MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE
Bakalářská práce
Brno 2016
Lucie Svobodníková
MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA FAKULT ÚSTAV EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE BIOLOGIE
INTERAKCE LÉČIV S ROSTLINAMI NA BUNĚČNÉ ÚROVNI
Bakalářská práce
Lucie Svobodníková
Vedoucí práce: RNDr. Štěpán Zezulka, Zezulka Ph.D.
Brno 2016
Bibliografický záznam Autor:
Lucie Svobodníková Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav experimentální biologie
Název práce:
Interakce léčiv s rostlinami na buněčné úrovni
Studijní program:
Speciální biologie
Studijní obor:
Experimentální biologie rostlin
Vedoucí práce:
RNDr. Štěpán Zezulka, Ph.D.
Akademický rok:
2015/2016
Počet stran:
51
Klíčová slova:
Léčiva; diklofenak; buněčné suspenzní Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow-2
kultury;
Bibliographic Entry Author:
Lucie Svobodníková Faculty of Science, Masaryk University Department of Experimental biology
Title of Thesis:
Interaction of pharmaceuticals with plant at cellular level
Degree programme:
Special biology
Field of Study:
Experimental biology of plants
Supervisor:
RNDr. Štěpán Zezulka, Ph.D.
Academic Year:
2015/2016
Number of Pages:
51
Keywords:
pharmaceuticals; diclofenac; cell suspension cultures; Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow-2
Abstrakt Cílem bakalářské práce je shromáždit a utřídit aktuální vědecké poznatky o interakci léčiv s rostlinami na buněčné úrovni, kde informace o interakci diklofenaku a tabákové buněčné suspenzi BY-2 jsou doposud nepočetné. Stále se zvyšující produkce a spotřeba léčiv má za důsledek jejich vstup do všech složek životního prostředí. Přítomnost léčiv je sledována zejména v půdách a vodním prostředí, kde se jejich vliv na necílové organismy projevuje v největší míře. Účinek léčiv na necílové organismy, hlavně na rostliny, však dosud není dostatečně prozkoumán. Působení těchto cizorodých látek v rostlině lze sledovat již na buněčné úrovni, na úrovni chemických a fyzikálních interakcí léčiv s buněčnou membránou. Proto je pro studium těchto interakcí nejvhodnější použití buněčných suspenzních kultur. Jako rostlinný materiál jsem si vybrala tabákovou suspenzi BY-2, která již byla využita jako modelový organismus pro celou řadu studií, díky své vysoké rychlosti růstu, životaschopnosti a fenotypové stabilitě.
Abstract The aim of thesis is to collect and organize current scientific knowledge about the drug interaction with plants at the cellular level, where information about the interaction of diklofenaku and tobacco BY-2 cell suspension are still not numerous. The ever increasing production and consumption of drugs has resulted in their entry into all components of the environment. The presence of a drug is monitored especially in soils and aquatic environments, where their impact on non-target organisms manifests itself in the largest extent. The effect of the drug on non-target organisms, especially the plants, however, is not yet sufficiently explored. The action of these foreign substances in the plant can be observed already at the cellular level,at the level of chemical and physical drug interactions with the cell membrane. Therefore, for the study of these interactions is the best use of cell suspension cultures. As the plant material, I chose the tobacco BY-2 suspension, which has already been used as a model organism for many studies, thanks to its high growth rate, viability and phenotypic stability.
Poděkování Na tomto místě bych chtěla poděkovat panu RNDr. Štěpánovi Zezulkovi, Ph.D. za vedení při vypracovávání bakalářské práce, za cenné rady a trpělivost. Dále bych ráda poděkovala paní doc. RNDr. Marii Kummerové, CSc. za pomoc při opravě napsaných textů a za čas, který mi věnovala.
Prohlášení Prohlašuji, že jsem svoji bakalářskou práci vypracovala samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány.
Brno 9. května 2016
……………………………… Jméno Příjmení
Obsah 1.
Úvod ...................................................................................................................................... 11
2.
Léčiva .................................................................................................................................... 12 2.1. Definice léčiv ...................................................................................................................... 12 2.2. Z čeho se lék skládá ............................................................................................................ 12 2.3. Rozdělení léčiv ................................................................................................................... 13 2.4. Životní cyklus léčiv ............................................................................................................ 14 2.5. ATC skupiny léčiv .............................................................................................................. 14 2.6.Vstup léčiv do prostředí ....................................................................................................... 14
3.
Čistírna odpadních vod .......................................................................................................... 16 3.1. Primární (mechanické) čištění ............................................................................................ 16 3.2. Sekundární (biologické) čištění .......................................................................................... 17 3.2.1. Anaerobní rozklad ....................................................................................................... 18 3.2.2. Aerobní rozklad ........................................................................................................... 18 3.3. Terciární čištění .................................................................................................................. 19 3.4. Kal ...................................................................................................................................... 20 3.4.1.Typy kalu ...................................................................................................................... 20 3.4.2. Složení kalu ................................................................................................................. 21 3.4.3. Stanovení léčiv v čistírenských kalech ........................................................................ 21
4.
Mechanismy odstranění léčiv ................................................................................................ 22 4.1. Fotodegradace ..................................................................................................................... 22 4.2. Sorpce ................................................................................................................................. 22 4.3. Biodegradace ...................................................................................................................... 22 4.4. Chemická oxidace............................................................................................................... 23 4.5. Membránové metody .......................................................................................................... 23 4.6. Aktivní uhlí ......................................................................................................................... 24 4.7. Fytoremediace .................................................................................................................... 24 4.7.1. Kořenové čistírny odpadních vod ................................................................................ 24
5.
Diklofenak ............................................................................................................................. 26 5.1.Základní vlastnosti diklofenaku ........................................................................................... 26 5.2.Účinky diklofenaku ............................................................................................................. 26 5.3.Užití a dávkování dikolofenaku ........................................................................................... 27 5.4.Distribuce............................................................................................................................. 27 5.5.Metabolismus....................................................................................................................... 27 5.6. Nežádoucí účinky diklofenaku ........................................................................................... 28 9
5.7. Využití diklofenaku ............................................................................................................ 29 5.8. Spotřeba diklofenaku .......................................................................................................... 29 5.9.Diklofenak v povrchové a odpadní vodě ............................................................................. 31 5.10.Vliv diklofenaku na necílové organismy ........................................................................... 32 5.10.1.Vliv diklofenaku na živočichy ........................................................................................ 32 6.
Buněčné suspenze .................................................................................................................. 34 6.1. Suspenzní kultury ............................................................................................................... 34 6.2. Historie ............................................................................................................................... 34 6.3. Jak získáme suspenzní kulturu? .......................................................................................... 35 6.4. Podmínky a způsoby kultivace rostlinných buněk ............................................................. 35 6.4.1.Charakteristika „ideální“ suspenzní kultury ................................................................. 35 6.4.2. Základní složení média pro buněčné suspenze ............................................................ 36 6.4.3. Růstová křivka buněčného růstu .................................................................................. 37 6.4.4. Měření a regulace v průběhu procesu v bioreaktorech ................................................ 38 6.4.5.Možnost ovlivnění tvorby sekundárních metabolitů .................................................... 38 6.5.Typy suspenzních kultur ...................................................................................................... 38 6.5.1.Vsádková kultura .......................................................................................................... 38 6.5.2.Kontinuální kultura ....................................................................................................... 39 6.6.Využití suspenzní kultury .................................................................................................... 40
7.
Tabáková buněčná suspenze BY-2 ........................................................................................ 42 7.1. Tabáková buněčná suspenze BY-2 ..................................................................................... 42 7.1.1. Charakteristika BY-2 jako materiálu pro analýzu rostlinných organel........................ 42 7.2. Kultivace BY-2 ................................................................................................................... 43 7.2.1. Jednokroková metoda synchronizace pomocíaphidicolinu: ........................................ 43 7.2.2. Sekvenční metoda synchronizace aphidicolinu a propyzamidu: ................................. 44 7.2.3. Problémy kultivací BY-2 ............................................................................................. 44 7.2.4. Růst BY-2 .................................................................................................................... 45 7.2.4.1. Rychlost a podmínky růstu BY-2……………….……………………………….45 7.2.5. Morfologie a cytologie BY-2....................................................................................... 45
8.
Závěr ...................................................................................................................................... 46
9.
Seznam zkratek ...................................................................................................................... 47
10.
Seznam použité literatury .................................................................................................. 48
11.
Internetové zdroje: ............................................................................................................. 51
10
1. Úvod Celosvětově se stále zvyšuje produkce a spotřeba léčiv. Léčiva jsou biologicky aktivní látky uzpůsobené k tomu, aby byly pomalu metabolizovány a prodloužily tak své působení v organismu (Dietrich, 2005). Tudíž mohou být z organismu vyloučena, buď v nezměněné formě, nebo jako metabolity, které jsou v některých případech nebezpečnější než původní lék (Šídlová et al., 2011). Metody pro odstranění léčiv z životního prostředí navíc nejsou dostatečně účinné. Účinnost snižuje i nesprávné zacházení s prošlými či nevyužitými léky. Díky tomu dochází k dlouhodobému výskytu léčiv v prostředí v koncentracích v řádech až µg/l. Dlouhodobé působení léčiv, i když v nízkých koncentracích, má vliv na necílové organismy. Jedním z nejpoužívanějších léčiv je nesteroidní protizánětlivý lék diklofenak. Jeho vliv na necílové organismy byl už v řadě studií prokázán, jednalo se především o jeho vliv na živočichy, na které negativně působila jeho schopnost inhibovat syntézu prostaglandinů. Nedostatečně je však prozkoumán jeho vliv na rostliny. Působení těchto cizorodých látek v rostlině lze sledovat již na buněčné úrovni, kde záleží hlavně na chemických a fyzikálních interakcích léčiv s buněčnou membránou. Pro studium těchto interakcí je vhodné použití buněčných suspenzních kultur. Suspenze rostlinných buněk představují významný experimentální materiál, který se ve větším měřítku používá od druhé poloviny 20. století. Úspěšnost mnoha pokusů prováděných na suspenzích rostlinných buněk je dána do značné míry tím, že představují jednodušší systémy, než jsou intaktní rostliny, a proto se u nich dá dobře odlišit vliv jednotlivých faktorů, jimiž jsou ovlivňovány. Disponují celou řadou fyziologických charakteristik, které velmi rychle a ochotně reagují na změnu podmínek či ošetření (Štěpán, 2011). Jako modelový organismus byla zvolena tabáková buněčná suspenze BY-2, která byla založena v 70. letech z kalusu iniciovaného na tabáku Nicotiana tabacum L. cv. „Bright Yellow 2“ a která jako jedna z mála podobných modelových systémů stabilně vytváří dlouhé vícebuněčné řetízky. BY-2 disponuje výhodnými vlastnostmi (vysoká rychlost růstu, vysoká životaschopnost a fenotypová stabilita), které jsou nezbytné pro studium biologických procesů v buňce, a proto je široce využívaným objektem (Muselíková, 2012). 11
2. Léčiva 2.1. Definice léčiv Léčivo můžeme definovat jako léčivou látku, její směs nebo léčivý přípravek, který se používá k podání lidem nebo zvířatům za účelem léčby nebo předcházení nemocí, stanovení lékařské diagnózy, obnově, úpravě či ovlivnění fyziologických funkcí prostřednictvím svého účinku (Katzung, 2006). Léčivým přípravkemje nazývána jakákoliv látka nebo kombinace látek, které jsou určeny k léčení, prevenci nemocí, ke stanovení diagnózy, k obnově, úpravě a ovlivnění fyziologických funkcí u lidí i zvířat. Do léčivých přípravků lze zařadit například léčivé čaje a další rostlinné přípravky, transfuzní přípravky, krevní deriváty, diagnostické přípravky (Katzung, 2006). Lékem nazýváme léčivý přípravek, který je upravený do vhodné formy a podává se cíleně pouze k účelu, který je dán vlastnostmi v něm obsažených léčiv (Katzung, 2006).
