MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie Oddělení genetiky a molekulární biologie

MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie Oddělení genetiky a molekulární biologie

Oportunní virové infekce u pacientů po transplantaci hematopoetických kmenových buněk

Brno 2010

Jana Zemanová

Poděkování Na tomto místě bych chtěla poděkovat vedoucí své diplomové práce Mgr. Martině Lengerové, Ph.D. za její odborné rady při řešení dané problematiky a za odbornou revizi celé práce. Dále bych chtěla poděkovat Mgr. Kristýně Hrnčířové a Mgr. Pavlíně Volfové za jejich podnětné rady a kolektiv, ve kterém se mi dobře pracovalo. 2

OBSAH 1 ÚVOD A PROBLEMATIKA.............................................................................. 6 1.1 PROTINÁDOROVÁ TERAPIE ................................................................. 6 1.2 VIROVÉ INFEKCE ..................................................................................... 7 1.2.1 Lidský cytomegalovirus ........................................................................... 7 1.2.1.1 Struktura CMV................................................................................... 8 1.2.1.2 Virový genom .................................................................................... 9 1.2.1.3 Infekce.............................................................................................. 11 1.2.1.4 Latence, reaktivace, superinfekce.................................................... 11 1.2.1.5 Léčba a rozvoj rezistence................................................................. 14 1.2.1.6 Genotypizace.................................................................................... 16 1.3 METODY DETEKCE LIDSKÉHO CYTOMEGALOVIRU ................ 18 1.3.1 Přímá detekce ......................................................................................... 19 1.3.1.1 Kultivační metody............................................................................ 19 1.3.1.2 Mikroskopie ..................................................................................... 19 1.3.1.3 Cytologie a histologie ...................................................................... 20 1.3.1.4 Průkaz antigenu................................................................................ 20 1.3.1.5 Průkaz nukleových kyselin .............................................................. 20 1.3.1.6 Další molekulárně biologické metody ............................................. 22 1.3.2 Nepřímá detekce - sérologické metody.................................................. 25 2 CÍLE PRÁCE ..................................................................................................... 27 3 MATERIÁL A METODY................................................................................. 28 3.1 MATERIÁL ................................................................................................ 28 3.1.1 Detekce rezistence.................................................................................. 28 3.1.2 Genotypizace .......................................................................................... 29 3.1.3 Ostatní používaný materiál..................................................................... 30 3.1.4 Přístroje .................................................................................................. 31 3.1.5 Software použitý při zpracování diplomové práce ................................ 32 3

3.2 METODY .................................................................................................... 32 3.2.1 Metody použité pro přípravu pozitivních kontrol k detekci rezistence . 32 3.2.1.1 Příprava PCR produktu pro klonování ............................................ 32 3.2.1.2 Purifikace PCR produktu ................................................................. 33 3.2.1.3 Ligace............................................................................................... 33 3.2.1.4 Příprava kultivačního média ............................................................ 33 3.2.1.5 Transformace buněk ........................................................................ 34 3.2.1.6 BLUE-WHITE Screening................................................................ 34 3.2.1.7 Detekce vnesené DNA v plazmidu.................................................. 35 3.2.1.8 Izolace plazmidové DNA................................................................. 36 3.2.1.9 Uchování transformovaných bakterií .............................................. 37 3.2.2 Metody použité při detekci rezistence.................................................... 37 3.2.2.1 Testování nových primerů pro HRM............................................... 37 3.2.2.2 Optimalizace protokolu pro HRM ................................................... 37 3.2.2.3 Sekvenování..................................................................................... 38 3.2.3 Metody použité pro genotypizaci........................................................... 39 3.2.3.1 Optimalizace PCR pro geny použité ke genotypizaci ..................... 39 3.2.3.2 Sekvenování..................................................................................... 39 3.2.3.3 Restrikční štěpení pro genotypizaci genu UL55.............................. 40 3.2.3.4 Klonování......................................................................................... 40 4 VÝSLEDKY........................................................................................................ 42 4.1 DETEKCE REZISTENCE V GENU UL97............................................. 42 4.1.1 Výsledky na plazmidech ........................................................................ 42 4.1.2 Optimalizace nových primerů pro HRM................................................ 44 4.1.3 Optimalizace protokolu pro HRM ......................................................... 46 4.1.4 Detekce rezistentního CMV – výsledky na klinických vzorcích........... 49 4.2 GENOTYPIZACE CMV V OPAKOVANÝCH EPIZODÁCH REAKTIVACE .................................................................................................. 50 4.2.1 Genotypizace genu UL55 restrikčním štěpením.................................... 51 4

4.2.2 Genotypizace genu UL55 sekvenováním............................................... 54 4.2.3 Genotypizace genu UL144..................................................................... 55 4.2.4 Genotypizace genu UL1......................................................................... 55 4.2.5 Výsledky genotypizace CMV – shrnutí ................................................. 57 5 DISKUZE ............................................................................................................ 60 5.1 REZISTENCE............................................................................................. 60 5.2 GENOTYPIZACE ...................................................................................... 61 6 ZÁVĚR ................................................................................................................ 63 7 SUMMARY......................................................................................................... 64 8 LITERATURA ................................................................................................... 65 PŘÍLOHY .............................................................................................................. 75

5

1 ÚVOD A PROBLEMATIKA 1.1 PROTINÁDOROVÁ TERAPIE V současné době patří leukémie stále k závažným onemocněním krvetvorby. U leukémií dochází k zmnožení bílých krvinek, které nevykonávají svou obrannou funkci a naopak utlačují zdravé krvetvorné i jiné buňky v lidském těle. Existuje několik typů léčby, jejichž společným cílem je odstranit z těla maligní buňky a tím zastavit jejich nekontrolovatelné dělení. Jednou z možností jsou transplantace. K transplantaci při leukémii mohou být použity buňky kostní dřeně (Bone Marrow Transplantation – BMT) nebo krvetvorné kmenové buňky periferní krve (Peripheral Blood Stem Cell Transplantation – PBSCT). PBSCT je metodou mladší ale v současné době preferovanější. Bylo totiž mj. prokázáno, že buňky periferní krve jsou schopné přežít v příjemci mnohem déle než buňky kostní dřeně. Výhodou PBSCT je, že příjemce dostává přibližně desetkrát vyšší dávku T a B lymfocytů než při BMT, čímž dochází k rychlejší obnově imunitního systému a tím i ke zkrácení terapie po transplantaci (Blaise et al., 2000). Vyšší dávka lymfocytů také značně zvyšuje odolnost pacienta k oportunním infekcím (Storek et al., 2000), jejichž rozvoj po transplantaci je nejčastější komplikací léčby (Maiolino et al., 2003). Největší rozdíl mezi četností infekcí po PBSCT a BMT byl zaznamenán u mykotických infekcí, kde je jejich četnost více jak pětkrát vyšší po BMT (Storek et al., 2001). Období po transplantaci rozdělujeme podle rizika rozvoje infekčních onemocnění do několika fází:


Časná fáze (fáze Pre-engraftment – před přihojením štěpu): období přibližně do 1 měsíce po transplantaci o Častý výskyt Pre-engraftment syndromu (neinfekční horečka, zarudnutí kůže, poškození plic...) (Lee et al., 2008) o Infekce způsobují převážně bakterie (běžné Gram pozitivní a Gram negativní bakterie) méně se vyskytují mykotické (Candida spp., Aspergillus spp.) a virové infekce (Ghosh et al., 2000)
Střední fáze (fáze Post-engraftment – po přihojení štěpu): období od 30 do 100 dne po transplantaci o Výskyt akutní GvHD (Graft versus Host Disease – reakce štěpu proti hostiteli) je hlavní imunokompromitující faktor především po alogení transplantaci

6

o Infekce způsobují především viry (Cytomegalovirus - CMV, Respirační Syncytiální virus - RSV) a mykotické patogeny (Aspergillus spp., Pneumocystis carinii) (Leung et al., 1999)
Pozdní fáze: období po 100 dni po transplantaci o Výskyt chronické GvHD a s ní spojené infekce o Infekce způsobují viry (Varicella-Zoster virus - VZV, Herpes Simplex virus - HSV, pozdní CMV, virus Epsteina-Barrové - EBV, adenovirus), mykotické patogeny (Candida spp., Aspergillus spp.) (Post et al., 2007) i bakterie (Haemophilus influenzae, Streptococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas spp.) (Escuissato et al., 2005)

1.2 VIROVÉ INFEKCE Onkologický pacient je oslaben jak samotným nádorovým procesem tak i následnou léčbou onemocnění. Je proto vystaven vysokému riziku rozvoje oportunních infekcí (virových, bakteriálních a mykotických). Nejčastějším původcem virových infekcí je CMV.

1.2.1 Lidský cytomegalovirus Již v 19. století byly pozorovány velké balónkovité buňky s inkluzemi v ledvinách mrtvě narozených novorozenců, které byly označeny jako cytomegalické (viz Obr. č. 1). Teprve v roce 1921 však bylo poprvé popsáno, že by se na vzniku cytomegalických buněk mohl podílet virus, a proto byl nazván jako cytomegalovirus. Tento název byl poprvé použit v roce 1960. V průběhu dvacátého století byl CMV izolován z řady tkání imunosuprimovaných ale i zdravých osob a často také novorozenců. CMV je herpetický virus, který je členem podčeledi betaherpesvirů. Infikuje epiteliální, endoteliální, nervové buňky, fibroblasty, monocyty a další (Sinzger et al., 1995). Je značně druhově specifický, a proto nejsou pro člověka infekční zvířecí kmeny CMV.

7

Obr. č. 1 Plicní exudát s typickými balónkovitými (owl´s eye) buňkami CMV Převzato z http://www.microbelibrary.org/ASMOnly/details.asp?id=658&Lang=English

CMV je běžným oportunním patogenem člověka, který se u zdravých osob vyskytuje především v latentním stavu. Pokud se u zdravých osob vyskytne akutní CMV infekce, je většinou subklinická, nebo může být v malém množství případů doprovázena např. horečkami, vyrážkou, případně může mít rysy infekční mononukleózy. Naopak u imunosuprimovaných osob může asymptomatická infekce lehce přejít v symptomatickou infekci (CMV onemocnění). V případě osob po BMT je nejčastější akutní CMV syndrom charakterizovaný horečkou, nevolností nebo trombocytopénií. Další klinické syndromy spojené s CMV infekcí osob po BMT jsou pneumonie, gastrointerstinální ulcerace a retinitidy (Ljungman et al., 2006). CMV infekce se podílí také na poškození imunitního systému. Dereguluje buněčný cyklus infikované buňky, čímž brání apoptóze buňky (Poncet et al., 2006). V místě infekce potlačuje prezentaci antigenů, produkuje cytokiny, které ovlivňují maturaci imunokompetentních buněk a aktivují rovněž další makrofágy k roznášení viru. Snižuje aktivitu NK (Natural Killer) buněk a cytotoxických T-lymfocytů (Dunn et al., 2003; Lodoen et al., 2003). Modulace imunitní odpovědi vede k prohloubeni imunosupresivniho stavu s rizikem rozvoje pozdních oportunních infekcí. Závažným problémem je rozvoj GvHD, kde byla souvislost s CMV již dávno prokázána (Miller et al., 1986).

1.2.1.1 Struktura CMV Průměr zralé virové částice je 150 – 200 nm. Virová částice je tvořena ikozaedrální nukleokapsidou o průměru 100 nm. Nukleokapsida je obalena proteinovou vrstvou zvanou tegument. Nad tegumentem se nachází lipidová vrstva s vysokých počtem glykoproteinů určujících imunogenicitu viru. Genom je tvořen dvouřetězcovou DNA o velikosti 230 kbp. 8

Pokud je buněčná kultura infikována CMV, tak produkuje infekční viriony spolu s dalšími dvěma typy morfologických částic: denzními tělísky a neinfekčními virovými částicemi. Neinfekční virové částice jsou defektní partikule tvořené nezralou nukleokapsidou bez DNA. Obsahují virový sestavovací AP (Assembly Protein) protein, který se však ve zralých infekčních virionech nenachází. Denzní tělíska jsou obalené částice bez nukleokapsidy i bez DNA a nejsou schopné replikace. Obsahují některé proteiny tegumentu, především je to pp65. Denzní tělíska jsou schopna doručovat virové proteiny do fibroblastů a do profesionálních antigen prezentujících buněk. Jsou tedy zodpovědná za rozvoj buněčné i humorální imunitní odpovědi, i když nedochází k virové replikaci (Pepperl et al., 2000). Poměr množství těchto tří virových částic závisí na virovém kmeni. Ikozaedrická nukleokapsida infekčních i defektních částic obsahuje 5 proteinů, z nichž některé hrají důležitou roli při maturaci. Tegument je spojovací amorfní část virionu obsahující řadu proteinů s dosud neznámou funkcí. Některé proteiny hrají důležitou roli při vstupu do buňky. Jiné ovlivňují expresi virových genů, kompletaci viru nebo zajišťují únik před imunitním systémem. Lipidová vrstva nad tegumentem obsahuje devět virových glykoproteinů, které mají zásadní vliv na vstup viru do buňky. Mutační analýza prokázala, že pokud nejsou přítomny některé glykoproteiny, tak není virus schopen tvorby infekčních virových částic (Hobom et al., 2000). Podle článku (Varnum et al., 2004) existuje 59 strukturálních proteinů, 29 proteinů je spojeno s denzními tělísky, 71 proteinů (nalezených srovnáváním peptidů viru a peptidů člověka) tvoří např. chaperony, buněčné strukturální proteiny nebo enzymy.

1.2.1.2 Virový genom Lidský CMV je největším herpesvirem. Genom CMV se skládá z unikátní dlouhé UL (Unique Long) a unikátní krátké US (Unique Short) oblasti. Obě oblasti jsou spojeny interními repeticemi a ohraničeny terminálními repetitivními sekvencemi, což umožňuje tvorbu čtyř izomerních forem (viz Obr. č. 2).

9

Obr. č. 2 Struktura čtyř izomerních forem CMV vzniklá inverzemi úseků UL a US Převzato a upraveno z (Landolfo et al., 2003)

Konzervativní betaherpesvirové geny se nacházejí převážně na UL oblasti, geny specifické pro jednotlivé viry se nalézají na oblasti US. Postupná exprese veškerých genů umožnila rozdělení genů do tří kategorií:


IE geny (Immediate Early - bezprostředně časné geny) o Kódují proteiny nezbytné pro transkripci časných genů
E geny (Early - časné geny) o Kódují proteiny nezbytné pro replikaci DNA a transkripci pozdních genů
L geny (late - pozdní geny) o Kódují strukturální virové komponenty

Prvním osekvenovaným kmenem byl laboratorní kmen AD169. Každý kmen obsahuje různé počty otevřených čtecích rámců. U AD169 bylo původně identifikováno 208 otevřených čtecích rámců (Rigoutsos et al., 2003; Yu et al., 2003). Jednotlivé otevřené čtecí rámce vyskytující se jen u některých kmenů, mohou mít vliv na růst v kultuře (Cunningham et al., 2009), na replikaci v různých typech buněk, latenci nebo patologii (Dunn et al., 2003). Mutačními analýzami kmenů s delecí nebo inzercí a srovnáváním jednotlivých kmenů lze tyto rozdíly identifikovat. Variabilita genomů mezi vysoce pasážovanými laboratorními kmeny a klinickými izoláty je okolo 15 kbp (Cha et al., 1996).

10

1.2.1.3 Infekce CMV vstupuje do těla několika cestami - přes epitel urogenitálního, gastrointerstinálního nebo respiračního traktu nebo v průběhu transplantace orgánů, krvetvorných kmenových buněk, transfúzí krve nebo transplacentárně z matky na plod. Šíří se tělními tekutinami (krví, slinami, močí, mateřským mlékem, spermatem, poševními sekrety). Primární infekce probíhá u většiny osob asymptomaticky a zpravidla v dětském věku. Po primární infekci nastává fáze latence, která může trvat celý život a virus nikdy žádnou symptomatickou infekci nezpůsobí. Osoby s primární infekcí jsou IgG negativní a IgM pozitivní. Osoby s latentním CMV jsou IgG pozitivní. Seropozitivita IgG se v populaci pohybuje v rozmezí 50 až 90 % v závislosti na věku, socioekonomických faktorech atd. (Dowd et al., 2009; Staras et al., 2006). K přechodu z latentní fáze do fáze aktivní infekce je zapotřebí silného potlačení imunitního systému (těhotenství, transplantace a s ní spojená imunosupresivní léčba, závažná onemocnění - AIDS, vysoký stres). Buňky, které jsou schopné CMV přijmout a umožnit mu replikaci, se označují jako permisivní. Jsou to buňky epiteliální, endoteliální, nervové buňky, buňky mléčné žlázy, kmenové buňky kostní dřeně, svalové buňky, hepatocyty a další (Sinzger et al., 1995). CMV je však schopen infikovat i buňky nepermisivní. Během aktivní infekce lze CMV detekovat v lymfocytech, monocytech, polymorfonukleárních leukocytech a diferencovaných epiteliálních buňkách. Pro šíření infekce organismem je důležitá produkce několika virových proteinů, které jsou např. homology k buněčnému receptoru IL-8 (Interleukin). Některé tyto virové proteiny působí jako chemoatraktanty pro makrofágy nebo polymorfonukleáry. Prostřednictvím těchto buněk se šíří virus směrem k cílovým orgánům, kde dochází k produktivní infekci epiteliálních buněk (Momma et al., 2003). Polymorfonukleáry jsou tedy důležitý přenašeč viru a to i v období latence. Replikace v nich nikdy neprobíhá. Virus proniká do těchto buněk endocytózou nebo přechodnou mikrofúzí s infikovanou buňkou (Gerna et al., 2000). Další důležitý přenašeč jsou monocyty. Jakmile jsou diferencovány na makrofágy, dochází k replikaci viru (Smith et al., 2004), virus se hromadí ve vakuolách a makrofág pak roznáší viry do okolních tkání. Důležité je zablokování fúze vakuol s lysozomy, aby nedošlo k destrukci zreplikovaného viru.

1.2.1.4 Latence, reaktivace, superinfekce Virus je schopen přejít z primární infekce do stádia latentní fáze infekce. Buňky, ve kterých byla latentní infekce detekována, jsou buňky kostní dřeně, hematopoetické progenitory, endoteliální buňky v různých částech organismu nebo progenitory polymorfonukleárů a monocytů (Goodrum et al., 2002). Primární místo latentní infekce zatím nebylo jednoznačně potvrzeno. 11

Ačkoliv nelze detekovat virové částice během latentní infekce, je latentní infekce spojena s přítomností charakteristických virových sense a antisense transkriptů (Bego et al., 2005; Landini et al., 2000). Tyto transkripty byly detekovány v CD33 + progenitorech dendritických buněk, polymorfonukleárů a CD14 + monocytů, CD34 + hematopoetických progenitorech a progenitorech B a T lymfocytů. Nebyly nalezeny v CD33 − makrofázích a CD34 − zralých B a T lymfocytech (Hahn et al., 1998). Funkce většiny transkriptů prozatím není objasněna. Latentní infekce je spojena také s charakteristickými změnami exprese řady genů týkající se imunitního systému postiženého organismu. Především dochází k snížení produkce MHC II proteinů na myeloidních progenitorech (Slobedman et al., 2002), čímž je CMV pod menším imunitním dohledem. Velká skupina genů je více transkribována, což může vést k výhodám v přežití během latentní infekce, nebo to může ovlivňovat iniciaci reaktivace (Slobedman et al., 2004). Během latentní fáze dochází často k reaktivacím viru, ale dobře fungující imunitní systém je schopen rychle zasáhnout a zabránit aktivní infekci. Počátky reaktivace viru lze zachytit pomocí detekce bezprostředně časných antigenů v krvi nebo detekcí DNA viru. Než dojde k rozvoji symptomů infekce, je v krvi detekováno značné množství kopií DNA viru. V tomto období je nejvhodnější začít s léčbou. Rozvinutá symptomatická infekce se léčí obtížněji a má závažnější průběh. Mechanismus reaktivace CMV prozatím nebyl jednoznačně popsán. Reaktivace je proto vysvětlena několika hypotézami. První mechanismus je spojen s imunosupresí. Špatně fungující imunitní systém nedokáže zabránit přechodu latentní infekce do fáze aktivní. Tato teorie je podpořena řadou studií prováděných na zvířecích modelech. Novější studie to většinou vyvracejí (Forster et al., 2009) a podporují jiné mechanismy. Mnohem podporovanějším modelem je reaktivace indukovaná buněčnou diferenciací. Podle tohoto modelu existují některé buňky, které jsou latentně infikovány, ale neexprimují geny spojené s produktivní infekcí. Reaktivace spojená s diferenciací byla popsána ve spojitosti s infikovanými

CD14 +

monocyty

(Soderberg-Naucler

et

al.,

2001),

které

jsou

nejinfikovanějšími leukocyty v těle. Tento model byl popsán u monocytů, které byly pomocí alogení stimulace diferencovány na makrofágy. Bylo popsáno, že kriticky důležitými mediátory, které řídí diferenciaci monocytů při alogení stimulaci, jsou cytokin IFN-γ (Interferon) a IL-2 (Interleukin). IFN-γ je produkován v časných stádiích diferenciace monocytů. Nejenže stimuluje diferenciaci, ale stimuluje také buněčnou imunitu ke kontrole virové infekce a brání transkripci IE (Immediate-Early) genů nezbytných pro zahájení replikace CMV. Proto musí být v buňkách přítomno dostatečné množství dalších cytokinů např TNF-α (Tumor Necrosis Factor), které tyto účinky potlačují. Samotný IFN-γ je nezbytný pro diferenciaci, ale není schopen sám stimulovat 12

reaktivaci. Jeho množství je ovlivněno IL-2, který je produkován CD4 + T-lymfocyty po jejich interakci s infikovanými monocyty. IL-2 aktivuje CD8 + T-lymfocyty, které IFN-γ produkují. IL2 také stimuluje monocyty po jejich interakci, ovlivňuje jejich migraci, přežití a produkci dalších cytokinů potřebných při pozdějších fázích diferenciace a následné reaktivace. Proto je pro diferenciaci kriticky důležitý kontakt s T-lymfocyty. Další buňky, u kterých byla prokázána reaktivace pomocí diferenciace, jsou např. progenitory polymorfonukleárů. Pokud jsou tyto buňky jednou infikovány CMV, dochází již trvale k expresi transkriptů specifických pro latentní infekci (Hahn et al., 1998). Tyto buňky byly infikovány rekombinantním virem a kultivovány na kultuře z lidských fibroblastů. Poté došlo ihned

k reaktivaci

viru

a

produkci

specifických

transkriptů.

Z toho

vyplývá,

že

polymorfonukleáry jsou schopné udržet latentní infekci a v přítomnosti specifických faktorů jsou schopné reaktivace. Latentní infekce těchto buněk může přejít v reaktivaci CMV především pomocí cytokinů TNF-α a IFN-γ. U menšího množství buněk může přejít v reaktivaci CMV pomocí IL-4 nebo GM-CSF (Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor), které iniciují myeloidní diferenciaci. Nově objevený model reaktivace CMV se týká reaktivace z CD34 + primárních hematopoetických progenitorových buněk (Goodrum et al., 2002). Tyto buňky byly infikovány rekombinantním virem a kultivovány na kultuře imortalizovaných myších stromálních buněk kostní dřeně, které podporovaly jejich diferenciaci a měly fenotyp lidských progenitorových buněk. CD34 + progenitory byly schopny si udržet virus maximálně do dvacátého dne po infekci. Pokud však byly přeneseny na kulturu fibroblastů, ihned došlo k reaktivaci a expresi řady genů. Z této studie vyplývá, že CMV potřebuje ke své reaktivaci alespoň částečně diferencované buňky, protože cytokiny produkované těmito buňkami navozují reaktivace. Vliv na reaktivaci má pravděpodobně i chromatin. Další podporovaný mechanismus reaktivace CMV je spojen s indukcí alogení odpovědi na transplantované orgány nebo buňky. Při této odpovědi jsou indukovány zánětlivé cytokiny TNF, IL-2 a IFN-γ. Těmito zánětlivými mediátory dochází především k indukci aktivace řady transkripčních faktorů jako je především NFқB (Nuclear Factor-KappaB), který se navazuje na MIEP (Major Immediate Early Promotor) promotor aktivovaný pomocí TNF. Tento promotor reguluje expresi genů IE-1 a IE-2 (Hummel et al., 2009). V novějších studiích však bylo zjištěno, že MIEP nemusí být aktivován pouze pomocí TNF a tudíž není potřeba jako transkripční faktor výhradně NFқB, ale může být zastoupen např. AP-1 (Activating Protein 1), CREB (cAMP Responsive Element Binding Protein) nebo ATF (Activating Transcription Factor) (Zhang et al., 13

2008). Kompletní signální dráha reaktivace však nebyla prozatím jednoznačně popsána, především i kvůli neustále se objevujícím alternativním cestám reaktivace. Superinfekce je stav, kdy buňka infikovaná jedním kmenem je infikována dalším kmenem viru. Virová superinfekce je velmi závažný stav, který může vést k rozvoji rezistence, snížení protivirové léčby, nebo může dojít k rekombinaci mezi viry. Častou příčinou superinfekce je infekce seropozitivního příjemce od seropozitivního dárce přes transplantát. Může být ale také způsobena akumulací různých CMV v člověku během celého života.

1.2.1.5 Léčba a rozvoj rezistence Léčba CMV reaktivace je založena především na podávání antivirotik. Podle strategie léčby CMV definujeme tři typy léčby:
Profylaktická - používána u všech pacientů s vyšším rizikem rozvoje infekce bez ohledu na jakékoliv příznaky CMV infekce. Nasazuje se zpravidla ještě před transplantací a vysazuje se nejdříve 100 dní po transplantaci.
Preemptivní - používána pouze u skupiny pacientů, u kterých již byly objeveny příznaky CMV infekce (DNAémie, antigenémie pp65). Podle výsledků přítomnosti virové DNA nebo antigenu pp65 je zahájena odpovídající léčba, aby se zabránilo rozvoji CMV onemocnění.
Empirická - sleduje přítomnost určitých markerů, podle kterých se zvolí příslušná léčba.

