MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA Ústav experimentální biologie
Bakalářská práce
BRNO 2013
Kateřina Sejpková
1
MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA Ústav experimentální biologie
Vliv hyaluronanu na nádorové buňky Bakalářská práce
Kateřina Sejpková
Vedoucí práce: RNDr. Lenka Švihálková Šindlerová, Ph.D.
BRNO 2013
2
Bibliografický záznam Autor: Kateřina Sejpková Název práce: Vliv hyaluronanu na nádorové buňky Studijní program: Experimentální biologie Studijní obor: Experimentální biologie živočichů a imunologie Vedoucí práce: RNDr. Lenka Švihálková Šindlerová, Ph.D. Akademický rok: 2013 Počet stran: 43 Klíčová slova: kyselina hyaluronová, hyaluronan, CD44, RHAMM, rakovina
Bibliographic Entry Author: Kateřina Sejpková Title of Thesis: Effect of hyaluronan on tumour cells Degree Programme: Experimental Biology Field of Study: Experimental biology of animals and imunology Supervisor: RNDr. Lenka Švihálková Šindlerová, Ph.D. Academic Year: 2013 Number of Pages: 43 Keywords: hyaluronan, hyaluronic acid, CD44, RHAMM, cancer
3
Abstrakt V následující práci jsem shrnula současné poznatky o vlastnostech hyaluronanu a jeho působení v nádorovém bujení. Zjištěné poznatky dokazují, že jeho role v průběhu onkogeneze je naprosto klíčová. Jeho interakce stimulují buněčnou proliferaci a migraci, angiogenezi, maligní transformaci i chemorezistenci. Naopak inhibuje buněčnou apoptózu a imunitní protirakovinné působení. Zkoumaná problematika nabízí možnosti využití pro nové léky proti rakovině. Získané výsledky na tomto poli jsou slibné, ale mechanismy působení některých látek potřebují další výzkum, stejně jako některé mechanismy působení hyaluronanu v nádorech.
Abstract In this bachelor thesis I summarized current information about hyaluronan properties and his influence in tumours. Discovered knowledge proved, that his role during oncogenesis is absolutely crucial. His interaction stimulates cell proliferation and migration, angiogenesis, malignant
transformation
and
chemoresistence.
In
spite
of
inhibits
apoptosis
and immunology anti-oncogene influence. Studied problems offer options for using in pharmacology. Gained results in this field are hopeful, but mechanisms influencing of some drugs needs next research, just as some mechanisms influencing of hylauronan in tumours.
4
5
Chtěla bych poděkovat doc. RNDr. Antonínovi Lojkovi, CSc. za vytvoření kvalitních podmínek pro sepsání bakalářské práce. Můj velký dík patří mé školitelce RNDr. Lence Švihálkové Šindlerové, Ph.D. a mému odbornému konzultantovi Mgr. Lukášovi Kubalovi, Ph.D. za předání zkušeností, cenné rady, a za odborné vedení při vypracování bakalářské práce. Děkuji také Mgr. Barboře Šafránkové za předání praktických zkušeností z laboratoře. Stejně tak děkuji i celému školitelskému kolektivu.
Prohlašuji,
že
jsem
bakalářskou
práci
vypracovala
samostatně
s využitím
informačních zdrojů, které jsou v práci citovány. V Brně dne
Podpis
6
Obsah 1
Chemické a fyzikální vlastnosti hyaluronanu .................................................................... 8
2
Působení HA ve zdravém organismu ............................................................................... 9 2.1
2.1.1
Intracelulární HA ................................................................................................ 9
2.1.2
Extracelulární a pericelulární HA ........................................................................ 9
2.2
Anabolismus HA............................................................................................... 12
2.2.2
Katabolismus HA.............................................................................................. 13
Signalizace HA ........................................................................................................ 15
2.3.1
Prostřednictvím CD44 ...................................................................................... 15
2.3.2
Prostřednictvím RHAMM .................................................................................. 17
2.3.3
Signalizace HA souvisí s velikostí polymeru .................................................... 19
Působení HA v rakovinném bujení ................................................................................. 19 3.1
4
Metabolismus HA u eukaryot .................................................................................. 12
2.2.1
2.3
3
Funkce HA................................................................................................................. 9
Solidní nádory ......................................................................................................... 20
3.1.1
Proliferace nádoru ............................................................................................ 20
3.1.2
Angiogeneze .................................................................................................... 23
3.1.3
Migrace nádoru ................................................................................................ 23
3.1.4
Epiteliálně-mezenchymová nádorová transformace ........................................ 26
3.1.5
HA ovlivňuje imunitní působení v nádoru ......................................................... 27
3.2
Leukémie ................................................................................................................. 28
3.3
Nové možnosti léčby ............................................................................................... 29
Závěr .............................................................................................................................. 32
7
1 Chemické a fyzikální vlastnosti hyaluronanu Hyaluronan byl poprvé popsán roku 1934 Karlem Mayerem, který tuto látku objevil ve sklivci z hovězích očí a nazval ji kyselina hyaluronová (hyaluronic acid, HA). Jelikož se však fyziologicky nachází většinou ve formě aniontu, je dnes častěji užíván název hyaluronan. Neutrální pH většiny tělních tkání tedy způsobuje záporné nabití molekuly a ta tak získává vlastnosti silného elektrolytu. HA je součástí obalů mikroorganismů (1), ale i tkání jako je chrupavka či epidermis v tělech obratlovců. V 70. letech minulého století byl identifikován i v cytoplazmě a jádrech buněk. Technikami jako je buněčná frakcionace, izotopové značení či autoradiografie byl prokázán jeho výskyt v mnoha tělních strukturách: v jádrech mozkových neuronů, v jaterních buňkách, v jádrech i cytoplazmě kožních fibroblastů. Pomocí elektronové mikroskopie byl poté mapován výskyt HA značeného částečkami zlata a s pomocí značení specifickými fluorescenčními sondami mohl být detekován i fluorescenčním mikroskopem. Výskyt HA byl díky tomu prokázán i v jádrech a cytoplazmě buněk pankreatu, v buňkách Graafova folikulu, v granulárních buňkách mozečku, v buňkách vaskulárního epitelu a hladké svaloviny a v jaderném heterochromatinu (4). Po chemické stránce je hyaluronan lineární polymer tvořený jednotkami disacharidů (1β-3)-D-glukuronová kyselina a (1-β-4)-N-acetyl-D-glukosamin. Jeho struktura umožňuje připojení objemných karboxylových či hydroxylových skupin do ekvatoriálních pozic, malé atomy vodíku jsou naopak směrovány do pozic axiálních. Celá struktura je tak stericky velmi stabilní a může být složená až z 10 000 jednotek (4000 kDA), čímž dosáhne délky průměru erytrocytu (2). In vivo je struktura HA stabilizována vnitřními vodíkovými vazbami a interakcemi s rozpouštědlem. Ekvatoriální vazby molekuly jsou hydrofilní, naopak vazby axiální mají nepolární charakter a tvoří tak hydrofobní součást molekuly. Molekula HA je tedy amfipatická, a proto zaujímá ve fyziologickém roztoku strukturu šroubovice, jejíž jeden oblouk má poloměr 200 nm (40). V extracelulárním prostředí vytváří tyto molekuly síť s různě velkými póry, která je stavebním prvkem tělních tkání, izoluje některé molekuly a udržuje viskozitu tělních tekutin (2). Je také významnou signální molekulou, která ovlivňuje buněčný cyklus, mobilitu, diferenciaci i maturaci. V jednotlivých částech organismu se liší svou koncentrací a metabolickou dynamikou a může hrát i podstatně odlišné role, což se odvíjí od jeho vazebných interakcí, které souvisí s velikostí jeho molekul. Za fyziologických podmínek se v těle nachází především vysokomolekulární HA (high molecular weight HMW HA - 4x102 – 2x104 kDa tedy asi 2x103 105 sacharidů), který váže značné množství vody, působí protizánětlivě a inhibuje procesy
8
angiogeneze. Naproti tomu nízkomolekulární HA (low molecular weight, LMW HA oligomery do desítek kDa) se v těle objevuje v důsledku fyziologické degradace HMW HA, probíhající však ve zvýšené míře při poškození tkání a jiných patologických procesech. LMW HA působí prozánětlivě a stimuluje angiogenezi (1).
2 Působení HA ve zdravém organismu 2.1 Funkce HA Extracelulární HMW HA je extrémně hygroskopický (dokáže navázat až tisícinásobek své vlastní hmotnosti) a je nezbytným stavebním prvkem chrupavky, epidermis a dalších tkání, v nichž je nutné udržet vysokou elasticitu a pevnost, jako je například sklivec, či pupečník. HMW HA i LMW HA mají významné signalizační funkce, které budou blíže popsány později. Intracelulární HA má především funkci signalizační a možná i izolační.
2.1.1 Intracelulární HA Intracelulární HA může být lokalizován v cytoplazmě nebo v jádru buňky a také může být vázaný na cytoplazmatickou membránu. V jádře bývá lokalizován hlavně na periferii nebo v jadérku. Jeho přítomnost v jádře a potenciálně v drsném endoplazmatickém retikulu může mít význam v procesu sestřihu mRNA pomocí splicing factor 2 (SF2) (4). Tento faktor je aktivován casein kinázou II, která může být fosforylována proteinem P32 (intracelulárním hyaladherinem) (31). Funkce HA v cytoplazmě buněk jsou především signalizační. HA se zde váže buď na cytoskelet, nebo různé receptory. Moduluje buněčné dělení a růst, což bylo pozorováno na buněčné fibroblastové linii 3T3, syntetizující intracelulární HA až po stimulaci sérem. Tyto buňky mají HA akumulovaný nejprve kolem jádra a v cytoplasmě, během metafáze pak HA zaplňuje buňku a obklopuje chromosomy v metafázní destičce. Významný je i v telofázi. Syntézu HA zde řídí hyaluronan syntáza 2 (Has2) (4).
2.1.2 Extracelulární a pericelulární HA Extracelulární HA je významným stavebním komponentem kůže, chrupavky, sklivce, pupečníku a srdečních chlopní (38). Pericelulární HA ovlivňuje pohyb membránových raftů, adhezivní interakce buněk a může mít vliv i na pohyb samotné buňky. V pericelulárním prostoru HA může interagovat s fosfolipidy, s různými proteoglykany, versicanem a některými proteiny, například s proteinem genu 6 indukovatelného tumor nekrotizujícím faktorem (TNF) (tumor necrosis factor-inducible gene 6, TSG6). Prostřednictvím vazby na 9
buněčné receptory CD44 a RHAMM (receptor, jehož prostřednictvím hyaluronan moduluje motilitu buněk Hyaluronan-mediated motility receptor) reguluje také buněčnou signalizaci. Buňky hladké svaloviny, keratinocyty, fibroblasty a další buňky syntetizují při mitóze jak intracelulární, tak extracelulární HA. Po stimulaci lidských fibroblastů bovinním sérem nebo růstovým faktorem PDGF (Platelet-derived growth factor) mají tyto buňky vyšší produkci HA (4). U kvasinek bylo prokázáno, že může přímo ovlivňovat buněčný cyklus prostřednictvím interakce s hyaladherinem Cdc37. Stejný protein byl nalezen i u obratlovců, jeho funkce u této skupiny však prozatím nebyla prokázána. Nejdůležitější proto zůstává jeho interakce s CD44, který reguluje příjem a degradaci HA a spouští buněčnou signalizaci podporující přežívání buněk přes signální dráhu PI3/Akt (phosphatidylinositol3/Akt pathway) (32).
2.1.2.1 HA v kůži V epitelech je HA lokalizováno poměrně málo, jelikož váže mnoho vody a narušuje tak soudržnost epitelů. Jeho koncentrace mezi epidermis a dermis se pohybuje okolo 2,5 mg/ml extracelulárního roztoku (33). Tato hodnota koreluje s proliferací okolních buněk, proto se nejvíce HA nachází v basální a suprabasální vrstvě epidermis (35). Na buňkách stratifikované kůže se exprimuje receptor CD44, který váže HA. Metabolismus HA v kůži je velmi dynamický, jeho poločas rozpadu u lidských kožních buněk in vitro je 1 den. HA v kůži ovlivňuje diferenciaci, migraci a proliferaci keratinocytů, pročež je jeho metabolismus přísně kontrolován pomocí různých hormonů, cytokinů i růstových faktorů (6). Například působením kyseliny retinové dochází ke stimulaci produkce HA a její obsah v epidermální vrstvě lidské kůže se zdvojnásobí. Následkem toho dochází ke snižování množství desmozomů, to zabraňuje vytváření těsných spojů (tight junction), což se projevuje ve zpomalení dozrávání keratinocytů (37). Kortizol, který je v lékařství používán jako antiproliferativní a protizánětlivý lék na choroby kůže, inhibuje katabolismus i syntézu HA (34). Růst vlasů i chlupů je spojený s úbytkem CD44 i HA. Interakce HA a CD44 inhibuje apoptózu keratinocytů (34). HA je schopný neutralizovat volné kyslíkové radikály (reactive oxygen species, ROS) a tím chrání kůži před působením UV záření. Dynamický obrat HA napomáhá obnově buněk epidermis (6).
