MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie Oddělení genetiky a molekulární biologie
VIRUS HEPATITIS E U PRASAT
Brno 2010
Jana Elsterová
Poděkování: Ráda bych poděkovala svému školiteli prof. MVDr. Vladimíru Celerovi, Ph.D. za trpělivost a cenné rady při zpracování mé bakalářské práce a uvedení do problematiky molekulární virologie nejen z teoretického, ale i z praktického hlediska. Dále chci poděkovat Mgr. Jitce Jankové a oddělení virologie Ústavu mikrobiologie a imunologie na Fakultě veterinárního lékařství Veterinární a farmaceutické univerzity Brno. 2
Obsah: 1. Úvod ……………………………………………………………
4
2. Charakterizace viru hepatitidy E, klasifikace a výskyt ………...
5
3. Charakter genomu HEV a popis virových proteinů ……………
6
4. Ţivotní strategie HEV ………………………………………….
9
5. Detekce HEV, diagnostika …………………………………….
12
5. 1. Molekulárně mikrobiologické testy …………………….
12
5. 2. Sérologické testy ……………………….………………..
13
6. Klinické příznaky infekce HEV ……………………………..…
14
6. 1. Klinické příznaky hepatitidy E u lidí ………….………...
14
6. 2. Klinické příznaky hepatitidy E u prasat …………………
15
7. Vakcinace ………………………………………………………
16
8. Epidemiologie ………………………………………………….
17
8. 1. Přenos HEV z prasete na člověka ……………………….
17
8. 2. Přenos HEV z prasete na prase ………………………….
19
9. Výskyt HEV ve světě, v Evropě a v ČR ……………………….
19
10. Závěr ……………………………………………………………
22
11. Seznam literatury ……………………………………………….
23
12. Slovníček ……………………………………………………….
30
13. Seznam zkratek …………………………………………………
31
3
1. Úvod Téma Virus Hepatitis E u prasat jsem si zvolila nejen pro aktuálnost tohoto tématu v současné době, ale bylo pro mne i vhodnou příleţitostí, abych se obeznámila s problematikou a metodami molekulární biologie virů. Původcem hepatitis E je virus hepatitidy E (HEV), který je rozšířen po celém světě. V určitých částech Asie a Afriky se stal endemickým vzhledem ke špatným hygienickým podmínkám, které tam panují. Ve vyspělých částech světa se tento virus vyskytuje jen sporadicky. Mým cílem bylo zmapování výskytu a způsobu přenosu ve vybraných státech Evropy, včetně České republiky. Virus hepatitidy E zde byl prokázán u lidí, kteří vycestovali do zemí, kde je toto onemocnění endemické. Byly však zaznamenány případy, kdy nemocný pobýval pouze v místě bydliště, a tudíţ byla vyloučena moţnost nákazy v zemích endemického výskytu tohoto onemocnění. Tyto případy hepatitidy E jsou pak pravděpodobně zoonotického původu. V následujícím textu shrnuji poznatky o výskytu viru hepatitidy E u prasat a moţnosti přenosu na člověka.
4
2. Charakterizace viru hepatitidy E, klasifikace a výskyt Příznaky hepatitid virového původu jsou doloţeny jiţ od starověku. Je známo pět virových druhů, které vyvolávají ţloutenku, a to virus hepatitidy A, B, C, D a E. Tyto viry se liší nejen taxonomickým zařazením, ale i ţivotním cyklem, rozšířením a způsoby přenosu. Nejbliţší viru hepatitidy E je Hepatovirus vyvolávající hepatitidu typu A. Patří do čeledi Picornaviridae. Virus hepatitidy A je podobný viru hepatitidy E tím, ţe se také jedná o neobalený virus s jednořetězcovou RNA a tím, ţe oba viry nevyvolávají chronickou formu ţloutenky a přenášejí se podobným způsobem. Hepacivirus u hepatitidy typu C je řazen do čeledi Flaviviridae a jeho obalený virion obsahuje téţ pozitivní jednovláknovou RNA. Oproti tomu virus hepatitidy typu B je zcela odlišný od viru hepatitidy E. Je řazen do čeledi Hepadnaviridae, jeho genom je tvořen molekulou DNA a kóduje reverzní transkriptázu. Hepatitis delta virus hepatitidy typu D je defektním RNA virem a k vyvolání hepatitidy tohoto typu je nutná koinfekce s virem hepatitidy typu B nebo je moţný přechod z hepatitidy typu B na chronickou formu hepatitidy typu D. Symptomy postiţení jater však mohou být pozorovány i u některých adenovirových infekcí, Herpes simplex viru, cytomegalovirů, viru Epstein-Barrové, viru vyvolávajícím horečku dengue, viru vyvolávajícím horečku rift valley a dalších. Virus hepatitidy E (HEV) byl objeven roku 1956 v souvislosti s epidemií hepatitid\ v Novém Dillí v Indii popsanou jako střevní non-A, non-B hepatitis. Později roku 1983 byla s vyuţitím elektronového mikroskopu popsána struktura tohoto viru (Balayan et al., 1983) a následně osekvenován celý jeho genom. Další kmen HEV byl popsán po epidemii hepatitidy v Myanmaru (Tam et al., 1991). Důleţitou událostí byl průkaz hepatitidy E i u zvířat, a to u prasete ve Spojených státech amerických v roce 1997. Tento virus hepatitidy E prasat (swHEV) izoloval Xiang-Jing Meng (Meng et al., 1997). HEV se vyskytuje v jednom sérotypu, ale na základě fylogenetických analýz jej dělíme na čtyři genotypy. Přítomnost pouze jednoho sérotypu je dána podobností kapsidového proteinu, jehoţ aminokyselinová sekvence je u jednotlivých genotypů vysoce konzervovaná (Okamoto, 2007). Diverzita aminokyselinové sekvence kapsidového proteinu se pohybuje jen okolo 6,5 – 11,7 %. Oproti tomu existuje mnoho subgenotypů, které se v rámci jednoho genotypu nepatrně liší z důvodu přítomnosti bodových mutací. Genotypy, respektive subgenotypy mají odlišnou geografickou distribuci. Genotypy 1 a 2 patří mezi endemické skupiny hepatitidy E a vyskytují se v oblastech s nedostatečnými hygienickými podmínkami, kde dochází ke kontaminaci pitné vody, například v období monzunových dešťů nebo kde je nedostatek zdrojů pitné vody. Genotyp 1 je rozšířen především 5
v Asii a v Africe, jen výjimečně se vyskytl například ve Velké Británii nebo v Japonsku u pacientů s cestovatelskou anamnézou. Byl také zjištěn v Myanmaru (Tam et al., 1991). Genotyp 2 byl poprvé zaznamenán v Mexiku po epidemii v roce 1986. Byl identifikován na základě odlišnosti nukleotidových sekvencí při srovnání s genotypem 1 (Huang et al., 1992). Genotyp 2 se dále rozšířil na africký kontinent (Maila et al., 2004). V roce 1997 v návaznosti na případ amerického pacienta, který trpěl akutní hepatitidou E, byl objeven třetí genotyp tohoto viru. U tohoto pacienta byla vyloučena cestovatelská anamnéza hepatitidy E (Kwo et al., 1997). Postupně se ukázalo, ţe tento genotyp je rozšířený po celém světě včetně Evropy. Další nový genotyp vyskytující se v Asii byl popsán v Číně v roce 1999 (Wang et al., 1999). Vzorek čínského pacienta s akutní formou hepatitidy E byl po genetických a fylogenetických analýzách klasifikován jako čtvrtý genotyp. Všechny genotypy jsou dále děleny do subgenotypů lišících se v nukleotidových sekvencích jednotlivých otevřených čtecích rámců (ORF). Genotyp 1 má pět subgenotypů, genotyp 2 má dva subgenotypy, genotyp 3 zahrnuje deset subgenotypů a genotyp 4 obsahuje sedm subgenotypů (Lu et al., 2006). Posledním genotypem 5 je ještě oficiálně neustanovený druh viru aviární hepatitidy E (Haqshenas et al., 2001). Virus vyvolává syndrom hepatosplenomegalie u kuřat a je podobný lidskému a prasečímu HEV v sekvenci nukleotidů kódujících enzym helikázu v otevřeném čtecím rámci jedna (ORF1) (Huang et al., 2004). Tento virus však není přenosný na savce na rozdíl od ostatních čtyř genotypů HEV. Experimentální infekce opice makak rhesus (Macaca mulatta) nevedla k navození virémie. V odebraných vzorcích séra také nebyly nalezeny protilátky proti viru aviární hepatitidy E a jaterní testy byly v rozmezí fyziologických hodnot. Virus hepatitidy E byl původně řazen do čeledi Caliciviridae z důvodu podobnosti struktury kapsidového proteinu (Li et al., 2009). Dalšími studiemi se tato klasifikace ukázala být neudrţitelná pro rozdílnost nukleotidových sekvencí a strategii replikace. V současnosti je HEV řazen do rodu Hepevirus, nově ustanovené čeledi Hepeviridae (Emerson et al., 2004).