CMV infekci lze velmi dobře léčit pomocí gancicloviru, cidofoviru nebo foskarnetu. Léčba antivirotiky se však neobejde bez řady vedlejších účinků z nichž nejhorším je rozvoj rezistence. Většina antivirotik je podávána intravenózně, některá jsou podávána i ústně. Antivirotika ganciclovir a valganciclovir (L-valyl ester gancicloviru) jsou nukleosidové analogy blokující replikaci CMV tím, že se začleňují do virové DNA jako analogy nukleotidů (metabolismus i mechanizmus účinku na CMV je stejný). V buňkách jsou antivirotika nejprve konvertována virovou kinázou (UL97) na monofosforylovanou formu a poté buněčnou kinázou na di- a trifosforylovanou formu. Ganciclovir se využívá profylakticky hlavně u osob s vysokým rizikem rozvoje CMV infekce (séropozitivní dárce, primární infekce) (Kline et al., 2006), ale i preemptivně (reaktivace). Účinnost preemptivní terapie intravenózním ganciclovirem a ústním valganciclovirem je velice podobná (van der Heiden et al., 2006). Ganciclovir má řadu nežádoucích účinků jako je hematotoxicita (především neutropenie a anémie), vyšší frekvence rozvoje sekundárních bakteriálních a mykotických infekcí (Burns et al., 2002). Může také 14

zpozdit odpověď specifických T buněk na CMV infekci, tím zvýšit výskyt pozdní CMV infekce, což má spojitost i s rozvojem GvHD (Razonable et al., 2001). Má však významný účinek na rozvíjející se CMV infekci (Einsele et al., 2000). Největším problémem je rozvoj rezistence u dlouhodobě léčených osob. Rezistence vzniká nejčastěji v genu UL97 (gen pro virovou kinázu) a v genu UL54 (gen pro virovou DNA polymerázu). Mutace v genu UL97 se týkají především kodonů 460, 520 a úseku 590 až 607 (viz Obr. č. 3) (Chou et al., 2002), s nejvyšší frekvencí se vyskytují L595S (záměna leucinu za serin), A594V (záměna alaninu za valin) a M460V (záměna methioninu za valin). Mutace týkající se genu UL54 nejsou u gancicloviru tak časté, ovšem mohou se objevit zkřížené rezistence s ostatními antivirotiky. Rozvoj rezistence v genu UL54 vede k tomu, že virová DNA polymeráza není blokována a může dále vytvářet nový řetězec DNA. Foscarnet je organický analog anorganického pyrofosfátu. Blokuje virovou polymerázu (UL54) tím, že se váže na vazebné místo pro pyrofosfát a tím brání prodlužování řetězce DNA. Je podáván pouze intravenózně v aktivní formě a pouze preemtivně. Je to lék druhé volby. Používá se pokud se rozvine rezistence na ganciclovir (Ohta et al., 2001) nebo je vysoké riziko rozvoje neutropenie. Jeho výhodou je, že působí i na jiné herpesviry a není tak hematotoxický jako ganciclovir (Reusser et al., 2002). Nevýhodou je velké množství nežádoucích účinků jako je poškození ledvin (Bregante et al., 2000), nerovnováha elektrolytů, nevolnost a zvracení. Rezistence na něj vzniká pouze v genu UL54 (Chou et al., 2003) (viz Obr. č. 3)

Obr. č. 3 Nejčastější oblasti zasažené mutacemi Převzato a upraveno z (Baldanti et al., 2004)

Cidofovir je nukleosidový analog cytosinu. Po difosforylaci buněčnými kinázami se začleňuje do virové DNA a selektivně inhibuje virovou polymerázu. Je to intravenózní antivirotikum. Jeho výhodou je, že účinkuje i na některé jiné herpesviry. Nevýhodou je značná 15

nefrotoxicita, častá je nevolnost a zvracení. Používá se pouze tehdy, pokud selže ganciclovir nebo foscarnet (Ljungman et al., 2001). Rezistence se u cidofoviru objevuje vzácně především proto, že není lékem první volby. Byla potvrzena pouze v genu UL54.

1.2.1.6 Genotypizace Genotypizace u CMV slouží k určení distribuce jednotlivých genotypů CMV v určitých populacích, případně je cílem určit, zda má určitý genotyp příslušného genu souvislost s jednotlivými onemocněními. Zastoupení jednotlivých genotypů je poměrně odlišné u různých skupin rizikových pacientů. Nasvědčuje to o rozdílech v biologických vlastnostech, které mohou ovlivnit imunogenicitu, virulenci i epidemiologii cirkulujících kmenů. Distribuce jednotlivých genotypů CMV v ČR je podobná, jako v jiných regionech střední a západní Evropy a ve Spojených státech. Nejčastější gen používaný pro genotypizaci je gen UL55 kódující glykoprotein B. Glykoprotein B (gB) je hlavní komponenta virového obalu. Zprostředkovává vstup viru do hostitelských buněk, přenos viru z buňky do buňky nebo fúzi infikovaných buněk. Je hlavním cílem neutralizačních protilátek humorální imunity a specifických cytotoxických T-lymfocytů buněčné imunity organismu. Je to nejvíce konzervovaný glykoprotein CMV, i když jeho sekvence obsahuje oblasti s vysokou variabilitou. Podle těchto variabilních oblastí lze rozlišit čtyři genotypy gB. Metodou RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) lze tyto genotypy identifikovat na základě tvorby různých restrikčních fragmentů (viz Obr. č. 4). Pro identifikaci genotypů již byla použita také metoda multiplex PCR (Polymerase Chain Reaction) se sekvenčně specifickými primery pro jednotlivé genotypy (Tarrago et al., 2003) nebo real-time PCR (Fan et al., 2009; Manuel et al., 2009; Pang et al., 2008). Podrobnou analýzu umožňuje sekvenace. Zastoupení jednotlivých genotypů je zhruba následující: gB1 (33 %), gB2 (29 %), gB3 (18 %), nejméně četný je gB4 (7 %), zbytek tvoří směsné infekce. U různě imunokompromitovaných osob jsou tato procenta odlišná. Především se u nich vyskytují směsi dvou ale i více genotypů, které mohou tvořit až 25 %. U osob HIV pozitivních tvoří směsi i 40 % (Tarrago et al., 2003). Detekce směsné infekce může být ovlivněna použitím jiného vstupního materiálu (Coaquette et al., 2004). Takováto infekce je spojena s vyšším rizikem GvHD, vyšší virovou náloží (Pang et al., 2008), prodlouženou léčbou a zřejmě i se závažnějšími symptomy. V mnoha studiích již byla snaha popsat vztah mezi genotypem gB a patogenitou. U gB3 a gB4 byla prokázána vyšší frekvence úmrtí ve spojení s myelosupresí u transplantovaných pacientů (Torok-Storb et al., 1997). U gB2 byl potvrzen tropismus na centrální nervovou soustavu 16

(Tarrago et al., 2003) a závažné symptomy u osob s AIDS. U gB1 nebyla prokázána souvislost se závažnými symptomy. U jednotlivých genotypů gB byla rovněž prokázána vysoká inter a intragenotypová variabilita (Chantaraarphonkun and Bhattarakosol, 2007) a možná homologní rekombinace (Haberland et al., 1999). Tato sekvenční diverzita způsobuje problémy při identifikaci jednotlivých genotypů (Nye et al., 2005).

Obr. č. 4 Fragmenty gB CMV po RFLP Metodou RFLP je možné rozlišit čtyři genotypy gB. PCR se provádí s primery gB1319 a gB1604. Ke štěpení se využívá dvou restrikčních endonukleáz Hinf I a Rsa I. K identifikaci velikosti fragmentů je využit délkový marker. Převzato z (Woo et al., 1997)

Dalším možným genem vhodným ke genotypizaci CMV je gen UL144, protože je velmi variabilní. UL144 je potenciální patogenní marker, protože má značnou sekvenční podobnost s mediátorem vstupu u herpes simplex viru, což je člen TNF receptorové superrodiny (Poole et al., 2006). UL144 však neváže žádný z TNF ligandů, ale váže jiný ligand, B a T lymfocytární atenuátor (BTLA) (Cheung et al., 2005). Vazba tohoto ligandu značně snižuje lymfocytární odpověď na CMV. Produkt genu UL144 je také potenciální aktivátor NFқB, což je pleiotrofní transkripční faktor. Aktivace NFқB je doprovázena zvýšenou expresí CCL22 chemokinu. Tento chemokin je chemoatraktantem pro pomocné T-lymfocyty a regulátory T-buněk. Tudíž je UL144 17

důležitým inhibitorem T-buněčné imunity (Poole et al., 2006). K identifikaci UL144 se často využívá nested PCR se sekvenčně specifickými primery pro každý genotyp nebo sekvenace. Po identifikaci velkého množství polymorfismů bylo definováno 5 genotypů (A, B, C, A/B, A/C). Nejméně se vyskytují genotypy A, A/B a A/C. V souvislosti s UL144 byl prokázán vztah mezi genotypem a klinickými symptomy. Nejzávažnější infekce u kongenitálně infikovaných dětí způsobují genotypy A/B, A/C a C, které byly nalezeny pouze u symptomatických dětí (AravBoger et al., 2006; Arav-Boger et al., 2002). Genotyp B byl nalezen jak u symptomatických tak i u asymptomatických dětí a vyskytuje se nejčastěji. Jiné studie souvislost s různými symptomy vyvracejí (Tanaka et al., 2005; Yan et al., 2008). Ke genotypizaci lze využít i gen UL1. Gen UL1 je součástí multigenové rodiny RL11, která obsahuje dvanáct genů, jejichž funkce prozatím nejsou u některých známé (Sekulin et al., 2007). Všichni členové RL11 rodiny obsahují RL11D doménu, která má značnou podobnost s doménou v E3 membránovém glykoproteinu adenoviru, proto je u většiny členů RL11 rodiny pravděpodobné, že kódují membránové glykoproteiny. Gen UL1 je nejvíce variabilní gen z celé RL11 rodiny. Byly u něho popsány tři genotypy A, B a C. K identifikaci jednotlivých genotypů byla použita PCR se sekvenčně specifickými primery nebo sekvenace. Detailní genovou analýzou byla identifikována vysoká intra a intergenotypová variabilita. Častý je i výskyt bodových mutací vedoucích ke stop kodonu nebo frameshiftu. U kmene Towne byl identifikován defekt v genu UL1 způsobený rozsáhlou delecí.

1.3 METODY DETEKCE LIDSKÉHO CYTOMEGALOVIRU K detekci CMV lze využít řadu metod. Záleží však na imunokompetenci, klinickém stavu pacienta, věku a s tím souvisí i požadavek na rychlost a citlivost detekční metody. CMV může být detekován z plné krve, moči, slin, plodové vody, z biopsie a to během primární infekce nebo i při reaktivaci. Metody detekce CMV můžeme rozdělit do čtyř skupin podle toho, co je předmětem detekce metody:


Virémie: přítomnost virových partikulí nebo cytopatického efektu v tkáňové kultuře
Antigenémie: přítomnost antigenu pp65 v leukocytech periferní krve
DNAémie: přítomnost DNA viru v plné krvi, v moči, plodové vodě, leukocytech
RNAémie: přítomnost RNA viru v plné krvi, v moči, plodové vodě, leukocytech

18

1.3.1 Přímá detekce 1.3.1.1 Kultivační metody Kultivační metody se nevyužívají pro rutinní diagnostiku CMV zejména proto, že identifikace cytopatického efektu je časově náročná. Cytopatický efekt se vyvíjí pomalu a je ho možné bezpečně sledovat nejméně za 21 dnů. Kultivace se provádí na tkáňových kulturách lidských fibroblastů (obvykle kultura Lep - Lidské embryonální plíce nebo kožní fibroblasty). Citlivost metody je dobrá a specificita vysoká. Nejčastější příčinou selhání je kontaminace vzorku zejména kvasinkami. Odlišným typem kultivace je shell vial (zrychlená kultivace). Tato metoda je založena na zrychlené kultivaci vzorků prostřednictvím velmi pomalé centrifugace s lidskými fibroblasty. Při této metodě lze již za dva dny identifikovat v narostlé kultuře infikovaných fibroblastů časný antigen CMV. K detekci se používá imunohistochemické barvení jader fluorescenčně značenou monoklonální protilátkou, která detekuje infikované buňky produkující časný antigen (viz Obr. č. 5). Ve srovnání s PCR není kultivace tak citlivá ve velmi časných fázích infekce, navíc PCR zůstává pozitivní mnohem déle po transplantaci než kultivace (Storch et al., 1994).

1.3.1.2 Mikroskopie Pomocí elektronového mikroskopu lze identifikovat viry i tehdy, pokud ztratily vitalitu. Problémem této metody je, že pro identifikaci je nutné velké množství virových partikulí (až 106 virionů v ml), elektronový mikroskop a zpracování vzorků pro něj je velmi nákladné a navíc nelze odlišit jednotlivé viry v čeledi kvůli morfologickým podobnostem s ostatními herpesviry.

Obr. č. 5 Shell vial kultura CMV barvená monoklonální protilátkou Zeleně zbarvená jádra buněk jsou infikována CMV. Tyto buňky produkují časný antigen. Převzato a upraveno z http://www.virology.org/sbpgphoto1.html

19

1.3.1.3 Cytologie a histologie Pomocí cytologie lze identifikovat intracytoplazmatické inkluze viru uvnitř buněk obsažených v moči, krvi, ve výpotcích, sekretech, stěrech, lavážích atd. Pomocí histopatologie lze identifikovat také intracytoplazmatické inkluze. Histopatologie však využívá biopsie různých typů tkání. Výhodou obou metod je, že je možná jejich kombinace s detekcí antigenů pomocí imunohistochemického barvení, kdy je pro identifikaci antigenů využita intracelulárně fluorescenčně značená protilátka.

1.3.1.4 Průkaz antigenu Průkazy antigenů jsou časově i technicky nenáročné metody. Spolu se serologií a průkazem nukleových kyselin patří mezi nejvýznamnější metody virologické diagnostiky. Antigenní testy jsou pozitivní daleko dříve, než se projeví infekce a také jsou negativní později v pozdní fázi systematické infekce. Protilátky mohou být značeny fluorescenčně, enzymaticky (ELISA - Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) nebo radionuklidy (Radioimmunoassay). Prokazovat antigeny lze v tkáních imunohistochemicky, v séru nebo likvoru pomocí ELISA, ve sputu, výtěrech nebo v moči přímou imunofluorescencí. Nejčastějším antigenem je časný antigen pp65, který je vystaven na povrchu infikovaných lymfocytů periferní krve. Oproti PCR metodám jsou některé testy na průkaz antigenu náročnější na kvalitu vzorku a nelze je tak snadno automatizovat a standardizovat (Cariani et al., 2007).

1.3.1.5 Průkaz nukleových kyselin Průkaz nukleových kyselin je nejpoužívanější metodou detekce infekce CMV. K detekci slouží různé typy modifikací základní metody PCR. Metoda PCR využívá enzymatické amplifikace cílového úseku ohraničeného dvojicí primerů (krátké sekvence komplementární k cílové DNA) až do detekovatelné hladiny. Každý PCR cyklus se skládá ze tří kroků: 1) tání DNA, 2) připojování primerů, 3) prodlužování nově vznikajícího řetězce. Detekce výsledného produktu může být prováděna pomocí real-time PCR nebo elektroforetickými metodami, kdy se srovnává velikost produktu s DNA velikostním markerem.

Nested PCR Nested PCR je vysoce citlivá metoda využívající dvě sady primerů. V první PCR jsou použity vnější primery a v druhé PCR primery tvořící kratší fragment. Reamplifikace vnitřním párem primerů slouží ke zvýšení specifity reakce. Nevýhodou této metody je vyšší frekvence manipulace se vzorky a tím vyšší pravděpodobnost kontaminace. 20

Real-time PCR První zmínky o kinetické (budoucí real-time) PCR sahají do roku 1991-1992. Higuchi et al. objevili, jak detekovat produkty PCR bezprostředně po jejich vzniku (Higuchi et al., 1992). Nejprve se k detekci využíval ethidium bromid, pak bylo prokázáno, že je možné využít 5´ nukleázovou aktivitu Taq-polymerázy. Principiálně nejjednodušší je využití interkalačních barviv (Sybr Green, Eva Green). Interkalační barviva mají tu výhodu, že umožňují použít PCR produkt pro další zpracování např. pro HRM. V současné době se využívají také sondy využívající přenos energie fluorescenční rezonancí (FRET), nebo specifické strukturní molekulární majáky (molecular beacon), PNA sondy, Scorpion nebo lineární hydrolyzační, hybridizační, Light Up sondy a řada dalších. Jakékoliv druhy real-time PCR (PCR v reálném čase) jsou založeny na kontinuálním monitorování přírůstku DNA během každého cyklu pomocí fluorescenčně značené nukleové kyseliny. Detektor v přístroji zachytí excitaci fluorescenčního záření během reakce. Za předpokladu, že se vytvoří dostatečné množství produktu, poskytují amplikony silný signál, který přístroj zachytí a vyhodnotí. Optimálně se bude v průběhu dalších cyklů míra fluorescence zvyšovat - dochází ke kvantifikaci produktu (viz Obr. č. 6). Detekovatelné množství, které protlo základní linii, se označuje jako detekční limit. Cyklus, při kterém k tomuto dojde, se označuje jako cycle treshold - CT.

Obr. č. 6 Graf amplifikačního zakřivení Každá barva na obrázku znázorňuje jiný analyzovaný produkt. Vzestup znázorňuje, kdy bylo dosaženo cycle treshold a dochází ke zvyšování množství produktu ve směsi.

21

Kvantifikace může být absolutní, při které stanovujeme přesný počet kopií daného genu. Pro tento typ kvantifikace však musíme při každé analýze vytvořit kalibrační křivku, ze které odečteme přesné množství templátu. Při relativní kvantifikaci není potřeba kalibrační křivka, exprese studovaného genu je normalizována vůči expresi tzv. housekeeping genu (gen exprimovaný téměř ve všech tkáních zajišťující základní funkce buněčného metabolismu). Pomocí kvantifikace lze odvodit, kdy je již nutné nasadit antivirovou léčbu a kdy léčbu změnit. Výhodou real-time PCR tak je schopnost detekovat široké rozmezí počtu kopií molekul DNA. Oproti antigenní analýze pp65 je real-time PCR velmi reprodukovatelná, automatizovaná, rychlejší a citlivější (Gimeno et al., 2008). Další výhodou je, že oproti antigenní analýze pp65 nepotřebuje real-time PCR leukocyty jako zdroj DNA, ale postačuje jí plazma (Tanaka et al., 2002). V plazmě je totiž CMV identifikován pouze při aktivní infekci a nedochází tím ke zkresleným výsledkům latentní infekcí při použití krve.

Reverzně transkripční PCR (RT-PCR) Výchozím materiálem pro RT-PCR je RNA. RNAémie může být detekovatelná i v latentní fázi infekce, protože transkripty bezprostředně časných genů jsou v malém množství neustále přítomny. Časným genem detekovaným pomocí RT-PCR je IE-1 gen (Blok et al., 2000; Gerna et al., 2003), jehož detekce byla již mnohokrát úspěšně prokázána. Vysoce citlivá je RTPCR i pro detekci mRNA pozdního genu pp67 (Meyer-Koenig et al., 2006), případně je možná i detekce mRNA obou těchto genů současně (Greijer et al., 2002). Detekce RNAémie analýzou mRNA časných a pozdních genů je tak vhodnější k detekci virové infekce. Nevýhoda spočívá v RNA jako vstupním materiálu, protože je náchylnější k degradaci.

1.3.1.6 Další molekulárně biologické metody Všechny další zmíněné metody přímé detekce vyžadují jako výchozí materiál specifický PCR produkt.

Štěpení restrikčními endonukleázami Pomocí restrikčních endonukleáz (enzymů) je možné identifikovat odlišné genotypy virů, odlišit mutovaný virus a virus bez mutace, rychle ověřit zaklonované fragmenty, používají se k tvorbě rekombinantních molekul DNA, ke studiu struktury, organizace nebo exprese a evoluce genomu. Endonukleázy jsou izolovány z bakterií. Každá endonukleáza štěpí oba řetězce DNA a většina z nich rozpoznává specifické místo na DNA (nejčastěji palindrom), některé však štěpí DNA zcela náhodně. Tyto enzymy vyžadují různé kofaktory. 22

Metoda PCR-RFLP může být použita např. pro identifikaci některých genotypů CMV. Tato metoda využívá elektroforézu v agarózovém nebo polyakrylamidovém gelu k separaci produktů vzniklých štěpením. K porovnávání spektra produktů je nutné znát restrikční mapu používaných endonukleáz. Častými úseky, u kterých se používá PCR-RFLP jako detekční systém, jsou geny pro glykoproteiny (Sowmya et al., 2007) a geny, ve kterých se vyskytuje rezistence ke gancikloviru (Eckle et al., 2004; Eckle et al., 2002; Chou et al., 2002).

High Resolution Melting (HRM) Metoda HRM patří mezi jednu z nejnovějších metod. Umožňuje analyzovat tání molekul DNA s vysokou rozlišovací schopností. Je to velmi jednoduchá tzv. post PCR metoda, která využívá klasické PCR reagencie a fluorescenční interkalační barvivo (Sybr Green, Eva Green), které se váže do dsDNA. Některá interkalační barviva se mohou vázat i na ssDNA, ale taková nejsou pro HRM používána. HRM detekuje sekvenční variabilitu DNA měřením změn tání DNA duplexů. Tání duplexů DNA je ovlivněno několika faktory. Jsou jimi délka fragmentu, obsah GC, sekvence, iontová síla, koncentrace DNA a přítomnost látek jako je např. DMSO (dimethyl sulfoxid) (Musso et al., 2006). HRM umožňuje odlišit i jedinou záměnu nukleotidu. Pokud se vytvoří heteroduplexy (nesprávné párování), tak jsou vždy snadno identifikovatelné (viz Obr. č. 7). Je to způsobeno hlavně relativní nestabilitou heteroduplexů (Wittwer et al., 2003). Změna Tm (teplota tání) je poměrně velká (0,8 - 1,4 °C) a tvar křivky je hodně odlišný. Homoduplexy vytvářejí vždy velmi podobné křivky, které jsou blízko sebe. Pokud dojde k záměně A za T nebo C za G a naopak, jsou změny Tm velmi malé (méně jak 0,4 °C) a nemusí dojít k odlišení jednotlivých vzorků (Liew et al., 2004). Velký vliv na tvorbu málo odlišitelných homoduplexů má sekvence v nejbližším okolí. Pokud se v okolí rovnoměrně vyskytují G/C nebo A/T páry je možnost odlišení vzorků zhoršena.

23

Obr. č. 7 Oba grafy ukazující dva typy homoduplexů a jeden heteroduplex. Graf s HFE naznačuje, že pokud jsou homoduplexy tvořeny nukleotidy, které se navzájem párují, jsou křivky téměř neodlišitelné. Graf s Factorem V znázorňuje, že pokud jsou homoduplexy tvořeny nukleotidy, které se navzájem nepárují, jsou křivky snadněji odlišitelné. Pokud se vytvoří heteroduplexy, jejich křivky mají jiný tvar a lze je snadno rozlišit, jak je vidět na obou grafech. Převzato a upraveno z (Liew et al., 2004)

Při HRM dochází k zahřívání produktu po předešlé PCR. Jakmile se teplota zvyšuje a duplexy procházejí teplotními změnami, dochází k uvolňování barviva a redukci fluorescence. Po proběhnutí HRM dochází k normalizaci fluorescence, což zkoriguje variabilitu fluorescence způsobenou např. odlišným množstvím amplikonů (Obr. č. 8A). Normalizovaná data jsou převedena derivací do jiného grafu, který umožňuje odlišné hodnocení (Obr. č. 8C). Často jsou normalizovaná data převedena do diferenciálního grafu, který umožňuje přesněji hodnotit odlišnosti křivek (viz Obr. č. 8B).

24

Obr. č. 8 Graf A znázorňuje normalizovaná data fluorescence, graf B je diferenciální graf, který srovnává všechna data vůči jedinému vzorku, graf C znázorňuje derivovaná data.

Metoda HRM je široce využívána ke genotypizaci, k identifikaci SNP (Single Nucleotide Polymorphism), ke skríningu mutací atd. Může být využita pro studium stovek mutací u mnoha odlišných genů (Garritano et al., 2009; Gidlof et al., 2009; Chmara et al., 2010; Odell et al., 2005). HRM již byla úspěšně použita, i pokud byly jako materiál využity cytologické preparáty (Nomoto et al., 2006), tkáně fixované methanolem (Takano et al., 2007), zamražené nádorové vzorky (Krypuy et al., 2007) a řada dalších nestandartních materiálů, i když citlivost může být v těchto případech snížená (Takano et al., 2007).

Sekvenování Sekvenování je náročná metoda, která se začala vyvíjet v druhé polovině 20. století. Sekvenační reakce nám umožňuje stanovit přesnou sekvenci úseku DNA. V současné době existuje velké množství metod sekvenování (modifikace Sangerovi metody, pyrosekvenování, 454 sekvenování atd.). Jedna z modifikací Sangerovi metody využívá fluorescenční barviva navázaná na jednotlivé dideoxynukleotidy. Prodlužování sekvence skončí vždy, když se naváže jeden z dideoxynukleotidů. Toto sekvenování vyžadující nejprve přesně provedenou PCR, poté dostatečně čistý produkt a následuje sekvenační reakce s odpovídající komerční sadou. Nejčastějším problémem při sekvenaci je nedostatečně čistý produkt (vytváří se silné pozadí), nízká koncentrace DNA produktu (nízký signál) nebo vysoká koncentrace DNA (překrývání píků).

1.3.2 Nepřímá detekce - sérologické metody Sérologické metody slouží k průkazu specifických protilátek infekčního agens ze séra (případně z jiných tělních tekutin – mozkomíšní mok). Detekce patogenů u těchto typů vyšetření je nepřímá, jelikož se neprokazuje přímo původce infekční choroby, ale stanovuje se pouze 25

reakce imunitního systému na jeho přítomnost. Z přítomnosti určitých protilátek, jejich množství a typu se dá usoudit, který mikrob způsobil infekci a navíc je možné odhadnout i stadium infekce. Oproti přímému průkazu jako je kultivace, průkaz antigenu nebo DNA mají tato vyšetření vyšší senzitivitu, protože určitá imunitní reakce organismu je při nebo i po infekci přítomná vždy. Zároveň jsou u nich časté nespecifické reakce, které vedou k falešné pozitivitě či negativitě. Srovnávání některých serologických testů bylo prováděno již dávno a mnohokrát (Phipps et al., 1983; Beckwith et al., 1985), ale velmi často s rozdílnými výsledky. Proto se řada serologických testů již nepoužívá v běžné diagnostice.

26

2 CÍLE PRÁCE

Molekulárně biologické metody (zejména PCR a real-time PCR) představují v dnešní době velmi rychlý a senzitivní přístup v diagnostice oportunních infekcí. Cílem práce bude ověřit přínos vhodných molekulárně biologických metod (PCR, real-time PCR, klonování, sekvenování, analýza křivek tání) k poznání a monitorování procesů, které vedou k rozvoji infekčních komplikací a zhodnotit jejich možné použití v praxi. Zejména se jedná o




zjednodušení metodiky detekce rezistence na běžně používaná antivirotika




genotypizaci kmenů CMV v opakovaných epizodách reaktivace CMV, kde je hlavním cílem zjistit, zda dochází k reaktivaci stále stejného endogenního kmene.