2.2. Z čeho se lék skládá Lék obsahuje jednu nebo více léčivých látek, které působí svým účinkem, a pomocných látek, které pomáhají léčivou látku zpracovat do lékové formy. Základní funkcí léčivé látky je působit svým účinkem na lidský organismus. Její účinek může být: •
Farmakologický - ovlivnění funkcí organismu různými mechanismy působení.
•
Imunologický - ovlivnění imunitního/obranného systému člověka. V případě léků jde o posílení nebo oslabení obranného systému.
•
Metabolický - spočívá v ovlivnění metabolismu látkové přeměny, tedy přeměny látek a energií v živých organismech. Jde o biochemické procesy v organismu, nutné pro jejich život a růst [1].
Pomocné látky nemají žádný léčebný účinek a jejich hlavní funkcí je umožnit nebo usnadnit výrobu, přípravu, uchovávání a podávání léků. Zároveň svými vlastnostmi mohou příznivě ovlivnit např. rozpad tablety v organismu, pozvolné uvolňování léčivé látky apod. Pomocné látky mají své specifické názvy podle jejich funkce.
12
Mezi ty základní například patří: •
plniva - látky, které pomáhají doplnit objem
•
pojiva - spojují léčivou látku s plnivy
•
kluzné látky - zamezují lepení tabletové směsi na tabletovacím lisu
•
rozvolňovadla - umožňují rozpad tablety v organismu
•
barviva - zajišťují estetický vzhled léku a zároveň tak zajišťují identifikaci léku
•
rozpouštědla - umožňují rozpouštění léčivé látky
•
proti mikrobiální látky - zabraňují množení a růst mikroorganismů
•
chuťová a čichová korigencia – „tlumí“ nepříjemnou chuť či vůni léčivé látky [1]
2.3. Rozdělení léčiv Léky je možné rozdělit podle dvou hlavních kritérií – pro koho jsou léky určeny a jakým způsobem jsou vyrobeny. Rozdělení podle určení: •
Humánní lék – tímto pojmem se rozumí lék, který je určen k podání lidem. Dozor v této oblasti vykonává Státní ústav pro kontrolu léčiv (SÚKL).
•
Veterinární lék – tímto pojmem se rozumí lék, který je určen k podání zvířatům. Dozor v této oblasti vykonává Ústav pro státní kontrolu veterinárních biopreparátů a léčiv (ÚSKVBL) [1].
Rozdělení podle způsobu výroby •
Individuálně připravovanými léky – se rozumí jakýkoli lék, který je připraven individuálně pro konkrétního pacienta v lékárně nebo ve zdravotnickém zařízení.
•
Hromadně vyráběný lék – tímto pojmem se rozumí jakýkoli lék, který je hromadně vyráběn pro větší skupinu osob a na trh je uváděn v konečné podobě k použití [1].
13
2.4. Životní cyklus léčiv Uvedení léku na trh předchází dlouholetý vývoj - klinické hodnocení, které probíhá v několika fázích. Výsledkem klinického hodnocení je stanovení nejvhodnějšího dávkování pro pacienta, kdy je lék účinný s minimálním rizikem nežádoucích účinků. Další etapou je registrace lékovou agenturou (např. SÚKL), kdy jsou posuzovány předložené výsledky klinického hodnocení a další požadavky zákona týkající se např. kvality zpracovávaných surovin, zajištění správné výrobní praxe a další. Po registraci může být lék uveden na trh. V té chvíli začíná jeho hodnocení v praxi. Sleduje se výskyt nežádoucích účinků, interakce s dalšími léky a další údaje, které se neprojevily v průběhu provedeného klinického hodnocení. V případě výskytu neočekávaných nežádoucích účinků je tato informace zpracována a uvedena v souhrnné informaci o léku. Pokud se projeví závažnější nežádoucí účinky, může být lék úplně stažen z trhu [1].
2.5. ATC skupiny léčiv Anatomicko-terapeuticko-chemický (ATC) klasifikační systém adefinované denní dávky (DDD) jsou standardem při mezinárodním výzkumu využití léčiv a při identifikaci léčiv. V klasifikačním ATC systému jsou účinné látky rozděleny do různých skupin podle orgánu nebo systému, na němž působí, a jejich léčebných, farmakologických a chemických vlastností [2].
2.6.Vstup léčiv do prostředí Léčiva se do prostředí dostávají primárně dvěma cestami a to s močía exkrementy, nebo nesprávným nakládáním s nepoužitými či prošlými léky. Léčiva jsou biologicky aktivní látky uzpůsobené k tomu, aby byly pomalu metabolizovány a prodloužily tak své působení v organismu (Dietrich, 2005). Tudíž mohou být z organismu vyloučena, buď v nezměněné formě, nebo jako metabolity, které jsou v některých případech nebezpečnější než původní lék (Šídlová et al., 2011). Hlavními zdroji znečištění jsou tedy nemocní lidé, lidé beroucí léky dlouhodobě (např. ženy a hormonální antikoncepce) a zvířata ošetřovaná veterináři (chovná zvířata ošetřovaná léky). Léčiva se poté dostávají do odpadní vody, povrchové vody, nebo rovnou do půdy (Cooper et al., 2008). 14
Obr. 1: 1 Vstup léčiv do životního životního prostředí, prostředí, převzato a upraveno (Heberera, 2002) Z průzkumu vyplynulo, že pouze 47% lidí nevyužité či prošlé léky odnese do lékárny, až pětina občanů České České republiky nevyužité nevyužité či prošlé léky vyhazuje do komunálního odpadu, 5% je splachuje splachuje do záchodu nebo spálí [3].. Léčiva se poté do prostředí dostanou buď průsakem ze skládek, nebo do odpadních vod při spláchnutí do záchodu. Odpadní vodou se léčiva dostávají až do čistíren odpadních vod.
15
3. Čistírna odpadních vod
Obr. 2: Schéma ČOV Modřice [4]
3.1. Primární (mechanické) čištění Primární čištění neboli mechanická separace znečišťujících látek, se obvykle provádí ve dvou stupních. V prvním stupni dochází k oddělení hrubších částic na česlích, které odstraní hrubé plovoucí nečistoty (např. toaletní papír, ubrousky,igelitové pytlíky, kusy dřeva), a lapácích písku. Ty jsou často spojeny s lapáky tuků a cílem je oddělit písek od organických nerozpuštěných látek (Frintová, 2007). Ve druhém stupni dochází k oddělení tuhé fáze od kapaliny v usazovacích nádržích. Rychlost usazování je dána hustotou, velikostí, tvarem a viskozitou částic. Tímto mechanismem lze obsah organických látek v odpadních vodách snížit asi o 15-30% (Kulíková, 2014). Hrubší pevné částice se odstraňují průtokem odpadních vod rošty a síty. Těžší částice, jako zrna písku a štěrk, se usazují v lapácích písku. Ty se konstruují tak, aby rychlost průtoku nepřevyšovala rychlost 0,3 m/s a těžší částice mohly lépe sedimentovat
16
(Frintová Frintová,, 2007). 2007 Tento způsob čištění čišt je nedostatečný, proto se používá jen jako předčištění, aby nečistoty nepoškodily další zařízení v průběhu čištění (Sojka,2001). předčištění, Po mechanickém předčištění následuje primární čištění, jehož účelem je snížit organické znečištění před biologickým čištěním. čištěním. Jednoduchým gravitačním usazováním může být z odpadní vody odstraněna významná část organických organických nečistot [5 [5].. Usazená hmota z primárního čištění se nazývá primární kal, který je z primárních dosazovacích nádrží ná čerpán ke zpracování kalu [5], [5 , vzniká v množství nožství cca 50-60 50 60 g nerozpuštěných látek na osobu a den (Frintová, ( 2007). Účinnost odstranění léčiv během primárního čištění je velmi nízká, někdy dokoncemohou být látky propuštěny propuštěny bez ovlivnění (Kulíková, Kulíková, 2014). 2014 Účinnost odstranění diklofenaku během primárního čištění je maximálně 28% (Behera, 2011). 2011)
Obr. 3: 3 Průměrné odstranění cílových léčiv v různých procesech při čištění odpadních vod; Diklofenak zvýrazněn šedě (Behera, 2011)
3.2. .2. Sekundární (biologické) čištění Po primárním čištění následuje sekundární biologické čištění. Při bbiologickém m čištění odpadních vod se využívá mikroorganismů, které rozkládají a odstraňují organické látky látkytak, že je přeměňují na biologické biologické vločky. vločky. Rychlost rozkladu závisí závisí na řadě faktorů, např. na obsahu kyslíku ve vodě, pH, teplotě, typu znečištění a přítomnosti toxických 17
látek. Důležitá je použitá metoda čištění a velikost částic (Frintová, 2007). Čištění může probíhat i v povrchových vodách, avšak s mnohem nižší rychlostí, díky rozdílné koncentraci mikroorganismů v povrchových vodách a v čistírně odpadních vod (Sojka, 2001). Po biologickém čištění se musí oddělit vyčištěná voda od aktivovaného kalu, který vznikl při sekundárním čištění a v němž se zachytila některá léčiva. Aktivovaný kal je těžší než voda a separace se dosahuje tím, že se vločky kalu nechají gravitačně usadit, čemuž napomáhá konstrukce čiřicí nádrže pro zajištění nízké turbulence a rychlosti proudění [5]. Většina usazeného kalu je následně vrácena do procesní nádrže, aby byl znovu použit, a množství rovné denní produkci je odčerpáno do procesu zpracování kalu. Recirkulace kalu zajišťuje udržování určitého stáří kalu, které je rozhodující pro jeho schopnost účinně čistit odpadní vodu [5]. Při biologickém čištění odpadních vod se používá dvou různých postupů: anaerobní, aerobní rozklad.