3. Charakter genomu HEV a popis virových proteinů HEV je neobalený virus s ikozahedrální symetrií nukleokapsidy o velikosti 27-30 nm. Genom je tvořen jednovláknovou RNA s pozitivní polaritou o velikosti přibliţně 7,2 kbp. Tento genom kóduje tři částečně se překrývající otevřené čtecí rámce (Obrázek č. 1). ORF1 je z nich největší. Po translaci dává vzniknout proteinu o velikosti 1693 aa a kóduje nestrukturální 6
proteiny zahrnující methyltransferázové, helikázové a RNA dependentní RNA polymerázové domény, doménu X a Y s neznámou funkcí a doménu papain-like cysteinové proteázy (Koonin et al., 1992). ORF2 kóduje protein o velikosti 660 aa a vyskytuje se jak v glykosylované, tak v neglykosylované formě. ORF2 kóduje kapsidový protein a nese imunoreaktivní epitopy (Jiménez de Oya et al., 2009). Tento kapsidový protein vzniká aţ po štěpení většího proteinového prekurzoru. Nejmenší ORF3 (po překladu 123 aa), který částečně překrývá oba předešlé otevřené čtecí rámce, kóduje malý imunogenní fosfoprotein, jehoţ funkce není dosud objasněna (Tyagi et al., 2002). Je pouze doloţena kooperace ORF3 s neglykosylovanou formou ORF2. Na koncích genomu leţí nepřekládané oblasti. 3’ konec je polyadenylován a na 5’ konci je čepička.
Obr. č. 1: Organizace genomu HEV. Na 5122. nukleotidu začíná iniciace subgenomové RNA. ORF1 kóduje nestrukturální proteiny. M - methyltransferáza; Y - Y doména; P - papain-like proteáza; V - doména bohatá na prolin; X - X doména; H - RNA helikáza; R - RNA polymeráza (Okamoto, 2007).
Nukleokapsidu viru tvoří jediný kapsidový strukturální protein se třemi doménami (Li et al., 2005). Tato nukleokapsida se skládá z kapsomer tvořených homodimery, doménami E2, které vyčnívají na povrch, interagují s hostitelskou buňkou a umoţňují infekci. E2 doména má na svém povrchu „ţlábek“ obsahující epitopy rozpoznávané virus neutralizačními protilátkami hostitelského organismu. Doména E2 obsahuje podoblast p239, která je zodpovědná za formaci viru podobných partikulí (VLP). Doposud byla popsána detailní struktura pouze E2 domény (Li et al., 2009). Hlavní část této domény se skládá z devíti ß-skládaných listů tvořících strukturu soudku (Obrázek č. 2). ß-řetězcová soudkovitá struktura (ß-barrel) se objevuje i u virů čeledi Caliciviridae. Proto byl HEV původně mylně do této čeledi zařazen. Oproti tomu není známa 7
ţádná podstatná homologie sekvence nebo struktury s jakýmikoli povrchovými proteiny jiných virů.
Obr. č. 2: A. Diagram podjednotky E2 dimeru. B. E2 dimer. Jsou zde vyznačeny N a C konce proteinových podjednotek (Li et al.,2009).
Další strukturou, kterou tvoří tento virus, jsou „virus-like“ partikule (VLP) (Obrázek č. 3). Jsou to kapsidy viru bez nukleové kyseliny (Xing et al., 1999). Tyto částice o velikosti 23,7 nm jsou tvořeny zkrácenou formou ORF2. Tato forma obsahuje deleci na N-konci aminokyselinové sekvence. Deletovaná doména je pravděpodobně odpovědná za enkapsidaci virové RNA, proto vzniklé VLP struktury neobsahují virový genom. Tento fakt potvrzuje i přítomnost velké dutiny uvnitř partikule. ORF1 a ORF3 se nepodílejí na konstrukci virových VLP. V porovnání s plnohodnotnými viriony jsou tyto částice menší, ale sdílejí s nimi tvar a povrchové struktury. Skládají se ze šedesáti podjednotek tvořících třicet dimerů kapsomer.
Obr. č. 3: Znázornění povrchu viru podobné partikule. Rekonstrukce partikulí je sloţena ze 73 samostatných zobrazení a provedena ve třech různých rovinách (Xing et al., 1999).
8
4. Životní strategie HEV Virus hepatitidy E se mnoţí v hepatocytech a je vylučován ve fécés. Jeho přenos se proto uskutečňuje především fekálně-orální cestou. Jeho ţivotní cyklus nebyl zcela objasněn, ale předpokládá se, ţe je analogický s alphaviry a s virem ţloutenky typu A (HAV), který je také neobalený a obsahuje jednovláknovou RNA s pozitivní polaritou tvořící genom. Po vazbě na receptory vnímavých hostitelských buněk virus penetruje do cytoplazmy (Obrázek č. 4), dojde k dekapsidaci genomu a genomová RNA se začne transkribovat za vzniku nestrukturálního polyproteinu kódovaného ORF1. Protein ORF1 je štěpen buněčnými proteázami. Pomocí enzymu replikázy (RNA dependentní RNA polymerázy) je pozitivní genomová RNA přepsána na negativní intermediát RNA. Ten slouţí jako matrice pro zrod nové genomové RNA a subgenomových RNA. Subgenomová RNA - mRNA - je překládána do strukturálních proteinů. Proteiny kapsidy poté zabalí genomovou RNA a vzniká virion. Přímé experimentální potvrzení tohoto způsobu replikace není dosud doloţeno. Zatím byla tato domněnka potvrzena pouze přítomností pozitivních a negativních RNA vláken v játrech experimentálně infikovaných prasat (Meng et al., 1998). Základní strategie ţivotního cyklu je u všech genotypů stejná. Genotyp 4 se však odlišuje, protoţe obsahuje nukleotidovou inzerci v části sekvence kódující ORF3, dále po směru posunuje čtecí rámec, coţ vede ke změně místa iniciačního kodonu, který iniciuje translaci ORF2 a ORF3.
9
Obr. č. 4. Zobrazení hypotetického replikačního cyklu HEV. (1) Vniknutí viru do buňky (2), obnaţení genomové RNA a její uvolnění do cytoplasmy. (3) Translace genomové RNA do nestrukturálních proteinů. (4A) Syntéza intermediátu negativního vlákna RNA a transkripce vláken s pozitivní RNA (4B), amplifikace genomu viru. (5) Pozitivní vlákna subgenomové RNA jsou překládána do strukturních proteinů. (6) Protein kapsidu obalí genomovou RNA za vzniku nových virionů, které jsou uvolněny z buňky (Chandra et al., 2008).