2.1.2.2 HA v chrupavce Chrupavčitá tkáň je pouze z 5 % tvořena buňkami, zbytek tvoří kolagen a proteoglykany, které vytvářejí velmi pevnou, ale též pružnou pojivovou extracelulární hmotu. Díky tomu chrupavka s minimálním poškozením odolává tlakům a tření při pohybu 10
kloubů. HA se zde uplatňuje jako stavební glykosaminoglykan a spojuje molekuly aggrecanu složené z chondroitinsulfátu a keratansulfátu (12).
Obr.č.1. Snímek z elektronového mikroskopu zobrazuje agregát tvořený hyaluronanem a spojovacími proteiny. (http://glycoforum.gr.jp/science/hyaluronan/HA05/HA05E.html)
Proteoglykany
chrupavky
jsou
tvořeny
intracelulárně
a
poté
sekretovány,
v extracelulárním prostoru pak dochází k jejich agregaci s HA syntetizovanými na cytoplazmatické membráně. HA je ve velkém množství exprimován hlavně synoviální buňkami v chrupavkách kloubů (2). Ve zdravém lidském kloubu se HMW HA nachází v koncentraci 2-4 mg/ml. Toto množství HA v chrupavce stoupá s věkem, v mládí tvoří pouze 1 % hmotnosti, kdežto ve stáří až 10 % (12). Fyziologický poločas rozpadu HA v chrupavce je 2-3 týdny. U pacientů se zánětem kloubu, například při osteoartritidě, se HMW HA v kloubu rozkládá na LMW HA (8).
2.1.2.3 Funkce HA při ovulaci Hlavní složkou matrix Graafova folikulu je HA, jeho koncentrace je zde 0,5-1 mg/ml. Díky němu je ve folikulu vázáno značné množství vody, která nakonec způsobí jeho rupturu, po níž následuje ovulace oocytu do vejcovodu. Folikulostimulační hormon (FSH) indukuje zvýšenou produkci HA ve folikulu s pomocí sekundárního posla cAMP. Produkci HA zde stimuluje ještě epidermální růstový faktor (EGF), který se váže na tyrosin kinázový receptor, a potřebné je také působení rozpustného oocytárního faktoru. Interakce těchto hormonů 11
a jejich receptorů umožňuje optimální expanzi folikulu. Pro správnou organizaci vznikajícího HA jsou potřebné také cytokiny inter-alfa-trypsin inhibitor (ITI) a (TNF). HA je tedy nezbytný pro fyziologickou ovulaci oocytu a při oplození pak tvoří přirozenou selektivní bariéru pro spermie, kterou spermie proráží pomocí enzymu hyaluronidázy (Hyal) v akrozomu spermie (3).
2.2 Metabolismus HA u eukaryot Metabolismus HA je poměrně rychlý, ale liší se v příslušných tělních tkáních. Jak už bylo řečeno, fyziologický poločas rozpadu například v chrupavce je 2-3 týdny, ale v epidermis je to méně než den a v krvi dokonce pouhých několik minut. Za den se tak vymění asi jedna třetina celkového množství HA v lidském těle (2). Nejvíce HA se fyziologicky vytváří ve tkáních, které ho využívají jako svou stavební součást, většinou působením enzymu Has2 (někteří autoři udávají, že aktivnější je Has3 (7, 41). Degradace HA probíhá především v lymfatických uzlinách, ledvinách, játrech a slezině kam je vyplavován cévním a mízním systémem, ale i v tkáních, kde je stavebním prvkem extracelulární matrix. Největší množství HA je degradováno v lymfatických uzlinách, což je regulováno buněčnými receptory Lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor 1 (LYVE1) (42). V játrech je HA degradován v Kupfferových buňkách, které exprimují značné množství receptorů HARE (HA receptor pro endocytózu) pro jeho příjem (14). Minoritní množství HA je degradováno v epiteliálních buňkách ledvinových kanálků a ve slezině (38).
2.2.1 Anabolismus HA Syntéza HA je pro buňku velmi energeticky náročná (16). Ve zdravém organismu se HA vytváří působením enzymů hyaluronan syntáz (Has1, 2, 3) na vnitřní straně cytoplazmatické
membrány,
postupně
vznikající
molekula
HA
je
vytlačována
do
extracelulárního prostoru pomocí multidrug resistant efflux system a kolem buňky tak vzniká polysacharidový plášť – pericelulární obal (41). Ten může vzniknout i pomocí vysoce afinitních HA receptorů. (7). Enzymy Has se navzájem liší především profilem exprese během embryonálního vývoje (15). Substrátem pro tvorbu HA jsou aktivované formy sacharidů: UDP - glukuronová kyselina a UDP-N-acetylglukosamin (2). Hyaluronan syntázy Has1 - v dospělosti je málo aktivní, syntetizuje velké polymery HMW HA (43) Has2 - je aktivnější než Has1, syntetizuje HMW HA (43) Has3 - podle některých autorů je nejaktivnější, syntetizuje LMW HA (43)
12
Geny HAS2 a 3 jsou velmi konzervativní, to podporuje domněnku, že HA vznikl u pokročilejších živočichů s notochordem. U lidí je gen HAS1 lokalizován na krátkém raménku devatenáctého chromosomu v oblasti 13.3-13.4 (19q13.3-13.4), gen HAS2 se nachází na krátkém raménku osmého chromosomu v oblasti 24.12 (8q24.12), gen HAS3 je lokalizován na krátkém raménku šestnáctého chromozomu v oblasti 22.1 (16q22.1) (7). Jak už bylo zmíněno výše, syntézu HA ovlivňují růstové faktory například transformující růstový faktor (TGFβ), insulinu podobný růstový faktor-1 (IGF-1), základní fibroblastový růstový faktor (bFGF) a od destiček odvozený růstový faktor (PDGF). Jejich vliv se ale liší v souvislosti s typem tkáně a její diferenciací. Například TGFβ stimuluje produkci HA u fibroblastů, ale inhibuje ji u keratinocytů (36). Také některé hormony (např.: FSH) regulují produkci HA (22). Látky aktivující proteinkinázu C, jako jsou např. phorbolestery, a faktory aktivující kinázy asociované s cAMP mohou zvyšovat biosyntézu HA (7). Nadměrná exprese všech Has může podporovat migraci a proliferaci buněk rakovinného bujení.
2.2.2 Katabolismus HA Metabolický obrat HA závisí na dvou faktorech 1) na jeho degradaci v tkáni odkud pochází 2) na jeho odplavení z tkáně krví či lymfou. V procesu degradace HA v jeho původních tkáních hraje důležitou roli vazba HA na CD44. To bylo prokázáno ve studiích na transgenních myších, které neexprimovaly CD44 v epidermis a stratu corneu a v těchto oblastech měly pak nahromaděný HA (11). Stejné hromadění HA bylo popsáno i u lidí s dědičnou chorobou pokožky lichen sclerosus et atrophicus (LSA), kteří mají též sníženou expresi CD44 v kůži. HA je aktivně vychytáván buňkami sleziny a lymfatických uzlin, zde pak dochází k jeho masivnímu štěpení pomocí enzymů Hyal a ROS (2). Hyal štěpí β(1→4) vazbu mezi Nacetyl-D-glukosaminem a D-glukuronovou kyselinou v HA a také β(1→4) glykosidické vazby mezi
N-acetyl-galaktosaminem
nebo
N-acetylgalaktosamin
sulfátem
v
chondroitinu,
chondroitin 4- a 6-sulfátech a dermatanu (38). K mohutné degradaci HA dochází také v chrupavce, jelikož jeho množství zde musí být neustále pečlivě korigováno. V lidském genomu najdeme sekvence pro 6 různých Hyal: HYAL1, HYAL2, HYAL3, HYAL4, SPAM1, PHYAL1. Sekvence HYAL4 a PHYAL1 však nejsou schopné translace, tudíž vznikají jen Hyal-1,-2,-3, a PH-20 (produkt genu SPAM).
13
Hyaluronidázy Hyal1 - je aktivní při kyselém pH. Štěpí LMW HA na tetrasacharidy. Je lokalizována v lysozomech, nejvíce se vyskytuje v ledvinách, játrech, slezině a srdci. Jako jediná je aktivní také v krvi a moči (38, 41). Hyal2 - aktivní je při pH nižším než 4. Štěpí HMW HA na fragmenty o délce cca 20 kDa. Je lokalizována v lysozomech a na cytoplasmatické membráně, kde je vázána glykosylfosfatidylinositolovou kotvou a nachází se ve všech tkáních včetně mozku (38, 41). Hyal3 - je nejvíce exprimována ve varlatech a kostní dřeni, v ostatních tkáních jen minoritně, její funkce není známá (38, 41). PH-20 - je aktivní při neutrálním pH, nachází se ve spermiích a je nezbytná pro fertilizaci, umožňuje spermiím proniknout zónou pellucida a oplodnit oocyt (9,25). Dále se nachází v nadvarlatech, seminálních váčcích, prostatě, ženských pohlavních orgánech, v prsou, placentě, tkáních plodu a epitelu ledvinových kanálků (38, 41). Geny HYAL 1-3 jsou u člověka lokalizovány na dlouhém raménku třetího chromozomu (3p21.3). Jejich čtecí rámce se překrývají. Geny pro Hyal4, PH-20 a SPAM jsou na krátkém raménku chromosomu 7 v oblasti 7q31.3. Degradace HA v lysozomu se účastní také 2 β-exogylokosidázy (β-glukuronidáza a βN-acetylglukosaminidáza), volné monosacharidy se poté uvolňují do buňky a mohou být znovu použity (41). Extracelulárně mohou HA štěpit také metaloproteinázy rodiny ADAM, jejichž působení bylo prokázáno například v chrupavce (11). Ke štěpení HA dále přispívají také ROS, které štěpí i další komponenty extracelulární matrix (38). Množství HA přijímaného receptorem do buňky koreluje s expresí CD44 daných buněk. Tuto schopnost blokují protilátky proti CD44. Po přijetí HA do buňky prostřednictvím receptoru CD44 může dojít k jeho transportu do lysozomu a následné kompletní degradaci, tato degradace může být však inhibována NH4Cl nebo chloroquinem (11). Také patogenní mikroorganismy jsou schopné produkovat enzym Hyal a ten jim umožní zvýšit jejich schopnost invaze do organismu (26).
14
2.3 Signalizace HA HA se váže na mnoho různých receptorů, které společně nazýváme hyaladheriny. Jsou to receptory jako CD44, Toll-like 4, LYVE1 a layilin. Intracellulární HA receptory jsou RHAMM, proteiny teplotního šoku (heat shock protein, HSP90 – asociovaný s chaperonem Cdc37, který doprovází mnoho důležitých kináz), P32 a intracelulární HA vázající protein (IHABP4). Všechny tyto intracelulární receptory sdílejí strukturní motiv B(X7)B kde B je arginin nebo lysin a X je nekyselá aminokyselina (16,31).
Obr.č.2 a) Asociace HA a CD44 se signální kinázou src, patrně závislá na jejich kolokalizaci v lipidovém raftu cytoplazmatické membrány vede k aktivaci signalizační kaskády protein kinasy C (PKC) b) Asociace HA a CD44 a receptoru pro regulaci buněčného cyklu ErbB2 aktivuje signalizační kaskádu mitogenem aktivovanou proteinkinázu (MAPK) c) Aktivace NF-κB působením asociace Ras a PKCζ (NF-κB je potřebný pro expresi genů typických pro B buňky, je potřebný pro diferenciaci a aktivaci makrofágů, granulocytů, osteoklastů, dendritických buněk a erytrocytů) d) Asociace HA a CD44 může vést k aktivaci malých GTPáz (Rho a Rac1), což může modifikovat lokální organizaci cytoskeletu. LEE, Janet Y a Andrew P SPICER. Hyaluronan: a multifunctional, megaDalton, stealth molecule. Current Opinion in Cell Biology. 2000, roč. 12, č. 5, s. 581-586. ISSN 09550674. DOI: 10.1016/S09550674(00)00135-6. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0955067400001356
2.3.1 Prostřednictvím CD44 CD44 je membránový glykoproteinový receptor exprimovaný téměř na všech buněčných typech. Doména, na níž se váže HA, obsahuje sto aminokyselin, které jsou 15
provázány pomocí 4 u člověka (u jiných živočichů až 5) disulfidických můstků mezi cysteiny (13). Tuto doménu najdeme nejen na receptoru CD44, ale i na proteoglykanech chrupavky, v proteinech neurocan, versican a brevican (syntetizovaných v centrální nervové soustavě) a v TNFα, který stimuluje gen pro TSG6. Pro vazbu HA je také důležitá jeho koncová doména. Buňky, jejichž CD44 nemají tuto doménu (označován jako CD44l), jsou sice schopné vázat HA na CD44l, ale nejsou schopné ho internalizovat dovnitř buňky (11). Interakce HA s receptorem CD44 jistě patří mezi nejvýznamnější způsoby signalizace HA. Ovlivňuje řadu významných buněčných pochodů jako je migrace, proliferace, agregace, apoptóza a procesy angiogeneze (9). CD44 podléhá alternativnímu sestřihu, avšak všechny isoformy CD44 váží HA na svou extracelulární doménu. Některé isoformy jsou typické pro konkrétní tkáně, například CD44v10 (gp116) pro endotel, nebo CD44v3–10 (epican) pro keratinocyty. Isoformy CD44v6 a CD44v9 jsou selektivně exprimovány v maligních buňkách. Rozdíly ve funkci těchto isoforem zatím nejsou příliš známé (11).
