l Octan hořečnatý: 2,48 mmol/l Síran zinečnatý: 1,24 mmol/l HEDTA: 2,48 mmol/l R2 substrát 4-nitrofenylfosfát: 81,6 mmol/l Sloţení reakční směsi: 2-amino-2-metyl-1-propanol, pH 10,4 (30 °C): 350 mmol/l Octan hořečnatý: 2 mmol/l Síran zinečnatý: 1 mmol /l HEDTA: 2 mmol/l 4-nitrofenylfosfát: 16 mmol/l 42

Příprava pracovního roztoku: 4 díly činidla R1 byly smíchány s 1 dílem činidla R2

Kalibrace Ke kalibraci byl pouţit BIO-LA-TEST® LYONORM KALIBRÁTOR (Erba Lachema, Brno)

Postup: Byla pouţita jednoreagenční metoda, kdy se reakce startuje přidáním vzorku (sérum): Na mikrotitrační destičku byl pipetován reagenční blank, kalibrátor a nehemolytické sérum dle schématu. Postup pipetování na destičku: reagenční blank kalibrátor pracovní roztok

250 l

250 l

250 l 5 l

vzorek 5 l

kalibrátor destilovaná voda

vzorek

5 l

Po promíchání byla destička inkubována 1 minutu při 37 °C. Poté byla měřena absorbance vzorku a kalibrátoru proti reagenčnímu blanku v jednominutových intervalech po dobu 3 minut při 420 nm. Byla vypočtena průměrná změna absorbance za 1 minutu (A/min). Výpočet ALP (kat/l)= (Avz/min)/ (Akal/min) x Ckal

6.4.9. Celkový bilirubin Pro stanovení byla pouţita souprava BIO-LA-TEST® BILIRUBIN CELKOVÝ LIQUID 350 (Erba Lachema, Brno). Jedná se o soupravu činidel pro stanovení celkového bilirubinu v séru či plazmě dle Jendrassik-Grófa v modifikaci vhodné pro pouţití na automatických analyzátorech.

43

Princip metody: Konjugovaný bilirubin reaguje rychle, reakce nekonjugovaného bilirubinu je urychlena přídavkem akcelerátorů (směs kofeinu a benzoanu sodného), které uvolní bilirubin z vazby na albumin. Bilirubin (volný a přímý) pak v kopulační reakci s diazotovanou kyselinou sulfanilovou v silně kyselém prostředí dává vzniku červeně zbarvenému azobilirubinu, který se stanovuje fotometricky (Schneiderka et al., 2004). Činidla: R1

Činidlo 1 (akcelerátor): Benzoan sodný: 387 mmol/l Chelaton 3: 2,7 mmol/l Kofein: 192 mmol/l Octan sodný: 680 mmol/

R2

Činidlo 2: Kyselina chlorovodíková:  170 mmol/l Kyselina sulfanilová: 29 mmol/l

R3

Činidlo 3: Dusitan sodný: 0,48 mmol/l

Sloţení reakční směsi: Benzoan sodný: 285,1 mmol/l Chelaton 3: 2 mmol/l Kofein: 141,8 mmol/l Octan sodný: 501,4 mmol/l Kyselina chlorovodíková:  37,7 mmol/l Kyselina sulfanilová: 5,9 mmol/l Dusitan sodný: 0,48 mmol/l Příprava pracovního činidla: Pracovní roztok byl připraven smícháním činidel R2 v poměru 31 + 1

44

Kalibrace: Ke kalibraci byl pouţit BIO-LA-TEST® LYONORM KALIBRÁTOR (Erba Lachema, Brno)

Postup: Na mikrotitrační destičku bylo dle schématu pipetováno činidlo R1, nehemolytické sérum a standard. Jako standard slouţil kalibrátor. Postup pipetování na destičku:

Činidlo R1

blank vzorku

vzorek

blank standardu

standard

l

l

l

l

l

l

Vzorek Standard

l

l

Ihned se promíchá a po 5 minutách stání ve tmě se přidá: l

Pracovní činidlo činidlo R2

l

l l

Promíchá se a po 5 minutách stání ve tmě byla změřena absorbance blanku vzorku A1, absorbance vzorku A2, absorbance blanku standardu A3 a absorbance standardu A4 proti reagenčnímu blanku při vlnové délce 546 nm. Výpočet: Bilirubin (mol/l) = (A2 - A1)/( A4 - A3) x Cst Cst = koncentrace standardu (kalibrátoru)

Následující metoda ELISA byla zčásti prakticky vypracována Mgr. Pavlínou Opatovou v rámci její diplomové práce. Velký podíl na provedení metody má doc. RNDr. Alena Ţákovská, Ph.D. Metodu mikroskopického aglutinačního testu prováděl Prof. MVDr. František Treml CSc. Pro vypracování předkládané diplomové práce byly pouţity právě výsledky těchto metod.

45

6.4.10.

Detekce specifických protilátek proti B. burgorferi s. l. metodou ELISA

Nejpouţívanější imunologická metoda slouţící k detekci protilátek a antigenů se nazývá ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). Patří mezi techniky EIA (enzyme immunoassay), konkrétně mezi heterogenní EIA, jejichţ podstatou je oddělení volného značeného reaktantu od značeného reaktantu vázaného s protilátkou (Mančal, 1987). K průkazu specifických protilátek a antigenů slouţí široké spektrum různých modifikací ELISA. Pro detekci specifických protilátek proti Borrelia burgdorferi s. l. byla pouţita nepřímá sendvičová ELISA. Podstatou bylo stanovení specifických protilátek IgM a IgG proti borreliovým antigenům B. afzelii, B. garinii, B. burgdorferi s. s. v kočičím séru. Obecné kroky metody ELISA (Crowther, 2001; Mančal, 1987): 

Imobilizace antigenu na pevnou fázi - antigen je pasivně adsorbován na imunosorbční povrch – nosič. Tento proces adsorpce se nazývá coating – koutování. Jako nosič se pouţívají nejčastěji jamky mikrotitračních destiček



Promývání – slouţí k oddělení vázaných od nenavázaných reaktantů. Promývá se zpravidla třikrát



Blokování – slouţí k eliminaci nespecifických vazeb mezi proteiny a volnými vazebnými místy na destičce



Přidání konjugátu – specifická protilátka s vhodným navázaným enzymem



Přidání substrátu – reaguje s konjugátem a v přítomnosti vhodného chromogenu vytváří barevnou reakci



Zastavení reakce – reakce je zastavena přidáním silné kyseliny či zásady v době, kdy se vztah enzym-substrát nachází v lineární fázi



6.4.11.

Intenzity barevné reakce je měřena na spektrofotometru

Mikroskopický aglutinační test (MAT)

Mikroskopický aglutinační test k detekci specifických protilátek proti L. interrogans s. l. ve vzorku (nejčastěji krevního séra) je standardní a zároveň nejpouţívanější metodou k nepřímému průkazu leptospir. Metodou MAT mohou být stanoveny specifické protilátky proti konkrétnímu sérovaru L. interrogans s. l. MAT je jednoduchá metoda zaloţená na smíchání testovaného séra s kulturou leptospir a následném hodnocení stupně aglutinace v temném poli

46

mikroskopu. Jako pozitivní je označován vzorek, ve kterém došlo k aglutinaci více neţ 50 % leptospir (Greene, 2006; Terpstra, 2003).

47

7. VÝSLEDKY Výsledky byly rozděleny dle souborů zvířat, tedy na kočičí pacienty z veterinární kliniky, na kočky umístěné v útulku a na zvířata odchycená na ulici. Před hodnocením výsledků je třeba upozornit na některé skutečnosti: 

Ne ke všem měřeným hematologickým či biochemickým parametrům byla dostupná čerstvá krev či sérum – asi 9 % z celého počtu vzorků (např. na dané měření jiţ nezbylo)



Byly vyřazeny vzorky, které dosahovaly extrémních hodnot, z důvodu zjevné chyby při měření – asi 12 % z celého souboru



Analýza celkového bilirubinu byla zahájena aţ v průběhu výzkumu – u 45 % vzorků nebyl tento parametr stanovován → Z těchto důvodů se proto se počet fakticky měřených vzorků u jednotlivých parametrů lehce liší.

Výsledky byly statisticky hodnoceny v programu Statistica for Windows.