Genotyp 4 se od ostatních genotypů liší ve způsobu translace otevřených čtecích rámců 2 a 3 (Wang et al., 2000). Inzerce jediného nukleotidu, uracilu, v pozici 5159 nt mění iniciaci ORF3 a pravděpodobně i ORF2, zatímco u ostatních genotypů je oblast iniciačního kodonu vysoce konzervativní (Obrázek č. 5). Tato změna prodluţuje produkt translace ORF2 o 14 aa (kodonů) na 5’ konci, zkracuje produkt ORF3 o 11 aa a mění délku překryvu ORF1 a ORF3 i ORF1 a ORF2. ORF2 tedy můţe být zahájen iniciačním kodonem, který je shodný s ostatními genotypy, nebo díky nukleotidové inzerci iniciačním kodonem, který u ostatních genotypů iniciuje translaci ORF3. Prodlouţení ORF2 však neovlivňuje konečnou podobu produktu, proteinu kapsidy. V genomu jsou přítomny tři iniciační kodony AUG, které mohou iniciovat tvorbu ORF3 (Graff et al., 2006). Tím, ţe v izolované subgenomové RNA nebyly první dva iniciační kodony přítomny, bylo prokázáno, ţe pouze třetí z nich iniciuje translaci ORF3. Tato skutečnost platí i pro ostatní genotypy. 10
Obr. č. 5: (a) Genom genotypů 1 aţ 3 a obecná strategie translace těchto genotypů. (b) Znázornění ORF genotypu 4 s alternativními iniciačními kodony pro ORF2 a zkrácený ORF3. Zkratky proteinů, které kóduje ORF1, jsou MT-methyltransferáza, Pro-proteáza. ORF2 vlastní signální sekvenci peptidu v terminální části aminokyselinové sekvence (černý rámeček) a potenciální místa glykosylace (černé značky). Genomová RNA dlouhá 7,5 kb je zobrazena ve spodní části obrázku (Wang et al., 2000).
Celkově je replikace HEV z molekulárního hlediska velmi málo prostudována z důvodu špatné kultivace buněk infikovaných HEV v in vitro podmínkách (Emerson et al., 2004). Tato skutečnost můţe být způsobena celou řadou negativních faktorů, včetně absence příslušného receptoru, poruchy replikace genomu nebo chyby v morfogenezi. Při kultivaci nebyla zaznamenána infekce virem z infikované buňky na neinfikovanou buňku z extracelulárního prostředí, virus se především šíří dělením infikovaných buněk. Bohuţel se ještě nepodařilo zvýšit počet virus pozitivních buněk natolik, aby mohla být přímo zaznamenána replikace RNA genomu. Bylo však prokázáno, ţe syntéza produktů ORF2 a ORF3 je závislá na replikaci virové RNA. Tento fakt potvrzuje, ţe proteiny tvořené oběma otevřenými čtecími rámci jsou translatovány ze subgenomové RNA, která je generována virovou RNA dependentní RNA polymerázou. ORF2 a ORF3 se tvoří z jediné bicistronické subgenomové RNA (Graff et al., 2006). Po iniciačním kodonu pro ORF3 následuje vysoce konzervativní oblast dvanácti nukleotidů, která tvoří promotor pro syntézu subgenomové RNA. Tato oblast je stejná u všech čtyř savčích genotypů. Iniciační kodon pro syntézu proteinu ORF3 na bicistronické mRNA předchází iniciaci proteinu ORF2. 11
Důleţitou sloţkou v iniciaci replikace je čepička na 5’ konci genomu, jejíţ nepřítomnost výrazně sniţuje schopnost infekce buňky virem (Emerson et al., 2004). Tato kapacita se sniţuje 32 aţ 38krát oproti kompletním genomovým RNA. Čepička tedy spíše usnadňuje translaci, neţ ţe by byla úplně nepostradatelná. Stále je tu totiţ jistá pravděpodobnost, ţe buňku infikuje virová RNA bez čepičky, na níţ se napojí ribozom a začne translace proteinů ORF1, tedy i RNA dependentní RNA polymerázy. V tom případě by první syntetizovaný genom de novo měl mít čepičku a měl by dále probíhat normální replikační cyklus. Infekce a následná kultivace HEV byla moţná pouze u savčích buněk, a to především u lidských buněčných linií PLC/PRF/5, Huh-7, Caco-2 a HepG2/3CA pocházejících z jaterní tkáně. U linie PLC/PRF/5 a Huh-7 byla infekce experimentálně prokázána infikováním makaka rhesus, u něhoţ poté došlo k manifestaci příznaků hepatitidy. Kultivace viru se nezdařila v buněčných liniích derivovaných z jaterních buněk myši a potkana.
5. Detekce HEV, diagnostika HEV infekci je moţno detekovat přímými metodami průkazu nukleové kyseliny viru ve vzorku pomocí PCR (polymerázové retězové reakce). Druhou moţností průkazu infekce je vyuţití detekce specifických protilátek proti viru HEV sérologickými testy. 5.1. Molekulárně mikrobiologické testy Jedinou moţností stanovení přítomnosti HEV v klinických vzorcích je jeho detekce metodou polymerázové řetězové reakce spřaţenou s reverzní transkripcí (RT PCR). Pouţité vzorky mohou být sérum, ţluč nebo stolice (Mushahwar, 2008). Tato metoda je při stanovení diagnózy rozhodující. Je to také zatím jediná moţnost stanovení diagnózy HEV v subklinickém stádiu, kde se ještě neprojevily typické příznaky ţloutenky (Mitsui et al., 2005). HEV RNA je detekovatelná 7 aţ 40 dní po infekci virem (Takahashi et al., 2005). RT-PCR test můţe být buď kvalitativní, kdy se určuje pouze přítomnost virové RNA, například při ověření diagnózy HEV infekce, nebo se pouţívají kvantitativní testy, které umoţňují stanovit mnoţství viru (Mushahwar, 2008). Kvantifikace HEV je prováděna real-time RT-PCR testem, který umoţňuje kvantifikaci genetické informace v reálném čase (Zhao et al., 2007). Tato metoda je navíc schopna detekovat aţ desetinásobně menší koncentraci RNA neţ standardní RT-PCR testy. 12
V současnosti Gyarmati et al. (2007) navrhli ještě senzitivnější variantu metody real-time PCR zaloţenou na formátu TaqMan testu v kombinaci s Primer-Probe Energy Transfer technikou (PriProEt). Citlivost těchto testů dosáhla limitu detekce dvaceti virových genomů. Tyto techniky je neustále nutné vylepšovat, aby byla zaručena přesná identifikace jednotlivých genotypů HEV v kontaminovaných zdrojích pitné vody, v jídle a zoonotického přenosu infekce HEV. Důleţitý je také výzkum mezidruhového přenosu HEV. PriProEt metoda je dokonce schopna tolerovat bodové mutace vyskytující se v nukleové kyselině, coţ umoţňuje rozpoznání nových variant viru HEV a zamezení falešně negativních výsledků. 5.2. Sérologické testy Sérologickými testy jsou detekovány protilátky proti HEV v séru, a to IgA, IgM a IgG typy (Mushahwar, 2008). Poté, co byl genom HEV naklonován a osekvenován, bylo moţné vyvinout testy na základě uměle syntetizovaných peptidů nebo rekombinantních proteinů viru, které modelovaly imunodominantní epitopy oblastí jeho proteinu nukleokapsidy. Tyto testy však vykazovaly velké kolísání v citlivosti (Mast et al., 1998). Testy byly vyuţívány zejména ke studiu infekce onemocnění v endemických i neendemických oblastech. Tyto testy také umoţňují detekci HEV specifických protilátek nejen u savců, ale i u dalších druhů, které byly experimentálně infikovány všemi genotypy HEV. V poslední době je k detekci HEV specifických protilátek nejvíce vyuţíván test ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay). Tento test detekuje protilátky korelující s virus neutralizačními protilátkami reagujícími na HEV genotypy jedna aţ čtyři (Zhou et al., 2004). Tento test přinesl inovaci v průkazu neutralizačních protilátek oproti předcházejícím typům těchto sérologických testů. Je zaloţen na pouţití monoklonálních protilátek váţících se na neutralizační epitopy přítomné ve struktuře kapsidového proteinu ORF2. Tento ELISA test je dále zdokonalován ve své specifitě a senzitivitě. Další varianty umoţňují i kvantifikaci zjištěných protilátek. Dva HEV testy detekující IgG protilátky jsou komerčně dostupné kromě Spojených států amerických. Jsou to Abbott Immunoglobulin G test (Laboratoře Abbott, Německo) a Genelabs IgG test (Genelabs Diagnostics, Singapur) (Mushahwar, 2008). Další varianty těchto testů jsou schopny rozlišit akutní a déle trvající HEV infekci. Jsou zaloţeny na detekci IgM protilátek a umoţňují přesné zmapování výskytu raných stádií HEV infekce. IgA testy jsou také pouţívány jako dodatečné průkazné protilátky k určení diagnózy rané HEV infekce. 13