Obr.č.3 model signální dráhy interakce CD44 a HA – HA navázané na CD44 aktivuje tyrosin kinázy Her2 a Src. Src fosforyluje cortactin. Dochází také k aktivaci RhoA a Rac1. CD44 vážeTiam1 a Vav2 a také Ankyrin, který interaguje s ERM proteiny (moesin, ezrin radixin like protein - proteiny cytoskeletu). Aktivace těchto signálních drah společně vede k invazi a migraci buněk. Tato interakce je klíčová pro signální dráhy jako Rho/Ras a Her2/c-Src, které řídí mnoho funkcí například adhezi nádorových buněk, proliferaci, invazi a migraci. (MLC = myosin light chain). TURLEY, E. A. Signaling Properties of Hyaluronan Receptors. Journal of Biological Chemistry. roč. 277, č. 7, s. 4589-4592. ISSN 00219258. DOI: 10.1074/jbc.R100038200. Dostupné z: http://www.jbc.org/cgi/doi/10.1074/jbc.R100038200
16
CD44 aktivuje tyrosin kinázy Her2 (p185) a c-Src. Kináza Her2 podporuje růst nádorů, její výskyt je známým markerem pro špatnou prognózu u pacientů s rakovinou prsu (44). Aktivace silně vázané c-Src kinázy má za následek fosforylaci cytoskeletálního proteinu cortactinu, který pak propojuje aktinové filamenty in vitro. Kinázy ze skupiny Src jsou obvykle lokalizovány v oblasti membrány bohaté na cholesterol a glykolipidy zvané lipidový raft, to může usnadňovat jejich interakci. Prostřednictvím aktivace cytoskeletu pak může docházet k migraci nádorových buněk. Obě tyto interakce mohou tedy ovlivňovat a stimulovat proces onkogeneze (45). CD44 bývá také asociován s GTPázami z rodiny Rho a Rac1, ty zprostředkovávají interakci s komponenty cytoskeletu. Například RhoA nekovalentně vázané na isoformu CD44v3 v buňkách rakoviny prsu stimuluje aktivitu Rho kináz fosforylujících proteiny, čímž je podporována vazba CD44 na ankyrin. Nadměrná exprese domén vážících Rho vede k inhibici ROS a tím k převrácení fenotypu buněk. Tato interakce je klíčová pro metastázování buněk prsního karcinomu. V některých buňkách je CD44 asociován také s Rac1, které regulují cytoskeletální aktin a jeho prostřednictvím ovlivňují pohyb membránových raftů, buněčnou migraci, transformaci a projekci (tvoření výběžků cytoplazmy) (10). CD44 také interaguje s cytoskeletálními proteiny ze skupiny ERM (ezrin, radixin, moesin like protein), které váží fosfatidylinositol a 4,5-bisfosfát (PIP2). Funkce této interakce v signalizaci HA ale není známá (46). Další cytoskeletální protein asociovaný s membránou a interagující s CD44 je anykrin. Doména receptoru CD44, která ho váže (zejména její region 1), je nezbytná pro adhezi buněk a vazbu HA (10). Tato doména je také nezbytná pro onkogenní signalizaci a transformaci nádorových buněk.
2.3.2 Prostřednictvím RHAMM RHAMM je membránový receptor, který svou interakcí s HA ovlivňuje především buněčnou mobilitu. Může být lokalizován nejen na povrchu buňky, ale také na cytoplazmatické membráně mitochondrií, či buněčného jádra, nebo i na buněčných cytoskeletálních systémech. RHAMM také podléhá posttranslačnímu sestřihu a jeho zkrácenou formu najdeme v poškozených buňkách, v nádorech a v mutantních buňkách transformovaných působením kaskády Ras (10).
17
Obr.č.4 Model signální dráhy hyaladherinu RHAMM – Hyaladherin v nativní formě je schopný vynořovat se z buněčné membrány do extracelulárního prostředí, přičemž ale zůstává v membráně ukotvený. RHAMM receptory v cytoplazmatické membráně po navázání HA regulují signální dráhy Ras a Src kináz a jsou schopné měnit schopnost PDGF potencovat Erk kinásu, která je klíčová pro buněčný pohyb. Intracelulární RHAMM ovlivňuje funkce cytoskeletu, včetně dělícího vřeténka. RHAMM je adaptérový protein podobně jako vinculin nebo paxilin. (FAK- focal adhesion kinase). TURLEY, E. A. Signaling Properties of Hyaluronan Receptors. Journal of Biological Chemistry. roč. 277, č. 7, s. 4589-4592. ISSN 00219258. DOI: 10.1074/jbc.R100038200. Dostupné z: http://www.jbc.org/cgi/doi/10.1074/jbc.R100038200
RHAMM asociuje s kinázami, kalmodulinem a cytoskeletem, pravděpodobně hraje klíčovou roli v regulaci cytoskeletu. Pokud separujeme membránový RHAMM od intracelulárního, dochází k aktivaci cytoskeletální signalizace intracelulárním HA a k předání informace do buněčného jádra. V tomto případě RHAMM podporuje ztrátu informací mezi buněčným jádrem a extracelulárním prostorem buňky, jde o oboustranně dynamický jev (dynamic reciprocity) (47). RHAMM tak může například representovat modifikovanou verzi buněčné externí i interní signalizace podobně jako receptory pro integriny. Receptor RHAMM v cytoplazmatické membráně interaguje s adhezními kinázami, kinázami Src a protein kinázami C. Je také nutný pro aktivaci Erk kináz prostřednictvím PDGF, nebo při hojení svalů (48). Aktivace Src kináz je dočasná, ale je zásadní pro fluktuaci adhezních lamel a pro buněčný pohyb. RHAMM je asociován s 20 % všech buněčných Erk1 a 10 % buněčných Src (10). Prostřednictvím G2M uzlu buněčného cyklu RHAMM reguluje také buněčnou progresi. Interakce HA a RHAMM umožňuje také přerušení adhezivních vazeb, které poutají buňku k podkladu, což je nezbytné pro buněčnou migraci, reguluje tak například migraci thymocytů do místa zánětu po fibronektinových kompartmentech extracelulárního prostoru společně s integrinovými fibronektinovými receptory α4β1 nebo α5β1 (48). Intracelulární receptory
18
RHAMM modulují funkci mikrotubulů dělícího vřeténka v interfázi i v mitóze. Exprese RHAMM je stejně jako exprese Has2 zvýšena v G2M fázi buněčného cyklu (16). Oba receptory RHAMM i CD44 tedy ovlivňují velice podobné buněčné pochody, dokonce bylo prokázáno, že delece genů pro RHAMM3 ani CD44 nejsou letální, což naznačuje, že jsou schopné navzájem částečně kompenzovat své funkce (10).
2.3.3 Signalizace HA souvisí s velikostí polymeru Velké nativní polymery HMW HA mající až 103 kDa jsou schopné i ve velmi malém množství aktivovat činnost výše zmiňovaných kinázových komplexů. HMW HA jsou obecně považovány za imunosupresivní a protizánětlivý faktor, kdežto LMW HA obvykle účinkuje opačně. LMW HA fragmenty detekované v mateřském mléce zvyšují produkci defensinu DEFB2 v lidských střevních epiteliálních buňkách, proto se předpokládá, že řídí novorozeneckou imunitní odpověď a chrání střevní epitel kojenců před infekcí. Nadměrná expozice střevního epitelu LMW HA však může zapříčinit i chronický patologický zánět (1). Oligomerní fragmenty HA vzniklé štěpením nativních polymerů HA bývají detekovány v místech zánětu, nádorového bujení či regenerujícího se zranění. Podporují angiogenezi a onkogenezi. Studie se zánětlivými makrofágy ukázala, že fragmenty HA o průměrné velikosti 250 kDa mohou indukovat expresi prozánětlivých genů (49). Podobných výsledků bylo dosaženo též u tubulárních buněk ledvinových kanálků, karcinomu T-24 (lidský karcinom močového měchýře) nebo u eosinofilů (50). HA fragmenty o velikosti 6-20 kDa jsou schopné indukovat expresi těchto prozánětlivých genů také v dendritických buňkách. LMW HA se uplatňuje také v ontogenezi při aktivaci genové transkripce či migraci buněk (10).
3 Působení HA v rakovinném bujení Akumulace HA byla pozorována v mnoha typech rakovinného bujení, u solidních nádorů i leukémií a vždy byla spjata se špatnou prognózou pro pacienty, agresivním růstem nádoru a metastazováním a mnohdy i s rezistencí vůči klasické chemoterapeutické léčbě. Zdá se, že díky mnohastupňové regulaci sekrece a degradace HA není tento polymer schopný vznik nádoru vyvolat, ale po indukci jeho tvorby již vzniklým nádorovým shlukem je schopný jeho vývoj všemožně podporovat. Jak už bylo zmíněno, HA stimuluje buněčné pochody jako proliferaci, migraci, agregaci a angiogenezi a inhibuje apoptózu. Díky těmto signálním schopnostem se stává skvělým nástrojem pro urychlení a horší průběh onkogeneze, ale může se stát i zbraní proti rakovině, pokud bychom této interakci u pacienta včas zamezili.
19
3.1 Solidní nádory Solidní neboli pevné nádory představují pevnou masu transformovaných buněk, které proliferují a omezují okolní tkáně, a to buď pouze prostorově a konkurenčně – benigní nádory, nebo i svojí invazivitou – maligní nádory. Maligní neboli zhoubný nádor je schopný proliferovat a invadovat do okolní tkáně, jeho buňky jsou schopné migrovat a vytvořit tak vzdálené metastázy nádoru. Přeměnu benigního nádoru (který většinou neohrožuje pacienta na životě) v maligní nádor, může stimulovat právě jeho interakce s HA. Extracelulární nahromadění HA bylo pozorováno v karcinomu plic, prsou, prostaty, ovarií, močového měchýře, dělohy, štítné žlázy a v plicním adenokarcinomu a bylo spojené se zvýšeným metastazováním nádoru (11, 14, 18). Existují různé teorie, které se snaží vysvětlit mechanismy akumulace HA v těchto karcinomech. První možností je zvýšená syntéza HA. Nejprve by však bylo nutné zvýšit expresi hyaluronanových syntetáz. Ty mohou být podporovány produkcí růstových faktorů EGF, PDGF a keratinovým růstovým faktorem, jejichž zvýšená hladina bývá často pozorována v maligním bujení. Například u rakoviny střeva a melanomu je vysoká hladina exprese Has1 spojená se špatnou prognózou (14, 15). Také bylo prokázáno, že inhibice Has a následné syntézy HA způsobila inhibici proliferace rakovinného bujení prsou (51). Na myším modelu byl následně prokázán také účinek 4-methylumebeliferonu (4-MU) - látky, která inhibuje aktivitu zmíněných enzymů, čímž inhibuje i proliferaci nádoru slinivky (9). Jak už bylo řečeno výše, k nahromadění HA v nádoru může dojít stimulací aktivity Has. Například pokusy na krysí fibroblastové linii 3Y1 ukázaly, že nadměrná exprese Has1 i Has2, vedla k růstu nádoru odvozeného z fibroblastové linie, kdežto zvýšená exprese pouze Has2 inhibovala růst nádoru (15). Druhou možností je nízký katabolismus HA v těchto nádorech. Ten je regulován působením Hyal 1, 2, 3 a ROS. HA je tak částečně naštěpen a zbytek je pak degradován v buňkách nebo transportován do lymfatických uzlin, jejíž buňky exprimují více HA metabolomických receptorů. Například v nádoru ovárií bylo zaznamenáno mnoho defektů na genech pro Hyal 1, 2, 3, ale nebylo prokázáno, že by to nějak souviselo s přežitím pacientek (14).