27

3 MATERIÁL A METODY 3.1 MATERIÁL 3.1.1 Detekce rezistence LB (Luria Bertani) agar a bujón: Yeast extract (Amresco) Trypton Plus (Fluka) Agar, Bacteriological (Amresco, Oxoid) 10 M chlorid sodný (Lachema) 5 M hydroxid sodný (Lachema) Materiál používaný při přípravě plazmidové DNA: Ampicilin (Sigma-Aldrich) Glycerol (USB corporation) 5 % X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-betagalaktopyranosid) (Sigma-Aldrich) 100 mM IPTG (isopropyl-beta-D-thiogalactopyranosid) (Sigma-Aldrich) TA Cloning® Kit (Invitrogen) QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) Reagencie pro PCR, real-time PCR, HRM a restrikční štěpení: Universal Master mix (Thermo Scientific) 25 µM MGB sondy (Applied Biosystems) SensiMix™ HRM Kit (Quantace) Rsa I (New England BioLabs, Inc) Hinf I (TaKaRa) 10X NEBuffer 1 (New England BioLabs, Inc) 10X H buffer (TaKaRa) Materiál pro sekvenaci: GenomeLab™ DTCS Quick Start Kit (Beckman Coulter) 3 M acetát sodný pH 5,2 100 mM EDTA pH 8,0 Glykogen (Sigma-Aldrich) 96 % ethanol 70 % ethanol 28

Primery použité k detekci rezistence: CPT 1442

5´-ATTACAGCCTCAGCGAGCCCTATC- 3´

CPT 1979

5´-ATGGTCTGCGAGCATTCGTGGTAG- 3

CPT 1713

5´-CGGTCTGGACGAGGTGCGCAT- 3´

CPT 1830M

5´-AATGAGCAGACAGGCGTCGGA GCAGTGCGTGAGCTTGCCGTTCTT- 3´

HRM-REZ F1

5´-AGGCGTTGCTCTTTAAGCAC- 3´

HRM-REZ R1

5´-GCCAGAATGAGCAGACAGG- 3´

1a L595S

5´-CCGCGCGTTGGAGAA- 3´

1b L595S

5´-ACAGACGCTCCACGTTCTTT- 3´

1c L595S

5´-CCGCGCGTCGGAGAA- 3´

2b L595S

5´-ACATCTTGGCCTCCACAAAG- 3´

3a L595S

5´-CGAATGTTACCACCCTGCTT- 3´

3b L595S

5´-GAGCTTGCCGTTCTCCAAC- 3´

3c L595S

5´-GAGCTTGCCGTTCTCCGAC- 3´

4a L595S

5´-GGTCTACGGCGTTATTGCAT- 3´

UL97 F

5´-GTTGGCCGACGCTATCAAAT- 3´

UL97 R

5´-GGTCCTCCTCGCAGATTATG- 3´

Primery a sondy použité ke kontrole úspěšnosti transformace: mutUL97-F

5´-AGGCGTTGCTCTTTAAGCAC- 3´

mutUL97-R

5´-AGGCGCCGTAGCTCATTT- 3´

A594V-F1

5´-AGGCGTTGCTCTTTAAGCAC- 3´

A594V-R

5´- GCCAGAATGAGCAGACAG G- 3´

VIC mutA594V-P VIC -CTCCAACACGCGGC- MGB VIC mutUL97-P

VIC -TTCTCCGACGCGCG- MGB

FAM wtUL97-P

FAM -CGCGTTGGAGAAC- MGB

3.1.2 Genotypizace Reagencie pro restrikční štěpení: Taq α I (New England BioLabs, Inc) Hha I (New England BioLabs, Inc) 10X NEB Taq α I (New England BioLabs, Inc) 10X NEBuffer 4 (New England BioLabs, Inc) 100X Purified BSA (New England BioLabs, Inc) 29

Primery použité při genotypizaci: UL144 F

5´-CGTATTACAAACCGCGGAGAGGAT- 3´

UL144 R

5´-CTCAGACACGGTTCCGTAAAGTC- 3´

UL1 F1

5´-ATCCTACCAGCAGCTCTTGC- 3´

UL1 F1A

5´-GCATTCTGGTACAGGCAATTCCACAT- 3´

UL1 F2

5´-CGTTTTACTGGCGACTTTTTCT- 3´

UL1 R

5´-CGTTGTTTCTAGTTCGTAGTCTGTG- 3´

CMV gB F

5´-TTTGGAGAAAACGCCGAC- 3´

CMV gB R

5´-CGCGCGGCAATCGGTTTG- 3´

gB 1319

5´-TGGAACTGGAACGTTTGGC- 3´

gB 1604

5´-GAAACGCGCGGCAATCGG- 3´

3.1.3 Ostatní používaný materiál 10X PCR Gold Buffer (Applied Biosystems) 10X PCR Buffer II (Applied Biosystems) AmpliTaq Gold® DNA Polymerase (Applied Biosystems) AmpliTaq® DNA Polymerase (Applied Biosystems) 25 mM MgCl2 Solution (Applied Biosystems) 10 mM dNTP (Roche Diagnostics) 25 µM primery (Generi Biotech) Destilovaná voda Materiál pro elektroforézu: Agaróza (Serva) 10X TBE (1,0 M TRIS-borát, 20 mM EDTA, pH = 8,3) Ethidiumbromid (Sigma-Aldrich) 6X DNA Loading Dye (Fermentas) 50 bp DNA Ladder (Fermentas) 100 bp DNA Ladder (Fermentas) Komerční soupravy: BigDye® Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) QIAquick PCR Purification kit (Qiagen) QIAquick Gel Extaction Kit (Qiagen) DyeEx 2.0 Spin Kit (Qiagen)

30

3.1.4 Přístroje Centrifugy:

Rotanta 450 R (Hettich) Centrifuge 5415 R (Eppendorf) Spektrafuge 7M Microcentrifuge (Labnet International, Inc) Minicentrifuge C-1200 (Labnet International, Inc)

Sekvenátory:

Beckmann Coulter CEQ 8000 (Beckmann Coulter) ABI PRISM® 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystem)

Vortexy:

Minishaker MS 2 (IKA® Works, Inc) Vortex-Genie 2 G-560E (Scientific Industries, Inc) BIO Vortex V1 (Biosan, Ltd)

Termocyklery:

Thermoblock T3 (Biometra) MJ Thermal Cycler PTC-200 (MJ Research)

Třepačky:

NB-205 Shaking incubator (N-Biotek, Inc) Thermomixer comfort (Eppendorf)

Termostaty:

Biological thermostat BT120 (Laboratorní přístroje Praha) Genius Heating Dry Bath Incubator MD-01N (Major Science)

Laminární boxy:

Biocap™ RNA DNA dynamic enclosure (Erlab) Biological Safety Cabinets EF/B (Clean Air Techniek) Laminar Air Flow UVF 6.15S (BDK)

Zdroje napění:

Power Pac 300 (Bio-Rad) Power Pac 1000 (Bio-Rad) Power Pac 3000 (Bio-Rad)

Elektroforézy:

Mini-Sub Cell GT Cell (Bio-Rad) Wide Mini-Sub Cell GT Cell (Bio-Rad) Sub-Cell GT Cell (Bio-Rad)

Spektrofotometr:

NanoDrop® ND-1000 (NanoDrop Technologies)

Váhy:

Denver XL-410D (Denver Instrument)

Transluminátory:

Transilluminator TM20 (UVP)

Vakuová odparka:

Concentrator 5301 (Eppendorf)

Magnetická míchačka:

Variomag MONO (P-Lab)

Repetman:

(Gilson, Inc)

Přístroje pro real-time PCR: Rotorgene 6000 (Corbett Research) Rotorgene 3000 (Corbett Research)

31

3.1.5 Software použitý při zpracování diplomové práce Zoner Photo Studio 9 Adobe Reader 9 ClustalW2 Sequence Manipulation Suite, Primer Map BLAST 2 Sequences, Nucleotide BLAST, Primer-BLAST Webcutter 2.0, NEBcutter 2.0 EndNote 5

3.2 METODY 3.2.1 Metody použité pro přípravu pozitivních kontrol k detekci rezistence 3.2.1.1 Příprava PCR produktu pro klonování Jako templát pro PCR k přípravě produktů na klonování byly použity klinické vzorky od pacientů, u nichž byla prokázána mutace v genu UL97. Složení reakční směsi mohlo být navrženo podle doporučení výrobce, nebo mohly být použity specifické podmínky. Klonování bylo použito u genu UL97 pro tvorbu pozitivních kontrol pro pozdější použití k identifikaci rezistentních mutantů a CMV bez mutace. Amplifikace vybraných DNA pro transformaci byla provedena s reagenciemi a podle podmínek viz Příloha č. 10. Po proběhnutí PCR byl produkt nanesen na agarózový gel a provedena elektroforéza. Elektroforéza byla prováděna v 1,5 % až 4 % agarózovém gelu. Ve 4 % gelu byly separovány krátké fragmenty po štěpení restrikčními endonukleázami. V 1,5 % gelu byly separovány produkty PCR reakce delší než 500 bp (fragmenty genů UL1, UL55, UL97, UL144). Navážka agarózy byla rozpuštěna v 1X TBE pufru a následně rozvařena v mikrovlnné troubě. Pod proudem studené vody byla směs částečně ochlazena a pro vizualizaci DNA bylo do směsi přidáno interkalační barvivo ethidium bromid. Směs byla ihned nalita do připravené formy s hřebínkem, který zajistil tvorbu startovacích jamek. Po vyjmutí hřebínku bylo do jamek napipetováno 10 µl PCR produktu, který byl smíchán s 1,5 µl barviva (6X DNA Loading Dye). Na každý gel byl nanesen buď 50 bp nebo 100 bp délkový marker pro identifikaci správné velikosti PCR produktu. Elektroforéza byla provedena v elektroforetické vaně pod konstantním napětím zpravidla 120 V přibližně 30 minut. Gel byl poté přenesen na UV-transluminátor vyzařující širokospektré UV záření, kde byly detekovány produkty pomocí začleněného ethidium bromidu.

32

3.2.1.2 Purifikace PCR produktu Pokud byl produkt dostatečně čistý (nebyly pozorovány žádné další nespecifické produkty při elektroforéze), byla použita k přečištění PCR produktu komerční sada QIAquick PCR Purification kit (Qiagen). Pokud nebyl PCR produkt dostatečně čistý, byl po elektroforéze vyříznut z gelu jednorázovým skalpelem a přečištěn komerční sadou QIAquick Gel Extaction Kit (Qiagen). Purifikace byla provedena podle doporučení výrobce. U přečištěného PCR produktu byla následně stanovena koncentrace genomové DNA pomocí automatického spektrofotometrického přístroje NanoDrop ND-1000. Měření bylo prováděno proti vodě při 260 nm v 2 µl vzorku. Čistota DNA byla ověřována z poměru vlnových délek 260/280.

3.2.1.3 Ligace K ligaci DNA fragmentů byl použit TA Cloning® Kit (Invitrogen). Podle doporučení výrobce byla připravena ligační směs. Množství DNA bylo vypočítáno podle níže uvedeného vzorce z naměřené koncentrace PCR produktu.

X ng PCR produktu =

( X bp PCR produktu )(50 ng pCR2.1vector ) ( X bp pCR2.1vector :~ 3900)

Ligační směs byla inkubována při 14 °C nejméně 4 hodiny, nejlépe přes noc.

3.2.1.4 Příprava kultivačního média Kultivační LB médium bylo připraveno z 10 g tryptonu, 5 g yeast extraktu a 10 g NaCl. K těmto složkám bylo přidáno 1000 ml destilované vody. Za pomoci magnetické míchačky došlo k rozpuštění všech složek směsi. Poté bylo upravena hodnota pH na 7 pomocí 5 M NaOH, který byl přikapáván do promíchavajícího se roztoku. Médium bylo rozlito do Erlenmeyerových kultivačních baněk a sterilizováno 20 minut při 125 °C. Po vychladnutí bylo médium uchováváno v lednici při 4 °C. Kultivační LB agar byl připraven z 10 g tryptonu, 5 g yeast extraktu a 10 g NaCl. Postup přípravy LB agaru byl stejný jako u LB média. LB médium bylo rozlito do 200 ml sklenic, ve kterých byly předem naváženy 3 g bactoagaru. LB agar byl poté autoklávován.

33

3.2.1.5 Transformace buněk Chemokompetentní buňky E.coli byly přeneseny z hlubokomrazícího boxu (-70 °C) na ledovou lázeň, kde byly ponechány 20 minut, aby došlo k jejich pozvolnému rozmrazení. Následně k nim byly přidány 2 µl ligační směsi. Po půl hodinové inkubaci v ledové lázni s ligační směsí následovalo zahřátí na 42 °C po dobu 30 sekund ve vodní lázni a poté ochlazení v ledové lázni. K buňkám bylo přidáno 250 µl S.O.C. média a směs byla regenerována 1 hodinu za třepání (250 rpm) při 37 °C. Na předem připravené agarové plotny se 100 mg/ml ampicilinu bylo naneseno 5 µl 100 mM IPTG a 40 µl 5 % X-Gal. Plotny byly poté temperovány dnem vzhůru při 37 °C nejméně 2 hodiny. Transformované buňky byly přeneseny na 2 agarové plotny s ampicilinem o koncentraci 100 mg/ml. K získání optimálního množství kolonií na misce, které umožní jasné odlišení kolonií nesoucích požadovaný inzert bylo na jednu plotnu naneseno 50 µl směsi a druhou 200 µl směsi. Bakterie byly inkubovány na plotně obrácené dnem vzhůru přes noc v termostatu při 37 °C.

3.2.1.6 BLUE-WHITE Screening Blue-white (modro-bílý) screening slouží k odlišení bakteriálních buněk po ligaci. Buňky, které nesou vektor s inzertem, jsou bílé. Buňky nesoucí pouze prázdný vektor jsou modré. Screening je založen na tom, že vektor obsahuje krátký segment laktosového operonu E. coli, který obsahuje regulační sekvenci a také kóduje α podjednotku LacZ proteinu. V sekvenci α podjednotky je začleněno multiklonovací místo, které nepřerušuje čtecí rámec (viz Obr. č. 9). Hostitelské buňky pak obsahují zbývající Ω podjednotku LacZ proteinu. Ani jedna z těchto podjednotek není sama o sobě aktivní. Funkční β-galaktosidasu mohou vytvořit pouze bakterie, které přijmou plazmid bez cizorodého fragmentu, enzym tedy vzniká na základně spojení obou podjednotek (princip α-komplementace). Tyto bakterie s funkční β-galaktosidasou prokazujeme na plotnách s chromogenním substrátem X-Gal. X-Gal je β-galaktosidasou rozložen na produkt, který způsobuje modré zabarvení kolonií. Indukce tvorby β-galaktosidasy je zajištěna pomocí IPTG. Pokud se do vektoru včlenila cizorodá DNA, není možná tvorba funkční β-galaktosidasy, nedochází k rozkladu X-Gal a bakterie rostou v bílých koloniích.

34

Obr. č. 9 Klonovací vektor pCR2.1 Klonovací vektor pCR2.1 obsahuje důležitou α podjednotku LacZ proteinu. V podjednotce α je začleněno multiklonovací místo, které nepřerušuje čtecí rámec. Obrázek také znázorňuje místa nasedání M13 primerů a důležité místo ampicilinové rezistence. Převzato a upraveno z http://tools.invitrogen.com/content/sfs/vectors/pcr2_1_map.pdf

3.2.1.7 Detekce vnesené DNA v plazmidu K detekci začleněného fragmentu DNA byla použita PCR se sekvenčně specifickými primery, případně s primery M13, které nasedají na sekvence plazmidu v okolí začleněného produktu (viz Obr. č. 9). K detekci vnesené DNA genu UL97 byla použita PCR s primery CPT 1442 a CPT 1979, podmínky viz Příloha č. 11. Do reakční směsi byly přidány 3 µl destilované vody navíc, protože zdrojem DNA byla bakteriální kolonie, která byla do reakce přidána pomocí pipetovací špičky. Kolonie byly pipetovací špičkou přeneseny nejprve na novou misku s LB médiem s ampicilinem a až poté použity do reakce. Plotny s přeočkovanými bakteriemi byly opět inkubovány přes noc v termostatu při 37 °C. Po skončení PCR byly produkty naneseny na agarózový gel. Pokud měl produkt správnou velikost, byl z příslušné kolonie izolován plazmid pomocí komerční sady QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) podle návodu. S izolovaným plazmidem byla provedena PCR s primery CPT 1713 a CPT 1830M a podmínkami podle 35

(Příloha č. 11). PCR produkty byly následně rozštěpeny restrikčními enzymy kvůli detekci vnesené DNA s mutacemí L595S, A594V nebo DNA bez mutace. Ke štěpení byly využity restrikční endonukleázy Taq α I a Hha I, které vytvářejí specifické fragmenty závislé na přítomnosti restrikčních míst. Složení reakčních směsí bylo následující: Reakční směs Taq α I: Pufr NEB Taq α I 10X.........................................2,5 µl BSA 100X ..........................................................0,5 µl Taq α I........................................... 0,5 µl (10 jednotek) Destilovaná voda ..............................................12,0 µl DNA .................................................................10,0 µl Celkem....................................................................25,0 µl

Reakční směs Hha I: Pufr NEB 4 10X .................................................2,5 µl BSA 100X ..........................................................0,5 µl Hha I............................................ 0,5 µl (10 jednotek) Destilovaná voda ..............................................12,0 µl DNA..................................................................10,0 µl Celkem....................................................................25,0 µl Reakční směs Taq α I byla inkubována v termobloku při 65 °C nejméně 3 hodiny a inaktivována při 80 °C 20 minut. Reakční směs Hha I byla inkubována v termobloku při 37 °C nejméně 3 hodiny a inaktivována při 65 °C 20 minut. 10 µl vzorku z obou reakčních směsí bylo naneseno na 4 % agarózový gel kvůli vyzualizaci výsledných fragmentů.

3.2.1.8 Izolace plazmidové DNA Bakterie pro izolaci plazmidové DNA byly zaočkovány do 2 ml tekutého LB média s ampicilinem o koncentraci 100 mg/ml a inkubovány při 37 °C na třepačce (250 rpm) 16 hodin. Kultura byla centrifugována 5 minut při 8000 rpm v mikrocentrifugační zkumavce. Supernatant byl slit a z peletu byl izolován plazmid pomocí komerční sady QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) podle doporučení výrobce.

36

3.2.1.9 Uchování transformovaných bakterií Pokud plazmidy obsahovaly potřebný inzert, byly uchovány transformované bakterie ve formě glycerolové kultury. K 850 µl bakteriální kultury vypěstované v tekutém médiu s ampicilinem o koncentraci 100 mg/ml bylo přidáno 150 µl sterilního glycerolu. Směs byla důkladně vortexována a rychle zamražena pomocí tekutého dusíku, aby nedošlo k vytvoření ledových krystalů uvnitř buněk, které by je mohly poškodit. Glycerolové kultury byly uchovávány při -70 °C.

3.2.2 Metody použité při detekci rezistence 3.2.2.1 Testování nových primerů pro HRM K detekci rezistence v genu UL97 byly použity primery 1a, 1b, 1c, 2b, 3a, 3b, 3c, 4a. Primery byly navrženy tak, aby se vždy jeden z páru specificky vázal buď pouze na DNA s mutací L595S nebo na DNA bez mutace. Reagencie a podmínky byly nastaveny (viz Příloha č. 16). Následovala optimalizace reakcí se všemi primery, která spočívala ve změnách teplot nasedání primerů prodlužování a zkracování času nasedání primerů a prodlužování nově vznikajícího řetězce.

3.2.2.2 Optimalizace protokolu pro HRM Protokol pro HRM se skládal z dvoukolové nested PCR, protože bylo prokázáno, že po dvoukolové PCR obsahují reakční směsi menší množství nespecifických produktů a HRM potom lépe diskriminuje jednotlivé vzorky. Pro externí kolo byly použity reagencie a podmínky podle již zavedených protokolů, proto je nebylo nutné optimalizovat (viz Příloha č. 11). Optimalizaci bylo nutné provést u interního kola, kde byly použity primery CPT 1713 a CPT 1830M ohraničující oblast s vysokou frekvencí mutací genu UL97. Jednalo se především o změny v ředění PCR produktu z externího kola a jeho případné purifikaci. Konečné reakční podmínky a použité reagencie odpovídaly protokolu (viz Příloha č. 17). Optimalizace byla prováděna také s nově navrženými primery HRM-REZ-F1 a HRMREZ-R1, které ohraničovaly podobný úsek jako primery CPT 1713 a CPT 1830M. Optimalizace spočívala ve změnách množství a poměru použitých primerů, ve změnách reakčních podmínek a ředění a v případné purifikaci použitého PCR produktu z externího kola. Konečné reakční podmínky a použité reagencie odpovídají protokolu (viz Příloha č. 18). Metoda HRM, která následuje ihned po real-time PCR, byla nově zaváděna, proto i zde byla nutná optimalizace, která se týkala zvyšování teploty pro denaturaci vzorků. Zvyšování 37

teploty po 0,2 °C nebo po 0,05 °C v každém kroku, který trval dvě sekundy, od 84 °C až na 90 °C bylo optimální. HRM byla prováděna na přístroji Rotor Gene 6000 (Corbett Research).

3.2.2.3 Sekvenování Sekvenační reakce byla prováděna na sekvenátoru Beckman-Coulter pomocí komerční sady GenomeLab™ DTCS Quick Start Kit (Beckman Coulter). Pro sekvenování bylo nutné provést PCR reakci, ověřit délku PCR produktu na agarózovém gelu, přečistit PCR produkt komerční sadou QIAquick PCR Purification kit (Qiagen) a změřit koncentraci DNA. Množství použitého PCR produktu do sekvenační reakce muselo obsahovat okolo 30 až 40 ng DNA.

Složení sekvenační reakce: 10 µM primer F nebo R ......................................2,0 µl QSM ...................................................................8,0 µl Destilovaná voda ..................................................X µl DNA .....................................................30,0 – 40,0 ng Celkem....................................................................20,0 µl

Reakční podmínky Beckman-Coulter: 1.

95 °C

20 sec

2.

50 °C

20 sec

3.

60 °C

4 min

4.

10 °C

10 min

30 cyklů

Pro vzorky sekvenované na Beckman-Coulter byl nejprve vytvořen stop premix.

Složení stop premixu pro 8 reakcí: 3 M NaOAc pH5,2 ...........................................17,0 µl 100 mM EDTA pH8,0 ......................................17,0 µl glykogen .............................................................9,0 µl Celkem....................................................................43,0 µl

Vzorky byly přeneseny do 0,5 ml zkumavek, do kterých se přidalo 5 µl stop premixu a směs se důkladně promíchala při pokojové teplotě. Ke směsi bylo přidáno 60 µl ledově vychlazeného (-20 °C) 96 % EtOH, která pak byla důkladně promíchána na vortexu. Od této fáze 38

musely být vzorky stále na ledové lázni. Vzorky byly stočeny při 4 °C ve vychlazené centrifuze po dobu 20 minut při 13000 rpm. Poté byl opatrně odstraněn supernatant a k peletu bylo přidáno 200 µl ledově vychlazeného (-20 °C) 70 % EtOH pro odstranění nečistot. Vzorky byly stočeny při 4 °C ve vychlazené centrifuze minimálně 2 minuty při 13000 rpm. Supernatant byl odpipetován. Znovu bylo k peletu přidáno 200 µl ledově vychlazeného (-20 °C) 70 % EtOH. Stočení bylo opakováno. Supernatant byl odpipetován a vzorky se nechaly vysušit ve vakuové odparce 10 minut při 30 °C. Následně byly vzorky rozsuspendovány v 50 µl roztoku Sample Loading Solution, který se používá pro nanášení vzorků do sekvenční kapiláry, převrstveny kapkou minerálního oleje a uloženy do mrazničky.

3.2.3 Metody použité pro genotypizaci 3.2.3.1 Optimalizace PCR pro geny použité ke genotypizaci Ke genotypizaci byly vybrány značně polymorfní geny UL1, UL55 a UL144. PCR byla modifikována podle publikovaných výsledků v článku (Sekulin et al., 2007) pro gen UL1. U genu UL55 byly použity podmínky publikované v článku (Tarrago et al., 2003). Pro gen UL144 byly použity informace z článku (Arav-Boger et al., 2002). Optimalizaci PCR byla nutná u všech sledovaných genů. Reakční podmínky byly upravovány tak, aby byly během reakce vytvořeny dostatečně specifické produkty. Byl zkracován čas nasedání primerů, měnilo se množství MgCl2, zvyšovala se teplota nasedání primerů, přidávalo se množství primerů atd. Optimální reakční podmínky pro další použití byly pro gen UL1 nastaveny viz Příloha č. 13 a Příloha č. 14, pro gen UL55 viz Příloha č. 15 a pro gen UL 144 viz Příloha č. 12. Veškeré PCR produkty byly nanášeny na 1,5 % agarózový gel k vizualizaci výsledných produktů.

3.2.3.2 Sekvenování Sekvenační reakce na sekvenátoru AbiPrism byla provedena pomocí komerční sady BigDye® Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) podle protokolu (viz Příloha č. 19).

Reakční podmínky AbiPrism: 1.

96 °C

30 sec

2.

50 °C

15 sec

3.

60 °C

4 min

39

30 cyklů

Purifikace sekvenačního produktu Purifikace sekvenačního produktu byla prováděna pomocí komerční sady DyeEx 2.0 Spin Kit (Qiagen) podle doporučení výrobce. Vzorky purifikované touto komerční sadou byly sekvenovány na AbiPrism.

3.2.3.3 Restrikční štěpení pro genotypizaci genu UL55 Pomocí primerů gB 1319 a gB 1604 byl vytvořen PCR produkt o délce 302 bp. Štěpení bylo prováděno enzymy Hinf I a Rsa I k identifikaci genotypů u genu UL55 kódujícího glykoprotein B.

Reakční směs Hinf I: 10X H buffer.......................................................2,0 µl Hinf I.............................................. 0,5 µl (5 jednotek) Destilovaná voda ................................................7,5 µl DNA .................................................................10,0 µl Celkem....................................................................25,0 µl

Reakční směs Rsa I: NEBuffer 1 .........................................................2,0 µl Rsa I............................................... 0,5 µl (5 jednotek) Destilovaná voda ................................................7,5 µl DNA .................................................................10,0 µl Celkem....................................................................25,0 µl

Podle vytvořených fragmentů, které jsou závislé na tvorbě či ztrátě restrikčních míst, lze identifikovat čtyři genotypy CMV. Obě reakční směsi byly inkubovány v termobloku při 37 °C nejméně 3 hodiny (nejlépe přes noc) a inaktivovány při 65 °C 20 minut. 10 µl vzorku z obou reakčních směsí bylo naneseno na 4 % agarózový gel.

3.2.3.4 Klonování Ke klonování byly použity vzorky, u kterých nebylo po sekvenaci jednoznačně možné rozhodnout, o který genotyp se jedná, kvůli přítomnosti směsi několika sekvencí. Klonování bylo provedeno na několika vzorcích u genů UL1 a UL144. K ligaci byly využity přečištěné PCR produkty uchovávané v mrazničce. Ligační reakce, transformace i izolace plazmidů byla 40

provedena stejně jako u genu UL97 viz kapitola 3.2.1. Identifikace vneseného fragmentu byla u genu UL1 provedena podle protokolu (viz Příloha č. 13) a u genu UL144 podle protokolu (viz Příloha č. 12). Pro sekvenaci byly použity plazmidy, které po amplifikaci úseku genu UL1 nebo UL144 vytvořily fragment o správné délce (vizualizace na gelu). Sekvenační reakce byla provedena podle protokolu (viz Příloha č. 19).

