MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDĚCKÁ FAKULTA ÚSTAV EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE

MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDĚCKÁ FAKULTA ÚSTAV EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE

Bakterie ve sladařském a pivovarském provozu Bakalářská práce

Kateřina Křesalová

VEDOUCÍ PRÁCE: RNDr. Dagmar Matoulková, Ph.D.

Brno 2016

Bibliografický záznam:

Autor:

Kateřina Křesalová, Masarykova univerzita, Přírodovědecká fakulta, Ústav experimentální biologie

Název práce:

Bakterie ve sladařském a pivovarském provozu

Studijní program:

Experimentální biologie

Studijní obor:

Speciální biologie, směr Mikrobiologie a molekulární biotechnologie

Vedoucí práce:

RNDr. Dagmar Matoulková, Ph.D.

Odborný konzultant:

Mgr. Jana Kopecká, Ph.D.

Akademický rok:

2015/2016

Počet stran:

74

Klíčová slova:

Pivovarství, sladařství, výroba piva, kontaminace piva, mléčné bakterie, striktně anaerobní bakterie, octové bakterie, enterobakterie, biofilm

Bibliographic entery: Author:

Kateřina Křesalová, Masaryk University, Faculty of Science, Department of Experimental Biology

Title of thesis:

Bacteria in malt-house and brewery plant

Degree of programme:

Experimental biology

Field of study:

Special biology, Microbiology and molecular biotechnologies

Supervisor:

RNDr. Dagmar Matoulková, Ph.D.

Consultant:

Mgr. Jana Kopecká, Ph.D.

Academic year:

2015/2016

Number of pages:

74

Keywords:

brewery plant, malt-house, beer processing, beer contamination, lactic acid bacteria, strictly anaerobic bacteria, acetic acid bacteria, enterobacteria, biofilm

Abstrakt: Pivo je alkoholický nápoj s relativně vysokou mikrobiologickou stabilitou. Hořké chmelové látky, alkohol, oxid uhličitý, nízké pH, nízký obsah živin a kyslíku jsou faktory zabraňující rozvoji většiny mikroorganizmů včetně patogenních. V různých fázích výroby piva (v závislosti na obsahu živin, podmínkách prostředí a zdrojích kontaminace) se mohou vyskytovat a uplatnit různé bakteriální druhy. Cílem práce je podat literární přehled shrnující současné poznatky o výskytu, druhovém zastoupení a škodlivosti

bakterií

ve

sladařském

a

pivovarském

provozu

(v surovinách,

meziproduktech a v hotovém pivu) a základní metody jejich detekce a identifikace. Stručně bude popsán samotný proces výroby sladu a piva se zaměřením na místa, kde se může vyskytnout mikrobiální kontaminace. Rešerše bude doplněna o fotografickou dokumentaci vybraných bakterií (makroskopické a mikroskopické znaky kontaminant pivovarského provozu).

Abstract: Beer is an alcoholic beverage with relatively high microbiological stability. Bitter hop compounds, alcohol, carbon dioxide, low pH, low contents of nutrient and oxygen are factors limiting the growth of most of the microorganisms, including pathogens. Several species of bacteria can occur in different phases of beer processing (in dependence on nutrient content, environmental conditions and sources of contamination). The aim of this thesis is to give an overview, which summarizes current findings about occurrence, species representation and harmfulness of bacteria in malt-house and brewery plant (in raw materials, intermediate products and in a finished beer) and basic methods of their detection and identification. The process of beer production will be briefly described with the focus on places, where the contamination can occur. The text will also include photographical documentation of selected bacteria (macroscopic and microscopic characters of brewery plant contaminants).

Poděkování: Ráda bych poděkovala své vedoucí RNDr. Dagmar Matoulkové, Ph.D. za odbornou pomoc, za poskytování cenných informací a za čas a trpělivost při zpracování mé bakalářské práce. Dále bych chtěla poděkovat Mgr. Janě Kopecké, Ph.D. za konzultace a rady při vypracovávání fotografické dokumentace. Nakonec bych ráda poděkovala Ing. Petře Kubizniakové za doplňující cenné informace k první části bakalářské práce.

Prohlášení: Prohlašuji, že jsem svoji bakalářskou práci vypracovala samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány. V Brně dne ………………

………………………………… Kateřina Křesalová

Obsah: 1. Seznam použitých zkratek ............................................................................................... 9 2. Úvod ................................................................................................................................ 10 2.1. Pivo jako nápoj ......................................................................................................... 10 2.2. Pivo a bakterie .......................................................................................................... 10 3. Cíl práce .......................................................................................................................... 12 4. Proces výroby piva ......................................................................................................... 13 4.1. Suroviny ................................................................................................................... 13 4.1.1. Voda.................................................................................................................. 13 4.1.2. Ječmen a ostatní obilniny ................................................................................... 14 4.1.3. Chmel ................................................................................................................ 15 4.1.4. Pivovarské kvasinky .......................................................................................... 16 4.2. Výroba piva .............................................................................................................. 18 4.2.1. Sladování........................................................................................................... 18 4.2.1.1. Máčení .......................................................................................................... 19 4.2.1.2. Klíčení .......................................................................................................... 19 4.2.1.3. Hvozdění....................................................................................................... 20 4.3. Výroba mladiny ........................................................................................................ 20 4.3.1. Šrotování ........................................................................................................... 21 4.3.2. Vystírání ............................................................................................................ 21 4.3.3. Rmutování a scezování ...................................................................................... 21 4.3.4. Chmelovar ......................................................................................................... 23 4.4. Propagace kvasnic ..................................................................................................... 25 4.5. Hlavní kvašení .......................................................................................................... 26 4.6. Dokvašování ............................................................................................................. 27 4.7. Filtrace ...................................................................................................................... 28 4.8. Pasterace ................................................................................................................... 29 4.9. Plnění do obalů ......................................................................................................... 30 4.9.1. Lahvování.......................................................................................................... 30 4.9.2. Sudování ........................................................................................................... 32 5. Bakterie v procesu výroby sladu .................................................................................... 33 6. Bakterie v procesu výroby piva...................................................................................... 35 6.1. Mléčné bakterie......................................................................................................... 39 6.1.1. Mechanizmus rezistence mléčných bakterií proti účinkům chmelových látek ..... 42 6.1.2. Rod Lactobacillus.............................................................................................. 44 6.1.3. Rod Pediococcus ............................................................................................... 45 6.1.4. Metody detekce mléčných bakterií ..................................................................... 46 6.2. Enterobakterie ........................................................................................................... 48 6.3. Striktně anaerobní bakterie ........................................................................................ 49 6.3.1. Rod Pectinatus .................................................................................................. 50 6.3.2. Rod Megasphaera ............................................................................................. 52 6.3.3. Rod Zymophilus................................................................................................. 53 6.3.4. Rod Selenomonas .............................................................................................. 53 6.3.5. Metody detekce striktně anaerobních bakterií .................................................... 53 6.4. Ostatní rody .............................................................................................................. 54 7. Závěr ............................................................................................................................... 57 8. Literatura........................................................................................................................ 58 9. Přílohy ............................................................................................................................. 65

8

Seznam použitých zkratek 1. Seznam použitých zkratek AAB

Acetic acid bacteria (octové bakterie)

ABD medium

Advanced beer-spoiler detection medium (vylepšené médium pro detekci pivního kažení)

AFLP

Amplified fragment length polymorphism (polymorfizmus délky amplifikovaných fragmentů)

CKT

Cylindrokónický tank

DNA

Deoxyribonucleic acid (deoxyribonukleová kyselina)

FISH

Fluorescent in situ hybridisation (fluorescenční in situ hybridizace)

HGB

High gravity brewing (vysokoobsažné várky)

LAB

Lactic acid bacteria (mléčné bakterie)

MALDI-TOF MS

Matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (hmotnostní spektrometrie s laserovou desorpcí a ionizací za účasti matrice s průletovým analyzátorem)

MRS

De Man-Rogosa-Sharp

NBB

Nachweismedium für bierschädliche Bakterien (médium pro průkaz pivo kazících bakterií)

PCR

Polymerase chain reaction (polymerázová řetězová reakce)

RAPD-PCR

Random amplified polymorphic DNA-PCR (náhodně amplifikovaná polymorfní DNA-PCR)

RFLP

Restriction fragment length polymorphism (polymorfizmus délky restrikčních fragmentů)

SMMP

Selective medium for Megasphaera and Pectinatus (selektivní médium pro rody Megasphaera a Pectinatus) 9

Úvod 2. Úvod 2.1. Pivo jako nápoj Pivo je jedním z nejstarších a nejpopulárnějších nápojů na světě. Jedná se o nízkoalkoholický kvašený nápoj vyráběný z vody, sladu a chmele za použití pivovarských kvasinek (Preedy a kol. 2009). Nejtradičnější výroba piva se nachází v Evropě, ze které pochází většina pivních stylů (Briggs a kol. 2004). V historii se jednalo o domácí výrobu, která byla postupně převáděna do průmyslového měřítka (Priest a Stewart 2006). Mnoho států má výrobu piva definovanou zákonem, nejvíce striktní je v Německu, kde je kladen velký důraz na kvalitu a původ surovin (Boulton a Quain 2001). I když je pivo vařeno jen z několika mála surovin, stále nabízí nové možnosti chutí a stylů, které mohou oslovit mnoho dalších konzumentů (Priest a Stewart 2006).

2.2. Pivo a bakterie Pivo můžeme považovat za nápoj s relativně vysokou mikrobiologickou stabilitou (Suzuki a kol. 2006a). Jen velmi málo mikroorganizmů je v něm schopno přežít a množit se. Důvody proč je pivo tak nepříznivým prostředím pro většinu mikroorganizmů, jsou obsah alkoholu (0,5-10 % w/w), hořkých chmelových látek (přibližně 17-55 ppm izo-α-kyselin), oxidu uhličitého (přibližně 0,5 % w/w), nízké pH (3,8-4,7) a nízký obsah kyslíku (< 0.1 ppm). Hotové pivo obsahuje jen velmi málo využitelných živin, většina jednoduchých cukrů je spotřebována kulturními kvasinkami během hlavního kvašení mladiny (Sakamoto a Konings 2003). Se

stoupající

produkcí

nízkoalkoholického,

nealkoholického

a nepasterizovaného piva se však zvyšuje náchylnost k mikrobiálnímu kažení. Nealkoholická a nízkoalkoholická piva neobsahují alkohol nebo ho obsahují jen v nízkých koncentracích. Běžně využívané postupy výroby takových piv mívají za následek vyšší obsah zkvasitelných cukrů v hotovém produktu (Vaughan a kol. 2005). U nepasterovaných piv hrozí navíc riziko kontaminace při plnění piva do obalů. Kontaminace některými bakteriálními druhy (většinou anaerobními) bývá spjata s modernizací plnících technologií, při nichž se dosahuje minimálních koncentrací rozpuštěného kyslíku (Matoulková a kol. 2012b). Mikroorganizmy vyskytující se v surovinách, meziproduktech a v hotovém pivu mohou být příčinou celé řady nežádoucích jevů. Pokud se vyskytnou ve vstupních surovinách, mohou negativně měnit jejich vlastnosti - další zpracování takových surovin 10

Úvod již není vhodné. Kontaminující mikroorganizmy mohou produkovat různé metabolity, které přechází do dalších fází výroby a nevratně mění chuť a vůni piva. Mikroorganizmy jako takové mohou ve větším množství zhoršovat filtraci piva a způsobovat tak jeho zákal (Briggs a kol. 2004). Do skupiny bakterií kazících pivo řadíme některé bakterie mléčného kvašení, jako například Lactobacillus brevis a Pediococcus damnosus, a některé gramnegativní bakterie

jako

Pectinatus

cerevisiiphilus,

Pectinatus

frisingensis

a

Megasphaera cerevisiae. Mohou způsobit zakalení piva a tvorbu sedimentu, nepříjemný zápach a chuť piva, které jsou způsobeny např. produkcí diacetylu, sirovodíku, kyseliny propionové a dalších senzoricky aktivních látek (Suzuki 2011). Dále se v pivovarském provozu objevují enterobakterie, např. Obesumbacterium proteus či Rahnella aquatillis. Bývají detekovány v mladině a vyznačují se produkcí biogenních aminů. Ojediněle lze zaznamenat i rody Bacillus, Clostridium, Kocuria (Vaughan a kol. 2005), Staphylococcus a octové bakterie (Hill a kol. 2015). I když většina bakterií má na pivo a jeho meziprodukty negativní účinky, některé z nich lze využít pro zefektivnění procesu a zlepšení vlastností sladu a piva (Laitila a kol. 2002; Vriesekoop a kol. 2012). U některých (zejména belgických) pivních specialit jsou pivo kazící bakterie přirozenou mikroflórou (Bokulich a Bamforth 2013, Keersmaecker 1992).

11

Cíl práce 3. Cíl práce Cílem práce je podat ucelený přehled o bakteriích vyskytujících se v pivovarském a sladařském provozu s důrazem na druhy, které mohou mít negativní vliv na suroviny, meziprodukty i hotové pivo. V práci je popsán základní postup výroby sladu a piva se zaměřením na místa, kde se může vyskytnout bakteriální kontaminace. Popsány jsou základní metody detekce a identifikace těchto bakterií. Rešerše je pro lepší ilustraci doplněna fotografickou dokumentací vybraných druhů bakterií kazících pivo.

12

Proces výroby piva 4. Proces výroby piva Výroba piva zahrnuje dva samostatné výrobní procesy, které probíhají odděleně – sladování a vlastní výrobu piva (Obr. 2). Cílem sladování, které probíhá ve sladovnách, je přeměnit zrno, nejčastěji ječmen, na slad bohatý na enzymy a extrakt (Kosař a kol. 2000). Výrobu piva probíhající v pivovaru lze rozdělit na tři hlavní výrobní části – příprava mladiny, hlavní kvašení a dokvašování, filtrace a stáčení piva. Nejdůležitějšími fyzikálně-chemickými pochody, které probíhají během výroby mladiny, jsou převedení extraktu sladu do roztoku a izomerace hořkých kyselin chmele (Basařová a kol. 2010). Cílem kvašení a dokvašování je řízená přeměna sacharidů na alkohol a CO2 a současně vytváření vhodných organoleptických vlastností piva. Po ukončení dokvašování může být pivo před vlastním stáčením filtrací upraveno tak, aby se po dobu několika měsíců nezměnily jeho organoleptické vlastnosti (Priest a Stewart 2006).

4.1. Suroviny Základními surovinami pro výrobu piva jsou voda, slad, chmel a kvasinky. Vlastnosti a kvalita vstupních surovin významně ovlivňují organoleptické vlastnosti vyrobeného piva. Skladba surovin použitých při produkci různých druhů piv se výrazně liší (Preedy a kol. 2009).

4.1.1. Voda Voda je důležitou základní surovinou pro výrobu piva a její složení má vliv na konečný produkt. Obsah vody v pivě je 75 až 80 % hmotnostních podle druhu výrobku. Kvalita vody musí odpovídat požadavkům na pitnou vodu, především z hlediska zdravotní a hygienické nezávadnosti (Basařová a kol. 2010). Sladovny a pivovary vodu používají ve velkém množství k máčení ječmene (začátek procesu sladování), vaření mladiny, případně k ředění hotového piva (technologie HGB). Voda se dále používá k čištění výrobního zařízení, k chlazení nebo naopak ohřívání, zaplnění linek před a po naplnění pivem, k filtraci, vyprání použitých kvasinek, odstranění nečistot a kalů (Briggs a kol. 2004). Značnou pozornost je nutno věnovat i vodám odpadním, aby jejich znečištění neohrožovalo okolní prostředí (Priest a Stewart 2006). Parametry vody určené ke sladování a vaření se pečlivě kontrolují a případně se různě upravují. Velký vliv na kvalitu a chuť piva má mimo jiné také tvrdost vody. 13

Proces výroby piva Například zvýšená tvrdost negativně ovlivňuje extrakci chuťových a barvících látek ze surovin do vody. Ideální je tedy voda měkká (Boulton 2013). 4.1.2. Ječmen a ostatní obilniny K výrobě piva se tradičně používá ječmen setý (Hordeum vulgare). Ostatní obiloviny jako je pšenice, čirok a v menší míře i žito, oves či proso se mohou k výrobě piva také používat podle druhu piva (Briggs a kol. 2004). Obvykle se ovšem pouze přidávají v určitém poměru do ječného sladu. Například bavorské pšeničné pivo obsahuje nejméně 50 % pšeničného sladu. Všechny alternativní zdroje škrobu – surogáty, ovlivňují barvu, zakalení a chuť piva. Také lze použít surové (nesladované) plodiny jako je například rýže nebo kukuřice, i když některé země používání těchto surovin regulují (Preedy a kol. 2009). Ječmen je jednoletá travina, patřící do čeledi Poaceae (Boulton 2013). Zralý ječmen je slámově žlutý po celém povrchu zrna. Jeho zeměpisné rozšíření je značné, od 70° s.š. po 50° j.š., dokáže růst i ve vyšších nadmořských výškách (Basařová a kol. 2010; Kosař a kol. 2000). Jednou z nejdůležitějších vlastností sladovnického ječmene je klíčivost, která by měla být co největší. Pro I. jakost musí dosahovat minimálně 96 % (Basařová a kol. 2015). Ječmen obsahuje 80 až 90 % sušiny, kterou tvoří dusíkaté a bezdusíkaté organické i anorganické látky. Sušina obsahuje 60 až 65 % škrobu. Ten zajišťuje zásobní energii pro embryo. Škrob se skládá z amylózy (glukózové jednotky spojené α-1,4-glykozidickou vazbou) a amylopektinu (glukózové jednotky spojené vazbami α1,4 a α-1,6) (Basařová a kol. 2015). Polysacharid celulóza je obsažen převážně v obalu (plevách) zrna. Při procesu vaření se nerozkládá a po scezování je součástí mláta. Dalšími látkami v zrnu jsou hemicelulózy, dusíkaté látky (např. albuminy, globuliny, prolaminy a lepek). Minerály jsou zastoupeny především křemíkem, draslíkem a fosforem.

