b MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA Ústav experimentální biologie Oddělení fyziologie a imunologie ţivočichů Interakce klíště hostitel

b MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA Ústav experimentální biologie Oddělení fyziologie a imunologie ţivočichů

Interakce klíště – hostitel Diplomová práce

Veronika Nesnídalová

Vedoucí práce: RNDr. Helena Nejezchlebová, Ph.D.

Brno 2013

Bibliografický záznam: Autor:

Bc. Veronika Nesnídalová Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav experimentální biologie Oddělení fyziologie a imunologie ţivočichů

Název práce:

Interakce klíště – hostitel

Studijní program:

Biologie

Studijní obor:

Obecná biologie

Vedoucí práce:

RNDr. Helena Nejezchlebová, Ph.D.

Akademický rok:

2012/2013

Počet stran:

111

Klíčová slova:

Ixodes ricinus; klíště; krevsající členovci; interakce klíště – hostitel; semiochemické látky; vertikální testy; MO – bioassay; sezónní aktivita; borrelie; DFM; krevní skupiny; vůně; kosmetické přípravky.

Bibliographic entry:

Author:

Bc. Veronika Nesnídalová Faculty of Science, Masaryk University Institute of Experimental Biology Department of Animal Physiology and Immunology

Title of Thesis:

Interaction Between Ticks and Humans

Degree Programme:

Biology

Field of Study:

General biology

Supervisor:

RNDr. Helena Nejezchlebová, Ph.D.

Academic Year:

2012/2013

Number of Pages:

111

Keywords:

Ixodes ricinus; tick; blood sucking arthropods; interaction tick host; semiochemical substances; vertical tests; MO - bioassay; seasonal activity; borrelia; DFM; blood group; fragrance; cosmetics.

Abstrakt Klíště obecné (Ixodes ricinus) patří mezi hematofágní členovce. Je přenašečem různých onemocnění. Tato onemocnění mohou být původu virového, bakteriálního nebo protozoálního. Onemocnění způsobených klíšťaty neustále narůstá. Tato práce zkoumala, jakou roli v interakcích klíště hostitel mají osobnostní charakteristiky: pouţití vonných kosmetických přípravků a krevní skupiny. Vonné kosmetické přípravky obsahují velké mnoţství substancí, které mohou ovlivnit tělesnou vůni uţivatele a tím i jeho individuální pachový (biochemický) profil, coţ můţe mít vliv na zmíněné interakce. Pro testování byly vybrané dva běţně vyuţívané přístupy pro testování repelentních přípravků – vertikální testy a „moving object bioassay“. Odpuzující účinek u vertikálních testů byl vyšší u toaletní vody Enigma Dare to Dream (98 %) neţ u toaletní vody Avon Summer White (88 %). Odpuzující účinek u MO – bioassay byl u Avon Summer White 86 % a u Enigma Dare to Dream 82 %. Toaletní voda Enigma Dare to Dream měla vyšší odpuzující účinky neţ toaletní voda Avon Summer White ve vertikálním testu, ale ne v MO – bioassay. Dále jsme zjišťovali, zda u výběru člověka jako hostitele hrají úlohu krevní skupiny. Preference krevních skupin byla testována pomocí přístupu, který se také vyuţívá pro testování repelentních přípravků – testy na Petriho misce. Jako nejpreferovanější krevní skupina byla skupina A, druhá byla krevní skupina 0, třetí nejpreferovanější skupinou byla skupina AB a nejméně preferovaná skupina byla B. Klíšťata pro testy byla sbírána na lokalitě Pisárky a Ruda v Brně v průběhu roku 2012. Na lokalitě Pisárky jsme nasbírali celkem 198 klíšťat. Nejvíce bylo nymf (85,35 %), dále samic (6,06 %), samců (5,56 %) a nejméně larev (3,03 %). Celková prevalence na přítomnost spirochét byla stanovena metodou DFM byla 4,5 %, infekční byly pouze nymfy. Na lokalitě Ruda jsme nasbírali 321 klíšťat. Nejvíce bylo nymf (73,52 %), dále larev (19,94 %), samců (4,36 %) a nejméně samic (2,18 %). Celková prevalence na přítomnost spirochét byla 9,35 %. Nejvíce pozitivních na přítomnost spirochét bylo nymf (61,9 %), dále samců (28,6 %), larev (7,1 %) a nejméně samic (2,4 %).

Abstract Tick (Ixodes ricinus) are among hematophagous arthropods. Is a carrier of various diseases. These diseases can be origin of viral, bacterial or protozoal. Diseases caused by ticks continually increasing. This study examined the role in the interactions of tick hosts have personal characteristics: the use of fragrant cosmetics and blood group. Essential cosmetic products contain large amounts of substances that can affect body odor user and thus the individual odor (biochemical) profile, which can affect the mentioned interaction. For testing, we selected two commonly used approaches for testing repellent products - vertical tests and "moving object bioassay." Repellent effect of the vertical test was higher in the toilet water Enigma Dare to Dream (98 %) than toilet water Avon Summer White (88 %). Repellent effect in MO – bioassay was in the Avon Summer White 86 % and Enigma Dare to Dream 82 %. Toilet water Enigma Dare to Dream had a higher repellent effect than toilet water Avon Summer White in the vertical test, but not in MO - bioassay. Furthermore, we examined choice of human as the host play a role blood groups. Preference blood groups was tested using an approach that is also used for testing repellent products - Tests on a Petri dish. As the most preferred blood group was group A, the second was blood group 0, the third most preferred group was AB and the least preferred group B. Ticks were collected for testing on the lokality of Pisárky and Ruda in Brno during the year 2012. In the locality Pisárky we collected a total of 198 ticks. The most were nymphs (85,35 %), followed by females (6,06 %), males (5,56 %) and least were larvae (3,03 %). The total prevalence of the presence spirochetes determined by DFM was 4,5 %, nymphs were only infectious. In the locality Ruda we collected 321 ticks. The most were nymphs (73,52 %), followed by larvae (19,94 %), males (4,36 %) and least were females (2,18 %). The total prevalence of the presence spirochetes was 9,35 %. The most nymphs were positive for the presence of spirochetes (61,9 %), followed by males (28,6 %), larvae (7,1 %) and least were females (2,4 %).

Poděkování: Na tomto místě bych chtěla poděkovat všem, kteří mi pomáhali při vypracování diplomové práce. Zejména děkuji své školitelce RNDr. Heleně Nejezchlebové, Ph.D. za cenné rady a připomínky. Dále bych poděkovala doc. RNDr. Aleně Ţákovské, Ph.D. za pomoc při zpracování vzorků z klíšťat. RNDr. Milanu Baláţovi, Ph.D. za pomoc při zpracování statistických dat. Na závěr chci poděkovat své rodině a mému příteli za trpělivost nejen při psaní diplomové práce, ale i za podporu během mého studia.

Prohlášení Prohlašuji, ţe jsem svoji diplomovou práci vypracovala samostatně s vyuţitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány. Brno 15. května 2013

……………………… jméno, příjmení

Obsah 1. Úvod ............................................................................................................................... 13 2. Krevsající členovci ......................................................................................................... 14 2. 1. Třída klepítkatci (Chelicerata) ............................................................................... 15 2. 1. 1. Řád roztoči (Acarina) ................................................................................. 15 2. 2. Třída hmyz (Insecta) .............................................................................................. 24 2. 2. 1. Řád blechy (Siphonaptera)......................................................................... 25 2. 2. 2. Čeleď štěnicovití (Cimicidae) .................................................................... 25 2. 2. 3. Řád vši (Phthiraptera)................................................................................ 26 2. 2. 4. Čeleď komárovití (Culicidae) .................................................................... 27 2. 2. 5. Čeleď ovádovití (Tabanidae) ..................................................................... 28 3. Interakce klíšťat .............................................................................................................. 29 3. 1. Vnitrodruhové interakce klíšťat .............................................................................. 30 3. 1. 1. Feromony.................................................................................................... 30 3. 2. Interakce klíště – hostitel ........................................................................................ 32 3. 2. 1. Výskyt klíšťat a vyhledávání hostitele ....................................................... 33 3. 2. 1. 1. Hlavní přirozené faktory ovlivňující výběr hostitele ............................. 34 3. 2. 1. 2. Vliv repelentů ......................................................................................... 37 3. 2. 2. Obranný systém hostitele ........................................................................... 39 3. 2. 3. Obranný systém klíštěte ............................................................................. 41 3. 2. 4. Metody identifikace hostitelů klíšťat ......................................................... 42 3. 3. Interakce klíště - patogen ........................................................................................ 43 4. Cíle práce........................................................................................................................ 44 5. Materiál a metody........................................................................................................... 45 5. 1. Sběr klíšťat - vlajkování ......................................................................................... 45 5. 1. 1. Materiál ...................................................................................................... 45 5. 1. 2. Postup ......................................................................................................... 46 5. 1. 3. Charakteristika lokality Pisárky ................................................................. 46 5. 1. 4. Charakteristika lokality Ruda ..................................................................... 47 5. 2. Testování odpuzujících účinků vonných přípravků................................................ 48 10

5. 2. 1. Testované přípravky ................................................................................... 48 5. 2. 2. Testovací přístupy ...................................................................................... 49 5. 2. 2. 1. Vertikální testy ....................................................................................... 49 5. 2. 2. 1. 1. Materiál .............................................................................................. 49 5. 2. 2. 1. 2. Postup ................................................................................................. 50 5. 2. 2. 2. ,,Moving – object bioassay“ ................................................................... 50 5. 2. 2. 2. 1. Materiál .............................................................................................. 52 5. 2. 2. 2. 2. Postup ................................................................................................. 52 5. 3. Preference krevních skupin klíšťaty ....................................................................... 53 5. 3. 1. Testy na Petriho misce ............................................................................... 53 5. 3. 1. 1. Materiál .................................................................................................. 53 5. 3. 1. 2. Postup ..................................................................................................... 53 5. 4. Stanovení přítomnosti spirochét v klíštěti metodou DFM ...................................... 54 5. 4. 1. Materiál ...................................................................................................... 55 5. 4. 2. Postup ......................................................................................................... 55 5. 5. Software pro statistické vyhodnocení dat ............................................................... 56 6. Výsledky......................................................................................................................... 57 6. 1. Výsledky vlajkování a DFM na lokalitě Pisárky .................................................... 57 6. 2. Výsledky metody vlajkování a DFM na lokalitě Ruda .......................................... 64 6. 3. Vliv vybraných vonných kosmetických přípravků na klíšťata (Ixodes ricinus)..... 72 6. 3. 1. Toaletní voda Avon Summer White........................................................... 72 6. 3. 1. 1. Vertikální testy ....................................................................................... 72 6. 3. 1. 2. MO – bioassay ........................................................................................ 73 6. 3. 1. 3. Porovnání vlivu toaletní vody Avon Summer White na chování klíšťat 74 6. 3. 2. Toaletní voda Enigma Dare to Dream ........................................................ 75 6. 3. 2. 1. Vertikální testy ....................................................................................... 75 6. 3. 2. 2. MO – bioassay ........................................................................................ 76 6. 3. 2. 3. Porovnání vlivu toaletní vody Enigma Dare to Dream .......................... 77 6. 3. 3. Srovnání vlivu toaletní vody na chování klíšťat ........................................ 78 6. 3. 3. 1. Vertikální testy ....................................................................................... 78 6. 3. 3. 2. MO – bioassay ........................................................................................ 79 6. 3. 4. Celkové srovnání vlivu toaletní vody na chování klíšťat ........................... 81 11

6. 4. Preference krevních skupin klíšťaty ....................................................................... 81 7. Statistické vyhodnocení výsledků .................................................................................. 85 7. 1. Statistické vyhodnocení aktivity klíšťat ................................................................. 85 7. 2. Statistické vyhodnocení vlivu toaletní vody na chování klíšťat ............................. 88 7. 3. Statistické vyhodnocení preference krevních skupin ............................................. 90 8. Diskuze ........................................................................................................................... 95 9. Závěr............................................................................................................................. 101 Seznam zkratek ................................................................................................................ 103 Seznam literatury.............................................................................................................. 104 Internetové zdroje ............................................................................................................. 110

12

1. Úvod Tato diplomová práce poskytuje informace o klíštěti obecném (Ixodes ricinus). Klíšťata patří mezi nejrozšířenější hematofágní členovce, kteří přenášejí i řadu onemocnění. V Evropě patří mezi nejčastější onemocnění přenášená klíšťaty lymeská borelióza (LB). Původcem LB je gramnegativní spirochéta Borrelia burgdorferi sensu lato (Bbsl). Doposud jsou v Evropě za patogenní povaţovány kmeny Borrelia afzelii, Borrelia garinii a Borrelia burgdorferi sensu strikto. Zaměřujeme se i na analýzu aspektů biologického a biochemiského profilu hostitele (člověka). Aspekty, námi zvolený kosmetický produkt nebo naše krevní skupina, mohou významně ovlivnit riziko ataku klíštěte a přenos nákazy. Důleţité je preventivní opatření proti onemocnění přenášených klíšťaty. Výhodnou strategií je analýza rizika onemocnění v prostoru i čase. Proto součástní diplomové práce je i pravidelný monitoring lokalit Pisárky a Ruda v Brně. Tyto lokality jsou často vyuţívány obyvateli města Brna k rekreaci a volnočasovým aktivitám. Díky pravidelnému monitoringu lze získat cenné informace o aktivitě klíšťat v průběhu sezóny, o jejich promořenosti patogeny a získáváme informace i o samotných patogenech. Lidé se vţdy snaţili bránit proti napadení hematofágními členovci. Jedním ze způsobů je pouţití chemických odpuzujících přípravků. Jedná se o látky, které zabraňují členovcům v přistání či probodení zvířecí nebo lidské kůţe. Odpuzujícími přípravky mohou být i vonné kosmetické přípravky. Vonné kosmetické přípravky obsahují biologicky aktivní látky, které mohou ovlivnit atraktivitu uţivatele, jako potenciálního hostitele pro klíště, a zvýšit nebo sníţit riziko jeho ataku. Pro testování vlivu vonných kosmetických přípravků na chování klíšťat jsme pouţili dvě vybrané metody – vertikální testy a MO – bioassay. Je známo, ţe někteří jedinci jsou více náchylní k napadení krevsajícími členovci. Snaţili jsme se zjistit, zda u klíšťat existují preferované krevní skupiny jako u komárů. U krevních skupin jsme předpokládali, ţe krevní skupiny se podílejí na vytvoření určité biochemické charakteristiky nositele a mohou zvýšit nebo sníţit atak hostitele.

13

2. Krevsající členovci Klíště i ostatní krevsající (hematofágní) členovci patří mezi nebezpečné přenašeče patogenů, kteří mohou vyvolávat závaţná onemocnění jak původu virového, tak i bakteriálního nebo protozoálního (Singh & Girschick, 2003). Protoţe se jedná o velmi rozsáhlou skupinu ţivočichů a práce se zaměřuje na jiné cíle neţ podat jejich vyčerpávající přehled, omezím se ve svojí práci na charakteristiku námi studovaného druhu Ixodes ricinus a stručný přehled o ostatních hematofágních členovcích, vyskytujících se stejně jako námi zkoumané klíště obecné na území ČR. Kmen členovci (Arthropoda) tvoří nejrozsáhlejší a nejrozšířenější ţivočišný kmen na Zemi (Sedlák, 2006). Svůj domov nacházejí od horských ledovců aţ po největší mořské hlubiny. Jméno mají podle článkovaných tělních přívěsků, původně v počtu jednoho páru na jednom článku. Kostra je chitinová, oběhový systém je otevřený. Tělní dutina vznikla splynutím prvotní a druhotné tělní dutiny a dostala název nepravá tělní dutina. Tělo členovců se skládá z hlavy, hrudi a zadečku, u některých druhů se vyskytuje hlavohruď. Tělní pokryv řada druhů svléká (Hubálek & Rudolf, 2007). Svlékání je řízeno hormony. Většina členovců jsou gonochoristé s často vytvořeným pohlavním dimorfismem. Mají larvální období, které tvoří u většiny druhů nejdelší část ţivota. Délka ţivota jen výjimečně dosahuje několika let. Hematofágní členovci patří do dvou ţivočišných tříd (klepítkatci a hmyz). Tito členovci jsou trapiči člověka i zvířat a mohou také přenášet původce různých onemocnění, které mohou končit aţ smrtí. Následující pasáţ podává přehled o začlenění hematofágních členovců do systému (Hubálek & Rudolf, 2007). Tučně jsou označené skupiny, které budou dále popsány. kmen: Členovci (Arthropoda) třída: Klepítkatci (Chelicerata) řád: Roztoči (Acarina) podřád: Klíšťata (Ixodides) čeleď: Klíšťatovití (Ixodidae) čeleď: Klíšťákovití (Argasidae) podřád: Zákoţkovci (Acariformes) čeleď: Sametkovití (Trombiculidae) čeleď: Čmelíkovití (Dermanyssidae)

14

třída: Hmyz (Insecta) řád: Vši (Anoplura) řád: Ploštice (Heteroptera) čeleď: Štěnicovití (Cimicidae) čeleď: Zákeřnicovití (Reduviidae) řád: Dvoukřídlí (Diptera) čeleď: Komárovití (Culicidae) čeleď: Flebomotové (Psychodidae) čeleď: Pakomárcovití (Ceratopogonidae) čeleď: Muchničkovití (Simuliidae) čeleď: Ovádovití (Tabanidae) čeleď: Bodalkovití (Stomoxyidae) čeleď: Glosiny (Glossinidae) čeleď: Klošovití (Hippoboscidae) řád: Blechy (Siphonaptera)

2. 1. Třída klepítkatci (Chelicerata) Klepítkatci nemají tykadla. Hlava je spojená s hrudí a tvoří hlavohruď (cephalothorax) (Hubálek & Rudolf, 2007). Dále se u nich vyskytují 2 páry ústních končetin (chelicery, pedipalpy). Jednotlivé fáze mezi svlékáními se nazývají instary. Stádium larvy nebo nymfy se většinou skládá z několika instarů.

2. 1. 1. Řád roztoči (Acarina) Do řádu roztočů řadíme 300 čeledí a nejméně 30 000 druhů (McGavin, 2000). Předpokládá se však, ţe mnoho druhů čeká ještě na své objevení. Roztoči jsou nejrozšířenějším řádem pavoukovců a patří mezi ně nejrozmanitější a nejškodlivější členovci. Někteří z roztočů jsou i cizopasníci a napadají člověka, zvířata i rostliny. Mnohé druhy jsou i dravé a poţírají jiné roztoče.

15

Četné druhy jsou menší neţ 1 mm, takţe je ani nevnímáme. Pouze samičky některých druhů mohou přesáhnout délku 1 cm (Hubálek & Rudolf, 2007). Jsou to samičky tropických druhů nebo samičky klíštěte po nasátí krví. Jejich trup není zřetelně rozlišen na hlavohruď a zadeček. Ovšem i zde jsou viditelné náznaky článkovaného těla (častý šev mezi druhým a třetím párem nohou). První pár končetin (chelicery) se nachází u úst a končí často klepítky, ale mohou být přizpůsobeny k bodání a sání (McGavin, 2000). Po stranách trupu mají 4 páry nohou. Larvy, které se líhnou z vajíček, mají pouze 3 páry nohou. Svůj vývoj uskutečňují proměnou dokonalou (Hubálek & Rudolf, 2007). U roztočů se budeme dále zabývat pouze podřádem klíšťata (Ixodides), do něhoţ patří námi studovaný druh klíštěte obecného. Tento podřád je rozdělen na tři čeledi: Argasidae, Ixodidae a Nuttalliellidae (Klompen a kol., 1996, Hubálek & Rudolf, 2007). Čeleď Nuttalliellidae Tato čeleď má pouze jediného zástupce a to druh Nuttalliella namaqua (Oliver, 1989). Ţivotní cyklus se podobá jak čeledi Argasidae, tak i Ixodidae a můţe být povaţován za vývojový mezistupeň těchto čeledí. O Nuttalliellidae není známo mnoho informací. Nymfy a samice se pravděpodobně ţiví na holubech, kuřatech, myších, krysách, křečcích a králících.

Obr. 1: Nuttalliella namaqua (URL 1)

Obr. 2: Nuttalliella namaqua (URL 2)

Klíšťatovití (Ixodidae) Tato čeleď zahrnuje asi 650 druhů (McGavin, 2000). Jde o ploché roztoče s velmi tvrdým povrchem těla. Hřbet je kryt destičkou, která je u samečků přirostlá a pokrývá celé tělo. Samičky a nedospělí jedinci mají štítek pouze na přední polovině těla. Zadeček je měkký 16

a pruţný a pojme obrovské mnoţství krve. Zbarvení kolísá od ţluté přes červenou aţ po červenohnědou. Vývoj jde od vajíčka přes larvu, nymfu aţ po dospělce (Oliver, 1989). Samičky se krmí pouze jednou a mohou sát několik dní aţ týdnů. Po nasátí se vytvoří velké mnoţství vajíček a po snůšce samička umírá. Samečci potravu nepřijímají vůbec. Vývoj obvykle trvá 3 roky (Hubálek & Rudolf, 2007). Z vajíček se vylíhnou šestinohé larvy, které šplhají po trávě a čekají na hostitele, kterým můţe být drobný hlodavec, pták nebo ještěrka (McGavin, 2000). Larva se krmí po několik dní, opouští hostitele a svléká se. Vzniká z ní nymfa, která má jiţ osm nohou. Ixodidae mají pouze jedno stádium nymfy. Hostitelem nymf bývají jiţ větší savci, jako jsou jeleni, psi a skot. Po odpadnutí se nymfa znovu svléká a stává se z ní dospělec. Na člověku mohou sát všechna stádia. Vývojový cyklus můţe probíhat na jednom nebo více hostitelích. Ixodes ricinus má trojhostitelský cyklus, z čehoţ vyplývá, ţe kaţdé stádium se krmí na jiném jedinci. Toto střídání hostitelů má epizootologický (infekčnost nemocí u zvířat) a epidemiologický význam. V České republice je nejčastějším zástupcem klíště obecné (Ixodes ricinus), ale můţeme nalézt i klíště jeţčí (Ixodes hexagonus) a klíště myší (Ixodes trianguliceps). Ixodes ricinus je lesklý černohnědý roztoč, jehoţ hladová samička měří okolo 4 mm (Wall & Shearer, 2001). Pomocí klepítek naruší kůţi hostitele a do ranky vsune hypostom opatřený zpětnými háčky (Nuttall a kol., 2000). Kdyţ se pevně zachytí, vypouští sliny obsahující látky tlumící bolest, zvyšují přívod krve a sniţují její sráţlivost. Napitá samička můţe svojí váhu zvýšit aţ dvěstěkrát. Dospělý sameček krev nepije a vůbec nepřijímá potravu. Rozšíření tohoto druhu zahrnuje téměř celou Evropu a část severní Afriky (Hubálek & Rudolf, 2007). Ixodes ricinus obývá převáţně smíšené a listnaté lesy. Zástupci tohoto druhu byli nalezeni i ve vysokých nadmořských výškách (aţ 1350 m. n. m.). První klíšťata začínají být aktivní v březnu – dubnu a jejich výskyt vrcholí v květnu. Poslední jedince můţeme najít dokonce aţ v říjnu – listopadu. Larvy sají na drobných savcích jako je myšice nebo norník. Nymfy dávají přednost veverkám, jeţkům a zajícům. Samice sají zejména na divoké i domácí zvěři. Ale i larvy a nymfy můţeme nalézt na vysoké zvěři. Člověka napadají všechna stádia, i kdyţ larvy vzácně. Sající nymfy jsou na člověku nalézány nejčastěji.