3.2.1. Anaerobní rozklad Bez přítomnosti kyslíku dochází k anaerobnímu rozkladu, ten se obvykle využívá u vysoce znečištěných vod a také při běžném způsobu likvidace kalu, známém jako vyhnívání (Frintová, 2007). Zachycují se zde pevné látkya dochází k vytvoření bioplynu, který se skládá převážně z metanu a oxidu uhličitého (Kulíková, 2014).
3.2.2. Aerobní rozklad Při biologickém aerobním čištění dochází k oxidaci organických látek působením mikroorganismů za přítomnosti kyslíku (Frintová, 2007). Nejběžnějším způsobem biologického čištění odpadních vod je aktivace. Aktivovaný kal (směsná kultura mikroorganismů) ve vodě vytváří volně suspendované vločky (Frintová, 2007). Z aktivační nádrže odtéká kal ve směsi s vyčištěnou odpadní vodou do separační nádrže, v níž se oddělí sedimentací. Voda je vypouštěna na další stupeň čištění, zahuštěný aktivovaný kal z dosazovací nádrže je vracen zpět do aktivační nádrže, aby pomáhal udržet rychlost reakce (Sojka, 2001).
18
Je potřeba zajistit dostatečné provzdušňování odpadní vody (stlačeným vzduchem), aby byl zajištěn přísun kyslíku, dále je zapotřebí vodu promíchávat, aby docházelo ke kontaktu vloček aktivovaného kalu s odpadní vodou (Frintová, 2007; Kulíková, 2014). Ve vodě byly po sekundárním čištění nalezeny mnohem menší koncentrace léčiv než ve vodě po primárním čištění (Kulíková, 2014). Po sekundárním čištění, je průměrná účinnost odstranění léčiv z odpadní vody v rozmezí 38-100%, u diklofenaku to je 68+-25% (Behera, 2011). Tab. 1:Míra odstranění léčiv z odpadních vod v procesu čištění, porovnání s jinými léčivy, převzato a upraveno (Kulíková, 2014). Přitékající
Odtékající
Účinnost
voda (µg/l)
voda (µg/l)
(%)
Neuvedeno
100
0,05-1,51
81
Aerobní
23
9,1
60
Anaerobní-aerobní
0,131
0,024
81
Neuvedeno
0,10-4,11
0,04-1,95
35
Aerobní
373
48
87
Anaerobní-aerobní
2260
0,04
98
Neuvedeno
0,17-83,5
< 95
74
Aerobní-anaerobní
0,0049
0,00094
81
Lék
Sekundární čištění
Aspirin Diazepam
Diklofenak
Ibuprofen
3.3. Terciární čištění Využívá se vzniku vloček (chemický kal) při smíšení koagulátu s vodou (Sojka, 2001). Slouží k dočištění odpadních vod, především k odstranění fosforu, nerozpuštěných látek a k hygienizaci vody.
19
Tab. 2: Účinnost odstranění léčiv po terciárním čištění, porovnání s jiným léčivy, převzato a upraveno (Kulíková, 2014). Terciární
Přitékající
Odtékající
čištění
voda (µg/l)
voda (µg/l)
Aktivovaný kal
0,997
0,420
58
UV záření
0,53
0,34
36
Aktivovaný kal
3,20
0,8
75
UV záření
14,6
n.d.
100
Aktivovaný kal
0,34
0,21
38
UV záření
0,37
0,33
11
Aktivovaný kal
170
2,8
98
UV záření
38,1
n.d.
100
UV záření
1,32
0,13
90
Aktivovaný kal
26,0
n.d.
100
Lék
Diklofenak
Ibuprofen
Ketoprofen
Kyselina salicylová Paracetamol
Účinnost (%)
3.4. Kal Znečištění odpadní vody z různých fází čištění se odstraňuje ve formě kalu s vysokým procentem vody. Tento kal je pak zapotřebí dále zpracovat. Charakter, vlastnosti a objem kalu se liší v závislosti na kvalitě přítoku odpadní vody. Náklady vynaložené na zpracování kalu jsou často vysoké, proto zvolit správnou metodu kalového hospodářství je nejdůležitějším stupněm v celém procesu čištění odpadních vod (Frintová, 2007). Kalové hospodářství se skládá z jednotlivých stupňů, které tvoří posloupnost různých operací: zahuštění, stabilizace a odvodnění. Konečným stupněm nakládání s kalem je jeho kompostování, spalování nebo využívání jako přídavku do půdy ke zlepšení jejich vlastností (Frintová, 2007).
3.4.1.Typy kalu Typy kalu rozlišujeme: -
Surový kal- separovaný v průběhu čištění > musí se dále zpracovávat
-
Primární kal- z mechanického stupně čištění
-
Biologický kal- z biologického stupně čištění
20
-
Chemický kal- ze srážení po biologickém čištění
(Frintová, 2007)
3.4.2. Složení kalu Kal se skládá z látek v pevné a kapalné formě a má vločkovitý charakter.
3.4.3. Stanovení léčiv v čistírenských kalech Vzorky se odebírají do polyethylenových lahví a následně se provádí extrakce sledovaných analytů z matrice, výsledný extrakt se přečistí a zkoncentruje. Nesteroidní protizánětlivé látky (diklofenak) se obvykle stanovují kapalinovou chromatografií se spektrometrickou detekcí. Množství se detekuje pomocí hmotnostního spektrometru nebo pomocí spektrofotometrických či fluorescenčních detektorů (Hájek, 2013).
21
4. Mechanismy odstranění léčiv 4.1. Fotodegradace Fotochemickou degradaci lze považovat za hlavní cestu vedoucí k samovolnému rozpadu léčiv v povrchových vodách. Rozlišujeme dva mechanismy: přímou fotolýzu a radikálový rozpad (Kotyza et al., 2009). Příčinou přímé fotolýzy je absorpce slunečního záření molekulou léčiva, přičemž dochází k jejímu rozpadu na jednodušší látky (Hájek, 2013). Účinnost fotolýzy závisí nejen na vlastnostech sloučenin (absorpční spektrum), ale i na intenzitě slunečního záření (zeměpisná šířka, roční období) (Šídlová et al., 2011), hloubce, v jaké se částice nachází, a případnému zákalu vody (Hájek, 2013). Radikálový rozpad je realizován účinkem silných oxidačních činidel- hydroxylový radikál ∙ , alkylperoxidový radikál ∙ nebo atomární kyslík (Kotyza et al., 2009).
4.2. Sorpce Sorpce na aktivovaný kal je dána dvěma mechanismy- absorpcí a adsorpcí. Absorpce probíhá na základě hydrofobní interakce alifatických a aromatických skupin léčiv s lipofilní membránou mikroorganismů a s lipofilními částmi kalu (Šídlová et al., 2011). K adsorpci dochází působením elektrostatických sil mezi pozitivně nabitými skupinami xenobiotik a záporně nabitým povrchem biomasy (Kotyza et al., 2009). Právě kvůli těmto mechanismům byl např. ve Švýcarsku vydán zákaz používání čistírenských kalů jako hnojiva zemědělských ploch z obavy, že by se sorbované látky mohly dostat do potravního řetězce (Kotyza et al., 2009).
4.3. Biodegradace Principem biodegradace je buď úplné rozložení léčiv, nebo alespoň jejich částečná transformace na degradační produkty díky mikrobiální aktivitě aktivovaného kalu (Kotyza et al., 2009). V čistírnách odpadních vod však díky neustálé nízké koncentraci reziduálních léčiv nedochází k jejich úplnému odbourání (Hájek, 2013). Stupeň
22
degradace závisí na stáří kalu v aktivaci, dostupnosti léčiv v matrici, sorpci, pH a dalších faktorech (Kotyza et al., 2009).
4.4. Chemická oxidace Principem chemické oxidace je tvorba oxidantů ∙ , během čištění vody a jejich následná reakce s organickými látkami a léčivy (Kotyza et al., 2009). Degradace léčiv za pomoci chemické oxidace je podobná fotodegradaci, protože také probíhá radikálově. Výhodnější v tomto případ je použít chemickou oxidaci na již vyčištěnou vodu, neboť zde bude navíc díky ozonizaci docházet k její dezinfekci (Hájek, 2013). Tab.3: Účinnost odstranění vybraných farmak různými metodami, ve srovnání s jinými léčivy, převzato a upraveno (Kulíková, 2014). Počáteční
Účinnost odstranění
koncentrace (mg/l)
(%)
Elektrolýza
0,5
100
TiO2 /UV
0,8
50
TiO2
15
100
Foto-Fentovona reakce
50
100
TiO2
4,2
75
H2O2/UV
0,24-0,71
90
Kyselina
H2O2/UVC
215-320
90
klofibrová
TiO2/UV
10
100
Lék
17β-estradiol
Diklofenak
Karbamazepin
Metoda
4.5. Membránové metody Membránové procesy patří mezi progresivní technologie v oblasti čištění odpadních vod, které jsou vysoce účinné při separaci xenobiotik o nízkých koncentracích (Kotyza et al., 2009). Díky vhodným sorpčním vlastnostem prokazují sice vysokou účinnost především při odstraňování estrogenních hormonů, nejsou však schopny zachytit většinu ostatních skupin léčiv, pro jejichž separaci je nutné použít nanofiltraci nebo reverzní osmózu (Hájek, 2013). Nanofiltraci lze také v budoucnu použít při oddělování léčiv a jejich metabolitů z moči pacientů (Kotyza et al., 2009).
23
4.6. Aktivní uhlí Aktivní uhlí se využívá ve formě granulí nebo prášku, většinou odstraňuje polutanty nepolárního charakteru (Kulíková, 2014). Velkou výhodou je, že během procesu nevznikají žádné meziprodukty nebo metabolity a také jeho snadná manipulace a odstranění po použití (nejčastěji se spaluje). Spalováním pak dochází i k odstranění všech organických látek včetně adsorbovaných léčiv (Kotyza et al., 2009).