7.1. Výskyt antiborreliových a antileptospirových protilátek v jednotlivých souborech zvířat v závislosti na prostředí Nejdříve byla vyhodnocena míra pozitivity na antiborreliové a antileptospirové protilátky v jednotlivých souborech zvířat (Tab. 1).

Počet zvířat v souboru Antiborreliové IgM (%) Antiborreliové IgG (%) Antileptospirové Ab (%)

Útulek 43 4,7 9,3 9,3

Pacienti 256 18,0 8,2 11,3

Odchyty 58 10,3 5,2 10,3

Tab. 1: Výskyt protilátek proti borreliím a leptospirám v jednotlivých souborech zvířat V souboru pacientů veterinární kliniky je nejvyšší výskyt antiborreliových protilátek třídy IgM i antileptospirových protilátek. Nejvyšší výskyt antiborreliových protilátek třídy IgG je u koček z útulku. Pro zjištění, zda se tyto soubory statisticky liší ve výskytu pozitivních vzorků, byl pouţit Fisher exact test. Byla hodnocena míra významnosti na hladině p< 0,05.

48

Pacienti x útulek

Útulek x odchyty

Odchyty x pacienti

0,2543

0,1091

Antiborreliové IgG

0,0162 0,4981

0,3363

0,3190

Antileptospirové Ab

0,4684

0,5698

0,2876

Antiborreliové IgM

Tab. 2: Statistické významnosti rozdílů výskytu pozitivních vzorků mezi soubory zvířat. Červeně je vyznačená významnost na hladině p< 0,05

Při statistickém hodnocení (Tab. 2) bylo zjištěno, ţe ve výskytu antiborreliových protilátek třídy IgM významně liší soubory koček z veterinární kliniky a útulku.

7.2. Srovnání hematologických a biochemických parametrů v jednotlivých souborech U měřených parametrů v jednotlivých souborech bylo třeba zhodnotit, zda mezi nimi existuje statisticky významný rozdíl. Nejprve jsou uvedeny popisné statistiky kaţdé měřené veličiny (Tab. 3 – Tab. 5), a poté v souhrnné tabulce (Tab. 6) významnost rozdílů mezi těmito hodnotami. Popisné statistiky u měřených parametrů: Kočky z útulku - popisné statistiky N platných Průměr Medián Minimum Proměnná ALT (kat/l) ALP ( kat/l) Bilirubin (mol/l) Hematokrit (%) Hemoglobin (g/l) Sedimentace (%) 6 Počet erytrocytů (*10 /l) 3 Počet leukocytů (*10 /l) 3 Počet neutrofilů (*10 /l) 3 Počet lymfocytů (*10 /l) 3 Počet monocytů (*10 /l) 3 Počet eozinofilů (*10 /l) 3 Počet bazofilů (*10 /l)

37 36 32 41 41 32 41 40 38 38 38 38 38

0,3 0,7 12,7 37,4 139,2 43,5 8,9 16,1 7,7 6,5 1,0 1,0 0,0

0,2 0,6 12,0 35,5 127,8 41,7 8,3 15,0 7,2 5,6 0,8 0,7 0,0

0,0 0,2 1,2 18,0 68,1 3,4 1,1 5,8 1,8 1,1 0,0 0,0 0,0

Maximum 1,2 1,8 48,3 49,0 224,2 93,5 13,7 32,2 15,8 17,1 3,2 3,3 0,5

Tab. 3: Popisné statistiky u koček z útulku

49

Kvantil 5 0,0 0,3 1,5 29,0 90,2 6,3 5,6 6,5 2,1 1,8 0,0 0,1 0,0

Kvantil 95 1,0 1,5 28,1 48,0 210,6 92,5 12,4 27,8 15,2 14,7 3,1 2,7 0,3

Odchycené kočky - popisné statistiky N platných Průměr Medián Minimum Proměnná ALT (kat/l) ALP ( kat/l) Bilirubin (mol/l) Hematokrit (%) Hemoglobin (g/l) Sedimentace (%) 6 Počet erytrocytů (*10 /l) 3 Počet leukocytů (*10 /l) 3 Počet neutrofilů (*10 /  3 Počet lymfocytů (*10 /l) 3 Počet monocytů (*10 / l) 3 Počet eozinofilů (*10 /l) 3 Počet bazofilů (*10 /l)

56 56 47 57 57 57 57 57 53 53 53 53 53

0,2 0,6 9,3 31,5 106,7 58,6 7,3 12,6 7,4 3,9 0,6 0,7 0,0

0,2 0,5 9,7 31,5 107,7 59,0 7,9 11,2 6,9 3,5 0,4 0,6 0,0

Maximum

0,1 0,1 1,3 14,5 51,9 20,5 3,2 3,4 1,2 0,3 0,0 0,0 0,0

1,6 1,7 16,7 44,0 152,7 95,0 11,2 42,7 17,3 23,9 4,3 2,5 0,4

Kvantil 5 0,1 0,2 2,2 18,0 70,0 25,0 4,4 5,0 2,2 1,1 0,0 0,0 0,0

Kvantil 95 0,4 1,4 16,1 41,0 140,4 93,5 9,9 20,1 14,5 8,6 1,9 1,9 0,3

Tab. 4: Popisné statistiky u odchycených koček Kočky z veterinární kliniky - popisné statistiky N platných Průměr Medián Minimum Maximum Proměnná ALT (kat/l) ALP ( kat/l) Bilirubin (mol/l)

252 254 67

0,3 0,6 11,7

0,2 0,4 6,2

0,0 0,0 1,2

3,3 3,5 60,8

Kvantil 5 0,0 0,1 1,2

Kvantil 95 0,9 1,8 41,0

Tab. 5: Popisné statistiky u koček z veterinární kliniky

Statistická významnost rozdílů mezi měřenými parametry: Soubory byly porovnány Mann-Whitney testem na hladině významnosti p< 0,05.

ALT ALP Bilirubin Hematokrit Hemoglobin Sedimentace Počet erytrocytů Počet leukocytů Počet neutrofilů Počet lymfocytů Počer monocytů Počet eozinofilů Počet bazofilů

Útulek x odchyty

Útulek x pacienti

0,3188

0,4712

0,1061

↑ 0,0185

0,0632 ↑ 0,0002

0,062

↑ 0,00003 0,0099 ↑ ↑ 0,0033 ↑ 0,0047 0,6037 ↑ 0,0001 ↑ 0,0390 0,1204 0,9487

50

Odchyty x pacienti 0,01428 ↑ 0,5727 0,1147

Tab. 6: Statistické významnosti rozdílů mezi měřenými parametry. Červeně jsou vyznačeny statisticky významné rozdíly mezi jednotlivými soubory. Šipka ve sloupci pod daným souborem značí, ţe tento soubor dosahuje vyšších hodnot měřeného parametru (oproti srovnávanému souboru).

Z tabulky lze vyčíst, ţe kočky z útulku dosahují vyšších hodnot v aktivitě ALP oproti pacientům z veterinární kliniky. Dále kočky z útulku dosahují vyšších hodnot oproti odchyceným kočkám v hematokritu, koncentraci hemoglobinu, počtu erytrocytů, leukocytů, lymfocytů a monocytů. Odchycené kočky mají vyšší sedimentaci oproti kočkám z útulku a dosahují niţších hodnot aktivity ALT oproti pacientům veterinární kliniky.

7.3. Vliv pozitivity (co se týče sledovaných protilátek) na hematologické a biochemické parametry Naším dalším cílem bylo zjistit, zda pozitivita na antiborreliové a antileptospirové protilátky měla vliv na měřené hodnoty. Byla opět určována statistická významnost pomocí testu Mann-Whitney na hladině významnosti p< 0,05. V testu byly srovnávány výsledky všech měřených hematologických a biochemických parametrů u negativních zvířat vůči výsledkům u pozitivních zvířat. Nejdříve byl hodnocen soubor pacientů (Tab. 7). Protoţe pozitivních vzorků v souborech odchycených zvířat a zvířat z útulku je nízký počet pro statistické vyhodnocení, tyto dva soubory byly sloučeny v jeden (Tab. 8). Pacienti z veterinární kliniky

ALT ALP Bilirubin

Negativní

pozitivní na antiborreliové IgM

pozitivní na antboreliové pozitivní na antileptospirové IgG Ab

0,129 0,685 0,908

0,07 0,241 0,062

0,08 0,963 0,602

Tab. 7: Statistické významnosti mezi měřenými parametry z hlediska negativity/pozitivity Tabulka ukazuje, ţe ani v jednom z případů se neprokázala statistická významnost, lze tedy říci, ţe pozitivita na příslušné protilátky neměla na aktivitu ALT, ALP a koncentraci bilirubinu ţádný podstatný vliv.