17

Obr. 3: Vývojová stádia klíštěte obecného (URL 3) Zejména klíště obecné, ale i jiní zástupci klíšťatovitých, jsou přenašeči mnoha chorob, které jsou nebezpečné nejen pro člověka, ale i ostatní savce (Service, 2001). Mezi taková onemocnění patří: 

Babesióza - původcem je prvok rodu Babesia, v Evropě nejčastěji Babesia divergens, která se přenáší na člověka. Jedná se o drobné parazity erytrocytů obratlovců s konečným vývojem u klíšťat (Hubálek & Rudolf, 2007). Babesióza se svými příznaky podobá malárii (Service, 2001). Projevuje se horečkou, únavou, hemolytickou anémií, která trvá několik dní nebo i pár měsíců (Goddard, 2000). Babesiózou mohou trpět i domácí zvířata, jako je skot (Babesia bovis), ovce a koza (Babesia motasi), kůň (Babesia caballi) nebo pes (Babesia canis) (Service, 2001).

Obr. 4: Babesia uvnitř erytrocytů (URL 4)

18



Bartonellóza – způsobují ji bakterie rodu Bartonella (Service, 2001). Pro člověka je nebezpečná např. Bartonella bacilliformis, která způsobuje oroyskou horečku. Jde o akutní formu anemie (Hubálek & Rudolf, 2007). Bez léčby je letalita 10 – 40 %. Verruga peruana – pupencová aţ bradavičnatá koţní forma, má letalitu niţší neţ oroyská horečka. Příznaky jsou horečka, bolest očí a zad, malátnost, nevolnost a zduření uzlin (Service, 2001).

Obr. 5: Bartonella bacilliformis (URL 5) 

Ehrlichióza a anaplazmóza - původcem jsou bakterie čeledi Anaplasmataceae. Postiţeni jsou lidé i zvířata. Člověka napadá zejména Ehrlichia chaffeensis (způsobuje lidskou monocytární ehrlichiózu – HME). HME se projevuje horečkou, zimnicí, bolesti kloubů, svalů a hlavy, nevolností, nechutenstvím, průjmem, zvracením a vyráţkou (Hubálek & Rudolf, 2007). Letalita 1-5 %. Anaplasma

phagocytophylum

je

zodpovědná

za

lidskou

granulocytární

anaplazmózu - HGE (Goddard, 2000). Projevy HGE jsou opět horečka, bolesti hlavy, svalů i kloubů, nechutenství, leukopenie, trombocytopenie, zvýšené transaminázy (Hubálek & Rudolf, 2007), deprese, anorexie (Service, 2001). Letalita se pohybuje okolo 5-10 % (Hubálek & Rudolf, 2007). Anaplasma phygocytophylum mimo člověka napadá i skot, ovce a vysokou zvěř (Goddard, 2000). Další zástupce čeledi Anaplasma marginale napadá skot, Ehrlichia equi koně.

19

Obr. 6: Erlichia uvnitř leukocytů (URL 6) 

Klíšťová encefalitida – je způsobena RNA virem rodu Flavivirus (Service, 2001). Klíšťová encefalitida je velice rozšířená nejen v Evropě, ale i v Asii. Přenašečem nemusí být pouze klíště (v našich podmínkách Ixodes ricinus), ale jsou známy i případy přenosu ze špatně tepelně upraveného mléka. Pokud je přenašečem klíště, onemocnění přenáší všechna stádia. Klíšťová encefalitida můţe postihnout i zvířata. Rezervoáry jsou také hlodavci, ptáci a savci (i domestikované kozy a ovce) (Provazník a kol., 1996). Nemoc se projevuje dvěma fázemi (Service, 2001). První fáze má příznaky chřipky s teplotou okolo 38 °C a trvá asi 3 – 14 dní. Dále ji provází bolesti hlavy, malátnost, gastrointestinální potíţe. Druhá fáze postihuje nervovou soustavu, má formu meningitickou (výrazné bolesti hlavy, konjunktivitida, světloplachost), encefalitickou (poškození mozkové kůry – poruchy spánku, paměti, koncentrace, orientace), encefalomyelitickou (poškození předních

míšních

rohů,

tvoří

se

obrny,

zejména

pletence

paţního)

a bulbocervikální (nejzávaţnější forma, postihuje většinou osoby nad 60 let, selhání důleţitých center v prodlouţené míše) (Provazník a kol., 1996). Není přenosná z člověka na člověka.

Obr. 7: Virus klíšťové encefalitidy (URL 7)

Obr. 8: Přenos encefalitidy ve vývojovém cyklu klíštěte (URL 8)

20



Lymeská borrelióza – původcem je spirochéta Borrelia burgdorferi sensu lato (Service, 2001). Borrelia napadá nejen člověka, ale i ostatní zvířata, na kterých klíšťata sají. Nemoc je přenášena všemi vývojovými stádii klíštěte (Provazník a kol., 1996). Nejdříve se borrelióza projevuje jako obyčejná chřipka doprovázená bolestí hlavy, svalovou bolestí, malátností a nízkými horečkami (Goddard, 2000). Příznakem je i bezbolestná skvrna zvaná erythema migrans (EM). Po několika týdnech se mohou vyskytovat postiţení nervového (strnutí šíje, porucha citlivosti, hybnosti, obrna, bolesti v zádech i v končetinách), kloubního (lymeská artritida – stěhovavé bolesti kloubů, které se vracejí, záněty šlach, úponů vazů, kloubních pouzder a svalů) nebo kardiovaskulárního původu (projevuje se dušnost, která připomíná infarkt) (Provazník a kol., 1996). Mohou se vyskytovat i oční obtíţe, které jsou velmi různorodé (konjunktivitida, episkleritida, edém víček).

Jako

rezervoáry borrelií se mohou vyskytovat i malí savci nebo ptáci (Service, 2001). Dokonce více neţ 100 druhů zvířat mohou být rezervoáry. Přímý přenos z člověka na člověka nebyl prokázán (Provazník a kol., 1996).

Obr 9: Erythema migrans (URL 9) Obr: 10, 11: Borrelia (Foto V. Nesnídalová) 

Q - horečka (query horečka) – je zoonóza, která se, kromě Nového Zélandu, nachází po celém světě (Service, 2001). Původcem je bakterie Coxiella burnetii. Nemoc má akutní a chronickou formu, kdy akutní je častější. Q – horečka bývá asymptomatická. Pokud se symptomy projeví, vyskytuje se horečka, únava, zimnice, svalová únava, pocení a kašel. Dále se vyskytují perikarditidy, myokarditidy a meningoencefalitidy. Letalita je okolo 1 % (Hubálek & Rudolf, 2007). Ze zvířat jsou ohroţeni zajíci, losi, mývali, ptáci, lišky, vysoká zvěř a jiná volně ţijící i domestikovaná zvířata včetně psů (Service, 2001).

21

Obr. 12: Coxiella burnetii (URL 10) 

Rickettsióza – Rickettsiae jsou malé gram negativní kokobacily (Service, 2001). Parazitují intracelulárně (v jádře nebo cytoplazmě buněk endotelu nebo leukocytů) (Hubálek & Rudolf, 2007). Mnoţí se příčným dělením. Jsou patogenní pro člověka i zvířata (Service, 2001). Většina zvířecích rickettsií není přenosná na člověka (Rickettsia rhipicephali, Rickettsia mossiliae, Rickettsia montana, Rickettsia parkeri, Rickettsia heilongjanji, Rickettsia belli). Rickettsia helvetica, Rickettsia mongolotimonae, Rickettsia slovaca, Rickettsia honei, Rickettsia africae a Rickettsia felis mohou vzácně infikovat člověka. Rickettsia prowazekii způsobuje epidemický skvrnitý tyfus (více o něm v podkapitole o vších), další rickettsie způsobují např. horskou, brazilskou nebo japonskou horečku.

Obr 13: Rickettsia prowazekii (URL 11) 

Tularémie – způsobuje jí bakterie Francisella tularensis. Jsou to bakterie kulovité aţ ovoidní, gramnegativní, fakultativně intracelulární (Hubálek & Rudolf, 2007). Ohroţeni jsou lidé i zvířata (Service, 2001). Je nazývaná také jako králičí horečka nebo tzv. deer fly fever (Goddard, 2000). Příznaky jsou různé. Můţe se vyskytovat náhlá horečka, bolest hlavy, zimnice, kašel, bolest svalů a zvracení (Service, 2001). Vyskytují se i hnisavé vředy. Bakterie se do těla můţe dostat nejen přes přenašeče, ale i zaţívacím a dýchacím traktem. Nákaza není přímo přenosná z člověka na člověka (Provazník a kol., 1996). 22

Obr. 14: Francisella tularensis (URL 12) Ixodes hexagonus je rozšířen v Evropě i v částech severní Afriky (Hubálek & Rudolf, 2007). Hlavními hostiteli, jak název napovídá, jsou jeţci a dále také šelmy (kunovité i psovité). Byl zjištěn jako přenašeč Borrelia burgdorferi v Německu. Ixodes trianguliceps se vyskytuje v Evropě (Bown, 2008). Jeho hostiteli jsou drobní hlodavci, člověka nenapadá. Můţe se stát ale přenašečem patogenů jako je např. anaplasma phagocytophilum. Klíšťákovití (Argasidae) Čeleď zahrnuje asi 150 druhů (McGavin, 2000). Tito členovci mají kulaté bobulovité tělo, které můţe být z hřbetní strany zploštělé. Pokoţka je tuhá, koţovitá a zvrásněná nebo poskládaná. Chelicery jsou přizpůsobeny k proříznutí kůţe hostitele. Hostitelé jsou většinou savci, včetně netopýrů, ale i ptáci a hadi. Argasidae se dělí na tři rody: Argas, Ornithodoros a Otobius (Klompen a kol. 1996). U kaţdého rodu se najdou druhy, které parazitují i na člověku. Ţivotní cyklus je rozdělen na stádia vajíčka, larvy, několika nymf a dospělce (Oliver, 1989). Všechna stádia sají na různých hostitelích po dobu několika minut aţ hodin. U čeledi Argasidae sají krev obě pohlaví dospělce. Většinou po nasátí kladou samičky velké počty vajíček a to několikrát za ţivot a u samců se spouští tvorba spermií. Vajíčka kladou do hnízd nebo nor svých hostitelů. Nymfy a dospělci ţijí společně na zvířatech. Jsou dlouhověcí (zvláště rod Ornithodoros – aţ 25 let) a vydrţí hladovět aţ 11 let (Hubálek & Rudolf, 2007). Můţou přenášet rozmanité choroby na zvířata, ale i člověka (např. Q – horečka). V ČR ţije pouze rod Argas. Klíšťák zhoubný (Argas persicus) se u nás nachází jen sporadicky a to u hranic se Slovenskem (Čihař, 2002). Nasátý dospělý klíšťák můţe hladovět aţ deset let a čekat na 23

nového hostitele. Zevní podobou připomíná klíště, ale jeho tělo je měkké, koţovité a jeho ústní ústrojí není vidět z pohledu ze shora, protoţe se nachází blíţe spodní straně těla. Klíšťák holubí (Argas reflexus) je v ČR hojný a jak název poukazuje, nejčastěji jej najdeme v holubích hnízdech, v kurnících, ale i ve starých věţí a podkrovních bytech. Barvou i velikostí 11 mm se velmi podobá klíšťáku zhoubnému. Krmí se na holubech, drůbeţi, ale příleţitostně napadá i člověka. Samička je mnohem větší neţ samec. Klíšťák obecný (Argas vulgaris) můţe být nalezen i na Moravě a Slovensku, přestoţe je rozšířen v jiţní Euroasii (Hubálek & Rudolf, 2007). Hostitelé jsou ptáci a to zejména vrabci, špačci, holubi a havrani. Ale napadnout můţe i člověka.

Obr. 15: Klíšťák holubí (URL 13)

2. 2. Třída hmyz (Insecta) Pro úplnost chceme stručně zmínit i další hematofágní hmyz, který, stejně jako námi studovaný roztoč, patří mezi obtěţující krevsající ektoparazity a přenašeče nemocí s významným medicínským a socioekonomickým dopadem. Do této třídy patří členovci, kteří mají tělo kryto pevnou kutikulou, na kterou se upínají svaly (Hubálek & Rudolf, 2007). Tělo je rozlišeno na hlavu, hruď a zadeček. Některé druhy jsou vţdy bezkřídlé (blechy, vši), některé mohou mít křídla zakrnělá nebo zkrácená

(McGavin, 2000). Hmyz se vyvíjí metamorfózou (Hubálek & Rudolf, 2007). U hmyzu se vyskytují dva typy vývoje, a to proměna dokonalá (larva, kukla, imago) a proměna nedokonalá (chybí stádium kukly. Nymfa se několikrát svléká, aţ se změní v dospělce). 24

2. 2. 1. Řád blechy (Siphonaptera) Do tohoto řádu patří asi 18 čeledí a okolo 2 000 druhů blech (McGavin, 2000). Nohy jsou dobře vyvinuté ke skákání, ale jsou uzpůsobeny i k běhání (Hubálek & Rudolf, 2007). Ústní ústrojí je přizpůsobené k sání krve (McGavin, 2000). Druhy, které tráví celý ţivot např. v hnízdě svého hostitele, jsou mohutnější, oči mohou mít zakrnělé a jejich schopnost skákat můţe být omezená (Hubálek & Rudolf, 2007). Druhy, které ţijí na hostitelích s hustou srstí, jsou štíhlejší a oči jsou dobře vyvinuty. Blecha morová (Xenopsylla cheopis) je hlavním přenašečem moru, který se můţe objevit i v ČR. Mor je způsobený bakterií Yersinia pestis, která je nebezpečná pro lidi i zvířata (Service, 2001). Nejčastější forma je bubonická. Příznaky jsou horečka, zimnice. Později se vytvoří zvětšená lymfatická uzlina (bubo) v tříslech, na krku nebo v podpaţdí. U většiny pacientů se vytvoří i koţní léze. Méně častá je plicní forma, která se projevuje horečkou, kašlem a krvavými hleny. Je vysoce přenosná na ostatní osoby a má vysokou mortalitu (Provazník a kol., 1996).

Obr. 16: Blecha psí (URL 14)

Obr. 17: Yersinia pestis (URL 15)

2. 2. 2. Čeleď štěnicovití (Cimicidae) Štěnicovití patří do řádu Ploštice (Heteroptera) (McGavin, 2000). Tato čeleďmá asi 90 druhů. Štěnice jsou oválný bezkřídlý hmyz. Tykadly ohledávají pokoţku a hledají cévy. Po vbodnutí vypouštějí do rány protisráţlivé sliny. Někteří lidé jsou na bodnutí citliví a tvoří se u nich růţově zbarvené pupeny (urticaria cimicima), kdeţto jiní bodnutí vůbec nevnímají. Štěnice jsou nositeli původců různých onemocnění, ale nejspíše jen v subtropických a tropických oblastech mohou příleţitostně nakazit člověka. 25

Štěnice domácí je nejznámější druh tohoto řádu (McGavin, 2000).

Svého hostitele

vyhledává pomocí tepla, které vydává. Parazituje na člověku i teplokrevných zvířatech (Čihař, 2002).

Obr. 18: Štěnice domácí (URL 16)

2. 2. 3. Řád vši (Phthiraptera) Jde o bezkřídlé ektoparazity se zploštělým tělem, kteří ţijí trvale na těle hostitelů (McGavin, 2000). Specializují se i na ţivot jen na některých částech těla, takţe na jednom hostiteli můţe být i více druhů. Vajíčka samice lepí blízko sebe na chlupy nebo tkaniny. Z těch se vylíhnou larvy, které hned sají krev. Veš šatní (Pediculus humanus corporis) je hlavním přenašečem skvrnitého tyfu, návratné horečky a volyňské horečky (Provazník a kol., 1996). Skvrnitý tyfus se projevuje zimnicí, třesavkou, bolestmi hlavy a celého těla. Také se objevuje vyráţka (zpočátku na hrudníku, později postupuje na končetiny). Nikdy není na obličeji, dlaních a chodidlech. Vyráţka později mizí, ale často se tvoří tmavé skvrny. Onemocnění není přímo přenosné z člověka na člověka. U neléčených osob je letalita 10 – 50 % (Hubálek & Rudolf, 2007). Recidiva můţe nastat i po 10 – 20 letech.

Obr. 19: Veš dětská (URL 17)

Obr. 20: Infekce skvrnitého tyfu na lidské noze (URL18) 26

2. 2. 4. Čeleď komárovití (Culicidae) Tato čeleď má asi 1 300 druhů, z toho v ČR ţije asi 40 (McGavin, 2000). Komárovití patří do řádu dvoukřídlých (Diptera). Samičky mnoha komárů přenášejí původce různých onemocnění, kteří jsou nebezpeční pro ţivočichy i člověka. Jedná se např. o malárii, ţlutou zimnici, horečku dengue, filariózu a encefalitidu. Anofeles čtyřskvrnný (Anopheles meculipennis) je známým přenašečem malárie v Evropě (Čihař, 2002). Malárie zabijí ročně miliony lidí na téměř celém světě, zejména dětí (Goddard, 2000). Původcem malárie je prvok rodu Plasmodium (Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale, Plasmodium vivax) (Service, 2001). Nejnebezpečnější je Plasmodium falciparum, které má na svědomí nejvíce pacientů. Ostatní tři plasmodia neohroţují postiţeného bezprostředně na ţivotě (Provazník a kol., 1996). Projevuje se horečkou, zimnicí, pocením, bolestí hlavy a svalů a malátností (Goddard, 2000). U Plasmodium falciparum se ke všemu přidává kašel, průjem, poruchy koagulace, šok, jaterní a ledvinové selhání, encefalopatie, plicní a mozkový edém a kóma (Provazník a kol., 1996). V ČR se naštěstí malárie povaţuje za vzácnou. Od roku 1990 – 2000 bylo touto nemocí nakaţeno průměrně 14 lidí ročně (Hubálek & Rudolf, 2007).

Obr. 21: Komár pisklavý (URL 19)

Obr. 22: Červené krvinky napadené prvokem rodu Plasmodium (URL 20)

Některé studie dnes naznačují, ţe komáři mohou být vektory i lymeské borreliózy (KosikBogacka a kol., 2007). Autoři uvádějí, ţe komáři mohou hrát roli v přenosu lymeské borreliózy, ale riziko je menší neţ u klíšťat. Pouze 1,3 % z 639 komárů bylo nakaţeno. I v ČR byl prováděn výzkum na pozitivitu bakterií Borrelia burgdorferi (Nejedlá a kol., 2009). Výzkum probíhal po čtyři roky v Blansku. Za tuto dobu bylo vyšetřeno metodou zástinové 27

mikroskopie a PCR (polymerase chain reaction) 1 179 larev komárů. Pozitivních na spirochéty bylo 25,4 %, ale pouze 0,3 % z celkového počtu bylo pozitivních na Borrelia burgdorferi sensu lato. Larvy komárů jsou tedy častěji napadeny těmito spirochétami neţ dospělci.

2. 2. 5. Čeleď ovádovití (Tabanidae) I tato čeleď patří do řádu dvoukřídlých (Diptera) (McGavin, 2000). V ČR ţije asi 63 druhů této čeledi. Napadají člověka i zvířata. Přenáší zejména tularémii (viz podkapitola o klíšťatech) a antrax (Provazník a kol., 1996). Původcem antraxu je Bacillus anthraxis. Jedná se o aerobní nepohyblivou grampozitivní tyčinku (Hubálek & Rudolf, 2007). Postihuje kůţi, dolní dýchací cesty i trávicí trakt (Provazník a kol., 1996). Prvním příznakem je svědění v místě poranění. Tvoří se léze, ohraničené edémem a někdy také malými sekundárními vřídky. U plicní formy selhává respirační systém, vyvíjí se horečka, šok a pacient do 24 hodin umírá. Střevní forma je doprovázená zvracením, nauzeou, horečkou a prudkými bolestmi břicha doprovázenými krvavými průjmy.

Obr. 23: Ovád bzučivý (URL 21)

Obr. 24: Koţní projev antraxu (URL 22)

28

3. Interakce klíšťat Klíšťata jsou velmi starými ţivočichy na naší planetě. Jejich vznik se odhaduje na rozhraní prvohor a druhohor (asi před 225 milióny let) (Klompen a kol.,1996). Nejspíše jiţ existovala tři vývojová stádia (Oliver, 1989). Klíšťata se postupem času adaptovala na různé hostitele. V době křídy došlo k adaptaci na krevsající členovce plazů a postupně se začali orientovat i na ptáky a savce (Mans & Neitz, 2003). Došlo téţ k rozdělení klíšťat na dva druhy a to na Argasidae a Ixodidae (Klompen a kol. 1996). V permu došlo k dělení na prostriata (pouze Ixodes – mají pohlavní ţlázy před řitním otvorem) a metastriata (ostatní klíšťata – pohlavní ţlázy za řitním otvorem). Z tohoto vyplývá, ţe klíšťata se nevyvinula pro hostitele, ale postupem času se na ně adaptovala. Některé druhy jsou tak specifické, ţe se mohou krmit pouze na jednom druhu hostitele. Předchůdci klíšťat se ţivili nejspíše lymfatickými tekutinami a to nejen na obratlovcích, ale i bezobratlých (Mans & Neitz, 2003). V následujících pasáţích bude pojednáno o různých typech interakcí klíšťat, jak vnitrodruhových, tak mezidruhových. Interakce v rámci druhu jsou důleţité zejména k vyhledání a spáření se s partnerem. Ale upevňují i vztahy, a to mezidruhové i mimodruhové. Pro přeţití je nutné vyhledání hostitele a narušení jeho obranných mechanismů. Třetí důleţitá interakce je mezi klíštětem a patogenem a přenos patogenů dále. Dle zadání práce bude důraz kladen na vzájemné ovlivňování hostitele (člověka) a klíštěte.

Obr. 25: Interakce mezi patogenem přenášeným klíšťaty, klíštětem a hostitelem (podle Nuttall, 2000).

29

3. 1. Vnitrodruhové interakce klíšťat U klíšťat se vyskytují semiochemické látky (látky vyuţívané v chemické komunikaci, kromě čichu zprostředkované také chutí) (Sonenshine, 2004). Mezi ně patří feromony (slouţí ke vnitrodruhové komunikaci), allomony (obranné sekrety) a kairomony (identifikace hostitele). V interakcích ţivočichů se obecně uplatňuje mnoţství vizuálních, dotykových, chemických a zvukových signálů. V rámci tématu se zaměříme na komunikaci prostřednictvím infochemikálií, neboť u klíšťat hrají dominantní úlohu.