3.1.1 Proliferace nádoru Interakcí HA s CD44 může být stimulována proliferace a migrace nádoru. DNA takto vzniklých nádorových buněk rychle mutuje a časem vznikají i mutace mnoha proonkogenů, což jsou geny kontrolující buněčný cyklus. Tyto zmutované geny pak umožňují nekontrolovatelnou proliferaci nádoru, která je navíc podporována výše zmíněnou interakcí. 20
Naopak omezována je tato proliferace množstvím živin, proto nádor potřebuje stimulovat angiogenezi, ale i to umožňuje právě interakce CD44 a HA. Zvýšená exprese Has3 vede ke zvýšení proliferace buněk nádoru prostaty (linie TSU) a exprese Has1 způsobuje znovunabytí schopnosti metastázování rakoviny prsou u myší (potom, co byla tato schopnost inhibována malou produkcí HA) (52). Výzkum doktora Itany se proto zaměřil na produkci specifických Has v souvislosti se stimulací onkogeneze in vitro u linie 3Y1 fibroblastových myších buněk. Tato buněčná linie byla infikována onkoviry (adenovirus E1A a opičí virus 40). Vzniklé nádory vykazovaly pomalý onkogenetický vývoj, ale navzdory tomu vysokou proliferaci nezávisle na kontaktu s podkladem. Po vyvolání buněčné transformace nádoru působením na receptory v-src (linie SR-3Y) nebo v-HA-ras (linie HR-3Y), došlo k rozvoji onkogeneze a nádor byl poté schopný tvořit metastázy. Tyto linie měly 3-5x vyšší akumulaci HA, naproti tomu linie, které byly pouze infikované onkoviry, neměly signifikantně vyšší akumulaci HA v médiu. Získaná data naznačují, že exprese Has2 je regulována působením na receptory Ras, kdežto Has1 působením závislým i nezávislým (inhibicí Src) na Ras. Zvýšená exprese Has2 u linie HR3Y1 nádoru peritonea a též u buněk gliomu způsobila inhibici růstu nádoru. Ale pouhá exprese Has2 v normální míře podporuje růst nádorů. Také použitím antisense inhibitorů HAS2 došlo ke snížení schopnosti migrace nádoru peritonea krysy (15). Výsledky experimentu doktora Itany jsou zobrazeny na Obr.č.6.
21
Obr.č.6 - Syntéza HA a aktivita HAS buněčné linie 3Y1 a jejich transformací. Množství sekretovaného HA bylo měřeno v médiu, Has aktivita byla měřena enzymatickou reakcí se substrátem UDP[14C]GlcA. Základní linie: krysí fibroblasty s označením 3Y1, E1A 3Y1 jsou odvozeny ze základní linie a infikované adenovirem E1A, SV-3Y1 odvozené ze základní linie a infikované opičím onkovirem 40, HR-3Y1 odvozené ze základní linie, infikované onkovirem a transformované působením HA na receptor v-Ha-ras, SR-3Y1 odvozené od základní linie, infikované onkovirem a transformované působením Ha na v-src, linie v-fos SR-3Y1 odvozené ze základní linie, infikované onkovirem a transformované působením HA na v-fos, linie S17N SR-3Y1 byla inkubována s dexamethasonem 2 dny (nebo ne +Dex/-Dex). ITANO, N. Selective Expression and Functional Characteristics of Three Mammalian Hyaluronan Synthases in Oncogenic Malignant Transformation. Journal of Biological Chemistry. 2004-03-07, roč. 279, č. 18, s. 18679-18687. ISSN 0021-9258. DOI: 10.1074/jbc.M313178200. Dostupné z: http://www.jbc.org/cgi/doi/10.1074/jbc.M313178200
Interakce HA a CD44 má vliv také na zvýšenou fosforylaci tyrosin kinázových receptorů v nádoru. Tyrosin kinázové receptory váží různé regulační faktory růstu jako EGF, IGF, PDGF a hepatocytární růstový faktor, které pak aktivují přežití buněk pomocí PI3/AKT signální dráhy. Jelikož tato signální dráha reguluje expresi genu p53 regulujícího buněčný cyklus, může abnormální aktivita těchto receptorů, zejména těch z rodiny ERBB, podporovat různé typy rakoviny. Zvýšení aktivity těchto receptorů může způsobit masivní proliferaci buněk, v důsledku níž dochází k amplifikaci genů a ke vzniku mutací a pozměnění regulace signalizace mezi integriny a jejich receptory, což vede ke změně apokrinní a parakrinní signalizace mezi různými řídícími proteiny. Tyto změny vedou ke zvýšení růstu nádoru, mobility, přežití a rezistence vůči chemoterapii. Experimentálně zvýšená hladina HA vedla ke zvýšení této aktivace u buněk, které normálně měly málo aktivovaných ERBB2. Navíc stimulace produkce HA indukuje vznik lipidových raftů spojujících fosforylované proteiny ErbB2, CD44, ezrin, PI3 kináz a chaperonových molekul HSP90 a proteinu kontrolujícího buněčné dělení (cell division cycle control protein, CDC37). Pokud je tato interakce s HA inhibována, dojde opět ke zničení tohoto komplexu (20). Aktivitu signální dráhy PI3/AKT
22
ovlivňuje také kináza Ras, která, jak už bylo zmíněno v kapitolách o signalizaci, může být regulována interakcí HA a RHAMM (10, 28).
3.1.2 Angiogeneze Akumulace HA v prostředí podporuje onkogenezi a nádorovou angiogenezi. Extracelulární HA urychluje rekrutování monocytů a makrofágů, které jsou důležité pro angiogenezi. Tyto buňky se rolováním pohybují po síti z polymerů HA a uvolňují zánětlivé růstové faktory, které se zde zachycují a podněcují vznik krevních kapilár. Bohužel imunitní buňky, které se díky tomu dostanou k nádoru, proti němu nejsou schopné bojovat, interakce HA a CD44 jim totiž brání produkovat ROS (21). Nedávné experimenty prokázaly, že progrese a vaskularizace tumoru je závislá na HA produkovaném buňkami stromatu a epitelů. U transgenních myší produkujících v epitelu Has2 se velmi rychle vyvinul agresivní nádor prsu. Naproti tomu skupina myší s velkým množstvím extracelulárního HA vykazovala pomalý rozvoj nádoru bez výskytu „šupinatých“ buněk (SCC – squamos cell carcinom – spinocelulární karcinom) a značně vaskularizovaný (68). Přispění stromálního HA k rozvoji vaskularizace nádoru je dobře vidět na experimentu, v němž byly fibroblasty neschopné produkovat Has2 společně s buňkami epiteliálního nádoru naočkované myši, vyvinul se protáhlý vaskularizovaný nádor, v němž špatně probíhal nábor makrofágů (53). Angiogenní vlastnosti HA oligosacharidů souvisí s jejich molekulovou hmotností. Nejvíce invazivní nádor močového měchýře byl schopen generovat HA10-15 (10-15 jednotek dlouhé fragmenty HA), které přispívaly k intenzivní proliferaci a adhezi nádoru i vývoji krevních kapilár. Podobné fragmenty HA byly pozorovány často u nádorů prostaty, krku, hlavy a SCC (9).
3.1.3 Migrace nádoru Zvýšení mobility buněk souvisí s vytvořením komplexu RHAMM–CD44–Erk1,2, který vyžaduje endogenní syntézu HA (9). Fragmenty HA indukují produkci zánětlivých chemokinů a cytokinů v makrofázích a stimulují zánětlivou odpověď organismu včetně endoteliální buněčné proliferace a migrace. V nádorech také stimulují expresi metaloproteináz (MMP) a následnou aktivaci NFκB (jaderný transkripční faktor kappa B). Indukcí některých proteolytických enzymů usnadňují degradaci extracelulární matrix a tím také růst a metastázování nádorů (17). HA bývá hojný také v mezenchymálních kmenových buňkách a v jejich extracelulárním prostoru. Výzkum na myším modelu lidského nádoru prsu ukazuje migraci těchto buněk do nádoru a následnou stimulaci metastázování nádoru (14). Různě dlouhé fragmenty HA účinkují různě, například HA4-6 stimulují expresi MMP proteáz, které podporují onkogenezi u myšího modelu (54). HA36 aktivují nádorové integriny, což vede ke stimulaci tvorby mezibuněčných spojů pomocí ICAM1 (intercellular adhesion molecule) (55). HA6-36 zvyšují štěpení CD44 a podporují tak migraci nádorových buněk 23
(56). HA4-25 indukují tvorbu krevních kapilár (angiogenezi) (57). HA10-12 naproti tomu inhibují na zakotvení nezávislý růst lidského karcinomu plic in vitro a in vivo růst myšího melanomu, rakoviny prsou a lidské rakoviny plic (58). Tyto poznatky vedly vědce k myšlence, že rakovinné buňky mohou produkovat HA o dané velikosti a cíleně tak využívat jeho signálních vlastností ve svůj prospěch. Vědecký tým doktora Sagahary proto provedl experimenty in vitro na linii lidských buněk z nádoru slinivky (MIA PaCa-2), které prokázaly, že tyto buňky stimulují činnost Hyal 1 a 2, díky čemuž pak vznikají HA10-40, které v závislosti na své koncentraci mohou aktivovat proteázy způsobující štěpení CD44. Přítomnost takto vzniklé solubilní CD44 byla prokázána u mnoha typů lidských nádorů od gliomů přes rakovinu prsu, plic, střeva a vaječníků a předpokládá se, že může vést k progresi nádoru. V tomto experimentu však bylo přímo prokázáno, že takto naštěpený CD44 usnadňuje onkogenezi nádoru, buňky navíc po stimulaci vytvořeným HA tvořily filopodia a aktinové filamenty, což způsobilo migraci nádoru in vitro (18). Buňky s filopodiemi nafocené pomocí fluorescenčního mikroskopu jsou zobrazené na obr. č. 7.
Obr.č.7 – A- analýza množství vzniklých naštěpených CD44 B - fragmenty HA indukovaly formování filopodií cytoskeletu a tím umožňovaly migraci nádoru – červeně je zviditelněný aktin, zeleně CD44 C - Počty migrujících buněk SUGAHARA, K. N. Tumor Cells Enhance Their Own CD44 Cleavage and Motility by Generating Hyaluronan Fragments. DOI: 10.1074/jbc.M506740200. Dostupné z: http://www.jbc.org/cgi/doi/10.1074/jbc.M506740200
24
Dřívější výzkum nádoru prsu prokázal, že interakce HA - CD44 je schopna indukovat +
+
Na /H výměnu, čímž dojde k vytvoření kyselého prostředí, které aktivuje funkci Hyal2 (66). Interakce HA a CD44 v rakovině prsu vede k zachycení MMP9, které přispívají k invazi nádoru. V rakovinném bujení dochází fyziologicky také k indukci imunitní odpovědi a tak vzniká velké množství fragmentů HA. Ty jsou schopné indukovat expresi MMP2 v melanomu prostřednictvím Toll-like receptoru (TLR) a NFκB. CD44 heparan sulfát navíc umožňuje vznik komplexu MMP7 s prekurzorem heparan vázajícího epidermálního růstového faktoru (pro-HB-EGF), tím vzniká aktivní růstový faktor (HB-EGF), což vede k aktivaci Her2/ErbB4 a dojde tak ke zvýšení schopnosti přežívání buněk. Aktivitu metaloproteináz i produkci HA indukuje také EMMPRIN (CD147, extracellular matrix metalloproteinase inducer, extracelulární indukční faktor metaloproteináz v matrix – membránové glykoproteiny často nahromaděné v oblasti nádoru), souhrou těchto faktorů je stimulována proliferace buněk nezávislá na kontaktu buněk s podkladem (9). CD44, HA a EMMPRIN se tak stávají partnery urychlujícími onkogenetický vývoj a usnadňujícími vznik chemorezistence. Souhrou těchto signálů je indukována tvorba bariéry kolem buněk tvořené polysacharidovým HA pláštěm, která brání průniku chemoterapeutik dovnitř buňky. V buňkách jsou navíc aktivovány opravné a detoxikační mechanismy a dojde také k zintenzivnění exportu chemoterapeutik ven z buňky pomocí ABC transportérů (ATP binding cassette, ATP vázající transportéry). Zvýší se také exprese signálních faktorů pro přežití buňky a proti apoptóze (20). EMMPRIN hraje klíčovou roli ve správné funkci receptorů transportujících laktát, které se vyskytují ve svalech a sítnici - MCT1, 3 a 4 (monokarboxylátové transportéry). Tato interakce je nutná při tzv. Warburgově efektu. Warburgův efekt byl popsán roku 1956. Jedná se o jev, při němž se zvýší glykolytická aktivita buňky a sníží se respirace buňky, následkem čehož dojde k hypoxii, acidóze okolního prostředí vylučovaným laktátem a mitochondriálním defektům. Zmíněné pochody nahrávají rezistenci nádoru vůči lékům. Kyselé prostředí buněk také podporuje nárůst invazivity nádoru, rezistence a metastází (27). Interakce CD44-HA také reguluje expresi P-glykoproteinu a BCRP (breast cancer resistance protein) v karcinomu a gliomu. Tato interakce ovlivňuje mobilitu a invazivitu buněk, proto také musí být oba aktivní při migraci T-lymfocytů do lymfatických uzlin. CD44 a P-glykoprotein jsou spolu také kolokalizovány v lipidových raftech, což dokazují zobrazení konfokálním mikroskopem a také technika FRET (fluorescenční rezonanční přenos energie) (20). Bylo prokázáno, že interakce oHA s TLR4 u lidských melanomů má za následek nadprodukci IL-8. A že v závislosti na působení TLR4 zvyšuje mobilitu nádorových buněk. Zvýšená produkce IL-8 u různých typů nádoru též značí špatnou prognózu pro pacienta a je
25
dokázáno, že podporuje růst rakovinného bujení a koreluje také se schopností nádoru metastázovat (17). Pro migraci nádoru jsou důležité také nádorové kmenové buňky. Ty pravděpodobně vznikají při metastázování nádoru a jsou velmi odolné vůči chemoterapii i radioterapii. Někteří vědci prokázali, že pro jejich funkčnost je nutná interakce s HA pomocí CD44 (59) jiní se však domnívají, že se tato interakce děje pomocí RHAMM (60). Dalším společným poznávacím znakem těchto kmenových buněk je receptor EpCAM (ESA), který je vazebným partnerem EMMPRIN. Tyto interakce kmenových buněk rakoviny byly zatím pozorovány hlavně u leukémií. Markerovým proteinem kmenových buněk rakoviny je CD44 a u některých také CD133 (prominin, jeho funkce je neznámá) (20).