41

4 VÝSLEDKY 4.1 DETEKCE REZISTENCE V GENU UL97 4.1.1 Výsledky na plazmidech Pro zajištění dostatečného množství templátu k optimalizaci detekce rezistentních kmenů virů v klinických vzorcích bylo nutné vnést DNA s mutacemi L595S a A594V a DNA bez mutace do plazmidů. Izolovaná plazmidová DNA byla také používána jako pozitivní kontrola při testování klinických vzorků pomocí real-time PCR s následnou HRM. K identifikaci začleněné sekvence s mutací L595S, A594V i sekvence bez mutace po klonování byly použity restrikční endonukleázy Taq α I a Hha I. Tyto endonukleázy vytvářejí podle přítomnosti určitých restrikčních míst specifické fragmenty, jejichž štěpná místa znázorňuje Obr. č. 10. Identifikaci plazmidu s mutantní nebo s DNA bez mutace znázorňuje Obr. č. 11.

Sekvence DNA bez mutace cggtctggacgaggtgcgcatgggcacggaggcgttgctctttaagcacgccggcgcggcctgccgcgcg gccagacctgctccacgcgtacccgtgcctccgcaacgagaaattcgtgcggccgcgccggacggcgcgc ttggagaacggtaagctcacgcactgctt/cgacgcctgtctgctcatt aacctcttgccattcgagtgcgtgacgaa/gctgcggacagacgagtaa Taq I

Sekvence L595S cggtctggacgaggtgcgcatgggcacggaggcgttgctctttaagcacgccggcgcggcctgccgcgcg gccagacctgctccacgcgtacccgtgcctccgcaacgagaaattcgtgcggccgcgccggacggcgcgc tt/cgagaacggtaagctcacgcactgctt/cgacgcctgtctgctcatt aa/gctcttgccattcgagtgcgtgacgaa/gctgcggacagacgagtaa Taq I Taq I

Sekvence A594V Hha I Hha I cggtctggacgaggtgcg/catgggcacggaggcgttgctctttaagcacgccggcg/cggcctgccgcg gccagacctgctccacgc/gtacccgtgcctccgcaacgagaaattcgtgcggccgc/gccggacggcgc tgttggagaacggtaagctcacgcactgcttcgacgcctgtctgctcatt acaacctcttgccattcgagtgcgtgacgaagctgcggacagacgagtaa Obr. č. 10 Štěpení restrikčními endonukleázami Taq α I a Hha I Velikosti restrikčních fragmentů jsou znázorněny v Tab. č. 1

42

Tab. č. 1 Velikosti restrikčních fragmentů vytvořené endonukleázami Taq α I a Hha I

Obr. č. 11 Identifikace PCR produktu s mutací L595S pomocí restrikčních endonukleáz K identifikaci PCR produktu s mutací nebo bez mutace byly použity endonukleázy Taq α I (T) a Hha I (H). Velikosti restrikčních fragmentů charakterizující DNA s mutací L595S a DNA bez mutace jsou znázorněny v Tab. č. 1. Správnou délku produktu umožňují určit 50 bp délkový marker (M). V jamce číslo 9 je neštěpený produkt, jamky 1 a 2 svými fragmenty charakterizují DNA bez mutace a ostatní jamky charakterizují DNA s mutací L595S.

Restrikčními endonukleázami Taq α I a Hha I byly štěpeny PCR produkty vytvořené pomocí primerů CPT 1713 a CPT 1830M. Templátem pro PCR byla plazmidová DNA izolovaná z transformovaných bakterií E. coli.

43

4.1.2 Optimalizace nových primerů pro HRM Optimalizace PCR byla prováděna u genu UL97 s nově navrženými primery 1a, 1b, 1c, 2b, 3a, 3b, 3c, 4a, které se vázaly na DNA podle Obr. č. 12. >>>3a L595S>>> cgcgaatgttaccaccctgctttccgacccatgccgctgcagaagctgctcatctgcgacccgcacgcg >>>4a L595S>>> cgtttccccgtagccggtctacggcgttattgcatgtcggagctgtcggcgctgggtaacgtgctgggc

ttttgcctcatgcggctgttggaccggcgcggtctggacgaggtgcgcatgggcacggaggcgttgctc >>>1c L595S >>> >>>1a L595S >>> tttaagcacgccggcgcggcctgccgcgcgttggagaacggcaagctcacgcactgctccgacgcctgt gttggagaacggcaagctc <<<3b L595S<<< <<<3c L595S<<< ctgctcattctggcggcgcaaatgagctacggcgcctgtctcctgggcgagcatggcgccgcgctggtg <<<2b L595S<<< tcgcacacgctgcgctttgtggaggccaagatgtcctcgtgtcgcgtacgcgcctttcgccgcttctac <<<1b L595S <<< cacgaatgctcgcagaccatgctgcacgaatacgtcagaaagaacgtggagcgtctgttggccacg Obr. č. 12 Primery pro detekci rezistence L595S v genu UL97 Modře zbarvený nukleotid označuje místo, kde dochází ke vzniku mutace L595S, pokud je t (thimidin) zaměněn za c (cytosin). Červeně zabarvené primery 1c, 3c mají thimidin zaměněn za cytosin a jsou použity k amplifikaci mutantní DNA. Kombinace primerů 1a1b, 1a2b, 3a3b a 4a3b amplifikují DNA bez mutace a kombinace 1c1b, 1c2b, 3a3c a 4a3c amplifikují DNA s mutací L595S.

Primery byly navrženy tak, aby se vždy jeden z páru specificky vázal buď pouze na DNA s mutací L595S nebo na DNA bez mutace. Při optimalizaci PCR bylo zjištěno, že všechny kombinace primerů (1c1b, 1c2b, 3a3c a 4a3c), které měly amplifikovat pouze DNA s mutací L595S, amplifikovali i DNA bez mutace. Kombinace primerů 1a1b, 1a2b, 3a3b a 4a3b, které měly amplifikovat DNA bez mutace, amplifikovaly i mutantní DNA. Stejných výsledků tak jako na Obr. č. 13 bylo dosaženo při použití primerů 1a1b, 1c1b, 1a2b a 1c2b. Tyto primery nebyly pro HRM používány, jelikož dostatečně dobře nediskriminovaly DNA bez mutace a DNA s mutací L595S.

44

Obr. č. 13 Elektroforetický gel s produkty PCR Obrázek znázorňuje produkty PCR, které byly vytvořeny pomocí primerů 3a3b (jamky 1, 2), 3a3c (jamky 3, 4), 4a3b (jamky 5, 6) a 4a3c (jamky 7, 8). Obrázek znázorňuje použití různých teplot nasedání primerů na DNA s mutací L595S a DNA bez mutace. Délkový marker 50 bp (M). WT značí DNA bez mutace a Mu značí DNA s mutací L595S.

45

4.1.3 Optimalizace protokolu pro HRM Externí kolo z dvoukolové nested PCR bylo provedeno s primery CPT 1442 a CPT 1979. Optimalizace real-time PCR s následnou HRM byla prováděna s primery CPT 1713 a CPT 1830M a HRM-REZ-F1 a HRM-REZ-R1. >>>CPT 1442>>> gattacagcctcagcgagccctatccggattacaacgagcgctgtgtggccgtctttcaggagacgggc acggcgcgccgcatccccaactgctcgcaccgtctgcgcgaatgttaccaccctgctttccgacccatg ccgctgcagaagctgctcatctgcgacccgcacgcgcgtttccccgtagccggtctacggcgttattgc atgtcggagctgtcggcgctgggcaacgtgctgggcttttgcctcatgcggctgttggaccggcgcggt >>>CPT 1713>>> >>>HRM-REZ-F1>>> ctggacgaggtgcgcatgggcacggaggcgttgctctttaagcacgccggcgcggcctgccgcgcgttg <<
Změnami v ředění PCR produktu z externího kola a v purifikaci byly pro real-time vybrány tyto podmínky: purifikace PCR produktu z externího kola s následným 100násobným ředěním. Jako první byly pro HRM analýzu použity primerů CPT 1713 a CPT 1830M, jejichž amplifikace byla velmi účinná. Amplifikace měla optimální průběh (viz Obr. č. 15). Délka amplifikovaného úseku byla 118 bp, což je ideální délka pro analýzu HRM.

46

Obr. č. 15 Amplifikační křivky produktů vytvořené primery CPT 1713 a CPT 1830M

Následnou HRM analýzou bylo zjištěno, že křivka u některých pacientů má odlišný tvar než křivky, které vytváří PCR produkty s mutacemi i bez mutace amplifikované z plazmidů. HRM (viz Obr. č. 16) a melting analýza s primery CPT 1713 a CPT 1830M (viz Obr. č. 17) tyto dvě skupiny znázorňují. Následovala sekvenace k identifikaci povahy a polohy případných polymorfismů či mutací mezi těmito skupinami. V jednom nukleotidu byl nalezen polymorfismus (viz Obr. č. 14). HRM i melting analýza s těmito primery jednoznačně odlišily vzorky, které nesly mutaci L595S a A594V a vzorky bez mutace.

Obr. č. 16 HRM s primery CPT 1713 a CPT 1830M

47

Obr. č. 17 Melting analýza s primery CPT 1713 a CPT 1830M

Nově navržené primery HRM-REZ-F1 a HRM-REZ-R1 (viz Obr. č. 14) nasedaly na úsek DNA viru tak, aby amplifikovaná sekvence neobsahovala žádný z polymorfismů, ale aby zároveň obsahovala úsek DNA, kde se vyskytují mutace L595S a A594V (viz Tab. č. 2 ). Délka amplifikovaného úseku s těmito primery byla 94 bp. HRM s primery HRM-REZ-F1 a HRMREZ-R1 amplifikovala úsek bez polymorfního nukleotidu, a proto se vytvářel pouze jeden produkt u DNA bez mutace (viz Obr. č. 19). Při použití stejných podmínek jako u primerů CPT 1713 a CPT 1830M docházelo ke špatné amplifikaci, která navíc neměla optimální průběh u vzorků s nížší virovou náloží, proto byla nutná optimalizace. Optimalizaci amplifikace znázorňuje Obr. č. 18. Primery HRM-REZ-F1 a HRM-REZ-R1 však i po optimalizaci špatně diskriminovaly mutaci A594V, a proto nebyly vhodné pro testování.

Tab. č. 2 Kodony amplifikované pomocí primerů pro HRM

48

Obr. č. 18 Amplifikační křivky produktů vytvořené primery HRM-REZ-F1 a HRM-REZ-R1

Obr. č. 19 HRM s primery HRM-REZ-F1 a HRM-REZ-R1

4.1.4 Detekce rezistentního CMV – výsledky na klinických vzorcích K analýze dalších klinických vzorků pacientů byly použity pouze primery CPT 1713 a CPT 1830M. Podle očekávání rozdělila HRM analýza skupinu pacientů bez mutace na dvě skupiny (viz Obr. č. 20). Souhrn výsledků znázorňuje Tab. č. 3.

49

Obr. č. 20 HRM dalších klinických vzorků

Tab. č. 3 Tabulka znázorňuje počet pacientů, kteří byli vyšetřeni. U třiceti čtyř pacientů byl identifikován jeden ze dvou polymorfismů nacházející se v kodonu 579 a u dvaceti osmi byl identifiková druhý polymorfismus.

Po analýze DNA všech šedesáti dvou pacientů nebyl identifikován žádný, který by nesl mutaci v jakémkoliv kodonu nacházejícím se v amplifikovaném úseku, která by vedla k rozvoji rezistence na léčbu.

4.2

GENOTYPIZACE

CMV

V OPAKOVANÝCH

EPIZODÁCH

REAKTIVACE Pro genotypizaci bylo vybráno deset pacientů, kteří měli v průběhu antileukemické léčby alespoň dvě epizody reaktivace CMV. Vzorky byly vybírány tak, aby pocházely vždy z počátku každé reaktivace CMV. Charakter onemocnění nebyl při výběru pacientů zohledňován. Celkově bylo analyzováno dvacet osm vzorků, u nichž byl stanoven genotyp genů UL1, UL55 a UL144.

50

4.2.1 Genotypizace genu UL55 restrikčním štěpením Genotypizace genu UL55 byla provedena nejprve metodou RFLP. PCR produkt amplifikovaný pomocí primerů gB 1319 a gB 1604 měl délku 302 bp. Restrikční endonukleázy Hinf I a Rsa I vytvářející podle přítomnosti určitých restrikčních míst fragmenty specifické pro jednotlivé genotypy (viz Tab. č. 4). Polohu restrikčních míst v sekvenci DNA jednotlivých genotypů gB znázorňuje Obr. č. 21. Příklad restrikční analýzy prováděné na klinických vzorcích ukazuje Obr. č. 22 a Obr. č. 23.

Tab. č. 4 Velikosti restrikčních fragmentů vytvořené endonukleázami Hinf I a Rsa I

gB1 Hinf I Rsa I tggaactcgaacgtttggccaaccgctccagtctg/aatcttactcataatagaaccaaaagaagt/aca accttgagcttgcaaaccggttggcgaggtcagac/ttagaatgagtattatcttggttttcttca/tgt Hinf I gatggcaacaatgcaactcatttatccaacatgg/aatcggtgcacaatctggtctacgcccagctgcag ctaccgttgttacgttgagtaaataggttgtacc/ttagccacgtgttagaccagatgcgggtcgacgtc ttcacctatgacacgttgcgcggttacatcaaccgggcgctggcgcaaatcgcagaagcctggtgtgtgg aagtggatactgtgcaacgcgccaatgtagttggcccgcgaccgcgtttagcgtcttcggaccacacacc atcaacggcgcaccctagaggtcttcaaggaactcagcaagatcaacccgtcagccattctctcggccat tagttgccgcgtgggatctccagaagttccttgagtcgttctagttgggcagtcggtaagagagccggta ttacaacaaaccgattgccgcgcgtttc aatgttgtttggctaacggcgcgcaaag gB2 Rsa I tggaattggaacgtttggccaatcgatccagtctgaatatcactcataggaccagaagaagt/acgagtg accttaaccttgcaaaccggttagctaggtcagacttatagtgagtatcctggtcttcttca/tgctcac Hinf I acaataatacaactcatttgtccagcatgg/aatcggtgcacaatctggtctacgcccagctgcagttca tgttattatgttgagtaaacaggtcgtacc/ttagccacgtgttagaccagatgcgggtcgacgtcaagt cctatgacacgttgcgcggttacatcaaccgggcgctggcgcaaatcgcagaagcctggtgtgtggatca ggatactgtgcaacgcgccaatgtagttggcccgcgaccgcgtttagcgtcttcggaccacacacctagt acggcgcaccctggaggtcttcaaggaactcagcaagatcaacccgtcagccattctctcggccatttac tgccgcgtgggacctccagaagttccttgagtcgttctagttgggcagtcggtaagagagccggtaaatg aacaaaccgattgccgcgcgtttc ttgtttggctaacggcgcgcaaag

51

gB3 Rsa I tggaactggaacgtttggccaatagctccggtgtgaactccacgcgtagaaccaagagaagt/acgggca accttgaccttgcaaaccggttatcgaggccacacttgaggtgcgcatcttggttctcttca/tgcccgt Hinf I Rsa I atacgaccaccctgtcgcttgaaagcg/aatctgt/acgaaatgtgctctacgctcagctgcagttcacc tatgctggtgggacagcgaactttcgc/ttagaca/tgctttacacgagatgcgagtcgacgtcaagtgg tatgatacgttgcgcagctacatcaatcgggcgttggcgcagatcgccgaggcctggtgtgtggatcaac atactatgcaacgcgtcgatgtagttagcccgcaaccgcgtctagcggctccggaccacacacctagttg ggcgcaccctagaggtcttcaaggaactcagcaagatcaatccatcagccattctctcggccatctacaa ccgcgtgggatctccagaagttccttgagtcgttctagttaggtagtcggtaagagagccggtagatgtt caaaccgattgccgcgcgtttc gtttggctaacggcgcgcaaag

gB4 Hinf I Rsa I tggaactcgaacgtttggccaaccgttccagtctg/aatcttactcatagtagaaccagaagaagt/aca accttgagcttgcaaaccggttggcaaggtcagac/ttagaatgagtatcatcttggtcttcttca/tgt Hinf I Rsa I gatggcaccaatgtaactcatttatctaatatgg/actcggt/acacaatctggtctacgcccagctgca ctaccgtggttacattgagtaaatagattatacc/tgagcca/tgtgttagaccagatgcgggtcgacgt gttcacctacgacacgttgcgcggctacatcaaccgggcgttgacacaaatcgcagaagcctggtgtgtg caagtggatgctgtgcaacgcgccgatgtagttggcccgcaactgtgtttagcgtcttcggaccacacac gatcaacggcgcaccctagaggtcttcaaggaacttagcaagatcaacccgtcagctattctctcggcca ctagttgccgcgtgggatctccagaagttccttgaatcgttctagttgggcagtcgataagagagccggt tctacaacaaaccgattgccgcgcgtttc agatgttgtttggctaacggcgcgcaaag Obr. č. 21 Štěpení restrikčními endonukleázami Hinf I a Rsa I Velikosti restrikčních fragmentů jsou znázorněny v Tab. č. 4

52

Obr. č. 22 Identifikace genotypů genu UL55 štěpením endonukleázami Hinf I a Rsa I Obrázek znázorňuje DNA od dvou pacientů (vzorky 1 – 8 a 9 – 12) po restrikčním štěpení. Délkový marker 50 bp (M).

Obr. č. 23 Identifikace genotypů genu UL55 štěpením endonukleázami Hinf I a Rsa I Obrázek znázorňuje DNA od dvou pacientů (vzorky 1 – 8 a 9 – 12) po restrikčním štěpení. Délkový marker 50 bp (M).

Oba pacienti na Obr. č. 22 a první pacient na Obr. č. 23 měli ve všech svých epizodách reaktivace vždy CMV gB1. Pouze druhý pacient na Obr. č. 23 měl ve svých epizodách reaktivace CMV gB2. Pomocí metody RFPL se nepodařilo identifikovat žádného pacienta se směsnou infekcí.

53

4.2.2 Genotypizace genu UL55 sekvenováním Protože genotypizace pomocí PCR-RFLP neukázala téměř žádné rozdíly, rozhodli jsme se provést podrobnější analýzu sekvenací delšího úseku genu kódujícího gB. Optimalizace PCR genu UL55 byla provedena pomocí PCR s primery CMV gB F a CMV gB R. PCR produkt o velikosti 751 bp byl po optimalizaci dostatečně čistý a byl využit pro sekvenaci (viz Obr. č. 24).

Obr. č. 24 PCR produkt genu UL55 Na agarózovém gelu jsou vyzualizovány PCR produkty genu UL55 o velikosti 751 bp. Správnou délku produktu umožňují určit 100 bp délkový marker. Jamka bez fragmentu obsahuje vzorek bez DNA.

Sekvenační reakce byla provedena s primery CMV gB F a CMV gB R ohraničujícími úsek dlouhý 751 bp. Výsledné sekvence byly porovnávány s referenčními sekvencemi M85229 (gB1), M60931 (gB2), M85228 (gB3) a M60926 (gB4). Vzorky obsahovaly sekvence glykoproteinů B1, B2 a B4. GB3 se nevyskytoval v žádném ze studovaných vzorků. Z dvaceti osmi sekvenovaných vzorků pouze jediný obsahoval gB4, a proto nemohl být porovnáván s jinými vzorky. U dvaceti tří vzorků byl identifikován gB1. U dvou vzorků od různých pacientů byl na dvou místech (pozice nukleotidu č. 13 a č. 459) nalezen polymorfismus vyznačený růžovou barvou (viz Příloha č. 1). Sekvence gB2 byly zjištěny u čtyř vzorků, ale pocházely z jednotlivých reaktivací jediného pacienta č. 2 (viz Příloha č. 2) a navzájem byly zcela shodné. GB4 byl nalezen u jednoho vzorku pacienta č. 10 (viz Příloha č. 3).

54

4.2.3 Genotypizace genu UL144 Optimalizace PCR genu UL144 byla provedena pomocí PCR s primery UL144 F a UL144 R. PCR produkt o velikosti 714 bp po optimalizaci neobsahoval žádné nespecifické fragmenty a byl využit pro sekvenaci (viz Obr. č. 25).

Obr. č. 25 PCR produkt genu pro UL144 Na agarózovém gelu jsou vyzualizovány PCR produkty genu UL144 o velikosti 714 bp (jamky 1 – 18). Správnou délku produktu umožňuje určit 100 bp délkový marker. Jamka bez fragmentu obsahuje vzorek bez DNA.

Sekvenační reakce byla provedena s primery UL144 F a UL144 R ohraničujícími úsek dlouhý 714 bp. Výsledné sekvence byly porovnávány s referenčními sekvencemi AF498086 (genotyp A), AF498087 (genotyp B), AF498088 (genotyp C), AF498089 (genotyp A/B) a AF498090 (genotyp A/C). Genotypy C a A/B nebyly nalezeny u žádného ze vzorků. Genotyp A se vyskytoval u obou vzorků pacienta č. 5 a pacienta č. 7. Oba pacienti měli navzájem několik odlišností v sekvenci genotypu A, které jsou vyznačeny (viz Příloha č. 4). Genotyp A/C byl nalezen u jediného pacienta č. 4 (viz Příloha č. 6). U tohoto pacienta byla navíc nalezena ve všech vzorcích směs dvou genotypů – A/C a B. Genotyp B byl nalezen u dvaceti čtyř sekvenovaných vzorků různých pacientů. Mimo pacienta č. 10 byly vzorky pocházející vždy od jednotlivých pacientů zcela stejné. Porovnáním vzorků mezi pacienty bylo zjištěno, že žádní pacienti nemají zcela stejný genotyp B (viz Příloha č. 5).

4.2.4 Genotypizace genu UL1 Optimalizace PCR genu UL1 byla provedena pomocí PCR s dvěma sadami primerů. Primery UL1 F2 a UL1 R (viz Obr. č. 26) a s primery UL1 F1A a UL1 R. Segment o velikosti 522 – 549 bp byl amplifikován pomocí primerů UL1 F2 a UL1 R. Velikost segmentu závisela na genotypu. Segment amplifikovaný primery UL1 F1A a UL1 R byl dlouhý 576 bp. Po

55

optimalizaci PCR byly všechny produkty dostatečně čisté a byly využity k sekvenaci (viz Obr. č. 26).

Obr. č. 26 PCR produkt genu pro gen UL1 amplifikovaný primery UL1 F2 a UL1 R Na agarózovém gelu jsou vyzualizovány PCR produkty genu UL1 o velikosti 522 – 549 bp. Správnou délku produktu umožňují určit 50 bp délkový marker (M). Jamky bez fragmentů (3, 4, 9, 10, 15, 16) obsahují vzorky, jejichž DNA musí být amplifikována jiným primerem např. UL1 F1A.

Sekvenační reakce byla provedena s primery UL1 F1A, UL1 F2 a UL1 R ohraničujícími úsek dlouhý 522 – 576 bp. Výsledné sekvence byly porovnávány s referenčními sekvencemi X17403 (genotyp A), GU937742 (genotyp A), GQ466044 (genotyp B), AY446859 (genotyp B), AY446894 (genotyp C) a GQ221974 (genotyp C). Genotyp C byl nalezen u obou vzorků pacienta č. 8 (viz Příloha č. 9). Genotyp A se vyskytoval u pacientů č. 3, 7 a 9 (viz Příloha č. 7). Vzorky jednotlivých pacientů byly vždy shodné. Při srovnání sekvencí jednotlivých pacientů navzájem nebyl ani jeden pacient zcela stejný s jiným. U pacienta č. 7 byla ve všech vzorcích identifikována směs dvou genotypů – A a B. Genotyp B byl identifikován u pěti pacientů. Vzorky pocházející vždy od jednoho pacienta byly stejné. Porovnáním vzorků mezi pacienty bylo zjištěno, že žádní pacienti nemají zcela stejný genotyp B s referenční sekvencí (viz Příloha č. 8). U pacientů č. 2 a 5 se nepodařilo gen UL1 amplifikovat. 56

4.2.5 Výsledky genotypizace CMV – shrnutí Srovnáním jednotlivých genotypů s referenčními sekvencemi jsem zjistila, že DNA šesti pacientů se zcela shoduje s referenční sekvencí gB1 a tedy i navzájem mezi sebou (viz Příloha č. 1). Jeden pacient měl jeden polymorfní nukleotid a dva pacienti jeden polymorfní a jeden mutovaný nukleotid. Tento nukleotid vede ke změně aminokyseliny. Pacient s gB2 měl dvě záměny v sekvenci oproti referenční sekvenci, ale ani jedna nevedla ke změně aminokyseliny (viz Příloha č. 2). Jednalo se tedy pouze o polymorfismus. Pacient č. 10 měl při první reaktivaci gB1 a ve druhé gB4. Sekvence gB4 byla naprosto shodná s referenční sekvencí (viz Příloha č. 3). Všichni pacienti kromě pacienta č. 10 měli v jednotlivých reaktivacích sekvenčně vždy naprosto shodné genotypy. Porovnáváním jednotlivých sekvencí genu UL144 bylo zjištěno, že oba pacienti s genotypem A měli několik různých změn oproti referenční sekvenci (viz Příloha č. 4). Některé byly polymorfismem a jiné vedly ke změně aminokyseliny. Genotyp B se vyskytoval u nejvíce pacientů a každý z nich měl alespoň jednu změnu oproti referenční sekvenci (viz Příloha č. 5). Nejvíce záměn měli pacienti č. 2 a 9, kteří měli oba čtyři rozdíly. U jediného pacienta byl detekován genotyp A/C, který měl v tomto genu tři změny, z nichž dvě vedly ke změně aminokyseliny a jedna byl polymorfismus. Tento pacient měl zároveň směsnou infekci s genotypem B a to u obou sekvenovaných vzorků, což bylo potvrzeno klonováním. Při porovnání sekvencí genu UL1 měli někteří pacienti se stejným genotypem zcela stejnou sekvenci s jiným pacientem, ale s referenčními sekvencemi neměl sekvenci shodnou nikdo. Dva pacienti s genotypem A se od sebe lišili třemi nukleotidy. Oba pacietni měli jěště navíc jednu stejnou záměnu v dalším nukleotidu. Vzhledem k oběma referenčním sekvencím dvě tyto změny vedly ke změně aminokyseliny a dvě byly polymorfismus. Třetí pacient s genotypem A byl značně odlišný jak od obou předešlých pacientů, tak i od obou referenčních sekvencí (viz Příloha č. 7). Některé změny v nukleotidech vedly k změnám v aminokyselinové sekvenci a některé byly pouze polymorfismem. Mimo jednoho pacienta, který se od ostatních odlišoval pouze delecí o délce 35 bp, byli tito tři pacienti s genotypem B zcela shodní (viz Příloha č. 8). Od obou referenčních sekvencí se však lišily o téměř třicet nukleotidů. Další změny se týkaly pouze jedné nebo druhé referenční sekvence. Další dva pacienti s genotypem B byli od ostatních značně odlišní, ale každý byl s jinou z referenčních sekvencí téměř shodný a tím pádem s druhou rozdílný. Oba měli dvě stejné změny v nukleotidech vůči oběma referenčním sekvencím, které vedly ke změně aminokyseliny. Pacient č. 7 měl ještě další dva polymorfní nukleotidy. Pacient č. 8 s genotypem C měl dvě změny ve dvou nukleotidech, které nevedly ke změně aminokyselny 57

(viz Příloha č. 9). Oba polymorfismy se však vyskytovaly alespoň u jedné z referenčních sekvencí. U dvou pacientů se nepodařilo gen UL1 amplifikovat, což může být způsobeno tím, že jsou infikováni kmenem příbuzným laboratornímu kmenu Towne, který má v tomto genu množství mutací a rozsáhlé delece. U pacienta č. 7 byla detekována směsná infekce u obou analyzovaných vzorků, což bylo potvrzeno klonováním.