3. 1. 1. Feromony Klíštěcí

feromony

jsou

trojího

typu:

,,shromaţďovací

feromony“

(arrestment

pheromones), ,,přitahovací feromony“ (attraction – aggregation – attachment , neboli AAA pheromones) a pohlavní feromony. ,,Shromaţďovací feromony“ (arrestment pheromones) – tyto feromony slouţí ke shromaţďování klíšťat na jednom místě (Oliver, 1989). Reagují na ně všechna stádia jednoho druhu. Mohou na ně reagovat ale i jiné druhy a mohly by slouţit ke značení teritoria. Umoţňují páření bez sloţitého hledání partnera (Sonenshine, 2004). Jsou rozeznávány z výkalů. Reagují na ně i nymfy a larvy a to zejména proto, ţe vedou k ostatním jedincům. Čím více jedinců se nachází na jednom místě, tím zde jsou méně stresující podmínky a dostatek hostitelů. Důleţitou látkou je zde guanin a ostatní puriny (např. xantin a hypoxantin), ale také močovina a amoniak. Směs těchto látek je mnohem účinnější neţ jednotlivé komponenty. AAA feromony – jsou důleţité pro nalezení hostitele (Oliver, 1989). Vylučují jej klíšťata, která se jiţ na daném hostiteli krmí. AAA mají pouze druhy klíšťat, u kterých samečci sají krev a ti tyto látky vylučují (Sonenshine, 2004). Působí na obě pohlaví. Nejedná se tedy o pohlavní feromon, který působí pouze na jedno pohlaví. Pohlavní feromony – jedná se o feromony vylučované krmícími se samičkami (Oliver, 1989). Jsou velice důleţité, aby nedocházelo k mezidruhovému kříţení (Sonenshine, 2004). Dělíme je na ASP – atraktantní pohlavní feromony (attractant sex pheromone), MSP -

30

,,upevňovací“ pohlavní feromony (mounting sex pheromone), GSP – genitální pohlavní feromony (genital sex pheromone). ASP – patří sem nejznámější feromon a to 2,6 – dichlórfenol. Vylučují je samičky krmících se samečků. Nekrmící samečci na ně nereagují. Samečci po detekci ASP se přestávají krmit a vyhledávají samičku. MSP – opět produkován krmícími se samičkami. Láká k nim samečky a stimuluje je k páření. Velkou roli zde hraje cholesterol a jeho estery. GSP – stimulují syntézu spermatoforů a následné páření. Obsahují nasycené mastné kyseliny, steroidy a 20 – hydroxyecdyson. Samci reagují vloţením chelicer do pochvy a přenosem spermií. Pohlavní feromony nebyly u rodu Ixodes identifikovány. Byly popsány pouze látky na bázi fenolů, cholesterolů a jejich derivátů, ale neví se, zda jsou pouţívány jako pohlavní feromony. Klíšťata vnímají semiochemické látky pomocí smyslových orgánů. Kromě setiformních senzil (vlasům podobné štětiny) na nohou a na těle (fungují jako mechanosenzily) mají také plno specializovaných chemosenzorických senzil. Ty jsou dvojího typu – čichové a chuťové senzily (viz obrázek 26, 27, 28). Klíšťata roztahují přední nohy jako tykadla a aktivně jimi prozkoumávají prostředí nebo reagují na podněty. Čichová senzila se nachází na předních nohách a detekuje pachy. Senzily ústí do lymfatických dutin, kde jsou pachy předány dendritům nervových buněk a tvoří se nervové impulzy. Chuťová senzila je tvořena jedním párem, nachází se na přední noze a zachycuje feromony samiček. Můţe se nacházet i na palpech nebo chelicerách a reaguje na změny koncentrace NaCl, ATP a glutationu.

Obr. 26: Umístění čichové senzily na noze klíštěte. Ap1 – čichová senzila, Ap – přední jamka, Pc – zadní kapsule (Soneshine, 2004).

31

Obr. 27: Velká čichová senzila. Ap – přední jamka, Ap1 – čichová senzila (Soneshine, 2004).

Obr. 28: Chuťová senzila. AT – apotele (nejvzdálenější část nohy od středu těla), DP – dorzální párové zuby senzily, MP – boční párové zuby senzily, VP – ventrální párové zuby senzily (Soneshine, 2004).

3. 2. Interakce klíště – hostitel Hostitel je druh obratlovce, ve kterém bylo detekováno dotyčné agens nebo z něj izolováno (Hubálek & Rudolf, 2007). Za rezervoár je povaţován ten hostitel, který zabezpečuje dlouhodobé přeţívání agens. Pokud se hostitel stává zdrojem nákazy pro dalšího obratlovce, mluvíme o něm jako o donoru a nový postiţený hostitel je recipientem. Autoři rozlišují u hostitelů podřazené kategorie. Hostitel primární zajišťuje cirkulaci agens, hostitel sekundární neboli vedlejší přispívá do epizootického procesu. Hostitel nahodilý nebo příleţitostný nehraje ţádnou roli v epizootickém procesu. Pro patogena je velice důleţitý hostitel amplifikátor. Ten umoţňuje pomnoţení agens, které se pak vyskytují ve vysoké koncentraci v jeho trusu, moči a krvi a můţe se tedy stát i donorem nákazy pro člověka. A to

32

buď kontaktem, nebo vektorem, který se nakazí sáním. Kompetentní hostitel je ten druh obratlovce, u něhoţ byla prokázána schopnost agens pomnoţovat a předávat. Klíšťata ve slinách nemají pouze molekuly, které narušují obranný systém hostitele, ale i různé toxiny (Mans & Neitz, 2003). Tyto toxiny mohou způsobit paralýzu, anafylaxi nebo srdeční selhání. Vliv na srdce má např. toxin TSGP2 a TSGP4. Klíšťata jsou schopna přeţít delší dobu bez hostitele. Tato adaptace jim umoţnila být více agresivními a lépe přeţívat jako druh, neţ ektoparazité, kteří jsou závislí na svých hostitelích. V klíšťatech se toxiny ale hromadí a mohou být pro hostitele velice nebezpečné. Klíšťata mohou přenášet i velké mnoţství parazitů, kterým vyhovuje dlouhá doba sání a jejich přenos usnadňuje i přijímání krevní potravy.

3. 2. 1. Výskyt klíšťat a vyhledávání hostitele Klíšťata jsou roztoči specializovaní na sání krve na obratlovcích (Hubálek & Rudolf, 2007). Ţiví se zejména na savcích. Napadáni jsou primáti, vačnatci, hmyzoţravci, letouni, šelmy, chudozubí, chobotnatci, damani, hlodavci, zajíci, lichokopytníci i sudokopytníci. Napadají ale i ptáky a plazi. V našich podmínkách se klíšťata vyskytují v biotopech lesů, křovin, pastvin, v městských parcích a zahradách. Pravidelný výskyt je samozřejmě vázán na mnoţství hostitelů. Klíšťata číhají na hostitele na vegetaci v různé výšce, a to podle vývojového stádia. Larvy a nymfy se ukrývají v trávě. Dospělci na keřích, vyšších travinách nebo bylinách a to aţ do výšky 1 m. Většinu svého času klíšťata tráví na zemi, protoţe pro přeţití potřebují vlhké prostředí a jejich malé tělo je náchylné k větším ztrátám vody (Subak, 2002). Začátkem jara dochází k oteplování okolního prostředí. Se vzrůstající teplotou roste i počet aktivnějších klíšťat. Na vrcholu aktivity jsou asi v květnu aţ v červnu, kdy teplota je vysoká a podnebí dostatečně vlhké. V letních měsících se klima mění na sušší a vzduch je horký (Randolph & Storey, 1999). Pro klíšťata nastávají těţké časy, které jim mohou způsobit i smrt dehydratací nebo vyčerpáním energetických zásob. Larvy v horkých letních dnech upadají do stavu strnulosti a klidu, kdy hostitele téměř nevyhledávají. Zdrţují se pod nízkou vegetací, kde se drţí vlhkost. Nymfy jsou nejvíce náchylné k vypařování vody. Při hledání hostitele jej můţou i stopovat a to vede k obrovským ztrátám energie i vody, protoţe více dýchají. Pokud hostitele najdou a začnou se krmit, přestávají regulovat příjem a vypařování vody, které pro ně můţe

33

být nebezpečné (Subak, 2002). Pro dospělce není vlhkost tolik důleţitá, jsou větší, více odolní a mají dostatečné zásoby vody i energie z krve (Norte a kol., 2012). Svého hostitele musí klíšťata nejprve najít (Sonenshine, 2004). Pouţívají k tomu látky zvané kairomony. Slouţí k rozpoznání hostitele a nalezení nejlepšího místa pro krmení na jeho těle. Nejvíce klíšťat se nachází na končetinách a hlavě hostitelů (Ogden a kol., 1998). Dospělce můţeme nejčastěji nalézt na proximální straně končetin (blíţe ke krku a hlavě), krku a uších. Larvy se vyskytují zejména na končetinách a rostrální (směřující k nosu) oblasti hlavy. Nymfy sají mezi larvami a dospělci a také v podpaţdí a tříslech, kde je kůţe tenká a cévy blízko pod epidermis. Nejméně klíšťat se nachází na trupu hostitele, protoţe je zde velké riziko odstranění roztoče. Pokud se i zde klíšťata objeví, jedná se většinou o dospělce. Mnoho klíšťat se nachází na vlhkých místech těla, jako jsou uši, oči a nozdry. Klíšťata se krmí zejména v noci, kdy hostitel spí, nebo přes den, kdy odpočívá a nehrozí tedy riziko odstranění roztoče (Oliver, 1989). U nočních druhů (jako jsou např. kuna nebo jeţek) je to obráceně. Své hostitele také opouštějí nejčastěji v norách, v hnízdech nebo jiných krytých místech, kde je vyšší pravděpodobnost na nalezení nového hostitele. Klíštěcí krmící perioda se tedy řídí aktivitou hostitele, poklesem teploty a fotoperiodou. Kairomony jsou vylučovány hostitelem (Sonenshine, 2004). Jedná se např. o CO2 z dechu nebo NH3 z kůţe a také kyselinu mléčnou. Klíšťata mohou také stopovat svého hostitele i pomocí látek, které zůstanou zachyceny na vegetaci. Ixodes ricinus má více hostitelů a pomocí kairomonů si můţe vybírat ty ,,oblíbené“. Napadení hostitele můţeme být druhově specifické (Tälleklint & Jaenson, 1997). Například bylo prokázáno, ţe myšice jsou častěji parazitovány klíšťaty neţ norníci. Rozdíly mohou být ale i v rámci jednoho druhu. Záleţí na věku (starší jedinci jsou více napadeni, protoţe nemají uţ tak účinný obranný systém), pohlaví (samci některých druhů hlodavců jsou napadáni častěji neţ samice) i zamořenosti jedince roztoči díky feromonům. I u ptáků se zamořenost liší (Norte a kol., 2012). Druhy, které hnízdí na zemi, mají více klíšťat, neţ druhy hnízdící v korunách stromů.

3. 2. 1. 1. Hlavní přirozené faktory ovlivňující výběr hostitele Semiochemické látky se nacházejí i v kůţi a v dechu hostitele. Mohou to být produkty ţláz nebo vznikají metabolismem. Semiochemikálie mohou krevsající členovce jak odpuzovat, tak i přitahovat. Následující řádky uvádějí příklady, jakou úlohu hrají 34

semiochemikálie u obratlovců v obraně proti obtěţujícím členovcům a ilustrují tak úlohu těchto látek ovlivňujících chování v interakcích nejen mezi hematofágními členovci a obratlovci. Jiţ u obojţivelníků nacházíme ţlázy, jejíţ produkty je brání proti některým druhům komárů a mravenců (Clarke, 1997). Hadi vylučují sekrety z pachových ţláz z kloaky a tyto sekrety obsahují glykoproteiny a C12 – C20 mastné kyseliny (Blum a kol., 1971). Ptáci mají ţlázy v kůţi, které odrazují vosy, sršně, vši i klíšťata (Cott, 1947). Uropygiální ţláza vylučuje olej, kterým si ptáci potírají peří a chrání je proti růstu mikroorganismů i ektoparazitům (Poulsen, 1994). Savci mají také ţlázy v kůţi, které vylučují maz s odpudivými molekulami pro ektoparazity (Gikonyo, 2000). Jako ostatní obratlovci i člověk má semiochemické látky, které mohou odpuzovat i přitahovat krevsající členovce. Interakce člověk – hematofágní parazit (klíště, komár) nejvíce ovlivňuje sloţení vydechovaného vzduchu a také kůţe a její produkty. Zda jsou aktivní sloţky dechu nebo kůţe atraktanty, nebo odpuzují, často záleţí na koncentraci látky a přítomnosti dalších látek. Přesný seznam látek, které přitahují klíšťata, je zatím neznámý (Sonenshine, 2004) V lidském dechu by mohl být největším atraktantem CO2, za odpuzující látky jsou povaţovány aceton, dimetyl sulfid, 2 – pentanon, nonanol (Krotoszynski a kol, 1977). CO2 z dechu můţe být detekován na velkou vzdálenost i ve směsi s okolním vzduchem, zatímco těkavé látky z kůţe jsou detekovány na krátkou vzdálenost, kdy jsou stále homogenní (Zwiebel & Takken, 2004). CO2 je zejména pro komáry a klíšťata velkým atraktantem, po jeho odstranění z dechu se přitaţlivost sníţí o 20 %. Lidská kůţe má jiné vlastnosti neţ kůţe ostatních savců. Její pH je 4,2 – 6 díky velkému mnoţství mastných kyselin (Markovitz, 1942). Kromě karboxylových kyselin, do nichţ patří i jiţ zmiňované mastné kyseliny, je zde velké mnoţství skvalenu, který je povaţován za atraktant. Nejhojnějšími kyselinami jsou kyselina palmitolejová, olejová, linolenová a kyselina mléčná (která je unikátní u člověka a krevsajícími členovci dobře rozpoznatelná) (Ansari a kol., 1970); (Zwiebel & Takken, 2004). Nejvíce odpuzující karboxylové kyseliny jsou kyselina kapronová, enanová a pelargonová (Skinner a kol., 1970). Kyselina mléčná sama o sobě nemá odpuzující účinky, ale ve směsi s ostatními karboxylovými kyselinami nebo ve vyšší koncentraci jej mít můţe (Bernier a kol., 2000). Vliv kyseliny mléčné se zvyšuje po kombinaci s karboxylovými kyselinami C1 – C3, C5 – C8 a C13 – C15 (Bosh a kol., 1999). Některé z těchto látek samostatně nemusí mít ţádný účinek nebo naopak i odpuzující účinek. Důleţitá je zde opět koncentrace látek tvořících směs s kyselinou mléčnou. Ve směsi jsou mastné kyseliny C1 – C3 účinné při nízkých koncentracích, C5 – C8 35

ve středních koncentracích a C13 – C15 ve vyšších koncentracích. Směs s kyselinami C9 – C12 a kyselinou mléčnou neměla ţádný účinek na zvýšení atraktivity. U nonanové kyseliny je i ve směsi pozorován odpuzující účinek. Dále jsou zde těkavé látky jako aldehydy, ketony, alkoholy a další sloučeniny jako např. aceton nebo isopren (Ellin a kol., 1974). Z aldehydů mohou mít odpuzujíci účinky hexanal, oktanal, nonanal a dekanal, které se také nacházejí na kůţi, opět zde záleţí na jejich koncentraci (Curran a kol., 2005). Aldehydy slouţí jako obrana proti ektoparazitům v ţivočišné říši (Logan a kol., 2008). Dobře prozkoumané v tomto směru jsou některé druhy ptáků a ţirafy. U člověka by mohly mít podobný účinek. Z ketonů je nejznámější aceton, který vzniká metabolismem tuků a provedené studie ukázaly jeho odpuzující efekt (Curran a kol., 2005). Ostatní ketony samy o sobě ţádný účinek nemají. Zde je opět důleţitá směs ketonů a kyseliny mléčné. Na kůţi byly nalezeny i alkoholy od butanolu po heptadekanol (Bernier a kol., 2000). Nalezen byl i glycerol a fenol. Alkoholy mají odpuzující účinky zejména na komáry. V minulosti se přírodní alkoholy vyuţívaly jako repelenty. Např. citronellol a linallol mají silné odpuzující účinky (Narusuye a kol., 2005). Citronellol je sloţkou esenciálního oleje obsaţeného v růţích, pelargóniích, muškátech, citrónové trávě, levanuli a bazalce. Linallol se nachází v meruňce, mrkvi, levanduli a majoránce. Oba se přidávají do parfémů pro svoji květinovou vůni. Linallol má větší inhibiční účinky neţ DEET (N, N-Diethyl-3-methylbenzamide) (Posey a kol. 1998). Ektoparazité jsou odpuzeni, protoţe tyto látky dobře skrývají přirozené pachy jedince nebo hostitele zaznamenají, ale nejsou schopni se k němu zorientovat. Dále se na kůţi nachází i amoniak a aminy (od metylaminu aţ po butylamin), kyselina močová a močovina (Ellin a kol., 1974). Amoniak v nízké koncentraci má spíše atraktantní účinek, ve vyšší odpuzující, protoţe není rozeznán jako lidský (Smallegange a kol., 2005). Lidská kůţe je pokryta i potem (Meijerink a kol., 2000). Pot obsahuje velkou řadu chemických látek. Čerstvý pot obsahuje etanol, 3-hydroxy-2-butanon, 6-metyl-5-hepten-2-on, nonanal, dekanal, geranyl aceton, kyselinu octovou, kyselinu propionovou, kyselinu 2etylhexanovou, a estery etyl hexanoát, etyl oktanoát, etyl dekanoát, etyl-4-metyldekanonát, etyl dodecanonát, etyl-4-metyldodekanonát, etyl 9-tetradekanonát, a 9-etyl-hexadekanonát. Později se sloţení potu mění. Obsahuje etanol, 3-metyl-1-butanol, 3-hydroxy-2-butanon, 6metyl-5-hepten-2-on, kyselinu octovou, 6-metyl-3,5-heptadien-2-on, 1-nonanol, geranyl aceton,

1-dodekanol,

1-tetradekanol,

1-hexadekanol, 36

a

indol.

Mnoţství

třech

nejzastoupenějších sloučenin rapidně klesá. Jedná se o etanol, kyselinu octovou a 3-hydroxy2-butanon. Tento vliv můţe mít vliv na atraktivitu lidského potu, neboť pozdější sloţení potu krevsající členovce více láká. I jiné látky působí jako atraktanty. Např. indol (aromatická heterocyklická organická sloučenina) se ukázal jako atraktantní stimul. Odpuzující účinky má 6-metyl-5-hepten-2-on z čerstvého potu, ale pouze v nízkých přirozených koncentracích, ve vyšších má naopak atraktantní účinky. To platí i v případě geranyl acetonu. Zda je látka atraktantem nebo odpuzující často záleţí na její koncentraci a přítomnosti dalších spolupůsobících látek. Vysoká nebo nízká koncentrace mohou mít odpuzující efekt, protoţe nejsou ektoparazity rozeznávány jako lidské (Bernier a kol., 2000). Koncentrace látek na kůţi i v potu se mezi lidmi liší (Logan a kol., 2008). Proto jsou různí jedinci více či méně odolní proti hematofágním členovcům neţ jiní.

3. 2. 1. 2. Vliv repelentů Mezi další látky ovlivňující interakce člověka s krevsajícími členovci řadíme repelenty. Repelenty jsou chemické látky, které mají zabránit v kontaktu nebo narušení kůţe hostitele (Bissinger & Roe, 2009). Repelenty působí na orientaci členovce, který se nepohybuje směrem k hostiteli, ale od něj. Jak jiţ bylo zmíněno dříve, klíšťata reagují na kairomony – látky, které pochází z hostitele (Sonenshine, 2004). Klíštěcí čichová senzila detekuje odpařené molekuly ze vzduchu (Bissinger & Roe, 2009). Na tomto principu působí i většina repelentů. Snaţí se zamaskovat kairomony vycházející z hostitele. Ideální repelent by měl působit proti široké škále členovců po dobu nejméně 8 hodin, neměl by být jedovatý, dráţdivý a měl by být bez zápachu a nemastný. Repelentní přípravky nemusí slouţit pouze k odpuzení krevsajícího členovce, ale mohou je dokonce i zabít. Tyto chemické látky obsahují insekticidy nebo akaricidy. Insekticidy a akaricidy jsou vypouštěny do okolí nebo jsou nanášeny na domestikovaná zvířata i člověka (Sonenshine, 2004). Příměsy v akaricidním přípravku na bázi feromonů přitahují různá stádia klíštěte. Akaricidy ale působí zejména na dospělce. Samcům znemoţňují nalézt samičky a samičky jsou usmrcovány ještě před tím, neţ se jim povede naklást vajíčka. Problém těchto látek je znečišťování ţivotního prostředí, kontaminace masa a mléka u chráněných zvířat, klíšťata si proti těmto látkám mohou vyvinout rezistenci a nevýhodou jsou i vysoké náklady (Bissinger & Roe, 2009). 37

Repelentů je na trhu velké mnoţství. Mohou být ve formě aerosolu, krému, pleťového mléka, opalovacího oleje, pudru, tuhé tyčinky a emulze (Brown & Hebert, 1997). Mezi nejčastěji pouţívané moderní syntetické repelenty patří například DEET, permethrin a picaridin. DEET (N, N-Diethyl-3-methyl-benzamide) – pouţití prvních syntetických repelentů bylo zastíněno objevením DEET (Bissinger & Roe, 2009). DEET se postupem času stal zlatým standardem pro repelenty proti různým členovcům. Aplikuje se na kůţi i oblečení a je účinný proti několika druhům klíšťat. U některých jedinců můţe způsobit podráţdění kůţe. Je bezpečný pro bavlněné, vlněné a nylonové tkaniny, ale můţe poškodit elastan, hedvábí, acetát a barvenou kůţi. Kromě toho můţe rozpouštět plast a vinyl (Brown & Hebert, 1997).

Obr. 29: molekula DEET (URL 23) Permethrin ((3 - phenoxyphenyl)methyl 3 - (2,2 - dichloroethenyl) - 2,2 – dimethyl – cyclopropan - 1 - karboxylát) – i on působí na velké mnoţství druhů klíšťat, ale ne svoji odpudivostí jako toxicitou (Bissinger & Roe, 2009). Aplikuje se na oblečení, ale neměl by být aplikován na kůţi. V řadě experimentů byl účinnější neţ DEET, ale doba odpuzování je kratší.

Obr. 30: molekula permethrinu (URL 24) 38

Picaridin (1-Piperidine carboxylic acid) – má mnohé vlastnosti ideálního repelentu (Bissinger & Roe, 2009). Je bezbarvý, téměř bez zápachu, nedráţdí pokoţku, není toxický a má dlouhotrvající účinek. Také odpuzující účinek je vysoký.

Obr. 31: molekula picaridinu (Bissinger & Roe, 2009) Repelenty nemusejí být pouze syntetické, ale i na rostlinné bázi (Bissinger & Roe, 2009). Rostliny produkují četné sekundární sloučeniny, které lze vyuţít jako repelenty. Tyto sloučeniny mohou mít pro členovce toxické účinky. Mezi obranné fytochemikálie patří regulátory růstu, dusíkaté sloučeniny, fenoly, inhibitory proteináz a terpenoidy. Před uvedením repelentu na trh je třeba, aby byla otestována účinnost přípravku. Metody testování repelentů jsou rozděleny na tři kategorie (Dautel, 2004). První z nich jsou testy s pouţitím ţivých hostitelů. Repelenty se testují na lidech i zvířatech. Na kůţi je nanesen repelent a sleduje se, zda klíšťata ošetřenou část pokoţky kontaktují nebo zda jsou odpuzena. Do druhé kategorie patří testy s atraktantím stimulem. Do této kategorie patří i námi pouţívaný ,,moving – object bioassay“ (MO – bioassay). Hostitel je nahrazen přístrojem, který se pohybuje a vydává teplo. Více o této metodě bude popsáno v praktické části. Třetí skupina testů jsou bez hostitele a atraktantního stimulu. Jsou zde zahrnuty testy na Petriho misce nebo vertikální testy. Princip spočívá v tom, ţe se sleduje, zda klíště kontaktuje plochu ošetřenou repelentem nebo zda zůstane na neošetřené ploše. I o vertikálních testech a testech na Petriho misce více v praktické části.