3.1.4 Epiteliálně-mezenchymová nádorová transformace Epiteliálně mezenchymová nádorová transformace je dlouhodobý onkogenetický proces, při němž původně epitelová tkáň výrazně mění svůj fenotypový projev, prochází zpětným vývojem a získává vlastnosti embryonální mezenchymové tkáně. HA v okolí buněk na sebe váže vodu, čímž dochází ke ztrátě integrity v tkáni. Epiteliální buňky nádoru snižují produkci
epitelových
markerů
(E-cadherin)
a
naopak
zvyšují
produkci
markerů
mezenchymálních (vimentin, hladkosvalový aktin). To podporuje rozvoj promigračního fenotypu buněk, který je nezbytný při embryonálním vývoji, ale je potřebný také pro metastázování nádoru. Například transgenní myši produkující příliš Has2 a c-neu protoonkogenu vykazovaly malou diferenciaci buněk prsního epitelu, ze kterých se vyvinul adenokarcinom, který však spíše připomínal diferencovaný dutý karcinom. Tyto myši také vykazovaly inhibici produkce E-cadherinu a naopak vyšší produkci jaderného β-cateninu. Byla u nich pozorována také zvýšená produkce stroma a HA, která zde podporovala vývoj mesenchymálně přeměněného karcinomu schopného migrace (61). Zvyšující se produkce HA vedla také k růstu a invazi nádoru (nezávisle na jeho uchycení na povrchu) v buňkách psího nádoru ledvin a lidského prsního karcinomu MCF10A, k aktivaci produkce proteáz (MMP2 a MMP9 – které štěpí gelatin a kolagen 4) a ke stimulaci produkce fosfoinositid kinásy (Akt signální dráha) (62). Buňky infikované adenovirem se zvýšenou aktivitou Has2 také vykazovaly produkci mezenchymálních markerů (vimentin), rozptýlení cytokeratinů a ztrátu adhezních proteinů a mezibuněčných interakcí. To vede k inhibici proliferace buněk, proto dochází opět k úbytku HA (9). V karcinomech, jejichž buňky mají původní diferenciaci, je tedy množství HA zvýšené, ale v nádorech dediferencovaných je toto zvýšení nepravidelné a jeho celkový úhrn je zde snížený. To je patrné též u kožního melanomu (61). 26
S množstvím HA v nádorech koreluje exprese jeho hlavního buněčného receptoru CD44. Podobnou závislost je možné pozorovat též u karcinomu odvozeného od jednoduchého epitelu – tedy např.: u karcinomu plic. Nízká hladina HA v karcinomech dutiny ústní a hrtanu koreluje se zapojením lymfatických uzlin a metastazováním. Pacienti se sníženou či nepravidelnou hladinou HA v těchto karcinomech jen v 50 % případů přežili déle jak 5 let. Naproti tomu pacienti s normální hladinou HA v těchto karcinomech přežili tuto hranici v 80 % případů (14). Analýzou biopsií tumorů sice nelze zjistit příčinu úbytku HA, ale pozorovaná narůstající exprese ektopických Hyal a proteáz MT-MMP1 a ADAM (schopných štěpit CD44) naznačuje, že se pravděpodobně zvyšuje jeho katabolismus (14). Produkce HMW HA vede ke zpětné přeměně fenotypu nádoru z mezenchymálního na epiteliální (9).
3.1.5 HA ovlivňuje imunitní působení v nádoru Rakovinné buňky in vitro indukují vysokou produkci ROS u monocytů, tvorbu superoxidových aniontů a hydroxylových radikálů. Avšak současné výzkumy naznačují, že povrchové determinanty rakovinných buněk a HA dokážou zabránit vytváření ROS, kterými monocyty ničí rakovinné buňky. Výsledky naznačují, že CD44 je součástí spouštěcího mechanismu pro produkci ROS při setkání monocytu s rakovinnou buňkou, přičemž abnormální nadprodukce HA zde může pomoci v odlišení rakovinné a zdravé buňky. Nicméně volný HA zároveň blokuje CD44, čímž se rakovinné buňky brání (21). Receptor CD44 podporuje produkci TNF a oxidu dusnatého při styku monocytů s rakovinnou buňkou. U myší bylo také pozorováno, že vazba LMW HA na CD44 podněcuje produkci chemokinů a zvyšuje aktivitu inducibilní NO syntázy (iNOS). Zároveň ale HA blokuje receptory CD44, tudíž nadprodukce HA i CD44 je vždy špatným prognostickým markerem, ale samotná nadprodukce CD44 nemusí být špatná (63). Skupina vědců pod vedením doktora Mytara prokázala, že po přidání HMW HA k monocytům předem stimulovaným rakovinnými buňkami byla indukována produkce ROS. Avšak když přidali HMW HA současně s rakovinnými buňkami, efekt byl mnohem menší. Stejně jako při použití LMW HA místo HMW HA. Jelikož bylo také prokázáno, že preinkubace HA u buněk, které neexprimují CD44, neměla žádný účinek, je jasné, že tato interakce je pro stimulaci aktivity monocytů klíčová. To potvrzuje i fakt, že po podání protilátky proti CD44 nedošlo
vůbec
k chemiluminiscenčnímu
vzplanutí.
Při
preinkubaci
monocytů
se
supernatantem z rakovinných buněk, který obsahoval akumulovaný HA, došlo také k indukci produkce ROS, po podání Hyal pak došlo k zastavení této imunitní odpovědi. Rakovinné buňky neexprimující CD44 byly i po preinkubaci HA stále stejně schopné vyvolat produkci
27
ROS monocytů. Z toho je patrné, že pro inhibici produkce ROS monocyty je nutná interakce receptoru CD44 a HA (21). V rakovinném mikroprostředí mohou vzniknout tzv. makrofágy asociované s nádorem (TAM; tumour-associated macrophages). Ty nejsou schopné s ním bojovat a navíc mohou svými interakcemi ke stejné reaktivitě stimulovat i další makrofágy, s nimiž se setkají. Mohou tak vlastně podporovat rozvoj rakoviny. Proto vysoká infiltrace makrofágů v nádoru bývá také špatným prognostickým markerem. Ve
zdravém
organismu
mohou
být
makrofágy
aktivovány
buď
stykem
s mikroorganismy a rakovinou (typ M1), nebo v důsledku stimulace protizánětlivými cytokiny IL4 a IL10 (typ M2). Lokální nadměrná exprese cytokinu IL12 stimuluje správnou imunitní reakci proti rakovině (23). Působení HA v nádoru se liší dle jeho velikosti – malé a střední fragmenty působením na receptory CD44 a TLR aktivují APCs (antigen presenting cells), ale velké molekuly nebo fragmenty HA menší než hexasacharid nemají tento účinek. Tímto působením L- a MMW (middle molecular weight) HA může dojít k indukci TAM, které potlačují protinádorovou imunitu a podporují progresi nádoru (64). Doktor Kuang ve svých výzkumech prokázal, že působení HA30 a HA60 stimuluje u makrofágů produkci TNFα a IL10, ale po šestidenním vystavení tomuto působení dochází k naprostému zrušení této produkce. Což je provázeno snížením exprese determinant CD68 (mucin, zprostředkující adhezi a vazbu lectinů) a HLA-DR (lidský leukocytární antigen). Dlouhodobým působením MMW HA tedy dochází k vyčerpání imunitních schopností makrofágů, podobně jako při dlouhodobé expozici lipopolysacharidu (23).
3.2 Leukémie Leukémie je nádorové onemocnění vycházející z krevních buněk – většinou lymfocytů či granulocytů. Nádorové buňky s nekontrolovanou proliferací a špatnou diferenciací se přirozenou cirkulací krve dostanou do celého těla, z tohoto hlediska se jedná o onemocnění závažnější než solidní nádor, jelikož postihne celý imunitní systém a v důsledku samo naprosto znemožní jeho funkčnost. Jedná se o nejčastější nádorové onemocnění u dětí. Leukémie se dělí na dva hlavní typy - akutní a chronickou. Akutní leukémie se vyznačuje nekontrolovanou proliferací nediferencovaných krevních buněk, u nichž je další diferenciace znemožněná. Při chronické leukémii buňky sice pomalu diferencují, ale proces proliferace také není kontrolován. Podle původu maligních buněk se také dělí na myeloidní leukémii, u níž jsou nádorově transformovány granulocyty, a lymfoidní, která vychází z prekurzorů lymfocytů. HA působí u těchto druhů rakoviny velmi podobně jako v solidních nádorech, stimuluje proliferaci buněk, chrání je proti působení imunitního systému i chemoterapeutik, brání jejich 28
apoptóze, ovlivňuje také adhezi, migraci a invazi buněk. Interakce těchto buněk s HA je zprostředkována pomocí obvyklých receptorů RHAMM a CD44. Může také docházet k akumulaci cytokinů v hyaluronanové síti, což ovlivňuje přežívání a proliferaci buněk (20). Liší se především mechanismus ovlivnění migrace leukemických buněk, který je umožněn interakcí HA s receptorem Tiam1 (T-lymfocytární invazivní a metastázový faktor1, T-cell lymphoma invasion and metastasis inducing) a proteinů účastnících se v reorganizaci cytoskeletu během invaze (9). Mnohočetný myelom je druhým nejčastějším leukemickým onemocněním, dochází při něm ke vzniku nádorů v kostní dřeni, ty porušují integritu kostí a způsobují časté zlomeniny a vytlačují zdravé buňky kostní dřeně, následkem čehož dochází k anémii a podobně. Nadměrně proliferující leukocyty často také vyprodukují nadměrné množství protilátek. Tyto protilátky se poté hromadí v ledvinách a způsobují druhotné příznaky choroby, které mohou vést až k selhání ledvin. Dochází také k poruchám fungování imunitního systému a následkem toho se u pacientů objevují časté a hůře zvládnutelné infekce. Myeloidní buňky přirozeně exprimují mnoho receptorů RHAMM a CD44, které interagují s HA. Nadměrná produkce HA je opět špatným prognostickým markerem pro pacienty, špatná je ale také nízká produkce HA (69). Doktor Calabro a jeho tým se zabývali výzkumem aktivity Has u pacientů s mnohočetným myelomem v porovnání se zdravými pacienty. Zjistili, že exprese Has u zdravých lidí a pacientů s mnohočetným myelomem se zásadně liší. Zatímco u zdravých lidí převažuje exprese Has2, u pacientů s myelomem je 7,6 x vyšší exprese Has1. Has1 se tak u těchto pacientů exprimuje 20 x víc než u zdravých lidí. Liší se také exprese Has3, která je u pacientů s myelomem většinou nulová. Oproti zdravým lidem je tedy zvýšená exprese Has1 a snížená exprese Has2 a Has3. V experimentech in vitro bylo prokázáno, že kontakt maligních buněk se zdravými buňkami ovlivňuje produkci HA i u zdravých buněk a stimuluje u nich aktivitu Has1. U nádorových kultur byla prokázána až 10 x vyšší produkce HA než u zdravých buněk, a to i při terapii obou typů buněk dexamethosanem – ten sice produkci HA signifikantně snižoval, přesto však byla 10 x vyšší u buněk pacientů s mnohočetným myelomem. Výsledky naznačují, že exprese Has1 a Has2 musí být regulována zvlášť, jelikož její zvýšení u pacientů je ovlivňováno navzájem nezávisle (22). Ostatní mechanismy působení HA při leukémii jsou velmi podobné jako u solidních nádorů.