51

Společný soubor útulek + odchyty Pouţité zkratky: ERY= erytrocyty, LEU= leukocyty, NEU= neutrofily, LYM= lymfocyty, MON= monocyty, EOZ= eozinofily, BAZ= bazofily pozitivní na antiborreliové IgM ALT ALP Bilirubin Hematokrit Sedimentace Počet ERY Počet LEU

Negativní

Hemoglobin

Počet NEU Počet LYM Počet MON Počet EOZ Počet BAZ

pozitivní na antboreliové IgG

0,129 0,685 0,908 0,815 0,899 0,205 0,219 0,762 0,807 0,287 0,785 0,792 0,605

0,070 0,241 0,062 0,035 ↑ 0,081 0,165 0,010 ↑ 0,106 0,127 0,332 0,212 0,215 0,986

pozitivní na antileptospirové Ab

0,080 0,963 0,602 0,740 0,928 0,060 0,693 0,281 0,788 0,250 0,190 0,489 0,530

Tab. 8: Statistické významnosti mezi měřenými parametry z hlediska negativity/pozitivity. Červeně jsou vyznačeny statisticky významné rozdíly, šipky značí vyšší hodnoty daného parametru u vzorků s výskytem příslušných protilátek.

Lze tabulky lze vyčíst, ţe zvířata pozitivní na antiborreliové protilátky třídy IgG měla vyšší hodnoty hematokritu a počtu erytrocytů neţ zvířata negativní. U všech ostatních měřených parametrů se neprokázala statistická významnost mezi negativními a pozitivními zvířaty.

7.4. Porovnání naměřených a referenčních hodnot Interpretace hematologických a biochemických parametrů spočívá ve srovnání s patřičnými referenčními hodnotami. Referenční hodnoty jsou hodnoty laboratorního vyšetření získané za definovaných podmínek, mezi nimiţ leţí 95 % naměřených hodnot daného souboru zdravých jedinců. Jsou ohraničeny dolní a horní mezí, mezi kterými je referenční rozmezí (Doubek et al., 2007). Všechny námi měřené parametry (s výjimkou sedimentace, u které není známo příslušné referenční rozmezí) byly v rámci hodnocení výsledků porovnány s referenčními hodnotami uvedenými v Doubek et al. (2007). 52

Pozn.: Při měření aktivity ALP je potřeba znát věk zvířete, protoţe aktivita tohoto enzymu závisí na věku. Ten však nebyl znám jak u některých negativních, tak pozitivních vzorků (celkem asi 13 % vzorků z celého souboru), a tato skutečnost se také odráţí na následném hodnocení.

7.4.1. Grafické znázornění výsledků Výsledky ze souboru koček z veterinární kliniky jsou pro velký počet vzorků (256) a nepřehlednost v podobě sloupcových grafů zobrazeny v podobě histogramů četností (Obr. 11 – 13) a tabulky (Tab. 9) s výskytem výsledků mimo referenční rozmezí i co se týče pozitivit na antiborreliové a antileptospirové protilátky. Pacienti veterinární kliniky – souhrnné výsledky:

250

Počet koček

200

150

100

50

0 -0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

Aktivita ALT (kat/l

Obr. 11: Histogram znázorňující četnost aktivit ALT v jednotlivých kategoriích. Nejvíce měřených vzorků dosahovalo aktivity ALT mezi 0 - 0,5 kat/l.

53

140 120

Počet koček

100 80 60 40 20 0 -0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

Aktivita ALP (kat/l)

Obr. 12: Histogram znázorňující četnost aktivit ALP v jednotlivých kategoriích. Nejvíce měřených vzorků dosahovalo aktivity ALP mezi 0 - 0,5 kat/l.

50 45 40

Počet koček

35 30 25 20 15 10 5 0 -10

0

10

20

30

40

50

60

70

Koncentrace bilirubinu (mol/l)

Obr. 13: Histogram znázorňující četnost koncentrace bilirubinu v jednotlivých kategoriích. Nejvíce měřených vzorků dosahovalo koncentrace bilirubinu mezi 0 - 10 mol/l.

54

Počet fakticky změřených vzorků Počet vzorků mimo referenční h. (RH) % podíl antiborreliových IgM mimo RH % podíl antiborreliových IgG mimo RH % podíl antileptospirových Ab mimo RH

ALT 252 10 2,2 0 15

ALP 254 3 0 0 0

Bilirubin 67 31 11,1 5,5 15

Tab. 9: Znázornění počtu všech/pozitivních vzorků mimo referenční rozmezí u pacientů Nejvíce vzorků pozitivních na příslušné protilátky, které leţí mimo referenční hodnoty, bylo zjištěno při měření koncentrace bilirubinu. Zde však skoro polovina naměřených výsledků leţí mimo referenční hodnoty. Kočky z útulků a odchytů: Grafy jsou rozděleny na dvě skupiny: a) s pozitivitou na protilátky proti borreliím b) s pozitivitou na protilátky proti leptospirám Legenda: hodnoty v referenčním rozmezí hodnoty mimo referenční rozmezí pozitivita na antiborreliové IgM pozitivita na antileptospirové IgG pozitivita na antileptospirové Ab

Z důvodu velkého mnoţství graficky znázorněných výsledků jsou tyto grafy (Obr. 14 – Obr. 65) součástí přílohy diplomové práce. Pro shrnutí jsou na tomto místě uvedeny tabulky (Tab. 10 – Tab. 13) znázorňující, kolik výsledků spadá mimo referenční hodnoty a podíl příslušných protilátek vyskytujících se mimo referenční rozmezí.

1. Kočky z útulku: Počet fakticky změřených vzorků Počet vzorků mimo referenční h. (RH) % podíl antiborreliových IgM mimo RH % podíl antiborreliových IgG mimo RH % podíl antileptospirových Ab mimo RH

Hematokrit Hemoglobin 41 41 8 13 0 50 75 75 25 25

ALT 37 7 0 25 25

ALP 36 0 0 0 0

Bilirubin 32 23 100 25 25

Tab. 10: Znázornění počtu všech/pozitivních vzorků mimo referenční rozmezí u koček z útulku 55

Počet fakticky změřených vzorků

Počet vzorků mimo referenční h. (RH) % podíl antiborreliových IgM mimo RH % podíl antiborreliových IgG mimo RH % podíl antileptospirových Ab mimo RH

ERY 41 16 100 75 50

LEU 40 17 100 25 75

NEU 38 8 0 25 25

LYM 38 18 100 25 100

MON 38 23 50 100 100

EOZ 38 14 0 50 50

BAZ 38 6 0 25 0

Tab. 11: Znázornění počtu všech/pozitivních vzorků mimo referenční rozmezí u koček z útulku Z tabulek lze vyčíst, ţe nejvyšší podíl vzorků pozitivních na antiborreliové protilátky třídy IgM leţících mimo referenční hodnoty byl zjištěn při měření koncentrace bilirubinu, počtu erytrocytů, leukocytů a lymfocytů. U antiborreliových protilátek třídy IgG to byly monocyty, a dále také hematokrit, koncentrace hemoglobinu a počet erytrocytů. U vzorků pozitivních na antileptospirové protilátky to byly lymfocyty, monocyty, ale také leukocyty. 2. Odchycené kočky:

Počet fakticky změřených vzorků Počet vzorků mimo referenční h. (RH) % podíl antiborreliových IgM mimo RH % podíl antiborreliových IgG mimo RH % podíl antileptospirových Ab mimo RH

Hematokrit Hemoglobin 57 57 7 6 50 0 0 0 33,3 0

ALT 56

ALP 56

Bilirubin 47

5

1

36

16,7 33,3 0

0 0 0

83,3 33,3 66,7

Tab. 12: Znázornění počtu všech/pozitivních vzorků mimo referenční rozmezí u odchycených koček

Počet fakticky změřených vzorků

Počet vzorků mimo referenční h. (RH) % podíl antiborreliových IgM mimo RH % podíl antiborreliových IgG mimo RH % podíl antileptospirových Ab mimo RH

ERY 57 11 33,3 0 33,3

LEU 57 18 66,7 66,7 50

NEU 53 21 66,7 66,7 66,7

LYM 53 8 16,7 66,7 0

MON 53 17 66,7 66,7 50

EOZ 53 17 16,7 66,7 16,7

BAZ 53 8 16,7 0 50

Tab. 13: Znázornění počtu všech/pozitivních vzorků mimo referenční rozmezí u odchycených koček U odchycených koček byl nejvyšší podíl vzorků pozitivních na antiborreliové protilátky třídy IgM leţících mimo referenční hodnoty zjištěn při měření koncentrace bilirubinu, a dále u počtu leukocytů, neutrofilů, monocytů, ale také hematokritu. U antiborreliových protilátek třídy IgG to byl počet leukocytů, neutrofilů, lymfocytů, monocytů a eozinofilů. U vzorků pozitivních

56

na antileptospirové protilátky to byla koncentrace bilirubinu, počet neutrofilů, ale také počet leukocytů, monocytů a bazofilů.