3. 2. 2. Obranný systém hostitele Aby se klíšťata dostala ke své jediné moţné potravě, a to krvi, musí naříznout kůţi hostitele a poškodit cévy (Mans & Neitz, 2003). Kapiláry a malé cévy se trhají a krev se 39

hromadí v místě sání. Kůţe je protrţena pomocí chelicer pod keratinózní vrstvou (Nuttall a kol., 2000). Do ranky je vsunut hypostom aţ do epidermis (u některých druhů aţ do dermis). Mnoho klíšťat rodu Ixodes vylučují mléčný cement, který slouţí jako těsnění kolem hypostomu, aby nedocházelo k úniku krve a slin. Klíšťata sají pomalu a střídá se u nich fáze sání a slinění. Během posledních hodin sání zrychlí. Po skončení krmení je hypostom vyjmut z ranky a ta je vyplněna cementem. Tento proces vede k různým hemostatickým a imunitním mechanismům. Jako první reakce se spouští sráţení krve, agregace krevních destiček a vazokonstrikce. Tvoří se zánět a spouští se imunitní reakce vrozená i získaná. Hostitel se brání tvorbou protilátek, aktivací komplementu, proliferací T – lymfocytů, produkcí cytokinů, aktivací makrofágů a Th1 buněk (Wikel, 1999). Langerhansovy buňky v pokoţce zachycují klíštěcí imunogeny (většinou se jedná o antigeny ze slin) a přenášejí je do mízních uzlin. Tvoří se protilátky, které se zachycují na bazofilech a dochází k vylití histaminu, leukotrienů, prostaglandinů a enzymů (Brossard & Wikel, 2004). Tím se zabraňuje překrvení poraněného místa a histamin potlačuje slinění klíštěte (Singh & Girschick, 2003). Vylitím mediátorů vzniká koţní přecitlivělost a poraněné místo svědí (Wikel, 1999), vznikají otoky a zarudnutí (Nuttall & Labuda, 2004). Histamin dále podporuje aktivaci TNF – α, který likviduje i borreliovou infekci. I NK buňky mají protivirovou aktivitu a podporují chemotaxi ţirných buněk, eozinofilů a mnoţení neutrofilů. Také se tvoří specifické protilátky a komplement, který útočí proti sajícímu roztoči (Wikel, 1999). Aktivuje se klasická i alternativní cesta komplementu, které jsou důleţité pro rezistenci vůči klíšťatům (Singh & Girschick, 2003). Vznikají anafylatoxiny C3a a C5a. Jde o látky, které pomáhají granulocytům vylévat mediátory. Tvoří se kyslíkové radikály a zvyšuje se počet zánětlivých cytokinů. Aktivace komplementu má za následek i opsonizaci a fagocytózu patogenů a zlepšuje prezentaci antigenů B – lymfocytům. Převaţují CD4 nad CD8 buňkami a po opakovaném napadení klíštětem jejich počet neustále roste. Moţná je to i díky tomu, ţe dochází ke zvětšení sleziny (Singh & Girschick, 2003). Tento jev byl prokázán u ptáků, u kterých se zvětšuje i Fabriciova bursa. Díky tomu je obrana silnější a účinnější. Po napadení se aktivuje IL – 2 a INF – γ, ale ne IL – 4. V místě sání převaţují Th1 buňky. Po několika dnech začne stoupat hladina IL – 4 a převaţují Th2 buňky. Posílení imunitních reakcí (zejména produkce histaminu) by vedlo k rezistenci proti klíšťatům. Klíšťata by přestala sát a mohla by i zahynout nebo by se sníţila plodnost u samic (Willadsen & Jongejan, 1999). 40

3. 2. 3. Obranný systém klíštěte I kdyţ je imunitní systém hostitele důmyslný, klíšťata se přesto mohou krmit bez větších komplikací. Sloţky klíštěcích slin jsou schopné účinně zasahovat do mnoha imunologických dějů (Nuttall a kol., 2000). Sliny umí tlumit jiţ prvotní aktivitu imunitního systému. Obsahují hlavně antihemostatické a protizánětlivé molekuly. První popsaná antihemostatická molekula byl prostaglandin (zejména PGE 2, PGI 2 a PGD2). PGI 2 je také silný inhibitor trombocytů (Singh & Girschick, 2003). Prostaglandin hraje úlohu ve vazodilataci a působí proti agregaci krevních destiček a imunomodulací (Nuttall a kol., 2000). Je produktem kyseliny arachnidové, která je získávána z krve. Agregace krevních destiček je inhibována i apyrázou (Singh & Girschick, 2003). Další vazodilatátor je maxadilan (Nuttall a kol., 2000). Pomáhá pronikání ústního ústrojí do kůţe, lokalizuje krevní kapiláry, při sání zvyšuje průtok krve a umoţňuje ukončit sání v co nejkratší době. Sliny klíšťat inhibují činnost kolagenu, trombinu a fibrinogenu a tím zabraňují hojení (Singh & Girschick, 2003). Nejdůleţitější protizánětlivé molekuly jsou namířeny proti histaminu (Nuttall a kol., 2000). Díky němu nastává svědění a klíště je hostitelem odstraněno. Ve slinách je mnoho histamin váţících molekul. Jedna z nich je histacalin. Váţe se na receptory histaminu a brání mu tak v navázání a tvorbě zánětlivé odpovědi. Byl nalezen u Ixodidae, ale ne u Ixodes ricinus, přestoţe antihistaminová činnost detekována byla. Je inhibován i bradykinin, který způsobuje bolest a svědění. (Singh & Girschick, 2003). Klíštěcí sliny obsahují i inhibitory komplementu a to jak alternativní, tak i klasické cesty (Nuttall a kol., 2000). Inhibují C3b a C5b sloţku a také anafylatoxin C3a, který je důleţitý pro uvolnění ţirných buněk a mediátorů z bazofilů (Wikel, 1999). Další sloţky ve slinách inhibují činnost T- lymfocytů (Willadsen & Jongejan, 1999). Sniţují produkci IL – 2 a INF – γ, čímţ zabraňují tvorbě zánětlivé reakce (Singh & Girschick, 2003). Jiné organické sloučeniny potlačují IL – 1 a TNF – α. IL – 8 aktivuje neutrofily a láká je do místa zánětu (Brossard & Wikel, 2004). I pro něj jsou ve slinách inhibitory. Místo IL – 2 se tvoří více IL – 4, 10 a 13, coţ podporuje Th2 cestu a výrazně sniţuje prozánětlivou Th1. Ve slinách jsou dokonce proteiny, které jsou zaměřeny proti IgG protilátkám. Jedná se o imunoglobiny vázající proteiny IGBPs, které se nacházejí ve slinách i v hemolymfě. Byly nalezeny i látky, které mají vliv na proliferaci B – lymfocytů (Hannier a kol., 2004). Klíšťata mají i MIF (migrační inhibiční faktor) makrofágů, NK buněk a lymfocytů (Nuttall & Labuda, 2004). 41

3. 2. 4. Metody identifikace hostitelů klíšťat Pro určení hostitelů klíšťat se pouţívají metody odchytu. Odchytáváni jsou samotní hostitelé (Siński a kol., 2006). Také je moţno vyuţívat metody molekulárně biologické (Morán-Cadenas a kol., 2007), jak je vysvětleno dále v textu. Jako nejčastější hostitelé jsou odchytáváni hlodavci. K jejich odchytu jsou pouţívány jednoduché pasti (Siński a kol., 2006). Po odchytnutí je hlodavce přiřazen ke svému druhu, je změřen, zváţen a je určeno pohlaví a věk jedince. Po té je vyšetřen na přítomnost parazitů, kteří jsou mu šetrně odebráni. U odebraných klíšťat se určuje druh a stádium. Nejde ale o metody, které by nám přiblíţily spektrum hostitelů nebo jakou procentuální hodnotu hraje daný hostitel v potravě klíšťat. Ukazují nám, jaká stádia nejčastěji sají na určitém druhu hostitele. Odchytovými metodami mohou být vyšetřováni i ptáci (Poupon a kol., 2006). Ti se vyšetřují zejména proto, ţe mohou klíšťata přenášet na velké vzdálenosti a šířit nemoci s nimi spojené. Molekulárně genetické metody se zaměřují na zjištění všech hostitelů, kteří by mohli být klíštětem napadeni (Morán-Cadenas a kol., 2007). Jsou zaloţeny na získávání hostitelské DNA ze střeva klíštěte. Ve střevě klíštěte se hledají zbytky krve, ze kterých by mohl být hostitel identifikován. K identifikaci se pouţívá fragment mitochondriálního genu kódujícího 12S rDNA. Tento gen je velmi variabilní. Pomocí něj můţe být hostitel přiřazen do rodu a někdy i druhu. Výhodou této metody je rychlost a zpracování velkého mnoţství vzorků. Nevýhodou je, ţe se jedná o relativně nákladnou metodu. Ne vţdy se podaří hostitele určit, důleţitou roli zde hraje doba, která uplynula od posledního nakrmení klíštěte. Čím delší doba, tím těţší určení hostitele, protoţe dochází k trávení krve. Další molekulárně genetickou metodou je měření poměrů přirozených stabilních izotopů dusíku a uhlíku (15N/14N, 13C/12C) v klíšťatech (Schmidt a kol., 2011). Poměry těchto izotopů se dají přiřadit k jednotlivým hostitelům. Metoda dokáţe nejen určit hostitele, ale i dobu, kdy byl napaden klíštětem. Oproti předchozí metodě nezáleţí na době, která uplynula od krmení klíštěte, neboť tyto izotopy se ukládají do tkání parazita. Zásadní nevýhodou je, ţe metoda nedokáţe určit vzorky z jednoho klíštěte, ale potřebuje nejméně 3. Proto dochází k neustálému zlepšování a vývinu této metody.

42

3. 3. Interakce klíště - patogen Přenos patogena je moţný dvěma směry (Nuttall a kol., 2000). Z infikovaného klíštěte na neinfikovaného hostitele, ale i obráceně. V přenosu patogena hraje roli tzv. SAT (saliva activated transmission) neboli slinami aktivovaný přenos. Klíšťata jsou díky slinám velice odolná vůči virům, bakteriím i patogenům. Tento systém moţná chrání i patogeny před protilátkami, které se s krví dostávají do zaţívacího traktu klíštěte. Proti protilátkám hostitele si klíště tvoří své vlastní protilátky. Spirochéty uvádíme jako příklad interakce klíště – patogen, protoţe jsou původci epidemiologického onemocnění lymeské borreliózy a zabývali jsme se jimi v experimentální části. Spirochéty se vyvinuly tak, ţe látky z klíštěcích slin pro potlačení imunity jim pomáhají proniknout do hostitele. Klíšťata neslouţí pouze pro přenos spirochét, ale umoţňují i jejich vývoj (Singh & Girschick, 2003). Spirochéty musí totiţ svůj metabolismus přizpůsobit ze studenokrevného klíštěte na teplokrevného hostitele. Patogen často napadá savce i ptáky a díky nim můţe být přenášet i na velké vzdálenosti. Spirochétám svědčí fyzická námaha i vylučování glukokortikoidů, coţ napomáhá propuknutí onemocnění. Spirochéty se mnohem lépe mnoţí ve stresovaném organismu. Během sání přecházejí ze střeva do slin klíštěte a jejich povrchové antigeny se mění. Patogen musí překonat mnoho nástrah hostitele i klíštěte (Nuttall & Labuda, 2004). Musí se dostat do střeva klíštěte, kde se můţe vyvíjet a tedy překonat jeho infekční bariéru. Dále se musí umět replikovat uvnitř hostitelských buněk. Spirochéty bývají specifické a napadají pouze např. nervovou tkáň nebo klouby. Pro některé borrelie můţe být nebezpečné sérum určitého druhu hostitele (Nuttall a kol., 2000). Např. molekuly ve slinách Ixodes hexagonus inhibují komplement u jeţčího a psího séra, ale ne baţantího a holubího, na kterých se nekrmí. Ixodes ricinus má mnoho hostitelů z řad savců i ptáků. Pro borrelie to můţe být nebezpečné. Borrelia garinii přeţívá v ptačím séru, ale hlodavčí jí můţe zabít. U Borrelia afzelii je to naopak. Některé kmeny Borrelia garinii mohou být citlivé na lidské sérum, ale přesto mohou vyvolat neuroboreliózu. Anti – komplementový faktor ve slinách borrelie chrání a pomáhá je přenést i do nepříznivého hostitele.

43

4. Cíle práce Krevsající členovci, jako jsou klíšťata, komáři, …, mohou přenášet řadu onemocnění. Tato onemocnění mohou být původu virového, bakteriálního i protozoálního. Experimentální diplomová část je zaměřena na v ČR nejběţnější druh klíštěte, klíště obecné (Ixodes ricinus), a faktory ovlinující jeho interakce s hostitelem (člověkem). Cíle práce: 1, Pravidelný monitoring lokality Pisárky a Ruda v Brně a přispět k systematickému mapování území města Brna z hlediska aktivity klíšťat a výzkumu ve vztahu k nákazám přenášených klíšťaty. 2, U odchycených jedinců zjistit prevalenci borrelií pomocí metody Dark field microscopy. 3, Stanovení, jakou roli v interakci člověk – klíště mohou hrát různé vonné kosmetické přípravky, které člověk pouţívá. 4, Ověření hypotézy, ţe jedinci s určitou individuální charakteristikou (krevní skupinou AB0) jsou preferovanějšími hostiteli klíštěte.

44

5. Materiál a metody 5. 1. Sběr klíšťat - vlajkování Vlajkování je běţná metoda pouţívána ke sběru klíšťat. Principem je pomocí vlajky (nejlépe flanelové, protoţe se klíště můţe dobře uchytit) o rozměru 1 x 1 metr nasbírat klíšťata (Ţákovská, 2000). Vlajka by měla být světlá, nejlépe bílá, protoţe roztoč je na světlém pozadí dobře rozeznatelný. Vlajkou je smýkáno po zemi, travinách i keřích a pravidelně se kontrolují a odebírají pinzetou přichycená klíšťata. Klíšťata jsou sbírána do plastových zkumavek, ve kterých jsou přepravena do laboratoře. Do zkumavky je vloţeno stéblo trávy, aby klíšťata měla dostatek kyslíku i vlhkosti. U této metody je důleţité preventivní opatření, protoţe hrozí riziko přisátí roztoče. Pouţívá se světlé oblečení a po sběru je dobré pouţít repelentní přípravek.

Obr 32: Metoda vlajkování

Obr. 33: Klíště přichycené na vlajce

(foto V. Nesnídalová).

(foto V. Nesnídalová).

5. 1. 1. Materiál Uzavíratelné plastové zkumavky, pinzeta, bavlněná látka, dřevěná tyč, listy trávy a teploměr s vlhkoměrem (THW 301, EMOS ).

45

5. 1. 2. Postup Metodou vlajkování jsme povedli sběr klíšťat na lokalitách Pisárky a Ruda (lokalita poblíţ Brněnské přehrady) v Brně. Sběr probíhal v týdenních intervalech na lokalitě Pisárky a jednou za 14 dní na lokalitě Ruda. Sběr jsme prováděli pokud moţno vţdy ve stejný den a stejnou hodinu. Klíšťata jsme sbírali na obou lokalitách po dobu 1 hodiny. Vlhkost a teplotu vzduchu jsme měřili pomocí teploměru s vlhkoměrem. Údaje o tlaku vzduchu jsme pouţili z Českého hydrometeorologického ústavu. Před testováním jsme klíšťata uchovávali v chladničce (5°C).

5. 1. 3. Charakteristika lokality Pisárky Lokalita Pisárky se nachází 2 km od centra města Brna a je vyhledávaným místem k rekreaci (Ţákovská a kol., 2008). Lokalita leţí v nadmořské výšce 197 – 210 m. n. m. a její souřadnice jsou 49°11„3„„ s. š., 16°34„31„„ v. d. V místě sběru se nachází smíšený les, ve ktrerém převaţují dub zimní (Quercus petraea),dub letní (Q. robur), habr obecný (Carpinus betulus), borovice lesní (Pinus silvestris), méně často se zde vyskytují smrk obecný (Picea abies), buk lesní (Fagus silvatica), sporadicky se vyskytují bříza bradavičnatá (Betula verucosa), topol osika (Populus tremola), trnovník akát (Robinia pseudoaccacia), borovice pichlavá (Pinus pungens), modřín opadavý (Larix decidua). Keřové patro tvoří bez černý (Sambucus nigra), bez hroznatý (Sambucus racemosa), pámelník bílý (Symphoricarpos rivalaris), svída krvavá (Cornus sanguinea) a hloh (Crataegus). V bylinném patře můţeme nalézt česnek medvědí (Allium ursinum), dymnivka dutá (Corydalis cava), orsej jarní (Ficaria verna), sasanka pryskyřníkovitá (Anemone ranunculoides), plicník lékařský (Pulmonaria officinalis), svízel lesní (Galium silvaticum), netýkavka malokvětá (Impatiens parviflora), lipnice hajní (Poa nemoralis), černýš hajní (Melampyrum nemorosum) a další (Ţákovská, 2000). Hostitelé klíštěte obecného na lokalitě Pisárky patří mezi malé a střední savce, nachází se zde např. zajíc polní (Lepus europaeus), veverka obecná (Sciurus vulgaris), jeţek maloasijský (Erinaceus concolor), norník rudý (Clethrionomys glareolus), myšice lesní (Apodemus flavicollis), myšice křovinná (Apodemus sylvaticus) (Pejchalová a kol., 2007).

46

Obr: 34: Lokalita Pisárky

Obr. 35: Lokalita Pisárky (URL 25).

(foto V. Nesnídalová).

5. 1. 4. Charakteristika lokality Ruda Lokalita Ruda se nachází asi 200 m na západ od Brněnské přehrady. Téměř po celý rok je přehrada navštěvována turisty i místními lidmi, kteří se sem chodí procházet, často i se psy. Nadmořská výška lokality je 233,72 m. n. m. Souřadnice jsou 49°14„18“ s. š., 16°31„29“ v. d. V místě sběru se nachází listnatý les. Vyskytují se zde dub zimní (Quercus petraea),dub letní (Q. robur), habr obecný (Carpinus betulus), borovice lesní (Pinus silvestris), buk lesní (Fagus silvatica), trnovník akát (Robinia pseudoaccacia). Keřové patro tvoří bez černý (Sambucus nigra). V bylinném patře nalézáme brambořík nachový (Cyclamen purpurascens), česnek šerý horský (Allium senescens subsp. montanum), hlístník hnízdák (Neottia nidus – avis), kruštík širolistý (Epipactis helleborine), náprstník velkokvětý (Digitalis grandiflora), okrotice bílá (Cephalanthera damasonium), pavinec horský (Jasione montana), lipnice hajní (Poa nemoralis) a konvalinka vonná (convallaria majalis). Ze zvířecích druhů zde můţeme potkat zajíce polního (Lepus europaeus), veverku obecnou (Sciurus vulgaris), jeţka maloasijského (Erinaceus concolor), norníka rudého (Clethrionomys glareolus) a myšici lesní (Apodemus flavicollis).

Obr. 36: Lokalita Ruda

Obr. 37 Lokalita Ruda (URL 26).

(Foto V. Nesnídalová). 47

5. 2. Testování odpuzujících účinků vonných přípravků Jedním z cílů práce je stanovit, jakou roli v interakci člověk – klíště mohou hrát různé vonné kosmetické přípravky, které člověk pouţívá. S ohledem na to, ţe součástí těchto přípravků bývají běţně látky, u nichţ literatura popisuje odpuzující účinky (Posey a kol., 1998), předpokládali jsme spíše odpuzující působení. Na základě tohoto předpokladu byly vybrány dva vhodné přístupy, běţně vyuţívané k testování (potenciálně) repelentních přípravků. A sice orientační vertikální testy a dále testy v přítomnosti atraktantních stimulů pomocí aparatury “moving object bioassay”. Vonné kosmetické přípravky jsem nanášeli na filtrační papír rovnoměrně po celé jeho ploše v mnoţství 174 μl (stanoveno empiricky).

5. 2. 1. Testované přípravky Avon Summer White – dámská toaletní voda (Avon). Výrobce vůni přípravku popisuje jako lehkou, svěţí, květinovou. Sloţení toaletní vody: Alkohol, voda, parfém, etylenhexanoát, etylhexyl metoxycinnamát, citral, linalool, geraniol, alfa-isometyl ionon, hexyl cinnamal, benzyl salicylát, kumarin, citronellol, limonen.

Obr. 38: Avon Summer White (Foto V. Nesnídalová). Enigma Dare to Dream – dámská toaletní voda (Oriflame). Vůně je popisována jako ovocno – květinová. Sloţení toaletní vody: alkohol denaturovaný, voda, parfém, benzyl salicylát, etylhexyl metoxycinnamát, linalool, hydroxycitronellal, hexyl cinnamal, limonen, alfa-isometyl ionon, 48

butyl

metoxydibenzoylmetan,

etylhexyl

salicylát,

geraniol,

citronellol,

isoeugenol,

benzylbenzoát, citral.

Obr. 39: Enigma Dare to Dream (Foto V. Nesnídalová).

5. 2. 2. Testovací přístupy Nejprve jsme provedli vertikální testy ( první, orientační testy) a poté ,,Moving – object bioassay“, kde testovaná látka ,,soupeří” s atraktantními stimuly.

5. 2. 2. 1. Vertikální testy Vertikální testy vyuţívají přirozené schopnosti klíšťat šplhat směrem nahoru po stoncích trávy, kde číhají na hostitele. Ve vhodné výšce se klíště postaví do číhací pozice a zvedá přední končetiny, pomocí kterých se snaţí zachytit pach hostitele (Dautel a kol., 1999). Ošetřená plocha repelentem má zabránit klíštěti v pohybu směrem nahoru.

5. 2. 2. 1. 1. Materiál Filtrační papír, provázek, 2 laboratorní stojany, nůţky, pinzeta, tuţka, toaletní voda, stopky.

49

5. 2. 2. 1. 2. Postup Test byl s úpravami vytvořen podle Carroll a kol. (2004). Pás filtračního papíru o rozměrech 17 x 2 cm je umístěn mezi dvěma nataţenými provázky, které jsou připevněny ke stojanu. Filtrační papír je tuţkou rozdělen na dvě poloviny. Klíšťata jsou umisťována na spodní polovinu papíru, 2 cm pod vyznačené rozhraní. Sledujeme pohyb klíštěte po papíře, přičemţ klíšťata mají přirozenou tendenci pohybovat se nahoru (podobně jako v přírodě šplhají po vegetaci vzhůru). Jako kontrola pro aktivitu se vyuţívá filtrační papír, který není ošetřen odpuzujícím přípravkem. Klíšťata, která se přemístí na horní polovinu, jsou uznána jako aktivní a pokračují do testů s repelenty nebo v našem případě s toaletní vodou. Toaletní vodu nanášíme na horní polovinu filtračního papíru a po dobu dvou minut sledujeme pohyb klíštěte. Odpuzené klíště je to, které nekontaktuje ošetřenou polovinu papíru nebo se rychle vrátí na spodní polovinu. Měřili jsme i čas, po který se klíště zdrţovalo na horní polovině nebo dokud nevylezlo aţ na vrchol, a to jak v kontrolních experimentech, tak v testech s vybranými látkami. Testovali jsme 50 aktivních jedinců.

Obr. 40: Vertikální test (Foto V. Nesnídalová).