6. Klinické příznaky infekce HEV 6.1. Klinické příznaky hepatitidy E u lidí Virus hepatitidy E se klinicky projevuje jako onemocnění jater, tedy ikterus – ţloutenka. Nejčastěji probíhá jako akutní forma ţloutenky, ale jsou známy i případy chronického průběhu například u pacientů s transplantací jater (Haagsma et al., 2008). Symptomy onemocnění jsou naţloutlá barva kůţe a očního bělma, anorexie, nevolnost, zvracení, malátnost, bolest břicha, tmavé zbarvení moči a horečka. Mortalita je udávána na 0,5 – 3 % u dospělých pacientů, ale aţ 15 – 20 % u těhotných ţen. Nemocí jsou nejčastěji postiţeni lidé ve věku od 15 do 40 let. Typickým příznakem je také zvýšená hladina enzymu alaninaminotransferázy (ALT). Diagnosticky významná je také přítomnost protilátek imunoglobulinu typu G v krevním séru a virové RNA v séru nebo ve stolici. U všech nemocných pacientů je patrné poškození jater v podobě nekrotického zánětu. U většiny pacientů se také projevují histologické změny jako anizokaryóza, rozdílná velikost a tvar jader a shluky Kupfferových buněk se siderózou. Výskyt cholangitidy, onemocnění intrahepatálních a extrahepatálních ţlučovodů, je častý a je pozorovatelná téţ cholestáze. Těţší příznaky jsou patrné u alkoholiků trpících cirhózou a u lidí s nemocnými játry. Chronická forma ţloutenky typu E byla rozpoznána u dvou pacientů z Holandska po transplantaci jater (Haagsma et al., 2008). První pacient onemocněl ţloutenkou po dvou měsících po transplantaci a později se u něho vyvinula cirhóza jater. Pacient znovu podstoupil transplantaci jater po sedmi letech, ale chronická forma ţloutenky typu E se opakovala. U druhého pacienta se objevila ţloutenka aţ sedm let po transplantaci. Opět u něho byla provedena retransplantace, po níţ byl pacient dlouhodobě bez známek ţloutenky. V obou případech se jednalo o infekci HEV genotypu 3, který obsahuje lidské kmeny blízce příbuzné s prasečími. Hlavní příčinou, proč virus HEV dlouhodobě perzistoval u těchto pacientů, je pravděpodobně potlačení jejich imunity z důvodu imunosupresivní léčby. Rozdíl mezi oběma pacienty byl také v mnoţství virových částic obsaţených v odebraném séru. Sérum prvního pacienta obsahovalo mnohem větší mnoţství virových částic, neţ bylo zjištěno u druhého pacienta, coţ pravděpodobně přispělo k recidivě onemocnění. První pacient uţíval také větší dávky imunosupresivních léčiv, coţ více oslabilo jeho imunitní odpověď. Ta pak nebyla schopna eliminovat HEV infekci i po odstranění největšího zdroje (jater), a proto se nemoc opakovala a virus opětovně infikoval i nově transplantovaná játra. Této hypotéze odpovídá i skutečnost, ţe druhý pacient byl schopen navodit tvorbu protilátek proti HEV, zatímco první 14
pacient nikoli. Zdroj onemocnění ţloutenkou u obou pacientů není znám. Zoonotický původ není vyloučen vzhledem k tomu, ţe genotyp 3 se vyskytuje i u prasat, která slouţí jako zdroj HEV ve vyspělých částech světa. Není také vyloučeno, ţe pacienti se ţloutenkou typu E, kteří dlouhodobě uţívají imunosupresiva, mohou být přenašeči infekce. V současnosti, díky kvalitním hygienickým podmínkám v nemocnicích, je tato moţnost infekce HEV velmi nepravděpodobná, jelikoţ se virus velmi obtíţně šíří s výjimkou oro-fekálního přenosu. Další moţnost nákazy virem HEV je prostřednictvím transplantovaných jater, krve nebo krevních derivátů. V poslední době se objevují případy přenosu HEV krevní transfuzí. V Japonsku byl registrován pacient trpící „T-buněčným lymfomem“, u kterého byla diagnostikována chronická forma ţloutenky typu E (Tamura et al., 2007). U dotyčného však nebyly přítomny protilátky proti HEV během šesti měsíců po pravděpodobné infekci kvůli imunosupresi při chemoterapii a také díky aktivitě lymfomu. Na základě porovnání sekvencí nukleové kyseliny viru z krve donora se vzorkem viru od pacienta byl prokázán transfúzní přenos HEV genotypu 3. HEV způsobuje těţký průběh ţloutenky u těhotných ţen a ohroţuje ţivot plodu (Patra et al., 2007). Riziko úmrtnosti matky je vysoké stejně jako aborty nebo poškození plodu. Gravidní ţeny trpí náhlým selháním jater, edémem mozku či krevními sraţeninami (Khuroo a Kamili, 2003). U těhotných ţen se infekce HEV rozvine v akutní formu ţloutenky mnohem častěji neţ u ţen, které nejsou gravidní. Úmrtnost se u těhotných pohybuje okolo 15 aţ 20 %. 6.2. Klinické příznaky hepatitidy E u prasat V roce 1997 Meng et al. (1997) prokázali virus HEV u prasat. Toto agens izolované z infikovaného prasete reagovalo s protilátkami proti kapsidovému antigenu HEV lidí. Další studie prokázaly, ţe HEV antigenně podobný lidskému HEV běţně cirkuluje v populaci prasat. Tento virus bývá označován jako swHEV. První studie prokazující přítomnost HEV u prasat prokázala séropozitivitu 18 z 21 březích prasnic v testovaném chovu. Selata z vrhu HEV pozitivních prasnic s nízkým titrem IgG protilátek proti HEV v krvi byla séronegativní. Dvoutýdenní selata narozená HEV pozitivním prasnicím s vysokým titrem IgG protilátek proti HEV v krvi měla detekovatelné HEV specifické IgG protilátky, ale ne IgM protilátky. Hladina IgG protilátek proti HEV u sérologicky pozitivních selat rychle klesala a vymizela v osmi aţ devíti týdnech stáří. Podle dynamiky jejich výskytu se lze domnívat, ţe se jednalo o mateřské protilátky. V pěti měsících stáří byla pozorována sérokonverze u 16 selat z 21. Pitva těchto zvířat prokázala multifokální a periportální lymfoplasmacytickou hepatitidu s výskytem mírné fokální 15
hepatocelulární nekrózy typické pro akutní fáze infekce HEV. Kromě toho všechna pitvaná selata
trpěla
lymfoplasmacytickou
enteritidou
a
tři
z nich
měla
multifokální
lymfoplasmacytickou intersticiální nefritidu. Dále se u jednoho selete na krčních mandlích a v Peyerových plátech objevily syncytiální buňky. Příznaky u mladých selat byly pouze subklinické na rozdíl od průběhu onemocnění u dospělých prasat. U těchto se infekce HEV projevuje typickými příznaky ţloutenky v důsledku poškození jater.