4.7. Fytoremediace Fytoremediace je technologie využívající rostliny a asociované mikroorganismy v rhizosféře k odstranění, přeměně nebo zadržení toxických látek nacházejících se v půdě, sedimentech, spodní vodě, povrchové vodě a dokonce i v atmosféře (Šídlová et al., 2011).
4.7.1. Kořenové čistírny odpadních vod Patří mezi přírodní způsoby čištění odpadních vod a jsou speciálně navrženy tak, aby vylepšovaly kvalitu vody. Mokřady tvoří směs vody, substrátu, rostlin, odpadu, různých bakterií a mikroorganismů, které zajišťují zlepšení kvality vody (Gardavská, 2013). Principem je průtok odpadní vody propustným filtračním polem (horizontální nebo vertikální), které je osázeno mokřadními rostlinami. Při průtoku odpadní vody mokřadem dochází k vysoce účinnému odstraňování nečistot z vody rhizofiltrací (Kotyza et al., 2009). Primární charakteristikou umělých mokřadů je použitá vegetace nebo naopak její nepřítomnost, vlastnosti substrátu (složení, pórovitost) a hydrologické změny. Rozlišujeme mokřady s plovoucími, submerzními a emerzními rostlinami. Mezi druhy nejčastěji využívané v České republice patří např. rákos, orobinec, sítina, kosatec atd. (Kotyza et al., 2009). Tato metoda je nejméně finančně náročná ze všech výše zmíněných a to v případě, kdy jsouvelké objemy vody znečištěny nízkými koncentracemi polutantu, což je v případě léčiv splněno (Kotyza et al., 2009).
24
Obr. 4:Typickéuspořádání kořenové čistírny odpadních vod [6] 1-distribuční zóna (kamenivo, 50-200 mm), 2-nepropustná bariéra (PE nebo PVC), 3-filtrační materiál (kačírek, štěrk, drcené kamenivo), 4-vegetace, 5- výška vodní hladiny v kořenovém loži nastavitelná v odtokové šachtě, 6-odtoková zóna (shodná s distribuční zónou), 7-sběrná drenáž (průměr 150-200 mm), 8-regulace výšky hladiny
25
5. Diklofenak Diklofenak je nesteroidní látka s dobrým protizánětlivým, analgetickým a mírným antipyretickým účinkem (Katzung, 1994).
5.1.Základní vlastnosti diklofenaku Tab. 4:Základní vlastnosti diklofenaku
Strukturní vzorec
Sumární vzorec Systematický název
C14H11Cl2NO2 2-[2-(2,6-dichlorofenylamino) fenyl] octová kyselina
Molekulová hmotnost
296,148 g/mol
Bod tání
283-285°C
Diklofenak je derivát kyseliny octové a vyskytuje se ve dvou formách buď jako diklofenak sodná sůl nebo jako diklofenak draselná sůl. Obě formy tvoří bílý nebo slabě nažloutlý krystalický slabě hydroskopický prášek mírně rozpustný ve vodě, snadno rozpustný v metanolu, dobře rozpustný v 96% lihu a těžce rozpustný v acetonu. Diklofenak sodná sůl taje při 283-285°C (Český lékopis 2.díl, 2002).
5.2.Účinky diklofenaku Diklofenak se používá k úlevě od bodavé svalové bolesti, bolesti hlavy, pooperační bolesti, nádorové bolesti, bolestivých otoků nebo zánětu po úrazu, ztuhlosti, při revmatických onemocněních (chronické i akutní artritidě), v gynekologii i v očním lékařství [7]. Diklofenak snižuje tvorbu prostaglandinů, které se účastní na vyvolání bolesti a zánětu v místech poškození organismu, čímž snižuje bolest a příznaky zánětu [8].
26
5.3.Užití a dávkování dikolofenaku Diklofenak se užívá ve formě potahovaných tablet, kapslí, čípků, injekcí, krémů, gelů a očních kapek. Diklofenak je silně účinný a proto se podává v nízkých dávkách. Doporučený rozsah dávkování pro dospělé a dospívající od 15 let věku je mezi 50 mg až 150 mg sodné soli diklofenaku za den, rozděleno do 2 - 3 samostatných dávek [7]. V případě gelu se doporučuje aplikace 3-4 denně, v tenké vrstvě vetřít do kůže. Gel by se však neměl používat déle než 14 dní. Diklofenak by se také neměl užívat během těhotenství ani během kojení a to ani ve formě gelu. Při užívání vyšších dávek diklofenaku by pacient neměl řídit ani obsluhovat stroje [7].
5.4.Distribuce Diklofenak je vázán z 99,7% na plazmatické bílkoviny, hlavně albumin (99,4%). Distribuční objem je 0,12-0,17 l/kg [7]. Diklofenak proniká do synoviální tekutiny, ve které byly naměřeny nejvyšší koncentrace za 2 až 4 hodiny po dosažení maximálních koncentrací v plazmě. Poločas eliminace ze synoviální tekutiny je 3-6 hodin [7].
5.5.Metabolismus Metabolismus diklofenaku je velice rychlý, již při prvním průchodu játry je látka rozložena téměř z 50 %, vznikající metabolity jsou tvořeny jednorázovou i mnohočetnou hydroxylací a následnou vazbou na kyselinu glukuronovou. Diklofenak a jeho metabolity (4'-hydroxydiklofenak,
5-hydroxydiklofenak,
3'-hydroxydiklofenak,
4',5-dihydroxydiklofenak) jsou vylučovány především močí, část se eliminuje žlučí. Kumulace v synoviální tekutině způsobuje delší terapeutický účinek, než by odpovídalo poločasu eliminace, který je v rozmezí 1-2 h (Vrtalová, 2010).
27
Obr. 5: Metabolizace diklofenaku (Bradáč, 2015)
5.6. Nežádoucí účinky diklofenaku Nežádoucí účinky se vyskytují asi u 12% pacientů a u 10% se vyskytnou trávicí obtíže (Lullmann et al., 2002). Nežádoucí účinky jsou z hlediska očekávané frekvence výskytu řazeny dle následujících kritérií: velmi časté (≥ 1/10), časté (≥ 1/100 až <1/10), méně časté (≥1/1000 až <1/100), vzácné (≥1/10 000 až <1/1000), velmi vzácné (<1/10 000) [7]. Často se mohou vyskytovat například: -
bolesti hlavy, závratě
-
zvracení, průjem, plynatost, snížená chuť k jídlu, malé krvácení do trávicího traktu
-
zvýšení hodnot aminotransferáz
-
hypersenzitivita (vyrážka, svědění) 28
Vyskytuje se zde také zvýšené riziko arteriálních trombotických příhod (infarkt myokardu, cévní mozková příhoda) při užívání vyšších dávek diklofenaku (150 mg/den) nebo při dlouhodobé léčbě [7]. Vzácně se může vyskytnout například: -
otoky (hlavně u pacientů se zvýšeným krevním tlakem a poruchami funkce ledvin)
-
kopřivka
-
hepatitida, žloutenka, poškození jater
-
gastritida, gastrointestinální krvácení, krvavý průjem, peptický vřed (s krvácením nebo perforací nebo bez těchto komplikací)
-
astma včetně dušnosti
-
hypertenze, vaskulitida
-
ospalost
-
hypersenzitivita, anafylaktické reakce
Při dlouhodobém užívání by se proto měla kontrolovat funkce jater, ledvin a srdce, také by mělo docházet k pravidelným kontrolám krevního obrazu [7]. Při užívání diklofenaku ve formě gelu se mezi časté vedlejší účinky uvádí dermatitis (včetně kontaktní dermatitidy), vyrážka, ekzém, erytém a svědění [7].
5.7. Využití diklofenaku Diklofenak se používá například v těchto přípravcích: Almiral, Apo- Diclo, Diclac, Diclofenac, Diclophlogont, Dicloreum, Ecofenac, Feloran, Flamrase, Inflamac, Monoflam, Naklofen, Olfen, Rementhan, Rewodina, Veral, Voltaren (Katzung, 2006) Diklofenak byl poprvé uveden na trh v Japonsku v roce 1974, ale jeho použití nebylo ve Spojených státechschválenoaž do roku 1989, pravděpodobně kvůli obavám z jeho hepatotoxicity (Beale et al., 2011).
5.8. Spotřeba diklofenaku Oproti roku 2014 se v roce 2015 v ČR prodalo o 200 tisíc balení diklofenaku více. 29
Tab. 5: Nejvyšší nárůst spotřeby léčiv v počtu balení, srovnání roku 2015 a 2014, převzato a upraveno [7]
Rok
Kód ATC7
Název ATC7
počet balení
rok 2014
rozdíl
2015 2015
N02BE01 R02CB01
Paracetamol Acetylencystein
7344160 1566766
7034441 1275205
309719 291561
2015
M02AA15
Diklofenak
1772733
1541064 231669
2015
A02BC02
Pantoprazol
1533570
1342058
191512
Tab. 6: Top 20 ATC3 skupin podle počtu balení, převzato a upraveno [7]
Rok
Kód ATC3
Název ATC3
počet balení
finance bez OP a DPH
DDD celkem
2015
N02
Analgetika
20773368
1520015668
91957811
2015
M01
Protizánětlivá a protirevmatická léčiva
15422000
1194923118
222708371
2015 2015 2015
N05 R05 C07
10457256 10376216 8242518
1550182382 875375077 762274197
170725846 63720866 262714158
2015
G03
4229445
1568099828
254185365
Psycholeptika Léčiva proti nachlazení a kašli Beta-blokátory Pohlavní hormony a modulátory genitálního systému
V roce 2015 se prodalo skoro 15,5 milionu balení protizánětlivých a protirevmatických léčiv. Tab. 7: Spotřeba diklofenaku podle cesty podání v ČR za rok 2010, převzato a upraveno [7] Název
Cesta
Počet
Finance bez
DDD
ATC7
podání
balení
OP a DPH
celkem
Injekce
116 892
4 392 142
481 755
0,5025
Perorální
473 908
31 230 742
9 092 248
9,4835
Rektální
11 033
599 458
83 760
0,0874
Kožní
395 661
34 567 602
0
0,0000
Oční
6 771
721 888
0
0,0000
1 004 265
71 511 832
Diklofenak
Celkem spotřebováno
30
DDD/1000/obyv./den
5.9.Diklofenak v povrchové a odpadní vodě První výzkumy o přítomnosti léčiv v životním prostředí proběhly v 70. letech, tehdy se začala monitorovat přítomnost farmaceutických látek v životním prostředí, jejich působení na organismy a další dopady způsobené jejich přítomností (Kulíková, 2014). Tab. 8: Porovnání obsahu diklofenaku v povrchových vodách v ČR a dalších zemích s dalšími analgetiky (ng/l), převzato a upraveno (Vydrová, 2011)
Analyt/Stát Diklofenak Ibuprofen paracetamol Kofein
Kys. Salicylová
UK
8
18
X
X
14
Německo
33
11
X
104
X
Švédsko
669
56
X
X
X
Španělsko
29
60
42
X
X
ČR
2154
1947
58
697
83
Z tabulky jasně vyplývá, že Česká republika je na tom, z hlediska koncentrace diklofenaku v povrchové vodě, nejhůře z vybraných zemí. V dané studii se v ČR naměřila koncentrace diklofenaku 2,154 μg/l. Tab.9:Koncentrace vybraných analgetik, pro různé země, v odpadních vodách (ng/l),převzato a upraveno (Vydrová, 2011)
Analyt/Stát Diklofenak Ibuprofen paracetamol
kys.
kys.