5. 2. 2. 2. ,,Moving – object bioassay“ Tento přístup se vyuţívá na testování repelentů proti klíšťatům. Hostitel je zde simulován otáčejícím se bubnem, který je naplněn vodou vyhřívanou na 36,5°C plus mínus 0,5°C (tato teplota je pro klíště atraktantem, protoţe připomíná teplotu těla člověka) (Dautel a kol., 1999). 50

Přesto, ţe rotující buben vydává atraktantní stimuly, roztoč by měl být po pouţití repelentu odpuzen. Jedině repelenty, které jsou účinné v přítomnosti těchto stimulů, jsou totiţ efektivní i při reálním pouţití. Zařízení je sloţeno z mosazného bubnu, který je z vrchní strany otevřený. Buben se naplní vodou a termostatem se udrţuje teplota 36,5°C. Buben je poloţen na otáčivé ploše, která je poháněna motorem. Asi v 9 cm výšce je na bubnu mosazný plech ve tvaru obdélníku, na který se připevňuje filtrační papír, na kterém je podle potřeby nanesena testovaná látka. Tato plocha je mírně vyvýšená a klíšťata se mohou přichytit na aparaturu pouze zde. Buben je natřen bílou barvou, aby byly minimalizovány kontrasty mezi ním a bílým filtračním papírem. Pro zviditelnění zadní strany bubnu pro experimentátora je pouţito zrcadlo. Klíště je umístěno na skleněnou tyčinku, která je od bubnu vzdálená na takovou vzdálenost, aby bylo klíště schopné přeskočit z tyčinky na filtrační papír umístěný na bubnu. Vzdálenost se můţe měnit podle stádia klíštěte, nejčastěji se pohybuje ale okolo 1 mm. Skleněná tyčinka je dlouhá asi 5cm a skloněna k bubnu pod úhlem 45° nebo 90°.

Obr. 41: Experimentální přístroj ,,Moving – object bioassay“ (podle Dautel a kol., 1999). Rozměry jsou uvedeny v milimetrech.

51

5. 2. 2. 2. 1. Materiál Zařízení pro MO – bioassay, pinzeta, filtrační papír, voda, nůţky, toaletní voda.

5. 2. 2. 2. 2. Postup Metoda ,,Moving – object bioassay“ podle Dautel a kol. (1999) byla upravena pro potřeby našeho výzkumu. V porovnání s originálním provedením experimentu podle Dautel a kol. (1999) došlo k nahrazení měděného bubnu skleněným, který je také natřen bílou barvou. Pro měření teploty se pouţívá teploměr, který je i s topidlem ponořen v bubnu z vrchní strany. Buben má drţáky na filtrační papír, který má rozměry 8 x 2 cm. Filtrační papíry bez přípravku jsou pouţívány jako kontroly pro aktivitu klíšťat a jejich schopnost atakovat hostitele. Otáčení bubnu zajišťuje rotující plošina poháněná motorkem. Skleněná tyčinka byla nahrazena laboratorní špachtlí, která je upevněná ve stojanu v úhlu 45°. Otáčivé zařízení je podloţeno bílým filtračním papírem, aby byla dobře viditelná klíšťata, která spadla z bubnu i ze špachtle. Klíšťata, která kontaktují neošetřený filtrační papír, umístěný na rotujícím bubnu, vyhodnotíme jako aktivní a v dalším kroku lze testovat jejich reakci na aplikované látky. Za odpuzená klíšťata povaţujeme ta, která nekontaktují rotující buben nebo kontaktují, ale okamţitě odpadávají. Námi testováno na toaletní vody bylo 50 aktivních jedinců.

Obr. 42: Upravená aparatura ,,moving – object bioassay“ (Foto V. Nesnídalová). 52

5. 3. Preference krevních skupin klíšťaty Je známo, ţe lidé s jistým typem krevní skupiny jsou buď odolní, nebo naopak náchylní k některým infekčním chorobám a k jistým parazitárním chorobám. Přitom je zřejmé, ţe lidé s krevní skupinou A jsou v jisté nevýhodě k lidem s krevní skupinou 0 nebo B. Krevní skupina 0 má silnější imunitní reakci neţ ostatní 3 zbylé (Cserti & Dzik, 2007). Komáři preferují nejspíše krevní skupinu 0, protoţe lidé s touto skupinou jsou nejvíce postiţeni malárií. My jsme se pokusili zjistit, jakou krevní skupinu by mohla preferovat klíšťata.

5. 3. 1. Testy na Petriho misce Pro testy preference krevních skupin byl pouţit přístup vyuţívající Petriho misky, podle Dautel (2004), a adekvátně modifikovaný pro účely našeho experimentu. U testů je sledován pohyb klíštěte po ošetřené a neošetřené ploše testovanou látkou. Filtrační papír je vystřihnut na dva půlkruhy s kulatým otvorem uprostřed. Mezera mezi polovinami filtračního papíru je asi 1 cm. Na tuto plochu jsou pokládána klíšťata (nejčastěji po dvou) a sleduje se, zda se pohybují směrem k ošetřené nebo neošetřené ploše repelentem.

5. 3. 1. 1. Materiál 2x Petriho miska, filtrační papír, pinzeta, nůţky, heparizovaná krev, stopky.

5. 3. 1. 2. Postup Do Petriho misky jsme vloţeli filtrační papír vystřiţený do kruhu, aby pokryl celé dno Petriho misky. Do okrajových míst v misce jsme na filtrační papír ve stejné vzdálenosti od sebe napipetovali krevní skupiny A, B, AB a 0, vţdy po 1 μl. Petriho misku jsme přiklopili druhou menší Petriho miskou. Klíště jsme vloţili doprostřed, stejně daleko od všech krevních skupin. Pozorovali jsme, jakou krevní skupinu bude klíště preferovat. Zaznamenávali jsme první kontakt s krevní skupinou a dále, kde se klíště nachází po jedné a dvou minutách. Preferované krevní skupiny byly zaznamenávány. Testovali jsme 100 jedinců všech stádií, kteří byli uznáni jako aktivní, pokud měli tendenci pohybovat se po Petriho misce. Pohyb

53

klíšťat po Petriho misce bez krevních skupin byl náhodný a klíšťata nepreferovala jednu stranu více neţ ostatní.

Obr. 43: Testy na Petriho misce (Foto V. Nesnídalová).

5. 4. Stanovení přítomnosti spirochét v klíštěti metodou DFM (dark field microscopy)

Mikroskopem se zástinovým kondenzorem jsme prohlíţeli obsah klíštěte a byla sledována přítomnost spirochét. Cílem bylo určit promořenost klíšťat spirochétami na lokalitách Pisárky a Ruda. Nejstarší modifikací světelné mikroskopie je pozorování objektů v zástinovém poli. Umoţňuje nám pozorovat velmi drobné a průhledné objekty i jejich struktury za ţiva (Knoz & Opravilová, 1992). Z kondenzoru vychází světelný kuţel (Hejtmánek, 1993). Pouze jeho okrajové a velmi šikmé paprsky vstupují do roviny objektu. Centrální paprsky kuţele jsou pohlceny. Objekt je tedy osvícen pouze za stran, neboli laterálně. Tímto dosáhneme tzv. Tyndalova efektu. Při tomto efektu ozařované částice světlo lámou a odráţejí, takţe v tmavém poli vyvolávají dojem, ţe sami září. Postranního osvětlení objektu je moţno dosáhnout více způsoby. Např. vychýlením zrcátka, vychýlením irisové clony od optické osy mikroskopu, vychýlením kondenzorového systému čoček od optické osy mikroskopu, umístěním tzv. centrální clony pod kondenzor nebo, i v našem případě pouţitý způsob, nahrazení běţného kondenzoru speciálně zkonstruovaným zástinovým kondenzorem. Dnes nejběţnějšími typy zástinových kondenzorů jsou tzv. zrcadlové kondenzory, u kterých se světlo odráţí na

54

zrcadlících se zakřivených plochách skleněných bloků tak, ţe se nakonec pod šikmými úhly ze všech stran koncentruje do ohniska pozorovaného objektu. Pro mikroskopii v temném poli je velice důleţitý silný světelný zdroj, tenká a čistá krycí i podloţní skla bez mastných skvrn a čisté médium bez nečistot a bublin (Knoz & Opravilová, 1992).

5. 4. 1. Materiál Světelný mikroskop se zástinovým kondenzorem (Olympus BX40), podloţní a krycí skla, pinzeta, preparační jehla, buničina, etanol 95%, sirky, kahan, pipety, jednorázové plastikové pipety, uzavíratelné Eppendorfovy zkumavky, sterilní fyziologický roztok.

5. 4. 2. Postup Krycí a podloţní skla jsme vyčistili etanolem. Na podloţní sklo byla kápnuta kapka fyziologického roztoku, do které jsme vloţili klíště. Pomocí preparační jehly jsme klíště rozcupovali. Vypitvaný tělesný obsah jedince bez těla jsme přikryli krycím sklem a pozorovali jsme jej na světelném mikroskopu se zástinovým kondenzorem. Preparační jehly byly po kaţdém pouţití opáleny nad kahanem a vloţeny do etanolu. Po vyšetření na spirochéty jsme zbytek klíštěte spláchli do 150 μl fyziologického roztoku v Eppendorfově zkumavce. Pozitivní vzorky jsme vyfotografovali. Eppendorfofy zkumavky s tělesným obsahem klíštěte byly popsány a zamraţeny k dalšímu pouţití.

Obr. 44: Světelný mikroskop se zástinovým kondenzorem napojený na počítač (Foto V. Nesnídalová). 55

5. 5. Software pro statistické vyhodnocení dat Analýza dat byla provedena softwarem STATISTICA 10. Vţdy jsme testovali nulovou hypotézu H0 proti alternativní hypotéze H1. Na základě hodnoty p a zvolené hladiny významnosti potvrzujeme nebo zamítáme nulovou hypotézu. Průměrný počet klíšťat v kaţdém měsíci byl hodnocen testem One – way ANOVA. One – way ANOVA nám vypočítá hodnotu p. Průměrné počty klíšťat můţeme porovnat pomocí homogenních skupin a to díky LSD testu, který je také součástí One – way ANOVY. Aktivita klíšťat byla porovnávána pomocí testu dobré shody (chí – kvadrátu). Důleţitý rozdíl byl mezi očekávanými počty klíšťat a pozorovanými počty klíšťat. Vypočtená testová statistika se porovná s kritickou hodnotou rozdělení x². Pro hladinu významnosti 5 % je α = 0,05. Vliv vonných kosmetických přípravků na chování klíšťat, stejně jako preferenci krevních skupin, jsme hodnotili také testem dobré shody (chí – kvadrátem). Hladina významnosti byla i zde zvolena α = 0,05.

56

6. Výsledky V této kapitole jsou shrnuty výsledky monitoringu klíšťat na lokalitách Pisárky a Ruda za rok 2012. Po kaţdém sběru jsme vyhledávali i hlášení z Českého hydrometeorologického ústavu (chmi) ohledně aktivity klíšťat. Výsledky z lokality Pisárky pocházejí i od Bc. Terezy Rašovské, která se podílela na monitoringu. Jsou zde zahrnuty i výsledky testovaných vonných kosmetických přípravků a výsledky testů s krevními skupinami.

6. 1. Výsledky vlajkování a DFM na lokalitě Pisárky Na lokalitě Pisárky probíhalo vlajkování kaţdý týden po dobu 60 minut. Sběry byly prováděny od 19. 3. 2012 do 16. 10. 2012. V Pisárkách bylo nalezeno 198 klíšťat. Pozitivních bylo 9 jedinců a celková pozitivita na borrelie byla 4,5 %. Z celkového počtu jedinců bylo 6 larev, 169 nymf, 11 samců a 12 samic. Pozitivní byly pouze nymfy a to 9.

Datum

Počet

Pozitivní Larvy

Nymfy

Samci Samice

Teplota (°C) Vlhkost (%) Tlak (hPa)

Chmi hlášení

klíšťat jedinci 19. 3. 2012

1

0

0

1

0

0

8

42

1028,1 ţádné riziko

26. 3. 2012

0

0

0

0

0

0

18,9

14,2

1030,6 mírné riziko

2. 4. 2012

0

0

0

0

0

0

15,4

3,5

1009,2 mírné riziko

9. 4. 2012

0

0

0

0

0

0

10,8

25

1013,3 malé riziko

16. 4. 2012

4

0

0

3

1

0

10,7

67,7

1009,3 středně velké riziko

23. 4. 2012

11

0

0

11

0

0

16,4

33,9

1006,4 velké riziko

30. 4. 2012

0

0

0

0

0

0

29,1

24

1014,3 nejvyšší riziko

7. 5. 2012

0

0

0

0

0

0

21,5

46,5

1016,9 nejvyšší riziko

14. 5. 2012

10

0

0

2

3

5

15,5

35,5

1025,2 velké riziko

21. 5. 2012

11

1

0

11

0

0

17,6

37,7

1014,6 nejvyšší riziko

28. 5. 2012

6

0

0

3

2

1

26,5

18,5

1014,5 nejvyšší riziko

4. 6. 2012

0

0

0

0

0

0

24,5

45

11. 6. 2012

10

3

0

7

0

3

22,2

55,1

1006,3 nejvyšší riziko

18. 6. 2012

24

0

1

23

0

0

21,3

32

1019 nejvyšší riziko

25. 6. 2012

4

0

0

4

0

0

32,4

30,5

1010,5 nejvyšší riziko

2. 7. 2012

31

2

0

26

3

2

16,7

54

1014,2 velké riziko

9. 7. 2012

8

0

0

7

1

0

32,6

40,1

1010,8 velké riziko

16. 7. 2012

31

2

2

29

0

0

16,8

70

1013,4 velké riziko

26. 7. 2012

7

0

0

7

0

0

30,7

61,1

57

1007,8 velké riziko

1015,3 středně velké riziko

30. 7. 2012

19

1

1

17

0

1

20,3

38

1018,3 středně velké riziko

6. 8. 2012

1

0

0

1

0

0

34,7

39

1009,7 mírné riziko

13. 8. 2012

12

0

2

10

0

0

20,2

65

1014,8 mírné riziko

19. 8. 2012

3

0

0

3

0

0

29,8

50

1015 mírné riziko

26. 8. 2012

0

0

0

0

0

0

22,6

64,5

1012,8 mírné riziko

3. 9. 2012

4

0

0

3

1

0

25,3

67

1020,2 mírné riziko

9. 9. 2012

0

0

0

0

0

0

23,3

49,5

1019,1 mírné riziko

18. 9. 2012

1

0

0

1

0

0

24,7

50

1010 mírné riziko

23. 9. 2012

0

0

0

0

0

0

14

50,4

1017,2 mírné riziko

2. 10. 2012

0

0

0

0

0

0

19,5

55

1017,8 mírné riziko

7. 10. 2012

0

0

0

0

0

0

11,2

76,5

1017,8 malé riziko

16. 10. 2012

0

0

0

0

0

0

10,5

66

1012,1 malé riziko

Tab. 1: Počet klíšťat nasbíraných v Pisárkách v roce 2012. Rozdělení na jednotlivá stádia, pozitivitu klíšťat na přítomnost spirochét, naměřenou teplotu, vlhkost, tlak a předpověď aktivity klíšťat Českého hydrometeorologického ústavu (Chmi).

Aktivita klíšťat v jednotlivých sběrech 35

31 31

30

24

25

19

20 15

11

10

6

4 00

12

10

8 4

Počet klíšťat

7 1

0

3

4 0

0 10 00 0

19.3.2012 26.3.2012 2.4.2012 9.4.2012 16.4.2012 23.4.2012 30.4.2012 7.5.2012 14.5.2012 21.5.2012 28.5.2012 4.6.2012 11.6.2012 18.6.2012 25.6.2012 2.7.2012 9.7.2012 16.7.2012 23.7.2012 30.7.2012 6.8.2012 13.8.2012 20.8.2012 27.8.2012 3.9.2012 10.9.2012 17.9.2012 24.9.2012 1.10.2012 8.10.2012 15.10.2012

5 1 000 0

1011

Graf 1: Počet klíšťat nasbíraných v jednotlivých sběrech. Graf 1 znázorňuje aktivitu klíšťat na lokalitě Pisárky během roku 2012. Můţeme zde vidět, ţe nejvyšší počet klíšťat byl zaznamenán 2. 7. a 16. 7. 2012, kdy bylo nasbíráno 31 klíšťat. Nejméně nalezených klíšťat bylo zaznamenáno 19. 3., 6. 8. a 18. 9. 2012, a to pouze 1 klíště. Ţádné klíště nebylo nalezeno 26. 3., 2. 4., 9. 4., 30. 4., 7. 5., 4. 6., 26. 8., 9. 9., 23. 9., 2. 10., 7. 10. a 16. 10. Kritickým měsícem z hlediska počtu nalezených klíšťat v jednotlivých sběrech byl červenec. 58

Počet jedinců v každém měsíci v roce 2012 120 100 80 60 40 20 0

96

27

15

počet jedinců

38 16

1

5

Měsíc sběru

Graf 2: Celkový počet nalezených jedinců v jednotlivých měsících. Graf 2 popisuje aktivitu klíšťat v kaţdém jednotlivém měsíci v roce 2012, kdy nejvyšší počet klíšťat byl nasbírán v červenci s počtem 96 jedinců. Červenec se stal nejkritičtějším měsícem i v celkovém počtu nalezených jedinců.

Zastoupení vývojových stádií v roce 2012 200

169

150 100 50

11

6

12

0 larvy

nymfy samci Jednotlivá vývojová stádia

samice

Graf 3: Zastoupení jednotlivých vývojových stádií. Graf 3 znázorňuje zastoupení vývojových stádií v roce 2012, kdy bylo nalezeno nejvíce nymf (169 jedinců), druzí byli samci (12 jedinců), samice (11 jedinců) a nejméně bylo larev 59

(6 jedinců). Z celkového počtu bylo 3,03 % larev, 85,35 % nymf, 5,56 % samců a 6,06 % samic.

35

Vývojová stádia podle sběru v roce 2012

30 25 20

Larvy

15

Nymfy

10

Samci

5

Samice

19.3.2012 26.3.2012 2.4.2012 9.4.2012 16.4.2012 23.4.2012 30.4.2012 7.5.2012 14.5.2012 21.5.2012 28.5.2012 4.6.2012 11.6.2012 18.6.2012 25.6.2012 2.7.2012 9.7.2012 16.7.2012 23.7.2012 30.7.2012 6.8.2012 13.8.2012 20.8.2012 27.8.2012 3.9.2012 10.9.2012 17.9.2012 24.9.2012 1.10.2012 8.10.2012 15.10.2012

0

Datum sběru

Graf 4: Zastoupení vývojových stádií v jednotlivých sběrech. Graf 4 znázorňuje aktivitu jednotlivých stádií v roce 2012. Počet larev se pohyboval v intervalu <0;6>, nymfy se pohybovaly v intervalu <0;169>, samci se pohybovali v rozmezí <0;11> a samice v rozmezí <0;12>.

Zastoupení jednotlivých vývojových stádií v každém měsíci v roce 2012 100

86

80 60

Larvy 34

40

Nymfy

0100

14 0 10

16 56 0

1 03

březen

duben

květen

červen červenec srpen

20

3 43

14 2 00

Samci 0410

0

Samice

září

Měsíc sběru

Graf 5: Zastoupení jednotlivých vývojových stádií v kaţdém měsíci. 60

Na grafu 5 je znázorněno zastoupení jednotlivých vývojových stádií v kaţdém měsíci v roce 2012. Ve všech měsících bylo nalezeno nejvíce nymf ve srovnání s ostatními stádii. Nejvíce nymf bylo nalezeno v červenci (86). Samců (5) a samic (6) bylo nejvíce v květnu. Nejvíce larev bylo nalezeno v červenci (3).

Závislost aktivity klíšťat na teplotě, vlhkosti a tlaku 90 80 70 60 50 40

Počet nasbíraných klíšťat

30

Teplota

20

Vlhkost

10

Tlak 19.3.2012 26.3.2012 2.4.2012 9.4.2012 16.4.2012 23.4.2012 30.4.2012 7.5.2012 14.5.2012 21.5.2012 28.5.2012 4.6.2012 11.6.2012 18.6.2012 25.6.2012 2.7.2012 9.7.2012 16.7.2012 23.7.2012 30.7.2012 6.8.2012 13.8.2012 20.8.2012 27.8.2012 3.9.2012 10.9.2012 17.9.2012 24.9.2012 1.10.2012 8.10.2012 15.10.2012

0

Datum sběru

Graf 6: Závislost aktivity klíšťat na teplotě, vlhkosti a tlaku ovzduší. Z grafu 6 lze vyčíst, ţe aktivita klíšťat je závislá na teplotě a vlhkosti ovzduší. Nejvíce aktivních klíšťat bylo v červenci, kdy teplota i vlhkost byly dostatečně vysoké. Srpen byl teplý, ale suchý měsíc a aktivita klíšťat začala klesat. V říjnu byla naopak vlhkost vysoká, ale teplota velice nízká, proto nebyla nejspíše nasbíráná ţádná klíšťata.

61

19.3.2012 žádné riziko 26.3.2012 mírné riziko 2.4.2012 mírné riziko 9.4.2012 malé riziko 16.4.2012 středně velké riziko 23.4.2012 velké riziko 30.4.2012 nejvyšší riziko 7.5.2012 nejvyšší riziko 14.5.2012 velké riziko 21.5.2012 nejvyšší riziko 28.5.2012 nejvyšší riziko 4.6.2012 velké riziko 11.6.2012 nejvyšší riziko 18.6.2012 nejvyšší riziko 25.6.2012 nejvyšší riziko 2.7.2012 velké riziko 9.7.2012 velké riziko 16.7.2012 velké riziko 26.7.2012 středně velké riziko 30.7.2012 středně velké riziko 6.8.2012 mírné riziko 13.8.2012 mírné riziko 19.8.2012 mírné riziko 26.8.2012 mírné riziko 3.9.2012 mírné riziko 9.9.2012 mírné riziko 18.9.2012 mírné riziko 23.9.2012 mírné riziko 2.10.2012 mírné riziko 7.10.2012 malé riziko 16.10.2012 malé riziko

Chmi hlášení vs. aktivita klíšťat

35

30

25

20

15

10

5

0 Aktivita klíšťat

Graf 7: Hlášení z Českého hydrometeorologického ústavu ohledně aktivity klíšťat vs.

námi nasbírané mnoţství klíšťat.

Graf 7 ukazuje, jak se aktivita klíšťat v jednotlivých sběrech v Pisárkách lišila od hlášení

Českého hydrometeorologického ústavu. Je viditelné, ţe aktivita klíšťat nebyla vţdy

v souladu s hlášením. Nejvyšší aktivita byla při hlášení velkého rizika. V době nejvyššího

rizika aktivita v Pisárkách někdy poklesla i k nule. Po hlášení úpadku rizika přes malé aţ

ţádné upadala i aktivita klíšťat v Pisárkách.

62

Promořenost klíšťat borreliemi Počet pozitivních jedinců

35 29

30

29

25

18

20 15

11

6

4 01

12

10 10

10 5

Počet negativních jedinců

24

0 1 0

0 0

8

7 4

3

0 0

2

0

7 2

1

3 01 0 0 0

4

1 0

0

0

Datum sběru

Graf 8: Pozitivita klíšťat na spirochéty v jednotlivých sběrech. Na grafu 8 je znázorněn počet klíšťat negativních i pozitivních na borrelie v jednotlivých sběrech. Nejvíce pozitivních klíšťat bylo zaznamenáno 11. 6. 2012, kdy bylo nasbíráno 7 klíšťat a z toho 3 jedinci byli pozitivní. Kritickým měsícem pro pozitivitu byl červenec, kdy bylo nasbíráno 5 nakaţených jedinců.