7. Vakcinace V současnosti není komerčně dostupná ţádná vakcína proti HEV. Experimentálně však bylo dosaţeno povzbuzujících výsledků při vývoji těchto vakcín. Jedna z testovaných vakcín byla zaloţena na rekombinantním proteinu z ORF2 exprimovaném v bakulovirovém systému. Takto připravený rekombinantní ORF2 protein se samovolně uspořádal do VLP částic. Touto vakcínou byla imunizována skupina primátů (makak rhesus), kteří byli experimentálně infikováni různými kmeny viru hepatitidy E. V jejich séru byly prokázány HEV specifické protilátky typu IgG, IgA a IgM. Tato varianta vakcíny však nezabránila infekci HEV u experimentálních zvířat, pouze omezila vznik klinických příznaků HEV infekce (Zhang et al., 2002). V dalším experimentu byla popsána DNA vakcína proti HEV infekci. V tomto experimentu byla aplikována purifikovaná plasmidová DNA s naklonovanou ORF2 oblastí genomu viru HEV (He et al., 1997). U experimentálně infikovaných myší byly prokázány HEV specifické protilátky. Poslední moţná alternativa vakcíny je zaloţena na swHEV, který vykazuje kříţovou reaktivitu s lidskými kmeny HEV. Nejreálnější cestou k tvorbě komerčně dostupné vakcíny je vyuţití rekombinantního kapsidového proteinu. Rekombinantní HEV vakcína získaná z bakuloviru v hmyzí buňce je vysoce imunogenní, tudíţ i dávka menší neţ 1 g účinně ochránila pokusné zvíře před klinickou manifestací onemocnění, i kdyţ ne nutně před infekcí (Purcell et al., 2003). Očkované pokusné opice byly odolné vůči HEV i po šesti měsících, v některých případech i po roce (Zhang et al., 2002). Národní ústav alergie a infekčních chorob v USA pod vedením Dr. R. H. Purcella úspěšně dokončil studii pro vytvoření potencionální komerční vakcíny proti HEV obsahující zkrácenou formu rekombinantního kapsidového proteinu o velikosti 56 kDa (Mushahwar, 2008). Ukázalo se, ţe vakcína zabránila manifestaci klinických příznaků HEV u rizikové skupiny 1794 16
nepálských vojáků, ale není doloţeno, zda také zabraňuje infekci HEV (Shrestha et al., 2007). Účinnost vakcíny dosahovala 95,5 % po aplikaci třetí dávky. Po podání pouze jedné dávky onemocněli 4 testovaní vojáci. Vakcína je tedy účinná aţ po druhé dávce Testovaní, u kterých byla aplikována víc neţ jedna dávka vakcíny, si vytvořili specifické HEV protílátky. Tato vakcína můţe celosvětově omezit přenos HEV, protoţe poskytuje příjemci dlouhodobou imunitu.
8. Epidemiologie 8.1. Přenos HEV z prasete na člověka Za původce přenosu HEV na člověka ve vyspělých zemích světa jsou pokládána prasata, jelikoţ slouţí jako hlavní zdroj zoonotické infekce. Prasečí kmeny genotypu 3 se totiţ vyskytují v různých částech světa kromě Afriky a genotyp 4 se pak vyskytuje převáţně v Asii. Infekce jedním kmenem HEV chrání před infekcí dalšími kmeny tohoto viru (Purcell et al., 2003). Malá dávka viru HEV způsobí viremii, ale nevyvolá klinické příznaky ţloutenky. Aţ větší mnoţství viru (105 virových partikulí) je nutné k manifestaci klinických příznaků ţloutenky typu E. Nízký počet lidí nakaţených virem HEV přeneseného z prasat v industrializovaných zemích koreluje s niţší schopností adaptace prasečího viru na lidský organismus (Péres-Gracia et al., 2007). Zvýšené riziko přenosu HEV platí pro lidi vyskytující se v blízkosti chovu prasat, pro veterináře nebo pro lidi manipulující s masem na jatkách, u kterých byla pozorována vyšší prevalence HEV specifických protilátek ve srovnání se zbytkem populace. Byly zaznamenány i případy HEV infekce poţitím nedostatečně tepelně upraveného masa (Banks et al., 2004a). SwHEV je rozšířen nejen u domácích prasat, ale i u prasat divokých, u vysoké zvěře a u hlodavců. Přenos v chudých částech světa se děje fekálně-orální cestou z člověka na člověka, na rozdíl od vyspělých zemí, kde jako zdroj infekce pro člověka slouţí prase. Ve Španělsku byl zaznamenán první případ infekce swHEV u muţe pracujícího na jatkách (Pérez-Gracia et al., 2007). Muţ trpěl diabetem typu 2, ve velké míře poţíval alkohol a byl jiţ dříve diagnostikován na onemocnění jater. Pravděpodobně se nakazil manipulací se syrovými orgány infikovaných prasat. Byl hospitalizován s typickými příznaky ţloutenky. Sérologické testy a detekce viru potvrdily nákazu HEV. Virus HEV, který byl příčinou infekce, byl typizován jako genotyp 3. Analýza sekvence genomu viru prokázala 83,4% podobnost s lidskými kmeny a 97,3% podobnost s prasečími kmeny viru HEV v Evropě. 17
Dalším rizikem nákazy HEV je poţití nedostatečně tepelně zpracovaného masa. V USA Feagins et al. (2007) testovali vepřová játra v místních obchodech s potravinami na přítomnost HEV, u pozitivních vzorků pak byla provedena jejich typizace sekvenováním. Bylo zakoupeno 127 kusů vakuově balených vepřových jater, z toho ve 14 (11,0 %) z nich byla prokázána RNA viru hepatitidy E. Tyto kmeny vykazovaly 84-100% homologii nukleotidových sekvencí mezi sebou, 86-94% shodu nukleotidových sekvencí s genotypem 3 swHEV vyskytující se v Americe a 87-93% shodu nukleotidových sekvencí se dvěma lidskými americkými kmeny (US1 a US2). Pro zjištění, zda pozitivní prasečí játra stále obsahují ţivotaschopné virové partikule, byla pozitivními prasečími játry infikována pokusná prasata ve věku čtyř týdnů. Byly pouţity tři jaterní vzorky pozitivní na HEV RNA a kaţdým vzorkem bylo experimentálně infikováno pět prasat. U dvou skupin byla zaznamenána viremie a vylučování viru stolicí. U třetí skupiny nebyla zaznamenána infekce, sérokonverze ani viremie. Virus HEV byl u této skupiny pravděpodobně inaktivován podmínkami skladování vepřových jater v obchodě. Protoţe se HEV přenáší fekálně-orální cestou, je virus odolný vůči kyselému a mírně zásaditému prostředí, aby byl schopen přeţít v trávicím traktu hostitele. HEV je však také velmi termolabilní. Virus je z 50 % inaktivován zahřátím na jednu hodinu jiţ při teplotě 56 °C a při 66 °C je virus HEV zcela deaktivován. Není zatím prokázáno, zda tepelná úprava vepřových výrobků inaktivuje HEV. Je proto stále moţné, ţe důvodem relativně vysoké séroprevalence v lidské populaci ve vyspělých zemích je konzumace kontaminovaných produktů z prasete. Ve Velké Británii byl evidován případ infekce poţitím masového produktu obsahujícího HEV (Banks et al., 2004a). Ţena, která nebyla v kontaktu s prasaty ani nikam během deseti let necestovala, onemocněla ţloutenkou. Dotyčná tři měsíce před nemocí snědla tepelně neupravené párky a slaninu. Testovaný vzorek její krve byl pozitivní na HEV specifické protilátky třídy IgM. Přítomnost viru HEV ve vzorku krve potvrdil také test přímé detekce virové RNA. Vyšetření ultrazvukem a jaterní testy prokázaly, ţe stav jejích jater byl v normálu a ţe netrpěla autoimunitní ani metabolickou poruchou jater. Analýza nukleotidové sekvence izolovaného kmenu HEV ze vzorku krve pacientky zařadila tento kmen do genotypu 3. Onemocnění ţloutenkou typu E bylo zaznamenáno i v jiných zemích. Mnoho zdokumentovaných případů pochází z Japonska vzhledem ke specifickým národním stravovacím zvyklostem.