7.4.2. Shrnutí získaných výsledků:  Nejvyšší počet antiborreliových protilátek třídy IgM i antileptospirových protilátek byl zjištěn u pacientů veterinární kliniky. Nejvyšší výskyt antiborreliových protilátek třídy IgG vykazují kočky z útulku  Ve výskytu příslušných protilátek se statisticky významně se liší pouze soubory koček z veterinární kliniky a útulku, konkrétně v zastoupení antiborreliových protilátek třídy IgM  Byla zjištěna statistická významnost rozdílů mezi některými měřenými parametry v jednotlivých souborech. Kočky z útulku dosahují vyšších hodnot v aktivitě ALP oproti pacientům z veterinární kliniky. Kočky z útulku dosahují vyšších hodnot oproti odchyceným kočkám v hematokritu, koncentraci hemoglobinu, počtu erytrocytů, leukocytů, lymfocytů a monocytů. Odchycené kočky mají niţší hodnoty aktivity ALT oproti pacientům z veterinární kliniky a vyšší sedimentaci oproti kočkám z útulku  Kočky pozitivní na antiborreliové protilátky třídy IgG dosahují statisticky vyšší hodnoty hematokritu a počtu erytrocytů neţ zvířata negativní. U ostatních měřených parametrů se statistická významnost rozdílů mezi pozitivními a negativními zvířaty neprokázala  Při srovnávání výsledků s referenčními hodnotami bylo zjištěno, ţe některé měřené parametry u zvířat pozitivních na příslušné protilátky, leţí mimo referenční rozmezí, jiné však nikoli. Jednoznačné závislosti nebyly pozorovány

57

8. DISKUZE V praktické části diplomové práce byly hodnoceny tři soubory koček, a to pacienti veterinární kliniky, kočky umístěné v útulku a kočky odchycené na ulici, přičemţ kaţdý z těchto souborů má svá specifika, coţ bylo také důvodem tohoto rozdělení. Kočičí pacienti byli na veterinární klinice vyšetřováni nejčastěji z důvodu pozorovaných klinických příznaků, které mohly souviset s nákazou Lymeskou borreliózou nebo leptospirózou. Kočky z útulku ţijí ve velkém počtu na jednom místě a jsou zde vhodné podmínky pro přenos určitých patogenů. Nejrizikovější skupinou, co se týče pravděpodobnosti nákazy, jsou odchycené kočky, které mohou být z hlediska svého ţivotního stylu promořené nejrůznějšími patogeny. Tento soubor byl také specifický v tom, ţe krev byla kočkám odebírána v celkové anestezii. Celkem bylo vyšetřeno 357 vzorků koček na vybrané hematologické a biochemické parametry. U kaţdého zvířete bylo známo, zda je negativní nebo pozitivní na antiborreliové či antileptospirové protilátky. Kočky, jakoţto pacienti, mohly být na klinice vyšetřovány v rámci preventivní prohlídky, častěji však z důvodu léčby určité choroby. Ošetření koček na veterinární klinice svědčí o dobré péči majitelů o svá zvířata. Přesto byl však v tomto souboru zjištěn nejvyšší podíl vzorků pozitivních na antiborreliové protilátky třídy IgM (18 %), a také nejvíce vzorků pozitivních na antileptospirové protilátky (11,3 %). U většiny těchto koček jsme měli k dispozici informaci, zda je majitelé chovají doma, nebo mají i volný pohyb venku. Ukázalo se, ţe asi ¾ koček se pohybují jak doma tak venku, nebo jsou pouze venkovní, z toho plyne i riziko nákazy zkoumanými zoonózami. Kočky pohybující se venku mohou být začleněny do ţivotního cyklu klíštěte, které je v Evropě nejčastějším přenašečem Lymeské borreliózy (Svoboda et Pospíšil, 1996). Kočka jako predátor loví nejčastěji hlodavce, kteří jsou rezervoárem leptospirózy. Jelikoţ se toto onemocnění přenáší přímým kontaktem s infikovanými ţivočichy, při pozření nakaţeného hlodavce i při jeho samotném ulovení je zde velké riziko nákazy (Greene, 2006). Navíc kočky, které se pohybují venku, mohou přijít do styku s močí jak infikovaných divokých zvířat, tak i nakaţených psů ve svém okolí (Songer et Post, 2005). Vysoký výskyt antiborreliových protilátek třídy IgM lze vysvětlit skutečností, ţe ve chvíli, kdy byly kočky přineseny z určitých zdravotních důvodů na vyšetření, mohly být v počáteční fázi nákazy, kdy se tyto protilátky tvoří. Je však třeba zmínit, ţe protilátky třídy IgM mají niţší afinitu a mohou reagovat do určité míry nespecificky. Nelze tudíţ vyloučit i kříţové reakce s jinými neţ čistě borreliovými antigeny.

58

Dalším sledovaným souborem byly kočky umístěné v útulku. U těchto koček jsme neměli informaci, jak dlouho v útulku pobývají, ale asi u poloviny koček byl znám jejich věk, který se nejvíce pohyboval v rozmezí prvních dvou let ţivota. Je tedy pravděpodobné, ţe do útulku byly umístěné jako koťata. Kočky z útulku vykazovaly oproti ostatním souborům zvířat nejniţší výskyt antiborreliových protilátek třídy IgM (4,7 %). Tyto protilátky se tvoří v rané fázi infekce, a proto by jejich nízký výskyt odpovídal tomu, ţe u koček, které ţijí v útulku, je opravdu malá pravděpodobnost nákazy klíštětem. Zjištěné pozitivní kočky mohly být do útulku umístěny v prvních týdnech infekce, kdy se tyto protilátky začnou tvořit. Oproti tomu u koček z tohoto souboru byl zaznamenán nejvyšší podíl antiborreliovýh protilátek třídy IgG (9,3 %). Ty se tvoří o něco později a jejich hladina přetrvává po řadu měsíců (Bojar, 1996). Příčina nejvyššího výskytu těchto protilátek u koček z útulku je nejasná. Kočky se borreliózou mohou nakazit pouze přes vektor (klíště), nikoliv přímo mezi sebou (Greene, 2006). Nejpravděpodobnější je moţnost, ţe kočky před svým umístěním do útulku byly nalezeny v prostředí, kde měly velké riziko napadení klíštětem, a tedy i nákazy boreliózou. Výskyt antileptospirových protilátek u koček z útulku činil 9,3 %. Jelikoţ leptospiróza se šíří přímým kontaktem s infikovaným zvířetem nebo jeho močí (Greene, 2006), teoreticky stačí jedno nakaţené zvíře ve skupině, aby byly infikovány i ostatní. Třetím zkoumaným souborem byly kočky odchycené v ulicích Brna. Pozitivita na antiborreliové protilátky třídy IgM dosahovala 10,3 %, na IgG 5,2 % a na antileptospirové protilátky 10,3 %. U těchto koček se předpokládal četný výskyt příslušných protilátek z důvodu způsobu jejich ţivota. Pokud se tyto kočky pohybují převáţně venku, mohou přijít jak do styku s infikovanými hlodavci, tak s klíšťaty. Hlodavci jsou svým výskytem z důvodu obţivy vázáni na lidskou společnost (Svoboda et Pospíšil, 1996), proto není jejich přítomnost ve velkých městech ţádnou výjimkou. I výskyt klíšťat ve městech narůstá (Shaw et Day, 2005), coţ má za následek vyšší riziko nákazy. Pokud bychom chtěli srovnat naše výsledky týkající se výskytu antiborreliových a antileptospirových protilátek s obdobným výzkumem, naráţíme na problém nedostatku studia dané problematiky u koček. Práce zaměřující se na tuto oblast jsou dosti ojedinělé. Co se týče leptospirózy, např. Larsson et al. (1984) uvádí, ţe metodou MAT byla prokázána pozitivita u 12,8 % zkoumaných koček. Větší výskyt byl prokázán u dospělých koček, coţ je logické, neboť s věkem stoupá riziko kontaktu s infekčním agens (Svoboda et Pospíšil, 1996). Ve Skotsku byla zjištěná sérovprevalence u 9,2 % koček (Agunloye et al., 1996). Svoboda et Pospíšil (1996) uvádí, ţe přítomnost antileptospirových protilátek se pohybuje mezi 2 - 25 %.