Pozitivita klíšťat vyjádřená v procentech % pozitivních jedinců

10% 7,90%

8%

5,20%

6% 3,70%

4% 2% 0%

0%

březen

duben

0%

0%

srpen

září

0% květen

červen červenec Měsíc sběru

Graf 9: Pozitivita klíšťat na spirochéty v jednotlivých měsících. 63

Graf 9 popisuje pozitivitu klíšťat na borrelie vyjádřenou v %. Nejvyšší pozitivita klíšťat byla v měsíci červnu (7,90 %). Nejniţší pozitivita byla pak v měsíci květnu s hodnotou 3,70 %. Ţádné pozitivní klíště nebylo nalezeno v březnu, dubnu, srpnu a září. Nejkritičtější

Počet pozitivních jedinců různých stádií

měsíc z procentuálního hlediska byl červen.

Porovnávání pozitivity jednotlivých vývojových stádií 9

10 8 6 4 2 0

0

0

samci

samice

0 larvy

nymfy

Vývojová stádia

Graf 10: Porovnání pozitivity jednotlivých vývojových stádií. Z grafu 10 je zřetelné, ţe celkový počet pozitivních klíšťat byl 9. Všechna pozitivní klíšťata byla ve stádiu nymfy.

6. 2. Výsledky metody vlajkování a DFM na lokalitě Ruda Na lokalitě Ruda probíhalo vlajkování jednou za 14 dní po dobu 60 minut. Sběry byly prováděny od 26. 3. 2012 do 2. 12. 2012. Na lokalitě Ruda bylo nalezeno 321 klíšťat. Pozitivních jedinců bylo 42 a celková pozitivita byla 9,35 %. Larev bylo 64 z toho 3 pozitivní, nymf 236 a 26 pozitivních, samců 14 a 12 pozitivních, samic 7 a jedna pozitivní.

Datum

Počet

Pozitivní

klíšťat

jedinci

Larvy

Nymfy

Samci

Teplota (°C) Vlhkost (%) Tlak (hPa)

Samice

Chmi hlášení

26. 3. 2012

9

0

0

7

1

1

19,4

13,7

1030,6 mírné riziko

9. 4. 2012

11

0

0

10

1

0

11,2

24,4

1013,3 malé riziko

23. 4. 2012

57

0

2

49

5

1

16,4

33,4

1006,4 velké riziko

64

7. 5. 2012

40

2

2

35

1

2

21

47

1016,9 nejvyšší riziko

21. 5. 2012

35

5

5

29

0

1

17,6

37,7

1014,6 nejvyšší riziko

4. 6. 2012

59

5

26

29

3

1

25

44,5

1007,8 velké riziko

18. 6. 2012

17

1

7

9

1

0

30,5

36,1

2. 7. 2012

18

6

1

16

1

0

28,9

57,2

1014,2 velké riziko

16. 7. 2012

36

4

16

19

0

1

20

70

1013,4 velké riziko

30. 7. 2012

25

6

4

20

1

0

21

54

1018,3 středně velké riziko

16. 8. 2012

2

0

0

2

0

0

19,9

47

1014,8 mírné riziko

26. 8. 2012

2

0

0

2

0

0

22,1

65

1012,8 mírné riziko

9. 9. 2012

2

0

0

2

0

0

23,8

49

1019,1 mírné riziko

23. 9. 2012

4

0

1

3

0

0

13,6

49

1017,2 mírné riziko

7. 10. 2012

0

0

0

0

0

0

11,7

77

1017,8 malé riziko

21. 10. 2012

2

1

0

2

0

0

16,7

62

1021,2 malé riziko

4. 11. 2012

2

0

0

2

0

0

10,7

56

1003 malé riziko

17. 11. 2012

0

0

0

0

0

0

5,8

51

1016,7 malé riziko

2. 12. 2012

0

0

0

0

0

0

-0,3

43

1011,7 ţádné

1019 nejvyšší riziko

Tab 2: Počet klíšťat nasbíraných na lokalitě Ruda v roce 2012. Rozdělení na jednotlivá stádia, pozitivitu klíšťat na přítomnost spirochét, naměřenou teplotu, vlhkost, tlak a předpověď aktivity klíšťat Českého hydrometeorologického ústavu (Chmi).

Aktivita klíšťat v jednotlivých sběrech 70 50

40

40

10

36

35

25

30 20

59

57

60

9 11

17 18

Počet klíšťat 2 2 2 4 0 2 2 0 0

26.3.2012 9.4.2012 23.4.2012 7.5.2012 21.5.2012 4.6.2012 18.6.2012 2.7.2012 16.7.2012 30.7.2012 13.8.2012 27.8.2012 10.9.2012 24.9.2012 8.10.2012 22.10.2012 5.11.2012 19.11.2012

0

Graf 11: Počet klíšťat nasbíraných v jednotlivých sběrech. Graf 11 znázorňuje aktivitu klíšťat na lokalitě Ruda během roku 2012. Můţeme zde vidět, ţe nejvyšší počet klíšťat byl zaznamenán 4. 6. 2012, kdy bylo nasbíráno 59 klíšťat. Nejméně nalezených klíšťat bylo zaznamenáno 16. 8., 26. 8., 9. 9., 21. 10. a 4. 11. 2012, a to 2 klíšťata. 65

Ţádné klíště nebylo nalezeno 7. 10., 17. 11. a 2. 12. Kritickým měsícem z hlediska počtu nalezených klíšťat v jednotlivých sběrech byl červen.

Počet jedinců 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

75

68

76

79

9

4

6

Počet jedinců 2

2

Měsíc sběru

Graf 12: Celkový počet nalezených jedinců v jednotlivých měsících. Graf 12 popisuje aktivitu klíšťat v kaţdém jednotlivém měsíci v roce 2012, kdy nejvyšší počet klíšťat byl nasbírán v červenci s počtem 79 jedinců. Červenec se stal nejkritičtějším měsícem v celkovém počtu nalezených jedinců.

Zastoupení vývojových stádií v roce 2012 236

250 200 150 100

64

50

14

7

Samci

Samice

0 Larvy

Nymfy

Jednotlivá vývojová stádia

Graf 13: Zastoupení jednotlivých vývojových stádií. 66

Graf 13 znázorňuje zastoupení vývojových stádií v roce 2012, kdy bylo nalezeno nejvíce nymf (236 jedinců), larvy (64 jedinců), samci (14 jedinců) a nejméně bylo samic (7 jedinců). Z celkového počtu bylo 19,94 % larev, 73,52 % nymf, 4,36 % samců a 2,18 % samic.

Vývojová stádia podle sběru v roce 2012 60 50 40 30

Larvy

20

Nymfy Samci

0

Samice

26.3.2012 2.4.2012 9.4.2012 16.4.2012 23.4.2012 30.4.2012 7.5.2012 14.5.2012 21.5.2012 28.5.2012 4.6.2012 11.6.2012 18.6.2012 25.6.2012 2.7.2012 9.7.2012 16.7.2012 23.7.2012 30.7.2012 6.8.2012 13.8.2012 20.8.2012 27.8.2012 3.9.2012 10.9.2012 17.9.2012 24.9.2012 1.10.2012 8.10.2012 15.10.2012 22.10.2012 29.10.2012 5.11.2012 12.11.2012 19.11.2012 26.11.2012

10

Datum sběru

Graf 14: Zastoupení vývojových stádií v jednotlivých sběrech. Graf 14 znázorňuje aktivitu jednotlivých stádií v roce 2012. Počet larev se pohyboval v intervalu <0;64>, nymfy se pohybovaly v intervalu <0;236>, samci se pohybovali v rozmezí <0;14> a samice v rozmezí <0;7>.

67

Zastoupení jednotlivých vývojových stádií v každém měsíci v roce 2012 70 60 50 40 30 20 10 0

64

59

55 38 33

Larvy

21 7 6 7 3 1 0 11 2 1

Nymfy

21 0400 1500 0200 0200

41

Samci Samice

Měsíc sběru

Graf 15: Zastoupení jednotlivých vývojových stádií v kaţdém měsíci. Na grafu 15 je znázorněno zastoupení jednotlivých vývojových stádií v kaţdém měsíci v roce 2012. Ve všech měsících, stejně jako na lokalitě Pisárky, bylo nalezeno nejvíce nymf ve srovnání s ostatními stádii. Nejvíce nymf bylo nalezeno v květnu (64). Larev bylo nejvíce v červnu (33). Samců bylo nejvíce v dubnu (6) a samic bylo nejvíce v květnu (3).

Závislost aktivity klíšťat na teplotě, vlhkosti a tlaku

Počet klíšťat Teplota 19.11.2012

5.11.2012

22.10.2012

8.10.2012

24.9.2012

10.9.2012

27.8.2012

13.8.2012

30.7.2012

16.7.2012

2.7.2012

4.6.2012

18.6.2012

21.5.2012

7.5.2012

9.4.2012

23.4.2012

Vlhkost 26.3.2012

90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 -10

Tlak

Datum sběru

Graf 16: Závislost aktivity klíšťat na teplotě, vlhkosti a tlaku ovzduší.

68

Z grafu 16 lze vyčíst, ţe aktivita klíšťat je závislá na teplotě a vlhkosti ovzduší. Nejvíce aktivních klíšťat bylo v dubnu a květnu, kdy teplota i vlhkost stoupaly. Koncem června vlhkost poklesla a s ní i počet klíšťat. V červenci opět došlo k nárůstu vlkosti i teploty a s nimi vzrostla i aktivita klíšťat. Na začátku srpna byla lokalita Ruda vystavena prudkému děšti a půda byla splavena z kopce dolů. Po této události počet klíšťat na této lokalitě nepřesáhl hodnotu 4 jedinců. Poslední jedinci byli nalzeni v listopadu. Po té teplota i vlhkost začaly prudce klesat a aktivita klíšťat ustala.

Chmi hlášení vs. aktivita klíšťat 70 60 50 40 30 20 10

2.12.2012 žádné riziko

17.11.2012 malé riziko

4.11.2012 malé riziko

21.10.2012 malé riziko

7.10.2012 malé riziko

23.9.2012 mírné riziko

9.9.2012 mírné riziko

26.8.2012 mírné riziko

16.8.2012 mírné riziko

16.7.2012 velké riziko

2.7.2012 velké riziko

18.6.2012 nejvyšší riziko

4.6.2012 velké riziko

21.5.2012 nejvyšší riziko

7.5.2012 nejvyšší riziko

23.4.2012 velké riziko

9.4.2012 malé riziko

26.3.2012 mírné riziko

30.7.2012 středn velké…

Aktivita klíšťat

0

Graf 17: Hlášení z Českého hydrometeorologického ústavu ohledně aktivity klíšťat vs. námi nasbírané mnoţství klíšťat. Graf 17 ukazuje, jak se aktivita klíšťat v jednotlivých sběrech na lokalitě Ruda lišila od hlášení Českého hydrometeorologického ústavu. Na lokalitě Ruda byly částečně pozorovány odchylky od hlášení Chmi. Jen při hlášení nejvyššího rizika nám vţdy počet klíšťat klesl. Při hlášeném poklesu středně velkého, mírného, malého a ţádného rizika klesala i aktivita klíšťat na lokalitě Ruda.

69

Promořenost klíšťat borreliemi 57

60

54

50 38

40

32

30 30

7.5.2012

1

4

6

02 02

Počet negativních jedinců

02

4 0

0

1

02

0 19.11.2012

23.4.2012

5

5.11.2012

9.4.2012

5

22.10.2012

2

8.10.2012

0

24.9.2012

0

10.9.2012

0

Počet pozitivních jedinců

30.7.2012

11

26.3.2012

10

9

19 12 6

16.7.2012

16

20

0

27.8.2012

13.8.2012

2.7.2012

18.6.2012

21.5.2012

4.6.2012

0

Datum sběru

Graf 18: Pozitivita klíšťat na přítomnost spirochét v jednotlivých sběrech. Na grafu 18 je znázorněn počet klíšťat negativních i pozitivních v jednotlivých sběrech. Nejvíce pozitivních klíšťat bylo zaznamenáno 2. 7. 2012 a 30. 7. 2012, kdy bylo pozitivních 6 jedinců. Kritickým měsícem pro pozitivitu byl červenec, kdy bylo nalezeno celkem 16 pozitivních jedinců.

% pozitivních jedinců

Pozitivita klíšťat vyjádřená v procentech 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%

50%

20,25% 9,33% 7,89% 0%

0%

0%

0%

0%

Měsíc sběru

Graf 19: Pozitivita klíšťat na spirochéty v jednotlivých měsících.

70

Graf 19 popisuje pozitivitu klíšťat vyjádřenou v %. Nejvyšší pozitivita klíšťat byla v říjnu (50 %), důvodem je to, ţe ze dvou odchycených klíšťat bylo jedno pozitivní. Nejniţší pozitivita byla pak v měsíci červnu s hodnotou 7,89 %. Ţádné pozitivní klíště nebylo nalezeno

Počet pozitivních jedinců různých stádií

v březnu, dubnu, srpnu, září a listopadu.

Porovnávání pozitivity jednotlivých vývojových stádií 30

26

25 20 15

12

10 5

3

1

0 Larvy

Nymfy

Samci

Samice

Vývojová stádia

Graf 20: Porovnání pozitivity jednotlivých vývojových stádií. Z grafu 20 lze vyčíst, ţe celkový počet pozitivních klíšťat byl 42. Nejvíce pozitivních jedinců bylo ve stádiu nymfy (26). Dále zde bylo vysoké mnoţství pozitivních samců (12), larev (3). Nejméně pozitivní byly samice, pouze jedna. Při pozorování tělesného obsahu klíšťat nebyly nalezeny pouze spirochéty, ale i prvoci. Prvoci byli předběţně určeni panem docentem Janem Votýpkou z parazitologického ústavu v Českých Budějovicích jako ptačí trypanosomy. Zde se snaţí i prvoky blíţe určit pomocí metody PCR. Zatím bohuţel bezvýsledku. Prvoci byli nacházeni u klíšťat, která měla vysoké mnoţství borrelií. Fotografie mají zvětšení 100 x 10.

71

Obr. 45: Prvoci v klíšťatech

Obr. 46: Prvok s boreliemi (Foto V. Nesnídalová)

(Foto V. Nesnídalová)

6. 3. Vliv vybraných vonných kosmetických přípravků na klíšťata (Ixodes ricinus)

6. 3. 1. Toaletní voda Avon Summer White

6. 3. 1. 1. Vertikální testy Test s toaletní vodou Kontrola Avon Summer White Neodpuzeno Odpuzeno Neaktivní na po hranici kontaktu 4 39 5 2 50 8% 78 % 10 % 4% 100 % Tab. 3: Vliv toaletní vody Avon Summer White na chování klíšťat, vertikální testy. K testování toaletní vody bylo pouţito 50 aktivních jedinců. I kdyţ byl test s toaletní vodou proveden pouze s klíšťaty, která v kontrolním experimentu prokázala aktivitu, během vlastního testu zůstali 2 jedinci neaktivní. 4 jedinci nebyli odpuzeni, 39 jedinců bylo odpuzeno na hranici mezi přípravkem ošetřenou a neošetřenou plochou a 5 jedinců bylo odpuzeno aţ po kontaktu s toaletní vodou.

72

Vliv toaletní vody Avon Summer White metodou vertikálních testů 120%

100%

100%

88%

80% 60% 40% 20%

8%

2%

0% Kontrola

Odpuzení jedinci

Neodpuzení jedinci

Neaktivní jedinci

Graf 21: Vliv toaletní vody Avon Summer White na chování klíšťat, testováno metodou vertikálních testů. Toaletní voda Avon Summer White měla odpuzující účinky. Odpuzeno bylo 88 % jedinců a 8 % jedinců odpuzeno nebylo, 2 % jedinců byla neaktivních.

6. 3. 1. 2. MO – bioassay Test s toaletní voda Avon Kontrola Summer White Neodpuzeno Odpuzeno Neaktivní na hranici po kontaktu 3 40 3 4 50 6% 80 % 6% 8% 100 % Tab. 4: Vliv toaletní vody Avon Summer White na chování klíšťat, metoda MO bioassay. K testování toaletní vody bylo pouţito 50 aktivních jedinců. I kdyţ byl test s toaletní vodou proveden pouze s klíšťaty, která v kontrolním experimentu prokázala aktivitu, během vlastního testu zůstali 4 jedinci neaktivní. 3 jedinci nebyli odpuzeni, 40 jedinců bylo odpuzeno na hranici přípravkem ošetřenou plochou a 3 jedinci byli odpuzeni aţ po kontaktu s toaletní vodou.

73

Vliv toaletní vody Avon Summer White metodou MO - bioassay 120%

100%

100%

86%

80% 60% 40% 20%

6%

8%

Neodpuzení jedinci

Neaktivní jedinci

0% Kontrola

Odpuzení jedinci

Graf 22: Vliv toaletní vody Avon Summer White na chování klíšťat, testováno metodou MO – bioassay. Toaletní voda Avon Summer White měla odpuzující účinky. Odpuzeno bylo 86 % jedinců a 6 % jedinců odpuzeno nebylo, 8 % zůstalo neaktivních.

6. 3. 1. 3. Porovnání vlivu toaletní vody Avon Summer White na chování klíšťat

Vliv toaletní vody na chování klíšťat 100%

88%

86%

80% 60%

Odpuzení jedinci Neodpuzení jedinci

40%

Neaktivní jedinci 20%

8%

4%

6% 8%

Vertikální testy

MO - bioassay

0%

Graf 23: Vliv toaletní vody Avon Summer White na chování klíšťat 74

Při pouţití toaletní vody Avon Summer White 88 % jedinců bylo odpuzeno při pouţití vertikálních testů a 86 % jedinců při pouţití metody MO – bioassay. U vertikálních testů nebylo odpuzeno 8 % jedinců a 6 % jedinců nebylo odpuzeno u metody MO – bioassay. Neaktivních jedinců bylo u vertikálních testů 4 % a u MO – bioassay 8 %.

6. 3. 2. Toaletní voda Enigma Dare to Dream

6. 3. 2. 1. Vertikální testy Test s toaletní vodou Enigma Dare to Kontrola Dream Neodpuzeno Odpuzeno Neaktivní na po hranici kontaktu 0 47 2 1 50 0% 94 % 4% 2% 100 % Tab. 5: Vliv toaletní vody Enigma Dare to Dream na chování klíšťat, vertikální testy. K testování toaletní vody bylo pouţito 50 aktivních jedinců. I kdyţ byl test s toaletní vodou proveden pouze s klíšťaty, která v kontrolním experimentu prokázala aktivitu, během vlastního testu zůstal 1 jedinec neaktivní. Ţádný jedinec nebyl neodpuzen, 47 jedinců bylo odpuzeno na hranici mezi přípravkem ošetřenou a neošetřenou plochou a 2 jedinci byli odpuzeni aţ po kontaktu s toaletní vodou.

75

Vliv toaletní vody Enigma Dare to Dream metodou vertikálních testů 120%

100%

100%

98%

80% 60% 40% 20%

0%

2%

Neodpuzení jedinci

Neaktivní jedinci

0% Kontrola

Odpuzení jedinci

Graf 24: Vliv toaletní vody Enigma Dare to Dream na chování klíšťat, testováno metodou vertikálních testů. Toaletní voda Enigma Dare to Dream měla odpuzující účinky. Odpuzeno bylo 98 % jedinců, ţádný jedinec se nepřesunul na ošetřenou plochu a 2 % jedinců nebyla aktivních.

6. 3. 2. 2. MO – bioassay Test s toaletní vodou Kontrola Enigma Dare to Dream Neodpuzeno Odpuzeno Neaktivní na hranici po kontaktu 2 40 1 7 50 4% 80 % 2% 14 % 100 % Tab. 6: Vliv toaletní vody Enigma Dare to Dream na chování klíšťat, MO - bioassay. K testování toaletní vody bylo pouţito 50 aktivních jedinců. I kdyţ byl test s toaletní vodou proveden pouze s klíšťaty, která v kontrolním experimentu prokázala aktivitu, během vlastního testu zůstalo 7 jedinců neaktivních. 2 jedinci nebyli odpuzeni, 40 jedinců bylo odpuzeno na hranici přípravkem ošetřenou plochou a 1 jedinec byl odpuzen aţ po kontaktu s toaletní vodou.

76

Vliv toaletní vody Enigma Dare to Dream metodou MO - bioassay 120%

100%

100%

82%

80% 60% 40% 20%

14%

4%

0% Kontrola

Odpuzení jedinci

Neodpuzení jedinci

Neaktivní jedinci

Graf 25: Vliv toaletní vody Enigma Dare to Dream na chování klíšťat, testováno metodou MO – bioassay. Toaletní voda Enigma Dare to Dream měla odpuzující účinky. Odpuzeno bylo 82 % jedinců a 4 % jedinců odpuzena nebyla, 14 % jedinců nebylo aktivních.

6. 3. 2. 3. Porovnání vlivu toaletní vody Enigma Dare to Dream na chování klíšťat

Vliv toaletní vody na chování klíšťat 110% 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%

98% 82% Odpuzení jedinci Neodpuzení jedinci Neaktivní jedinci 14% 4%

0% 2% Vertikální testy

MO - bioassay

Graf 26: Vliv toaletní vody Enigma Dare to Dream na chování klíšťat.

77

Při pouţití toaletní vody Enigma Dare to Dream 98 % jedinců bylo odpuzeno při pouţití vertikálních testů a 82 % jedinců při pouţití metody MO – bioassay. U vertikálních testů nebylo odpuzeno 0 % jedinců a 4 % jedinců nebyla odpuzena u metody MO – bioassay. Neaktivních jedinců bylo u vertikálních testů 2 % a u MO – bioassay 14 %.

6. 3. 3. Srovnání vlivu toaletní vody na chování klíšťat

6. 3. 3. 1. Vertikální testy Enigma Dare to Avon Summer White Dream Neodpuzeno

4 8% 44 88 % 2 4%

Odpuzeno Neaktivní

0 0% 49 98 % 1 2%

Tab. 7: Výsledky vlivu toaletní vody na chování klíšťat metodou vertikálních testů Toaletní voda Avon Summer White odpudila 44 klíšťat z 50 (88 %), neodpudila 4 klíšťata (8 %) a 2 (4 %) klíšťata byla neaktivní. Toaletní voda Enigma Dare to Dream odpudila 49 klíšťat z 50 (98 %), neodpudila 0 % klíšťat a neaktivní bylo 1 klíště (2 %).

Porovnání vlivu toaletní vody na chování klíšťat 120% 100%

98%

88%

80%

Odpuzení jedinci

60%

Neodpuzení jedinci

40% 20%

Neaktivní jedinci 8%

4%

0%

2%

0% Avon Summer White

Enigma Dare to Dream

Graf 27: Porovnání vlivu toaletní vody na chování klíšťat metodou vertikálních testů. 78

Toaletní voda Avon Summer White měla méně odpuzených klíšťat a více neodpuzených neţ toaletní voda Enigma Dare to Dream, která všechna aktivní klíšťata odpudila. U toaletní vody Avon Summer White byla 4 % jedinců neaktivních a u toaletní vody Enigma Dare to Dream byla 2 % jedinců neaktivních.