Lipidy

jsou

prezentovány

hlavně

neutrálními

lipidy,

převážně

triacylglyceroly. Jsou důležité pro metabolizmus ječného zrna i pivovarských kvasinek, mohou negativně ovlivnit chuť piva a stabilitu pěny. Ječmen je bohatý na vitamíny, například vitamín C a vitamíny B komplexu. Bohužel většina vitamínů se během vaření piva inaktivuje. Přítomné polyfenoly v zrnu mění vlastnosti hotového piva (Preedy a kol. 2009).

14

Proces výroby piva 4.1.3. Chmel Chmel otáčivý (Humulus lupulus L.) dodává pivu typickou hořkost a chmelové aroma. Nejvýhodnější podmínky pro jeho pěstování poskytují oblasti mírného pásma severní polokoule. Ekologické podmínky stanoviště značně ovlivňují kvalitu chmelových hlávek (Basařová a kol. 2010). Největšími producenty chmelu jsou Německo (Hallertau, Elbe-Saale, Tettnang, Spalt) a Spojené státy (Washington, Oregon, Idaho) (Preedy a kol. 2009). V České republice jsou hlavními pěstebními oblastmi Žatecko, Louny a Tršicko (Kosař a kol. 2000). V pivovarnictví se používají neoplozené samičí květy uspořádané do šištic. Na nich se nachází lupulinové žlázy, které produkují pro pivovarství důležité lupuliny, látky dodávající hořkost a typickou chuť (Boulton 2013). Průměrný obsah sušiny ve chmelu je 88 až 92 % a k pivovarsky cenným složkám sušiny patří zejména pryskyřice, polyfenoly a silice. Nejdůležitější složkou jsou chmelové pryskyřice, které jsou zdrojem hořké chuti piva. Ve chmelu jsou zastoupeny z 15 až 20 %. Zahrnují všechny hořké látky α- a β-kyseliny a tvrdé pryskyřice (Kosař a kol. 2000). Nejúčinnější skupina α-kyselin se během vaření izomeruje na rozpustné izo-α-kyseliny, které vykazují silnou organoleptickou hořkost, zatímco β-kyseliny se v mladině izomerují minimálně a jejich příspěvek k hořkosti je mnohem menší (Priest a Stewart 2006). Tyto látky jsou antibakteriální, tudíž v pivu fungují také jako konzervanty. 0,5 až 3 % chmele tvoří silice. Jsou zodpovědné za příjemnou, přirozenou chuť po chmelu (Boulton 2013). Chmelové silice dávají pivu charakteristickou vůni v závislosti na svém složení, které je značně ovlivněné odrůdou (Preedy a kol. 2009). Třetí skupinou látek, která ovlivňuje organoleptické vlastnosti piva, jsou polyfenoly, jejichž obsah ve chmelu se pohybuje mezi 2 až 6 %. Mají pozitivní i negativní význam pro technologii i kvalitu piva, mohou např. působit jako antioxidanty nebo prooxidanty (Basařová a kol. 2010). Průmyslové pivovary používají hlávkový chmel jen zřídka. Většinou používají lépe skladovatelné a trvanlivější chmelové pelety, které se vyrábějí z nasekaného a usušeného chmele. Dále se používají chmelové extrakty, které se získávají extrakcí hořkých látek z rozemletého chmele různými rozpouštědly (Basařová a kol. 2010; Priest a Stewart 2006).

15

Proces výroby piva 4.1.4. Pivovarské kvasinky Kvasinky jsou skupinou heterotrofních eukaryotických mikroorganizmů, které řadíme do říše hub. Rozmnožují se převážně vegetativně pučením, některé druhy jsou schopny vytvářet pseudomycelia. Většina z nich je fakultativně anaerobní (Němec a Matoulková

2015),

sacharidy

mohou

využívat

oxidačním

i

fermentačním

metabolizmem (Basařová a kol. 2010). Některé druhy rodu Saccharomyces jsou využívány v potravinářském průmyslu (Boulton 2013). Při výrobě piva mají kvasinky zásadní význam pro svou schopnost přeměny zkvasitelných cukrů (glukóza, maltóza, sacharóza, maltotrióza) na etanol a CO 2 anaerobním kvašením (Briggs a kol. 2004). Kvasinky můžeme rozdělit na základě jejich flokulačních vlastností na spodní a svrchní. Pro výrobu piva typu ležák se používají spodní pivovarské kvasinky Saccharomyces pastorianus. Při hlavním kvašení je teplota udržována mezi 7 až 15 °C. Při konečné fázi hlavního kvašení se buňky shlukují a sedimentují na dně kvasné nádoby. Plně zkvašují rafinózu. Svrchní pivovarské kvasinky Saccharomyces cerevisiae kvasí při teplotách v rozmezí 18 až 22 °C. Tímto typem kvašení se vyrábí piva typu Ale, Stout, Porter či pšeničná piva. V konečné fázi kvašení jsou kvasinky vynášeny do kvasničné deky. Rafinózu zkvašují z jedné třetiny. Dalšími rozdíly mezi těmito technologickými i taxonomickými druhy kvasinek jsou například složení genetického materiálu, složení buněčných stěn, růst na specifických půdách a odlišné senzorické vlastnosti piv (Kopecká 2015). Velikost buněk kvasinek se pohybuje v rozmezí 3–15 µm. Jak velikost buněk, tak i jejich tvar jsou dány rodovou příslušností a podmínkami kultivace (Obr. 1). Za základní tvar se považuje rotační elipsoid (Němec a Matoulková 2015). Kolonie rodu Saccharomyces jsou většinou krémové nebo světle hnědé, hladké a lesklé (Tvrzová a kol. 2006).

16

Proces výroby piva

Obr. 1: Mikroskopický snímek buněk a snímek kolonií spodních (A, B) a svrchních kvasinek (C, D) (převzato z Kopecká 2015).

Při posuzování technologických vlastností pivovarských kvasinek lze využít laboratorní kvasné testy probíhající v kvasných válcích. Ze získaných údajů můžeme u kvasinek popsat rychlost kvašení, stupeň prokvašení, rychlost sedimentace atd. (Basařová a kol. 2010). U násadních kvasnic v pivovaru je nutné pravidelně stanovovat mikrobiologickou čistotu. Sleduje se zejména přítomnost enterobakterií, bakterií mléčného kvašení a divokých kvasinek (Šavel 1980). Čistota kvasnic většinou odpovídá hygienické úrovni pivovaru. Kvasnice lze do jisté míry „čistit“ kyselým praním, které zabíjí část kontaminantů, samotné kvasničné buňky jsou však tímto procesem také oslabovány (Boulton 2013). Důležitými

vlastnostmi

provozních

kmenů

kvasinek

je

viabilita

(životaschopnost) a vitalita (fyziologický stav). Mezi základní metody kontroly kvasnic patří metabolické testy např. test acidifikace glukózy, rychlost spotřeby O 2 a tvorby CO2. V provozní pivovarské laboratoři jsou běžně používané mikroskopické metody, zejména barvení mrtvých buněk metylenovou modří. Méně běžné je pak použití fluorescenčních metod (Basařová a kol. 2010). K okamžitému zjištění dobrého stavu je vhodná průtoková cytometrie, která je však ekonomicky náročná na pořízení, ovšem její provoz je rychlý, nenáročný a lze analyzovat velké množství buněk (Hewitt a NebeVon-Caron 2001). 17

Proces výroby piva 4.2. Výroba piva

Ječmen

Rmutování

Šrotování

Sladování

Slad

Šrot

Cezení

Rmut

Stočené pivo

Sladina Pivo

Stáčení

Hlavní kvašení

Chmelovar

Mladina Mladé pivo

Dokvašování

Obr. 2: Schéma výroby piva (převzato z Boulton a Quain 2001, upraveno).

4.2.1. Sladování Jako zdroj škrobu a proteinů se běžně používá ječmen, ten se nejdříve musí zpracovat sladováním. Sladování je proces, kdy je umožněno zrnům klíčit za stanovených podmínek. Cílem sladování je aktivace a syntéza enzymů a rozluštění (vnitřní přeměna) zrna. Škrob a proteiny v zrnech se naklíčením přemění na jednodušší a snadněji využitelné cukry a aminokyseliny (Prescott a kol. 2002). Postup sladování se skládá z máčení, klíčení a hvozdění (Obr. 3). Při sušení se ze zrn uvolňují látky, které dávají pivu typickou chuť a barvu (Preedy a kol. 2009). Ječná zrna jsou po převozu do sladovny laboratorně kontrolována, pročištěna a uskladněna za vhodných podmínek do sila (Boulton 2013). Před sladováním jsou zrna skladována 4-8 týdnů, kdy dochází k posklizňovému dozrávání a dormanci obilek (Kosař a kol. 2000; Preedy a kol. 2009).

Obr. 3: Schéma moderní výroby sladu (převzato z Preedy a kol. 2009, upraveno).

18

Proces výroby piva 4.2.1.1. Máčení Proces sladování začíná máčením, které probíhá v kónických náduvnících. Máčením se řízeně zvýší vlhkost v zrnu a tím dochází k aktivaci enzymatických reakcí. Je nutno ze zrn splavit nečistoty a případné mikroorganizmy, které by mohly negativně působit na další fáze sladování. Faktory ovlivňující rychlost máčení jsou teplota máčecí vody, velikost zrna, struktura zrna a provětrání ječmene. Současný způsob vzdušného máčení se provádí v náduvnících na 3 namočení, mezi nimi jsou provzdušňovací přestávky (Kosař a kol. 2000). Později se vlhkost, udržovaná mezi 42-48 %, může zvýšit sprchováním. Schopnost klíčit se urychlí zvýšením teploty, to ovšem podporuje růst mikroorganizmů. Do máčecí vody je možné přidat dezinfekční přípravky (Briggs a kol. 2004) a také giberelinovou kyselinu pro zlepšení klíčivosti (Boulton 2013). 4.2.1.2. Klíčení Nejdůležitějším procesem při klíčení a zároveň během celého sladování je nová tvorba a aktivace enzymů a dále vnitřní přeměna - rozluštění zrna. Nejdůležitějšími enzymy, které jsou aktivovány a nově tvořeny, jsou amylázy, které později při rmutování odbourávají škrob na zkvasitelné cukry. Z látkových přeměn probíhajících během klíčení jsou pro sladaře nejdůležitější pochody označované jako „rozluštění“, jedná se především o rozrušení buněčných stěn a následně o rozštěpení škrobových zrn a bílkovinných řetězců (Kosař a kol. 2000). Klasická sladovna používá ke klíčení humna, ve kterých se zrna rozloží do hromad. V současné době jsou více používány moderní pneumatické systémy sladovadel, která jsou jak vertikální, tak horizontální. Mohou pracovat taktově i kontinuálně (Kosař a kol. 2000). Během klíčení se vlivem růstu zárodku zrno zahřívá (Briggs a kol. 2013), embryo potřebuje dostatečný přísun kyslíku a odvod oxidu uhličitého. Během celého procesu musí být zajištěna regulace teploty a obsahu kyslíku a CO2 (Preedy a kol. 2009). Teplota hromad, přísun kyslíku a odvádění CO2 se proto reguluje obracením, nakypřením, případně stažením nebo povolením hromady. Dále se mohou parametry regulovat otevíráním a zavíráním tahů, u modernějších humnových sladoven pouštěním ventilátorů. Během klíčení se hromady musí průběžně kropit, aby vlhkost zrna byla kolem 44 % (Kosař a kol. 2000). Teplota je udržována mezi 14 a 18 °C. Embryo při tomto procesu začíná růst a vyvíjet se. Začíná enzymaticky rozkládat škroby a přetvářet je na jednodušší cukry 19

Proces výroby piva (Boulton 2013). Klíčení probíhá 3-6 dnů (Justé a kol. 2011). Takto naklíčený produkt se nazývá zelený slad (Briggs a kol 2004). 4.2.1.3. Hvozdění Hvozdění je závěrečnou fází sladování, jeho cílem je převést zelený slad s vysokým obsahem vody do skladovatelného a stabilního stavu. Při hvozdění/sušení se v zeleném sladu sníží obsah vody na hodnoty 3 až 4 % u světlých a 1,5 až 2 % u tmavých sladů (Basařová a kol. 2015), ukončí se přeměna látek a utvoří se typická barva a aroma sladu. U dobře hvozděných sladů je endosperm křehký, u špatně hvozděných pak tvrdý a sklovitý. Pro sušení se používají různé konstrukce hvozdů (Kosař a kol. 2000). V první fázi hvozdění se nejprve zvýší teplota na 30 °C a vlhkost se odvádí pomocí rozvádění vzduchu po dnu hvozdu. Až se zrna dostatečně usuší, teplota se zvýší na cca 70 °C a sníží se proudění vzduchu. Jestliže se sníží vlhkost na stanovenou mez, znovu se teplota zvýší. Dotahovací teplota pro světlé slady plzeňského typu je 80 až 85 °C. Plzeňský slad se vyznačuje světlou barvou, vysokou enzymatickou aktivitou a používá se jako základní slad pro výrobu většiny piv. Slad pro výrobu piv typu Ale se hvozdí při 100 °C (Boulton 2013). Pokud se dotahovací teplota zvýší až na 105 °C, jedná se o slad bavorského typu, který má vyšší barvící schopnost a také utváří odlišnou chuť a aroma piva. Enzymy jsou v tomto sladu zničeny vysokou teplotou (Boulton 2013). Po hvozdění probíhá odklíčkování na odkličkovači. Odstraní se kořínky (sladový květ), poškozená zrna a prach. Sladový květ bývá používán jako krmení pro hospodářská zvířata. Dále je možné slad upravit a zpracovat např. pražením na slad karamelový či barvicí. Finální produkt se uskladní do sil a nechá se 4-6 týdnů odpočívat (Kosař a kol. 2000). 4.3. Výroba mladiny Cílem varního procesu je převést extraktivní složky sladu do roztoku, roztok oddělit od nerozpustných zbytků sladového zrna a povařením takto získané sladiny spolu s chmelem převést do roztoku hořké látky a tepelně stabilizovat. Získaná mladina je po odloučení kalů a ochlazení připravená pro kvasný proces (Kosař a kol. 2000). Výroba mladiny se odehrává ve varně, proces není kontinuální, vaří se na várky. Typická várka má objem 1,6-16 hl, záleží ovšem na velikosti provozu (Boulton 2013). 20

Proces výroby piva Proces výroby mladiny zahrnuje několik kroků: šrotování, vystírání, rmutování a scezování, a chmelovar. (Priest a Stewart 2006) 4.3.1. Šrotování Cílem šrotování sladu je dokonalé vymletí endospermu sladových zrn na vhodné podíly jemných a hrubých částic při zachování celistvosti pluch (Basařová a kol. 2010). Menší částice mají větší povrch a zefektivní se tak enzymatické reakce a látky se z nich lépe rozpouští do vody. Většinou je slad šrotován pro jednu varnou dávku (várku). Plevy sladu by se měly zachovat neporušeny, fungují jako filtr během scezování (Boulton 2013). 4.3.2. Vystírání Sešrotovaný slad se smíchá s vystírací vodou (5-6 hl/100 kg sladu) ve vystírací nádobě. Moderní vystírací pánve se nyní vyrábí z nerezové oceli, která má dobré tepelné a technické vlastnosti a je nenáročná na sanitaci. Teplé vystírání s teplotou nálevové vody v rozmezí 35 až 38 °C je vhodné pro dekokční způsob rmutování. Při této teplotě dojde k změknutí a částečnému rozpuštění rozemletého zrna. Vystírka se ještě zapaří horkou vodou na teplotu 50 až 52 °C. Zapařování podporuje účinnost proteolytických a cytolytických enzymů. Zapářku je nutno míchat, aby nedošlo k lokálnímu přehřátí (Basařová a kol. 2010). Pro aktivaci enzymů, nejdůležitější složky sladu, jsou mnohdy potřeba kofaktory v podobě iontů. Proto se zastoupení jednotlivých minerálů ve vodě sleduje, popřípadě upravuje (Boulton 2013). 4.3.3. Rmutování a scezování Úkolem rmutování je rozštěpení a převedení extraktových složek do roztoku, zejména veškerého škrobu a vhodného podílu bílkovin. Rmutování je prováděno ve rmutovací pánvi, která je vybavena míchadlem. Vystírka se zahřeje na určitou stanovenou teplotu vhodnou pro aktivaci a působení sladových enzymů. Aktivované enzymy štěpí škrob na cukry a zbytek proteinů na aminokyseliny, které jsou zkvasitelné (Preedy a kol. 2009). Při rmutování pH většinou klesá (Briggs a kol. 2004). Podle způsobu zvyšování teploty vystírky můžeme rozlišovat dva různé postupy rmutování: infuzní a dekokční. Při dekokčních postupech rmutování se z vystírky vezme určitý podíl, který se povaří. Obvykle stačí 10-20 minut, pro tmavá piva 30-45 minut. Díky povaření dílčího 21

Proces výroby piva rmutu obsažený škrob zmazovatí a stává se tekutým. Poté se rmut vrátí do vystírací kádě, kde je ztekucený škrob rychle zcukřen enzymy z vystírky. Objem rmutu, který vrátíme do vystírky, musí odpovídat potřebnému zvýšení teploty ve vystírací kádi po jeho vrácení (Obr. 4). Pro dokonalé zcukření (rozštěpení škrobu na zkvasitelné jednoduché cukry) jsou důležité cukrotvorné teploty, nižší v rozmezí 62-64 °C – optimum pro ß-amylázy, a vyšší 72-75 °C – optimum pro α-amylázy. U dekokčního rmutování je dosaženo lepších varních výtěžků, je ale delší a finančně náročnější (Basařová a kol. 2010; Kosař a kol. 2000). Rozlišujeme jednormutový, dvourmutový a třírmutový postup. Pro výrobu piv plzeňského typu je nejvhodnější klasický dvourmutový postup.