59

Novější publikace přináší informaci, ţe séroprevalence se pohybuje mezi 1,4 – 21,4 % (Horzinek et al., 2003). Lymeská borrelióza je u koček zmiňována více, avšak spíše v jiných částech světa. Např. ve starším výzkumu z Connecticutu (USA) byla sledována přítomnost antiborreliových protilátek u přirozeně infikovaných koček (Magnarelli et al., 1990). Bylo zjištěno, ţe séroprevalence se pohybovala od 8,8 % do 33,3 % v závislosti na ročním období. Na severovýchodě USA v endemických oblastech byla zjištěna séroprevalence pohybující se v rozmezí aţ 47 - 71 % (Levy et al., 2003; Magnarelli et al., 2005). Co se týče Evropy, Hozinek et al. (2003) uvádí, ţe výskyt antiborreliových protlátek u koček se pohybuje mezi 0 – 37 %. V praktické části diplomové práce bylo dále hodnoceno, zda námi měřené hematologické a biochemické parametry se v jednotlivých souborech statisticky významně liší. Bylo zjištěno, ţe kočky z útulku dosahují vyšších hodnot v aktivitě ALP oproti pacientům z veterinární kliniky. Tento údaj je patrně způsoben jiţ zmiňovaným faktem, ţe aktivita tohoto enzymu je závislá na věku zvířete (Dürr et al., 2001). Konkrétně většina koček z útulku byla ve věkovém rozmezí 0 – 2 roky, kdy je aktivita enzymu v séru nejvyšší díky proliferaci osteoblastů při růstu zvířete. Pacienti z veterinární kliniky byli průměrně o něco starší, nejvíce zvířat náleţí do věkové skupiny 0 - 5 let. Dále bylo zjištěno, ţe kočky z útulku dosahují vyšších hodnot oproti odchyceným kočkám v hematokritu, koncentraci hemoglobinu, počtu erytrocytů, leukocytů, lymfocytů a monocytů. Kočky z útulku byly při odběru krve vystaveny velkému stresu a strachu. Oproti tomu odchyceným kočkám byla krev odebírána v celkové anestezii. V důsledku stresu se zvyšuje počet erytrocytů a leukocytů (O'Brien et al., 1998). U kočky můţe dojít k rychlému nárůstu mnoţství erytrocytů díky silně kontraktilní slezině (Doubek et al., 2003). Stejně tak leukocyty mohou být v důsledku stresového stimulu rychle mobilizovány, přičemţ dojde k přesunu marginálního poolu do cirkulace. Zvýšení hodnoty hematokritu a koncentrace hemoglobinu je zřejmě spojeno s nárůstem počtu erytrocytů (Dürr et al., 2001). Zvýšení počtu lymfocytů mohlo mít opět původ ve stresovém činiteli, nebo mohlo být způsobeno věkem, protoţe lymfocytóza je častá u mláďat (Day et al., 2000). Kočky z útulku byly průměrně mladší neţ odchycené kočky, asi v polovině případů jejich věk nepřesahoval 1 rok. K nárůstu počtu monocytů nejčastěji dochází při zánětlivé reakci (Dürr et al., 2001), tyto kočky však nevykazovaly ţádné klinické známky onemocnění. Vyšší počet monocytů lze vysvětlovat větší antigenní zátěţí, jelikoţ kočky v útulku ţijí ve vysokém počtu zvířat na jednom místě.

60

Naším dalším poznatkem bylo, ţe odchycené kočky mají niţší hodnoty aktivity ALT oproti pacientům veterinární kliniky a vyšší sedimentaci oproti kočkám z útulků. Aktivita ALT v séru se zvyšuje nejčastěji v důsledku poškození hepatocytů (Rebar et al., 1999). Je moţné, ţe pacienti veterinární kliniky mohli mít potíţe spojené s poškozením jater z důvodu primárního onemocnění nebo v důsledku uţívání léků. Odchycené kočky oproti tomu mohla být relativně zdravá zvířata. Co se týče sedimentace, k jejímu zvýšení dochází při infekčních onemocněních. Kočky ţijící na ulici mohly být více nakaţené různými infekčními agens, se kterými zde přijdou do styku. Na tomto výsledku se také ale mohla podílet skutečnost, ţe zvýšení počtu erytrocytů má vliv na sníţení sedimentace (Bičík, 1992). Jinými slovy, kočky z útulku, u kterých byl prokázán vyšší počet erytrocytů oproti odchyceným kočkám, mohly mít sníţenou sedimentaci, a proto se nyní jeví sedimentace u odchycených koček jako zvýšená. Naším dalším cílem bylo zjistit, zda pozitivita na antiborreliové a antileptospirové protilátky měla vliv na měřené hematologické a biochemické parametry. Nejdříve byl hodnocen soubor kočičích pacientů, kde se neprokázal statisticky významný rozdíl u ţádného měřeného parametru (aktivita ALT, ALP, koncentrace bilirubinu). Protoţe pozitivních vzorků v souborech odchycených zvířat a zvířat z útulku byl nízký počet pro statistické vyhodnocení, tyto dva soubory byly sloučeny v jeden. Bylo zjištěno, ţe zvířata pozitivní na antiborreliové protilátky třídy IgG měla vyšší hodnoty hematokritu a počtu erytrocytů neţ zvířata negativní. U všech ostatních měřených parametrů se neprokázala statistická významnost mezi negativními a pozitivními zvířaty. Lze tedy říci, ţe pozitivita na příslušné protilátky neměla na aktivitu ALT, ALP, koncentraci bilirubinu, hemoglobinu, sedimentaci a počet leukocytů (i jednotlivých typů) ţádný podstatný vliv. Proč mají zvířata pozitivní na antiborreliové protilátky třídy IgG vyšší hodnoty hematokritu a počtu erytrocytů, není jasné. Problematikou hematologického vyšetření v souvislosti s antiborreliovými protilátkami se dosud nikdo podrobněji nezajímal. Pouze Svoboda et Pospíšil (1996) uvádějí, ţe hematologické vyšetření nepřináší ţádné odchylky od referenčních hodnot. Doubek et al. (2003) však uvádí, ţe samotný počet erytrocytů má omezenou výpovědní hodnotu. Všechny námi měřené parametry (s výjimkou sedimentace, u které není známo příslušné referenční rozmezí) byly v rámci hodnocení výsledků porovnány s referenčními hodnotami uvedenými v Doubek et al. (2007). Při hodnocení bylo zjištěno, ţe nejvyššího podílu výsledků spadajících mimo referenční hodnoty dosahuje celkový bilirubin. Je nepravděpodobné, ţe by