Salicylová
Mefenamová
Francie
486
219
X
52
X
Rakousko
4114
2679
X
X
X
UK
X
405
X
X
1327
Švédsko
111
751
X
X
X
Španělsko
250
516
10194
X
5
ČR
2394
5191
355
16
6
31
5.10.Vliv diklofenaku na necílové organismy Neznámé způsoby působení farmaceutických kontaminantů na nižší organismy, ztěžuje predikci toxicity daných léků. Koncentrace léčiv naměřené v povrchových vodách jsou obecně výrazně nižší než koncentrace způsobující akutní toxicitu pro vodní organismy. Nicméně, chronická expozice léčiv má potenciál pro četné mírnější účinky, jako jsou metabolické nebo reprodukční změny necílových organismů (Cooper et al., 2008).
5.10.1.Vliv diklofenaku na živočichy U mnoha druhů obatlovců způsobuje diklofenak poškození trávicího traktu a ledvin. Působí nefropaticky díky inhibici biosyntézy prostaglandinů. Diklofenak také generuje velké množství reaktivních radikálů kyslíku (ROS), ty bývají zdrojem poškození proteinů. Koncentrace, které způsobují tyto efekty, jsou ale stále vyšší než ty, které se vyskytují v prostředí (Michelová, 2011). Další efekty diklofenaku byly sledovány na druhu kvasinky Candida albicans. Po přidání diklofenaku byla pozorována inhibice tvoření klíčních hyf, ty umožňují této kvasince osidlovat prostředí a reagovat na nepříznivé podmínky. Proto mají morfologické změny hyf vliv na její životaschopnost (Ericson et al., 2010). U slávky jedlé (Mytilus edulis) v koncentraci diklofenaku 100 μg/l byla pozorována retardace růstu. Studie také prokázala, že se diklofenak bioakumuluje ve tkáních, což způsobuje zvýšené změny a poškození při delším vystavení diklofenaku (Ericson et al., 2010). U medaky japonské (Oryzias latipes) byla už od koncentrace 1μg/l sledována zvýšená produkce cytochromů a to hlavně u samců. V této koncentrace byla jejich produkce zvýšena 9,3x v játrech, 5,7x v žábrech a 18,4x ve tkáni střeva. To naznačuje potenciál diklofenaku vyvolat u medaky buněčnou toxicitu (Michelová, 2011). U samců byla také pozorována zvýšená produkce vitellogeninu, tudíž by diklofenak mohl ovlivnit i hormonální systém samců (Michelová, 2011). Při vystavení pstruha duhového (Oncorhynchus mykiss) environmentálně reálným koncentracím diklofenaku, vyvolává to u něj reakci v játrech, ledvinách a žábrách (Triebskorn, 2004). Pstruh duhový diklofenak akumuluje v celém těle, hlavně v žábrách, ledvinách a játrech. Dochází ke změnám ve tkáních, které ukazují na aktivované 32
detoxikační mechanismy a zvýšenou spotřebu energetických zásob. Tyto změny probíhaly již od koncentrace 1 µg/l. U žáber, ledvina jater už bylo zřejmé poškození jejich funkce (Triebskorn, 2004). U pstruha potočního měly koncentrace reálně se vyskytující v prostředí (0,5 μg/l a vyšší) vliv na jeho krvetvorbu snížením hematokritu. Nefrotoxicita diklofenaku mohla být způsobena inhibicí tvorby prostaglandinů a indukcí oxidativního stresu (Michelová, 2011). V letech 2000 až 2003 v Pákistánuse vyskytlo vysoké procento úmrtí (5-86%) dospělých supů Gyps bengalensis, díky čemuž také došlo k poklesu jejich populace (34-95%).Tato úmrtí byla spojena se selháním ledvin a viscerální dnou (Kummerer, 2009). Byla nalezena přímá korelace mezi rezidui protizánětlivého léku diklofenaku a selháním ledvin. Supi požívali diklofenak při krmení z mršin dobytka, který jím byl ošetřen. Při studii bylo také dokázáno, že k zabránění dalšímu úhynu supů by stačilo místo diklofenaku používat meloxicam, který na supy nemá žádný účinek (Kummerer, 2009).
33
6. Buněčné suspenze 6.1. Suspenzní kultury Buněčné suspenzní kultury rostlin představují relativně homogenní populaci buněk nebo malých buněčných agregátů, které jsou kultivovány v pohybujícím se tekutém živném médiu. Buňky suspenze jsou kultivovány v kontrolovaných aseptických podmínkách. Jednotlivé buňky jsou v přímém kontaktu s živným médiem, takže jeho jednotlivé složky jsou jim rychle dostupné. Dobrá výměna plynů v pohybujícím se médiu umožňuje velmi rychlý růst buněčné suspenze (Kováč, 1992). Rostlinné buněčné kultury jsou potenciálně obnovitelným zdrojem různých látek, u kterých by chemická výroba byla finančně nákladnější. Z rostlinných buněčných kultur se získávají například barviva, esence, látky potřebné pro výrobu léků, atd. s výrazně vyšším výtěžkem sekundárních metabolitů než z mateřské rostliny (Kieran, 1997).
6.2. Historie Na přelomu 19. století se Haberlandt (1902) průkopnicky snažil izolovat a kultivovat jednotlivé buňky z listů rostlin. Předpokládal, že takový systém by mohl poskytnout vynikající příležitost pro studium vlastností a potenciálu rostlinných buněk a mohou vést k pochopení vzájemných vztahů buněk v mnohobuněčných organismech. Přestože se Haberlandtovi nepodařilo dosáhnout rozdělení jednotlivých buněk, jeho detailní práce z roku 1902 podnítila několik vědců, aby pokračovali v tomto směru zkoumání. (Bojwani et Razdan, 1996). V roce 1953 se Muirovi podařilo vyvinout techniku pro kultury jednotlivých buněk. Jednotlivé buňky byly umístěny na čtverečky filtračního papíru, spodní plocha papíru byla v kontaktu s aktivně rostoucí "sesterskou" kulturou. Tato technika zajistila nejen izolaci buněk, ale i jejich kontakt s živinami z média přes starší kulturu a s růstovými regulátory syntetizovanými sesterskou tkání (Dodds et Roberts, 1996). Téměř okamžitě po tomto objevu Bergmann v roce 1960 vyvinul mnohem lepší metodu. Filtroval suspenzní kulturu, což vedlo k zisku populace separovaných buněk. Buňky byly smíchány s živným médiem, ke kterému byl přidán agar. Teplé médium bylo poté nalito v tenké vrstvě do Petriho misky. S touto metodou byl Bergmann schopen iniciovat 34
buněčné dělení a tvorbu kalusu u asi 20% buněk tabáku a fazole. Tato metoda se brzy stala populární a stále se ještě používá (Pierik, 1987).
6.3. Jak získáme suspenzní kulturu? Suspenzní buněčné kultury můžeme získat buď z kalusu, z homogenizovaných diferencovaných pletiv, nebo z protoplastu. Suspenzní kultury jsou udržovány v tekutém mediu za kultivačních podmínek, které podmiňují stabilní stupeň disociace buněk. Ideální je kultivace v malých objemech na rollerech (v šikmé rovině se otáčející plocha) nebo třepačkách (pohyb baněk v horizontální rovině). Suspenzní kultura je základem monokoloniové izolacerostlinné buňky (klonování) a velkoobjemových kultivací. Buněčné populace těchto kultur jsou výchozím biologickým materiálem pro manipulace buněčného a genového inženýrství (Jirků et al., 1986).
6.4. Podmínky a způsoby kultivace rostlinných buněk Biotechnologické využití rostlinné buňky vyžaduje přechod od kultivací v malých objemech do větších objemů, což je jednak spojováno s modelováním levných kultivačních půd a použitím zařízení (bioreaktorů), která zajišťují dokonalou sterilitu kultivace. Tato zařízení se v základních rysech neliší od fermentací používaných pro kultivace mikroorganismů a mohou být konstruována na principu chemostatu i turbidostatu. Vzhledem k tomu, že rostlinné buňky jsou křehké, je obvykle vyloučeno mechanické míchání a kultury jsou míchány proudem procházejícího sterilního vzduchu. Kultivační teplota se pohybuje v rozmezí 25-30°C (Jirků et al., 1986). Volba způsobu kultivace i kultivačního prostředí je podřízena vlastnostem kultury, stupni diferenciace a cíli kultivace (tj., buď produkci biomasy, nebo produkci extracelulárního metabolitu) (Jirků et al., 1986).