Porovnání způsobu repelence 60 50 40

2 5 Odpuzena po kontaktu

30 20

Odpuzena na hranice

47

39

10 0 Avon Summer White

Enigma Dare to Dream

Graf 28: Porovnání způsobů repelence u toaletní vody metodou vertikálních testů. Toaletní voda Avon Summer White odpudila na hranici mezi přípravkem ošetřenou a neošetřenou plochou 39 klíšťat a 5 klíšťat bylo odpuzeno aţ po kontaktu s toaletní vodou. Toaletní voda Enigma Dare to Dream odpudila 47 klíšťat na hranici mezi přípravkem ošetřenou a neošetřenou plochou a 2 klíšťata byla odpuzena po kontaktu.

6. 3. 3. 2. MO – bioassay Avon Summer White Neodpuzeno Odpuzeno Neaktivní

Enigma Dare to Dream 3 6% 43 86 % 4 8%

2 4% 41 82 % 7 14 %

Tab. 8: Výsledky vlivu toaletní vody na chování klíšťat metodou MO - bioassay 79

Toaletní voda Avon Summer White odpudila 43 klíšťat z 50 (86 %), neodpudila 3 klíšťata (6 %) a 4 klíšťata (8 %) byla neaktivní. Toaletní voda Enigma Dare to Dream odpudila 41 klíšťat z 50 (82 %), neodpudila 2 klíšťata (4 %) a neaktivních bylo 7 klíšťat (14 %).

Porovnání vlivu toaletní vody na chování klíšťat 100%

86%

82%

80% 60%

Odpuzení jedinci Neodpuzení jedinci

40%

Neaktivní jedinci 20%

6%

14%

8%

4%

0% Avon Summer White

Enigma Dare to Dream

Graf 29: Porovnání vlivu toaletní vody na chování klíšťat metodou MO – bioassay. Toaletní voda Avon Summer White měla více odpuzených klíšťat, ale i více neodpuzených neţ toaletní voda Enigma Dare to Dream. Neaktivních jedinců bylo u toaletní vody Avon Summer White 8 % a 14 % u toaletní vody Enigma Dare to Dream.

Porovnání způsobu repelence 50 40

3

1

30 40

40

20

Odpuzena po kontaktu Odpuzena na hranici

10 Avon Summer White

Enigma Dare to Dream

Graf 30: Porovnání způsobů repelence u toaletní vody metodou MO – bioassay. 80

Toaletní voda Avon Summer White odpudila na hranici přípravkem ošetřenou plochou 40 klíšťat a 3 klíšťata byla odpuzena aţ po kontaktu s toaletní vodou. Toaletní voda Enigma Dare to Dream odpudila také 40 klíšťat na hranici přípravkem ošetřenou plochou a pouze jedno bylo odpuzeno po kontaktu.

6. 3. 4. Celkové srovnání vlivu toaletní vody na chování klíšťat

Srovnání odpuzujících účinků v obou testech 110% 98%

100% 90%

86%

88% 82% MO - bioassay

80%

Vertikální testy

70% 60% 50% Avon Summer White

Enigma Dare to Dream

Graf 31: Porovnání vlivu obou toaletních vod na chování klíšťat. Toaletní voda Avon Summer White měla vyšší odpuzující účinek ve vertikálním testu stejně jako toaletní voda Enigma Dare to Dream. Toaletní voda Enigma Dare to Dream měla vyšší odpuzující účinky neţ toaletní voda Avon Summer White ve vertikálním testu, ale ne v MO – bioassay.

6. 4. Preference krevních skupin klíšťaty Testováno bylo 100 jedinců, kteří byli uznáni jako aktivní, pokud měli tendenci pohybovat se po Petriho misce. Petriho miska byla vţdy při testech zakrytá.

81

Preference krevních skupin v t=0 40% 35% 30% 25% 20% 15% 10% 5% 0%

36% 32%

17%

15%

A

B

AB

0

Graf 32: Preference krevních skupin klíštětem. Jako první krevní skupina, na kterou klíště vstoupilo, byla krevní skupina A (36 %), za ní byla krevní skupina 0 (32 %) a AB (17 %). Nejméně klíšťat si jako počáteční skupinu vybralo B (15 %).

Preference krevních skupin v t=1 min.

40% 35%

34%

30% 24%

25%

24%

20% 14%

15% 10%

4%

5% 0% A

B

AB

0

Petriho miska

Graf 33: Preference krevních skupin klíštětem po 1 minutě. Po jedné minutě byla opět nejpreferovanější krevní skupina A (34 %). Jako druhá nejoblíbenější byla 0 s AB (24 %). Skupina B byla znovu nejméně preferovanou krevní skupinou (14 %). 4 % klíšťat byla mimo testované krevní skupiny a šplhala po svrchní Petriho misce.

82

Preference krevních skupin v t=2 min. 35% 29%

30%

26% 23%

25% 20% 15%

12%

10%

10% 5% 0% A

B

AB

0

Petriho miska

Graf 34: Preference krevních skupin klíštětem po 2 minutách. Po dvou minutách byla i po třetí nejpreferovanější krevní skupina A (26 %). Jako druhá nejoblíbenější byla AB (26 %), dále krevní skupina 0 (23 %). Skupina B byla nejméně oblíbenou krevní skupinou (12 %). 10 % klíšťat bylo mimo testované krevní skupiny.

Změna preference krevních skupin v čase 40% 35%

36% 34% 32% 29%

30%

26% 24%

25%

24% 23% t=0

20%

17%

t=1 min

15% 14% 12%

15%

t=2 min. 10%

10% 4%

5% 0% A

B

AB

0

Graf 35: Změna preference krevních skupin v čase.

83

Petriho miska

Preference krevní skupiny A mírně s časem klesala. Krevní skupina B se stále drţela nad 10 %. Preference krevní skupiny AB, jako jediné, časem stoupala. Krevní skupina 0 měla po počáteční době velký pokles a po 1 a 2 minutách její obliba klesala. Na vrchní Petriho misku přelézali zejména samci, které krev téměř nelákala.

Průměr preference krevních skupin 35%

33%

30%

26%

25%

22%

20% 14%

15% 10% 5% 0% A

B

AB

0

Graf 36: Průměr preference krevních skupin. Po zprůměrování vyšla jako nejpreferovanější skupina A, druhá byla krevní skupina 0, třetí nejpreferovanější skupinou byla skupina AB a nejméně preferovaná skupina byla B.

84

7. Statistické vyhodnocení výsledků Analýza dat byla provedena softwarem STATISTICA 10. Pouţité testy: One – way ANOVA, Chí kvadrát, X2 pozorované vs. očekáváné.

7. 1. Statistické vyhodnocení aktivity klíšťat Lokalita Pisárky A, Průměrný počet klíšťat na lokalitě Pisárky v jednotlivých měsících: Pouţitý test: One – way ANOVA (analysis of variance) Testuje nulovou hypotézu H0 proti alternativní hypotéze H1. Zvolená hladina významnosti α = 0,05. H0: Počet klíšťat v každém měsíci se neliší. H1: Počet klíšťat je v každém měsíci odlišný. Efekt Měsíc Chyba

SČ

Stupně volnosti PČ

1009,046

5

201,809

1151,300

20

57,565

F

p

3,50576 0,019455

Tab. 9: Jednorozměrný test významnosti pro počet klíšťat Pokud hodnota p je značena červenou barvou zamítáme nulovou hypotézu. Počet klíšťat v kaţdém měsíci se statisticky liší.

Průměr počtu klíšťat

Měsíc

Homogenní skupiny

9

1,25

****

4

3

****

8

4

****

5

6,75

****

6

9,5

****

7

19,2

**** ****

Tab. 10: Fisherův LSD test ukazující homogenní skupiny 85

Fisherův LSD test ukázal konkrétní rozdíly mezi měsíci, kdy byl nasbírán určitý počet klíšťat. Od ostatních měsíců, kromě června, se statisticky liší červenec v počtu nasbíraných klíšťat. B, Aktivita klíšťat na lokalitě Pisárky: Pouţitý test: Test dobré shody (chí – kvadrát) H0: Zastoupení vývojových stádií se neliší. H1: Zastoupení vývojových stádií se liší.

Stádium nymfy samci samice

pozorované očekávané 169 96 11 48 12 48

Tab. 11: Uvedené hodnoty pro výpočet chí – kvadrátu

n = 192 α = 0,05 F krit. pro (n-1 = 2) = 5,991 X2 = (169 – 96)2 / 96 + (11 – 48)2 / 48 + (12 – 48)2 / 48 = 55,5 + 28,5 + 27 = 111 X² > F krit. 111 > 5,991 → zamítáme nulovou hypotézu na hladině významnosti α = 0,05 Aktivita jednotlivých vývojových stádií se statisticky významně liší.

Lokalita Ruda A, Průměrný počet klíšťat na lokalitě Ruda v jednotlivých měsících: Pouţitý test: One – way ANOVA (analysis of variance) Testuje nulovou hypotézu H0 proti alternativní hypotéze H1. Zvolená hladina významnosti 86

α = 0,05. H0: Počet klíšťat v každém měsíci se neliší. H1: Počet klíšťat je v každém měsíci odlišný.

Efekt Měsíc Chyba

Stupně volnosti

SČ 4329, 920

PČ

1

1151,300

F 4329,920

20

p 18,35432

0,002037

57,565

Tab. 12: Jednorozměrný test významnosti pro počet klíšťat Hodnota p je značena červenou barvou, zamítáme nulovou hypotézu. Počet klíšťat v kaţdém měsíci se statisticky liší.

Měsíc

Průměr počtu klíšťat

Homogenní skupiny

10

1,00000

****

11

1,00000

****

8

2,00000

****

9

3,00000

****

****

7

26,33333

****

****

****

4

34,00000

****

****

****

5

37,50000

****

****

6

38,00000

****

Tab. 13: Fisherův LSD test ukazující homogenní skupiny Fisherův LSD test ukázal konkrétní rozdíly mezi měsíci, kdy byl nasbírán určitý počet klíšťat. Duben, červen, červenec, srpen, září a říjen se počtem klíšťat od sebe statisticky neliší. Dále se statisticky neliší mezi sebou duben, květen, červenec a září. Ani duben, květen, červen a červenec se v počtu klíšťat od sebe statisticky neliší. B, Aktivita klíšťat na lokalitě Ruda: Pouţitý test: Test dobré shody (chí – kvadrát) H0: Zastoupení vývojových stádií se neliší. H1: Zastoupení vývojových stádií se liší. 87

Stádium nymfy samci samice

pozorované očekávané 236 129 14 64 7 64

Tab. 14: Uvedené hodnoty pro výpočet chí – kvadrátu

n = 192 α = 0,05 F krit. pro (n-1 = 2) = 5,991 X2 = (236 – 129)2 / 129 + (14 – 64)2 / 64 + (7 – 64)2 / 64 = 88,8 + 39,1 + 50,8 = 178,7 X² > F krit. 178,7 > 5,991 → zamítáme nulovou hypotézu na hladině významnosti α = 0,05 Aktivita jednotlivých vývojových stádií se statisticky významně liší.

7. 2. Statistické vyhodnocení vlivu toaletní vody na chování klíšťat Pouţitý test: Chí – kvadrát – test maximální věrohodnosti (Chí kvadrát v programu STATISTICA 10) Testuje uvedenou testovou hypotézu H0 proti alternativě H1. Vypočtená testová statistika se porovná s kritickou hodnotou rozdělení x². Pro hladinu významnosti 5 % je α = 0,05. A, Avon Summer White H0: Použití toaletní vody nemá vliv na chování klíšťat k hostiteli. H1: Použití toaletní vody má vliv na chování klíšťat k hostiteli.

chí kvadrát = 12 400,500

p = 0,0000

Tabulka 15: Výstup z programu STATISTICA 10, chí - kvadrát

p=0 α = 0,05 p < α => existuje statisticky významný rozdíl. 88

Na základě výpočtu hodnoty p = 0 zamítáme H0 na hladině významnosti α = 0,05. Pouţití toaletní vody má vliv na chování klíšťat k hostiteli.

B, Enigma Dare to Dream H0: Použití toaletní vody nemá vliv na chování klíšťat k hostiteli. H1: Použití toaletní vody má vliv na chování klíšťat k hostiteli.

chí kvadrát = 760, 500

p = 0,0000

Tabulka 16: Výstup z programu STATISTICA 10, chí - kvadrát

p=0 α = 0,05 p < α => existuje statisticky významný rozdíl. Na základě výpočtu hodnoty p = 0 zamítáme H0 na hladině významnosti α = 0,05. Pouţití toaletní vody má vliv na chování klíšťat k hostiteli. C, Srovnání vlivu toaletních vod na chování klíšťat metodou vertikálních testů. H0: Mezi vlivem jednotlivých toaletních vod na chování klíšťat není statisticky významný rozdíl. H1: Existuje statisticky významný rozdíl mezi vlivem jednotlivých toaletních vod na chování klíšťat.

chí kvadrát = 0,740

p = 0,3897

Tabulka 17: Výstup z programu STATISTICA 10, chí - kvadrát

p = 0, 3897 α = 0,05 p > α => neexistuje statisticky významný rozdíl. Na základě výpočtu hodnoty p = 0,3897 nezamítáme H0 na hladině významnosti α = 0,05. 89

Mezi vlivem toaletních vod na chování klíšťat není statisticky významný rozdíl. D, Srovnání vlivu toaletních vod na chování klíšťat metodou MO - bioassay. H0: Mezi vlivem jednotlivých toaletních vod na chování klíšťat není statisticky významný rozdíl. H1: Existuje statisticky významný rozdíl mezi vlivem jednotlivých toaletních vod na chování klíšťat.

chí kvadrát = 2,600

p = 0,1069

Tabulka 18: Výstup z programu STATISTICA 10, chí - kvadrát

p = 0,1069 α = 0,05 p > α => neexistuje statisticky významný rozdíl. Na základě výpočtu hodnoty p = 0,1069 nezamítáme H0 na hladině významnosti α = 0,05. Mezi vlivem toaletních vod na chování klíšťat není statisticky významný rozdíl.

7. 3. Statistické vyhodnocení preference krevních skupin Pouţitý test: Chí – kvadrát – test maximální věrohodnosti (Chí kvadrát v programu STATISTICA 10) Testuje uvedenou testovou hypotézu H0 proti alternativě H1. Vypočtená testová statistika se porovná s kritickou hodnotou rozdělení x². Pro hladinu významnosti 5 % je α = 0,05.

A, Krevní skupina A Vliv krevní skupiny A na chování klíšťat H0: Krevní skupina nemá vliv na chování klíšťat k hostiteli. H1: Krevní skupina má vliv na chování klíšťat k hostiteli.

90

chí kvadrát = 134,93

p = 0,0000

Tabulka 19: Výstup z programu STATISTICA 10, chí - kvadrát

p=0 α = 0,05 p < α => existuje statisticky významný rozdíl. Na základě výpočtu hodnoty p = 0 zamítáme H0 na hladině významnosti α = 0,05. Krevní skupina A má vliv na chování klíšťat k hostiteli. Pokles preference krevní skupiny A v čase H0: Preference krevní skupiny v čase se statisticky neliší. H1: Preference krevní skupiny v čase se statisticky liší.

chí kvadrát = 134,93

p = 0,01278

Tabulka 20: Výstup z programu STATISTICA 10, chí - kvadrát

p = 0,01278 α = 0,05 p < α => existuje statisticky významný rozdíl. Na základě výpočtu hodnoty p = 0,01278 zamítáme H0 na hladině významnosti α = 0,05. Preference krevní skupiny A se v čase statisticky liší.

B, Krevní skupina B Vliv krevní skupiny B na chování klíšťat H0: Krevní skupina nemá vliv na chování klíšťat k hostiteli. H1: Krevní skupina má vliv na chování klíšťat k hostiteli.

91

chí kvadrát = 223,65

p = 0,0000

Tabulka 21: Výstup z programu STATISTICA 10, chí - kvadrát

p=0 α = 0,05 p < α => existuje statisticky významný rozdíl. Na základě výpočtu hodnoty p = 0 zamítáme H0 na hladině významnosti α = 0,05. Krevní skupina B má vliv na chování klíšťat k hostiteli. Pokles preference krevní skupiny B v čase H0: Preference krevní skupiny v čase se statisticky neliší. H1: Preference krevní skupiny v čase se statisticky liší.

chí kvadrát = 15,600

p = 0,000410

Tabulka 22: Výstup z programu STATISTICA 10, chí - kvadrát

p = 0,000410 α = 0,05 p < α => existuje statisticky významný rozdíl. Na základě výpočtu hodnoty p = 0,000410 zamítáme H0 na hladině významnosti α = 0,05. Preference krevní skupiny B se v čase statisticky liší.

C, Krevní skupina AB Vliv krevní skupiny AB na chování klíšťat H0: Krevní skupina nemá vliv na chování klíšťat k hostiteli. H1: Krevní skupina má vliv na chování klíšťat k hostiteli.

chí kvadrát = 181,41

p = 0,0000

Tabulka 23: Výstup z programu STATISTICA 10, chí - kvadrát 92

p=0 α = 0,05 p < α => existuje statisticky významný rozdíl. Na základě výpočtu hodnoty p = 0 zamítáme H0 na hladině významnosti α = 0,05. Krevní skupina AB má vliv na chování klíšťat k hostiteli. Pokles preference krevní skupiny AB v čase H0: Preference krevní skupiny v čase se statisticky neliší. H1: Preference krevní skupiny v čase se statisticky liší.

chí kvadrát = 2,640

p = 0,267

Tabulka 24: Výstup z programu STATISTICA 10, chí - kvadrát

p = 0,267 α = 0,05 p > α => neexistuje statisticky významný rozdíl. Na základě výpočtu hodnoty p = 0,267 nezamítáme H0 na hladině významnosti α = 0,05. Preference krevní skupiny AB se v čase statisticky neliší.

D, Krevní skupina 0 Vliv krevní skupiny 0 na chování klíšťat H0: Krevní skupina nemá vliv na chování klíšťat k hostiteli. H1: Krevní skupina má vliv na chování klíšťat k hostiteli.

chí kvadrát = 163,29

p = 0,0000

Tabulka 25: Výstup z programu STATISTICA 10, chí - kvadrát

93

p=0 α = 0,05 p < α => existuje statisticky významný rozdíl. Na základě výpočtu hodnoty p = 0 zamítáme H0 na hladině významnosti α = 0,05. Krevní skupina 0 má vliv na chování klíšťat k hostiteli. Pokles preference krevní skupiny 0 v čase H0: Preference krevní skupiny v čase se statisticky neliší. H1: Preference krevní skupiny v čase se statisticky liší.

chí kvadrát = 2,160

p = 0,3396

Tabulka 26: Výstup z programu STATISTICA 10, chí - kvadrát

p = 0,3396 α = 0,05 p > α => neexistuje statisticky významný rozdíl. Na základě výpočtu hodnoty p = 0,3396 nezamítáme H0 na hladině významnosti α = 0,05. Preference krevní skupiny 0 se v čase statisticky neliší.

94

8. Diskuze Cílem této diplomové práce byl pravidelný monitoring aktivity a pozitivity klíšťat na spirochéty na dvou lokalitách v Brně (lokalita Pisárky a Ruda) metodou vlajkování. Klíšťata byla vyšetřována na přítomnost spirochét metodou DFM. Dalším z cílů práce je stanovit, jakou roli v interakci člověk – klíště mohou hrát různé vonné kosmetické přípravky, které člověk pouţívá. Nalezení jedinci byli testováni nejprve vertikálními testy (prvními, orientačními testy) a za pomocí aparatury ,,Moving – object bioassay“, kde testovaná látka ,,soupeří” s atraktantními stimuly. Cílem práce byla i snaha o určení preference krevních skupin klíšťaty. Na lokalitě Pisárky probíhá pravidelný monitoring jiţ od roku 1996 (Ţákovská a kol., 2008). Na lokalitě Ruda byl monitoring proveden poprvé ve snaze rozšířit monitoring aktivity klíšťat na území města Brna o další lokalitu, která je hojně navštěvovaná za účelem rekreace jak obyvateli města samotného, tak turisty. Analýza sezónní aktivity klíšťat byla doplněna stanovením prevalence borrelií, původců závaţného onemocnění lymeská borrelióza, v tělech těchto roztočů. Na lokalitě Pisárky probíhal sběr kaţdý týden ve stejný den i hodinu po dobu 60 minut (Ţákovská a kol., 2008). Od března do října jsme nalezli 198 jedinců klíštěte obecného (Ixodes ricinus). Ve sběrech se nacházela všechna vývojová stádia klíštěte. Aktivita klíšťat kolísala v závislosti na teplotě i vlhkosti ovzduší stejně jako uvádí literatura (Subak, 2002). Pravidelný výskyt je samozřejmě vázán na mnoţství hostitelů (Hubálek & Rudolf, 2007). Klíšťata číhají na hostitele na vegetaci v různé výšce, a to podle vývojového stádia. Larvy a nymfy se ukrývají v trávě. Dospělci na keřích, vyšších travinách nebo bylinách a to aţ do výšky 1 m. Nejvíce klíšťat jsme nalezli u země, protoţe klíšťata pro přeţití potřebují vlhké prostředí a jejich malé tělo je náchylné k větším ztrátám vody (Subak, 2002). Nejvyšší počet klíšťat byl zaznamenán 2. 7. a 16. 7. 2012, kdy bylo nasbíráno 31 klíšťat. Červenec byl z hlediska aktivity nejrizikovější měsíc. Od srpna následoval pokles aktivity klíšťat. Srpen byl horký a suchý měsíc, kdy pro klíšťata nastávají těţké časy, které jim mohou způsobit i smrt dehydratací nebo vyčerpáním energetických zásob (Randolph & Storey, 1999). Aktivita klíšťat v kaţdém měsíci se statisticky lišila. Fisherův LSD test ukázal konkrétní rozdíly mezi měsíci. Na základě homogenních skupin bylo moţné identifikovat statisticky významný rozdíl mezi červencem a ostatními měsíci, kromě června. Sníţení počtu klíšťat při pravidelném monitoringu v Pisárkách od r. 2012 byl způsoben pravděpodobně provedenými úpravami lesoparku Správou lesů města Brna. Na jaře roku 2012 došlo k 95

vykácení přestárlých stromů (120 – 130 let starých) a ke zmlazování nových porostů. Výsledkem čehoţ by měla být přirozená obnova daného ekosystému. Tyto úpravy, kdy došlo ke změně celkové charakteristiky monitorovaného území (změny mikroklimatu, počtů potenciálních hostitelů v důsledku prováděných prací, …), mohou být příčínou poklesu odchycených klíšťat. Úprava nespočívala pouze v kácení lesů, ale i v chemických postřicích. Z celkového počtu bylo 3,03 % larev, 85,35 % nymf, 5,56 % samců a 6,06 % samic. Početní zastoupení jednotlivých vývojových stádií není náhodné a je statisticky významné na hladině významnosti 5 %. Mezi jednotlivými stádii převaţovaly nymfy. Tyto údaje jsou známy i z literatury (Hubálek & Rudolf, 2007); (Ţákovská a kol., 2011). Jedním z důvodů, proč převaţují nymfy nad ostatními stádii, můţe být nedostatek vhodných hostitelů (Siński a kol., 2006). Nemusí se jednat pouze o určitý vhodný druh hostitele, ale také o jeho pohlaví, věk nebo i roční období. Mnoţství klíšťat také ovlivňuje typ vegetace na vybrané lokalitě. Bylo dokázáno, ţe podstatně větší počet klíšťat je nasbírán v oblastech se stromy, neţ na otevřených prostranstvích, jako jsou pole, pastviny a udrţované trávníky (Hubálek & Rudolf, 2007). Pozitivita klíšťat na borrelie v roce 2012 zjišťována metodou DFM (Knoz & Opravilová, 1992); (Ţákovská a kol., 2008) byla na lokalitě Pisárky 4,5 %. Dlouhodobá pozitivita zjištována metodou DFM na lokalitě Pisárky v letech 1996-1997 byla 9,3 % a v letech 19962002 byla pozitivita 5,8 % (Ţákovská, 2000); (Ţákovská a kol., 2008). Nejvyšší pozitivita klíšťat byla v měsíci červnu (7,90 %). Nejniţší pozitivita byla pak v měsíci květnu s hodnotou 3,70 %. Ţádné pozitivní klíště nebylo nalezeno v březnu, dubnu, srpnu a září. Nejkritičtější měsíc z procentuálního hlediska byl tedy opět červenec. Všechna pozitivní klíšťata byly nymfy. Na lokalitě Ruda probíhal sběr kaţdých 14 dnů přibliţně ve stejný den i hodinu po dobu 60 minut, stejně jako na lokalitě Pisárky (Ţákovská a kol., 2008). Od března aţ do prosince jsme nalezli 321 jedinců klíštěte obecného (Ixodes ricinus). Ve sběrech jsme nalezli všechna vývojová stádia klíštěte. Na lokalitě Ruda byl relativně vysoký počet larev v porovnání s Pisárkami. Čím více jedinců se nachází na jednom místě, tím zde jsou méně stresující podmínky (Oliver, 1989). Teplota a vlhkost prostředí jsou zde nejspíše vhodné pro kladení vajec. Musí zde být i dostatek vhodných hostitelů. Larvy sají na drobných savcích jako je myšice nebo norník (Hubálek & Rudolf, 2007). Nymfy dávají přednost veverkám, jeţkům a zajícům. Samice sají zejména na divoké i domácí zvěři. Ale i larvy a nymfy můţeme nalézt na vysoké zvěři (Oliver, 1989). Aktivita klíšťat kolísala v závislosti na teplotě i vlhkosti ovzduší (Subak, 2002). 96