3.3 Nové možnosti léčby Jak už bylo několikrát řečeno, akumulace HA způsobuje vznik chemorezistence vůči mnoha chemoterapeutikům (např.: methotrexat, doxorubicin, taxol, vincristin, cisplatina, etoposid, gemcitabin, transtuzumab a další). Klíčovou roli přitom hraje jeho interakce 29
s receptorem CD44, která aktivuje eflux těchto toxických látek z buňky ven. Druhým mechanismem způsobujícím tuto rezistenci je vznik hyaluronanového pláště kolem rakovinných buněk, který chemoterapeutika nepropustí dovnitř. Velmi slibnou možností obrany proti vzniku takovéto chemorezistence je zabránění interakce HA a CD44. Toho lze dosáhnout několika různými způsoby. První možností je znemožnění akumulace HA, toho lze docílit buď inhibicí jeho produkce, nebo naopak stimulací jeho katabolismu. Inhibování produkce HA umožňují například nové léky na bázi 4-MU, jedná se o inhibitor Has, který umožňuje zastavení růstu nádoru. Doktor Tammi se svým kolektivem na myším modelu prokázal, že 4-MU je schopen zabránit rezistenci buněk karcinomu prsu na transtuzumab –protilátku proti ErbB receptoru (jeden z regulátorů buněčného cyklu) (14). Účinnost 4-MU byla prokázána i na imunodeficitním myším modelu (SCID myši) s indukovaným lidským nádorem slinivky břišní. V tomto případě byl použit 4-MU v kombinaci s gemcitabinem a bylo prokázáno, že kombinace obou dosahuje lepších výsledků než jejich podávání samostatně. 4-MU tak lze použít jako chemosensitizér (30). Druhou možností je zablokování vazebného místa pro HA na receptorech CD44. Toho lze dosáhnout podáváním oligomerů HA o určité velikosti. Tato léčba je obvykle spojená s podáváním některého z chemoterapeutických léků, samotné oligomery HA totiž rakovinné buňky nemohou zničit. Zatím je zkoušena hlavně na in vitro a in vivo experimentálních modelech. Mechanismus fungování této terapie není přesně prokázaný, ale předpokládá se, že oligomery HA se extracelulárně váží na CD44, a tím znemožňují vazbu endogenního HA na tento receptor, ta normálně aktivuje faktory přežití buňky stimulací fosfatidylinositol kinázy PI3/Akt signální dráhy (24). Oligomery HA nejen, že blokují vazbu HA a CD44, ale také inhibují produkci HA polymerů. Dokonce bylo prokázáno, že jsou schopné indukovat i apoptózu buněk gliomu in vivo (20). Také skupina doktora Gilga prováděla pokusy s oligomery HA a prokázala, že tyto oligomery in vivo (na krysích modelech) brzdí rozvoj gliomu odvozeného od rezistentní linie C6SP. Na modelu rakovinného bujení došlo ke snížení proliferace, zvýšení apoptózy, inhibici aktivity epidermálního růstového faktoru, BCRP a Akt. V důsledku toho pak došlo také ke zvýšení toxicity methotrexatu (29). Také doktor Zeng se svým týmem již roku 1998 prokázal, že malé oligomery HA soutěží o vazbu větších HA na CD44 a tím zamezují proliferaci nádorových buněk. Na buňkách myšího melanomu B16F10 experimentálně in vivo prokázal po týdenním podávání 0,5 mg/ml oligomerů HA3-12 snížení proliferace nádoru až o víc jak 85 %. Týdenním podáváním CD44Rg (CD44-Ig spojující protein) indukoval snížení proliferace stejného nádoru o víc jak 40 %. (19).
30
Skupina vědců pod vedením doktora Toola prováděla experimenty s rozpustnými HA vázajícími proteiny HABPs. Ty soupeří o vazbu na hyaladherinech s endogenním HA, čímž nakonec dojde k přerušení jejich interakce s CD44 receptory rakovinných buněk. Důsledkem toho je inhibice tvorby HA polymerů, inhibice růstu a metastázování nádoru, indukce apoptózy u nádorových buněk nebo alespoň zastavení jejich buněčného cyklu (20). Třetí možností jak zamezit interakci HA s CD44 je inhibovat expresi receptorů CD44, nebo stimulovat jejich štěpení. Pokud by se to podařilo, interakce HA a CD44 by již nebyla možná a HA by nemohly podporovat rakovinné bujení. Některé studie zmiňují, že rozšíření některých isoforem CD44 v rakovině může být diagnostickým ukazatelem, konkrétně jde o isoformy v3, v6, v9. Například výskyt isoformy v9 je statisticky významně spojený se špatnou prognózou pro pacienty s mnohočetným myelomem (67). Navíc u rakoviny slinivky břišní bylo prokázáno, že exprese CD44v6 vedla k metastázování nádoru (68). Různé isoformy CD44 také regulují Ras signalizaci, následkem čehož dochází k proliferaci a invazi buněk rakoviny. Například podáváním protilátek způsobujících aktivaci různých isoforem CD44 bylo zamezeno vzniku chemorezistence na lék 1,3-bis(2-chloroethyl)-1-nitrosourea (BCNU) u karcinomu střeva. Také při transfekci tohoto nádoru malým množstvím CD44 isoforem v3-10 došlo ke vzniku rezistence vůči etoposidu, zatímco transfekce standardním CD44 měla menší efekt (20). Inhibice exprese CD44 lze dosáhnout transfekcí siRNA proti CD44 (20). To ve svých pokusech vyzkoušel i doktor Palyi-Krekk se svým týmem, který se snažil zamezit vývoji chemorezistence na transtuzumab u karcinomu prsou. Jak již bylo řečeno transtuzumab je protilátka proti ErbB receptoru, ovlivňujícímu buněčný cyklus. Zdá se, že akumulace HA je schopná skrývat tento receptor a zamezit tak vazbě protilátky, následkem čehož nedojde ke zpětné internalizaci receptoru. To potvrzuje fakt, že vývoj této chemorezistence koreluje s vysokou
expresí
CD44.
Doktoru
Palyi-Krekkovi
se
podařilo
zamezit
vzniku
chemorezistence na transtuzumab použitím inhibitoru Has 4-MU. Při použití siRNA inhibující expresi CD44 však nebylo dosaženo zastavení vývoje chemorezistence, přestože došlo k signifikantnímu snížení exprese CD44. Také samostatně podávaný 4MU nepotlačoval expresi ErbB2 ani růst nádoru. Je tedy zřejmé, že tato látka nemůže být s dostatečnou účinností použitá samostatně. Jelikož se transtuzumab může na ErbB2 vázat více způsoby, problematika korelace této interakce s CD44-HA vazbou je velmi složité téma, které si vyžaduje další podrobný výzkum (24).
31
4 Závěr HA je jednoduchý polysacharid, složený z jednotek disacharidů (1-β-3)-D-glukuronové kyseliny (1-β-4)-N-acetyl-D-glukosaminu, který se objevuje v živočišném organismu, pravděpodobně od vzniku chordy. Evolučně vychází ze stejného polysacharidu jako celulóza nebo chitin. Jeho délka může dosáhnout až průměru erytrocytu (10 000 jednotek, 4 000 kDA) (2). Jeho zobrazení umožňují techniky buněčné frakcionace, radiolabeling, autoradiografie a v moderní době zejména elektronová mikroskopie a fluorescenční mikroskopie, využívající značení částečkami zlata či specifickými fluorescenčními sondami (4). Syntézu HA umožňují enzymy Has1, 2, 3 (7). Metabolismus HA bývá velmi dynamický, za den se vymění až 1/3 jeho celkového množství v lidském těle. K jeho degradaci dochází především ve slezině, lymfatických uzlinách a v tkáních, v nichž je nezbytným stavebním prvkem (chrupavka). Tento proces umožňují extracelulární i intracelulární enzymy hyal1, 2, 3 a uplatňují se při něm také ROS. Pro regulaci katabolismu HA je klíčová jeho interakce s receptorem CD44 (2). HMW HA váže značné množství vody, je nezbytnou stavební složkou některých tkání a je také protizánětlivým signalizačním faktorem. Naopak LMW HA narušuje integritu tkání a indukuje prozánětlivé působení (1). V lidské ontogenezi hraje velmi důležitou úlohu, už od stadia oocytu. Nachází se v zóně pellucida, kde brání průniku spermií (3). Při vývoji plodu se akumuluje okolo buněk, tvoří kolem nich nepropustný plášť a brání jejich diferenciaci. S postupující ontogenezí HA v embryu velmi rychle ubývá, rozmanité růstové faktory následně pronikají k buňkám a stimulují jejich diferenciaci a proliferaci, dochází tak k vývoji tkání, orgánů a orgánových systémů a mezi buňkami se vytváří adherentní spoje udržující integritu tkání (6). V postnatálním vývoji se HA nachází především v tkáních jako je chrupavka, sklivec či kůže, kde váže značné množství vody a ochraňuje tak buňky v těchto oblastech před mechanickým poškozením (2). Umožňuje expanzi Graafova folikulu a fyziologickou ovulaci oocytu do vejcovodu (3). Intracelulárně ovlivňuje uspořádání cytoskeletu, aktivitu tyrosin kinázových receptorů regulujících buněčný cyklus, průběh buněčného dělení i samotný růst buňky. V pericelulárním prostoru ovlivňuje vznik a pohyb lipidových raftů. Tyto komplexy pak umožňují kolokalizaci receptoru CD44 s dalšími receptory (např.: ErbB2 či EMMPRIN) a regulují tak signalizaci buněk prostřednictvím těchto receptorů (4). Extracelulární signalizací hlavně prostřednictvím receptorů CD44 a RHAMM ovlivňuje proliferaci, adhezi a migraci buněk, angiogenezi a imunitní funkce organismu (10). Díky těmto vlastnostem je ideálním nástrojem rakovinného bujení působícím proti obraně vlastního těla i chemoterapeutických látek. Jeho akumulace je ve všech typech nádorů
32
špatným prognostickým markerem. Vede k agresivnímu onkogenetickému vývoji, proliferaci a metastázování nádoru. Mnohdy způsobuje vznik chemorezistence nádoru vůči běžně používaným léčivům (9). Jeho mechanismy působení jsou téměř stejné jak v solidních, tak v leukemických nádorech. Nádor sám se tak chová jako jakýsi organismus, který si sám řídí produkci HA pomocí jeho interakce s CD44 a působením některých cytokinů. Indukuje vznik speciálních imunitních buněk, které produkují tyto potřebné zánětlivé cytokiny, v místě nádoru tak vzniká chronický zánět. Aktivované makrofágy jsou brzy vyčerpané a nemohou již organismus bránit (23). Kolem buněk nádoru vzniká hyaluronanový plášť, který zachycuje růstové faktory a tak dochází ke stimulaci proliferace nádoru a vytváření nových krevních kapilár (angiogenezi). V cytoplazmatické membráně buněk dochází ke vzniku lipidových raftů, v nichž je HA kolokalizován s dalšími receptory regulujícími například buněčný cyklus (ErbB) a aktivitu MCT transportérů (EMMPRIN) (4). Tak může dojít nejen k neregulované proliferaci nádoru, ale také ke vzniku příhodného mikroprostředí nádoru. V něm je zvýšená glykolytická aktivita a snížená respirace buněk, což vede k hypoxii a vylučování laktátu, tak vzniká charakteristické kyselé pH a dochází k defektům na mitochondriích, které vedou ke vzniku ROS a ty způsobují další mutace genetického materiálu rakovinných buněk (Warburgův efekt) (20,27). Interakce HA s CD44 může také způsobovat výměnu Na+/H+ iontů, čímž opět dochází ke vzniku kyselého prostředí. Kyselé extracelulární prostředí aktivuje Hyal2, ta štěpí HA na menší fragmenty, které dále stimulují zánět i onkogenetický vývoj (18). Působením na vnitřní cytoskeletální struktury buněk HA umožňuje migraci nádorových buněk a následné metastázování rakovinného bujení. Aktivací PI3/Akt pathway indukuje přežívání buněk navzdory extracelulárním apoptotickým signálům (24). Aktivuje ABC transportéry, které umožňují eflux toxických látek ven z buněk, čímž je brání proti působení chemoterapeutik (20). Hyaluronanový plášť také maskuje některé receptory, proti kterým bývá normálně cílená chemoterapeutická léčba (např.: ErbB) a dokonce může i zamezit průniku chemoterapeutika do buňky (24). Proto je velmi důležité diagnostikovat nádor brzy, ve chvíli, kdy je pravděpodobné, že ještě nevznikly žádné nádorové kmenové buňky, ve chvíli, kdy není nadměrně zmutovaný a tudíž se nebrání všem možným regulacím a lékům a ve chvíli, kdy ještě nemigruje do okolních (i vzdálených) tkání. Jakmile dojde k metastázování nádorů, bývá boj pacienta o přežití většinou již prakticky prohraný. Některé léky mohou ještě prodloužit jeho život, ale současnými metodami již nikdy není možné vrátit jej do plnohodnotného života. Avšak pokud bychom zamezili interakci HA s CD44 a kombinovali tuto terapii nejlépe s chemoterapeutiky podávanými v liposomových váčcích či jiných transportních systémech, které propustí lék až při kontaktu s rakovinnou buňkou, byla by i u takto nemocných možná naprosto elegantní, jednoduchá a rychlá destrukce rakovinného bujení, která by 33
pravděpodobně ani nevyžadovala operaci, či ozařování a ve srovnání s těmito metodami by možná nepřinášela běžné dlouhodobé a nebezpečné vedlejší účinky. Bohužel vývoj liposomových váčků je teprve v začátcích. Nicméně, co se týče přerušení interakce HA s CD44, experimenty na in vivo modelech lidských nádorů již přinesly slibné výsledky. Zajímavý je zejména účinek inhibitoru Has 4-MU. Ten lze použít jako chemosensitizér pokročilých rakovinných bujení vůči lékům, na něž si tyto nádory již dříve vyvinuly rezistenci (30). Další možností, jak znemožnit zmíněnou interakci je pozměnění chemické struktury CD44, nebo zablokování vazebného místa pro HA. Zajímavé výsledky v tomto směru přinesly pokusy se specifickými oligomery HA, které extracelulární vazbou na zmíněný receptor znemožní intracelulární interakci CD44 s HA, a tak dojde k přerušení signalizace pro přežití zprostředkovávané aktivací PI3/Akt pathway. Opět je většinou nutná kombinace této terapie s klasickými chemoterapeutickými prostředky. Přesné mechanismy tohoto působení nejsou zatím známé (20). Je zřejmé, že HA naprosto klíčovým způsobem ovlivňuje průběh onkogeneze. Toto zjištění má obrovský význam pro léčbu rakoviny, avšak možnosti jeho využití si vyžadují ještě další poměrně rozsáhlý výzkum.