61

u tolika koček docházelo ke značně zvýšené produkci nebo sníţené exkreci bilirubinu. Víme však, ţe ke zvýšení hladiny bilirubinu dochází v důsledku hemolýzy, lipémie nebo dlouhé komprimace při odběru krve (Horzinek et al., 2003). Poslední jmenovanou nemůţeme zpětně zjistit, ale při analýze sér bylo zaznamenáváno, zda se u nich vyskytuje hemolýza, lipemie, nebo hyperbilirubinemie (hodnocením barvy séra). Při dohledání těchto vzorků bylo zjištěno, ţe tyto tři parametry se vyskytovaly celkem u cca 40 % vzorků. Je tedy moţné, ţe zvýšené hodnoty byly způsobeny právě tímto problémem. I kdyţ není vyloučeno, ţe některé kočky mohly trpět hyperbilirubinémií z patologických příčin. Při měření aktivity ALP pouze 4 vzorky ze všech hodnocených koček, u kterých byl znám jejich věk, přesahovaly referenční hodnoty, coţ mohlo být způsobeno onemocnění jater, ţlučníku nebo ţlučových cest (Thrall et al., 2006). Aktivita ALT přesahovala horní referenční mez jen v několika málo případech. Zde se mohlo jednat o poškození jater (Rebar et al., 1999). U některých vzorků však byly naměřeny niţší hodnoty, neţ udává dolní referenční mez. To mohlo být způsobeno chybně provedeným měřením. Z parametrů měřených z čerstvé krve odpovídají výsledky jiţ zmíněným rozdílům mezi soubory koček z útulku a odchycených koček. Vyšší podíl vzorků mimo referenční hodnoty (oproti odchyceným kočkám) dosahují kočky z útulku v počtu erytrocytů, leukocytů, lymfocytů, monocytů, hematokritu a koncentraci hemoglobinu. Příčiny tohoto vyššího počtu jsou uvedeny výše. Oproti tomu neutrofily dosahují více výsledků leţících mimo referenční hodnoty u odchycených koček. Důvodem byl pravděpodobně fakt, ţe těmto kočkám byla krev odebírána v průběhu operačního zákroku. Co se týče počtu eozinofilů a bazofilů mimo referenční hodnoty, jsou u obou sledovaných souborů skoro stejné. Ke zvýšení počtu obou těchto granulocytů dochází z podobných příčin, nejčastěji jsou znakem parazitárních infekcí nebo hypersenzitivních reakcí (Day et al., 2000). Teoreticky mohly být napadeny parazity spíše odchycené kočky, neţ kočky v útulku, které jsou navíc odčervovány. Výsledky leţící mimo referenční hodnoty byly také posuzovány z hlediska, kolik se mezi nimi nachází pozitivních vzorků na antiborreliové a antileptospirové protilátky. I kdyţ u většiny parametrů se takové vzorky vyskytují, někdy i ve značné míře, nelze říci, ţe by všechny pozitivní vzorky leţely u konkrétního parametru mimo referenční rozmezí.

62

9. ZÁVĚR Diplomová práce si kladla za cíl alespoň částečně přispět k rozšíření poznatků o kočce domácí, a to především z hlediska nákazy Lymeskou borreliózou a leptospirózou, které se řadí mezi nejrozšířenější světové zoonózy. Zjištěný výskyt antiborreliových a antileptospirových protilátek ve zkoumaném souboru zvířat nepřekračuje hodnoty udávané v literatuře. Přesto kočky, zejména chované venku, přicházejí často do styku s infikovanými hlodavci nebo klíšťaty. Ačkoli většinou nejsou u koček popisovány klinické známky onemocnění Lymeská borrelióza a leptospiróza, v našem výzkumu se ukázalo, ţe kočky pozitivní na antiborreliové protilátky třídy IgG dosahovaly statisticky vyšší hodnoty hematokritu a počtu erytrocytů neţ zvířata negativní. Je však moţné, ţe na námi sledované vybrané hematologické a biochemické parametry mají vliv další činitelé, které jsme nepostihli. Je proto třeba, aby navazující výzkum v této oblasti zhodnotil i další moţné faktory působící jak na sledovaná zvířata, tak i na vzorky čerstvé krve nebo sér. Doba od odběru krve po vyhodnocení příslušných parametrů musí být stejná, jako i podmínky, při kterých bude probíhat analýza. Zmrazená séra by se měla uchovávat také po stejnou dobu. Závěrem je třeba říci, ţe námi sledované kočky (357) tvoří velmi obsáhlý a zajímavý soubor dat, který se bude do budoucna rozšiřovat a získané vědomosti přispějí k lepšímu prozkoumání a pochopení dané problematiky.

63

10. SEZNAM POUŢITÝCH ZKRATEK Ab

- protilátka (antibody)

ALP

- alkalická fosfatáza

ALT

- alaninaminotransferáza

BAZ

- bazofil

Dbp

- protein váţící decorin (decorin-binding protein)

EIA

- enzyme immunoassay

ELISA

- enzyme-linked immunosorbent assay

EOZ

- eozinofil

FeLV

- virus kočičí leukémie (feline leukaemia virus)

FIV

- virus kočičí imunodeficience (feline immunodeficiency virus)

Ig

- imunoglobulin

LipL

- leptospiral lipoprotein

Loa

- OmpA-like protein of leptospira

LYM

- lymfocyt

MAT

- mikroskopický aglutinační test

MHC

- hlavní histokompatibilní komplex (major histocompatibility komplex)

MON

- monocyt

NEU

- neutrofil

NADP /H

- nikotinamid adenin dinukleotid fosfát

Omp

- vnější membránový protein (outer membrane protein)

Osp

- vnější povrchový protein (outer surface protein)

RH

- referenční hodnoty

VFU

- Veterinární a farmaceutická univerzita

2,3-DPG

- 2,3-difosfoglycerát

64

11. SEZNAM POUŢITÉ LITERATURY Aberer, E. 2007. Lyme borreliosis-an update. Journal of the German Society of Dermatology, vol. 5, no. 5, p. 406-414. Abu-Ghazaleh, R. I., Dunnette, S. L., Loegering, D. A., Checkel, J. L., Kita, H., Thomas, L. L., Gleich, G. J. 1992. Eosinophil granule proteins in peripheral blood granulocytes. Journal of leukocyte biology, vol. 52, no. 6, p. 611-618. Adler, B., de la Peña Moctezuma, A. 2010. Leptospira and leptospirosis. Veterinary microbiology, vol. 140, no. 3-4, p. 287-96. Agunloye, C. A., Nash, A. S. 1996. Investigation of possible leptospiral infection in cats in Scotland. The journal of small animal practice, vol. 37, no., p. 126-129. Archer, F. J., Taylor, S. M. 1996. Alkaline phosphatase bone isoenzyme and osteocalcin in the serum of hyperthyroid cats. The Canadian veterinary journal, vol. 37, no. 12, p. 735–739. Bacha, W. J., Bacha, L. M. 2000. Color atlas of veterinary histology. 2nd printing. Philadelphia : Lippincott Williams  Wilkins. 318 p. ISBN 0-683-30618-9. Bičík, V. 1992. Základy hematologie a imunohematologie. 1. vyd. Olomouc : Univerzita Palackého. 52 s. ISBN 80-7067-131-9. Birchard, S. J., Sherding, R. G. 2006. Saunders manual of small animal practise. 3rd printing. St. Louis, Missouri : Sounders Elsevier. 2008 p. ISBN 0-7216-0422-6. Bojar, M. 1996. Lymeská borelióza. Praha : Maxdorf s.r.o. 224 s. ISBN 80-85800-35-7. Borregaard, N., Sørensen, O. E., Theilgaard-Mönch, K. 2007. Neutrophil granules : a library of innate immunity proteins. Trends in immunology, vol. 28, no. 8, p. 340-345. Brown, R. R., Elston, T. H., Evans, L., Glaser, C., Gulledge, M. L., Jarboe, L., Lappin, M. R., Marcus, L. C. 2005. Feline zoonoses guidelines from the American Association of Feline Practitioners. Journal of feline medicine and surgery, vol. 7, no. 4, p. 243-274.