Obr. 4: Dvourmutové dekokční rmutování (převzato z Briggs a kol. 2004, upraveno).

Infuzní rmutování je nejjednodušším typem rmutování. Je při něm potřeba jediné rmutovací kádě. Postup se uplatňuje při výrobě světlých, většinou svrchně kvašených piv. Výsledné pivo má světlejší barvu a méně výraznou chuť než u dekokčních postupů (Kosař a kol. 2000). Infuzní rmutování je kratší než dekokční, je při něm nutné používat dobře rozluštěný slad. Proces zahrnuje vystírku o teplotě 35-50 °C. Teplota okolo 50 °C se udržuje po dobu 30 minut, při které dochází ke štěpení bílkovin. Dále se ohřeje na 6222

Proces výroby piva 65 °C opět po dobu 30 minut. Následuje ohřev na teplotu 70-72 °C po dobu dokonalého zcukření (testuje se jodovou zkouškou). Finální odrmutovací teplota je 78 °C (Basařová a kol. 2010). Při rmutování vznikají dvě složky – mláto a sladina. Pro separaci těchto složek se používá scezovací káď. V ní se mláto usadí a funguje tak jako filtr pro vyčištění sladiny (Boulton 2013). Také je možné používat sladinové filtry (Kosař a kol. 2000). Sladina je použita pro další kroky výroby piva. Mláto (většinou pluchy, zbytky endospermu) je pro pivovary odpad, který lze využít jako krmivo pro hospodářská zvířata (Boulton 2013).

4.3.4. Chmelovar Chmelovar je poslední krok, který vede k produkci mladiny. Odehrává se při něm řada dějů: 

Inaktivace sladových enzymů



Sterilizace díla



Extrakce látek (složek) chmele do mladiny (izomerace chmelových kyselin)



Koagulace proteinů a tvorba protein/polyfenolových komplexů



Modifikace chuťových a barevných vlastností



Snížení pH



Tvorba redukujících látek, které pivo chrání před oxidativními procesy



Odpaření přebytečné vody – zahuštění mladiny (Briggs a kol. 2004) Během chmelovaru je přidáván chmel v různých podobách. Množství použitého

chmele (chmelových produktů) se určuje podle obsahu α–kyselin jednotlivých produktů. Obsah izosloučenin ve světlých ležácích je okolo 26–34 mg.l-1, ve výčepních pivech 18–24 mg.l-1. Tmavá piva bývají méně chmelena. Doba varu při chmelení je stanovena mnoha faktory. Je důležité, aby se všechny hořké látky izomerizovaly kvůli koagulaci dusíkatých látek – tvorba lomu a odpaření dimetylsulfidu, který má negativní chuťové vlastnosti – zeleninová příchuť (Kosař a kol. 2000). Chmelové přípravky jsou aplikovány většinou ve dvou nebo ve třech dávkách. Při chmelení na dvě dávky se nejprve přidá 70–80 % z celkové dávky α–kyselin na počátku chmelovaru. První dávka dává mladině hlavní podíl hořkosti. Druhá dávka

23

Proces výroby piva obsahuje zbylých 20–30 % a přidává se cca 20 minut před koncem varu. Dodává mladině převážně aroma. Při chmelení na tři dávky se aplikuje jako první dávka extrakt a hořký chmel, druhá dávka po 60 minutách vaření a třetí 10 až 15 minut před koncem varu. Vnesený podíl α-kyselin je v první dávce 20–30 %, v druhé dávce 50–65 % a ve třetí dávce zbylých 15–20 %. Při vysokém využití hořkých látek se získává příjemné chmelové aroma. Čím později se chmel aplikuje, tím větší zbytkový podíl silic zůstává zachován v mladině (Kosař a kol. 2000). Na konci chmelovaru obsahuje mladina zbytky chmele a vločky kalu, které je nutno odstranit (Briggs a kol. 2004). Vločky obsahují proteiny, hořké látky, polyfenoly, mastné kyseliny a minerální látky v různém poměru. Tento hrubý kal by se měl úplně oddělit od mladiny. Zanáší povrch kvasinek a nepříznivě ovlivňuje chuť a pěnivost piva. Zhoršuje vyčeření a filtrovatelnost piva. Hrubý kal se nejčastěji odstraňuje pomocí vířivé kádě (Preedy a kol. 2009). Vířivá káď je stojatá válcová nádoba z nerezu, která má rovné nebo mírně kónické dno. Mladina se do ní pouští zboku (tangenciálně) v určité rychlosti, tím dochází k takzvanému efektu čajového hrnečku a kaly se usazují na dně kádě do kuželu (Boulton 2013; Preedy a kol. 2009). Mladina se odčerpá a je co nejrychleji zchlazena a zakvašena produkčním kmenem kvasinek, aby se zamezilo mikrobiální kontaminaci. Zákvasná teplota je v rozmezí 6–12 °C u spodně kvašených piv a 15–22 °C u piv svrchně kvašených. V moderních pivovarech se teplo z chlazení využívá na ohřev vystírací vody (Briggs a kol. 2004). Hotová mladina je ideální médium pro růst pivovarských kvasinek a také případných kontaminujících mikroorganizmů, zejména enterobakterií a divokých kvasinek (Bokulich a Bamforth 2013). Obsahuje utilizovatelné cukry - glukózu, fruktózu, sacharózu, maltózu a maltotriózu. Jako zdroj dusíku jsou kvasinkami využívány aminokyseliny, peptidy a proteiny. Kvasinky potřebují i dostatek minerálů jako kofaktory enzymů (Mg) a pro rozmnožování (K, Ca). Dalšími esenciálními minerály jsou Na, Fe, Zn, Mn a Cu. V menším množství potřebují i vitamíny (skupiny B), puriny, pirimidiny, nukleozidy a nukleotidy, mastné kyseliny, fosfor a síru (Preedy a kol. 2009). Metabolizmus kvasnic naopak může být inhibován mnoha faktory, mezi ně patří např. vysoká stupňovitost mladiny (nad 20 %), s tím související vysoký obsah alkoholu ke konci kvašení (nad 6 %), vyšší koncentrace NO2- a NO3 - iontů (Kosař a kol. 2000). 24

Proces výroby piva 4.4. Propagace kvasnic Propagace je postup, který vede k pomnožení kultury pivovarských kvasnic. Pomnožená kultura musí být čistá a mít požadované vlastnosti (Boulton 2013). Propagace bývá rozdělována do dvou fází. Tou první je laboratorní. Kultura kvasinek se v laboratoři naočkuje ze zásobní kultury nebo z provozní mladiny většinou do tekutého média. Jako médium je v pivovarech využívána sterilní sladina nebo mladina, v posledních fázích laboratorní propagace pak mladina. Kultivace probíhá za laboratorní teploty, první fáze pro urychlení množení kvasinek na třepačce (Kosař a kol. 2000). Po pomnožení se kultura sterilně přenese do většího množství mladiny a pokračuje se v kultivaci. Po laboratorní propagaci následuje provozní propagace. Spočívá v přenesení propagované laboratorní kultury do rozkvasného válce. Z něho jsou kvasinky rozváděny do hlavních propagátorů. Zde se rychle množí a poté jsou připraveny k použití. Řada pro navyšování objemu mladiny bývá 1:5 až 1:10 (Obr. 5). Při přenášení kultury do propagátoru existuje významné riziko zanesení kontaminace. Proto se musí dodržovat hygienické zásady a propagátor bývá umístěn v místnosti oddělené od ostatního provozu (Briggs a kol. 2004).

Obr. 5: Schéma propagace kvasnic (převzato z Kosař a kol. 2000).

25

Proces výroby piva Po hlavním kvašení lze kvasnice promýt (vodou nebo potravinářskou kyselinou), a opětovně použít (Hill a kol. 2015). Neměly by se použít více jak 3x za sebou kvůli zhoršování fyziologického stavu a kumulování kontaminace (Kosař a kol. 2000). Po dobu skladování do doby dalšího nasazení je potřeba zachovat dobrou viabilitu a vitalitu kvasnic a zajistit minimální fyziologické změny. Kvasnice se uchovávají pod vodou se zbytky piva při teplotě 4 °C (Basařová a kol. 2010). 4.5. Hlavní kvašení Cílem hlavního kvašení je přeměna jednoduchých cukrů vytvořených při rmutování na etanol a oxid uhličitý. Při tomto procesu se vytvářejí typické chuťové vlastnosti, které jsou ovlivňovány jak hlavními produkty kvašení, tak i vedlejšími produkty jako například vyššími alkoholy, estery, ketony, aldehydy, sloučeniny síry atd. (Basařová a kol. 2010). Zchlazená a provzdušněná mladina je rychle smísena s kvasnicemi. Běžná dávka kvasnic bývá 15–20 mil. buněk/ml při dobré kondici kvasinek. Aplikace 30 mil. buněk/ml je doporučené množství pro silná piva typu Ale a pro piva speciální (silnější). Směs se aeruje (provzdušňuje) a je tak dobře promíchána (Preedy a kol. 2009). Hlavní kvašení probíhá v kvasných nádobách různé konstrukce. Při tradičním způsobu kvašení se používají otevřené kvasné kádě, které jsou nejčastěji vyrobeny z nerezu (Kosař a kol. 2000). Moderní technologie využívají uzavřené kvasné velkoobjemové kvasné nádoby cylindrokónické tanky –CKT (Bamforth a kol. 2006). Prostor, ve kterém probíhá hlavní kvašení tradičním otevřeným způsobem, se nazývá spilka. Při fermentaci se z díla uvolňuje velké množství CO2. Proto je spilka vybavena větráním a tento plyn je odváděn pryč. Při vyšších koncentracích se hromadí ve spodní části místnosti (protože je těžší než vzduch) a může tak být nebezpečný pro obsluhu. Při kvašení v CKT je vznikající CO2 jímán a využit v navazujících výrobních procesech. Fermentace je exotermický proces, při němž se dílo zahřívá, proto jsou spilka, CKT a jednotlivá zařízení chlazena. Teplota se udržuje v rozmezí 8–10 °C při klasickém kvašení (Kosař a kol. 2000, Briggs a kol. 2004), pro CKT technologii se udává rozmezí 9 až 16 °C (Kosař a kol. 2000). Během kvašení postupně klesá koncentrace sacharidů. Nejprve kvasinka přijímá glukózu a sacharózu. Po glukóze teprve buňka začne přijímat maltózu (Basařová a kol. 2010).

26

Proces výroby piva Při tradičně vedeném hlavním kvašením můžeme rozeznat čtyři stádia, která se odlišují vzhledem povrchu kvasničné deky, změnou pH, změnou teploty, nárůstem kvasinek a úbytkem živin. Nárůst kvasinek odpovídá růstové křivce. Prvním stádiem je zaprašování, kdy se během 12 až 24 hodin intenzivně tvoří pěna, klesá obsah extraktu a pH. Mírně stoupá teplota. Druhé stádium je tvorba nízkých až vysokých bílých kroužků. Je to doba od 24. do 40. hodiny od inokulace, při které se nejintenzivněji tvoří oxid uhličitý. Vysoké hnědé kroužky jsou třetím stádiem třetího až pátého dne kvašení. Kroužky pěny se zbarvují hnědě kvůli kalům vynášeným z média. Teplota dosahuje maxima. V poslední fázi propadání deky kvasnice plně aglutinují a sedimentují. Kroužky se propadají a na hladině je jen hustá tmavá pěna – deka. Ta se musí sbírat, protože obsahuje látky, které by nepříznivě ovlivňovaly chuť piva (Basařová a kol. 2010). 4.6. Dokvašování Mladé pivo je zakalené, obsahuje minimum CO 2 a jeho chuť i aroma se jen vzdáleně podobají pivu. Cílem dokvašování je proto dosažení požadovaných organoleptických vlastností piva, nasycení oxidem uhličitým a vyčeření (Kosař a kol. 2000). Při přečerpání mladého piva do ležáckých tanků nebo CKT je odstraněna většina kvasinek a zůstane v něm jen jejich menší podíl (cca 1-4 mil. buněk/ml). Zbylé kvasinky během dokvašování pomalu zkvašují zbylé sacharidy a vznikající CO 2 nasycuje pivo (tanky jsou uzavřené). Dochází k vyčeření a dotváření typických organoleptických vlastností piva (Briggs a kol. 2004). Mladé spodně kvašené pivo se tradičně suduje do přetlakovaných ležáckých nádob. Tyto nádoby obvykle nacházíme v ležáckých sklepech, kde se teplota udržuje od -2 °C do +3 °C. Jsou většinou vyrobeny z nerezu. Proces dokvašování může trvat od několika dnů do řádu týdnů i měsíců podle stupňovitosti piva, kapacity ležáckého sklepa a podle standardů daného pivovaru (Basařová a kol. 2010). Vzhledem k nízkým teplotám ležení piva, nízké koncentraci utilizovatelných živin a vyšší koncentraci alkoholu je tato fáze výroby méně náchylná z hlediska rozvoje kontaminace. Uplatnit se zde mohou pouze některé pediokoky (Vaughan a kol. 2005).

27

Proces výroby piva 4.7. Filtrace Cílem filtrace je upravit pivo před stáčením tak, aby se po dobu několika měsíců nezměnila jeho čirost v transportním obalu. V průběhu filtrace se odstraní zákalotvorné částice, zbylé kvasinky a případná mikrobiální kontaminace. Čiřením získá výrobek vyšší trvanlivost (Basařová a kol. 2010). Filtrace je nejpoužívanější postup pro separaci zákalových částic, jednoduššími metodami jsou centrifugace a sedimentace. K odstranění částic dané velikosti je možno způsoby separace různě kombinovat (Kosař a kol. 2000). Filtrace je několikastupňovým procesem, na jehož konci vzniká čirý produkt (Obr. 6). Pro správný průběh filtrace je důležité vědět, jak velké částice se v pivu nachází. Podle velikosti se tak můžou volit různé postupy (Priest a Stewart 2006). Pivovary využívají převážně filtrační materiály, které zahrnují křemelinu, perlit nebo jiné vysoce porézní látky. Sypou se do filtračních přepážek a pravidelně se vyměňují. Tyto materiály se před použitím musí upravit (spálit), aby získaly požadované vlastnosti (Boulton 2013; Buttrick 2007). Během filtrace nesmí docházet k nárůstu obsahu rozpuštěného kyslíku ani ke změnám vlastností piva např. ztráta barvy, snížení hořkých látek. Při filtraci obecně hrozí velké riziko mikrobiální a chemické kontaminace, proto by se mělo dbát na důslednou hygienu a kontrolu (Basařová a kol. 2010). Modernější a účinnější metodou je filtrace membránová. Membrány bývají vyrobeny z polymerních materiálů nebo keramiky. Keramické mikrofiltry se méně zanáší a lépe snáší čistící procedury (Bamforth a kol. 2006; Kuiper a kol. 2001). Pokud se mikroorganizmy kazící pivo rozmnožily už od začátku výroby piva např. při kvašení, lze očekávat zhoršení jeho filtrovatelnosti (Basařová a kol. 2010).

28

Proces výroby piva

Obr. 6: Možné postupy filtrace piva. Pro dokonalé odstranění kalů a mikroorganizmů se volí kombinace různých typů filtrací (převzato z Kosař a kol. 2000).