6.4.1.Charakteristika „ideální“ suspenzní kultury Mezi charakteristiky suspenzní buněčné kultury patří: -
stabilita genotypu, stálá koncentrace DNA;
-
zachování žádaných fyziologických a biochemických vlastností pletiva, popř. orgánu, z kterého byla kultura odvozena;
35
-
homogenita tvaru, velikosti a nutného stupně diferenciovaných buněk (homogenní morfologie buněk);
-
jednobuněčný stav, tedy výskyt minimálního počtu buněčných agregátů v suspenzní kultuře; snadno rozpadavé buněčné agregáty;
-
zřetelná jádra a hustá základní cytoplazma buněk;
-
karyologická stabilita;
-
malý výskyt diferencovaných pletiv (tracheální elementy);
-
rychlý nástup zdvojení populace (24-72 hod)
(Jirků et al., 1986) [9]
6.4.2. Základní složení média pro buněčné suspenze Základní složení média pro buněčné suspenze: -
základní anorganické živiny (Na+, K+, Ca2+, Mg2+, Cl-)
-
stopové prvky
-
zdroj energie (glukóza)
-
aminokyseliny
-
stabilizátory pH (CO32-/HCO3- , HPO42-/H2PO4-)
-
vitamíny a jiné složky různých enzymů
-
mastné kyseliny a lipidy
-
specifické proteiny a peptidy podporující buněčné dělení (růstové faktory)
-
antibiotika (pro snížení rizika kontaminace bakteriemi)
-
acidobazický indikátor (fenolová červeň)
-
sérum (zpravidla fetální bovinní sérum) [10]
36
6.4.3. .4.3. Růstová křivka buněčného buněčného růstu
Obr. 6: 6 Růstová křivka buněčného růstu [11] Vyjadřuje změny početnosti buněk v závislosti na čase. Růst buněčné kultury prochází několika fázemi: Lag-fáze fáze – počáteční fáze, početbuněk poč buněk nejprve mírně klesne a pak poměrně rychle vzrůstá. Buňky se adaptují na kultivační kultivační prostředí a připravují se k buněčnému dělení. Log-fáze fáze (též logaritmická nebo exponenciální fáze) – početbuněk buněk exponenciálně roste. V této fázi zachytíme nejvíce buněk v mitóze, což lze využít pro chromozomové vyšetření. Stacionární fáze – rychlost růstu buněčné populace postupně klesá, projevují se inhibiční mechanismy (např. kontaktní inhibice, produkce produkce růstových inhibitorů) a postupné vyčerpávání živin z média. Fáze úbytku buněk – dochází k postupnému odumírání buněk způsobenému nedostatkem živin, živin, snížením pH (následkem zvýšení koncentrace CO2 a dalších kyselinotvorných látek v médiu) a hromaděním toxických produktů buněčného metabolismu [12]. [12]
37
V průběhu kultivace suspenzních kultur sledujeme především změny pH, spotřebu kyslíku, vodivost média, růst, životnost a genetickou stabilitu kultury či případnou kontaminaci.Genetická stabilita suspenzních kultur je díky rychlému dělení obecně lepší než u kalusových kultur. V případě mikropropagace je však nutné ji periodicky prověřovat [9].
6.4.4. Měření a regulace v průběhu procesu v bioreaktorech Během procesu se měří fyzikální a fyzikálně chemické parametry. Mezi fyzikálnípatří: teplota, tlak páry, vody a stlačeného vzduchu, příkon, tvorba a množství pěny, průtok plynů a kapalin. Mezi fyzikálně-chemické patří: pH, redoxní potenciál, množství rozpuštěného kyslíku (kyslíková elektroda), měření koncentrace stimulátorů a inhibitorů růstu nebo tvorby produktů- C, N, P, S, Mg, K, Na, Fe, regulátory růstu, prekursory, měření koncentrace NH4+, Mg2+, Na+, Ca2+, PO43- atd. specifickými elektrodami [9].
6.4.5.Možnost ovlivnění tvorby sekundárních metabolitů Tvorbu sekundárních metabolitů lze ovlivnit buď elicitory (abiotické, biotické), prekursory nebo absorbenty [9].
6.5.Typy suspenzních kultur V zásadě existují dva typy suspenzních kultur: vsádkové (batch) a kontinuální kultury.
6.5.1.Vsádková kultura Slouží k iniciaci jednobuněčné kultury. Kultivace buněčné suspenze se provádí v100-250 ml baňkách, přičemž každá obsahuje 20-75 ml kultivačního média. Kultury jsou neustále množeny, pravidelně je odbírán malý podíl suspenze, který se převádí do čerstvého média. Během inkubační doby se biomasa suspenzních kultur zvětšuje díky buněčnému dělení a zvětšování buněk. Tento postup se opakuje po omezenou dobu, po níž se růst zastaví kvůli vyčerpání některých faktorů nebo hromadění některých toxických metabolitů v kultivačním médiu. Je-li v této fázi malý podíl buněčné suspenze, s rovnoměrně rozloženými buňkami a buněčnými agregáty, převede se do čerstvého média stejného složení (pasážování) a růst buněk je obnoven (Bojwani et Razdan, 1996). 38
Růst biomasy ve vsádkové kultuře lze charakterizovat sigmoidní růstovou křivkou. Zpočátku kultura prochází lag fází, po níž následuje krátká fáze exponenciálního růstu, během které dochází k aktivnímu buněčnému dělení(Bojwani et Razdan, 1996). V kultuře rostlinných buněk dosaženo je pouze 10-15 násobného zvýšení celkového počtu buněk, což odpovídá reprodukci v rozsahu 3-4 generací, poté kultura vstupuje do stacionární fáze (Jirků et al., 1986). Trvání lag fáze do značné míry závisí na fázi růstu zásobní kultury v době pasážování a na velikosti inokula. Kultury lze udržovat trvale v exponenciální fázi častým pasážováním dané suspenze (každé 2-3 dny) (Bojwani et Razdan, 1996). Dlouhodobé udržování kultury v stacionární fázi může mít za následek rozsáhlé úmrtí a lyze buněk. Je proto důležité, aby se suspenze pasážovaly brzy poté, co dosáhnou svého maximálního výnosu suché hmotnosti. Generační doba buňky v suspenzní kultuře se mění v závislosti na pletivu: Nicotiana tabacum, 48 h; Acer pseudoplatanus, 40 h; Rosa sp., 36 h; Haplopappus gracilis, 22 h (Bojwani et Razdan, 1996). Pro získání dobré suspenzní kultury je nanejvýš důležité, aby se, pokud je to možné, drolivý kalus používal zpočátku. Jak již bylo zmíněno dříve, drobivost kalusovéhopletiva se často zvyšuje, pokud je udržováno na polotuhém médium po 2-3 pasáže. Ale je třeba mít na paměti, že i nejlepší buněčná suspenze obsahuje buněčné agregáty a žádná suspenzní kultura se neskládá výhradně z volných buněk (Bojwani et Razdan, 1996).
6.5.2.Kontinuální kultura Řada kultivačních nádob byla navržena tak, aby v nich mohly po dlouhou dobu růst rozsáhlé kultury v ustáleném stavu tím, že se přidávalo čerstvé médium a vypouštělo použité médium. Kontinuální kultivace mohou být uzavřeného typu nebo otevřeného typu. V prvním případě, přidání čerstvého média je dáno odstraněním starého média. Buňky jsou z odpadního média mechanicky odděleny a přidány zpět do kultury. V "uzavřené kontinuální kultivaci" se tedy buněčná biomasa nadále zvyšuje. Naopak v "otevřené kontinuální kultivaci" je přítok média doprovázen odběrem stejného objemu kultury (media a buněk). Míra přítoku média a odběru kultury je nastavena tak, že kultury jsou udržovány na konstantním submaximálním tempu růstu „do nekonečna“ (Bojwani et Razdan, 1996). Jako dva hlavní typy zařízení pro otevřenou kontinuální kultivaci se používají chemostat a turbidostat. Při kultivaci v chemostatu je ustálený stav buněčného růstu udržován 39
konstantním přísunem čerstvého média, kde koncentrace zvolené živiny (dusík, fosfor nebo glukóza) byla upravena tak, aby limitovala růst. V takovém médiu jsou všechny ostatní konstituenty kromě těch, které limitují růst, přítomny v koncentraci vyšší, než je potřebné k udržení požadované míry buněčného růstu. Úroveň faktoru limitujícího růst je nastavena tak, že jakékoli zvýšení nebo snížení se odráží odpovídajícím zvýšením nebo snížením tempa růstu buněk. Při kultivaci v turbidostatu je vstup čerstvého média přerušován a řízen nárůstem zákalu kultury z buněčného růstu. Předem zvolená hustota biomasy je udržována vymýváním buněk (Bojwani et Razdan, 1996).
6.6.Využití suspenzní kultury Buněčné kultury se hojně využívají jako modelový systém při studiu procesů sekundárního metabolismu, indukci enzymů, genové exprese a jako výchozí materiál pro přípravu enzymů. Většina buněčných suspenzí v buňkách neobsahuje karotenoidy a chlorofyl, což je z hlediska izolace enzymů a sekundárních metabolitů velmi výhodné. Buněčné suspenzní kultury se také využívají jako výchozí materiál pro mutační šlechtění rostlin a k produkci somatických embryí (Kováč, 1992). Cílem vývoje technologií, které jsou založeny na použití suspenzních kultur, je především zajištění potřebných množství farmaceutických surovin na průmyslovém základě. Možnost pěstovat a průmyslově využívat rostlinné buňky podobně jako mikroorganismy odstraňuje především problémy, které jsou dnes spojeny se zajišťováním přírodních surovin (omezování rostlinných zdrojů, narušování životního prostředí, omezení klimatickými pásy atd.). K dispozici jsou i informace o přípravě suspenzních kultur z hlediska produkce alkaloidů, antibiotik, enzymů i peptidů a řady chemicky vzdálených látek s biologickou aktivitou. Velmi významná je produkce alergenů a inhibitorů rostlinných virů (Jirků et al., 1986). O většině těchto látek lze říct, že mohou být zároveň substrátem biotransformačního procesu, který je katalyzován enzymatický systémem buňky. Biotransformační potenciál rostlinné buňky lze průmyslově použít nejen pro cílené modifikace jejich produktů, ale i pro chemické modifikace látek připravených organickou syntézou (Jirků et al., 1986). Z uvedeného je zřejmé, že velmi důležitým faktorem vývoje průmyslových klonů rostlinných buněk je metodika jejich „screeningu“, rychlé a reprodukovatelné detekce žádané vlastnosti získané kultury. S přípravou kultury přirozeně souvisí i poznání její 40
funkční stability. Jiným problémem je udržení sterility kultur při dlouhodobých kultivacích. Zcela individuální jsou i ekonomická kritéria. Z těchto i dalších důvodů jsou prognózy úspěšnosti technologií na bázi rostlinných buněk velmi složité a zcela individuální (Jirků et al., 1986).