58

Tab. č. 5 Souhrnná tabulka výsledků genotypizace CMV * Vzorky, u kterých se nepodařilo amplifikovat virovou DNA genu UL1 MUD – transplantát od nepříbuzného dárce, alo – transplantát od příbuzného dárce, auto – transplantát vlastních krvetvorných buněk

5 DISKUZE 5.1 REZISTENCE CMV je bezpochyby nejčastějším oportunním patogenem člověka, který způsobuje závažné infekce u pacientů po transplantaci hematopoetických kmenových buněk, transplantaci orgánů nebo u osob s AIDS. Účinná léčba CMV infekce se opírá především o nezbytná laboratorní vyšetření, která jsou převážně prováděna pomocí real-time PCR. Oproti široce využívané detekci pp65 je real-time PCR výhodnější, protože je velmi reprodukovatelná, automatizovaná, rychlejší a citlivější (Gimeno et al., 2008). Díky neustálému vývoji by některá z nových metod jako je např. post-PCR metoda HRM, která je schopna provádět genotypizaci a zároveň mutační analýzu na amplifikovaném úseku DNA, mohla nahradit v některých analýzách stávající real-time PCR. Vysoká citlivost HRM byla experimentálně prokázána např. v roce 2006 v

(http://www.ngrl.org.uk/Wessex/downloads/pdf/NGRL_HRM_WebPP.pdf),

kdy

byly

srovnávány různé metody detekce mutací s metodou HRM. Existuje velké množsví prací popisující metodiku HRM, ovšem žádná práce nepopisuje využití HRM ve spojitosti s CMV infekcí (Andriantsoanirina et al., 2009). Hlavním problémem infekcí způsobených CMV je rozvoj rezistence na podávaná antivirotika. Nejčastěji se rozvíjí rezistence u dlouhodobě léčených pacientů s AIDS (Jabs et al., 2001; Jabs et al., 2003), zejména po terapii trvající déle než tři měsíce. Nicméně rezistence se může vyvinout i u osob po transplantacích, osob s primární imunodeficiencí nebo u osob, které byly profylakticky léčeny acyclovirem (Nogueira et al., 2006; Wolf et al., 2003; Wolf et al., 2001). Mutace, které vedou k rozvoji rezistence, se vyskytují u dvou genů, které jsou zapojeny do mechanismu účinku antivirotik. Jsou to geny UL97 a UL54 (Scott et al., 2004). Častěji jsou rezistence detekovány ve spojitosti s genem UL97. Mutace v genu UL54 však mohou vést k závažným zkříženým rezistencím na více antivirotik. Frekvence infekcí způsobených CMV rezistentními kmeny je prozatím neznámá, protože se může značně lišit u osob s odlišným onemocněním. Nová metoda HRM měla značně usnadnit a zrychlit diagnostiku detekce rezistence v genu UL97. Po optimalizaci metody HRM se podařilo detekovat polymorfní místo v blízkosti výskytu nejčastějších mutací (viz Obr. č. 14). Použitím jiných primerů, které toto místo neohraničovaly, však nebyla diskriminace křivek vytvořených u vzorků z DNA bez mutace a DNA s mutací dostatečná (viz Obr. č. 19). Proto jsem k detekci využila původní primery, ačkoliv dělily vzorky bez mutace do dvou skupin (viz Obr. č. 20). Z celkových šedesáti dvou analyzovaných pacientů 55 % pacientů obsahovalo sekvenci GGT v polymorfním kodonu 579 a

45 % obsahovalo ve stejném kodonu sekvenci GGC. Tento polymorfní kodon nijak neovlivňuje diskriminaci vzorků bez mutace a vzorků s mutacemi. Možnost, jak se vyhnout polymorfnímu kodonu a tím se vyhnout dvěma typům křivek u vzorků bez mutace, by spočívala v navržení jiných primerů, které by dostatečně dobře odlišily mutantní a nemutovanou DNA. Metoda HRM nebyla prozatím použita pro detekci mutací v genu UL97. Tato práce však potvrdila, že HRM je možné využít jako diagnostickou metodu k detekci CMV rezistence. V současnosti jsou mutace v genu UL97 detekovány především pomocí nested PCR-RFLP (Nogueira et al., 2006), sekvenací (Boutolleau et al., 2009; Lurain et al., 2001) nebo real-time PCR (Liu and Zhang, 2008). Oproti široce využívané metodě nested PCR-RFLP (Eckle et al., 2003; Eckle et al., 2004) je HRM mnohem rychlejší, je výrazně citlivější a nevyžaduje zdlouhavé post-PCR zpracování. Oproti sekvenaci má HRM tu výhodu, že je podstatně levnější, rychlejší a hlavně výrazně reprodukovatelnější. Vzhledem k metodě real-time PCR má HRM schopnost rozeznat jednotlivé mutace nebo polymorfismy, které real-time není schopna bez specifických sond odlišit. Pokud by bylo použito dostatečné množství sond, aby detekovaly veškeré známé mutace, musela by být každá sonda značena jiným fluorochromem. Použití takovéhoto množství sond by bylo velmi nákladné. Reprodukovatelnost obou metod je srovnatelná.

5.2 GENOTYPIZACE Genotypizace CMV slouží k identifikaci rozložení jednotlivých genotypů CMV v různých populacích. Snahou mnoha studií bylo především najít vztah mezi jednotlivými symptomy CMV infekce a příslušnými genotypy např. u glykoproteinu B (Wu et al., 2009), nebo najít souvislost mezi genotypem určitého genu a tropismem k některým buňkám (Tarrago et al., 2003). Některé studie takovéto souvislosti potvrzují, ale definitivní spojitost prozatím popsána nebyla. Bylo také publikováno, že smíšená infekce vede k závažnějším klinickým projevům (Coaquette et al., 2004; Pang et al., 2008) a že často dochází k superinfekci novým kmenem CMV, pokud pacient přijme transplantát od seropozitivního dárce (Manuel et al., 2009). Prozatím se však žádná studie nezabývala tím, zda je v jednotlivých epizodách CMV reaktivován vždy stejný kmen CMV nebo zda dochází k reaktivaci jiného endogenního kmene, nebo infekci novým CMV kmenem, pokud není brána v úvahu superinfekce od dárce transplantátu. Druhým cílem této práce byla tedy snaha identifikovat, zda v jednotlivých reaktivacích CMV infekce dochází k reaktivaci stále stejního nebo jiného kmene CMV. Pro genotypizaci jsem vybrala jako první gen UL55 kódující glykoprotein B, který je jedním z nejčastějších genů používaných ke genotypizaci CMV. Ve své práci jsem potvrdila, že gB1 je 61

nejčastěji se vyskytujícím genotypem, tak jak to bylo potvrzeno i jinde (Fan et al., 2009). Ze všech analyzovaných vzorků byl přítomen gB1 u 89 %, gB2 u 14 %, gB3 nebyl detekován a gB4 byl přítomen v 3,6 %. U různě imunokompromitovaných jedinců může být procentuální zastoupení částečně odlišné, čemuž odpovídají tyto výsledky v porovnání s jinými studiemi (Manuel et al., 2009). Směsná infekce vzhledem k tomuto genu nebyla detekována u žádného vzorku. Podle dostupné literatury se směs dvou nebo více genotypů CMV vyskytuje jen u asi 20 % pacientů (Manuel et al., 2009; Pang et al., 2008). Gen UL144 je velmi vhodný ke genotypizaci, protože je velmi variabilní. Je to strukturální homolog TNF receptorové superrodiny, který váže pouze jeden ligand, B a T lymfocytární atenuátor (BTLA) (Cheung et al., 2005). Původně tři nedávno popsané genotypy A, B a C byly rozšířeny o další dva chimerické A/B a A/C (A sekvence N-terminálního konce genu a B nebo C sekvence C-terminálního konce genu) (Lurain et al., 1999). Rozdělení bylo založeno na detekci velkého počtu polymorfismů v genu UL144. Každý genotyp však stále obsahují řadu míst, kde se vyskytuje polymorfismus nebo dochází ke změně aminokyseliny. Taková variabilní místa mezi sekvencemi jednotlivých pacientů určitého genotypu se vyskytovala i v této práci. Obdobně jako u gB je snaha identifikovat, zda některé symptomy CMV infekce nesouvisí s určitým genotypem i u genu UL144. V některých studiích tato souvislost byla potvrzena (AravBoger et al., 2006; Arav-Boger et al., 2002). Arav-Boger et al. tvrdí, že především genotypy A a C, které jsou v populaci méně časté, jsou spojeny s mnohem závažnějšími příznaky než ostatní genotypy. Jiné studie souvislost s různými symptomy vyvracejí (Heo et al., 2008; Mao et al., 2007; Tanaka et al., 2005; Yan et al., 2008). Většina studií je však prováděna v souvislosti s kongenitálním přenosem CMV, proto nelze říci, zda tyto výsledky mohou platit i u osob po PBSCT. Proto nelze srovnávat výskyt genotypizace uvedené v této práci (A 14 %, B 86 %, A/C 14 %) s výsledky uvedenými v těchto článcích. Třetí analyzovaný gen byl gen UL1, který kóduje membránový protein. Patří do rodiny RL11 (Sekulin et al., 2007). Z této rodiny je gen UL1 nejvíce variabilní, což potvrzují i mé výsledky. Pro každý genotyp byly popsány dvě částečně odlišné sekvence, avšak za jiný genotyp považovány nejsou. To může být znak, proč je tento gen tak variabilní. Není to příliš prozkoumaný gen, proto je porovnávání obtížné. Jednotlivé genotypy měly v mé práci zastoupení A (25 %), B (54 %) a C (7 %). Vzhledem k identifikaci jednoho pacienta – pacient č. 10, u něhož byl v obou reaktivacích detekován jiný kmen CMV jak u genu UL55 tak u genu UL144, lze konstatovat, že ne vždy dochází k reaktivaci původního endogenního kmene.

62

6 ZÁVĚR Doposud nejčastějším oportunním patogenem způsobujícím závažné infekce u imunokompromitovaných osob po PBSCT nebo BMT je CMV. U těchto osob se provádí rutinně screening pomocí real-time PCR pro včasný záchyt reaktivace CMV a sledování odpovědi na léčbu. Při ztrátě léčebné odpovědi (opětovný nárůst virové nálože) vzniká podezření na rozvoj rezistence viru. Současné metody jako je převážně RFLP umožňují potvrdit rozvoj rezistence do dvou dnů. Z toho důvodu byla tato práce zaměřena na další možné způsoby detekce rezistence CMV v kratší době. Vybrána byla poměrně nová metoda HRM, která vyniká především svou jednoduchostí, reprodukovatelností, rychlostí a možností provádět současně genotypizaci a mutační analýzu. Touto metodou bylo analyzováno celkem šedesát dva pacientů. Metoda HRM představuje jednoduchý detekční systém založený na analýze křivek tání jednotlivých DNA CMV. Detekovat mutace vedoucí k rozvoji rezistence je možné touto metodou již za šest hodin. Na základě získaných výsledků lze konstatovat, že metodu HRM se podařilo úspěšně zoptimalizovat a může být použita pro rutinní diagnostiku rezistence CMV v genu UL97. Na základě mnoha zveřejněných výsledků týkajících se genotypizace CMV bylo dalším cílem práce zmapovat přítomnost genotypů určitých genů v jednotlivých epizodách reaktivace CMV. Celkem bylo pro genotypizaci vybráno deset pacientů, u nichž byly pomocí sekvenace a PCR-RFLP analyzovány tři geny ve všech reaktivacích. Procentuální rozložení genotypů jednotlivých genů odpovídá průměrným výsledkům publikovaným po celém světě, mimo gen UL1, kterým se příliš mnoho studií prozatím nezabývalo. Analýzou získaných dat lze zjistit, že v jednotlivých reaktivacích CMV dochází zpravidla k reaktivaci stále stejného endogenního kmene CMV.

63

7 SUMMARY The most frequent opportunistic pathogen that causes serious infections at immunocompromised persons after PBSCT or BMT is CMV. These persons are rutinely subjected to the screenings carried out by real-time PCR to ensure timely capture of the CMV reactivation as well as the cure response monitoring. If the cure response is lost (meaning a reccurent grow of viral load), a suspicion of a viral resistance development arises. The current methods, as is predominantly RFLP, make it possible to confirm the resistance development within two days. That is why the thesis focuses on further options of the CMV resistance detection accomplishmed in shorter time. A relatively new HRM method has been chosen for that reason. This method stands out mainly for its simplicity, reproducibility, rapidity and possibility of carrying out the genotypisation and mutation analysis at the same time. Sixty two pacients in total were analysed with the above mentioned method. The HRM method represents a simple system of detection based on the melting curve analysis of individual DNA CMV. Using this method, it is possible to detect the mutations that lead to the resistance development in as early as six hours. On the basis of the acquired results, it is possible to state that the HRM method has been successfully optimalized and might be applied for rutinne CMV resistance diagnosis in the UL97 gene. Based on many published outcomes concerning CMV genotypisation, the further goal of the thesis was to map the presence of genotypes of particular genes in individual episodes of CMV reactivation. Ten patients were selected, whereat three genes were analysed in all reactivations using the sequenation and PCR-RFPL. The percentual genotype distribution of individual genes corresponds to the average outcomes published all over the world (except for the UL1 gene, which was not concern of many studies yet). Using the analysis of acquired information, it is possible to ascertain that in separate CMV reactivations, always the same endogenous CMV stem is being reactivated as a rule.

64

8 LITERATURA Andriantsoanirina, V., Lascombes, V., Ratsimbasoa, A., Bouchier, C., Hoffman, J., Tichit, M., Rabarijaona, L. P., Durand, R. and Menard, D. (2009). Rapid detection of point mutations in Plasmodium falciparum genes associated with antimalarial drugs resistance by using High-Resolution Melting analysis. J Microbiol Methods 78: 165-170. Arav-Boger, R., Battaglia, C. A., Lazzarotto, T., Gabrielli, L., Zong, J. C., Hayward, G. S., Diener-West, M. and Landini, M. P. (2006). Cytomegalovirus (CMV)-encoded UL144 (truncated tumor necrosis factor receptor) and outcome of congenital CMV infection. J Infect Dis 194: 464-473. Arav-Boger, R., Willoughby, R. E., Pass, R. F., Zong, J. C., Jang, W. J., Alcendor, D. and Hayward, G. S. (2002). Polymorphisms of the cytomegalovirus (CMV)-encoded tumor necrosis factor-alpha and beta-chemokine receptors in congenital CMV disease. J Infect Dis 186: 1057-1064. Baldanti, F., Lurain, N. and Gerna, G. (2004). Clinical and biologic aspects of human cytomegalovirus resistance to antiviral drugs. Hum Immunol 65: 403-409. Bego, M., Maciejewski, J., Khaiboullina, S., Pari, G. and St Jeor, S. (2005). Characterization of an antisense transcript spanning the UL81-82 locus of human cytomegalovirus. J Virol 79: 11022-11034. Blaise, D., Kuentz, M., Fortanier, C., Bourhis, J. H., Milpied, N., Sutton, L., Jouet, J. P., Attal, M., Bordigoni, P., Cahn, J. Y., Boiron, J. M., Schuller, M. P., Moatti, J. P. and Michallet, M. (2000). Randomized trial of bone marrow versus lenograstim-primed blood cell allogeneic transplantation in patients with early-stage leukemia: a report from the Societe Francaise de Greffe de Moelle. J Clin Oncol 18: 537-546. Blok, M. J., Lautenschlager, I., Goossens, V. J., Middeldorp, J. M., Vink, C., Hockerstedt, K. and Bruggeman, C. A. (2000). Diagnostic implications of human cytomegalovirus immediate early-1 and pp67 mRNA detection in whole-blood samples from liver transplant patients using nucleic acid sequence-based amplification. J Clin Microbiol 38: 4485-4491. Boutolleau, D., Deback, C., Bressollette-Bodin, C., Varnous, S., Dhedin, N., Barrou, B., Vernant, J. P., Gandjbakhch, I., Imbert-Marcille, B. M. and Agut, H. (2009). Resistance pattern of cytomegalovirus (CMV) after oral valganciclovir therapy in transplant recipients at high-risk for CMV infection. Antiviral Res 81: 174-179. Bregante, S., Bertilson, S., Tedone, E., Van Lint, M. T., Trespi, G., Mordini, N., Berisso, G., Gualandi, F., Lamparelli, T., Figari, O., Benvenuto, F., Raiola, A. M. and Bacigalupo, A. (2000). Foscarnet prophylaxis of cytomegalovirus infections in patients undergoing allogeneic bone marrow transplantation (BMT): a dose-finding study. Bone Marrow Transplant 26: 23-29. Burns, L. J., Miller, W., Kandaswamy, C., DeFor, T. E., MacMillan, M. L., Van Burik, J. A. and Weisdorf, D. J. (2002). Randomized clinical trial of ganciclovir vs acyclovir for 65

prevention of cytomegalovirus antigenemia after allogeneic transplantation. Bone Marrow Transplant 30: 945-951. Cariani, E., Pollara, C. P., Valloncini, B., Perandin, F., Bonfanti, C. and Manca, N. (2007). Relationship between pp65 antigenemia levels and real-time quantitative DNA PCR for Human Cytomegalovirus (HCMV) management in immunocompromised patients. BMC Infect Dis 7: 138. Coaquette, A., Bourgeois, A., Dirand, C., Varin, A., Chen, W. and Herbein, G. (2004). Mixed cytomegalovirus glycoprotein B genotypes in immunocompromised patients. Clin Infect Dis 39: 155-161. Cunningham, C., Gatherer, D., Hilfrich, B., Baluchova, K., Dargan, D. J., Thomson, M., Griffiths, P. D., Wilkinson, G. W., Schulz, T. F. and Davison, A. J. (2009). Sequences of complete human cytomegalovirus genomes from infected cell cultures and clinical specimens. J Gen Virol 91: 605-615. Dowd, J. B., Aiello, A. E. and Alley, D. E. (2009). Socioeconomic disparities in the seroprevalence of cytomegalovirus infection in the US population: NHANES III. Epidemiol Infect 137: 58-65. Dunn, W., Chou, C., Li, H., Hai, R., Patterson, D., Stolc, V., Zhu, H. and Liu, F. (2003). Functional profiling of a human cytomegalovirus genome. Proc Natl Acad Sci U S A 100: 14223-14228. Eckle, T., Jahn, G. and Hamprecht, K. (2003). High impact of an expanded restriction fragment length polymorphism assay on detection of ganciclovir-resistant UL97 mutants of human cytomegalovirus. Antimicrob Agents Chemother 47: 442-443. Eckle, T., Jahn, G. and Hamprecht, K. (2004). The influence of mixed HCMV UL97 wildtype and mutant strains on ganciclovir susceptibility in a cell associated plaque reduction assay. J Clin Virol 30: 50-56. Eckle, T., Lang, P., Prix, L., Jahn, G., Klingebiel, T., Handgretinger, R., Selle, B., Niethammer, D. and Hamprecht, K. (2002). Rapid development of ganciclovir-resistant cytomegalovirus infection in children after allogeneic stem cell transplantation in the early phase of immune cell recovery. Bone Marrow Transplant 30: 433-439. Einsele, H., Hebart, H., Kauffmann-Schneider, C., Sinzger, C., Jahn, G., Bader, P., Klingebiel, T., Dietz, K., Loffler, J., Bokemeyer, C., Muller, C. A. and Kanz, L. (2000). Risk factors for treatment failures in patients receiving PCR-based preemptive therapy for CMV infection. Bone Marrow Transplant 25: 757-763. Escuissato, D. L., Gasparetto, E. L., Marchiori, E., Rocha Gde, M., Inoue, C., Pasquini, R. and Muller, N. L. (2005). Pulmonary infections after bone marrow transplantation: highresolution CT findings in 111 patients. AJR Am J Roentgenol 185: 608-615. Fan, J., Zhang, X., Chen, X. M., Gao, H. N., Yang, M. F., Zhao, H., Hu, J. H. and Ma, W. H. (2009). Monitoring of human cytomegalovirus glycoprotein B genotypes using real-time quantitative PCR in immunocompromised Chinese patients. J Virol Methods 160: 74-77. 66

Forster, M. R., Bickerstaff, A. A., Wang, J. J., Zimmerman, P. D. and Cook, C. H. (2009). Allogeneic stimulation causes transcriptional reactivation of latent murine cytomegalovirus. Transplant Proc 41: 1927-1931. Garritano, S., Gemignani, F., Voegele, C., Nguyen-Dumont, T., Le Calvez-Kelm, F., De Silva, D., Lesueur, F., Landi, S. and Tavtigian, S. V. (2009). Determining the effectiveness of High Resolution Melting analysis for SNP genotyping and mutation scanning at the TP53 locus. BMC Genet 10: 5. Gerna, G., Lilleri, D., Baldanti, F., Torsellini, M., Giorgiani, G., Zecca, M., De Stefano, P., Middeldorp, J., Locatelli, F. and Revello, M. G. (2003). Human cytomegalovirus immediate-early mRNAemia versus pp65 antigenemia for guiding pre-emptive therapy in children and young adults undergoing hematopoietic stem cell transplantation: a prospective, randomized, open-label trial. Blood 101: 5053-5060. Gerna, G., Percivalle, E., Baldanti, F., Sozzani, S., Lanzarini, P., Genini, E., Lilleri, D. and Revello, M. G. (2000). Human cytomegalovirus replicates abortively in polymorphonuclear leukocytes after transfer from infected endothelial cells via transient microfusion events. J Virol 74: 5629-5638. Ghosh, S., Champlin, R. E., Englund, J., Giralt, S. A., Rolston, K., Raad, I., Jacobson, K., Neumann, J., Ippoliti, C., Mallik, S. and Whimbey, E. (2000). Respiratory syncytial virus upper respiratory tract illnesses in adult blood and marrow transplant recipients: combination therapy with aerosolized ribavirin and intravenous immunoglobulin. Bone Marrow Transplant 25: 751-755. Gidlof, O., Burvall, S., Edvinsson, L., Montelius, M., Allen, M. and Molin, M. (2009). Complete discrimination of six individuals based on high-resolution melting of hypervariable regions I and II of the mitochondrial genome. Biotechniques 47: 671-672, 674, 676, passim. Gimeno, C., Solano, C., Latorre, J. C., Hernandez-Boluda, J. C., Clari, M. A., Remigia, M. J., Furio, S., Calabuig, M., Tormo, N. and Navarro, D. (2008). Quantification of DNA in plasma by an automated real-time PCR assay (cytomegalovirus PCR kit) for surveillance of active cytomegalovirus infection and guidance of preemptive therapy for allogeneic hematopoietic stem cell transplant recipients. J Clin Microbiol 46: 3311-3318. Goodrum, F. D., Jordan, C. T., High, K. and Shenk, T. (2002). Human cytomegalovirus gene expression during infection of primary hematopoietic progenitor cells: a model for latency. Proc Natl Acad Sci U S A 99: 16255-16260. Greijer, A. E., Adriaanse, H. M., Dekkers, C. A. and Middeldorp, J. M. (2002). Multiplex realtime NASBA for monitoring expression dynamics of human cytomegalovirus encoded IE1 and pp67 RNA. J Clin Virol 24: 57-66. Haberland, M., Meyer-Konig, U. and Hufert, F. T. (1999). Variation within the glycoprotein B gene of human cytomegalovirus is due to homologous recombination. J Gen Virol 80 ( Pt 6): 1495-1500. Hahn, G., Jores, R. and Mocarski, E. S. (1998). Cytomegalovirus remains latent in a common precursor of dendritic and myeloid cells. Proc Natl Acad Sci U S A 95: 3937-3942. 67

Heo, J., Petheram, S., Demmler, G., Murph, J. R., Adler, S. P., Bale, J. and Sparer, T. E. (2008). Polymorphisms within human cytomegalovirus chemokine (UL146/UL147) and cytokine receptor genes (UL144) are not predictive of sequelae in congenitally infected children. Virology 378: 86-96. Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P. S. and Griffith, R. (1992). Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences. Biotechnology (N Y) 10: 413-417. Hobom, U., Brune, W., Messerle, M., Hahn, G. and Koszinowski, U. H. (2000). Fast screening procedures for random transposon libraries of cloned herpesvirus genomes: mutational analysis of human cytomegalovirus envelope glycoprotein genes. J Virol 74: 7720-7729. Hummel, M., Kurian, S. M., Lin, S., Borodyanskiy, A., Zhang, Z., Li, Z., Kim, S. J., Salomon, D. R. and Abecassis, M. (2009). Intragraft TNF receptor signaling contributes to activation of innate and adaptive immunity in a renal allograft model. Transplantation 87: 178-188. Cha, T. A., Tom, E., Kemble, G. W., Duke, G. M., Mocarski, E. S. and Spaete, R. R. (1996). Human cytomegalovirus clinical isolates carry at least 19 genes not found in laboratory strains. J Virol 70: 78-83. Chantaraarphonkun, S. and Bhattarakosol, P. (2007). Intra- and intergenotypic variations among human cytomegalovirus gB genotypes. Intervirology 50: 78-84. Cheung, T. C., Humphreys, I. R., Potter, K. G., Norris, P. S., Shumway, H. M., Tran, B. R., Patterson, G., Jean-Jacques, R., Yoon, M., Spear, P. G., Murphy, K. M., Lurain, N. S., Benedict, C. A. and Ware, C. F. (2005). Evolutionarily divergent herpesviruses modulate T cell activation by targeting the herpesvirus entry mediator cosignaling pathway. Proc Natl Acad Sci U S A 102: 13218-13223. Chmara, M., Wasag, B., Zuk, M., Kubalska, J., Wegrzyn, A., Bednarska-Makaruk, M. and Pronicka, E. (2010). Molecular characterization of Polish patients with familial hypercholesterolemia: novel and recurrent LDLR mutations. J Appl Genet 51: 95-106. Chou, S., Lurain, N. S., Thompson, K. D., Miner, R. C. and Drew, W. L. (2003). Viral DNA polymerase mutations associated with drug resistance in human cytomegalovirus. J Infect Dis 188: 32-39. Chou, S., Waldemer, R. H., Senters, A. E., Michels, K. S., Kemble, G. W., Miner, R. C. and Drew, W. L. (2002). Cytomegalovirus UL97 phosphotransferase mutations that affect susceptibility to ganciclovir. J Infect Dis 185: 162-169. Jabs, D. A., Martin, B. K., Forman, M. S., Dunn, J. P., Davis, J. L., Weinberg, D. V., Biron, K. K., Baldanti, F. and Hu, H. (2001). Longitudinal observations on mutations conferring ganciclovir resistance in patients with acquired immunodeficiency syndrome and cytomegalovirus retinitis: The Cytomegalovirus and Viral Resistance Study Group Report Number 8. Am J Ophthalmol 132: 700-710.