4.8. Pasterace Trvanlivost piva se pohybuje od řádů několika týdnů do několika měsíců. Pro pivovary distribuující do obchodních řetězců je nutné pivo stabilizovat (Fricker 1984, Kosař a kol. 2000). Cílem tepelné úpravy piva - pasterace - je zajištění biologické trvanlivosti. Jde o tepelnou inaktivaci pivu škodících mikroorganizmů. Touto technikou se zabíjí a redukuje počet mikroorganizmů, výrobek ovšem není sterilní (Prescott a kol. 2002). Účinnost pasterace je charakterizována pasterační jednotkou (PU). Je to pasterační účinek tepla působící při teplotě 60 °C po dobu 1 minuty. K zajištění mikrobiologické stability a nezávadnosti normálně prokvašeného a zfiltrovaného piva stačí 5-10 PU. V běžné praxi se ovšem používá 20-30 PU (Janoušek a Basařová 2002; Kosař a kol. 2000). Využívají se dvě metody pasterace – tunelová a průtoková. Tunelová pasterace slouží k ošetření piva již naplněného do láhví či plechovek. Používá teploty kolem 6062 °C po dobu 15 až 20 minut. Tunelová pasterace je energeticky více náročná než průtoková pasterace a pro nádoby s větším objemem (sudy od 25 l) nepoužitelná

29

Proces výroby piva (Basařová a kol. 2010). Další nevýhodou tunelové pasterace je tepelné narušení organoleptických vlastností piva – pivo může dostat tzv. pasterační chuť (Fricker 1984). Průtoková pasterace slouží k ošetření piva, které se teprve poté plní do láhví, sudů, plechovek či PET láhví. Metoda využívá působení vyšší teploty (68-72 °C) po velmi krátkou dobu (30-40 sekund). Průtoková pasterace se provádí v deskovém výměníku, kde teplota působí na tenký film piva (Basařová a kol. 2010). Z hlediska rizika mikrobiální kontaminace je tunelová pasterace spolehlivější. Pokud se stáčí zkontaminovaná šarže nebo se láhev či pivo na lince kontaminují během plnění, je tato kontaminace tunelovou pasterací eliminována (nikoliv však již vytvořené mikrobiální metabolity). Při průtokové pasteraci hrozí kontaminace piva nejen při jeho plnění, ale je nutné dbát na sterilitu potrubí a obalů. Při kontaminaci během stáčení průtokově pasterovaného piva do obalů pak hovoříme o tzv. sekundární, tedy postpasterizační kontaminaci (Vaughan a kol. 2005). 4.9. Plnění do obalů Před distribucí se pivo musí naplnit do obalů, nejčastěji do skleněných láhví, PET láhví, plechovek a sudů (Bamforth a kol. 2006). Plnění je z hlediska kontaminace velice rizikový proces. V případě průtokové pasterace hrozí sekundární kontaminace z potrubí, ze špatně očištěných obalů, nebo z aerosolu, který se vytváří v plniči. Vysoká vlhkost a zbytky piva zde podmiňují růst biofilmu

na různých površích v prostoru stáčecích zařízení (Matoulková

a

Kubizniaková 2014; Priest a Campbell 2003). Mikroorganizmy se pak mohou prostřednictvím

aerosolu dostat i do vzdálenějších míst v prostoru stáčírny

(Matoulková a kol. 2012b). Nezbytná je proto častá sanitace zahrnující mechanické odstranění biofilmu (Hill a kol. 2015). 4.9.1. Lahvování Nyní je většina úkonů zahrnující láhvování piva automatizovaná. Jednotlivé fáze operace plnicí linky je následující: 

přenesení prázdných láhví



mytí (v případě vratných láhví)



kontrola prázdných láhví (vyřazení láhví obsahující mechanické nečistoty)



oplach

30

Proces výroby piva 

plnění a uzavírání



pasterace (v případě tunelové pasterace)



etiketování a kontrola etiketování



ukládání do beden a paletizace

(Priest a Stewart 2006) Skleněné láhve jsou jako obal pro plnění piva využívány po staletí (Priest a Stewart 2006). Jejich výhoda spočívá v odolnosti a v inertnosti materiálu, který je recyklovatelný. Sklo je ovšem křehké a skleněné láhve nestabilní (Basařová a kol. 2010). V moderních pivovarech dosahuje rychlost plnění piva 60-70 tisíc láhví/hod. (Briggs a kol. 2004) Použité pivní láhve se nejprve omyjí v myčce. Myčky mohou být různého provedení a konstrukce, záleží hlavně na typu mytí (Basařová a kol. 2010). Z hlediska kontaminace se doporučuje zvolit spíše myčku průchozí nežli vratnou, aby nedocházelo ke kontaminaci čistých láhví špinavými. Umístění myčky láhví (a kegů) v blízkosti plnících zařízení je dalším z faktorů, které zvyšují riziko kontaminace hotového piva (Matoulková a Kubizniaková 2014). Princip mytí láhví spočívá ve vystříkání láhve vodou nebo vodou a mycím prostředkem v poloze dnem vzhůru a máčení povrchu láhve (odstranění staré etikety). Mytí je velmi náročné na spotřebu vody a tepla (Basařová a kol. 2010). K mytí se používá 1 až 3% NaOH s možným přidáním různých saponátů (Priest a Stewart 2006). Očištěné láhve se zkontrolují, zda nejsou poškozené, neobsahují střepy a mechanické nečistoty (Tsarouhas a Arvanitoyannis 2009). Kontrolu láhví už zajišťují samotná zařízení díky zabudované kameře, tzv. inspektory láhví (Briggs a kol. 2004). Následuje naplnění láhve pivem. Dnešní plniče jsou pneumatické, pivo se plní pod tlakem dlouhou či krátkou trubicí. Před naplněním se provádí pre-evakuace, která snižuje obsah kyslíku v lahvi na 1 % (Bamforth a kol. 2006). Po naplnění se láhev co nejrychleji uzavře korunkou, aby se předešlo vniknutí kyslíku a kontaminaci piva. Uzavírací stroj (korunkovačka) se obvykle nachází bezprostředně za plničem, v uspořádání tzv. monobloku, který je od ostatního prostoru ve stáčecí hale ohraničen prosklenými stěnami. V prostoru monobloku platí zvýšená hygienická opatření, jako je např. vstup pouze v čistém oděvu, po očištění obuvi dezinfekční rohoží, dezinfekci

31

Proces výroby piva rukou. Vstup do monobloku je navíc vyhrazen pouze určeným osobám (Hill a kol. 2015; Matoulková a kol. 2012b). Dále láhev projde kontrolou, jestli je správně naplněná a zda neobsahuje cizorodé částice. Pivo po naplnění do láhví může projít tunelovou pasterací, pokud nebylo pasterováno průtokově. Nakonec se etiketuje (Briggs a kol. 2004). Láhve jsou poté baleny do beden či paletizovány (Priest a Stewart 2006). 4.9.2. Sudování V pivovarství se v dnešní době používají KEG sudy. Umožňují snazší dopravu, mytí a plnění. Mají jediný otvor (Basařová a kol. 2010). Objem sudů může být od 10 do 163 litrů (Boulton 2013), v Evropě jsou nejčastější objemy 30 a 50 litrů. KEG sudy bývají vyrobeny z hliníku nebo z nerezu (Priest a Stewart 2006). Pivo k plnění do sudů by mělo být chlazené, filtrované a ošetřené průtokovou pasterací (Boulton 2013). Samotná linka začíná opět depaletizací, odstraněním krytek armatury a dále se povrch sudu omyje. V kontrolní a předmývací stanici je testována těsnost sudů (Basařová a kol. 2010). Netěsnící sudy, které jsou potenciálním zdrojem kontaminace, se vyřazují (Briggs a kol. 2004). Sud, který prošel kontrolou, se vypláchne horkou vodou, poté se naplní horkým alkalickým detergentem a nechá se nejméně 5 minut odmočit. Následuje výplach kyselinou a vodou, postup závisí na mycím programu zařízení. Dále probíhá sterilizace suchou parou. Následuje natlakování plynem (CO2,) a plnění pivem (Basařová a kol. 2010). Po naplnění zařízení provede kontrolu naplnění sudu vážením, sud zakrytkuje a označí etiketou s potřebnými informacemi. Na konci se sudy zpátky paletizují a uskladní (Briggs a kol. 2004).

32

Bakterie v procesu výroby sladu 5. Bakterie v procesu výroby sladu Pivo tvoří poměrně stabilní mikrobiologické prostředí, avšak existuje několik mikroorganizmů, které jsou schopné růstu ve sladu, mladině i v pivu. Během výroby sladu a piva jejich přítomnost silně ovlivňuje výsledný produkt (Vaughan a kol. 2005). Při sladování je zrno primárně ohroženo vláknitými houbami, například rody Alternaria, Cladosporium, Epicoccum a Fusarium. Na uskladněném ječmeni mohou růst druhy rodu Aspergillus a Penicillium. Je také potvrzena přítomnost divokých kvasinek (Noots a kol. 1998). Výskyt vláknitých hub může být nebezpečný kvůli produkci mykotoxinů. Tyto látky přetrvávají v procesu výroby a mohou být detekovány i v hotovém pivu (Inoue a kol. 2013; Malfeito -Ferreira a Loureiro 2009). Nicméně svou roli při sladování hrají i bakterie. Vysoce zastoupené jsou mléčné bakterie. Jsou součástí mikroflóry ječmene a přetrvávají v něm (O’Sullivan a kol. 1999; Vaughan a kol. 2005). Je popsáno, že mohou mít i pozitivní vliv, konkurují ostatním mikroorganizmům, acidifikují prostředí a produkují antimikrobiální látky. Kmeny druhu Lactobacillus plantarum přidané do máčecí vody inhibují růst rodů Fusarium o několik desítek procent (Laitila a kol. 2002). Zdrojem mikrobiální kontaminace pro sladované zrno bývají skladovací nádoby (silo, pytle, zásobníky) a máčecí voda. Ta by měla být mikrobiologicky nezávadná (Vaughan a kol. 2005). Při sklizení ječmene se jeho mikroflóra podobá mikroflóře okolní půdy, vegetace a vzduchu. Převažuje výskyt gramnegativních bakterií, zvláště pak druhu Erwinia herbicola (Vaughan a kol. 2005). Během máčení se část mikroorganizmů odplaví pryč (Justé a kol. 2011). Po máčení jejich počet vzroste díky lepšímu přístupu ke vzduchu a k živinám, které se dobře rozpouštějí ve vodě. Pokud se bakterie přemnoží, spotřebovávají velké množství kyslíku a tím je růst embrya značně inhibován. Dochází ke snížení klíčivosti a aktivity α-amylázy (Bokulich a Bamforth 2013). Díky spotřebě kyslíku vznikne mikroaerobní prostření kde se hojně množí bakterie mléčného kvašení, zejména rod Leuconostoc (Justé a kol. 2011). Bylo prokázáno, že druhy Flavobacterium esteroaromaticum, Erwinia

herbicola,

Pseudomonas

fluorescens,

Pseudomonas

putida,

Serratia

plymuthica a některé druhy rodu Lactobacillus jsou schopny během máčení přežít a množit se během klíčení (Priest a Campbell 2003). Snížením obsahu živin a vyplavováním mikroorganizmů pomocí vyměňování vody během vzdušné přestávky je

33

Bakterie v procesu výroby sladu možné snižovat počty kontaminujících mikrobů. Také je vhodné máčet za nižších teplot (Briggs a McGuinness 1992). Během klíčení se mikroorganizmy rychle množí. Převažuje růst bakterií čeledi Enterobacteriaceae, rodu Pseudomonas a Leuconostoc (Justé a kol. 2011). Pravděpodobnost bakteriální kontaminace závisí i na způsobu klíčení. Tradiční klíčení v humnech je rizikovější, zatímco pneumatické sladování ve skříňových nebo bubnových klíčidlech se považuje za méně rizikové (Kosař a kol. 2000; Priest a Campbell 2003). Poslední krok v procesu sladování (hvozdění) je z hlediska bakteriálního znečištění nejdůležitější. Ve sladovnách s moderními hvozdiči se při něm 99,8 % mikrobů zničí. V případě přemnožení vznikne biofilm, ve kterém mikroorganizmy přetrvají i během vysokých teplot finální fáze hvozdění (Justé a kol. 2011; O’Sullivan a kol. 1999). Termorezistentní bakterie s odolnými sporami jako Bacillus a Clostridium rovněž mohou hvozdění přežít (Basařová a kol. 2010). Slad a jeho meziprodukty, které bývají napadeny mikrobiální kontaminací, lze poznat podle výskytu slizu na povrchu zrn, zabarvením obilek, přítomností metabolitů mikroorganizmů a sníženým obsahem kyslíku v zrnu (Briggs a McGuinness 1992). Tab. 1: Zastoupení bakteriálních rodů ječmene a ječného sladu (převzato z Noots a kol. 1998, upraveno).

Mikroflóra po sklizni Gram -

Mikroflóra sladu

Gram +

Gram -

Gram +

Clavibacterium

Actinomyces

Clavibacterium

Actinomyces

Enterobacter

Arthobacter

Enterobacter

Arthrobacter

Erwinia

Bacillus

Erwinia

Bacillus

Escherichia

Corynebacterium

Escherichia

Lactobacillus

Flavobacterium

Lactobacillus

Flavobacterium

Leuconostoc

Pseudomonas

Leuconostoc

Pseudomonas

Micrococcus

Xanthomonas

Micrococcus

Pediococcus

Pediococcus Streptomyces Thermoactinomyces

34

Bakterie v procesu výroby piva 6. Bakterie v procesu výroby piva Výroba piva je velmi komplexní proces, při kterém se ve srovnání s ostatními potravinářskými provozy uplatňuje jen poměrně úzké spektrum bakterií. Množství živin je značně omezené (většina z nich je spotřebována kulturními kvasinkami během hlavního kvašení), postup výroby většinou zamezuje růstu a množení mikroorganizmů (Sakamoto a Konings 2003; Vriesekoop a kol. 2012). Jsou tu i citlivá místa (resp. fáze výroby), u kterých lze kontaminaci předpokládat a jsou tudíž pravidelně kontrolována, např. propagace kvasnic, zchlazená mladina (zejména při kvašení v otevřených kádích), plnění pasterovaného piva apod. (Bokulich a Bamforth 2013). V pivovarských provozech se kromě bakterií objevují i vláknité houby a divoké kvasinky (Vaughan a kol. 2005). Mezi bakterie adaptované na podmínky pivovarského prostředí řadíme mléčné bakterie, enterobakterie, některé mikrokoky, některé striktně anaerobní bakterie a nepřímo i octové bakterie (Basařová a kol. 2010). Během chmelovaru se chmel přidává primárně pro své charakteristické aroma a chuť a zároveň kvůli svým inhibičním účinkům proti většině grampozitivních bakterií. Tyto vlastnosti mu propůjčují chmelové pryskyřice, hlavně pak α-kyseliny (humulony) a β-kyseliny (lupulony). Humulony během chmelovaru izomerizují. Ve své izomerované formě pak rozrušují plazmatickou membránu citlivých bakterií, inhibují aktivní transport živin přes membránu a syntézu proteinů a nukleových kyselin (Vriesekoop a kol. 2012). V buňce vnímavých LAB bakterií dále disociují, působí jako protonofory (snižují pH gradient). Aktivní pH gradient je důležitá složka proton-motivní síly, která pomáhá vytvářet energii v podobě ATP. Hodnota pH také ovlivňuje distribuci živin v cytoplazmě a metabolizmus buňky. Pokud se pH gradient destabilizuje, dochází naopak k inhibici transportu živin a tím ke strádání citlivých bakterií. Bylo zjištěno, že disociované hořké kyseliny jsou schopny vyměnit svoje protony za bivalentní kationty jako například Mn2+. Chmelové kyseliny v podobě COO- (anionty) se vážou s těmito kationty a mohou být vyplaveny ven z buňky. Kovové ionty, obzvláště pak Mn2+, jsou pro růst buňky esenciální (Hill a kol. 2015). Dalším inhibičním faktorem je relativně nízké pH mladiny. K jeho poklesu dochází

už

při

rmutování,

díky

fosforečnanům

pocházejícím

ze

sladu

a

aminokyselinám, organickým kyselinám a iontům ve varní vodě. Optimální pH rmutů je 5,4-5,5, u mladiny 5,2 (Basařová a kol. 2010). K docílení okyselení lze použít slad, který byl inokulován vybranými kmeny LAB, nebo lze inokulovat zchlazenou mladinu 35

Bakterie v procesu výroby piva (Vaughan a kol. 2005). Nízké pH má vliv na enzymatickou aktivitu a příjem živin mikroorganizmy. Mnoho patogenních bakterií nedokáže v pivu přežít. Bylo zjištěno, že jen druhy Yersinia enterocolitica, Staphylococcus aureus, Clostridium botulinum a Salmonella spp. jsou schopny růstu při pH piva. Ostatní překážky jako chmelové složky, etanol a CO2 je zničí (Vriesekoop a kol. 2012). Velmi nízký potenciál kažení mají také rody Bacillus, Corynebacterium, Kocuria a Streptococcus (Simpson a kol. 1988). Při fermentaci se začíná produkovat etanol, který je pro řadu bakterií inhibující. Čím vyšší obsah alkoholu je v hotovém pivu, tím je pivo méně náchylné ke kontaminaci. Alkohol působí na plazmatickou membránu - zvyšuje její permeabilitu a snižuje enzymatickou aktivitu membránových proteinů (Hill a kol. 2015; Vriesekoop a kol. 2012). Také snižuje příjem živin. Tato skutečnost se promítá do tvaru buněk; bylo zjištěno, že laktobacily citlivé na přítomnost etanolu mají větší rozměry buňky (Obr. 7.) a v přítomnosti etanolu (a tedy i v těžším přístupu k živinám) zmenšují a ztlušťují svoji buňku (Suzuki a kol. 2008b).

(a)

(b)

Obr. 7: Adaptace L. brevis ABBC45 na pivo (a) L. brevis adaptovaný na pivo, (b) L. brevis neadaptovaný na pivo (převzato ze Suzuki a kol. 2008b).

Gramnegativní i grampozitivní bakterie staví svou odolnost na změně plazmatické membrány a buněčné stěny (Suzuki a kol. 2008b). Zvyšuje se podíl víceuhlíkatých mastných kyselin (16-18C), lipidů, peptidoglykanu a proteinů vnější membrány. Mezi nejodolnější druhy gramnegativních bakterií patří Zymomonas mobilis, která je používána v lihovarnictví (Liu a Qureshi 2009). Při kvašení se kromě alkoholu vytváří velké množství oxidu uhličitého. Moderní stáčení způsobuje, že v pivu je nízké procento kyslíku a vysoký podíl CO2. Toto 36

Bakterie v procesu výroby piva prostředí je ideální pro růst anaerobních bakterií. Samotný oxid uhličitý snižuje pH, ovlivňuje karbonylační a dekarboxylační reakce a přímo inhibuje růst mikrobů (Vriesekoop a kol. 2012). Živiny v kvasící mladině jsou rychle využívány kulturními kvasinkami, a tudíž se jejich koncentrace v průběhu fermentace snižuje. Živiny zahrnují sacharidy, aminokyseliny a vitamíny skupiny B. Zvýšený podíl dusíkatých látek zvyšuje možnost mikrobiální kontaminace (Vriesekoop a kol. 2012). Kontaminaci můžeme rozlišovat podle různých hledisek. Nejčastěji se pivu škodící mikroorganizmy posuzují podle fáze výroby, při níž dochází ke kontaminaci, na tzv. primární a sekundární kontaminaci. Primární kontaminace zahrnuje znečištěné suroviny - slad a vodu. Vstupní cestou do výroby mohou být i kvasnice, a to jak opakovaně nasazené kontaminované v daném provozu, tak i kvasnice z jiného pivovaru. Dále se mohou meziprodukty znečistit vlivem lidského zásahu, znečištěným vybavením (potrubí, varné kádě, tanky atd.), špatnou sanitací a špatnou kanalizací. Za sekundární kontaminaci považujeme kontaminaci hotového piva. Někdy je používán pojem postpasterizační kontaminace. Jde zejména o kontaminace piva při plnění do obalů, případně kontaminaci při převozu hotového piva cisternami (Vaughan a kol. 2005). Při sekundární kontaminaci jsou častým zdrojem biofilmy (Obr. 8). Bakterie v různých úrovních biofilmu mají různou metabolickou aktivitu, mnohdy vytváří extracelulární polymery (pouzdra) a tím zajišťují mimořádnou odolnost biofilmu vůči teplu a chemikáliím. V pivovarství mají hlavní podíl na jeho tvorbu octové bakterie, které jsou aerobní. Uvnitř biofilmu spotřebou kyslíku vytváří anaerobní prostředí s ideálními podmínkami pro růst fakultativních i striktních anaerobů. Biofilmy se většinou vytváří na nerovných, členitých a drsných površích, kde se bakterie lépe uchytí (Basařová a kol. 2010; Matoulková a kol. 2012b). Pokud se v pivovarském provozu objeví, lze je považovat za zdroj mikrobiální kontaminace. Z biofilmů byly izolovány grampozitivní i gramnegativní bakterie, kvasinky i vláknité houby (Shabani a Devolli 2010). Nyní se výzkum hojně zabývá novými technikami čištění a ošetřování povrchů (Priha a kol. 2015).