65

Burgess, E. C. 1992. Experimentally induced infection of cats with Borrelia burgdorferi. American journal of veterinary research, vol. 53, no. 9, p. 1507-1511. Campbell, D. J., Rawlings, J. M., Koelsch, S., Wallace, J., Strain, J. J., Hannigan, B. M. 2004. Age-related differences in parameters of feline immune status, Veterinary immunology and immunopathology, vol. 100, no. 1-2, p. 73-80. Colville, J. L., Berryhill, D. L. 2007. Handbook of zoonoses : Identification and prevention. St. Louis, Missouri : Mosby Elsevier. 249 p. ISBN 978-0-323-04478-3. Crowter, J. R. 1995. ELISA : Theory and Practise. Totowa, New Jersey : Humana Press., 223 p. ISBN 0896032795. Cullen, P. A., Haake, D. A., Adler, B. 2004. Outer membrane proteins of pathogenic spirochetes. FEMS microbiology reviews, vol. 28, no. 3, p. 291-318. Day, M. J., Mackin, A., Littlewood, J. D. 2000. Manual of canine and feline haematology and transfusion medicine. British Small Animal Veterinary Association. 320 p. ISBN 0-905214-39-0. Dellmann, H. D., Eurell, J. A. 1998. Textbook of veterinary histology. 5th printing. Maryland : Lippincott Williams  Wilkins. 380 p. ISBN 0-683-30168-3. Donner, L. 1985. Klinická hematologie. 1. vyd. Praha : Avicenum. 448 s. ISBN 08-077-85. Doubek, J., Bouda, J., Doubek, M., Fürll, M., Knotková, Z., Pejřilová, S., Pravda, D., Scheer, P., Svobodová, Z., Vodička, R. 2003. Veterinární hematologie. Brno : Noviko, a.s. 464 s. ISBN 80-86542-02-5. Doubek, J., Šlosárková, S., Řeháková, K., Scheer, P., Beránková, J. 2007. Interpretace základních biochemických a hematologických nálezů u zvířat. Brno : Noviko, a.s. 78 s. Dürr, U. M., Kraft, W., Ballauf, B., Bostedt, H., Dietz, I., Dreier, H.-K., Fürrl, M., Grabner, A., Hasslinger, M. A., Heinritzi, K., Hirschberger, J., Mischke, R., Moritz, A., Weber, A., Wirth, W. 2001. Klinická laboratórna diagnostika vo veterinárnej medicíne. Bratislava : Hajko & Hajková. 365 s. ISBN 8088700515. Fox, J. G., Anderson, L. C., Loew, F. M., Quimby, F. W. 2002. Laboratory animal medicine. 2nd printing. London : Elsevier. 1325 p. ISBN 0-12-263951-0.

66

Greene, C. E. 2006. Infectious diseases of the dog and cat. 3rd printing. St. Louis, Missouri : Elsevier. 1387 p. ISBN 1-4160-3600-8. Horzinek, M. C., Schmidt, V., Lutz, H. 2003. Nemoci koček. 3. vyd. Bratislava : Pro-Trade s.r.o. 814 s. ISBN 80-969010-5-20. Hořejší, V., Bartůňková, J. 2005. Základy imunologie. 3. vyd. Praha : Triton, s.r.o. 279 s. ISBN 80-7254-686-4. Hubálek, Z., Rudolf, I. 2007. Mikrobiální zoonózy a sapronózy. 2. vyd. Brno : Masarykova Universita Brno. 176 s. ISBN 987-80-210-4460-9. Kaneko, J. J., Harvey, J. W., Bruss, M. L. 1997. Clinical biochemistry of domestic animals. 5th printing. San Diego : Academic press. 932 p. ISBN 0-12-396305-2. Larsson, C. E., Santa Rosa, C. A., Hagiwara, M. K., Paim, G. V., Guerra, J. L. 1984. Prevalence of feline leptospirosis: serologic survey and attempts of isolation and demonstration of the agent. International journal of zoonoses, vol. 11, no. 2, p. 161-169. Lawler, D. F., Chase, K., Teckenbrock, R., Lark, K. G. 2006. Heritable components of feline hematology, clinical chemistry and acid-base profiles. Journal of heredity, vol. 97, no. 6, p. 549554. Levy, S. A., O'Connor, T. P., Hanscom, J. L., Shields, P. 2003. Evaluation of a canine C6 ELISA Lyme disease test for the determination of the infection status of cats naturally exposed to Borrelia burgdorferi. Veterinary therapeutics, vol. 4, no. 2, p. 172-177. Liang, F. T., Brown, E. L., Wang, T., Iozzo, R. V., Fikrig E. 2004. Protective niche for Borrelia burgdorferi to evade humoral immunity. The American journal of pathology, vol. 165, no. 3, p. 977-985. Mančal, P. 1987. Metody enzymové imunoanalýzy. Praha : Ústav sér a očkovacích látek. 84 s. Magnarelli, L. A., Anderson, J. F., Levine, H. R., Levy, S. A. 1990. Tick parasitism and antibodies to Borrelia burgdorferi in cats. Journal of the American Veterinary Medical Assiciation, vol. 197, no. 1, p. 63-66.

67

Magnarelli, L. A., Bushmich, S. L., Ijdo, J. W., Fikrig, E. 2005. Seroprevalence of antibodies against Borrelia burgdorferi and Anaplasma phagocytophilum in cats. American journal of veterinary research, vol. 66, no. 11, p.1895-1899. Monahan, A. M., Callanan, J. J., Nally, J. E. 2009. Review paper : Host-pathogen interactions in the kidney during chronic leptospirosis. Veterinary pathology, vol. 46, no. 5, p. 792-799. Musil, J. 1994. Molekulové základy klinické biochemie. Praha : Grada, Avicenum. 377 s. ISBN 8071690562. Nelson, R. W., Couto, C. G., Bunch, S. E., Grauer, G. F., Hawkins, E. C., Lappin, M. R., Johnson, Ch. A., Taylor, S. M., Ware, W. A., Williard, M. D. 2003. Small animal internal medicine. 3rd printing. St. Louis, Missouri : Mosby. 1362 p. ISBN 0-323-01724-x. O'Brien, M., Murphy, M. G., Lowe, J. A. 1998. Hematology and clinical chemistry parameters in the cat (Felis domesticus), The journal of nutrition, vol. 128 (12 Suppl), p. 2678S-2679. Picardeau, M., Brenot, A., Saint Girons, I. 2001. First evidence for gene replacement in Leptospira spp. Inactivation of L. biflexa flaB results in non-motile mutants deficient in endoflagella. Molecular microbiology, vol. 40, no. 1, p. 189-199 Rabinowitz, P. M., Gordon, Z., Odofin, L. 2007. Pet-related infections, American family phycician, vol. 76, no. 9, p. 1314-1322. Rebar, A. H., Boon, G. D., Boon, C. D., Christian, J. A. 1999. Biochemical profiling in the dog and cat. Wilminghton : The Gloyd group. 108 p. ISBN 0967800544. Ristow, P., Bourhy, P., da Cruz McBride, F. W., Figueira, C. P., Huerre, M., Ave, P., Girons, I. S., Ko, A. I., Picardeau, M. 2007. The OmpA-like protein Loa22 is essential for leptospiral virulence. PLoS Pathogens, vol. 3, no. 7, e97 Rosa, P. A., Tilly, K., Stewart, P. E. 2005. The burgeoning molecular genetics of the Lyme disease spirochaete. Nature reviews. Microbiology, vol. 3, no. 2, p. 129-143. Schaechter, M., Engleberg, N. C., Eisenstein, B. I., Medoff, G. 1999. Mechanisms of microbial disease. 3rd printing. Maryland : Lippincott Williams & Wilkins. 733 p. ISBN 0-68307605-1. 68