18
8.2. Přenos HEV z prasete na prase Přirozený přenos viru HEV z prasete na prase se uskutečňuje fekálně-orální cestou. Experimentálně byl transfer HEV uskutečněn experimentální infekcí zdravého prasete infikovanou krví nebo vzorkem HEV pozitivních jater. K přenosu infekce HEV došlo i pouhým kontaktem infikovaného zvířete se zdravým jedincem. Virémie u infekce HEV je pouze přechodná a trvá jeden aţ tři týdny. Oproti tomu vylučování viru stolicí trvá aţ sedm týdnů (Meng et al., 1998). Byla zpracována studie, zaměřená na moţné cesty přenosu HEV infekce v rámci chovu komerčně vyuţívaných prasat (Kasorndorkbua et al., 2004). Cílem této studie bylo zjištění, zda se virus HEV můţe přenášet vystavením zdravého jedince sekretům z rypáku a mandlí infikovaného prasete nebo orofekálně trusem nemocného zvířete a zda je moţný také přenos opakovaně pouţívanou infikovanou jehlou, coţ se často děje při očkování v chovech prasat. Pro zjištění přítomnosti HEV u prasat, která byla vystavena HEV infekci různými způsoby, bylo vyuţito molekulárně biologických metod (RT-PCR, sekvenování). V případě infikovaných nosních sekretů a slin, které byly opakovaně vtírány zdravým prasatům do nosní a ústní dutiny, byl přenos HEV neúspěšný. Všechna testovaná prasata byla negativní na přítomnost HEV RNA. Přenos HEV pomocí kontaminované jehly vpichem do kosterního svalstva při očkování byl také neúspěšný. Je doloţeno, ţe kosterní svalstvo prasete není místem replikace viru HEV, proto se virus ve vepřovém mase nevyskytuje ani při virémii (Williams et al., 2001). Po poţití stolice infikované virem HEV třemi zdravými prasaty byla sérokonverze prokázána pouze u jednoho z nich, klinické příznaky hepatitidy typu E však nebyly po dobu 14 týdnů zaznamenány (Kasorndorkbua et al., 2004). Jedinou moţnou variantou přenosu je tedy fekálně-orální cesta. Je však nutná opakovaná expozice zdravého prasete infikovaným exkretům, aby byl přenos HEV úspěšný.
9. Výskyt HEV ve světě, v Evropě a v ČR HEV vyvolávající akutní virovou hepatitidu typu E je endemický ve velkém počtu států Asie, Afriky a částečně i Latinské Ameriky (Obrázek č. 6). Přibliţně 2 miliardy obyvatel ţije na území s endemickým výskytem HEV. Jsou známy i případy importu HEV z míst, kde je HEV endemický, do států s ojedinělým výskytem HEV, jako jsou Austrálie, Francie, Izrael, Nizozemsko, Španělsko, Británie a USA. SwHEV se vyskytuje převáţně na území států s vyšším 19
ţivotním standardem. Jsou registrovány případy hlavně z Evropy, Severní Ameriky a západní Asie (Japonsko a západní Čína). Byl zaznamenán i případ pacientky s akutní ţloutenkou typu E, po jejíţ diagnostice bylo zjištěno, ţe sekvence izolovaná ze vzorku pacientky je shodná se sekvencí sw HEV izolované z vakuově baleného vepřového produktu. (Yazaki et al., 2003).
Obr. č. 6: Zobrazení séroprevalence a endemických oblastí HEV. Červené oblasti na mapě znázorňují státy světa s endemickým výskytem HEV, kde je víc neţ 25 % případů akutní hepatitidy vyvolané virem HEV. Ve vybraných státech jsou uvedena procenta séroprevalence HEV (Chandra et al., 2008).
20
Výskyt swHEV u prasat v Evropě znázorňuje tabulka č. 1. HEV byla detekována průkazem viru nebo sérologicky. Stát
Vzorek
Počet prasat Počet pozit. prasat
%
Reference
Velká Británie
sérum
256
219
Švédsko
stolice
10
6
60
Norder et al., 2009
Dánsko
stolice
97
53
55
Rutjes et al., 2007
Francie
sérum
215
87
40,5 Kaba et al., 2009
Česká
ţluč, játra, 32
12
37,5 Vašíčková et al., 2009
154
42
27,3 Reuter et al., 2009
republika
sérum
85,5 Banks et al., 2004b
stolice, Maďarsko
játra
van der Poel et al., Nizozemí
stolice
115
25
22
2001 Clemente-Casares et
Španělsko
sérum
73
10
13,7 al., 2003 Di Martino et al.,
Itálie
stolice
150
11
7,3
2010
Tabulka č. 1: Prevalence viru hepatidy E u prasat v různých zemích Evropy
První publikovaná studie o stavu výskytu swHEV u prasat v České republice byla provedena aţ v roce 2008 (Vašíčková et al., 2009). Pomocí nested reverzní transkriptázové polymerázové řetězové reakce (nRT-PCR) byly testovány vzorky séra, ţluči a jater, a to z 32 selat z jedenácti různých chovů v České republice. HEV RNA byla nejčastěji detekována ve ţluči (40 % pozitivních vzorků), poté v játrech (16,1 %) a v séru (3,2 %). V sedmi (63,6 %) z jedenácti chovů bylo vţdy alespoň jedno sele pozitivní na HEV. Z 32 testovaných selat bylo 12 HEV pozitivních, coţ činí 37,5 %. Fylogenetická analýza prokázala, ţe všechny detekované HEV z ČR patří do genotypu 3.
21
10. Závěr Hepatitida typu E je rozšířena po celém světě. Ve většině států třetího světa je toto onemocnění endemické. Naopak ve vyspělých státech se infekce tohoto typu vyskytuje pouze sporadicky. Od doby, kdy byl popsán virus HEV i u prasat, je původ infekce u některých pacientů, kteří onemocněli ţloutenkou typu E ve vyspělých státech, přisuzován zoonotickému přenosu z prasete na člověka. V roce 1997 byl popsán virus swHEV, který byl antigenně příbuzný s virem HEV člověka (Meng et al., 1997). Byla zjištěna podobnost s genotypy humánní HEV na úrovni nukleotidových sekvencí viru. Byly provedeny fylogenetické analýzy, které prokázaly, ţe swHEV se vyskytuje ve dvou genotypech, a to v genotypu 3 vyskytujícím se převáţně v Evropě, na americkém kontinentu a v Austrálii, a v genotypu 4, jehoţ výskyt je doloţen v Asii. V současnosti je znám HEV u člověka a u prasat a zatím oficiálně neuznaný HEV u ptáků. Protilátky proti HEV však byly prokázány i u jiných druhů zvířat, jako jsou kočky, psi, ovce, kozy nebo hlodavci. Je tedy zřejmé, ţe virus HEV je schopen mezidruhového přenosu. Z hlediska studia HEV má zcela ojedinělé postavení Japonsko, protoţe se zde současně vyskytují genotypy 1, 3 a 4 (Okamoto, 2007). Genotyp 1 je doloţený pouze jako importovaná infekce HEV ze zemí endemického výskytu, genotyp 3 sem byl zavlečen z Británie dovozem prasat a genotyp 4 se zde vyskytuje přirozeně. V ţádném jiném státě se nevyskytují více neţ dva genotypy. Japonsko díky své kultuře stravování má také více případů akutní hepatitidy E zoonotického původu oproti ostatním zemím, kde se swHEV vyskytuje. Z mnoţství dostupných odborných publikací je zřejmé, ţe problematika HEV je nejvíce aktuální v Japonsku a v USA. V USA byl virus HEV poprvé popsán u prasat. V současné době je v USA pozornost soustředěna na riziko profesionální infekce u osob pracujících na jatkách nebo u veterinářů. Bylo prokázáno, ţe tito lidé, kteří jsou v kontaktu s prasaty, mají častěji protilátky proti HEV v krvi v porovnání s běţnou populací. Oproti tomu v Japonsku bylo publikováno nejvíce prací o případech nákazy akutní formou ţloutenky typu E po poţití nedostatečně tepelně upravených výrobků z vepřového masa. Byly zde také publikovány případy přenosu HEV transfúzí. V Evropě se problematikou viru HEV zabývají převáţně jen ve státech západní Evropy (Benelux, Francie a Velká Británie). Bohuţel ţádné informace o výskytu HEV u prasat nebo u lidí ve státech východní Evropy jako je Ukrajina, Bulharsko, Polsko nebo Slovensko není dostupná. 22