37

Bakterie v procesu výroby piva

Obr. 8: Ukázka biofilmu na konstrukci monobloku a dopravníkovém pásu (převzato z Matoulková a kol. 2012b).

Dalším

hlediskem,

podle

kterého

lze

kontaminující

mikroorganizmy

klasifikovat, je jejich škodlivost. Nejvíce rizikové jsou obligátně pivo kazící bakterie. Ty zahrnují např. rody Lactobacillus, Pediococcus a Pectinatus. Potencionálně škodlivé bakterie jsou schopny růstu pouze po adaptaci na podmínky v pivu nebo v nedostatečně prokvašeném pivu (např. rody Lactobacillus, Kocuria, Zymomonas). Další skupinou jsou nepřímo škodlivé bakterie. Pomnožují se v meziproduktech a nepřímo ovlivňují parametry piva (např. enterobakterie produkující senzoricky aktivní metabolity, které přechází až do hotového piva). Indikátorové bakterie mohou poukazovat na špatnou sanitaci provozu (např. octové bakterie). Poslední skupinou jsou latentní bakterie, které ve výrobě pouze přežívají, např. některé enterobakterie (Basařová a kol. 2010). Menší pivovarské provozy (např. restaurační pivovary) bývají více ohroženy mikrobiální kontaminací. Pivo většinou nijak nestabilizují a čištění a sanitace výrobních zařízení není mnohdy řešena systematicky (Maifreni a kol. 2015). V práci Jeon a kol. (2015) je potvrzeno, že kontaminací více trpí pivo vyrobené v restauračních pivovarech (minipivovarech) a pivo točené. Pro točená piva bývají zdrojem výčepní zařízení, jejichž provozovatelé provádějí mnohdy nedostačující sanitaci (Hill a kol. 2015).

38

Bakterie v procesu výroby piva Tab. 2: Hlavní skupiny bakterií v pivovarství (převzato z Basařová a kol. 2010, upraveno). Název

Příklad

Specifikace

Octové bakterie

A. aceti, G. oxydans

Mladinové bakterie

Enterobakterie: E. aerogenes, O. proteus, R. aquatilis

Mléčné bakterie-tyčky

L. brevis, L. casei, L. lidneri L. delbrueckii, L. buchneri

Mléčné bakterie-koky

P. damnosus, P. inopinatus, P. pentosaceus

Mikrokoky

K. kristinae

Bacillus Striktně anaerobní bakterie

B. coagulans, B. stearothermophylus P. cerevisiiphilus, P. frisingensis, M. cerevisae, Z. mobilis, S. lacticifex, Z. raffinosivorans, Z. paucivorans

G- aerobní tyčky a koky, pohyblivé/nepohyblivé, nesporulující, kataláza + G- převážně fakultativně anaerobní tyčky, pohyblivé/nepohyblivé, nesporulující, kataláza + G+ mikroaerofilní tyčky, nepohyblivé, nespoulující, katalázaG+ anaerobní i mikroaerofilní koky, po dvou, tetrády, kataláza G+ fakultativně anaerobní koky, kataláza + G+ aerobní tyčky či koky, sporulující, kataláza + G- obligátně anaerobní, nesporulující, tyčky i koky

6.1. Mléčné bakterie Mléčné bakterie se běžně vyskytuji ve všech odvětvích potravinářského průmyslu. V mlékárenství bývají využívány pro výrobu mléčných výrobků. Jejich výskyt při výrobě piva zpravidla není žádoucí. Mohou měnit senzorické vlastnosti piva a v extrémních případech může dojít i k úplnému zničení várky (Hollerová a Kubizniaková 2001). Bakterie mléčného kvašení tvoří heterogenní skupinu grampozitivních bakterií zahrnující rody Lactobacillus, Lactococcus, Pediococcus, Enterococcus, Leuconostoc, Oenococcus,

Paralactobacillus,

Streptococcus,

Tetragenococcus,

Weisella

aj.

(Matoulková a Kubizniaková 2015). Tyto bakterie se vyznačují produkcí kyseliny mléčné jako hlavním produktem fermentace sacharidů. Můžeme je rozdělit na homofermentativní, jejíchž hlavním produktem metabolizmu je kyselina mléčná (Obr 9), a heterofermentativní, které produkují směs kyseliny mléčné, etanolu a oxidu uhličitého (Boulton 2013).

39

Bakterie v procesu výroby piva Během homofermentativního kvašení dochází k přeměně glukózy procesem glykolýzy na dvě molekuly pyruvátu. Ten se pak přemění na kyselinu mléčnou. V případě heterofermentativní fermentace vzniká jedna molekula kyseliny mléčné, etanol a CO2 (Obr. 10). Některé LAB jsou schopné tvořit diacetyl (Basařová a kol. 2010).

2 ATP glukóza

4 ADP

2 ADP

4 ATP 2 pyruvát

EMP

2 NADH2

2 NAD

2 laktát

2 CO2 Obr. 9: Schéma homofermentativního mléčného kvašení (převzato z Němec a Matoulková 2015, upraveno).

40

Bakterie v procesu výroby piva

glukóza ATP ADP glukóza-6-P NAD

xylulóza-5-P

NADH2 k. 6-P-glukonová CO2

fosfoketoláza

epimeráza

NADH2 NAD

ribulóza-5-P

glyceraldehyd-3-P 2 ADP

NAD

2 ATP

NADH2

k. pyrohroznová

acetylfosfát KoA P acetyl-KoA

NADH2 NAD laktát

NADH2 KoA

NAD

acetaldehyd NADH2 NAD etanol

Obr. 10: Schéma heterofermentativního kvašení (převzato z Němec a Matoulková 2015, upraveno).

LAB jsou nejčastějšími kontaminanty piva, zodpovědné za asi 60-70 % všech případů mikrobiálního kažení. Ne všechny druhy a kmeny mléčných bakterií mají schopnost kazit pivo. Tato schopnost je dána kmenovou příslušností. Odlišit kazící kmeny od nekazících bývá komplikované, některé jsou považovány jen za potencionálně kazící – v pivu přežívají, ale nekazí ho (Suzuki a kol. 2006a). 41

Bakterie v procesu výroby piva 6.1.1. Mechanizmus rezistence mléčných bakterií proti účinkům chmelových látek Antimikrobiální vlastnosti chmelových α-kyselin (humulonu), β-kyselin (lupulonu) a jejich izomerizovaných forem jsou studovány řadu let (Hill a kol. 2015). Pokud se mléčné bakterie opakovaně inkubují v živném médiu s obsahem hořkých chmelových kyselin, dokáží se na ně adaptovat. Pokud se pak převedou na médium bez chmelových látek, jejich rezistence klesá, pokud se obsah látek v médiu naopak zvyšuje, rezistence rapidně vzroste (Suzuki a kol. 2002). Je pravděpodobné, že schopnost kazit pivo u mléčných bakterií je podmíněna geneticky. Gen horA, spjatý s rezistencí vůči chmelovým kyselinám byl zjištěn u izolátů druhů L. brevis, L. casei, L. linderi, L. paracollinoides a P. damnosus (Haakensen a kol. 2007). Gen byl nalezen na plazmidu pRH45 u druhu L. brevis a byl prokázán jeho horizontální přenos (Sami a kol. 1998; Suzuki 2011). Je také možný transpozonální horizontální přenos, kdy bakterie předá pouze tyto geny bez celého plazmidu (Hill a kol. 2015). Dále byl gen horA prokázán na plazmidu pRH478 izolovaného z P. damnosus (Obr. 11). Gen i plazmidy z obou izolátů byly kompletně osekvenovány (Suzuki a kol. 2006b).

Obr. 11: Restrikční mapa plazmidu: (a) pRH478 (P. damnosus) a (b) pRH45 (L. brevis) (převzato ze Suzuki a kol. 2006b, upraveno).

Výsledný protein HorA je umístěn v membráně a funguje jako pumpa, která hořké kyseliny odčerpává ven z buňky (Suzuki a kol. 2008b). Závislost přítomnosti genu horA a rezistence nebyla zatím jasně prokázána (Haakensen a kol. 2007). Výsledný produkt genu z L. brevis je v některých částech homologní se savčími P-

42

Bakterie v procesu výroby piva glykoproteiny, MDR1 a MDR3 multidrogovými přenašeči. Dále je podobný s ABC transportery MsbA u E. coli a s YwjA B. subtilis (Sami a kol. 1997b). ABC multidrogové přenašeče jsou vysoce specifické membránové proteiny. Jejich specifita spočívá v přenášení určitých skupin molekul např. malé, velké, různě nabité. Některé z přenašečů jsou natolik specifické, že rozeznají a přenesou jen určitou molekulu. Většina těchto přenašečů zprostředkovává export (jsou to uniporty), díky nimž se organizmus zbavuje metabolitů či toxických látek (Higgins 2001). Rezistence na hořké kyseliny nemá vliv na morfologii buňky či kolonie, rozpětí pH růstu, spektrum využívaných sacharidů, produkci metabolitů atd. (Sakamoto a Konings 2003). Je ovšem pravděpodobné, že LAB se snaží zmenšit povrch svojí buňky, a tím si tak zajistit vyšší zastoupení jednotlivých membránových komponent na povrchu (Suzuki a kol. 2008b). Dále bylo prokázáno, že za rezistenci je zodpovědný gen horC, který byl prokázán u bakterie L. brevis. Jeho funkce byla prokázána transformací. Gen horB pravděpodobně hraje roli v regulaci exprese genu horC (Iijima a kol. 2006). Produkt genu může hrát roli v proton motivní síle (PMF), protein je jako HorA zakomponován do membrány. Oba tyto geny byly prokázány také u druhů L. linderi, L. paracollinoides a P. damnosus (Suzuki 2011). Pokud jsou geny horA a horC u LAB prokázány, existuje 100% pravděpodobnost, že tato bakterie je rezistentní ke chmelovým kyselinám a je schopna kazit pivo. Pokud je prokázán pouze jeden gen, pravděpodobnost se snižuje na 94 % (horA) nebo na 96 % (horC). Tyto geny se mohou používat jako spolehlivé markery při určování schopnosti kazit pivo (Suzuki 2011). Ztráta dvojmocných iontů (Mn2+, Mg2+) je v buňce nahrazena jejich přenášením z prostředí pomocí membránového přenašeče dvojmocných kationtů HitA (Matoulková a kol. 2012c). Tento přenašeč homologní s proteinem Nramp patří do rodiny transportních proteinů přenášejících dvojmocné kationty (Hayashi a kol. 2001). Mezi pasivní způsoby obrany proti hořkým kyselinám patří změny v buněčné membráně. Bakterie změní její složení, konkrétně pak saturované mastné kyseliny s 16 uhlíkatým řetězcem. Tato změna sníží fluiditu membrány a ta je poté méně prostupná pro chmelové kyseliny. Některé kmeny bakterií mají v buněčné stěně lipoteichoové kyseliny o vyšší molekulové hmotnosti (Obr. 12). Ty způsobují, že chmelové kyseliny méně prochází do buňky (Hill a kol. 2015).

43

Bakterie v procesu výroby piva

Obr. 12: Schéma znázorňující mechanizmy rezistence ke chmelovým látkám: Membránové proteiny HorA a HorC odčerpávají z buňky chmelové kyseliny (Hop-H), membránový protein HitA zpět načerpává dvojmocné kationty, ATPáza aktivně odčerpává disociované H+ ionty. Buňka zmenšuje svůj povrch kvůli „zkoncentrování“ membránových proteinů a dochází ke zvyšování exprese hitA (převzato z Hill a kol. 2015, upraveno).

6.1.2. Rod Lactobacillus Tvar buněk rodu Lactobacillus je většinou tyčkovitý, někdy i variabilní (kokotyčky). Vyskytují se většinou jednotlivě. Délka a tvar buněk závisí na stáří kultury, dostupnosti živin, přítomnosti inhibitorů, na tenzi kyslíku atd. Kolonie jsou většinou bílé až krémové, slizovité s pravidelnými či nepravidelnými okraji (Matoulková a Kubizniaková 2015). Rod Lactobacillus je nejrozšířenějším rodem LAB v pivovarském prostředí (Hollerová a Kubizniaková 2001). Lactobacillus brevis je obligátně heterofermentativní bakterie, která patří mezi nejprostudovanější pivo kazící bakterie. Roste optimálně při 30 °C, v rozmezí pH 4-6 a za mikroaerofilních podmínek. Některé kmeny se vyznačují rezistencí k hořkým chmelovým látkám. Lactobacillus brevis bývá nejčastější kontaminantou v pivovarech, je zodpovědná za cca 50 % případů mikrobiálního kažení piva. Můžeme ji nalézt v meziproduktech (mladina, mladé pivo) i v hotovém pivu. V hotovém pivu způsobuje zákal, sediment a kyselou vůni a chuť (Sakamoto a Konings 2003; Suzuki 2011). Některé kmeny tohoto druhu mají extracelulární kapsuly, které odolávají většině prostředků, které jsou používány v pivovarech a přežijí 25 pasterizačních jednotek. (Back 2005; Hill a kol. 2015). Tento druh roste na většině mikrobiologických půd na rozdíl od jiných těžko kultivovatelných druhů (Suzuki a kol. 2008b).

44

Bakterie v procesu výroby piva Některé homofermentativní druhy jsou acidofilní a tolerují až 15% obsah etanolu v půdě. Patří mezi ně například L. fructivorans izolovaný z piva typu Ale. Díky velkému rozšíření laktobacilů v pivovarech se výzkum zabývá vývojem selektivních izolačních médií (Suzuki a kol. 2008b). Některé druhy tohoto rodu i rodu Pediococcus mohou zlepšovat vlastnosti surovin a meziproduktů, přidávají se například do máčecí vody během sladování, do vody během mokrého šrotování anebo do mladiny. Přispívají tak k bioacidifikaci (Lowe a kol. 2005). Tyto technologie ovšem částečně mění organoleptické vlastnosti piva, nabízí však nové možnosti v chuti. Přítomnost určitých kmenů LAB a dalších mikroorganizmů (kvasinek) vyžaduje výroba některých pivních specialit jako například kyselého piva, spontánně kvašeného piva Lambic, některých dalších belgických piv a berlínského pšeničného piva (Bokulich a Bamforth 2013; Hill a kol. 2015).