68

Jabs, D. A., Martin, B. K., Forman, M. S., Hubbard, L., Dunn, J. P., Kempen, J. H., Davis, J. L. and Weinberg, D. V. (2003). Cytomegalovirus resistance to ganciclovir and clinical outcomes of patients with cytomegalovirus retinitis. Am J Ophthalmol 135: 26-34. Krypuy, M., Ahmed, A. A., Etemadmoghadam, D., Hyland, S. J., DeFazio, A., Fox, S. B., Brenton, J. D., Bowtell, D. D. and Dobrovic, A. (2007). High resolution melting for mutation scanning of TP53 exons 5-8. BMC Cancer 7: 168. Landini, M. P., Lazzarotto, T., Xu, J., Geballe, A. P. and Mocarski, E. S. (2000). Humoral immune response to proteins of human cytomegalovirus latency-associated transcripts. Biol Blood Marrow Transplant 6: 100-108. Landolfo, S., Gariglio, M., Gribaudo, G. and Lembo, D. (2003). The human cytomegalovirus. Pharmacol Ther 98: 269-297. Lee, Y. H., Lim, Y. J., Kim, J. Y., Kim, Y. D. and Lee, S. W. (2008). Pre-engraftment syndrome in hematopoietic stem cell transplantation. J Korean Med Sci 23: 98-103. Leung, A. N., Gosselin, M. V., Napper, C. H., Braun, S. G., Hu, W. W., Wong, R. M. and Gasman, J. (1999). Pulmonary infections after bone marrow transplantation: clinical and radiographic findings. Radiology 210: 699-710. Liew, M., Pryor, R., Palais, R., Meadows, C., Erali, M., Lyon, E. and Wittwer, C. (2004). Genotyping of single-nucleotide polymorphisms by high-resolution melting of small amplicons. Clin Chem 50: 1156-1164. Liu, J. B. and Zhang, Z. (2008). Development of SYBR Green I-based real-time PCR assay for detection of drug resistance mutations in cytomegalovirus. J Virol Methods 149: 129135. Ljungman, P., Deliliers, G. L., Platzbecker, U., Matthes-Martin, S., Bacigalupo, A., Einsele, H., Ullmann, J., Musso, M., Trenschel, R., Ribaud, P., Bornhauser, M., Cesaro, S., Crooks, B., Dekker, A., Gratecos, N., Klingebiel, T., Tagliaferri, E., Ullmann, A. J., Wacker, P. and Cordonnier, C. (2001). Cidofovir for cytomegalovirus infection and disease in allogeneic stem cell transplant recipients. The Infectious Diseases Working Party of the European Group for Blood and Marrow Transplantation. Blood 97: 388-392. Ljungman, P., Perez-Bercoff, L., Jonsson, J., Avetisyan, G., Sparrelid, E., Aschan, J., Barkholt, L., Larsson, K., Winiarski, J., Yun, Z. and Ringden, O. (2006). Risk factors for the development of cytomegalovirus disease after allogeneic stem cell transplantation. Haematologica 91: 78-83. Lodoen, M., Ogasawara, K., Hamerman, J. A., Arase, H., Houchins, J. P., Mocarski, E. S. and Lanier, L. L. (2003). NKG2D-mediated natural killer cell protection against cytomegalovirus is impaired by viral gp40 modulation of retinoic acid early inducible 1 gene molecules. J Exp Med 197: 1245-1253. Lurain, N. S., Kapell, K. S., Huang, D. D., Short, J. A., Paintsil, J., Winkfield, E., Benedict, C. A., Ware, C. F. and Bremer, J. W. (1999). Human cytomegalovirus UL144 open reading frame: sequence hypervariability in low-passage clinical isolates. J Virol 73: 1004010050. 69

Lurain, N. S., Weinberg, A., Crumpacker, C. S. and Chou, S. (2001). Sequencing of cytomegalovirus UL97 gene for genotypic antiviral resistance testing. Antimicrob Agents Chemother 45: 2775-2780. Maiolino, A., Biasoli, I., Lima, J., Portugal, A. C., Pulcheri, W. and Nucci, M. (2003). Engraftment syndrome following autologous hematopoietic stem cell transplantation: definition of diagnostic criteria. Bone Marrow Transplant 31: 393-397. Manuel, O., Pang, X. L., Humar, A., Kumar, D., Doucette, K. and Preiksaitis, J. K. (2009). An assessment of donor-to-recipient transmission patterns of human cytomegalovirus by analysis of viral genomic variants. J Infect Dis 199: 1621-1628. Mao, Z. Q., He, R., Sun, M., Qi, Y., Huang, Y. J. and Ruan, Q. (2007). The relationship between polymorphisms of HCMV UL144 ORF and clinical manifestations in 73 strains with congenital and/or perinatal HCMV infection. Arch Virol 152: 115-124. Meyer-Koenig, U., Romberg, I., Schneider, K., Weidmann, M., Kern, W. V. and Hufert, F. T. (2006). Diagnostic value of reverse transcription-PCR for detection of cytomegalovirus pp67 in samples from solid-organ transplant recipients. J Clin Microbiol 44: 3394-3396. Miller, W., Flynn, P., McCullough, J., Balfour, H. H., Jr., Goldman, A., Haake, R., McGlave, P., Ramsay, N. and Kersey, J. (1986). Cytomegalovirus infection after bone marrow transplantation: an association with acute graft-v-host disease. Blood 67: 1162-1167. Momma, Y., Nagineni, C. N., Chin, M. S., Srinivasan, K., Detrick, B. and Hooks, J. J. (2003). Differential expression of chemokines by human retinal pigment epithelial cells infected with cytomegalovirus. Invest Ophthalmol Vis Sci 44: 2026-2033. Musso, M., Bocciardi, R., Parodi, S., Ravazzolo, R. and Ceccherini, I. (2006). Betaine, dimethyl sulfoxide, and 7-deaza-dGTP, a powerful mixture for amplification of GC-rich DNA sequences. J Mol Diagn 8: 544-550. Nogueira, E., Ozaki, K. S., Tomiyama, H., Granato, C. F., Camara, N. O. and Pacheco-Silva, A. (2006). The emergence of cytomegalovirus resistance to ganciclovir therapy in kidney transplant recipients. Int Immunopharmacol 6: 2031-2037. Nomoto, K., Tsuta, K., Takano, T., Fukui, T., Yokozawa, K., Sakamoto, H., Yoshida, T., Maeshima, A. M., Shibata, T., Furuta, K., Ohe, Y. and Matsuno, Y. (2006). Detection of EGFR mutations in archived cytologic specimens of non-small cell lung cancer using high-resolution melting analysis. Am J Clin Pathol 126: 608-615. Nye, M. B., Leman, A. R., Meyer, M. E., Menegus, M. A. and Rothberg, P. G. (2005). Sequence diversity in the glycoprotein B gene complicates real-time PCR assays for detection and quantification of cytomegalovirus. J Clin Microbiol 43: 4968-4971. Odell, I. D., Cloud, J. L., Seipp, M. and Wittwer, C. T. (2005). Rapid species identification within the Mycobacterium chelonae-abscessus group by high-resolution melting analysis of hsp65 PCR products. Am J Clin Pathol 123: 96-101.

70

Ohta, H., Matsuda, Y., Tokimasa, S., Sawada, A., Kim, J. Y., Sashihara, J., Amo, K., Miyagawa, H., Tanaka-Taya, K., Yamamoto, S., Tano, Y., Aono, T., Yamanishi, K., Okada, S. and Hara, J. (2001). Foscarnet therapy for ganciclovir-resistant cytomegalovirus retinitis after stem cell transplantation: effective monitoring of CMV infection by quantitative analysis of CMV mRNA. Bone Marrow Transplant 27: 1141-1145. Pang, X., Humar, A. and Preiksaitis, J. K. (2008). Concurrent genotyping and quantitation of cytomegalovirus gB genotypes in solid-organ-transplant recipients by use of a real-time PCR assay. J Clin Microbiol 46: 4004-4010. Pepperl, S., Munster, J., Mach, M., Harris, J. R. and Plachter, B. (2000). Dense bodies of human cytomegalovirus induce both humoral and cellular immune responses in the absence of viral gene expression. J Virol 74: 6132-6146. Poncet, D., Pauleau, A. L., Szabadkai, G., Vozza, A., Scholz, S. R., Le Bras, M., Briere, J. J., Jalil, A., Le Moigne, R., Brenner, C., Hahn, G., Wittig, I., Schagger, H., Lemaire, C., Bianchi, K., Souquere, S., Pierron, G., Rustin, P., Goldmacher, V. S., Rizzuto, R., Palmieri, F. and Kroemer, G. (2006). Cytopathic effects of the cytomegalovirus-encoded apoptosis inhibitory protein vMIA. J Cell Biol 174: 985-996. Poole, E., King, C. A., Sinclair, J. H. and Alcami, A. (2006). The UL144 gene product of human cytomegalovirus activates NFkappaB via a TRAF6-dependent mechanism. Embo J 25: 4390-4399. Post, M. J., Lass-Floerl, C., Gastl, G. and Nachbaur, D. (2007). Invasive fungal infections in allogeneic and autologous stem cell transplant recipients: a single-center study of 166 transplanted patients. Transpl Infect Dis 9: 189-195. Razonable, R. R., Rivero, A., Rodriguez, A., Wilson, J., Daniels, J., Jenkins, G., Larson, T., Hellinger, W. C., Spivey, J. R. and Paya, C. V. (2001). Allograft rejection predicts the occurrence of late-onset cytomegalovirus (CMV) disease among CMV-mismatched solid organ transplant patients receiving prophylaxis with oral ganciclovir. J Infect Dis 184: 1461-1464. Reusser, P., Einsele, H., Lee, J., Volin, L., Rovira, M., Engelhard, D., Finke, J., Cordonnier, C., Link, H. and Ljungman, P. (2002). Randomized multicenter trial of foscarnet versus ganciclovir for preemptive therapy of cytomegalovirus infection after allogeneic stem cell transplantation. Blood 99: 1159-1164. Rigoutsos, I., Novotny, J., Huynh, T., Chin-Bow, S. T., Parida, L., Platt, D., Coleman, D. and Shenk, T. (2003). In silico pattern-based analysis of the human cytomegalovirus genome. J Virol 77: 4326-4344. Scott, G. M., Isaacs, M. A., Zeng, F., Kesson, A. M. and Rawlinson, W. D. (2004). Cytomegalovirus antiviral resistance associated with treatment induced UL97 (protein kinase) and UL54 (DNA polymerase) mutations. J Med Virol 74: 85-93. Sekulin, K., Gorzer, I., Heiss-Czedik, D. and Puchhammer-Stockl, E. (2007). Analysis of the variability of CMV strains in the RL11D domain of the RL11 multigene family. Virus Genes 35: 577-583. 71

Sinzger, C., Grefte, A., Plachter, B., Gouw, A. S., The, T. H. and Jahn, G. (1995). Fibroblasts, epithelial cells, endothelial cells and smooth muscle cells are major targets of human cytomegalovirus infection in lung and gastrointestinal tissues. J Gen Virol 76 ( Pt 4): 741-750. Slobedman, B., Mocarski, E. S., Arvin, A. M., Mellins, E. D. and Abendroth, A. (2002). Latent cytomegalovirus down-regulates major histocompatibility complex class II expression on myeloid progenitors. Blood 100: 2867-2873. Slobedman, B., Stern, J. L., Cunningham, A. L., Abendroth, A., Abate, D. A. and Mocarski, E. S. (2004). Impact of human cytomegalovirus latent infection on myeloid progenitor cell gene expression. J Virol 78: 4054-4062. Smith, M. S., Bentz, G. L., Alexander, J. S. and Yurochko, A. D. (2004). Human cytomegalovirus induces monocyte differentiation and migration as a strategy for dissemination and persistence. J Virol 78: 4444-4453. Soderberg-Naucler, C., Streblow, D. N., Fish, K. N., Allan-Yorke, J., Smith, P. P. and Nelson, J. A. (2001). Reactivation of latent human cytomegalovirus in CD14(+) monocytes is differentiation dependent. J Virol 75: 7543-7554. Sowmya, P., Dhanya, V., Madhavan, H. N. and Therese, K. L. (2007). Comparative efficacy of PCR-based restriction fragment length polymorphism (RFLP) & multiplex PCR for glycoprotein B (gB) genotyping of human cytomegalovirus. Indian J Med Res 126: 122127. Staras, S. A., Dollard, S. C., Radford, K. W., Flanders, W. D., Pass, R. F. and Cannon, M. J. (2006). Seroprevalence of cytomegalovirus infection in the United States, 1988-1994. Clin Infect Dis 43: 1143-1151. Storek, J., Dawson, M. A., Storer, B., Stevens-Ayers, T., Maloney, D. G., Marr, K. A., Witherspoon, R. P., Bensinger, W., Flowers, M. E., Martin, P., Storb, R., Appelbaum, F. R. and Boeckh, M. (2001). Immune reconstitution after allogeneic marrow transplantation compared with blood stem cell transplantation. Blood 97: 3380-3389. Storek, J., Espino, G., Dawson, M. A., Storer, B., Flowers, M. E. and Maloney, D. G. (2000). Low B-cell and monocyte counts on day 80 are associated with high infection rates between days 100 and 365 after allogeneic marrow transplantation. Blood 96: 3290-3293. Storch, G. A., Buller, R. S., Bailey, T. C., Ettinger, N. A., Langlois, T., Gaudreault-Keener, M. and Welby, P. L. (1994). Comparison of PCR and pp65 antigenemia assay with quantitative shell vial culture for detection of cytomegalovirus in blood leukocytes from solid-organ transplant recipients. J Clin Microbiol 32: 997-1003. Takano, T., Ohe, Y., Tsuta, K., Fukui, T., Sakamoto, H., Yoshida, T., Tateishi, U., Nokihara, H., Yamamoto, N., Sekine, I., Kunitoh, H., Matsuno, Y., Furuta, K. and Tamura, T. (2007). Epidermal growth factor receptor mutation detection using high-resolution melting analysis predicts outcomes in patients with advanced non small cell lung cancer treated with gefitinib. Clin Cancer Res 13: 5385-5390.

72

Tanaka, K., Numazaki, K. and Tsutsumi, H. (2005). Human cytomegalovirus genetic variability in strains isolated from Japanese children during 1983-2003. J Med Virol 76: 356-360. Tanaka, Y., Kanda, Y., Kami, M., Mori, S., Hamaki, T., Kusumi, E., Miyakoshi, S., Nannya, Y., Chiba, S., Arai, Y., Mitani, K., Hirai, H. and Mutou, Y. (2002). Monitoring cytomegalovirus infection by antigenemia assay and two distinct plasma real-time PCR methods after hematopoietic stem cell transplantation. Bone Marrow Transplant 30: 315319. Tarrago, D., Quereda, C. and Tenorio, A. (2003). Different cytomegalovirus glycoprotein B genotype distribution in serum and cerebrospinal fluid specimens determined by a novel multiplex nested PCR. J Clin Microbiol 41: 2872-2877. Torok-Storb, B., Boeckh, M., Hoy, C., Leisenring, W., Myerson, D. and Gooley, T. (1997). Association of specific cytomegalovirus genotypes with death from myelosuppression after marrow transplantation. Blood 90: 2097-2102. van der Heiden, P. L., Kalpoe, J. S., Barge, R. M., Willemze, R., Kroes, A. C. and Schippers, E. F. (2006). Oral valganciclovir as pre-emptive therapy has similar efficacy on cytomegalovirus DNA load reduction as intravenous ganciclovir in allogeneic stem cell transplantation recipients. Bone Marrow Transplant 37: 693-698. Varnum, S. M., Streblow, D. N., Monroe, M. E., Smith, P., Auberry, K. J., Pasa-Tolic, L., Wang, D., Camp, D. G., 2nd, Rodland, K., Wiley, S., Britt, W., Shenk, T., Smith, R. D. and Nelson, J. A. (2004). Identification of proteins in human cytomegalovirus (HCMV) particles: the HCMV proteome. J Virol 78: 10960-10966. Wittwer, C. T., Reed, G. H., Gundry, C. N., Vandersteen, J. G. and Pryor, R. J. (2003). Highresolution genotyping by amplicon melting analysis using LCGreen. Clin Chem 49: 853860. Wolf, D. G., Lurain, N. S., Zuckerman, T., Hoffman, R., Satinger, J., Honigman, A., Saleh, N., Robert, E. S., Rowe, J. M. and Kra-Oz, Z. (2003). Emergence of late cytomegalovirus central nervous system disease in hematopoietic stem cell transplant recipients. Blood 101: 463-465. Wolf, D. G., Yaniv, I., Ashkenazi, S. and Honigman, A. (2001). Emergence of multiple human cytomegalovirus ganciclovir-resistant mutants with deletions and substitutions within the UL97 gene in a patient with severe combined immunodeficiency. Antimicrob Agents Chemother 45: 593-595. Woo, P. C., Lo, C. Y., Lo, S. K., Siau, H., Peiris, J. S., Wong, S. S., Luk, W. K., Chan, T. M., Lim, W. W. and Yuen, K. Y. (1997). Distinct genotypic distributions of cytomegalovirus (CMV) envelope glycoprotein in bone marrow and renal transplant recipients with CMV disease. Clin Diagn Lab Immunol 4: 515-518. Wu, X., Wang, Y., Xu, Y., Wu, D., Sun, A., Zhu, Z., Han, Y., Qiu, H., Tang, X., Fu, Z., He, G., Li, C., Ma, X. and Liu, Y. (2009). Cytomegalovirus glycoprotein B genotype in hematopoietic stem cell transplant patients from China. Biol Blood Marrow Transplant.

73

Yan, H., Koyano, S., Inami, Y., Yamamoto, Y., Suzutani, T., Mizuguchi, M., Ushijima, H., Kurane, I. and Inoue, N. (2008). Genetic variations in the gB, UL144 and UL149 genes of human cytomegalovirus strains collected from congenitally and postnatally infected Japanese children. Arch Virol 153: 667-674. Yu, D., Silva, M. C. and Shenk, T. (2003). Functional map of human cytomegalovirus AD169 defined by global mutational analysis. Proc Natl Acad Sci U S A 100: 12396-12401. Zhang, Z., Kim, S. J., Varghese, T., Thomas, G., Hummel, M. and Abecassis, M. (2008). TNF receptor independent activation of the cytomegalovirus major immediate early enhancer in response to transplantation. Transplantation 85: 1039-1045.

74

PŘÍLOHY

75

gB1 10 9 8 6 4 1 7 5 3

CACTATCGTCTCCGACTTTGGAAGACCGAATTCTGCGTTAGAGACCCACAGGTTGGTGGCTTTTCTTGAACGTGCGGACTCGGTGATCTCCTGGGATATACAGGACGAA CACTATCGTCTCCGACTTTGGAAGACCGAATTCTGCGTTAGAGACCCACAGGTTGGTGGCTTTTCTTGAACGTGCGGACTCGGTGATCTCCTGGGATATACAGGACGAA CACTATCGTCTCCGACTTTGGAAGACCGAATTCTGCGTTAGAGACCCACAGGTTGGTGGCTTTTCTTGAACGTGCGGACTCGGTGATCTCCTGGGATATACAGGACGAA CACTATCGTCTCCGACTTTGGAAGACCGAATTCTGCGTTAGAGACCCACAGGTTGGTGGCTTTTCTTGAACGTGCGGACTCGGTGATCTCCTGGGATATACAGGACGAA CACTATCGTCTCCGACTTTGGAAGACCGAATTCTGCGTTAGAGACCCACAGGTTGGTGGCTTTTCTTGAACGTGCGGACTCGGTGATCTCCTGGGATATACAGGACGAA CACTATCGTCTCCGACTTTGGAAGACCGAATTCTGCGTTAGAGACCCACAGGTTGGTGGCTTTTCTTGAACGTGCGGACTCGGTGATCTCCTGGGATATACAGGACGAA CACTATCGTCTCCGACTTTGGAAGACCGAATTCTGCGTTAGAGACCCACAGGTTGGTGGCTTTTCTTGAACGTGCGGACTCGGTGATCTCCTGGGATATACAGGACGAA CACTATCGTCTCTGACTTTGGAAGACCGAATTCTGCGTTAGAGACCCACAGGTTGGTGGCTTTTCTTGAACGTGCGGACTCGGTGATCTCCTGGGATATACAGGACGAA CACTATCGTCTCTGACTTTGGAAGACCGAATTCTGCGTTAGAGACCCACAGGTTGGTGGCTTTTCTTGAACGTGCGGACTCGGTGATCTCCTGGGATATACAGGACGAA CACTATCGTCTCTGACTTTGGAAGACCGAATTCTGCGTTAGAGACCCACAGGTTGGTGGCTTTTCTTGAACGTGCGGACTCGGTGATCTCCTGGGATATACAGGACGAA

gB1 10 9 8 6 4 1 7 5 3

AAGAATGTCACTTGTCAACTCACTTTCTGGGAAGCCTCGGAACGCACCATTCGTTCCGAAGCCGAGGACTCGTATCACTTTTCTTCTGCCAAAATGACCGCCACTTTCT AAGAATGTCACTTGTCAACTCACTTTCTGGGAAGCCTCGGAACGCACCATTCGTTCCGAAGCCGAGGACTCGTATCACTTTTCTTCTGCCAAAATGACCGCCACTTTCT AAGAATGTCACTTGTCAACTCACTTTCTGGGAAGCCTCGGAACGCACCATTCGTTCCGAAGCCGAGGACTCGTATCACTTTTCTTCTGCCAAAATGACCGCCACTTTCT AAGAATGTCACTTGTCAACTCACTTTCTGGGAAGCCTCGGAACGCACCATTCGTTCCGAAGCCGAGGACTCGTATCACTTTTCTTCTGCCAAAATGACCGCCACTTTCT AAGAATGTCACTTGTCAACTCACTTTCTGGGAAGCCTCGGAACGCACCATTCGTTCCGAAGCCGAGGACTCGTATCACTTTTCTTCTGCCAAAATGACCGCCACTTTCT AAGAATGTCACTTGTCAACTCACTTTCTGGGAAGCCTCGGAACGCACCATTCGTTCCGAAGCCGAGGACTCGTATCACTTTTCTTCTGCCAAAATGACCGCCACTTTCT AAGAATGTCACTTGTCAACTCACTTTCTGGGAAGCCTCGGAACGCACCATTCGTTCCGAAGCCGAGGACTCGTATCACTTTTCTTCTGCCAAAATGACCGCCACTTTCT AAGAATGTCACTTGTCAACTCACTTTCTGGGAAGCCTCGGAACGCACCATTCGTTCCGAAGCCGAGGACTCGTATCACTTTTCTTCTGCCAAAATGACCGCCACTTTCT AAGAATGTCACTTGTCAACTCACTTTCTGGGAAGCCTCGGAACGCACCATTCGTTCCGAAGCCGAGGACTCGTATCACTTTTCTTCTGCCAAAATGACCGCCACTTTCT AAGAATGTCACTTGTCAACTCACTTTCTGGGAAGCCTCGGAACGCACCATTCGTTCCGAAGCCGAGGACTCGTATCACTTTTCTTCTGCCAAAATGACCGCCACTTTCT

gB1 10 9 8 6 4 1 7 5 3

TATCTAAGAAGCAAGAGGTGAACATGTCCGACTCTGCGCTGGACTGCGTACGTGATGAGGCTATAAATAAGTTACAGCAGATTTTCAATACTTCATACAATCAAACATA TATCTAAGAAGCAAGAGGTGAACATGTCCGACTCTGCGCTGGACTGCGTACGTGATGAGGCTATAAATAAGTTACAGCAGATTTTCAATACTTCATACAATCAAACATA TATCTAAGAAGCAAGAGGTGAACATGTCCGACTCTGCGCTGGACTGCGTACGTGATGAGGCTATAAATAAGTTACAGCAGATTTTCAATACTTCATACAATCAAACATA TATCTAAGAAGCAAGAGGTGAACATGTCCGACTCTGCGCTGGACTGCGTACGTGATGAGGCTATAAATAAGTTACAGCAGATTTTCAATACTTCATACAATCAAACATA TATCTAAGAAGCAAGAGGTGAACATGTCCGACTCTGCGCTGGACTGCGTACGTGATGAGGCTATAAATAAGTTACAGCAGATTTTCAATACTTCATACAATCAAACATA TATCTAAGAAGCAAGAGGTGAACATGTCCGACTCTGCGCTGGACTGCGTACGTGATGAGGCTATAAATAAGTTACAGCAGATTTTCAATACTTCATACAATCAAACATA TATCTAAGAAGCAAGAGGTGAACATGTCCGACTCTGCGCTGGACTGCGTACGTGATGAGGCTATAAATAAGTTACAGCAGATTTTCAATACTTCATACAATCAAACATA TATCTAAGAAGCAAGAGGTGAACATGTCCGACTCTGCGCTGGACTGCGTACGTGATGAGGCTATAAATAAGTTACAGCAGATTTTCAATACTTCATACAATCAAACATA TATCTAAGAAGCAAGAGGTGAACATGTCCGACTCTGCGCTGGACTGCGTACGTGATGAGGCTATAAATAAGTTACAGCAGATTTTCAATACTTCATACAATCAAACATA TATCTAAGAAGCAAGAGGTGAACATGTCCGACTCTGCGCTGGACTGCGTACGTGATGAGGCTATAAATAAGTTACAGCAGATTTTCAATACTTCATACAATCAAACATA

gB1 10 9 8 6 4 1 7 5 3

TGAAAAATATGGAAACGTGTCCGTCTTTGAAACCACTGGTGGTTTGGTAGTGTTCTGGCAAGGTATCAAGCAAAAATCTCTGGTGGAACTCGAACGTTTGGCCAACCGC TGAAAAATATGGAAACGTGTCCGTCTTTGAAACCACTGGTGGTTTGGTAGTGTTCTGGCAAGGTATCAAGCAAAAATCTCTGGTGGAACTCGAACGTTTGGCCAACCGC TGAAAAATATGGAAACGTGTCCGTCTTTGAAACCACTGGTGGTTTGGTAGTGTTCTGGCAAGGTATCAAGCAAAAATCTCTGGTGGAACTCGAACGTTTGGCCAACCGC TGAAAAATATGGAAACGTGTCCGTCTTTGAAACCACTGGTGGTTTGGTAGTGTTCTGGCAAGGTATCAAGCAAAAATCTCTGGTGGAACTCGAACGTTTGGCCAACCGC TGAAAAATATGGAAACGTGTCCGTCTTTGAAACCACTGGTGGTTTGGTAGTGTTCTGGCAAGGTATCAAGCAAAAATCTCTGGTGGAACTCGAACGTTTGGCCAACCGC TGAAAAATATGGAAACGTGTCCGTCTTTGAAACCACTGGTGGTTTGGTAGTGTTCTGGCAAGGTATCAAGCAAAAATCTCTGGTGGAACTCGAACGTTTGGCCAACCGC TGAAAAATATGGAAACGTGTCCGTCTTTGAAACCACTGGTGGTTTGGTAGTGTTCTGGCAAGGTATCAAGCAAAAATCTCTGGTGGAACTCGAACGTTTGGCCAACCGC TGAAAAATATGGAAACGTGTCCGTCTTTGAAACCACTGGTGGTTTGGTAGTGTTCTGGCAAGGTATCAAGCAAAAATCTCTGGTGGAACTCGAACGTTTGGCCAACCGC TGAAAAATATGGAAACGTGTCCGTCTTTGAAACCACTGGTGGTTTGGTAGTGTTCTGGCAAGGTATCAAGCAAAAATCTCTGGTGGAACTCGAACGTTTGGCCAACCGC TGAAAAATATGGAAACGTGTCCGTCTTTGAAACCACTGGTGGTTTGGTAGTGTTCTGGCAAGGTATCAAGCAAAAATCTCTGGTGGAACTCGAACGTTTGGCCAACCGC