Shaw, S. E., Day, M. J. 2005. Arthropod-borne infectious diseases of the dog and cat. London : Manson Publishing. 152 p. ISBN 1-84076-057-5. Shi, H. Z. 2004. Eosinophils function as antigen-presenting cells. Journal of leukocyte biology, vol. 76, no. 3, p. 520-527. Schneiderka, P., Jirsa, M., Kazda, A., Kocna, P., Mašek, Z., Nekulová, M. Pick, P., Šebesta, I., Šimíčková, M., Štern, P., Zima, T. 2004. Kapitoly z klinické biochemie. 2. vyd. Karolinum. 356 s. ISBN 80-246-0678-x. Schwan, T. G., Piesman, J., Golde, W. T., Dolan, M. C., Rosa, P. A. 1995. Induction of an outer surface protein on Borrelia burgdorferi during tick feeding. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, vol. 92, no. 7, p. 2909-2913. Songer, S. G., Post, K. W. 2005. Veterinary microbiology : Bacterial and fungal agents of animal disease. St. Louis, Missouri : Elsevier Saunders. 434 p. ISBN 0-72216-8717-2. Svoboda, M., Pospíšil, Z. 1996. Infekční nemoci psa a kočky. Brno: Noviko a.s. 504 s. Svoboda, M. 2008. Nemoci psa a kočky. 1. díl. Brno : Noviko a.s. 1152 s. ISBN 978-80-8654218-8. Terpstra, W. J. 2003. Human leptospirosis : Guidance for diagnosis, surveillance and control. World Health Organisation. 114 p. ISBN 9241545895. Thrall, M. A., Baker, D. C., Campbell, T. W., DeNicola, D., Fettman, M. J., Lassen, E. D., Rebar, A., Weiser, G. 2006. Veterinary hematology and clinical chemismy. Maryland : Blackwell Publishing. 518 p. ISBN 0-7-817-6850-0. Villiers, E., Blackwood, L. 2005. BSAVA manual of canine and feline clinical pathology. British Small Animal Veterinary Association 456 p. ISBN 0-905214-79. Wexler – Mitchell, E. 2004. Guide to a healthy cat. New Jersey : Wiley Publishing. 272 p. ISBN 0-7645-4163-3. Young, B., Lowe, J. S., Stevens, A., Heath, J. W. 2006. Wheater´s functional histology : A text and colour atlas. 5th printing. Elsevier Limited. 437 p. ISBN 0-443-06850-x. Zima, T. 2002. Laboratorní diagnostika. 1. vyd. Praha : Galén. 906 s. ISBN 80-7262-201-3

69

Internetové zdroje:

URL 1 http://www.medvet.umontreal.ca/clinpath/banq-im/hematology/rouleauxE.htm URL 2 http://themedicalbiochemistrypage.org/hemoglobin-myoglobin.html URL 3 http://www.ctdslab.co.uk/felinehaematologyimages.html URL 4 http://ahdc.vet.cornell.edu/clinpath/modules/heme1/eos.htm URL 5 http://ahdc.vet.cornell.edu/clinpath/modules/heme1/baso.htm URL 6 http://ahdc.vet.cornell.edu/clinpath/modules/heme1/lymph.htm URL 7 http://ahdc.vet.cornell.edu/clinpath/modules/heme1/monocyte.htm URL 8 http://fyziologie.lf1.cuni.cz/file/5472/protokoly_1b_v051.pdf

70

Přílohy 1. Kočky z útulku a) Výskyt koček pozitivních na antiborreliové protilátky ve vztahu k referenčnímu rozmezí u měřených hematologických a biochemických parametrů

Obr. 14: Pozitivita na antiborreliové protilátky při měření hematokritu

Obr. 15: Pozitivita na antiborreliové protilátky při měření koncentrace hemoglobinu

71

Obr. 16: Pozitivita na antiborreliové protilátky při měření sedimentace

Obr. 17: Pozitivita na antiborreliové protilátky při měření počtu erytrocytů

Obr. 18: Pozitivita na antiborreliové protilátky při měření počtu leukocytů 72

Obr. 19: Pozitivita na antiborreliové protilátky při měření počtu neutrofilů

Obr. 20: Pozitivita na antiborreliové protilátky při měření počtu lymfocytů

Obr. 21: Pozitivita na antiborreliové protilátky při měření počtu monocytů 73

Obr. 22: Pozitivita na antiborreliové protilátky při měření počtu eozinofilů

Obr. 23: Pozitivita na antiborreliové protilátky při měření počtu bazofilů (u většiny vzorků se počet bazofilů rovnal nule, mezi nimi byly i ty pozitivní)

Obr. 24: Pozitivita na antiborreliové protilátky při měření aktivity ALT 74

Obr. 25: Pozitivita na antiborreliové protilátky při měření koncentrace bilirubinu

Obr. 26: Pozitivita na antiborreliové protilátky při měření aktivity ALP (zde jsou vzorky uspořádány vzestupně dle věku koček )

75

b) Výskyt koček pozitivních na antileptospirové protilátky ve vztahu k referenčnímu rozmezí u měřených hematologických a biochemických parametrů

Obr. 27: Pozitivita na antileptospirové protilátky při měření hematokritu

Obr. 28: Pozitivita na antileptospirové protilátky při měření koncentrace hemoglobinu

76

Obr. 29: Pozitivita na antileptospirové protilátky při měření sedimentace

Obr. 30: Pozitivita na antileptospirové protilátky při měření počtu erytrocytů

Obr. 31: Pozitivita na antileptospirové protilátky při měření počtu leukocytů 77

Obr. 32: Pozitivita na antileptospirové protilátky při měření počtu neutrofilů

Obr. 33: Pozitivita na antileptospirové protilátky při měření počtu lymfocytů

Obr. 34: Pozitivita na antileptospirové protilátky při měření počtu monocytů 78

Obr. 35: Pozitivita na antileptospirové protilátky při měření počtu eozinofilů

Obr. 36: Pozitivita na antileptospirové protilátky při měření počtu bazofilů (u většiny vzorků se počet bazofilů rovnal nule, mezi nimi byly i ty pozitivní)

Obr. 37: Pozitivita na antileptospirové protilátky při měření aktivity ALT 79

Obr. 38: Pozitivita na antileptospirové protilátky při měření koncentrace bilirubinu

Obr. 39: Pozitivita na antileptospirové protilátky při měření aktivity ALP (uspořádáno vzestupně dle věku zvířetě; tyto vzorky byly všechny negativní)

80

2. Odchycené kočky a) Výskyt koček pozitivních na antiborreliové protilátky ve vztahu k referenčnímu rozmezí u měřených hematologických a biochemických parametrů

Obr. 40: Pozitivita na antiborreliové protilátky při měření hematokritu

Obr. 41: Pozitivita na antiborreliové protilátky při měření koncentrace hemoglobinu

81

Obr. 42: Pozitivita na antiborreliové protilátky při měření sedimentace

Obr. 43: Pozitivita na antiborreliové protilátky při měření počtu erytrocytů

Obr. 44: Pozitivita na antiborreliové protilátky při měření počtu leukocytů 82

Obr. 45: Pozitivita na antiborreliové protilátky při měření počtu neutrofilů

Obr. 46: Pozitivita na antiborreliové protilátky při měření počtu lymfocytů

Obr. 47: Pozitivita na antiborreliové protilátky při měření počtu monocytů 83

Obr. 48: Pozitivita na antiborreliové protilátky při měření počtu eozinofilů

Obr. 49: Pozitivita na antiborreliové protilátky při měření počtu bazofilů (u většiny vzorků se počet bazofilů rovnal nule, mezi nimi byly i ty pozitivní)

Obr. 50: Pozitivita na antiborreliové protilátky při měření aktivity ALT 84

Obr. 51: Pozitivita na antiborreliové protilátky při měření koncentrace bilirubinu

Obr. 52: Pozitivita na antiborreliové protilátky při měření aktivity ALP

85

b) Výskyt koček pozitivních na antileptospirové protilátky ve vztahu k referenčnímu rozmezí u měřených hematologických a biochemických parametrů

Obr. 53: Pozitivita na antileptospirové protilátky při měření hematokritu

Obr. 54: Pozitivita na antileptospirové protilátky při měření koncentrace hemoglobinu

86

Obr. 55: Pozitivita na antileptospirové protilátky při měření sedimentace

Obr. 56: Pozitivita na antileptospirové protilátky při měření počtu erytrocytů

Obr. 57: Pozitivita na antileptospirové protilátky při měření počtu leukocytů 87

Obr. 58: Pozitivita na antileptospirové protilátky při měření počtu neutrofilů

Obr. 59: Pozitivita na antileptospirové protilátky při měření počtu lymfocytů

Obr. 60: Pozitivita na antileptospirové protilátky při měření počtu monocytů

88

Obr. 61: Pozitivita na antileptospirové protilátky při měření počtu eozinofilů

Obr. 62: Pozitivita na antileptospirové protilátky při měření počtu bazofilů (u většiny vzorků se počet bazofilů rovnal nule, mezi nimi byly i ty pozitivní)

Obr. 63: Pozitivita na antileptospirové protilátky při měření aktivity ALT 89

Obr. 64: Pozitivita na antileptospirové protilátky při měření koncentrace bilirubinu

Obr. 65: Pozitivita na antileptospirové protilátky při měření aktivity ALP

90