34
Seznam zkratek 4-MU – 4methylumbelliferon ABC transportéry – ATP vázající transportéry ADAM – rodina extracelulárních metaloproteináz štěpících HA BCRP – „breast cancer resistance protein” bFGF - základní fibroblastový růstový faktor cAMP – cyklický adenosin monofosfát (2. posel) CD44 - hyaladherin EGF – epidermální růstový faktor EMMPRIN (CD147) – extracelulární indukční faktor metaloproteináz v matrix ErbB2 (Her2) – receptor pro epidermální růstový faktor Erk – extracelulární signálně-regulační kináza FSH – folikulostimulační hormon G2M – kotrolní uzel druhé generativní fáze buněčného cyklu HA – hyaluronan, „hyaluronic acid“ HAS1, 2, 3 – geny pro hyaluronan syntetázy Has1, 2, 3 – hyaluronan syntetázy HARE – HA receptor pro endocytózu HMW HA – hyaluronan o vysoké molekulové hmotnosti, Hyal1, 2, 3 – enzymy hyaluronidázy HYAL1, 2, 3, 4 – geny pro hyaluronidázy IGF-1 - insulinu podobný růstový faktor-1 IL – interleukin iNOS – inducibilní NO syntéza LMW HA – hyaluronan o nízké molekulové hmotnosti, LYVE-1 – Lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor 1 MAPK – mitogenem aktivovaná proteinkináza MCT – monokarboxylátové transportéry MMP – metaloproteinázy MMW HA – hyaluronan o střední molekulové hmotnosti NFκB – jaderný transkripční faktor PDGF – od destiček odvozený růstový faktor PH-20 – hyaluronidáza produkovaná ve spermiích PHYAL – gen pro hyaluronidázu PH-20 PI3/Akt – kinázová signalizační dráha podporující přežívání buněk PIP2 – 4,5 bisfosfát
35
RHAMM – receptor, jehož prostřednictvím hyaluronan moduluje motilitu buněk Rho, Rac1, Ras – rodiny malých GTPáz ROS – (reactive oxygen species ) volné kyslíkové radikály SCC – spinocelulární karcinom – 2. Nejčastější typ rakoviny kůže SPAM – genová sekvence pro hyaluronidázu Src – nereceptorická tyrosin kináza SV3T3 – linie myších buněk, infikovaných transgenním opičím virem TGF6, β - transformující růstový faktor 6, β Tiam - T-lymfocytární invazivní a metastázový factor TLR – „Toll like receptor“ TNF (α) – rakovinu nekrotizující faktor (α) TSG6 - rakovinný nekrotizující faktor 6
36
Seznam citací 1 GÜNTHERT, U., 1991: A new variant of glycoprotein CD44 confers metastatic potential to rat carcinoma cells. Cell. roč. 65, č. 1, s. 13-24. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/009286749190403L 5 EVANKO, S. P., WIGHT, T. N., 1999: Intracellular Localization of Hyaluronan in Proliferating Cells. Journal of Histochemistry. roč. 47, č. 10, s. 1331-1341. Dostupné z: http://jhc.sagepub.com/lookup/doi/10.1177/002215549904701013 8 PASQUALI-RONCHETTI, I., QUAGLINO, D., MORI, 1997: Hyaluronan Phospholipid Interactions. Journal of Structural Biology., roč. 120, č. 1, s. 1-10. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1047847797939083 9 SIRONEN, R.K., TAMMI, M., TAMMI, R., 2011: Hyaluronan in human malignancies. Experimental Cell Research. roč. 317, č. 4, s. 383-391. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S001448271000546X 10 TURLEY, E. A., 2002: Signaling Properties of Hyaluronan Receptors. Journal of Biological Chemistry. roč. 277, č. 7, s. 4589-4592. Dostupné z: http://www.jbc.org/cgi/doi/10.1074/jbc.R100038200 11 KNUDSON, W., CHOW, G., KNUDSON, C., 2002: CD44-mediated uptake and degradation of hyaluronan. Matrix Biology. roč. 21, č. 1, s. 15-23. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0945053X0100186X 13 KOHDA, D., MORTON, C. J., PARKAR, A. A. 1996: Solution Structure of the Link Module: A Hyaluronan-Binding Domain Involved in Extracellular Matrix Stability and Cell Migration. Cell. 1996, roč. 86, č. 5, s. 767-775. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0092867400801518 14 TAMMI, R. H., KULTTI, A., KOSMA, V.-M., 2008: Hyaluronan in human tumors: Pathobiological and prognostic messages from cell-associated and stromal hyaluronan. Seminars in Cancer Biology. roč. 18, č. 4, s. 288-295. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1044579X08000266 15 ITANO, N., 2004: Selective Expression and Functional Characteristics of Three Mammalian Hyaluronan Synthases in Oncogenic Malignant Transformation. Journal of Biological Chemistry. roč. 279, č. 18, s. 18679-18687. Dostupné z: http://www.jbc.org/cgi/doi/10.1074/jbc.M313178200 16 LEE, J., SPICER, A. P., 2000: Hyaluronan: a multifunctional, megaDalton, stealth molecule. Current Opinion in Cell Biology. roč. 12, č. 5, s. 581-586. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0955067400001356
37
17 VOELCKER, V., GEBHARDT, C., AVERBECK, M., 2008: Hyaluronan fragments induce cytokine and metalloprotease upregulation in human melanoma cells in part by signalling via TLR4. Experimental Dermatology. roč. 17, č. 2, s. 100–107. Dostupné z: http://doi.wiley.com/10.1111/j.1600-0625.2007.00638.x 18 SUGAHARA, K. N., 2005: Tumor Cells Enhance Their Own CD44 Cleavage and Motility by Generating Hyaluronan Fragments. Journal of Biological Chemistry. roč. 281, č. 9, s. 5861-5868. Dostupné z: http://www.jbc.org/cgi/doi/10.1074/jbc.M506740200 19 ZENG, C., TOOLE, B., 1998: Inhibition of tumor growth in vivo by hyaluronan oligomers. Int J Cancer. roč. 77, č. 3, s. 396-401. Dostupné z: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/%28SICI%2910970215%2819980729%2977:3%3C396::AID-IJC15%3E3.0.CO;2-6/abstract?globalMessage=0 20 TOOLE, B. P., SLOMIANY, M. G., 2008: Hyaluronan, CD44 and Emmprin: Partners in cancer cell chemoresistance. Drug Resistance Updates. roč. 11, č. 3, s. 110-121. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1368764608000216 21 MYTAR, B., SIEDLAR, M., WOLOSZYN, M., 2001: Cross-talk between human monocytes and cancer cells during reactive oxygen intermediates generation: The essential role of hyaluronan. International Journal of Cancer. roč. 94, č. 5, s. 727-732. Dostupné z: http://doi.wiley.com/10.1002/ijc.1530 22 CALABRO, A., 2002: Characterization of hyaluronan synthase expression and hyaluronan synthesis in bone marrow mesenchymal progenitor cells: predominant expression of HAS1 mRNA and up-regulated hyaluronan synthesis in bone marrow cells derived from multiple myeloma patients. Blood. roč. 100, č. 7, s. 2578-2585. Dostupné z: http://www.bloodjournal.org/cgi/doi/10.1182/blood-2002-01-0030 23 KUANG, D. M., WU, Y., CHEN, N., 2007: Tumor-derived hyaluronan induces formation of immunosuppressive macrophages through transient early activation of monocytes. Blood. roč. 110, č. 2, s. 587-595. Dostupné z: http://www.bloodjournal.org/cgi/doi/10.1182/blood-2007-01-068031 24 PáLYI-KREKK, Z., BAROK, M., ISOLA, J., 2007: Hyaluronan-induced masking of ErbB2 and CD44-enhanced trastuzumab internalisation in trastuzumab resistant breast cancer. European Journal of Cancer. 2007, roč. 43, č. 16, s. 2423-2433. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0959804907006466 25 EVANS, E. A, ZHANG, H., MARTIN-DELEON, P. A., 2003: SPAM1 (PH-20) protein and mRNA expression in the epididymides of humans and macaques: utilizing laser microdissection/RT-PCR. Reproductive Biology and Endocrinolog. roč. 1, č. 1, s. 1-54. Dostupné z: http://www.RBEj.com/content/1/1/54
38
26 KREJSEK, J., KOPECKÝ, O., 2004: Klinická imunologie. 1. vyd., Hradec Králové, NUCLEUS HK, 941 s., ISBN 80-862-2550-X. 27 WU, W., ZHAO, S., 2012: Metabolic changes in cancer: beyond the Warburg effect. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. roč. 45, č. 1, s. 18-26. Dostupné z: http://abbs.oxfordjournals.org/cgi/doi/10.1093/abbs/gms104 29 GILG, A. G., TYE, S. L., TOLLIVER, L. B., 2008: Targeting Hyaluronan Interactions in Malignant Gliomas and Their Drug-Resistant Multipotent Progenitors. Clinical Cancer Research. roč. 14, č. 6, s. 1804-1813. Dostupné z: http://clincancerres.aacrjournals.org/cgi/doi/10.1158/1078-0432.CCR-07-1228 30 NAKAZAWA, H., YOSHIHARA, S., KUDO, D., 2006: 4-methylumbelliferone, a hyaluronan synthase suppressor, enhances the anticancer activity of gemcitabine in human pancreatic cancer cells. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. roč. 57, č. 2, s. 165-170. Dostupné z: http://www.springerlink.com/index/10.1007/s00280-005-0016-5 31 DEB T.gB., DATTA, K. 1996: Molecular Cloning of Human Fibroblast Hyaluronic Acidbinding Protein Confirms Its Identity with P-32, a Protein Co-purified with Splicing Factor SF2. Journal of Biological Chemistry. roč. 271, č. 4, s. 2206-2212. Dostupné z: http://www.jbc.org/cgi/doi/10.1074/jbc.271.4.2206 32 GRAMMATIKAKIS, A. 1995: A Novel Glycosaminoglycan-binding Protein Is the Vertebrate Homologue of the Cell Cycle Control Protein, Cdc37. Journal of Biological Chemistry. 1995, roč. 270, č. 27, s. 16198-16205. Dostupné z: http://www.jbc.org/cgi/doi/10.1074/jbc.270.27.16198 33 TAMMI, R., 1991: Degradation of Newly Synthesized High Molecular Mass Hyaluronan in the Epidermal and Dermal Compartments of Human Skin in Organ Culture. Journal of Investigative Dermatology. roč. 97, č. 1, s. 126-130. Dostupné z: http://www.nature.com/doifinder/10.1111/1523-1747.ep12478553 34 AGREN, U.M., TAMMI, M., TAMMI, R., 1995: Hydrocortisone regulation of hyaluronan metabolism in human skin organ culture. Journal of Cellular Physiology. roč. 164, č. 2, s. 240-248. Dostupné z: http://doi.wiley.com/10.1002/jcp.1041640204 35 TAMMI, M., TAMMI, R., 1991: Correlations between hyaluronan and epidermal proliferation as studied by [3H]glucosamine and [3H]thymidine incorporations and staining of hyaluronan on mitotic keratinocytes. Experimental cell research. 1991, roč. 195, č. 2, s. 524527. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/001448279190405J 36 PASONEN-SEPPÄNEN, S., KARVINEN, S., TÖRRÖNEN, K., 2003: EGF Upregulates, Whereas TGF-β Downregulates, the Hyaluronan Synthases Has2 and Has3 in Organotypic