gB1 10 9 8 6 4 1 7 5 3

TCCAGTCTGAATCTTACTCATAATAGAACCAAAAGAAGTACAGATGGCAACAATGCAACTCATTTATCCAACATGGAATCGGTGCACAATCTGGTCTACGCCCAGCTGC TCCAGTCTGAATCTTACTCATAATAGAACCAAAAGAAGTACAGATGGCAACAATGCAACTCATTTATCCAACATGGAATCGGTGCACAATCTGGTCTACGCCCAGCTGC TCCAGTCTGAATCTTACTCATAATAGAACCAAAAGAAGTACAGATGGCAACAATGCAACTCATTTATCCAACATGGAATCGGTGCACAATCTGGTCTACGCCCAGCTGC TCCAGTCTGAATCTTACTCATAATAGAACCAAAAGAAGTACAGATGGCAACAATGCAACTCATTTATCCAACATGGAATCGGTGCACAATCTGGTCTACGCCCAGCTGC TCCAGTCTGAATCTTACTCATAATAGAACCAAAAGAAGTACAGATGGCAACAATGCAACTCATTTATCCAACATGGAATCGGTGCACAATCTGGTCTACGCCCAGCTGC TCCAGTCTGAATCTTACTCATAATAGAACCAAAAGAAGTACAGATGGCAACAATGCAACTCATTTATCCAACATGGAATCGGTGCACAATCTGGTCTACGCCCAGCTGC TCCAGTCTGAATCTTACTCATAATAGAACCAAAAGAAGTACAGATGGCAACAATGCAACTCATTTATCCAACATGGAATCGGTGCACAATCTGGTCTACGCCCAGCTGC TCCAGTCTGAATCTTACTCATAATAGAACCAAAAGAAGTACAGATGGCAACAATGCAACTCATTTATCCAACATGGAATCGGTGCACAATCTGGTCTACGCCCAGCTGC TCCAGTCTGAATCTTACTCATACTAGAACCAAAAGAAGTACAGATGGCAACAATGCAACTCATTTATCCAACATGGAATCGGTGCACAATCTGGTCTACGCCCAGCTGC TCCAGTCTGAATCTTACTCATACTAGAACCAAAAGAAGTACAGATGGCAACAATGCAACTCATTTATCCAACATGGAATCGGTGCACAATCTGGTCTACGCCCAGCTGC

gB1 10 9 8 6 4 1 7 5 3

AGTTCACCTATGACACGTTGCGCGGTTACATCAACCGGGCGCTGGCGCAAATCGCAGAAGCCTGGTGTGTGGATCAACGGCGCACCCTAGAGGTCTTCAAGGAACTCAG AGTTCACCTATGACACGTTGCGCGGTTACATCAACCGGGCGCTGGCGCAAATCGCAGAAGCCTGGTGTGTGGATCAACGGCGCACCCTAGAGGTCTTCAAGGAACTCAG AGTTCACCTATGACACGTTGCGCGGTTACATCAACCGGGCGCTGGCGCAAATCGCAGAAGCCTGGTGTGTGGATCAACGGCGCACCCTAGAGGTCTTCAAGGAACTCAG AGTTCACCTATGACACGTTGCGCGGTTACATCAACCGGGCGCTGGCGCAAATCGCAGAAGCCTGGTGTGTGGATCAACGGCGCACCCTAGAGGTCTTCAAGGAACTCAG AGTTCACCTATGACACGTTGCGCGGTTACATCAACCGGGCGCTGGCGCAAATCGCAGAAGCCTGGTGTGTGGATCAACGGCGCACCCTAGAGGTCTTCAAGGAACTCAG AGTTCACCTATGACACGTTGCGCGGTTACATCAACCGGGCGCTGGCGCAAATCGCAGAAGCCTGGTGTGTGGATCAACGGCGCACCCTAGAGGTCTTCAAGGAACTCAG AGTTCACCTATGACACGTTGCGCGGTTACATCAACCGGGCGCTGGCGCAAATCGCAGAAGCCTGGTGTGTGGATCAACGGCGCACCCTAGAGGTCTTCAAGGAACTCAG AGTTCACCTATGACACGTTGCGCGGTTACATCAACCGGGCGCTGGCGCAAATCGCAGAAGCCTGGTGTGTGGATCAACGGCGCACCCTAGAGGTCTTCAAGGAACTCAG AGTTCACCTATGACACGTTGCGCGGTTACATCAACCGGGCGCTGGCGCAAATCGCAGAAGCCTGGTGTGTGGATCAACGGCGCACCCTAGAGGTCTTCAAGGAACTCAG AGTTCACCTATGACACGTTGCGCGGTTACATCAACCGGGCGCTGGCGCAAATCGCAGAAGCCTGGTGTGTGGATCAACGGCGCACCCTAGAGGTCTTCAAGGAACTCAG

77

gB1 10 9 8 6 4 1 7 5 3

CAAGATCAACCCGTCAGCCAT CAAGATCAACCCGTCAGCCAT CAAGATCAACCCGTCAGCCAT CAAGATCAACCCGTCAGCCAT CAAGATCAACCCGTCAGCCAT CAAGATCAACCCGTCAGCCAT CAAGATCAACCCGTCAGCCAT CAAGATCAACCCGTCAGCCAT CAAGATCAACCCGTCAGCCAT CAAGATCAACCCGTCAGCCAT

Příloha č. 1 Porovnání sekvencí jednotlivých jedinců s gB1 s referenční sekvencí (M85229) Porovnáním sekvencí všech pacientů s gB1 měli tři pacienti ve všech vzorcích odlišnosti od referenční sekvence. Znázorněno růžově.

78

gB2 2

CACCATCGTTTCCGACTTTGGAAGACCCAACGCTGCGCCAGAAACTCATAGGTTGGTGGCTTTTCTTGAACGTGCCGACTCGGTGATCTCTTGGGATATACAGGACGAG CACCATCGTTTCCGACTTTGGAAGACCCAACGCTGCGCCAGAAACTCATAGGTTGGTGGCTTTTCTCGAACGTGCCGACTCGGTGATCTCTTGGGATATACAGGACGAG

gB2 2

AAGAATGTCACCTGCCAGCTCACCTTCTGGGAAGCCTCGGAACGCACTATCCGTTCCGAAGCCGAAGATTCGTACCACTTTTCTTCTGCCAAAATGACTGCAACTTTTC AAGAATGTCACCTGCCAGCTCACCTTCTGGGAAGCCTCGGAACGCACTATCCGTTCCGAAGCCGAAGATTCGTACCACTTTTCTTCTGCCAAAATGACTGCAACTTTTC

gB2 2

TGTCTAAGAAACAAGAAGTGAACATGTCCGACTCCGCGCTAGACTGCGTACGTGATGAGGCTATAAATAAGTTACAGCAGATTTTCAATACTTCATATAATCAAACATA TGTCTAAGAAACAAGAAGTGAACATGTCCGACTCCGCGCTAGACTGCGTACGTGATGAGGCTATAAATAAGTTACAGCAGATTTTCAATACTTCATATAATCAAACATA

gB2 2

TGAAAAATACGGAAACGTGTCCGTCTTCGAAACCAGCGGCGGTCTGGTGGTGTTCTGGCAAGGCATCAAGCAAAAATCTTTGGTGGAATTGGAACGTTTGGCCAATCGA TGAAAAATACGGAAACGTGTCCGTCTTCGAAACCAGCGGCGGTCTGGTGGTGTTCTGGCAAGGCATCAAGCAAAAATCTTTGGTGGAATTGGAACGTTTGGCCAATCGA

gB2 2

TCCAGTCTGAATATCACTCATAGGACCAGAAGAAGTACGAGTGACAATAATACAACTCATTTGTCCAGCATGGAATCGGTGCACAATCTGGTCTACGCCCAGCTGCAGT TCCAGTCTGAATATCACTCATAGGACCAGAAGAAGTACGAGTGACAATAATACAACTCATTTGTCCAGCATGGAATCGGTGCACAATCTGGTCTACGCCCAGCTGCAGT

gB2 2

TCACCTATGACACGTTGCGCGGTTACATCAACCGGGCGCTGGCGCAAATCGCAGAAGCCTGGTGTGTGGATCAACGGCGCACCCTGGAGGTCTTCAAGGAACTCAGCAA TCACCTATGACACGTTGCGCGGTTACATCAACCGGGCGCTGGCGCAAATCGCAGAAGCCTGGTGTGTGGATCAACGGCGCACCCTAGAGGTCTTCAAGGAACTCAGCAA

gB2 2

GATCAACCCGTCAGCCAT GATCAACCCGTCAGCCAT

Příloha č. 2 Porovnání sekvence jedince s gB2 s referenční sekvencí (M60931) Porovnání sekvence pacienta s gB2 s referenční sekvencí objevilo dvě změny oproti referenční sekvenci. Znázorněno růžově.

79

gB4 10

CACTATCGTCTCTGACTTTGGAAGACCGAATTCTGCGTTAGAGACCCACAGGTTGGTGGCTTTTCTTGAACGTGCGGACTCGGTGATTTCCTGGGATATACAGGACGAA CACTATCGTCTCTGACTTTGGAAGACCGAATTCTGCGTTAGAGACCCACAGGTTGGTGGCTTTTCTTGAACGTGCGGACTCGGTGATTTCCTGGGATATACAGGACGAA

gB4 10

AAGAATGTCACTTGTCAACTCACTTTCTGGGAAGCCTCGGAACGCACCATTCGTTCCGAAGCCGAGGAGTCATATCACTTTTCTTCTGCCAAAATGACCGCTACTTTCC AAGAATGTCACTTGTCAACTCACTTTCTGGGAAGCCTCGGAACGCACCATTCGTTCCGAAGCCGAGGAGTCATATCACTTTTCTTCTGCCAAAATGACCGCTACTTTCC

gB4 10

TGTCTAAGAAGCAAGAGGTGAACATGTCCGATTCCGCGCTGGACTGCGTACGTGATGAGGCTCTAAATAAGTTACAGCAGATTTTTAATGCTTCATACAATCAGACATA TGTCTAAGAAGCAAGAGGTGAACATGTCCGATTCCGCGCTGGACTGCGTACGTGATGAGGCTCTAAATAAGTTACAGCAGATTTTTAATGCTTCATACAATCAGACATA

gB4 10

TGAAAAGTACGGAAACGTGTCCGTCTTCGAAACTACCGGCGGACTAGTAGTGTTCTGGCAAGGTATCAAGCAAAAATCTCTGGTGGAACTCGAACGTTTGGCCAACCGT TGAAAAGTACGGAAACGTGTCCGTCTTCGAAACTACCGGCGGACTAGTAGTGTTCTGGCAAGGTATCAAGCAAAAATCTCTGGTGGAACTCGAACGTTTGGCCAACCGT

gB4 10

TCCAGTCTGAATCTTACTCATAGTAGAACCAGAAGAAGTACAGATGGCACCAATGTAACTCATTTATCTAATATGGACTCGGTACACAATCTGGTCTACGCCCAGCTGC TCCAGTCTGAATCTTACTCATAGTAGAACCAGAAGAAGTACAGATGGCACCAATGTAACTCATTTATCTAATATGGACTCGGTACACAATCTGGTCTACGCCCAGCTGC

gB4 10

AGTTCACCTACGACACGTTGCGCGGCTACATCAACCGGGCGTTGACACAAATCGCAGAAGCCTGGTGTGTGGATCAACGGCGCACCCTAGAGGTCTTCAAGGAACTTAG AGTTCACCTACGACACGTTGCGCGGCTACATCAACCGGGCGTTGACACAAATCGCAGAAGCCTGGTGTGTGGATCAACGGCGCACCCTAGAGGTCTTCAAGGAACTTAG

gB4 10

CAAGATCAACCCGTCAGCTAT CAAGATCAACCCGTCAGCTAT

Příloha č. 3 Porovnání sekvence jedince s gB4 s referenční sekvencí (M60926) Porovnání sekvence pacienta s gB4 nenalezlo žádné změny oproti referenční sekvenci.

80

A 5 7

ATGAAGCCTCTGGTGATGCTCATCTGCTTTGCTGTGATATTATTGCAGCTTGGAGTGACTAAAGTGTGTCAGCATAATGAAGTGCAACTGGGCAATGAGTGCTGCCCTC ATGAAGCCTCTGGTGATGCTCATCTGCTTTGCTGTGATATCATTGCAGCTTGGAGTGACTAAAGTGTGTCAGCATAATGAAGTGCAACTGGGCAATGAGTGCTGCCCTC ATGAAGCCTCTGGTGATGCTCATCTGCTTTGCTGTGATATTATTGCAGCTTGGAGTGACTAAAGTGTGTCAGCATAATGAAGTGCAACTGGGCAATGAGTGCTGTCCTC

A 5 7

CGTGTGGTTCGGGACAAAGAGTTACTAAAGTATGCACGGATTATACCAGTGTAACGTGTACCCCTTGCCCCAACGGCACGTATGTATCGGGACTTTACAACTGTACCGA CGTGTGGTTCGGGACAAAGAGTTACTAAAGTATGCACGGATTATACCAGTGTAACGTGTACCCCTTGCCCCAACGGCACGTATGTATCGGGACTTTACAACTGTACCGA CGTGTGGTTCGGGACAAAGAGTTACTAAAGTATGCACGGATTATACCAGTGTAACGTGTACCCCTTGCCCCAACGGCACGTATGTATCGGGACTTTACAACTGTACCGA

A 5 7

TTGCACTCAATGTAACGTCACTCAGGTCATGATTCGTAACTGCACTTCCACCAATAATACCGTATGCGCACCTAAGAACCATACGTACTTCTCCACTCCAGGCGTCCAA TTGCACTCAATGTAACGTCACTCAGGTCATGATTCGTAACTGCACTTCCACCAATAATACCGTATGCGCACCTAAGAACCATACGTACTTTTCCACTCCAGGCGTCCAA TTGCACTCAATGTAACGTCACTCAAGTCATGATTCGTAACTGCACTTCCACCAATAATACCGTATGCGCGCCTAAGAACCATACGTACTTTTCCACTCCAGGCGTCCAA

A 5 7

CATCACAAGCAACGACAGCAAAATCATACCGCACATATAACTGTCAAACAAAGAAAAAGCGGTCGTCATACTCTAGCCTGGTTGTCTCTCTTTATCTTTCTTGTGGGTA CATCACAAGCAACGACAGCAAAATCATACCGCACATATAACTGTCAAACAAAGAAAAAGCGGTCGTCATACTCTAGCCTGGTTGTCTCTCTTTATCTTTCTTGTGGGTA CATCACAAGCAACGACAGCAAAATCATACCGCACATATAACCGTCAAACAAGGAAAAAGCGGTCGTCATACTCTAGCCTGGTTGTCTCTCTTTATCTTTCTTGGGGGTA

A 5 7

TCATACTTTTAATTCTCTATCTTATAGCCGCCTATCGGAGTGAGAGATGCCAACAGTGTTGC TCATACTTTTAATTCTCTATCTTATAGCCGCCTATCGGAGTGAGAGATGCCAACAGTGTTGC TCATACTTTTAATTCTCTATCTTATAGCCGCCTATCGGAGTGAGAGATGCCAACAGTGTTGC

Příloha č. 4 Porovnání sekvencí jedinců s UL144-A s referenční sekvencí (AF498086) Porovnání sekvencí pacientů s UL144-A s referenční sekvencí potvrdilo několik změn. Znázorněno růžově.

81

B 2 9 10/2 1 8 10/1 3 6 4

ATGAAGCCTCTGGTGATGCTTATTTTGCTGAGTATGCTATTGGCATGCATAGGGAAAACTGAAATATGCAAACCCGAAGAAGTGCAATTAGGAAATCAGTGTTGTCCCC ATGAAGCCTCTGGTGATGCTTATTTTGCTGAGTATACTATTGGCATGCATAGGGAAAACTGAAATATGCAAACCCGAAGAAGTGCAATTAGGAAATCAGTGTTGTCCCC ATGAAGCCTCTGTTGATGCTTATTTTGCTGAGTATACTATTGGCATGCATAGGGAAAACTGAAATATGCAAACCCGAAGAAGTGCAATTAGGAAATCAGTGTTGTCCCC ATGAAGCCTCTGGTGATGCTTATTTTGCTGAGTATACTATTGGCATGCATAGGGAAAACTGAAATATGCAAACCCGAAGAAGTGCAATTAGGAAATCAGTGTTGTCCCC ATGAAGCCTCTGGTGATGCTTATTTTGCTGAGTATACTATTGGCATGCATAGGGAAAACTGAAATATGCAAACCCGAAGAAGTGCAATTAGGAAATCAGTGTTGTCCCC ATGAAGCCTCTGGTGATGCTTATTTTGCTGAGTATGCTATTGGCATGCATAGGGAAAACTGAAATATGCAAACCCGAAGAAGTGCAATTAGGAAGTCAGTGTTGTCCCC ATGAAGCCTCTGGTGATGCTTATTTTGCTGAGTATGCTATTGGCATGCATAGGGAAAACTGAAATATGCAAACCCGAAGAAGTGCAATTAGGAAATCAGTGTTGTCCCC ATGAAGCCTCTGGTGATGCTTATTTTGCTGAGTATGCTATTGGCATGCATAGGGAAAACTGAAATATGCAAACCCGAAGAAGTGCAATTAGGAAATCAGTGTTGTCCCC ATGAAGCCTCTGGTGATGCTTATTTTGCTGAGTATGCTATTGGCATGCATAGGGAAAACTGAAATATGCAAACCCGAAGAAGTGCAATTAGGAAATCAGTGTTGTCCCC ATGAAGCCTCTGGTGATGCTTATTTTGCTGAGCATGCTATTGGCATGCATAGGGAAAACTGAAATATGCAAACCCGAAGAAGTGCAATTAGGAAATCAGTGTTGTCCCC

B 2 9 10/2 1 8 10/1 3 6 4

CATGTAAACAAGGATATCGTGTTACAGGACAATGTACGCAATATACGAGTACAACATGTACACTTTGCCCTAACGGTACGTATGTATCAGGGCTTTACAATTGTACCAA CATGTAAACAAGGATATCGTGTTACAGGACAATGTACGCAATATACGAGTACAACATGTACACTTTGCCCTAACGGTACGTATGTATCAAGGCTTTACAATTGTACCAA CATGTAAACAAGGATATCGTGTTACAGGACAATGTACGCAATATACGAGTACAACATGTACACTTTGCCCTAACGGTACGTATGTATCAGGGCTTTACAATTGTACCAA CATGTAAACAAGGATATCGTGTTACAGGACAATGTACGCAATATACGAGTACAACATGTACACTTTGCCCTAACGGTACGTATGTATCAGGGCTTTACAATTGTACCAA CATGTAAACAAGGATATCGTGTTACAGGACAATGTACGCAATATACGAGTACAACATGTACACTTTGCCCTAACGGTACGTATGTATCAGGGCTTTACAATTGTACCAA CATGTAAACAAGGATATCGTGTTACAGGACAATGTACGCAATATACGAGTACAACATGTACACTTTGCCCTAACGGTACGTATGTATCAGGGCTTTACAATTGTACCAA CATGTAAACAAGGATATCGTGTTACAGGACAATGTACGCAATATACGAGTACAACATGTACACTTTGCCCTAACGGTACGTATGTATCAGGGCTTTACAATTGTACCAA CATGTAAACAAGGATATCGTGTTACAGGACAATGTACGCAATATACGAGTACAACATGTACACTTTGCCCTAACGGTACGTATGTATCAGGGCTTTACAATTGTACCAA CATGTAAACAAGGATATCGTGTTACAGGACAATGTACGCAATATACAAGTACAACATGTACACTTTGCCCTAACGGTACGTATGTATCAGGGCTTTACAATTGTACCAA CATGTAAACAAGGATATCGTGTTACAGGACAATGTACGCAATATACGAGTACAACATGTACACTTTGCCCTAACGGTACGTATGTATCAGGGCTTTACAATTGTACCAA

B 2 9 10/2 1 8 10/1 3 6 4

TTGCACTGAGTGTAATGACACTGAGGTTACAATTCGTAACTGCACTTCCACTAATAACACCGTATGCGCATCTAAGAATTATACGTCGTTTTCCGTTCCAGGCGTCCAA TTGCACTGAGTGTAATGACACTGAGGTTACAATTCGTAACTGCACTTCCACTAATAACACCGTATGCGCATCTAAGAATCATACGTCGTTGTCCGTTCCAGGCGTCCAA TTGCACTGAGTGTAATGACACTGAGGTTACAATTCGTAACTGCACTTCCACTAATAACACCGTATGCGCATCTAAGAATCATACGTCGTTGTCCGTTCCAGGCGTCCAA TTGCACTGAGTGTAATGACACTGAGGTTACAATTCGTAACTGCACTTCCACTAATAACACCGTATGCGCATCTAAGAATCATACGTCGTTGTCCGTTCCAGGCGTCCAA TTGCACTGAGTGTAATGACACTGAGGTTACAATTCGTAACTGCACTTCCACTAATAACACCGTATGCGCATCTAAGAATCATACGTCGTTGTCCGTTCCAGGCGTCCAA TTGCACTGAGTGTAATGACACTGAGGTTACAATTCGTAACTGCACTTCCACTAATAACACCGTATGCGCATCTAAGAATTATACGTCGTTGTCCGTTCCAGGCGTCCAA TTGCACTGAGTGTAATGACACTGAGGTTACAATTCGTAACTGCACTTCCACTAATAACACCGTATGCGCATCTAAGAATTATACGTCGTTGTCCGTTCCAGGCGTCCAA TTGCACTGAGTGTAATGACACTGAGGTTACAATTCGTAACTGCACTTCCACTAATAACACCGTATGCGCATCTAAGAATTATACGTCGTTGTCCGTTCCAGGCGTCCAA TTGCACTGAGTGTAATGACACTGAGGTTACAATTCGTAACTGCACTTCCACTAATAACACCGTATGCGCATCTAAGAATTATACGTCGTTTTCCGTTCCAGGCGTCCAA TTGCACTGAGTGTAATGATACTGAGGTTACAATTCGTAACTGCACTTCCACTAATAACACCGTATGCGCATCTAAGAATTATACGTCGTTTTCCGTTCCAGGCGTCCAA

82

B 2 9 10/2 1 8 10/1 3 6 4

CATCACAAGCAACGACAAAATCATACCGCACATGTAACCGTCAAACAAGGGAAAAGTGGTCGTCATACTCTAGCCTGGTTGTCCCTCTTCATCTTTCTCGTGGGTATCA CATCACAAGCAACGACAAAATCATACCGCACATGTAACCGTCAAACAAGGGAAAAGTGGTCGTCATACTCTAGCCTGGTTGTCCCTCTTCATCTTTCTCGTGGGTATCA CATCACAAGCAACGACAAAATCATACCGCACATGTAACCGTCAAACAAGGGAAAAGTGGTCGTCATACTCTAGCCTGGTTGTCCCTCTTCATCTTTCTCGTGGGTATCA CATCACAAGCAACGACAAAATCATACCGCACATGTAACCGTCAAACAAGGGAAAAGTGGTCGTCATACTCTAGCCTGGTTGTCCCTCTTCATCTTTCTCGTGGGTATCA CATCACAAGCAACGACAAAATCATACCGCACATGTAACCGTCAAACAAGGGAAAAGTGGTCGTCATACTCTAGCCTGGTTGTCCCTCTTCATCTTTCTCGTGGGTATCA CATCACAAGCAACGACAAAATCATACCGCACATGTAACCGTCAAACAAGGGAAAAGTGGTCGTCATACTCTAGCCTGGTTGTCCCTCTTCATCTTTCTCGTGGGTATCA CATCACAAGCAACGACAAAATCATACCGCACATGTAACCGTCAAACAAGGGAAAAGTGGTCGTCATACTCTAGCCTGGTTGTCCCTCTTCATCTTTCTCGTGGGTATCA CATCACAAGCAACGACAAAATCATACCGCACATGTAACCGTCAAACAAGGGAAAAGTGGTCGTCATACTCTAGCCTGGTTGTCCCTCTTCATCTTTCTCGTGGGTATCA CATCACAAGCAACGACAAAATCATACCGCACATGTAACCGTCAAACAAGGGAAAAGTGGTCGTCATACTCTAGCCTGGTTGTCCCTCTTCATCTTTCTCGTGGGTATCA CATC----------------------------------------------------------------------CTGGTTGTCCCTCTTCATCTTTCTCGTGGGCATCA

B 2 9 10/2 1 8 10/1 3 6 4

TACTTTTAATTCTCTATCTTATAGCCGCCTATCGGAGTGAGAGATGCCAACAGTGTTGCTCAAT TACTTTTAATTCTCTATCTTATAGCCGCCTATCGGAGTGAGAGATGCCAACAGTGTTGCTCAAT TACTTTTAATTCTCTATCTTATAGCCGCCTATCGGAGTGAGAGATGCCAACAGTGTTGCTCAAT TACTTTTAATTCTCTATCTTATAGCCGCCTATCGGAGTGAGAGATGCCAACAGTGTTGCTCAAT TACTTTTAATTCTCTATCTTATAGCCGCCTATCGGAGTGAGAGATGCCAACAGTGTTGCTCAAT TACTTTTAATTTTCTATCTTATAGCCGCCTATCGGAGTGAGAGATGCCAACAGTGTTGCTCAAT TACTTTTAATTCTCTATCTTATAGCCGCCTATCGGAGTGAGAGATGCCAACAGTGTTGCTCAAT TACTTTTAATTCTCTATCTTATAGCCGCCTATCGGAGTGAGAGATGCCAACAGTGTTGCTCAAT TACTTTTAATTCTCTATCTTATAGCCGCCTATCGGAGTGAGAGATGCCAACAGTGTTGCTCAAT TACTTTTAATTCTCTATCTTATAGCCGCCTATCGGAGTGAGAGATGCCAACAGTGTTGCTCAAT

Příloha č. 5 Porovnání sekvencí jedinců s UL144-B s referenční sekvencí (AF498087) Porovnání sekvencí pacientů s UL144-B s referenční sekvencí potvrdilo několik změn. Pacient č. 10 měl navzájem ve svých vzorcích odlišnosti, což znamená že byl osekvenován jiný kmen CMV. Znázorněno růžově.