6.1.3. Rod Pediococcus Bakterie tohoto rodu jsou grampozitivní, mají tvar koků, vyskytují se jednotlivě, ve skupinách či v tetrádách. Bývají nazývány jako „mléčné koky“ nebo „sarciny“ (Matoulková a Kubizniaková 2015). Průkaz koků v tetrádách se může považovat jako předběžný průkaz pediokoků v pivu. Nevytváří spory, jsou nepohyblivé a anaerobní, pH optimum je okolo 6. Je možné je zachytit v pivě, které dokážou okyselit až na pH 4 (Basařová a kol. 2010). Optimální teplota růstu je okolo 28 °C, dokážou růst i v mnohem nižší teplotě okolo 0 °C (Hill a kol. 2015). U jednotlivých druhů může být rozsah optimální teploty růstu různý. U P. damnosus to bývá 8-30 °C, u P. acidilacti je optimum uváděno okolo 40 °C, maximální teplota růstu je dokonce 50-53 °C. Obecně rostou velmi pomalu, při kultivaci 28-30 °C 5-7 dní, u druhu P. damnosus i déle (Matoulková a Kubizniaková 2015). Pediokoky jsou podobně nutričně náročné na živiny jako laktobacily, jsou ovšem citlivější. Jsou homofermentativní, kataláza negativní (Basařová a kol. 2010) a jsou typické produkcí velkého množství diacetylu, které pivu dává máslovou až medovou chuť a vůni (Sakamoto a Konings 2003). Nacházíme je ve všech stádiích výroby piva od výroby mladiny až po hotové pivo. Pomnožení pediokoků v mladině během kvašení má za následek zvýšenou teplotu dokvašování (Basařová a kol. 2010). Mohou adherovat na povrch kvasinek a způsobit tak jejich předčasnou flokulaci a sedimentaci (Suzuki 2011). Pediococcus a další LAB bývají součástí mikroflóry spontánně kvašeného piva Lambic (Boulton a Quain 2001). 45

Bakterie v procesu výroby piva Dříve rod Pediococcus způsoboval velké škody například v ležáckém sklepě, nyní se tyto škody díky pokročilé sanitační technologii většinou nevyskytují (Basařová a kol. 2010). Samotná izolace a identifikace pediokoků do druhů bývá náročná (Hollerová a Kubizniaková 2001). V pivovarech byly prokázány tyto druhy: P. acidilacti, P. damnosus (dříve nazývaný jako P. cerevisiae), P. dextrinicus, P. halophilus (nyní klasifikován jako Tetragenococcus halophilus), P. inopinatus, P. parvulus a P. pentosaceus (Collins a kol. 1990; Hill a kol. 2015). Nejvíce zastoupen je druh P. damnosus. Nalezen byl pouze v pivu a pivovarských kvasnicích, nikoli v surovinách (Matoulková a Kubizniaková 2015). Naopak P. acidilacti a P. pentosaceus se vyskytují ve sladu a při vaření piva do procesu chmelení (Jespersen a Jakobsen 1996). 6.1.4. Metody detekce mléčných bakterií Kvůli riziku kažení piva a tím i velkým finančním ztrátám pivovarů je nutno jednotlivé druhy kontaminace včas a co možno nejrychleji detekovat. Nejpomalejší a mnohdy komplikovaný krok v metodice je samotná kultivace bakterií (Taskila a kol. 2009). Univerzální kultivační půda pro detekci všech škodlivých mléčných bakterií neexistuje (Back 2005). Nejčastěji používaným médiem pro kultivaci LAB je MRS médium. Je vhodné pro detekci širokého spektra mléčných bakterií. Pokud chceme kultivaci urychlit, lze do média přidat glukózu či sacharózu (Matoulková a Kubizniaková 2015; Taskila a kol. 2009). Dalšími doporučenými médii jsou Raka-Ray, VLB-S7, NBB-A a BMB (Suzuki a kol. 2008a). Dále existují média, jejichž základ tvoří pivo, např. UBA, KOT, také lze použít NBB. Složení těchto půd je popsáno v práci Jespersena a Jakobsena (1996). Pro těžko kultivovatelné kmeny bylo vyvinuto Suzuki a kol. (2008a) ABD médium, které vykazuje selektivitu k bakteriím citlivým k pivu. Naočkované plotny se kultivují v anaerobní nádobě, ze které se odčerpá vzduch nebo je načerpána umělá atmosféra (Briggs a kol. 2004). Možná a levná je kultivace kontaminantů na půdách obsahujících chmelové složky. Případný růst je indikátorem pivo kazících bakterií (Sami a kol. 1997a). Dále je možno očkovat do piva, které je předtím vhodné provzdušnit a upravit jeho pH (Jespersen a Jakobsen 1996). Pro detekci kontaminantů z odpadních nebo očkovacích kvasnic, kvasící mladiny, piva z ležáckých tanků je vhodné kultivovat vzorek o objemu 1 ml na pevném 46

Bakterie v procesu výroby piva či v tekutém médiu. Pro zfiltrované pivo, stočené pivo a vody z CIP se 100 ml vzorku zfiltruje membránovou filtrací a filtr je kultivován na selektivním médiu. Vedle používání selektivních půd pro jednotlivé skupiny pivo kazících bakterií je vhodné testování doplnit o klasické testování mezofilních a aerobních bakterií na neselektivních plotnách, tento postup zajistí stanovení hygienické a sanitační úrovně provozu (Jespersen a Jakobsen 1996). U mléčných bakterií není bezpodmínečně nutná identifikace na úroveň druhu. Důležitějším znakem je schopnost růstu v pivu, tedy schopnost pivo kazit (Suzuki a kol. 2006a). Metoda stanovení mikrokolonií je založena na aplikaci CFDA či FISH a pozorování mikrokolonií na membránovém filtru pod mikroskopem. Kultivace trvá kolem 3 dní, tato doba stačí pro nárůst mikrokolonií a jejich analýzu pomocí CCD kamery (Asano a kol. 2009). Dále je možná imunologická identifikace, která je založena na navázání specifických monoklonálních protilátek na povrchové antigeny bakterie. Pozitivní reakce (navázání) je potvrzena např. chemiluminiscencí (March a kol. 2005). Byly publikovány práce na využití avoparcinu a vankomycinu jako selektivních látek pro rozlišení jednotlivých druhů mléčných bakterií (Simpson a kol. 1988). Rezistenci ke chmelovým látkám můžeme prokázat několika dalšími způsoby. Mléčné bakterie, u kterých se prokážou geny horA a horC, jsou pivo kazící (Suzuki a kol. 2006a). Regiony plazmidu nesoucí tyto geny jsou u obou rodů (Lactobacillus a Pediococcus) z 99 % totožné, tudíž je možná druhově nezávislá identifikace bakterií rizikových pro pivo (Iijima a kol. 2007). Jako rychlá a nenáročná metoda se nabízí amplifikace části genu horA (Sami a kol. 1997a; Suzuki a kol. 2006b). Byla navržena řada primerů pro PCR, které vykazovaly různou kvalitu reakce (Haakensen a kol. 2007; Sami a kol. 1997a; Suzuki a kol. 2006b). Primery byly navrženy k amplifikaci konzervativních částí DNA regionů např. Walker A, linker peptid (Suzuki a kol. 2006b). Dále je možná amplifikace genů horC, hitA a gyrB (Suzuki a kol. 2008b). Používá se jak standardní PCR tak i real-time PCR (Haakensen a kol. 2007). Další metodou molekulární biologie, kterou lze pro určení použít, je například RAPD-PCR. Tato metoda je založena na použití jednoho či několika primerů, jejichž lokusy jsou pro danou skupinu bakterií typické. Vykazuje vysokou specifitu (Fujii a kol. 2005).

47

Bakterie v procesu výroby piva Vhodná je i ribotypizace, jež je založena na štěpení zkoumané DNA restrikčními enzymy a na následném Southernově blottu (přenosu). Poté jsou aplikovány hybridizační

sondy,

komplementární

k 5S-16S-23S

ribozomálnímu

operonu.

Ribotypizace je velmi přesnou a široce aplikovatelnou metodou, která je již automatizovaná, její velkou nevýhodou je vysoká pořizovací cena i vysoká cena jednoho běhu (Suzuki a kol. 2006a). Dále se používá metoda FISH, která umožňuje detekci bakterie na úrovni jediné buňky. Princip spočívá v navázání hybridizační sondy, jež vykazuje specifitu. Při navázání sondy se odštěpí fluorescenční značka, díky které lze pozitivní reakci detekovat. Výhoda techniky spočívá v rychlosti testování, kdy lze vynechat kultivační krok (Suzuki a kol. 2006a). MALDI-TOF MS je vysoce úspěšnou metodou pro určování bakterií. Je založena na detekci specifických proteinů či peptidů, jejichž spektrum se poté porovnává s databází. Lze ji aplikovat v mnoha odvětvích mikrobiologie. Díky ní můžeme analyzovat jak vzorky z kultivace tak i mikrobiální společenstva, například biofilmy. Nevýhodou je vysoká pořizovací cena spektrometru, ale samotný běh je levný (Vávrová a kol. 2014).

6.2. Enterobakterie V procesu výroby piva se tato skupina nejčastěji vyskytuje v mladině či při propagaci kvasnic. Mladina je ideální prostředí pro množení mikroorganizmů. Obsahuje sice již chmel, ale etanol se vytvoří až v průběhu kvašení (Vuuren a kol. 1978). Primárním zdrojem enterobakterií je většinou voda (Basařová a kol. 2010; Briggs a kol. 2004). Čeleď Enterobacteriaceae patří do třídy Gammaproteobacteria. V pivovarském provozu se vyskytují rody Obesumbacterium, Citrobacter, Rahnella, Klebsiella, Enterobacter a Escherichia (Hill a kol. 2015). Obecně jsou citlivé k nízkému pH (pod 4,4), jejich růst je inhibován již za nízkých koncentrací alkoholu (Priest a kol. 1974). V mladině vytváří dimetylsulfid, organické kyseliny, 2, 3-butandiol, další zástupci mohou tvořit biogenní aminy, které mohou být ve větším množství zdraví škodlivé. Obesumbacterium proteus a R. aquatilis byly detekovány v pivovarských kvasnicích a pokud jsou přítomny v mladině, zvyšují její pH (Vaughan a kol. 2005). Obecně jsou k mikrobiálnímu kažení nejvíce náchylná piva s nízkým obsahem alkoholu (nealkoholická), s vyšším pH a s krátkou dobou ležení, rizikové jsou nápoje 48

Bakterie v procesu výroby piva z piva a cukerných bází, tzv. radlery (Preedy a kol. 2009). Některé studie ukazují, že růst patogenních zástupců jako např. Salmonella, Serratia, Shigella, Escherichia a Enterobacter je inhibován změnami, které probíhají v kvasící mladině (Preedy a kol. 2009; Vriesekoop a kol. 2012). V práci Menz a kol. (2010) byla mladina zaočkována současně kvasnicemi i enterobakteriemi. Bakterie se množily po dobu přibližně 20 hodin, poté začaly odumírat vlivem přibývajícího etanolu a oxidu uhličitého. Ve studii Kim a kol. (2014) byl do piva naočkován vybraný kmen druhu E. coli a S. enterica ser. typhimurium. Tyto bakterie v pivu přežily i po 28 dnech, aniž by pivo zkazily. Stanovení přítomnosti enterobakterií je obvykle jednoduché. Optimální teplota růstu je u většiny enterobakterií kolem 37 °C, u izolátů z prostředí spíše 30-32 °C (Priest a kol. 1974). Používán je Endův agar obsahující indikátor fuchsin. Dále se může použít McConkey agar s chlorfenolovou červení. Hlavní skupiny lze odlišit podle základních biochemických testů nebo sérologicky (Basařová a kol. 2010). Dále lze použít komerční testy API ® od firmy BioMérieux. Stejně jako Enterotesty fungují jako sada (většinou 20) biochemických testů s indikátorem (Boulton 2013). Dostupné jsou i molekulární metody, např. PCR nebo automatická ribotypizace (Hill a kol. 2015). Přítomnost enterobakterií je žádoucí v prvních fázích spontánního kvašení belgického piva Lambic. Během fermentace jsou postupně nahrazeny divokými kvasinkami či jinými bakteriemi (Bokulich a Bamforth 2013, Keersmaecker 1992). 6.3. Striktně anaerobní bakterie V procesu výroby piva můžeme nalézt čtyři rody striktně anaerobních bakterií. Jsou to rody Pectinatus, Zymophilus, Selenomonas a Megasphaera patřící do čeledi Veillonellaceae řádu Clostridiales (Bokulich a Bamforth 2013; Němec a Matoulková 2015). Jsou to gramnegativní bakterie s rozmanitým tvarem, mohou být pohyblivé i nepohyblivé (Hill a kol. 2015). Obecně snáší široké rozmezí hodnot pH a koncentrace etanolu až do 5 % (Bokulich a Bamforth 2013). Většina anaerobních bakterií se vyskytuje jako sekundární kontaminace hotového piva. Tyto druhy jsou spjaty s moderní výrobou a plněním piva, které obsahuje jen malé množství kyslíku. Minimum kyslíku zajišťuje vyšší chemickou stabilitu a tím i delší trvanlivost piva. Představuje však ideální prostředí pro růst anaerobů. Vzrůstající četnost kontaminace touto skupinou je dále podporována stále větší produkcí nepasterovaného nebo průtokově pasterovaného piva (Haikara a

49

Bakterie v procesu výroby piva Helander 2006). Některé druhy jsou zodpovědné za kontaminaci kvasnic (Sakamoto a Konings 2003).

6.3.1. Rod Pectinatus Rod Pectinatus zahrnuje 3 druhy objevující se v pivovarství: P. cerevisiiphilus, P. frisingensis a P. haikarae (Paradh a Hill 2016). Tato skupina je zodpovědná za 20-30 % všech incidentů mikrobiálních kažení převážně nepasterovaného piva. Ekologická nika (původní prostředí) dosud není známa (Sakamoto a Konings 2003). Tento rod byl objeven poměrně nedávno a to v 70. letech minulého století v USA. Druh P. cerevisiiphilus byl následně zaznamenán v pivovarech ve Finsku, Německu, Norsku, Japonsku, Španělsku, Nizozemsku, Švédsku a Francii (Paradh a kol. 2011). Bakterie Pectinatus jsou mimořádně přizpůsobené k růstu v pivu, rozpětí pH růstu je od 3,5 do 8,0. Snáší koncentraci etanolu do 4,5 % a koncentraci hořkých kyselin do 150 mg/l (Matoulková a Kubizniaková 2014). Jsou gramnegativní, mezofilní, kataláza negativní a mohou se pohybovat pomocí bičíků (1-23), umístěných na jedné straně buňky do „hřebínku“. Tvar mladších buněk je tyčkovitý s kulatými konci, zatímco starší buňky jsou delší a helikální. Jsou většinou pohyblivé, pohyb mladších buněk připomíná písmeno X, pohyb starších buněk bývá popisován jako hadovitý (Lee a kol. 1978; Matoulková 2008; Paradh a kol. 2011). Kvůli podobné morfologii mohou být zaměňovány s rodem Zymomonas (Priest 1981). Při barvení podle Grama vykazují gramvariabilitu, protože mají silnou buněčnou stěnu (Obr. 13), která barvivo přijímá, ale zároveň mají vnější lipidovou membránu typickou pro gramnegativní bakterie (Helander a kol. 2004; Liu a Qureshi 2009).

50

Bakterie v procesu výroby piva

Obr. 13: Pectinatus frisingensis v TEM: OM = vnější membrána, CM = cytoplazmatická membrána, PG = ztluštělá peptidoglykanová vrstva (buněčná stěna), V = váčky, I = invaginace, M = mezozomy (převzato z Helander a kol. 2004).

Rod Pectinatus hraje významnou roli při sekundární kontaminaci piva. Nejčastěji bývá detekován ve stáčecích halách, nejvíce pak na podlaze, na spodní straně monobloku a dopravníku, na potrubí, na kabeláži, v mazacích olejích atd. Dále byl nalezen na stropě stáčecí haly v ležáckých a v přetlačných tancích a v kanalizaci. Je pravděpodobné, že se bakterie při plnění piva uvolní do prostředí, prostřednictvím aerosolu se přenáší vzduchem a způsobují tak nahodilou kontaminaci plněných láhví (Haikara a Helander 2006; Matoulková a kol. 2012b). Nebývají tedy kontaminovány celé šarže (jak je tomu např. v případě, kdy se v ležáckém tanku pomnoží pediokoky). V závislosti na teplotě skladování a druhu piva může proces množení bakterií Pectinatus v pivu probíhat několik dnů, týdnů nebo i měsíců, kdy je pivo již distribuováno až k zákazníkovi (Matoulková a Kubizniaková 2014). Pectinatus je schopen utilizace širokého spektra obvyklých i neobvyklých cukrů, nicméně nezpracovává ani neprodukuje etanol (Matoulková 2008). Produkuje značné množství propionátu, který spolu s dalšími metabolity zcela změní charakter piva (Membré a Tholozan 1994). Dalšími produkty jsou acetát, acetoin, sirovodík, metylmerkaptan, dimetylsulfid atd. Díky sirným metabolitům lze pivo zkažené touto bakterií popsat jako páchnoucí po zkažených vejcích. Pectinatus také vytváří sediment a zákal (Obr. 14) a díky velké produkci plynů láhve mohou dokonce explodovat (Matoulková a Kubizniaková 2014; Paradh a kol. 2011).

51

Bakterie v procesu výroby piva

Obr. 14: Pivo zkažené druhem Megasphaera cerevisiae (vlevo) a Pectinatus frisingensis (vpravo) (převzato z Hill a kol. 2015).

6.3.2. Rod Megasphaera Dalším anaerobním zástupcem je rod Megasphaera. Jsou známy druhy, které se vyskytují v trávicím traktu člověka a ovcí (Engelmann a Weiss 1985). V pivovarství se vyskytují druhy M. cerevisiae, M. paucivorans a M. sueciensis, přičemž prvně zmiňovaný bývá nejvíce zastoupen (Paradh a kol. 2011). Druh M. cerevisiae se vyskytuje méně než rod Pectinatus. Výskyt byl zaznamenán v pivovarech v Německu, Rakousku a Finsku, Velké Británii, v USA a Austrálii a v českých pivovarech (Matoulková a kol. 2012b; Paradh a kol. 2011; Suihko a Haikara 2001). Megasphaera byla izolována z pivovarských kvasnic, ze zkaženého piva, hraje významnou roli při sekundární kontaminaci, podobně jako Pectinatus (Haikara a Helander 2006, Matoulková 2008). Megasphaera je obligátně pivo kazící bakterie a pro pivovary je velmi obávanou kontaminantou (Suzuki 2011). Megasphaera je gramnegativní, kataláza negativní, roste v rozmezí teplot 15-37 °C s optimem kolem 28 °C (Engelmann a Weiss 1985). Metabolity této bakterie zahrnují sirovodík, butyrát a izobutyrát, kapronát, valerát a izovalerát (Hill a kol. 2015). V pivu vytváří zákal a nepříjemně kyselou chuť a zápach po zkažených vejcích (Hill a kol. 2015; Paradh a kol. 2011). Vykazuje menší odolnost k etanolu a k nízkému pH než Pectinatus. Z těchto důvodů se objevuje spíše při kontaminacích nízkoalkoholického a nealkoholického piva (Jespersen a Jakobsen 1996).