11. Seznam použité literatury Balayan, M.S., Andjaparidze, A.G., Savinskaya, S.S., Ketiladze, E.S., Braginsky, D.M., Savinov, A.P. and Poleshuk, V.F. 1983. Evidence for a virus in non-A, non-B hepatitis transmitted via the fecal-oral route. Intervirology 20: 23-31. Banks, M., Bendall, R., Grierson, S., Heath, G., Mitchell, J. and Dalton, H. 2004a. Human and porcine hepatitis E virus strains, United Kingdom. Emerging Infectious Diseases 10: 953-955. Banks, M., Heath, G.S., Grierson, S.S., King, D.P., Gresham, A., Girones, R., Widen, F. and Harrison, T.J. 2004b. Evidence for the presence of hepatitis E virus in pigs in the United Kingdom. The Veterinary Record 154: 223-227. Clemente-Casares, P., Pina, S., Buti, M., Jardi, R., Martín, M., Bofill-Mas, S. and Girones, R. 2003. Hepatitis E virus epidemiology in industrialized countries. Emerging Infectious Diseases 9: 448-454. Di Martino, B., Di Profio, F., Martella, V., Di Felice, E., Di Francesco, C.E., Ceci, C. and Marsilio, F. 2010. Detection of hepatitis E virus in slaughtered pigs in Italy. Archiv of Virology 155: 103-106. Emerson, S.U., Nguyen, H., Graff, J., Stephany, D.A., Brockington, A. and Purcell, R.H. 2004. In vitro replication of hepatitis E virus (HEV) genomes and of an HEV replicon expressing green fluorescent protein. Journal of Virology 78: 4838-4846. Feagins, A.R., Opriessnig, T., Guenette, D.K., Halbur, P.G. and Meng, X.J. 2007. Detection and characterization of infectious Hepatitis E virus from commercial pig livers sold in local grocery stores in the USA. Journal of General Virology 88: 912-917. Graff, J., Torian, U., Nguyen, H. and Emerson, S.U. 2006. A bicistronic subgenomic mRNA encodes both the ORF2 and ORF3 proteins of hepatitis E virus. Journal of Virology 80: 5919-5926. 23
Gyarmati, P., Mohammed, N., Norder, H., Blomberg, J., Belák, S. and Widén, F. 2007. Universal detection of hepatitis E virus by two real-time PCR assays: TaqMan and PrimerProbe Energy Transfer. Journal of Virological Methods 146: 226-235. Haagsma, E.B., van den Berg, A.P., Porte, R.J., Benne, C.A., Vennema, H., Reimerink, J.H. and Koopmans, M.P. 2008. Chronic hepatitis E virus infection in liver transplant recipients. Liver Transplantation 14: 547-553. Haqshenas, G., Shivaprasad, H.L., Woolcock, P.R., Read, D.H. and Meng, X.J. 2001. Genetic identification and characterization of a novel virus related to human hepatitis E virus from chickens with hepatitis-splenomegaly syndrome in the United States. Journal of General Virology 82: 2449-2462. He, J., Hoffman, S.L. and Hayes, C.G. 1997. DNA inoculation with a plasmid vector carrying the hepatitis E virus structural protein gene induces immune response in mice. Vaccine 15: 357-362. Huang, C.C., Nguyen, D., Fernandez, J., Yun, K.Y., Fry, K.E., Bradley, D.W., Tam, A.W. and Reyes, G.R. 1992. Molecular cloning and sequencing of the Mexico isolate of hepatitis E virus (HEV). Virology 191: 550-558 Huang, F.F., Sun, Z.F., Emerson, S.U., Purcell, R.H., Shivaprasad, H.L., Pierson, F.W., Toth, T.E. and Meng, X.J. 2004. Determination and analysis of the complete genomic sequence of avian hepatitis E virus (avian HEV) attempts to infect rhesus monkeys with avian HEV. Journal of General Virology 85: 1609-1618. Jiménez de Oya, N.J., Galindo, I., Gironés, O., Duizer, E., Escribano, J.M. and Saiz, J.C. 2009. Serological immunoassay for detection of hepatitis E virus on the basis of genotype 3 open reading frame 2 recombinant proteins produced in Trichoplusia ni larvae. Journal of Clinical Microbiology 47: 3276-3282. Kaba, M., Davoust, B., Marié, J.L., Barthet, M., Henry, M., Tamalet, C., Raoult, D. and Colson, P. 2009. Frequent transmission of hepatitis E virus among piglets in farms in Southern France. Journal of Medical Virology 81: 1750-1759. 24
Kasorndorkbua, C., Guenette, D.K., Huang, F.F., Thomas, P.J., Meng, X.J. and Halbur, P.G. 2004. Routes of transmission of swine hepatitis E virus in pigs. Journal of Clinical Microbiology 42: 5047-5052. Khuroo, M.S. and Kamili, S. 2003. Aetiology, clinical course and outcome of sporadic acute viral hepatitis in pregnancy. Journal of Viral Hepatitis 10: 61-69. Koonin, E.V., Gorbalenya, A.E., Purdy, M.A., Rozanov, M.N., Reyes, G.R. and Bradley, D.W. 1992. Computer-assisted assignment of functional domains in the nonstructural polyprotein of the hepatitis E virus: delineation of an additional group of positive-strand RNA plant and animal viruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 89: 8259-8263. Li, S., Tang, X., Seetharaman, J., Yang, C., Gu, Y., Zhang, J., Du, H., Shih, J.W., Hew, C.L., Sivaraman, J. and Xia, N. 2009. Dimerization of hepatitis E virus capsid protein E2s domain is essential for virus-host interaction. PloS Pathogens 5 [online], [cit. 31. října 2009]. Dostupný na www:
Li, S.W., Zhang, J., He, Z.Q., Gu, Y., Liu, R.S., Lin, J., Chen, Y.X., Ng, M.H. and Xia, N.S. 2005. Mutational analysis of essential intreractions involved in the assembly of hepatitis E virus capsid. The Journal of Biological Chemistry 280: 3400-3406. Lu, L., Li, C., Hagedorn, C.H. 2006. Phylogenetic analysis of global hepatitis E virus sequences: genetic diversity, subtypes and zoonosis. Reviews in Medical Virology 16: 5-36. Maila, H.T., Bowyer, S.M. and Swanepoel, R. 2004. Identification of a new strain of hepatitis E virus from an outbreak in Namibia in 1995. Journal of General Virology 85: 89-95. Mast, E.E., Alter, M.J., Holland, P.V. and Purcell, R.H. 1998. Evaluation of assays for antibody to hepatitis E virus by a serum panel. Hepatology 27: 857-861.