83

AC 4

ATGAAGCCTCTGATAATGCTCATCTGCTTTGCTGTGATATTATTGCAGCTTGGAGTGACTAAAGTGTGTCAGCATGATGAAGTGCAACTGGGCAATGAGTGCTGCCCTC ATGAAGCCTCTGATAATGCTCATCTGCTTTGCTGTGATATTATTGCAGCTTGGAGTGACTAAAGTGTGTCAGCATAATGAAGTGCAACTGGGCAATGAGTGCTGCCCTC

AC 4

CGTGTGGTTCGGGACAAAGAGTTACTAAAGTATGCACGGATTATACCAGTGTAACGTGTACCCCTTGCCCCAACGGCACTTATCTCACAGGGCTTTACAACTGTACTAA CGTGTGGTTCGGGACAAAGAGTTACTAAAGTATGCACGGATTATACTAGTGTAACGTGTACCCCTTGCCCCAACGGCACTTATCTCACAGGGCTTTACAACTGTACTAA

AC 4

TTGTACTCAATGTAACGACACTCAGACCACGGTTCGTAACTGCACTTCCACTAATAACACCATATGCGCATCTAAGAATCATACATTGTTTTCCACTCCAGGTGTCCAA TTGTACTCAATGTAACGACACTCAGATCACGGTTCGTAACTGCACTTCCACTAATAACACCATATGCGCATCTAAGAATCATACATTGTTTTCCACTCCAGGTGTCCAA

AC 4

CATCACAAGCAACGACAGCAAAATCATACCGCACATGTAACCGTCAAACAAGGGAAAAGTGGTCGTCATACTCTAGCCTGGTTGTCCCTCTTCATCTTTCTCGTGGGTA CATCACAAGCAACGACAGCAAAATCATACCGCACATGTAACCGTCAAACAAGGGAAAAGTGGTCGTCATACTCTAGCCTGGTTGTCCCTCTTCATCTTTCTCGTGGGTA

AC 4

TCATACTTTTAATTCTCTATCTTATAGCCGCCTATCGGAGTGAGAGATGCCAACAGTGTTGCTC TCATACTTTTAATTCTCTATCTTATAGCCGCCTATCGGAGTGAGAGATGCCAACAGTGTTGCTC

Příloha č. 6 Porovnání sekvence jedince s UL144-A/C s referenční sekvencí (AF498090) Porovnání sekvence pacienta s UL144-A/C s referenční sekvencí potvrdilo několik změn. Znázorněno růžově.

84

AD169-A 3 9 TOLEDO-A 7

ACATGTAGAAGCACCCATTACAGTAACGCAGGGAGACACAGTCTACCTAGATGCTAGCAATAATCCCTGTAATTATTCCAGCTTTTGGTACCACGGTAATTGCGAACTT ACATGTAGAAGCACCCATTACAGTAACGCAGGGAGACACAGTCTACCTAGATGCTAGCAATAATCCCTGTAATTATTCCAGCTTTTGGTACCACGGTAATTGCGAACTT ACATGTAGAAGCACCCATTACAGTAACGCAGGGAGACACAGTCTACCTAGATGCTAGCAATAATCCCTGTAATTATTCCAGCTTTTGGTACCACGGTAATTGCGAACTT ACATGTAGAAGCACCCATTACAGTAACGCAGGGAGACACAGTCTACCTAGACGCTAGCAATAATCCCTGTAATTATTCCAGCTTTTGGTACCACGGTAATTGCGAACTT ACATGTGGAAACACCCATTACAGTAACGCAGGGAGACACAGTCTACCTAAATGCTAGCAATAATCCCTGTAATTATTCCAGCTTTTGGTACCACGGTAATTACGAACTT *

AD169-A 3 9 TOLEDO-A 7

TGTGGATGGAACGGATATCTACGCAATGTTACACATTACTACACAAACACATCGTGTTCCCCGCAATTCATGTGCATAAACGAAACTAAAGGTCTGCAGTTATATAATG TGTGGATGGAACGGATATCTACGCAATGTTACACATTACTACACAAACACATCGTGTTCCCCGCAATTCATGTGCATAAACGAAACTAAAGGTCTGCAGTTATATAATG TGTGGATGGAACGGATATCTACGCAATGTTACACATTACTACACAAACACATCGTGTTCCCCGCAATTCATGTGCATAAACGAAACTAAAGGTCTGCAGTTATATAATG TGTGGATGGAACGGATATCTACGCAATGTTACACATTACTACACAAACACATCGTGTTCCCCGCAATTCATCTGCATAAACGAAACTAAAGGTCTGCAGTTATATAATG TGTGGATGGAACGGATATCTACGCAATGTTACACGTTACTACACAAACACATCGTGTTCCCCGCAATTCATCTGCATAAACGAAACTAAAGGTCTGCAGTTATATAATG *

AD169-A 3 9 TOLEDO-A 7

ACATTAAACGATTCAGGTGCTTATACTGAACACGTTTACGAATGTGATCTTTCATGTAACATTACTACTTATAACGAATATGAAATACTCAATTACTTCGATAACTGTA ATATTAAACGATTCAGGTGCTTATACTGAACACGTTTACGAATGTGATCTTTCATGTAACATTACTACTTATAACGAATATGAAATACTCAATTACTTCGATAAGTGTA ACATTAAACGATTCAGGTGCTTATACTGAACACGTTTACGAATGTGATCTTTCATGTAACATCACTACTTATAACGAATATGAAATACTCAATTACTTCGATAACTGTA ACATTAAACGATTCAGGCGCTTATACTGAACACGTTTACGAATGTGACCTTTCGTGTAACATTACTACTAATAACGAATATGAAATACTCAATTATTTTGATAACTGTA ACATTAAACGATTCAGGCGCTTATACTGAACACGTTTACGAATGTGACCTTTCATGTAACATTACTACTTATAACGAATATGAAATACTCAATTACTTCGACAACTGTA * * * * * *

AD169-A 3 9 TOLEDO-A 7

ACTACACCATAAATAGCACCAAGCATATTATCACCGTGGTGTCTTCACGTCATTCTAAACAAACAAATTCCCACGTATCCACTCACGCTGGTTGGGCAGCCGCCGTGGT ACTACACCATAAATAGCACCAAGCATATTATCACCGTGGTGTCTTCACGTCATTCTAAACAAACAAATTCCCACGTATCCACTCACGCTGGTTGGGCAGCCGCCGTGGT ACTACACCATAAATAGCACCAAGCATATTATCACCGTGGTGTCTTCACGTCATTCTAAACAAACAAATTCCCACGTATCCACTCACGCTGGTTGGGCAGCCGCCGTGGT ACTACACCATAAATAGCACCAAGCATATTATCACCGTGGTGTCTTCACGTCATTCTAAACAAACAAATTCCCACGTATCCACTCACGCTGGTTGGGCAGTCGCCGTGGT ACTACACCATAAATAGCACCAAGCATATTATCACCGTGGTGTTTTCACGTCATTCTAAACAAACAGATTCCCACGTATCCACTCAAGCTGGTTGGGCAGCCGTCGTGGT * * * *

AD169-A 3 9 TOLEDO-A 7

GACGGTAATTATGATCTACGTTTTGATCCACTTTAACGTTCCGGCAACTCTGAGACACAAACTACGA GACGGTAATTATGATCTACGTTTTGATCCACTTTAACGTTCCGGCAACTCTGAGACACAGACTACGA GACGGTAATTATGATCTACGTTTTGATCCACTTTAACGTTCCGGCAACTCTGAGACACAGACTACGA GACGGTAATTATGATCTACGTTCTGATCCACTTTAACGTCCCGGCAACTCTGAGACACAAACTACGA GATGGTAATTATGATCTACGTTCTGATCCACTTTAACGTTCCGGCAACTCTGAGACACAGACTACGA * * *

Příloha č. 7 Porovnání sekvencí jedinců s UL1-A s referenčními sekvencemi (GU937742 a X17403) Porovnání sekvencí pacientů s UL1-A s referenčními sekvencemi potvrdilo několik změn od jedné nebo od obou referenčních ssekvencí. Hvězdičky znázorňují změnu od jedné sekvence, zabarvený nukleotid změnu od obou referenčních sekvencí. Znázorněno růžově

85

W-B 4 3310-B 7 1 6 10

ACATATAGACGCACCTATTACAGTAATTCAGGGAGATACAGTTTATCTCAACGCTAGTAACAATCCCTGTAATTATTCCAGCTTTTGGTACCACGGTAATTGCGAACTT ACATATAGACGCACCTATTACAGTAATTCAGGGAGATACAGTTTATCTCAACGCTAGTAACAATCCCTGTAATTATTCCAGCTTTTGGTACCACGGTAATTGCGAACTT ACATATAGACGCACCTATTACAGTAATTCAGGGAGATACAGTTTATCTCAACGCTAGTAACAACCCCTGCAATTATTCCAGCTTTTGGTACCATGGTAATTGTGAACTT ACATATAGACGCACCTATTACAGTAATTCAGGGAGATACAGTTTATCTCAACGCTAGTAACAACCCCTGCAATTATTCCAGCTTTTGGTACCATGGTAATTGTGAACTT ACATATAGACGCACCTATTACACTAATTCAGGAAGACACAGTTTATCTCAACGCTAGTAACAATCCCTGCAATTATTCCAGCTTTCGGTACCACGGTAATTGCGAACTT ACATATAGACGCACCTATTACACTAATTCAGGAAGACACAGTTTATCTCAACGCTAGTAACAATCCCTGCAATTATTCCAGCTTTCGGTACCACGGTAATTGCGAACTT ACATATAGACGCACCTATTACACTAATTCAGGAAGACACAGTTTATCTCAACGCTAGTAACAATCCCTGCAATTATTCCAGCTTTCGGTACCACGGTAATTGCGAACTT * * *

W-B 4 3310-B 7 1 6 10

TGTGGTTGGAACGGACACTTACATAATTTTACAGAATACCATACAAATACATCGTGTTCCCCGAAATTCATCTGCATAAACGAAACTAAAGGACTGCAGTTACATAATG TGTGGTTGGAACGGACACTTACATAATTTTACAGAATACCATACAAATACATCGTGTTCCCCGAAATTCATCTGCATAAACGAAACTAAAGGACTGCAGTTACATAATG TGTGGATGGAACGGACACTTACACAATTTTACAGAATACCACACAAATACATCGTGTTCCCCGAAATTCATCTGCATAAACGAAACTAAAGGACTGCAGTTACATAATG TGTGGATGGAACGGACACTTACACAATTTTACAGAATACCACACAAATACATCGTGTTCCCCGAAATTCATCTGCATAAACGAAACTAAAGGACTGCAGTTACATAATG TGTGGATGGAACGGACACTTACACAATTTAAAAAAATAGCACACAAATACATTGTGTTCCCCGAAATTTACCTGCATAAACGAAACTAAAGGGCTGCAATTACATAATG TGTGGATGGAACGGACACTTACACAATTTAAAAAAATAGCACACAAATACATTGTGTTCCCCGAAATTTACCTGCATAAACGAAACTAAAGGGCTGCAATTACATAATG TGTGGATGGAACGGACACTTACACAATTTAAAAAAATAGCACACAAATACATTGTGTTCCCCGAAATTTACCTGCATAAACGAAACTAAAGGGCTGCAATTACATAATG * *

W-B 4 3310-B 7 1 6 10

TAACATTGAACGATTCAGGAACATATACCGAGGACGTTTACGAGTGCGACCTTTTATGTAACATTACTAACTGCACCTACACCATAAACAGCACTAAATATATTATTAC TAACATTGAACGATTCAGGAACATATACCGAGGACGTTTACGAGTGCGACCTTTTATGTAACATTACTAACTGCACCTACACCATAAACAGCACTAAATATATTATTAC TAACATTGAACGATTCAGGAACATATACCGAGGACGTTTACGAGTGCGACCTTTTATGTAACATTACTAACTGCACCTACACCATAAACAGTACTAAATATATTATCAC TAACATTGAACGATTCAGGAACATATACCGAGGACGTTTACGAGTGCGACCTTTTATGTAACATTACTAACTGCACCTACACCATAAACAGTACTAAATATATTATCAC TAACATTGAACGATTCAGGAACATATACTGAGGACGTTTAC-----------------------------------CTACACCATAAACAGCACCAAATATATTATCAC TAACATTGAACGATTCAGGAACATATACTGAGGACGTTTACGAGTGCGACCTTTTATGCAACACTGCTAACTGCACCTACACCATAAACAGCACCAAATATATTATCAC TAACATTGAACGATTCAGGAACATATACTGAGGACGTTTACGAGTGCGACCTTTTATGCAACACTGCTAACTGCACCTACACCATAAACAGCACCAAATATATTATCAC * *

W-B 4 3310-B 7 1 6 10

CGTGCGCTCTCCACATCATTCTAAACACACCAATTCCCATGTATCCACTCACGTTGGTTGGACAGCTGCCGTGGTTACGGTTATTATAATCTGCGTTCTGATTTACTTT CGTGCTCTCTCCACATCATTCTAAACACACCAATTCCCATGTATCCACTCACGTTGGTTGGACAGCTGCCGTGGTTACGGTTATTATAATCTGCGTTCTGATTTACTTT TGTGCTCTCCCCACATCATTCTAAACACACCAATTCCCACGTATCCACTCACGTTGGTTGGACACTTGCCGTGGTTACGATTATTATAATCTGCGTTCTGATTTACTTT TGTGCTCTCCCCACATCATTCTAAACACATCAATTCCCACGTATCCACTCACGTTGGTTGGACACTTGCCGTGGTTACGATTATTATAATCTGCGTTCTGATTTACTTT CGTGTTCTCCCCACATCATTCTGAACATACCTATTCCCACGTATCCACTCACGTTGGTTGGACAGCTGCCGTGGTTACGGTTATTGTAATCTGCGTTCTAATTTACTTT CGTGTTCTCCCCACATCATTCTGAACATACCTATTCCCACGTATCCACTCACGTTGGTTGGACAGCTGCCGTGGTTACGGTTATTGTAATCTGCGTTCTAATTTACTTT CGTGTTCTCCCCACATCATTCTGAACATACCTATTCCCACGTATCCACTCACGTTGGTTGGACAGCTGCCGTGGTTACGGTTATTGTAATCTGCGTTCTAATTTACTTT * * * * * ** *

86

W-B 4 3310-B 7 1 6 10

AACGTTCCAACAACCCTAAGACACAAACTACAA AACGTTCCAACAACCCTAAGACACAGACTACGA AACGTTCCAACAACCCTAAGACACAAACTACAA AACGTTCCACCAACCCTAAGACACAGACTACGA AACGTTCCAACGACCCTGAGACACAGACTACGA AACGTTCCAACGACCCTGAGACACAGACTACGA AACGTTCCAACGACCCTGAGACACAGACTACGA *

Příloha č. 8 Porovnání sekvencí jedinců s UL1-B s referenčními sekvencemi (AY446859 a GQ466044) Porovnání sekvencí pacientů s UL1-B s referenčními sekvencemi potvrdilo několik změn od jedné nebo od obou referenčních ssekvencí. Hvězdičky znázorňují změnu od jedné sekvence, zabarvený nukleotid změnu od obou referenčních sekvencí. Znázorněno růžově

87

3157-C 8 MERLIN-C

ACATGTACAAATACCCATCACAGTAGCCGAAGGAGATACAATTTGCTTTAACGTTAGTGATAACCCCTGCAACTTTTCTAGTTACTGGAATCACAATAACTGCGAACTT ACATGTACAAATACCCATCACAGTAGCCGAAGGAGATACAATTTGCTTTAACGTTAGTGATAACCCCTGCAACTTTTCTAGTTACTGGAATCACAATAACTGCGAACTT ACATGTACAAATACCCATCACAGTAGCCGAAGGAGATACAATTTGCTTTAACGTTAGTGATAACCCCTGCAACTTTTCTAGTTACTGGAATCACAATAACTGCGAACTT

3157-C 8 MERLIN-C

TGCGGTTGGACACCATTTTACTCGGAATATGCTGGATATTCCGAAAACAAGTCGTGTCACCCACGATTTACCTGTCTTCACGATACTAAAGGTCTGAAACTACACAACG TGCGGTTGGACACCATTTTACTCGGAATATGCTGGATATTCCGAAAACAAGTCGTGTCACCCACGATTTACCTGTCTTCACGATACTAAAGGTCTGAAACTACACAACG TGCGGTTGGACACCATTTTACTCGGAATATGCTGGATATTCCGAAAACAAGTCGTGTCACCCACGATTTACCTGTCTTCACGATACTAAAGGTCTGAAACTACACAACG

3157-C 8 MERLIN-C

TAACTACAAATGATTCAGGAATTTATACCCGAAACGTTTATTACTGTGACATTCCATGCAACATCAGCGATGATCATAAACATAACGTAGAGGACTTTAACAACTGTAA TAACTACAAATGATTCAGGAATTTATACCCGAAACGTTTATTACTGTGACATTCCATGCAACATCAGCGATGATCATAAACATAACGTAGAGGACTTTGACAACTGTAA TAACTACAAATGATTCAGGAATTTATACCCGAAACGTTTATTACTGTGACATTCCATGCAACATCAGCGATGATCATAAACATAACGTAGAGGACTTTGACAACTGTAA *

3157-C 8 MERLIN-C

CACCACTATAAATAGAACTCACTATATTATTACTGTCTCGTCTTCACGTTATTCTAACCGCACCAATTCCCACGTAGCCACTCACGTTGGTTGGACAGCCACCGTGGTG CACCACTATAAATAGAACTCACTATATTATTACTGTCTCGTCTTCACGTTATTCTAACCGCACCAATTCCCACGTAGCCACTCACGTTGGTTGGACAGCCACCGTGGTG CACCACTATAAATAGAACTCACTATATTATTACTGTCTCGTCTTCACGTTATTCTAAACGCACCAATTCCCACGTAGCCACTCACGTTGGTTGGACAGCCACCGTGGTG *

3157-C 8 MERLIN-C

ATAATTATCTGCGTTTTAACTTACGTTAACGTTACAACAACCCTGA-GCACAGACTACGA ATAATTATCTGCGTTTTAACTTACGTTAACGTTACAACAACCCTGA-GCACAGACTACGA ATAATTATCTGCGTTTTAACTTACGTTAACGTTACAACAACCCTGAAGCACAGACTACGA

Příloha č. 9 Porovnání sekvence jedince s UL1-C s referenčními sekvencemi (AY446894 a GQ221974) Porovnání sekvence pacienta s UL1-C potvrdilo jednu změnu od jedné a jednu změnu od druhé referenční sekvence. Znázorněno hvězdičkou – růžově.

88

Datum:

Amplifikace DNA pro detekci mutací v genu UL97 HCMV Centrum molekulární biologie a genové terapie, IHOK, FN Brno

Pacient datum odběru

Jméno

kopií CMV/µg DNA

PCR – master mix: 10xPCR buffer II............................................2,5 µl MgCl2…..........................................................1,0 µl 1,5 mM dNTP mix 10mM...........................................0,5 µl 0,2 mM Destilovaná voda..........................................15,7 µl Primer UL97-F.................(25 µM)................1,0 µl 1µM Primer UL97-R.................(25 µM)................1,0 µl 1µM DNA...............................................................3,0 µl Taq pol…...........….1.5 U..........…….. …….0,3 µl objem.......................................…...................25,0 µl

1: 95 °C /10min 2: 94 °C /30s 3: 60 °C /30 s 4: 72 °C /30 s 5: Go to 2, 39x 6: 72 °C /5 min 7: 10 °C /for 5 min 8: end PCR produkt – 776 bp

Příloha č. 10

89

koncentrace DNA

Datum:

Amplifikace DNA pro detekci mutací v genu UL97 HCMV Centrum molekulární biologie a genové terapie, IHOK, FN Brno

Pacient datum odběru

jméno

kopií CMV/µg DNA

PCR – master mix: externí kolo 10xPCR buffer II.........................................2,5 µl MgCl2….......................................................3,0 µl 3 mM dNTP mix 10mM........................................0,5 µl 0,2 mM Destilovaná voda......................................13,7 µl Primer R8/CPT 1442...........(25 µM)..........1,0 µl 1 µM Primer R9/CPT 1979...........(25 µM)..........1,0 µl 1 µM DNA............................................................3,0 µl Taq pol…..............1.5 U..........…….. ……0,3 µl objem.......................................…..25,0 µl

PCR – master mix: interní kolo 10xPCR buffer II........................................2,5 µl MgCl2….......................................................1,0 µl 1,0 mM dNTP mix 10mM........................................0,5 µl 0,2 mM Destilovaná voda .......................................16,7 µl Primer R3/CPT 1713............(25 µM).........1,0 µl 1 µM Primer R4/CPT 1830M........(25 µM)..........1,0 µl 1 µM DNA............................................................2,0 µl (50x ředěný) Taq pol…..............1.5 U..........…….. ……0,3 µl objem........................................…..............25,0 µl 1: 95 °C /3 min 2: 95 °C /1 min 3: 60 °C /1 min 4: 72 °C /1 min 5: Go to 2, 36x 6: 72 °C /7 min 7: 10 °C / 5 min 8: end

PCR produkt – 538 bp - externí kolo PCR produkt – 118 bp - interní kolo

Příloha č. 11

90

koncentrace DNA

Datum:

CMV – UL144

PCR – master mix: 10xPCR...............................Gold.....................2,5 µl MgCl2 25mM..................................................1,5 µl (1,5 mM) dNTP mix 10mM ...........................................0,5 µl (200 µM) Destilovaná voda............................................14,9 µl Primer UL144 F........(25 µM)..........................0,2 µl (0,2 µM) Primer UL144 R........(25 µM)..........................0,2 µl (0,2 µM) DNA...................................................................5 µl Gold-Polymerase (5U/µL) ...........0,2 µl...........(1,0 U) objem................................................................25,0 µl 1: 95 °C /10min 2: 95 °C /30s 3: 60 °C /30 s 4: 72 °C /1 min 5: Go to 2, 39x 6: 72 °C /10 min 7: 10 °C /for 5 min 8: end

Příloha č. 12

91

Datum:

CMV – UL1

PCR – master mix: 10xPCR.................................Gold...................2,5 µl MgCl2 25mM..................................................2,5 µl (2,5 mM) dNTP mix 10mM ...........................................0,5 µl (200 µM) Destilovaná voda............................................13,9 µl Primer UL1 F2..........(25 µM)..........................0,2 µl (0,2 µM) Primer UL1 R1..........(25 µM)..........................0,2 µl (0,2 µM) DNA..................................................................5 µl Gold-Polymerase (5U/µL) ...........0,2 µl..........(1,0 U) objem................................................................25,0 µl 1: 94 °C /10 min 2: 94 °C /1 min 3: 60 °C /1 min 4: 72 °C /1 min 5: Go to 2, 42x 6: 72 °C /5 min 7: 10 °C /for 5 min 8: end

Příloha č. 13

92

Datum:

CMV – UL1

PCR – master mix: 10xPCR................................Gold....................2,5 µl MgCl2 25mM..................................................1,5 µl (1,5 mM) dNTP mix 10mM ...........................................0,5 µl (200 µM) Destilovaná voda.............................................14,5 µl Primer UL1 F1A........(25 µM)..........................0,4 µl (0,4 µM) Primer UL1 R1.......... (25 µM)..........................0,4 µl (0,4 µM) DNA..................................................................5 µl Gold-Polymerase (5U/µL) ...........0,2 µl..........(1,0 U) objem................................................................25,0 µl 1: 94 °C /10 min 2: 94 °C /1 min 3: 60 °C /1 min 4: 72 °C /1 min 5: Go to 2, 42x 6: 72 °C /5 min 7: 10 °C /for 5 min 8: end

Příloha č. 14

93

Datum:

CMV – UL55 - glycoprotein B - sekvenace

PCR – master mix: 10xPCR...............................Gold.....................2,5 µl MgCl2 25mM..................................................2,5 µl (2,5 mM) dNTP mix 10mM ...........................................0,5 µl (200 µM) Destilovaná voda............................................13,9 µl Primer gBf..........(25 µM).................................0,2 µl (0,2 µM) Primer gBr..........(25 µM).................................0,2 µl (0,2 µM) DNA................................................................5 µl Gold-Polymerase (5U/µL) ...........0,2 µl.........(1,0 U) objem................................................................25,0 µl

1: 95 °C /10min 2: 94 °C /30s 3: 60 °C /30 s 4: 72 °C /30 s 5: Go to 2, 39x 6: 72 °C /5 min 7: 10 °C /for 5 min 8: end

Příloha č. 15

94

Datum:

Amplifikace DNA pro detekci mutací v genu UL97

PCR – master mix: 10xPCR..................................Gold...................2,5 µl MgCl2 25mM...................................................1,0 µl (1,0 mM) dNTP mix 10mM .............................................0,5 µl (200 µM) Destilovaná voda..............................................15,4 µl Primer 1a, 1c, 3a, 4a (25 µM)............................0,2 µl (0,2 µM) Primer 1b, 2b, 3b, 3c (25 µM)...........................0,2 µl (0,2 µM) DNA..................................................................5 µl Gold-Polymerase (5U/µL) ...........0,2 µl..........(1,0 U) objem................................................................25,0 µl 1: 95 °C /10 min 2: 95 °C /30 sec 3: 55 – 65 °C /30 sec 4: 72 °C /40 sec 5: Go to 2, 35x 6: 72 °C /7 min 7: 10 °C /for 5 min 8: end

Příloha č. 16

95

Datum :

PROTOKOL PRO HRM – PCR REZISTENCE CMV

Externí kolo SensiMix HRM

12,5 µL

EvaGreen

1 µL

Primer 1713

0,2 µL

Primer 1830M

0,2 µL

Destilovaná voda

6,1 µL

(c)DNA

5 µL

objem

25 µL

Program: 1: 95 °C/10min 2: 95 °C /15s 3: 60 °C /10s 4: 72 °C /10s acquire on GREEN channel 5: go to 2, 40x

Příloha č. 17

96

Datum :

PROTOKOL PRO HRM – PCR REZISTENCE CMV

Externí kolo SensiMix HRM

12,5 µL

EvaGreen

1 µL

HRM-REZ-F1

0,9 µL

HRM-REZ-R1

0,9 µL

Destilovaná voda

4,7 µL

(c)DNA

5 µL

objem

25 µL

Program: 1: 95 °C /10min 2: 95 °C /15s 3: 60 °C /10s 4: 72 °C /30s acquire on GREEN channel 5: go to 2, 40x

Příloha č. 18

97

Datum :

Sekvenační reakce (sekvenátor AbiPrism 310) Pacient (jméno, datum odběru)

PCR-prod. (konc., µl)

Primer 10µ µM (název, µl)

Amplifikace DNA: Termin. Ready Reac. Mix………………….…4 µl 5 x Sequencing buffer..……….…………...….2 µl Primer (10 µM)…..……………………….….0,5 µl DNA (1237bp c ~ 40ng)……………………..X µl Objem destilované vody...........………………20 µl

1. 96 °C /30s 2. 50 °C /15s 3. 60 °C /4min 4. GOTO 1 30x 5. 10 °C /forever

Příloha č. 19

98

Sekv. kit 5 x sekv. pufr Destilovaná voda (µ µl) (µ µl) (µ µl)

99