41
7. Tabáková buněčná suspenze BY-2 7.1. Tabáková buněčná suspenze BY-2 Tabáková buněčná suspenze BY-2 byla založena v 70. letech z kalusu iniciovaného na tabáku Nicotiana tabacum L. cv. „Bright Yellow 2“ v „The Tobacco Science Research Laboratory“ v Japonsku (Nagata et al., 1992). Díky svým jedinečným vlastnostem, jako je např. mimořádně vysoká rychlost růstu, životaschopnost a vysoká homogenita BY-2, buněčné linie se nyní stala jedním z nejpopulárnějších modelových systémů pro studium buněčné biologie a biochemie na vyšších rostlinách (Nagata et al., 2004). Používá se jako ideální model rostlinných buněk pro studium programované buněčné smrti a reakcí na uměle vyvolávané stresové podmínky, studium biosyntetických drah různých látek a produkce sekundárních metabolitů, signalizace v rostlinných buňkách a regulace buněčného cyklu, funkce cytoskeletárních struktur, intracelulárních transportních systémů a projevů genové exprese (Muselíková, 2012). BY-2 buňky byly také využity v mnoha aspektech výzkumu organel rostlin, neboť organely v BY-2 buňkách vykazují dynamické změny v morfologii a funkci v závislosti na jejich fázi růstu a kultivačních podmínkách (Nagata et al., 2004).
7.1.1. Charakteristika BY-2 jako materiálu pro analýzu rostlinných organel BY-2 buňky jsou rychle se množící meristematické buňky, které vykazují značnou homogenitu. Vzhledem k obtížím při přípravě homogenních meristematických buněk ve velkém množství z intaktních rostlin, biochemické a fyziologické analýzy jejich organel jsou téměř nemožné. Nicméně s BY-2 buněčnou linií můžeme snadno získat velké množství relativně homogenních meristematických buněk (Nagata et al., 2004). Homogenita BY-2 buněk může částečně záviset na jednoduché struktuře jejich buněčného shluku („cell cluster“). V tekuté suspenzní kultuře, BY-2 buňky tvoří malé buněčné shluky, z nichž každý se skládá z několika (obvykle 2-16) válcových článků zapojených mezi sebou do tandemu („řetízku“). Vzhledem k tomu, že většina povrchu každé buňky v lineárních shlucích buněk je přímo vystavena kultivačnímu médiu, mikroprostředí obklopující buňky je poměrně homogenní, což napomáhá udržovat buňky ve vysoce homogenním stavu (Nagata et al., 2004).
42
Jednoduchá struktura BY-2 buněčných shluků je výhodná pro mikroskopické pozorování cytoplasmatických organel. Navíc to může pomoci při účinné tvorbě protoplastu a následné izolaci organel. BY-2 buňky jsou snadno převedeny na protoplast, tlusté stěny rostlinných buněk se při účinné izolaci organel narušují, ale izolace organel z protoplastů je poměrně snadná (Nagata et al., 2004).
7.2. Kultivace BY-2 Buněčná suspenze tabáku BY-2 bývá udržována v tekutém LS médiu (Linsmaier a Skoog 1964) modifikovaném podle Nagaty (1992) (Víteček et al., 2005). LS médium bývá obohaceno o 30 g/l sacharózy, 370 mg/l roztoku KH2PO4, 1 mg/l thiamin HCl, 100 mg/l myo-inositolu a 0,2 mg/l 2,4-D. Před autoklávováním by mělo být pH média upraveno pomocí KOH na 5,8. Buňky by měly být kultivovány v Erlenmeyerových baňkách na orbitální třepačce při 27°C ±1°C a 135 otáčkách za minutu, k dosáhnutí neustálého krouživého pohybu média (Nagata et Kumagai, 1999; Nagata, 1992). V rámci zachování sterility by hrdlo Erlenmeyerovy baňky mělo být uzavřeno 3 vrstvami hliníkové folie. Většinou se kultivace provádí ve tmě, někdy však i při difuzním světle, přítomnost světla však není podmínkou kultivace. Po autoklávování se může vhledem k vysoké koncentraci fosfátů objevit bílá sraženina, ta však nemá vliv na kulturu (Nagata et Kumagai, 1999). Buněčná suspenze BY-2 je snadno synchronizovatelná kombinací inhibičních látek aphidicolinu a propyzamidu (Muselíková, 2012).
7.2.1. Jednokroková metoda synchronizace pomocíaphidicolinu: 1) Přeneseme část 7 dní starých BY-2 buněk Komagome pipetou do modifikovaného LS média, do kterého byl před použitím přidán aphidicolin. 2) Kulturu kultivujeme 24 hodin. 3) Poté je kultura promyta za pomocí čerstvého média, s odpadem nakládáme opatrně, neboť obsahuje aphidicolin. 4) Po filtraci je suspenze resuspendována a převedena do požadovaného objemu. 5) Buňky kultivujeme na orbitální třepačce; mitotický vrchol asi 70% buněk lze pozorovat 8 až 9 hodin po ukončení ošetření aphidicolinem. (Nagata et Kumagai, 1999)
43
7.2.2. Sekvenční metoda synchronizace aphidicolinu a propyzamidu: 1) Postup stejný jako u jednokrokové synchronizační metody od 1. do 5. kroku. 2) Po ošetření aphidicolinem se kultura kultivuje ještě 5 hodin, poté se přidá propyzamid. 3) Kultivace probíhá další 4 hodiny. 4) Buňky jsou promýványstejně jako při ošetření aphidicolinem. 5) Následuje kultivace na orbitální třepačce. Mitotický vrchol cca 95% buněk lze pozorovat 1hodinu po ošetření propyzamidem. Výběr metody závisí na typu experimentu. (Nagata et Kumagai, 1999)
7.2.3. Problémy kultivací BY-2 Některé laboratoře měly problémy s kultivováním BY-2, téměř pokaždé to však bylo způsobeno nesprávnou manipulací a udržováním buněčné linie. Chyba může nastat například při příliš těsném uzavření baněk, pravděpodobně z obavy z kontaminace. V takovém případě stačí obtočit baňky alobalem volněji a růst buněk by se měl obnovit. V jiných případech se zdá být problémem převod buněk ve stacionární fázi do čerstvého média. Buňky BY-2 mají navíc tendenci snadno sedimentovat, pokud není médium promícháváno. Při přenosu buněk do čerstvého média tak může snadno dojít k tomu, že se odebere pouze supernatant buněčné suspenze a buňky zůstanou usazené na dně baňky. Tomuto však lze snadno zabránit promícháním suspenze těsně před převodem do čerstvého média. Při přenosu buněk může dojít k potížím i při použití mechanických pipet, neboť mají tendenci snadněji přenést supernatan do čerstvého média. Proto Nagata a spol. používali Komagome pipety, druh odměrné pipety s relativně větším ústím (2mm) (Nagata et Kumagai, 1999). V laboratorní praxi se běžně používají plastové jednorázové Pasteurovy pipety. Existuje také poměrně jednoduchý způsob ověření zachování vysoké míry růstu buněk BY-2. Přenesením 0,9 až 1 ml buněk ze stacionární fáze (7. den) do 95 ml čerstvého média. Buňky se namnoží až 100násobně za týden. Pokud tomu tak není, pak buněčná linie není v dobrém stavu. Jestliže buňky rostou pomalu, existuje také metoda pro obnovení rychlosti růstu BY-2 buněk tím, že zvětšíme velikost inokula buněk ze stacionární fáze na 5 nebo 10 ml v době převodu. Buňky by pak měly dosáhnout stacionární fáze během 4-5 dní, v tomto bodě je 5 nebo 10 ml buněk ze stacionární fáze 44
opět převedeno na nové médium po 4-5 dnech. Jestliže opakujeme tento proces dvakrát až třikrát (případně víckrát), měla by se rychlost růstu obnovit (Nagata et Kumagai, 1999).
7.2.4. Růst BY-2 Růst buněčné suspenze tabáku probíhá stejně jako u ostatních buněčných suspenzí v podobě růstové křivky sigmoidního tvaru. (viz suspenzní kultury)
7.2.4.1. Rychlost a podmínky růstu TBY-2 Buňky tabáku BY-2 jsou rychle rostoucích buňky, které se množí až 100násobně do týdne za běžných kultivačních podmínek (Nagata et al., 2004). Vysoká rychlost růstu BY-2 je částečně závislá na obsahu fosfátů. Optimální množství v LS médiu bylo stanoveno na 510 mg/l, což je třikrát více, než obsahuje MS médium (Murashige a Skoog 1962). Nicméně tento fosfát byl v kultivačním médiu spotřebován do 3 dnů kultivace (Nagata, 1992). Mezi základní podmínky existence a růstu BY-2 suspenze patří přítomnost syntetické látky s auxinovým charakterem 2,4-D. Tuto růstovou látku nelze nahradit nativním, nebo jiným syntetickým auxinem při dlouhodobé kultivaci. 2,4-D zajišťuje nesoudržnost buněk (Muselíková, 2012).