39
Keratinocyte Cultures: Correlations with Epidermal Proliferation and Differentiation. Journal of Investigative Dermatology. roč. 120, č. 6, s. 1038-1044. Dostupné z: http://www.nature.com/doifinder/10.1046/j.1523-1747.2003.12249.x 37 TAMMI, R., RIPELLINO, J. A., MARQUOLIS, R. U., 1989: Hyaluronate accumulation in human epidermis treated with retinoic acid in skin organ culture. The journal of investigative dermatology. 1989, 92(3), s. 326-32. Dostupné z: http://www.nature.com/doifinder/10.1111/1523-1747.ep12277125 38 JIANG, D., LIANG, J., NOBLE, P. W., 2007: Hyaluronan in Tissue Injury and Repair. Annual Review of Cell and Developmental Biology. roč. 23, č. 1, s. 435-461. Dostupné z: http://www.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.cellbio.23.090506.123337 40 SCOTT, J.E., 1989: Secondary structures in hyaluronan solutions: chemical and biological implications. Ciba Foundation symposium. 1989, 143:6-15, 15-20, 281-5. 41 STERN, R., 2005: Hyaluronan metabolism: a major paradox in cancer biology. Pathologie Biologie. roč. 53, č. 7, s. 372-382. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0369811404003104 42 LIU, N. 2003: Metabolism of macromolecules in tissue. Lymphatic research and biology. roč. 1, č. 1, s. 67-70. 43 ITANO, N., 2004: Three Isoforms of Mammalian Hyaluronan Synthases Have Distinct Enzymatic Properties. Journal of Biological Chemistry. roč. 274, č. 35, s. 25085-25092. Dostupné z: http://www.jbc.org/cgi/doi/10.1074/jbc.274.35.25085 44 CHEANG, M. C. U., CHIA, S. K., VODUC, D., 2009: Ki67 Index, HER2 Status, and Prognosis of Patients With Luminal B Breast Cancer. Journal of the National Cancer Institute. roč. 101, č. 10, s. 736-750. Dostupné z: http://jnci.oxfordjournals.org/cgi/doi/10.1093/jnci/djp082 45 BOURGUIGNON, L. Y. W., ZHU, H., SHAO, L., 1999: Migration in metastatic breast cancer cells. Cell motility and the cytoskeleton. roč. 43, č. 4, s. 269–287. 46 BOURGUIGNON, L. Y. W., 2000: CD44 Interaction with Tiam1 Promotes Rac1 Signaling and Hyaluronic Acid-mediated Breast Tumor Cell Migration. Journal of Biological Chemistry. roč. 275, č. 3, s. 1829-1838. Dostupné z: http://www.jbc.org/cgi/doi/10.1074/jbc.275.3.1829 47 LELIÈVRE, S. A., BISSELL, M.J., 1998: Communication between the cell membrane and the nucleus: role of protein compartmentalization. Journal of Cellular Biochemistry. Supplement. roč. 30, č. 31, s. 250-63. 48 GURSKI, L. A., XU, X., LABRADA, L. N., 2012: Hyaluronan (HA) Interacting Proteins RHAMM and Hyaluronidase Impact Prostate Cancer Cell Behavior and Invadopodia Formation in 3D HA-Based Hydrogels. PLoS ONE. roč. 7, č. 11. Dostupné z: http://dx.plos.org/10.1371/journal.pone.0050075 40
49 HODGE-DUFOUR, J., NOBLE, P. W., HORTON, M.R., 1997: Induction of IL-12 and chemokines by hyaluronan requires adhesion-dependent priming of resident but not elicited macrophages. The journal of the imunology. roč. 159., č. 5, s. 2492-2500. 50 BECK-SCHIMMER, B., OERTLI, B., PASCH, T., 1998: Hyaluronan induces monocyte chemoattractant protein-1 expression in renal tubular epithelial cells. Journal of the America society of nephrology. roč. 9, č. 12, s. 2283-2290. 51 EL-MEZAYEN, H. A., EL-SHAHAT, A. T., DARWISH, H., 2013: Development of a novel metastatic breast cancer score based on hyaluronic acid metabolism. Medical Oncology. roč. 30, č. 1. Dostupné z: http://link.springer.com/10.1007/s12032-012-0404-8 52 LIU, N., GAO, F., HAN, Z., 2001: Hyaluronan synthase 3 overexpression promotes the growth of TSU prostate cancer cells. Cancer research. roč. 61, č. 13, s. 5207-5214. Dostupné z: http://cancerres.aacrjournals.org/content/61/13/5207.long 53 KOBAYASHI, N., MIYOSHI, S., MIKAMI, T., 2010: Hyaluronan deficiency in tumor stroma impairs macrophage trafficking and tumor neovascularization. Cancer research. roč. 61, č. 70, 7073–7083. Dostupné z: http://cancerres.aacrjournals.org/cgi/doi/10.1158/0008-5472.CAN-09-4687 54 FIEBER, C. 2004: Hyaluronan-oligosaccharide-induced transcription of metalloproteases. Journal of Cell Science. roč. 117, č. 2, s. 359-367. Dostupné z: http://jcs.biologists.org/cgi/doi/10.1242/jcs.00831 55 FUJISAKI, T., TANAKA, Y., FUJII, K., 1999: CD44 stimulation induces integrin-mediated adhesion of colon cancer cell lines to endothelial cells by up-regulation of integrins and c-Met and activation of integrins. Cancer research. 1999, roč. 59, č. 17, s. 4427-4434. 56 SUGAHARA, K. N., 2003: Hyaluronan Oligosaccharides Induce CD44 Cleavage and Promote Cell Migration in CD44-expressing Tumor Cells. Journal of Biological Chemistry. roč. 278, č. 34, s. 32259-32265. Dostupné z: http://www.jbc.org/cgi/doi/10.1074/jbc.M300347200 57 WEST, D., HAMPSON, I., ARNOLD, F., 1985: Angiogenesis induced by degradation products of hyaluronic acid. Science. roč. 228, č. 4705, s. 1324-1326. Dostupné z: http://www.sciencemag.org/cgi/doi/10.1126/science.2408340 58 GHATAK, S., 2002: Hyaluronan Oligosaccharides Inhibit Anchorage-independent Growth of Tumor Cells by Suppressing the Phosphoinositide 3-Kinase/Akt Cell Survival Pathway. Journal of Biological Chemistry. roč. 277, č. 41, s. 38013-38020. Dostupné z: http://www.jbc.org/cgi/doi/10.1074/jbc.M202404200 59 JIN, L., HOPE, K. J., ZHAI, Z., 2006: Targeting of CD44 eradicates human acute myeloid leukemic stem cells. Nature Medicine. roč. 12, č. 10, s. 1167-1174. Dostupné z: http://www.nature.com/doifinder/10.1038/nm1483 41
60 MAXWELL, C. A., 2004: RHAMM expression and isoform balance predict aggressive disease and poor survival in multiple myeloma. Blood. roč. 104, č. 4, s. 1151-1158. Dostupné z: http://www.bloodjournal.org/cgi/doi/10.1182/blood-2003-11-4079 61 ITANO, N., 2002: Abnormal accumulation of hyaluronan matrix diminishes contact inhibition of cell growth and promotes cell migration. Proceedings of the National Academy of Sciences. roč. 99, č. 6, s. 3609-3614. Dostupné z: http://www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.052026799 62 ZOLTAN-JONES, A., 2003: Elevated Hyaluronan Production Induces Mesenchymal and Transformed Properties in Epithelial Cells. Journal of Biological Chemistry. roč. 278, č. 46, s. 45801-45810. Dostupné z: http://www.jbc.org/cgi/doi/10.1074/jbc.M308168200 63 ZEMBALA, M., SIEDLAR, M., RUGGIERO, I., 1994: The MHC class-II and CD44 molecules are involved in the induction of tumour necrosis factor (TNF) gene expression by human monocytes stimulated with tumour cells. International Journal of Cancer. roč. 56, č. 2, s. 269-274. Dostupné z: http://doi.wiley.com/10.1002/ijc.2910560221 64 MCKEE, C. M., PENNO, M. B., COWMAN, M., 1996: Hyaluronan (HA) fragments induce chemokine gene expression in alveolar macrophages. The role of HA size and CD44. Journal of Clinical Investigation. roč. 98, č. 10, s. 2403-2413. Dostupné z: http://www.jci.org/articles/view/119054 66 BOURGUIGNON, L. Y. W., 2004: CD44 Interaction with Na -H Exchanger (NHE1) Creates Acidic Microenvironments Leading to Hyaluronidase-2 and Cathepsin B Activation and Breast Tumor Cell Invasion. Journal of Biological Chemistry. roč. 279, č. 26, s. 2699127007. Dostupné z: http://www.jbc.org/cgi/doi/10.1074/jbc.M311838200 67 STAUDER, R., 1996: Different CD44 splicing patterns define prognostic subgroups in multiple myeloma. Blood. roč. 88, č. 8, s. 3101-3108. 68 KOYAMA, H., KOBAYASHI, N., HARADA M., 2008: Significance of Tumor-Associated Stroma in Promotion of Intratumoral Lymphangiogenesis. The American Journal of Pathology. roč. 172, č. 1, s. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0002944010614733 69 DAHL, IM, I TURESSON a E HOLMBERQ. 1999: Serum Hyaluronan in Patients With Multiple Myeloma: Correlation With Survival and Ig Concentration. Blood. roč. 93, č. 12, s. 4144-4148. Dostupné z: http://bloodjournal.hematologylibrary.org/content/93/12/4144.long
42
Internetové zdroje 2 HASCALL, V., LAURENT, T., 1997: Hyaluronan structure and physical properties [online]. [cit. 2013-02-09]. Dostupné z: http://glycoforum.gr.jp/science/hyaluronan/HA01/HA01E.html 3 SALUSTRI, A., FULOP, C., 1998: Role of Hyaluronan during ovulation and fertilization [online]., [cit. 2013-02-09]. Dostupné z: http://glycoforum.gr.jp/science/hyaluronan/HA03/HA03E.html 4 EVANKO, S., WIGHT, T., 2001: Intracelular hyaluronan [online]., [cit. 2013-02-09]. Dostupné z: http://glycoforum.gr.jp/science/hyaluronan/HA20/HA20E.html 5 TAMMI, R., TAMMI, M., 1998: HA in the Epidermis [online]., [cit. 2013-02-09]. Dostupné z: http://glycoforum.gr.jp/science/hyaluronan/HA04/HA04E.html 7 SPICER, A., MCDONALD, J., 1998: Eucaryotic HA synthese [online]., [cit. 2013-02-09]. Dostupné z: http://glycoforum.gr.jp/science/hyaluronan/HA07/HA07E.html 12 HARDINGHAM, T., 1998: Cartilage: Aggrecan - link protein, hyaluronan aggregates [online]., [cit. 2013-02-09]. Dostupné z: http://glycoforum.gr.jp/science/hyaluronan/HA05/HA05E.html 28 MASOPUST, J., 2008: Kmenové buňky a vznik nádorového onemocnění [online]. [cit. 2013-02-09]. Dostupné z: http://www.roche-diagnostics.cz/download/la/0208/kmenove.pdf 65 ADAM, Z., VORLÍČEK, J., MARESCHOVÁ, U., 1996: Mnohočetný myelom Informace pro pacienty a jejich blízké. Fakultní nemocnice Brno [online]., [cit. 2013-03-18]. Dostupné z: http://www.fnbrno.cz/mnohocetny-myelom/t1286
43