25
Meng, X.J., Halbur, P.G., Haynes, J.S., Tsareva, T.S., Bruna, J.D., Royer, R.L., Purcell, R.H. and Emerson, S.U. 1998. Experimental infection of pigs with the newly identified swine hepatitis E virus (swine HEV), but not with human strains of HEV. Archives of Virology 143: 1405-1415. Meng, X.J., Purcell, R.H., Halbur, P.G., Lehman, J.R., Webb, D.M., Tsareva, T.S., Haynes, J.S., Thacker, B.J. and Emerson, S.U. 1997. A novel virus in swine is closely related to the human hepatitis E virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 94: 9860-9865. Mitsui, T., Tsukamoto, Y., Suzuki, S., Yamazaki, C., Masuko, K., Tsuda, F., Takahashi, M., Tsatsralt-Od, B., Nishizawa, T. and Okamoto, H. 2005. Serological and molecular studies on subclinical hepatitis E virus infection using periodic serum samples obtained from healthy individuals. Journal of Medical Virology 76: 526-533. Mushahwar, I.K. 2008. Hepatitis E virus: molecular virology, clinical features, diagnosis, transmission, epidemiology, and prevention. Journal of Medical Virology 80: 646-658. Okamoto, H. 2007. Genetic variability and evolution of hepatitis E virus. Virus Research 127: 216-228. Patra, S., Kumar, A., Trivedi, S.S., Puri, M. and Sarin, S.K. 2007. Maternal and fetal outcomes in pregnant women with acute hepatitis E virus infection. Annals of Internal Medicine 147: 28-33. Pérez-Gracia, M.T., Mateos, M.L., Galiana, C., Fernández-Barredo, S., García, A., Gómez, M.T. and Moreira, V. 2007. Autochthonous hepatitis E infection in a slaughterhouse worker. The American journal of tropical medicine and hygiene 77: 893-896. Peron, J.M., Danjoux, M., Kamar, N., Missoury, R., Poirson, H., Vinel, J.P., Mansuy, J.M., Bureau, C., Izopet, J., Brousset, P. and Selves, J. 2007. Liver histology in patients with sporadic acute hepatitis E: a study of 11 patients from South-West France. Virchows Archiv 450: 405-410. 26
Purcell, R.H., Nguyen, H., Shapiro, M., Engle R.E., Govindarajan, S., Blackwelder, W.C., Wong, D.C., Prieels, J.P. and Emerson, S.U. 2003. Pre-clinical immunogenicity and efficacy trial of a recombinant hepatitis E vaccine. Vaccine 21: 2607-2615. Reuter, G., Fodor, D., Forgách, P., Kátai, A. and Szűcs, G. 2009. Characterization and zoonotic potential of endemic hepatitis E virus (HEV) strains in humans and animals in Hungary. Journal of Clinical Virology 44: 277-281. Rutjes, S.A., Lodder, W.J., Bouwknegt, M. and de Roda Husman, A.M. 2007. Increased hepatitis E virus prevalence on Dutch pig farms from 33 to 55% by using appropriate internal quality controls for RT-PCR. Journal of Virological Methods 143: 112-116. Shrestha, M.P., Scott, R.M., Joshi, D.M., Mammen, M.P.Jr,, Thapa, G.B., Thapa, N., Myint, K.S., Fourneau, M., Kuschner, R.A., Shrestha, S.K., David, M.P., Seriwatana, J., Vaughn, D.W., Safary, A., Endy, T.P. and Innis, B.L. 2007. Safety and efficacy of a recombinant hepatitis E vaccine. The New England Journal of Medicine 356: 895-903. Takahashi, M., Kusakai, S., Mizuo, H., Suzuki, K., Fujimura, K., Masuko, K., Sugai, Y., Aikawa, T., Nishizawa, T. and Okamoto, H. 2005. Simultaneous detection of immunoglobulin A (IgA) and IgM antibodies against hepatitis E virus (HEV) is highly specific for diagnosis of acute HEV infection. Journal of Clinical Microbiology 43: 49-56. Tam, A.W., Smith, M.M., Guerra, M.E., Huang, C.C., Bradley, D.W., Fry, K.E. and Reyes, G.R. 1991. Hepatitis E virus (HEV): molecular cloning and sequencing of the full-length viral genom. Virology 185: 120-131. Tamura, A., Shimizu, Y.K., Tanaka, T., Kuroda, K., Arakawa, Y., Takahashi, K., Mishiro, S., Shimizu, K. and Moriyama, M. 2007. Persistent infection of hepatitis E virus transmitted by blood transfusion in a patient with T-cell lymphoma. Hepatology Research 37: 113-120. Tyagi, S., Korkaya, H., Zafrullah, M., Jameel, S. and Lal, S.K. 2002. The phosphorylated form of the ORF3 protein of hepatitis E virus interacts with its non–glycosylated form of the major capsid protein, ORF2. The Journal of Biological Chemistry 277: 22759-22767. 27
van der Poel, W.H., Verschoor, F., van der Heide, R., Herrera, M.I., Vivo, A., Kooreman, M. and de Roda Husman, A.M. 2001. Hepatitis E virus sequences in swine related to sequences in humans, the Netherlands. Emerging Infectious Diseaes 7: 970-976. Vašíčková, P., Psikal, I., Widen, F., Smítalová, R., Bendová, J., Pavlík, I. and Králík, P. 2009. Detection and genetic characterisation of Hepatitis E virus in Czech pig production herds. Research of Veterinary Science 87: 143-148. Vokurka, M., Hugo, J. a kolektiv. 2008. Velký lékařský slovník. 8. vydání. Maxdorf Jessenius. Praha. Wang, Y., Ling, R., Erker, J.C., Zhang, H., Li, H., Desai, S., Mushahwar, I.K. and Harrison, TJ. 1999. A divergent genotype of hepatitis E virus in Chinese patients with acute hepatitis. Journal of General Virology 80: 169-177. Wang, Y., Zhang, H., Ling, R., Li, H. and Harrison, T.J. 2000. The complete sequence of hepatitis E virus genotype 4 reveals an alternative strategy for translation of open reading frames 2 and 3. Journal of General Virology 81: 1675-1686. Williams, T.P., Kasorndorkbua, C., Halbur, P.G., Haqshenas, G., Guenette, D.K., Toth, T.E. and Meng, X.J. 2001. Evidence of extrahepatic sites of replication of the hepatitis E virus in a swine model. Journal of Clinical Microbiology 39: 3040-3046. Xing, L., Kato, K., Li, T., Takeda, N., Miyamura, T., Hammar,L. and Cheng, R.H. 1999. Recombinant hepatitis E capsid protein self-assembles into a dual-domain T = 1 particle presenting native virus epitopes. Virology 265: 35-45. Yazaki, Y., Mizuo, H., Takahashi, M., Nishizawa, T., Sasaki, N., Gotanda, Y. and Okamoto, H. 2003. Sporadic acute or fulminant hepatitis E in Hokkaido, Japan, may be foodborne, as suggested by the presence of hepatitis E virus in pig liver as food. Journal of General Virology 84: 2351-2357.
28
Zhang, M., Emerson, S.U., Nguyen, H., Engle, R., Govindarajan, S., Blackwelder, W.C., Gerin, J. and Purcell, R.H. 2002. Recombinant vaccine against hepatitis E: duration of protective immunity in rhesus macaques. Vaccine 20: 3285-3291. Zhao, C., Li, Z., Yan, B., Harrison, T.J., Guo, X., Zhang, F., Yin, J., Yan, Y. and Wang, Y. 2007. Comparison of real-time fluorescent RT-PCR and conventional RT-PCR for the detection of hepatitis E virus genotypes prevalent in China. Journal of Medical Virology 79: 1966-1973. Zhou, Y.H., Purcell, R.H. and Emerson, S.U. 2004. An ELISA fo putative neutralizing antibodies to hepatitis E virus detects antibodies to genotypes 1, 2, 3, and 4. Vaccine 22: 25782585.
29
12. Slovníček Alaninaminotransferáza – enzym ze skupiny transamináz, jehoţ aktivita v krevním séru se zvyšuje zejm. u jaterního poškození. Nachází se v cytosolu hepatocytů Anizokaryóza – nestejná velikost (vzhled) buněčných jader Enteritida – zánět střeva Fokální – loţiskový Hepatocelularní – týkající se jaterních buněk (hepatocytů) Cholangitida – zánět ţlučových cest, zejm. intrahepatálních Cholestáza – městnání ţluči. Stav, kdy do duodena nepřitéká normální mnoţství ţluči, jejíţ sloţky se hromadí v játrech a v organismu Imunogenní – schopný navodit imunitní reakci, vznik protilátek Intersticiální – týkající se intersticia, vmezeřené tkáně orgánu, tvořenou řídkým vazivem Lymfoplasmacytická – týkajíci se lymfocytárních buněk charakteru B lymfocytů a blízké plasmocytům, které mohou produkovat imunoglobuliny Multifokální – mnoholoţiskový, vycházející z mnoha loţisek, s mnoha ohnisky Nefritida – zánětlivé onemocnění ledvin (Vokurka a Hugo, 2008). Nekróza – intravitální odumření buňky, tkáně či části orgánu Periportální – v okolí portálního pole, coţ je vazivový prostor mezi jaterními lalůčky Peyerovy pláty – nahromadění lymfatické tkáně ve sliznici střeva Prevalence – procento pozitivních případů onemocnění (sérologických nebo virologicky pozitivních) ve vybrané populaci Sérokonverze – reakce tvorbou protilátek na přítomnost infekčního agens Séroprevalence – procento sérologicky pozitivních jedinců Sideróza – ukládání anorganických sloučenin ţeleza v tkáni Syncytiální buňky – útvar vytvořený splynutím několika buněk Syndrom hepatosplenomegalie – syndrom zvětšení jater a sleziny
30
13. Seznam zkratek ALT
- Alaninaminotransferáza
EIA
- Enzyme ImmunoAssay
ELISA
- Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
HAV
- Hepatitis A virus
HEV
- Hepatitis E virus
ORF
- Open reading frame - otevřený čtecí rámec
PCR
- Polymerase chain reaction - polymerázová řetězová reakce
RT-PCR
- Reverse transkriptase polymerase chain reaction – reverzní transkriptázová polymerázová řetězová reakce
VLP
- Virus-like particules - viru podobné částice
31