7.2.5. Morfologie a cytologie BY-2 Suspenze buněk tabáku jsou typickým představitelem rostlinné buňky obsahujícím téměř všechny typy organel nalezených v jiných typech buněk. Suspenze BY-2 je tvořena charakteristickými vícebuněčnými jednořadovými řetízky, které spontánně nedisociují na jednotlivé buňky. Bez přítomnosti 2,4-D se řetízky nevytváří. Za standardních podmínek je suspenze fenotypově stabilní a neadheruje k podkladům. Jádra mají za normálních okolností kulovitý tvar a jsou často umístěná na jedné straně buňky, téměř se dotýkající cytoplazmatické membrány (Muselíková, 2012). Každá buňka obsahuje přibližně 400-750 mitochondrií a 50-100 plastidů, které se nediferencují do chloroplastů za běžných podmínek (Nagata et al., 2004). Suspenze tedy není schopna procesu fotosyntézy a je závislá na exogenní výživě. Z tohoto důvodu jsou buňky přizpůsobeny absorbovat všechny druhy látek z média, včetně těch, které nejsou potřebné pro růst. (Muselíková, 2012). 45
8. Závěr Léčiva se v životním prostředí vyskytují dlouhodobě, avšak o jejich přítomnost v prostředí se lidé začali zajímat až v 70. letech minulého století. Problém tkví v tom, že nejsme schopni je v dostatečné míře z prostředí odstraňovat. V případě diklofenaku je úspěšnost odstranění v ČOV cca 68% a v prostředí se vyskytuje v koncentracích v řádech µg/l. Na necílové organismy z říše živočichů působí nefropaticky díky své schopnosti inhibovat biosyntézu prostaglandinů a tvorbě velkého množství ROS. Vlivem diklofenaku na rostliny se budu zabývat ve své diplomové práci. Protože působení těchto cizorodých látek v rostlině lze sledovat již na buněčné úrovni, kde záleží hlavně na chemických a fyzikálních interakcích léčiv s buněčnou membránou, je nejvhodnější využít pro studium těchto interakcí právě buněčné suspenzní kultury. Suspenze rostlinných buněk se využívají od 50. let minulého století a představují významný experimentální materiál. Úspěšnost suspenzních kultur je dána do značné míry tím, že tyto suspenze představují jednodušší systémy, než jsou intaktní rostliny, a proto se u nich dá dobře odlišit vliv jednotlivých faktorů, jimiž jsou ovlivňovány. Disponují celou řadou fyziologických charakteristik, které velmi rychle reagují na změnu podmínek či ošetření. Jako modelový organismus bude zvolena tabáková buněčná suspenze BY-2, která byla založena v 70. letech z kalusu iniciovaného na tabáku Nicotiana tabacum L. cv. „Bright Yellow 2“ v Japonsku. Díky svým vlastnostem jako je například vysoká rychlost růstu (množí se až 100násobně do týdne), životaschopnost a vysoká homogenita buněk, se stala jedním z nejpopulárnějších modelových systémů pro studium buněčné biologie a biochemie na vyšších rostlinách.BY-2 má přesně definované podmínky a postupy při kultivaci, jejich nedodržení nebo nesprávná manipulace s buněčnou linii má za následek zpomalení nebo zastavení růstu kultury. BY-2 je charakteristická svou závislostí na přítomnosti 2,4-D v médiu, bez jeho přítomnosti neroste a nelze ho nahradit nativním ani jiným syntetickým auxinem. BY-2jako typický představitel rostlinné buňky obsahuje téměř všechny typy organel nalezených v jiných typech buněk až na chloroplasty, suspenze tudíž není schopna procesu fotosyntézy a je závislá na exogenní výživě. Proto jsou buňky přizpůsobeny absorbovat všechny druhy látek z média, včetně těch, které nejsou potřebné pro růst. Tato práce poslouží jako teoretický základ pro mou diplomovou práci, ve které bych se chtěla blíže zaměřit na vliv diklofenaku na BY-2. 46
9. Seznam zkratek BY-2 - Nicotiana tabacum L. cv. „Bright Yellow 2“; tabáková suspenze BY-2 SÚKL - Státní ústav pro kontrolu léčiv ÚSKVBL - Ústav pro státní kontrolu veterinárních biopreparátů a léčiv 2,4-D - 2,4-dichlorfenoxyoctová kyselina ATC - Anatomicko-terapeuticko-chemický; Anatomical Therapeutic Chemical DDD - definované denní dávky; Defined Daily Dose ČOV – čistírna odpadních vod ČR – Česká republika ROS – reaktivní radikály kyslíku LS médium - Linsmaier a Skoog medium 1964 MS médium - Murashige a Skoog medium 1962
47
10.
Seznam použité literatury
BEALE, J. M.; BLOCK, J. H. Wilson and Gisvold's textbook of organic medicinal and pharmaceutical chemistry. Philadelphia: Wolters Kluwer Health/Lippincott Williams & Wilkins, 2011, s.802-803. ISBN 978-0-7817-7929-6. BEHERA, S. K., et al. Occurrence and removal of antibiotics, hormones and several other pharmaceuticals in wastewater treatment plants of the largest industrial city of Korea. Science of the Total Environment, 2011, 409.20: 4351-4360. BOJWANI, S. S.; RAZDAN, M. K. Plant tissue culture: theory and practice, a revised edition. Elsevier.1996. s.63,66-69.ISBN 0-444-81623-2. BRADÁČ, A. Vliv diklofenaku na růst Lemna minor L. 2015. PhD Thesis. Masarykova univerzita, Přírodovědecká fakulta. COOPER, E. R.; SIEWICKI, T. C.; PHILLIPS, K. Preliminary risk assessment database and risk ranking of pharmaceuticals in the environment. Science of the total environment, 2008, 398.1: 26-33. Český lékopis 2002: Evropská část 2. Praha: Grada,;2002, s.2257-2259. ISBN 80-2470464-1. DIETRICH, D. R.; WEBB, S.; PETRY, T. Hot spot pollutants: Pharmaceuticals in the environment. Academicpress, 2005. DODDS, J. H.; ROBERTS, L. W. Experiments in plant tissue culture. Cambridge University Press, 1985. s.5-6; ISBN 0-521-31516-6. ERICSON, H.; THORSÉN, G.; KUMBLAD, L. Physiological effects of diclofenac, ibuprofen and propranolol on Baltic Sea blue mussels. Aquatic Toxicology, 2010, 99.2: 223-231. FRINTOVÁ, K. Čištění odpadních vod. 2007. PhD Thesis. Masarykova univerzita, Pedagogická fakulta. GARDAVSKÁ, A. Modelování čištění komunálních odpadních vod. 2013. PhD Thesis. Masarykova univerzita, Přírodovědecká fakulta.
48
HÁJEK, R. Stanovení léčiv v kalech z čistíren odpadních vod. 2013. PhD Thesis. Vysoké učení technické v brně, Chemická fakulta. HEBERER, T. Occurrence, fate, and removal of pharmaceutical residues in the aquatic environment: a review of recent research data.Toxicology letters, 2002, 131.1: 5-17. HYNIE, S. Farmakologie v kostce. Praha: Triton, 2001, s.206. ISBN 80-7254-181-1. JIRKŮ, V.; BASAŘVÁ, G. Biotechnologické využití rostlinné a živočišné buňky. Kvasný průmysl. 1986, 32.2:37-41. KATZUNG, B. G. Základní a klinická farmakologie. Vyd. 2. Jinočany: H & H, 2006, s.14, 574-575. ISBN 80-7319-056-7. KIERAN, P. M.; MACLOUGHLIN, P. F.; MALONE, D. M. Plant cell suspension cultures: some engineering considerations. Journal of Biotechnology, 1997, 59.1: 39-52. KOTYZA, J., et al. Léčiva–„nový “enviromentální polutant. Chemické listy, 2009, 103: 540-547. KOVÁČ, Jaroslav. Explantátové kultury rostlin. Skriptum. Ústí nad Labem: Univerzita Jana Evangelisty Purkyně, fakulta pedagogická, 1992, s.59-64. ISBN 80-7044-036-8. KUKLÍKOVÁ, Š. Monitorování osudu farmaceutických látek v procesu čištění odpadních vod. 2014. PhD Thesis. Masarykova univerzita, Přírodovědecká fakulta. KÜMMERER, K. The presence of pharmaceuticals in the environment due to human use–present knowledge and future challenges. Journal of environmental management, 2009, 90.8: 2354-2366. LINCOVÁ, D.; FARGHALI, H. Základní a aplikovaná farmakologie. Praha: Galén, 2002, s.304.ISBN 80-7262-168-8. LÜLLMANN, H.; MOHR, K.; WEHLING, M. Farmakologie a toxikologie. Praha: GradaPublishing, 2002, s.334. ISBN 8071699764. MICHELOVÁ, M. Výskyt farmak v prostředí a jejich interakce s organismy. 2011. PhD Thesis. Masarykova univerzita, Přírodovědecká fakulta.
49
MUSELÍKOVÁ, K. Interakce 2,4-D a etylénu v růstu tabákové BY-2 suspenze. 2012. PhD Thesis. Mendelova univerzita, Agronomická fakulta. NAGATA, T.; HASEZAWA, S.; DEPICKER, A. (ed.). Tobacco BY-2 cells. Springer Science & Business Media,s.1,192-193. 2004. NAGATA, T.; KUMAGAI, F.. Plant cell biology through the Windows of the highly synchronized tobacco BY-2 cell line. Methods in Cell Science, 1999, 21.2-3: 123-127. NAGATA, T.; NEMOTO, Y.; HASEZAWA, S. Tobacco BY-2 cell line as the “HeLa” cell in the cell biology of higher plants. IntRevCytol, 1992, 132.1: 30. PIERIK, R.L.M. In vitro culture of higher plants. Martinus Nijkoff Publishers, s.227. 1987. ISBN 90-247-3531-9 SOJKA, J., Malé čistírny odpadních vod. 2.vyd. Brno: ERA, 2004, s.98, ISBN 80-8651780-2. ŠÍDLOVÁ, P.; PODLIPNÁ, R.; VANĚK, T. Cytostatická léčiva v životním prostředí. Chem. Listy, 2011, 105: 8-14. ŠTĚPÁN, Z., et al. Effect of kadmium on tobacco cell suspension BY-2. 2011. TRIEBSKORN, R., et al. Toxic effects of the non-steroidal anti-inflammatory drug diclofenac: Part II. Cytological effects in liver, kidney, gills and intestine of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Aquatictoxicology, 2004, 68.2: 151-166. VÍTEČEK, J., et al. Aplikace spektrofluori-metrického stanovení esteras v rostlinném materiálu. Chemické listy, 2005, 99.7: 496-501. VITVAROVÁ, A. Stanovení léčiv v odpadních vodách. 2013. PhD Thesis. Masarykova univerzita, Přírodovědecká fakulta. VRTALOVÁ, M. Vliv kyseliny salicylové na fytoextrakci naproxenu a diklofenaku. 2010. PhD Thesis. Univerzita Karlova, Přírodovědecká fakulta. VYDROVÁ, L. Využití separačních metod pro studium biologicky aktivních látek ve vodách. 2011. PhD Thesis. Vysoké učení technické v brně, Chemická fakulta.
50
11.
Internetové zdroje:
[1] http://www.olecich.cz/encyklopedie/o-lecich; 1.5.2016 [2] http://www.whocc.no/atc/structure_and_principles/; 3.5.2016 [3] http://arnika.org/vyhazovani-leku-ohrozuje-zivotni-prostredi; 29.2.2016 [4] https://is.mendelu.cz/eknihovna/opory/zobraz_cast.pl?cast=11968; 8.3.2016 [5] http://cz.grundfos.com/odvetvi-a-aplikace-cerpadel/aplikace/primarytreatment.html; 8.3.2016 [6] http://www.ceskaenergetika.cz/nezarazene_clanky/cisteni_odpadnich_vod_v_kor enovych_cistirnach.html; 8.3.2016 [7] http://www.sukl.cz/; 8. 3. 2016 [8] http://www.olecich.cz/diklofenak-kardiovaskularni-riziko-obdobne-jako-ukoxibu; 9.3.2016 [9] http://slideplayer.cz/slide/3107077/; 11.4.2016; prezentace Ing. RNDr. Marek Klemš, Ph.D. [10] http://www.molbio.upol.cz/stranky/vyuka/BAM/03.%20Bunecne_kultury.pdf; 11.4.2015; prezentace Ing. Mgr. Marta Greplová, Ph.D. [11] http://www.wikiskripta.eu/index.php/Soubor:Bacterial_growth_cs.svg;
11.
2016 [12] http://www.slideshare.net/medik.cz/biologie-pro-bakale-praktikum-2; 11.4.2016
51
4.