52

Bakterie v procesu výroby piva 6.3.3. Rod Zymophilus Rod Zymophilus nyní zahrnuje dva druhy: Z. paucivorans a Z. raffinosivorans. Oba druhy byly izolovány v pivovarském provozu konkrétně pak v kvasnicích a v odpadech. Na rozdíl od ostatních výše zmíněných rodů bývá v provozu zachycován jen výjimečně (Haikara a Helander 2006). Zymophilus se morfologií podobá rodu Pectinatus a lze je tak zaměnit (Priest 1981). Oba druhy vytváří acetát a propionát, Z. paucivorans navíc i laktát. Rosou nad pH 4,3-4,6 a při koncentraci etanolu do 5 %. Charakter kažení má tedy velmi podobný jako Pectinatus (Felsberg a kol. 2015). Oba zástupci jsou gramnegativní pohyblivé tyčky, mohou být rovné, zakřivené i helikální. Vyskytují se jednotlivě, v párech anebo v krátkých řetízcích (Matoulková 2008).

6.3.4. Rod Selenomonas Mezi další rody striktně anerobních bakterií patří rod Selenomonas. Jako ostatní zmíněné rody patří do čeledě Veilonelaceae. Zahrnuje 10 druhů, ovšem pouze jeden druh S. lacticifex nacházíme v pivovarském provozu (Matoulková 2008). Další druhy se vyskytují v dutině ústní člověka a v gastrointestinálním traktu zvířat (Hespell a kol. 2006). Selenomonas lacticifex je gramnegativní striktně anaerobní pohyblivá tyčka, která může být zakřivená. Bičíky má charakteristicky uspořádané v „trsu“ na zakřivené straně (Hespell a kol. 2006). Dokáže fermentovat široké spektrum sacharidů, zahrnující například arabinózu, celobiózu či glukózu. Od ostatních striktně anaerobních druhů se odlišuje produkcí laktátu jako hlavního metabolitu (Hill a kol. 2015). Selenomonády bývají sporadicky izolovány z pivovarských kvasnic a z piva. V práci Vávrové a kol. (2014) byla S. lacticifex izolována ve stáčírně láhví. Selenomonády jsou schopné růstu v uměle zkaženém pivu (Vaughan a kol. 2005). 6.3.5. Metody detekce striktně anaerobních bakterií Mezi nejpoužívanější metody detekce se stále řadí kultivační metody. Patří mezi ně tzv. shelf-life test, kdy se stočené pivo uskladní na několik měsíců při pokojové teplotě a v průběhu času se sleduje tvorba zákalu (Matoulková a Kubizniaková 2014). Pro urychlení kultivace lze do hotového piva přidat koncentrované MRS médium s fruktózou nebo NBB-C médium, tzv. forcing test (Felsberg a kol. 2015).

53

Bakterie v procesu výroby piva Kultivace anaerobních bakterií bývá náročná na vybavení. Při očkování a kultivaci je nutné použít anaerobní boxy, které umožňují úpravu atmosféry (Paradh a kol. 2011). Většinou se používá NBB či MRS médium. Pro selektivní detekci je možné použít SMMP (Jespersen a Jakobsen 1996). Matoulková a kol. (2012a) vyvinuli modifikované MRS médium pro detekci rodu Pectinatus, obsahující izo-α-hořké kyseliny, které inhibují růst grampozitivních bakterií. Na rozdíl od LAB kultivace anaerobů na filtru není úspěšná ani při filtraci za CO2 atmosféry (Matoulková a kol. 2012a). Jsou zavedeny standardizované metody PCR na všechny zmíněné rody anaerobů. Pro zařazení do druhu se převážně amplifikuje mezerníková část (spacer) mezi geny pro 16S a 23S rRNA (Motoyama a Ogata 2000). Výhoda v amplifikaci spaceru tkví v tom, že není tolik konzervativní jako samotný gen pro 16S rRNA, který se využívá pro fylogenetickou analýzu nejvíce. Při amplifikaci 16S rDNA totiž docházelo ke vzájemné reakci mezi rody Pectinatus a Zymophilus kvůli vysoké podobnosti těchto genů. Před nedávnem vyvinuté primery na spacer pro rod Zymophilus vykazují 100% specifitu reakce (Felsberg a kol. 2015). Nejrozšířenější bývá klasická PCR, dále je vhodná real-time PCR, při které se sleduje přírůstek produktu v reálném čase a umožňuje tak rychlou detekci (Haakensen a kol. 2008). Dalším typem je RAPDPCR, PCR-ELISA, rep-PCR a RFLP-PCR. Využívají se imunofluorescenční, FISH, chromatografické i spektrometrické metody (Matoulková a Kubizniaková 2014). Metoda MALDI-TOF MS je pro striktně anaerobní bakterie již standardizovaná, referenční databáze byla obohacena o rody Pectinatus, Megasphaea a Selenomonas. Vykazuje vysokou spolehlivost a umožňuje analýzu biofilmů (Vávrová a kol. 2014). 6.4. Ostatní rody Rod Kocuria je prezentován jediným druhem vyskytujícím se v pivovarském prostředí. Kocuria kristinae, dříve Micrococcus kristinae, je poměrně citlivý k vysoké koncentraci alkoholu a chmelových látek. Roste nad pH 4,5 a na rozdíl od ostatních zástupců mikrokoků a kocurií je tento druh schopen anaerobního růstu (Jespersen a Jakobsen 1996). Další méně častou bakterií je rod Staphylococcus. Tento rod je prezentován druhy S. aureus a S. epidermidis. Jak kocurie, tak i stafylokoky jsou schopny setrvávat ve stočeném pivu, avšak jen zřídkakdy pivo kazí. U rodů Kocuria a Bacillus byly

54

Bakterie v procesu výroby piva zjištěny případy kažení v nízkoalkoholickém a nízce chmeleném pivu (Simpson a kol. 1988). Zásadní znak, který odlišuje stafylokoky a kocurie od ostatních koků je rezistence k lyzostafinu a erytromycinu (Kim a kol. 2014; Priest 1981). K identifikaci lze využít základní biochemické testy. Na rozdíl od pediokoků jsou stafylokoky a kocurie kataláza pozitivní. Stafylokoky lze prokázat a odlišit je od kocurií komerčními biochemickými testy (STAPHYtest 24, API) (Boulton 2013; Sedláček a Kocur 1991). Dalšími bakteriemi, které se mohou do jisté míry uplatnit jako kontaminace piva, jsou sporulující bakterie. Mezi ně řadíme rody Clostridium, Bacillus a Paenibacillus. Můžeme je nalézt v meziproduktech i v hotovém pivu. Díky tvorbě endospor, které bývají velmi odolné, se jich provoz špatně zbavuje. Obecně jsou citlivé k nízkému pH a ke chmelovým kyselinám, tudíž u normálně chmeleného piva nezpůsobují problémy. U méně chmelených piv a piv s vyšším pH (při nedostatečném prokvašení) se mohou pomnožit (Hill a kol. 2015). Rod Bacillus je prezentován druhy B. cereus a B. coagulans, (Hill a kol. 2015; Priest 1981), z rodu Clostridium byl v pivovarském provozu zjištěn jediný druh C. butyricum (Hill a kol. 2015). Bakterie B. cereus byly také nalezeny v surovinách, v mladině a produktech v provozu minipivovarů, (Kim a kol. 2014) i větších provozech (Priest 1981). Endospory dokážou přežít teplotu chmelovaru (Vaughan a kol. 2005). Při přemnožení rodu Bacillus přítomného ve vystírce či mladině (zejména v případě technologických poruch) mohou být produkovány nitrozaminy (Smith a kol. 1992). Naproti tomu rod Clostridium produkuje velké množství butyrátu, který pivu dodává sýrové aroma (Bokulich a Bamforth 2013). Samotné vegetativní buňky rodu Bacillus přežijí ve sladině při teplotách mezi 55-70 °C. Bacillus colaguans přežije ve sladině při teplotách rmutování, může produkovat nitrozaminy redukcí nitrátů (Smith a kol. 1992). V práci Jeon a kol. (2015) bylo prokázáno, že po inokulaci piva druhem B. cereus vegetativní buňky vytvářely endospory a ty poté přežily až 28 dní. V další studii naopak vegetativní buňky zanikly a celý experiment přežily jen endospory (Kim a kol. 2014). Další skupinou gramnegativních bakterií, které se mohou uplatnit při výrobě piva, jsou octové bakterie. Patří do třídy Alphaproteobacteria a v pivovarství bývají prezentovány rody Acetobacter a Gluconobacter (Hill a kol. 2015; Jespersen a Jacobsen 1996). Bakterie rodu Acetobacter jsou tyčkovité, pohyblivé i nepohyblivé a striktně 55

Bakterie v procesu výroby piva aerobní. Oxidují alkohol na kyselinu octovou (Gilliland a Lacey 1966; Priest 1981), která pivu dodává nepříjemnou octovou příchuť (Jespersen a Jakobsen 1996). Jsou spíše spjaty s výčepním zařízením v restauračních zařízeních, nalezeny byly také v prázdných výčepních sudech (Paradh a Hill 2016). V menším množství je lze nalézt ve vzorcích hlavního kvašení a v zásobních tancích (Hill a kol. 2015). Vzhledem k nízkému obsahu kyslíku v pivu se neuplatňují jako pivo kazící bakterie. V současné době spočívá škodlivost octových bakterií zejména v tvorbě biofilmu – jako jedni z prvních kolonizátorů povrchů vytvářejí za přístupu vzduchu první povlak za hojné tvorby extracelulární matrix. Uvnitř povlaku se díky spotřebě kyslíku vytváří anaerobní prostředí, které je ideální pro růst striktně anaerobních a mléčných bakterií (Maifreni a kol. 2015). AAB jsou přirozenou součástí mikroflóry spontánně kvašeného piva Lambic v první polovině fermentace. Jejich přemnožení však není žádoucí, jelikož až příliš okyselují pivo (Bokulich a Bamforth 2013; Keersmaecker 1992). K izolaci AAB neexistuje univerzální kultivační půda. Octové bakterie lze ale jednoduše izolovat kultivací s etanolem jako zdrojem uhlíku spolu s indikátorem (Frateurovo etanolové médium). Úbytek etanolu a okyselení může indikovat jejich přítomnost. Molekulární metody detekce zahrnují real-time PCR, RFLP, AFLP či FISH. (Paradh a Hill 2016; Priest 1981). Zymomonas mobilis je jediný zástupce čeledi Sphingomonadaceae (Němec a Matoulková 2015), který je schopen kontaminovat pivo. Používá se v biotechnologiích pro výrobu etanolu. Díky vysokému zastoupení valerové kyseliny v lipidech cytoplazmatické membrány je tato bakterie extrémně odolná vůči vnikání etanolu (Liu a Qureshi 2009). Lze ji tudíž detekovat při technologii HGB, kdy je vyráběno pivo s vysokým obsahem alkoholu (Briggs a kol. 2004). Zymomonas je gramnegativní, kataláza pozitivní pohyblivá tyčka, vyskytující se samostatně, v párech někdy i v krátkých řetízcích či rozetách. Je anaerobní, toleruje ovšem jisté množství kyslíku v prostředí. Roste nad pH 3,4 a v rozmezí teplot 25-30 °C. Dokáže zpracovat glukózu, fruktózu a některé kmeny i sacharózu. Produkuje množství acetaldehydu a sirovodíku (Jespersen a Jakobsen 1996). Není schopna fermentace maltózy ani maltotriózy - ležáky nekazí, nicméně představuje problém v provozu výroby cideru (Paradh a Hill 2016). Pivo zkažené touto bakterií je zakalené, má ovocné aroma, nebo je cítit po shnilých vejcích či jablkách (Hill a kol. 2015). Pro rod Zymomonas byla vyvinuta restrikční analýza ARDA zaměřený na gen pro 23S ribozomální podjednotku (Paradh a Hill 2016). 56

Závěr 7. Závěr Úkolem této bakalářské práce bylo podat přehled o nejčastějších kontaminantech v pivovarském a sladařském provozu a stručně popsat výrobu piva. Z hlediska možností rozvoje mikrobiální kontaminace lze sladařský a pivovarský proces charakterizovat jako několikastupňový dekontaminační proces

–

škodlivé a potenciálně škodlivé

mikroorganizmy jsou eliminovány v těchto krocích: hvozdění (působení vysokých teplot), rmutování (vysoká teplota), chmelovar (vysoká teplota, hořké chmelové kyseliny), hlavní kvašení (alkohol produkovaný kulturními kvasinkami, pokles pH, spotřebování živin kvasinkami), ležení (nízká teplota), filtrace (mechanické odstranění části kontaminant), pasterace (tepelná inaktivace mikrobů) a v neposlední řadě i skladování hotového piva při nízkých teplotách. Hotové pivo vykazuje vysokou mikrobiologickou stabilitu díky svým vlastnostem (nízké pH, alkohol, chmelové látky, nízké množství O2, vysoké množství CO2, málo živin). Existují však bakterie, které tyto bariéry dokážou překonat a mohou pivo poškodit změnou barvy, tvorbou zákalu, a produkcí zdraví škodlivých a/nebo nežádoucích senzoricky aktivních látek. Mezi nejvýznamnější pivo kazící bakterie řadíme některé mléčné bakterie, enterobakterie (dříve nepřesně nazývané mladinové bakterie), striktně anaerobní bakterie a nepřímo také octové bakterie. Tyto skupiny lze nalézt v různých fázích výroby, v surovinách, v meziproduktech i v hotovém pivu. K mikrobiálnímu kažení jsou více náchylná nedostatečně prokvašená piva, protože obsahují více extraktu a zároveň méně alkoholu. Vyšší pH zároveň rozšiřuje spektrum bakterií, které by se za normálních podmínek nemohly uplatnit. Riziko kontaminace je vysoké u piv nealkoholických a nízkoalkoholických a u piv nepasterovaných nebo ošetřených technikou průtokové pasterace. Současný výzkum se aktivně zabývá mechanizmem odolnosti mléčných bakterií ke chmelovým látkám. Jeho pochopení může přispět k lepší identifikaci i zamezení růstu těchto bakterií. Jsou studovány nové metody ošetřování povrchů. Vzhledem k tomu, že se bakterie stále dynamicky přizpůsobují změnám podmínek prostředí, je jejich eliminace v pivovarských a sladařských provozech nepravděpodobná.

57

Literatura 8. Literatura Asano S., Iijima K., Suzuki K., Motoyama Y., Ogata T., Kitagawa Y. (2009): Rapid detection and identification of beer-spoilage lactic acid bacteria by microcolony method. J. Biosci. Bioeng. 108(2), 124-129. Back W. (2005): Colour atlas and handbook of beverage biology. Carl Fachverlag Hans,Nünberg, ISBN 3-418-00799-1, 215p. Bamforth Ch. W.(edt.) (2006): Brewing: New technologies. Woodhead Publishing Limited, Cambridge, Boca Raton, ISBN 978-0849391590, 500p. Basařová G., Psota V., Šavel J., Basař P., Paulů R., Kosař K., Dostálek P., Basařová P., Kellner V., Mikulíková R., Čejka P. (2015): Sladařství teorie a praxe výroby sladu. Havlíček Brain Team, Praha, ISBN 978-80-87109-47-2, 626p. Basařová G., Šavel J., Basař P., Lejsek T. (2010): Pivovarství: teorie a praxe výroby piva. VŠCHT Praha, Praha, ISBN 978-80-7080-734-7, 904p. Bokulich N. A., Bamforth Ch. W. (2013): The microbiology of malting and brewing. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 77(2) 157-172. Boulton Ch. (2013): Encyclopaedia of brewing. John Willey & Sons, Hoboken, ISBN 978-1-4051-6744-4, 716p. Boulton Ch., Quain D. (2001): Brewing yeast and fermentation. Blackwell Science, Bodmin, ISBN 0-632-05475-1, 24-30. Briggs D. E., Boulton Ch. A., Brookes P. A., Stevens R. (2004): Brewing science and practise. Woodhead Publishing Limited, Cambridge, Boca Raton, ISBN 978-1-85573490-6, 900p. Briggs D. E., McGuinness G. (1992): Microbes on barley grains. J. Inst. Brew. 98, 249255. Buttrick P. (2007): Filtration-the facts. BDI 3, 12-19. Collins M. D., Williams A. M., Wallbanks S. (1990): The phylogeny of Aerococcus and Pediococcus as determined by 16S rRNA sequence analysis: description of Tetragenococcus gen. nov. Microbiol. Lett. 70, 255-262. Engelmann U., Weiss N. (1985): Megasphaera cereviviae sp. nov.: A new gramnegative obligately anaerobic coccus isolated from spoiled beer. System. Appl. Microbiol. 6, 287-290. Felsberg J., Jelínková M., Kubizniaková P., Matoulková D. (2015): Development of a PCR assay based on the 16S-23S rDNA internal transcribed space for identification of strictly anaerobic bacterium Zymophilus. Anaerobe 33, 85-89. 58

Literatura Fricker R. (1984): The flash pasteurisation of beer. J. Inst. Brew. 90, 146-152. Fujii T., Nakashima K., Hayashi N. (2005): Random amplified polymorplic DNA-PCR based cloning of markers to identify the beer-spoilage strains Lactobacillus brevis, Pediococcus damnosus, Lactobacillus collinoides and Lactobacillus coryniformis. J. Appl. Microbiol. 98, 1209-1220. Gilliland R. B., Lacey J. P. (1966): An Acetobarter lethal to yeasts in bottled beer. J. Inst. Brew. 72, 291-303. Haakensen M. C., Butt L., Chaban B., Deneer H., Ziola B. (2007): horA –specific realtime PCR for detection of beer spoilage lactic acid bacteria. J. Am. Soc. Brew. Chem. 65(3), 157-165. Haakensen M., Dobson C. M., Deneer H., Ziola B. (2008): Real time-PCR detection of bacteria belonging to the Firmicutes phylum. J. Food. Microbiol. 125, 236-241. Haikara A., Helander I. (2006) Pectinatus, Megasphaera, Zymophilus. In: Dworkin M., Falkow S., Rosenberg E., Schleifer K.-H., Stackebrandt E. (eds.), Prokaryotes, ISBN 978-0-387-30740-4, 965-981. Hayashi N., Ito M., Horiike S., Taguchi H. (2001): Molecular cloning of a putative divalent-cation transporter gene as a new genetic marker for the identification of Lactobacillus brevis strains capable of growing in beer. Appl. Microbiol. Biotechnol. 55, 596-603. Helander I. M., Haikara A., Sadovskaya I., Vinogradov E., Salkinoja-Salonen M. S. (2004): Lipopolysaccharides of anaerobic beer spoilage bacteria of the genus Pectinatus - lipopolysaccharides of Gram-positive genus. Microbiol. Rev. 28, 543-552. Hespell R. B., Paster B. J., Dewhirst F. E. (2006) The genus Selenomonas In: Dworkin M., Falkow S., Rosenberg E., Schleifer K.-H., Stackebrandt E. (eds.), Prokaryotes, ISBN 978-0-387-30740-4, 982-990. Hewitt Ch. J., Nebe-Von-Caron G. (2001): An industrial application of multiparameter flow cytometry: Assessment of cell physiological state and its application to the study of microbial fermentations. Cytometry 44, 179-187. Higgins Ch. F. (2001): ABC transporters: physiology, structure and mechanism-an overview. Res. Microbiol. 152, 205-210. Hill A, E. (edt.) (2015): Brewing microbiology: Managing microbes, ensuring quality and valorising waste. Woodhead Publishing is an imprint of Elsevier Cambridge, Waltham, Kidlington, ISBN 978-1-78242-349-2, 506p. Hollerová I., Kubizniaková P. (2001): Monitoring gram-positive contamination in Czech breweries. J. Inst. Brew. 107(6), 355-358.

59

bacterial

Literatura Iijima K., Suzuki K., Asano S., Kuryiama H., Kitagawa Y. (2007): Isolation and identification of potential beer-spoilage Pediococcus inopinatus and beer-spoilage Lactobacillus backi strains carrying the horA and horC gene clusters. J. Inst. Brew. 113(1), 96-101. Iijima K., Suzuki K., Ozaki K., Yamashita H. (2006): horC confers beer-spoilage ability on hop-sensitive Lactobacillus brevis ABBCC45CC. J. Appl. Microbiol. 100, 12821288. Inoue T., Nagatomi Y., Uyama A., Mochizuki N. (2013): Fate of mycotoxins during beer brewing and fermentation. Biosci. Biotechnol. Biochem. 77(7), 1410-1415. Janoušek J., Basařová G. (2002): Význam pojmu "pasterační jednotka" v moderním pivovarství. Kvasny Prum 48(4), 82-87. Jeon S. H., Kim N. H., Shim M. B., Jeon Y. W., Ahn J. H., Lee S. H., Hwang I. G., Rhee M. S. (2015): Microbiological diversity and prevalence of spoilage and pathogenic bacteria in commercial fermented alcoholic beverages (beer, fruit wine, refined rice wine, and Yakju). J. Food Prot. 78(4), 812-818. Jespersen J., Jakobsen M. (1996): Specific spoilage organisms in breweries and laboratory media for their detection. Int. J. Food Microbiol. 33, 139-155. Justé A., Malfliet S., Lenaerts M., de Cooman L., Aerts G., Willems K. A., Lievens B. (2011): Microflora during malting of barley: Overview and impact on malt quality. BrewingScience 64, 22-31. Keersmaecker De J. (1992): The mystery of lambic. Sci. Am. 8, 74-80. Kim S. A., Kim N. H., Lee S. H., Hwang I. G., Rhee M. S. (2014): Surviving of foodborne pathogenic bacteria (Bacillus cereus, Escherichia coli O157:H7, Salmonella enteritica ser typhimurium, Staphylococcus aureus and Listeria monocytogenes) and Bacillus cereus spores in fermented alcoholic beverages (beer and refined rice wine). J. Food Prot. 77, 419-426. Kopecká J. (2015): Polyfázová taxonomie technologicky významných kvasinek. Dizertační práce, Masarykova univerzita, Brno, 12-13. Kosař K., Procházka S. (eds.) (2000): Technologie výroby sladu a piva. Výzkumný ústav pivovarský a sladařský, Praha, ISBN 80-902658-6-3, 398p. Kuiper S., van Rijn C., Nijdam W., Raspe O., van Wolferen H., Krijnen G., Elwenspoek M. (2001): Filtration of lager beer with microstieves: flux, permeate haze and in-line microscopeobservations. J. Membr. Sci. 196(2), 159-170. Laitila A., Alakomi H.-L., Raaska L., Mattila-Sandholm T., Haikara A. (2002): Antifungal activities of two Lactobacillus plantarum strains against Fusarium moulds in vitro and in malting of barley. J. Appl. Microbiol. 93, 566-576. 60

Literatura Lee S. Y., Mabee M. S., Jangaard N. O. (1978): Pectinatus, a new genus of the family Bacteroidaceae Int. J. Syst. Bacteriol. 28(4), 582-594. Liu S., Qureshi N. (2009): How microbes tolerate ethanol and butanol. New. Biotechnol. 26, 117-121. Lowe D. P., Arendt E. K., Soriano A. M., Ulmer H. M. (2005): The influence of lactic acid bacteria on the quality of malt. J. Inst. Brew. 111(1), 42-50. Maifreni M., Frigo F., Bartolomeoli I., Buiatti S., Picon S., Marino M. (2015): Bacterial biofilm as a possible source of contamination in the microbrewery environment. Food Control 50, 809-814. Malfeito-Ferreira M., Loureiro V. (2009): Spoilage yeast and other fungi: their roles in modern enology. In: Rai M., Bridge P. D. (eds.), Applied mycology, CABI, Wallingford, ISBN 978-1-84593-534-4, 156-172. March C., Manclús J. J., Abad A., Navarro A., Montoya A. (2005): Rapid detection and counting of viable beer-spoilage lactic acid bacteria using a monoclonal chemiluminescence enzyme immunoassay and a CCD camera. J. Immunol. Methods 303, 92-104. Matoulková D. (2008): Striktně anerobní bakterie v pivu a pivovarském provozu. Kvasny Prum. 54, 338-343. Matoulková D., Kosař K., Sigler K. (2012a): Rapid, simple and specific cultivation – based method for detection of Pectinatus spp. in brewery samples. J. Am. Soc. Brew. Chem. 70(1), 29-34. Matoulková D., Kosař K., Slabý M., Sigler K. (2012b): Occurrence and species distribution of strictly anaerobic bacterium Pectinatus in brewery bottling halls. J. Am. Soc. Brew. Chem. 70(4), 1-4. Matoulková D., Kubizniaková P. (2014): Mikrobiologie kvasné výroby - Striktně anaerobní bakterie Megasphaera, Pectinatus, Selenomonas a Zymophilus a metody jejich detekce. Kvasny Prum. 60, 285-294. Matoulková D., Kubizniaková P. (2015): Mikrobiologie kvasné výroby - Bakterie mléčného kvašení a kultivační metody pro jejich detekci - I. část. Kvasny Prum. 3, 7688. Matoulková D., Kubizniaková P., Sigler K. (2012c): Schopnost mléčných bakterií kazit pivo a souvislost s přítomností genů horA, horC a hitA. Kvasny Prum. 58, 336-342. Membré J. M., Tholozan J. L. (1994): Modeling growth and off-flavours production of spoiled beer bacteria, Pectinatus frisingensis. J. Appl. Microbiol. 77(4), 456-460.

61

Literatura Menz G., Vriesekoop F., Zarei M., Zhu B., Aldred P. (2010): The growth and survival of food-borne pathogens in sweet and fermenting brewers’ wort. Int. J. Food. Microbiol. 140, 19-25. Motoyama Y., Ogata T. (2000): 16S–23S rDNA spacer of Pectinatus, Selenomonas and Zymophilus reveal new phylogenetic relationships between these genera. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 50, 883-886. Němec M., Matoulková D. (2015): Základy obecné mikrobiologie. Masarykova univerzita, Brno, ISBN 978-80-210-7923-6, 256p. Noots I., Delcour J. A., Michiels Ch. W. (1998): From field barley to malt: Detection and specification of microbial activity for quality aspects. Crit. Rev. Microbiol. 25(2), 121-153. O’Sullivan T. F., Walsh Y., O’Mahony A., Fitzgerald G. F., van Sinderen D. (1999): A comparative study of malthouse and brewhouse microflora. J. Inst. Brew. 105, 55-61. Paradh A. D., Mitchell W. J., Hill A. E. (2011): Occurrence of Pectinatus and Megasphaera in the major UK breweries. J. Inst. Brew. 117(4), 498-506. Paradh A., Hill A. E. (2016): Review: Gram negative bacteria in brewing. Adv. Microbiol. 6, 195-209. Preedy V. R. (edt.) (2009): Beer in health and disease prevention. Academic Press is an imprint of Elsevier, Burlington, San Diego, London, ISBN 978-0-12-373891-2, 1248p. Prescott L. M., Harley J. P., Klein D. A. (2002): Prescott’s microbiology. McGraw-Hill Education, Boston, ISBN 0-07-282905-2, 971-995. Priest F. G. (1981): The classification and nomenclature of brewing bacteria: a review. J. Inst. Brew. 87, 279-281. Priest F. G., Campbell I. (2003): Brewing microbiology. Springer Science & Business Media New York, ISBN 0-306-47288-0, 399p. Priest F. G., Cowbourne M. A., Hough J. S. (1974): Wort enterobacteria-review. J. Inst. Brew. 80, 342-356. Priest F. G., Stewart G. G. (2006): Handbook of brewing. Taylor & Francis Group, Boca Raton, ISBN 978-0-8247-2657-7, 872p. Priha O., Raulio M., Cooke K., Fisher L., Hill C., Hylkinen S., Kelly P., Navabpour P., Ostovarpour S., Tapani K., Tattershall C., Vehviläinen A.-K., Verran J., Storgårds (2015): Microbial populations on brewery filling hall surfaces - Progress towards functional coatings. Food Control 55, 1-11.

62

Literatura Sakamoto K., Konings W. N. (2003): Beer spoilage bacteria and hop resistance. Int. J. Food. Microbiol. 89, 105-124. Sami M., Suzuki K., Sakamoto K., Kadokura H., Kitamoto K., Yoda K. (1998): A plasmid pHR45 of Lactobacillus brevis confers hop resistance. J. Gen. Appl. Microbiol. 44(5), 392-363. Sami M., Yamashita H., Hirono T., Kadokura H., Kitamoto K., Yoda K., Yamasaki M. (1997b): Hop-resistant Lactobacillus brevis contains a novel plasmid harboring a multidrug resistance-like gene. J. Ferment. Bioeng., 84, 1–6. Sami M., Yamashita H., Kadokura H., Kitamoto K., Yoda K., Yamasaki M. (1997a): A new rapid method for determination of beer-spoilage ability of Lactobacilli. J. Am. Soc. Brew. Chem. 55(4), 137-140. Šavel J. (1980): Mikrobiologická kontrola v pivovarech. SNTL, Praha, 180p. Sedláček I., Kocur M. (1991): Identification of Staphylococcus and Micrococcus species with the STAPHYtest system. Folio Microbiol. 36(4), 401-405. Shabani L., Devolli A. (2010): Microbial spoilage in beer processing by biofilms. Natura Montenegrina 9(3), 655-662. Simpson W. J., Hammond J. R. M., Miller R. B. (1988): Avoparcin and vancomycin: useful antibiotics for the isolation of brewery lactic acid bacteria. J. Appl. Bacteriol. 64, 299-309. Smith N. H., Smith P., Woodruff C. A. (1992): The role of Bacillus spp. in nnitrosamine formation during wort production. J. Inst. Brew. 98, 409-414. Suihko M.-L., Haikara A. (2001): Characterisation of Pectinatus and Megasphaera strains by automated ribotyping. J. Inst. Brew. 107(3), 175-184. Suzuki K, Asano S., Iijima K., Kuriyama H., Kitagawa Y. (2008a): Development of detection medium for hard-to-culture beer-spoilage lactic acid bacteria. J. Appl. Microbiol. 104, 1458-1470. Suzuki K. (2011): 125th anniversary review: Microbiological instability of beer caused by spoilage bacteria. J. Inst. Brew. 117(2), 131–155. Suzuki K., Asano S., Iijima K., Kitamoto K. (2008b): Sake and beer spoilage lactic acid bacteria–a review. J. Inst. Brew. 114(3), 209–223. Suzuki K., Iijima K., Sakamoto K., Sami M., Yamashita H. (2006a): A review of hop resistance in beer spoilage lactic acid bacteria. J. Inst. Brew. 112(2), 173-191. Suzuki K., Sami M., Iijima K., Ozaki K., Yamashita H. (2006b): Characterisation of horA and its flanking regions of Pediococcus damnosus ABBC478 and development of more specific and sensitive horA PCR method. Lett. Appl. Microbiol. 42, 392-399. 63

Literatura Suzuki K., Sami M., Kadokura H., Nakajima H., Kitamoto K. (2002): Biochemical characterization of horA-independent hop resistance mechanism in Lactobacillus brevis. Int. J. Food Microbiol. 76(3), 223-230. Taskila S., Neubauer P., Tuomola M., Breitenstein A., Kronlöf J., Hillukkala T. (2009): Improved enrichment cultivation of beer spoiling lactic acid bacteria by continuous glucose addition to the culture. J. Inst. Brew. 115(3), 177-182. Tsarouhas P. H., Arvanitoyannis I. S. (2009): Assessment of operation management for beer packaging line based on field failure data: A case study. Int. J. Food Eng. 98, 5159. Tvrzová L., Chumchalová J., Němec M., Páčová Z., Savická D., Kubátová A., Patáková P. (2006): Miniatlas mikroorganismů. Masarykova univerzita, Brno [online] http://is.muni.cz/do/rect/el/estud/prif/ps06/mikroorg/web/index.html. Vaughan A., O’Sullivan T., van Sinderen D. (2005): Enhancing the microbiological stability of malt and beer – A review. J. Inst. Brew. 111(4), 355-371. Vávrová A., Matoulková D., Balážová T., Šedo O. (2014): MALDI-TOF MS analysis of anaerobic bacteria isolated from biofilm-covered surfaces in brewery bottling halls. J. Am. Soc. Brew. Chem. 72(2), 95-101. Vriesekoop F., Krahl M., Hucker B., Menz G. (2012): 125 th anniversary review: Bacteria in brewing: The good, the bad and the ugly. J. Inst. Brew. 118, 335-345. Vuuren van H. J. J., Kersters K., De Ley J., Toerien D. F. , Meisel R. (1978): Enterobacter agglomerans - a new bacterial contaminant isolated from lager beer breweries. J. Inst. Brew. 84, 315-317.

64

Přílohy 9. Přílohy Fotografická dokumentace zahrnuje u mléčných bakterií Gramovo barvení (při zvětšení 1000x s imerzí), tvar kolonií a celkový pohled na růst na Petriho misce. Byl pozorován různorodý tvar tyček rodu Lactobacillus, jejich charakteristické uspořádání i odlišný vzhled kolonií (zvětšení okolo 2x). Rod Pediococcus měl kolonie drobné a tvar buněk je výhradně kokovitý. Preparáty byly pozorovány mikroskopem Olympus BX50 systémem analýzy obrazu od firmy Laboratory Imaging, programem NIS Elements. Přípravu médií, kultivaci a dokumentaci jsem prováděla osobně. Bakterie byly kultivovány na MRS agaru (firma Merck) v anaerostatu s použitím vyvíječe anaerobní atmosféry Anaerocult® A (firma Merck). Kultivace rodu Lactobacillus probíhala 2 dny, u rodu Pediococcus 7 dní při teplotě 28 °C. U striktně anaerobních rodů byly kultury dodány v tekutém médiu a kultivace nebyla provedena. Bylo provedeno Gramovo barvení (při zvětšení 1000x s imerzí) a byl zhotoven nativní preparát. Fotografie nativního preparátu nejsou kvalitní kvůli aktivnímu pohybu buněk. Pohyb obou kmenů rodů Pectinatus byl charakteristicky ve tvaru X, tyčky byly lehce zakřivené. Megasphaera se vyznačovala kokovitým tvarem. Fotografická dokumentace byla vypracována na Oddělení mikrobiologie Přírodovědecké fakulty Masarykovy univerzity. Kmeny bakterií pochází ze sbírky pivovarských kvasinek a mikroorganizmů VÚPS, a.s. (RIBM) v Praze, která obsahuje produkční kmeny pivovarských kvasinek, divoké kvasinky a bakterie izolované jako kontaminanty pivovarských provozů. A

B

Obr. 15: Kultivace v anaerostatu aktivovaným vyvíječem anaerobní atmosféry (A) a anaerobní vyvíječ Anaerocult® A (B) (©K. Křesalová).

65

Lactobacillus backii DSM 18080

66 Lactobacillus brevis RIBM 2-16

Lactobacillus brevis RIBM 2-56 R

67 Lactobacillus brevis RIBM 2-68

Lactobacillus brevis RIBM 2-111

68 Lactobacillus buchneri RIBM 2-9

Lactobacillus casei/paracasei RIBM 2-26

69 Lactobacillus casei/paracasei RIBM 2-46

Lactobacillus casei/paracasei RIBM 2-113

70 Lactobacillus fermentum CCM 7192

Lactobacillus plantarum RIBM 2-29

71 Lactobacillus plantarum RIBM 2-90

Pediococcus damnosus CCM 3453

72 Pediococcus inopinatus CCM 3451

Pediococcus pentosaceus CCM 3447

73 Megasphaera cerevisiae DSM 20461

Pectinatus frisingensis DSM 20465

74 Pectinatus frisingensis RIBM R1