Nejvyšší počet klíšťat byl zaznamenán 4. 6. 2012, kdy bylo nasbíráno 59 klíšťat. Červen byl z hlediska aktivity nejrizikovější měsíc. Květen a červen jsou v literatuře udávány jako nejrizikovější měsíce (Randolph & Storey, 1999). Od srpna jsme sledovali obrovský pokles aktivity klíšťat. Koncem července došlo k prudkým sráţkám a půda na lokalitě Ruda, která se nachází většinou ve stráni, byla splavena dolů a s ní i vegetace a zřejmě i většina klíšťat. Aktivita klíšťat v kaţdém měsíci se statisticky lišila. Fisherův LSD test ukázal konkrétní rozdíly mezi měsíci, kdy byl nasbírán určitý počet klíšťat. Duben, červen, červenec, srpen, září a říjen se počtem klíšťat od sebe statisticky neliší. Dále se statisticky neliší mezi sebou duben, květen, červenec a září. Ani duben, květen, červen a červenec se v počtu klíšťat od sebe statisticky neliší. Z celkového počtu bylo 19,94 % larev, 73,52 % nymf, 4,36 % samců a 2,18 % samic. Početní zastoupení jednotlivých vývojových stádií není náhodné a je statisticky významné na hladině významnosti 5 %. Mezi jednotlivými stádii převaţovaly opět nymfy. Pozitivita klíšťat na borrelie zjišťována metodou DFM (Knoz & Opravilová, 1992); (Ţákovská a kol., 2008) byla na lokalitě Ruda 9,35 %. Nejvyšší pozitivita klíšťat byla v říjnu (50 %). Důvodem je to, ţe ze dvou odchycených klíšťat bylo jedno pozitivní. Nejniţší pozitivita byla pak v měsíci červnu s hodnotou 7,89 %. Ţádné pozitivní klíště nebylo nalezeno v březnu, dubnu, srpnu, září a listopadu. Nejkritičtější měsíc z procentuálního hlediska byl říjen. Nejvíce pozitivních jedinců bylo ve stádiu nymfy (26). Dále zde bylo vysoké mnoţství pozitivních samců (12). Samci se museli nakazit jiţ ve stádiu nymfy, protoţe jako dospělí potravu nepřijímají (Hubálek & Rudolf, 2007). Následovaly larvy (3) a nejméně pozitivní byly samice, pouze jedna. Dále byl testován vliv vonných kosmetických přípravků na chování klíšťat. Byly pouţity 2 přístupy: vertikální testy a metoda MO – bioassay (Dautel a kol., 1999). S ohledem na to, ţe součástí těchto přípravků bývají běţně látky, u nichţ literatura popisuje odpuzující účinky (Posey a kol. 1998), předpokládali jsme spíše odpuzující působení. Pro účely naší analýzy byly náhodně vybrány dvě toaletní vody: Avon Summer White a Enigma Dare to Dream, které mají následující sloţení (látky, které literatura popisuje jako repelentní, jsou ve sloţení obou přípravků zvýrazněny kurzívou): Avon Summer White obsahuje alkohol, vodu, parfém, etylenhexanoát, etylhexyl metoxycinnamát, citral, linalool, geraniol, alfa-isometyl ionon, hexyl cinnamal, benzyl salicylát, kumarin, citronellol, limonen. Enigma Dare to Dream obsahuje alkohol denaturovaný, voda, parfém, benzyl salicylát, etylhexyl metoxycinnamát, linalool, hydroxycitronellal, hexyl cinnamal, limonen, alfa97

isometyl ionon, butyl metoxydibenzoylmetan, etylhexyl salicylát, geraniol, citronellol, isoeugenol, benzylbenzoát, citral. Odpuzující účinek podle literatury mají alkoholy. Alkoholy se v minulosti vyuţívaly i jako repelenty (Bernier a kol., 2000). I látky odvozené od alkoholu mají odpuzující účinky. Záleţí ale na jejich koncentraci. Např. 6-metyl-5-hepten-2-on má odpuzující účinky, ale pouze v nízkých přirozených koncentracích, ve vyšších má naopak atraktantní účinky (Meijerink a kol., 2000). Jejich velké mnoţství se nachází v lidském potu. Benzyl salicylát je ester kyseliny salicylové, která patří mezi aromatické karboxylové kyseliny. Karboxylové kyseliny při kombinaci s kyselinou mléčnou z kůţe můţe mít odpuzující účinek (Bosh a kol., 1999). Linalool má silné odpuzující účinky, stejně jako citronellol (Narusuye a kol., 2005). Oba se přidávají do parfémů pro svoji květinovou vůni. Linallol má větší inhibiční účinky neţ DEET (Posey a kol. 1998). Geraniol podobně jako geranyl aceton by mohl mít také odpuzující účinky, ale pouze v nízkých přirozených koncentracích, ve vyšších má naopak atraktantní účinky (Meijerink a kol., 2000). I aceton je povaţován za odpuzující látku (Krotoszynski a kol, 1977). Obě toaletní vody prokázaly statisticky vliv na chování klíšťat. Kdy na základě výpočtu hodnoty p = 0 jsme zamítli H0 na hladině významnosti α = 0,05. Pouţití toaletních vod mělo vliv na chování klíšťat k hostiteli. Vertikální testy vyuţívají přirozené schopnosti klíšťat šplhat směrem nahoru po stoncích trávy, kde číhají na hostitele. Ve vhodné výšce se klíště postaví do číhací pozice a zvedá přední končetiny, pomocí kterých se snaţí zachytit pach hostitele (Dautel a kol., 1999). Protoţe nejsou přítomny podněty, které by klíšťata motivovaly pro překonání odpuzující bariéry, jsou testované odpuzující látky účinné, i kdyţ jsou jen slabě odpuzující (Dautel, 2004). Přípravky analyzované ve studii za pomoci vertikálních testů se ukázaly jako klíšťata odpuzující. Z 50 jedinců bylo odpuzeno toaletní vodou Avon Summer White 88 % klíšťat, 8 % odpuzeno nebylo a 4 % jedinců zůstala neaktivních. Toaletní voda Enigma Dare to Dream odpudila 98 % testovaných jedinců a 2 % nebyla aktivní. Avon Summer White odpudil na hranici mezi přípravkem ošetřenou a neošetřenou plochou 39 klíšťat a 5 klíšťat bylo odpuzeno aţ po kontaktu s vonným kosmetickým přípravkem. Enigma Dare to Dream odpudil 47 klíšťat na hranici mezi přípravkem ošetřenou a neočetřenou plochou a 2 klíšťata byla odpuzena po kontaktu. Nebyl prokázán statisticky významný rozdíl mezi působením vonných kosmetických přípravků na chování klíšťat. Při výpočtu hodnoty p = 0,3897 nezamítáme H0 na hladině významnosti α = 0,05. 98

MO – bioassay se vyuţívá na testování repelentů proti klíšťatům. Hostitel je zde simulován otáčejícím se bubnem, který je naplněn vodou vyhřívanou na 36,5°C plus mínus 0,5°C (tato teplota je pro klíště atraktantní, protoţe připomíná teplotu těla člověka) (Dautel a kol., 1999). Přesto, ţe rotující buben vydává atraktantní stimuly, roztoč by měl být po pouţití odpuzující látky odpuzen. Jedině repelenty, které jsou účinné v přítomnosti těchto stimulů, jsou totiţ efektivní i při reálném pouţití. V naší studii se ,,moving object bioassay“ ukázal jako účinný test. Z 50 jedinců bylo odpuzeno toaletní vodou Avon Summer White 86 % klíšťat, 6 % odpuzeno nebylo a 8 % jedinců zůstalo neaktivních. Toaletní voda Enigma Dare to Dream odpudila 82 % testovaných jedinců, 4 % odpuzena nebyla a 14 % nebylo aktivní. Avon Summer White odpudil na hranici přípravkem ošetřenou plochou 40 klíšťat a 3 klíšťat byla odpuzena aţ po kontaktu s vonným kosmetickým přípravkem. Enigma Dare to Dream odpudil 40 klíšťat na hranici přípravkem ošetřenou plochou a 1 klíště bylo odpuzena po kontaktu. Nebyl prokázán statisticky významný rozdíl mezi působením vonných kosmetických přípravků na chování klíšťat. Při výpočtu hodnoty p = 0,1069 nezamítáme H0 na hladině významnosti α = 0,05. Kosmetický přípravek Avon Summer White měl dle očekávání vyšší odpuzující účinek ve vertikálním testu (88 %) stejně jako toaletní voda Enigma Dare to Dream (98 %). Odpuzující účinek u MO – bioassay byl u Avon Summer White 86 % a u Enigma Dare to Dream 82 %. Toaletní voda Enigma Dare to Dream měla vyšší odpuzující účinky neţ toaletní voda Avon Summer White ve vertikálním testu, ale ne v MO – bioassay. U preferencí krevních skupin jsme sledovali pohyb klíštěte po filtračním papíru uvnitř Petriho misek. Původní test (Dautel a kol., 2004) slouţí k testování odpuzujících přípravků a sleduje se pohyb klíštěte po ošetřené a neošetřené ploše filtračního papíru. U krevních skupin byla testována i varianta s Eppendorfovou zkumavkou. U horního okraje Eppendorfovy zkumavky byl filtrační papír, na kterém byly naneseny krevní skupiny. Klíště jsme poloţili na dno zkumavky a sledovali jeho pohyb ke krevním skupinám. Snaţili jsme se vyuţít stejné tendence klíšťat jako u vertikálních testů a to přirozené schopnosti klíšťat šplhat směrem nahoru po stoncích trávy, kde číhají na hostitele (Dautel a kol., 1999). Tento test se nám ale neosvědčil pro krevní skupiny, kdy klíšťata zůstávala na dně Eppendorfovy zkumavky nebo vylezla aţ na víčko a o krevní skupiny v tomto testu klíšťata nejevila téměř ţádný zájem. U testů na Petriho misce jsme sledovali, jakou krevní skupinu klíště kontaktuje jako první. Šlo o přímý kontakt, to znamená, ţe klíště muselo skvrnku s touto krevní skupinu fyzicky 99

kontaktovat. Bylo testováno 100 jedinců a do testů byla zařazena všechna stádia. Pohyb klíšťat po Petriho misce bez krevních skupin byl náhodný a klíšťata nepreferovala ţádnou stranu více neţ jinou. Komáři preferují nejspíše krevní skupinu 0, protoţe lidé s touto skupinou jsou nejvíce postiţeni malárií (Cserti & Dzik, 2007). Po zprůměrování vyšla jako nejpreferovanější skupina klíštětem A, druhá byla krevní skupina 0, třetí nejpreferovanější skupinou byla skupina AB a nejméně preferovaná skupina byla B. U všech krevních skupin byl statisticky potvrzen vliv na chování klíšťat. Na základě výpočtu hodnoty p = 0 jsme zamítli H0 na hladině významnosti α = 0,05. Preference krevní skupiny A se v čase statisticky lišila. Na základě výpočtu hodnoty p = 0,01278 zamítáme H0 na hladině významnosti α = 0,05. I preference krevní skupiny B se v čase statisticky lišila. Na základě výpočtu hodnoty p = 0,000410 zamítáme H0 na hladině významnosti α = 0,05. Preference krevní skupiny AB v čase statisticky nelišila. Na základě výpočtu hodnoty p = 0,267 nezamítáme H0 na hladině významnosti α = 0,05. Ani preference krevní skupiny 0 se v čase statisticky nelišila. Na základě výpočtu hodnoty p = 0,3396 nezamítáme H0 na hladině významnosti α = 0,05.

100

9. Závěr Na lokalitě Pisárky bylo nalezeno celkem 198 klíšťat. Z celkového počtu jedinců bylo 6 larev, 169 nymf, 11 samců a 12 samic. Z hlediska počtu nalezených klíšťat v jednotlivých měsících byl nejkritičtějším měsícem červenec s 96 jedinci. Nejvyšší počet klíšťat byl nalezen 2. 7. a 16. 7. 2012, kdy jsme nasbírali 31 jedinců. Nejméně jedinců jsme nalezli v březnu a to pouze jednoho. Pozitivní na borrelie byly pouze nymfy (9). Celková pozitivita na borrelie byla 4,5 %. Nejvyšší pozitivita klíšťat byla v měsíci červnu (7,90 %). Nejniţší pozitivita byla v měsíci květnu s hodnotou 3,70 %. Nejkrititější měsíc z hlediska pozitivity na borrelie byl červen. Na lokalitě Ruda bylo nalezeno celkem 321 klíšťat. Larev bylo 64, nymf 236, samců 14 a 7 samic. I na lokalitě Ruda jsme nalezli nejvíce jedinců v červenci (79) a červenec se stal nejkritičtějším měsícem z hlediska aktivity klíšťat. Nejvyšší počet klíšťat byl zaznamenán 4. 6. 2012, kdy bylo nasbíráno 59 klíšťat. Nejméně nalezených klíšťat bylo v říjnu a v listopadu se dvěma jedinci. Pozitivních jedinců na borrelie bylo 42 a celková pozitivita byla 9,35 %. Nejvíce pozitivních jedinců bylo ve stádiu nymfy (26). Dále zde bylo vysoké mnoţství pozitivních samců (12), následovaly larvy (3). Nejméně pozitivní byly samice, pouze jedna. Nejvyšší pozitivita klíšťat byla v říjnu (50 %). Nejniţší pozitivita byla pak v měsíci červnu s hodnotou 7,89 %. Nejkritičtější měsíc z hlediska pozitivity na borrelie byl říjen. Toaletní voda Avon Summer White odpudila 88 % jedinců při pouţití vertikálních testů a 86 % jedinců při pouţití metody MO – bioassay. Neodpuzených jedinců bylo u vertikálních testů 8 % a 6 % u metody MO – bioassay. U vertikálních testů bylo neaktivních jedinců 4 % a 8 % u metody MO – bioassay. Toaletní voda Enigma Dare to Dream odpudila 98 % klíšťat metodou vertikálních testů a 82 % metodou MO – bioassay. Neodpuzených bylo 0 % u vertikálních testů a 4 % u MO – bioassay. Neaktivních jedinců bylo u metody vertikálních testů 2 % a u MO – bioassay 14 %. Při pouţití metody vertikálních testů měla vyšší odpuzující účinek toaletní voda Enigma Dare to Dream (98 %) neţ toaletní voda Avon Summer White (88 %). U metody MO – bioassay měla vyšší odpuzující účinek toaletní voda Avon Summer White (86 %) neţ Enigma Dare to Dream (82 %). Nejpreferovanější krevní skupina klíšťaty byla krevní skupina A (33 %). Druhá byla krevní skupina 0 (26 %), následovala skupina AB (22 %) a nejméně preferovanou krevní 101

skupinou byla skupina B (14 %). Preference krevní skupiny A po 1 a 2 minutách mírně klesala, stejně jako preference krevní skupiny B. Preference krevní skupiny AB, jako jediné, časem stoupala. Krevní skupina 0 měla po 1 a 2 minutách velký pokles. Její preference poklesla o 9 %.

102

Seznam zkratek AAA: attraction – aggregation – attachment pheromones (,,přitahovací feromony“) ASP: attractant sex pheromone (atraktantní pohlavní feromony) ATP: adenosintrifosfát Bbsl: Borrelia burgdorferi sensu lato CD: cluster of differentiation DEET: N, N-Dietyl-3-metyl-benzamide DFM: dark field microscopy (mikroskopie v zástinu) DNA: deoxyribonukleová kyselina DTP: deoxyribonukleotid triphosfát EM: erythema migrant GSP: genital sex pheromone (genitální pohlavní feromony) HGE: human granulocytic anaplasmosis (lidská granulocytární anaplazmóza) HME: human monocytic ehrlichiosis (lidská monocytární ehrlichióza) Chmi: Český hydrometeorologický ústav Ig: imunoglobulin IGBPs: immunoglobulin binding proteins (imunoglobuliny vázající protein) IL: interleukin INF: interferon LB: lymeská borelióza MIF: migraci inhibující faktor MO – bioassay: Moving object bioassay MSP: mounting sex pheromone (,,upevňovací pohlavní feromony“) NK: natural killer cells PCR: polymerase chain reaction (polymerázová řetězová reakce) PGE: prostaglandin Q – horečka: query horečka rDNA: ribosomální DNA RNA: ribonukleová kyselina SAT: saliva activated transmission (slinami aktivovaný přenos) TH: T helper buňky TNF: tumor nekrotizující faktor TSGP: tumor-specifický glykoprotein 103

Seznam literatury Ansari M. N. A., Nicolaides N., Fu H. C. 1970. Fatty acid composition of the living layer and stratum corneum lipids of human sole skin epidermis. Lipids. vol. 5, p. 838 – 845. Bernier U. R., Kline D. L., Barnard R. D., Shreck C. E., Yost R. A. 2000. Analysis of human skin emanations by gas chromatography/mass spectrometry, 2. Identification of volatile compounds that are candidate attractants for the yellow fever mosquito (Aedes aegypti), Analytical Chemistry. vol. 72, p. 747 – 756. Bissinger B. W., Roe R. M. 2010. Tick repellents: Past, present, and future. Pesticide Biochemistry and Physiology. vol. 96, no. 2, p. 63 – 79. Black W. C. IV, Klompen J. S., Keirans J. E. 1997. Phylogenetic relationships among tick subfamilies (Ixodida: Ixodidae: Argasidae) based on the 18S nuclear rDNA gene. Molecular Phylogenetics and Evolution. vol. 7, p. 129 – 144. Blum M. S., Byrd J. B., Travis J. R., Watkins II J. F., Gehlbach F. R. 1971. Chemistry of the cloacal sac secretion of the blind snake Leptotyphlops dulcis. Comparative Biochemistry and Physiology. vol. 38, p. 103 – 107. Bosh O. J., Geier M., Boeckh J. 1999. Contribution of Fatty Acids to Olfactory Host Finding of Female Aedes aegypti. Oxford University Press Journals. vol. 25, p. 323 – 330. Bown K. J., Lambin X., Telford G. R., Ogden N. H., Telfer S., Woldehiwet Z., Birtles R. J. (2008). Relative Importance of Ixodes ricinus and Ixodes trianguliceps as Vectors for 75 Anaplasma phagocytophilum and Babesia microti in Field Vole (Microtus agrestis) Populations. Applied and Environmental Microbiology. vol. 74, p. 7118 – 7125. Brossard M., Wikel S. K. 2004. Tick immunobiology. Parasitology. vol. 129, p. 161 – 176. Brown M., Hebert A. A. 1997. Insect repellents: An overview. Journal of the American Academy of Dermatology. vol. 36, no. 2, p. 243 – 249. Carroll J. F., Solberg V. B., Klun J. A., Kramer M., Debboun M. 2004. Comparative activity of deet and AI3-37220 repellents against the ticks Ixodes scapularis and Amblyomma americanum (Acari : Ixodidae) in laboratory bioassays. Journal of Medical Entomology. vol. 41, no. 2, p. 249 – 254. Clarke B. T. 1997. The natural history of amphibian skin secretions, their normal functioning and potential medical applications. Biol. Rev. vol. 72, p. 365 – 379.

104

Cott H. B. 1947. The edibility of birds: Illustrated by five years‟ experiments and observations (1941–1946) on the food preferences of the hornet, cat and man; and considered with special reference to the theories of adaptive coloration, Proceedings of the Zoological Society of London. vol. 161, p. 371 – 524. Cserti C. M., Dzik W. H. 2007. The ABO blood group system and Plasmodium falciparum malaria. Blood. vol. 110, no. 7, p. 2250 – 2258. Curran A. M., Rabin S. I., Prada P. A., Furton K. G. 2005. Comparison of the volatile organic compounds present in human odor using spme-gc/ms. Journal of Chemical Ecology. vol. 31, p. 1607 – 1619. Čihař J. a kolektiv. 2002. Příroda v České a Slovenské republice. 4. opravené a rozšířené vydání. Praha: Academia. 429 s. ISBN 80-200-0938-8. Dautel H. 2004. Test systems for tick repellents. International Journal of Medical Microbiology. vol. 293, no. 37, p. 182 – 188. Dautel H., Kahl O., Siems K., Oppenrieder M., Müller-Kuhrt L., Hilker M. 1999. A novel test system for detection of tick repellents. Entomologia Experimentalis et Applicata. vol. 91, p. 431 – 441. Ellin R. I., Farrand. R. L., Oberst F. W., Crouse Ch. L., Billups N. B., Koon W. S. Musselman N. P., Sidell F. R. 1974. An apparatus for the detection and quantitation of volatile human effluents. Journal of Chromatography. vol. 100, p. 137 – 152. Gikonyo N. K., Hassanali A., Njagi P. G. N., Saini R. K. 2000. Behaviour of Glossina morsitans morsitans Westwood (Diptera: Glossinidae) on waterbuck Kobus defassa Ruppel and feeding membranes smeared with waterbuck sebum indicates the presence of allomones. Acta Tropica. vol. 77, p. 295 – 303. Goddart J. 2000. Infectious diseases and arthropods. New Jersey: Humana Press. 231 s. ISBN 0-89603-825-4. Hannier S., Liversidge J., Sternberg J. M., Bowman A. S. 2004. Characterization of the B-cell inhibitory protein factor in Ixodes ricinus tick saliva: a potential role in enhanced Borrelia burgdoferi transmission. Immunology. vol. 113, p. 401 – 408. Hejtmánek M. 1993. Úvod do světelné mikroskopie. 3. přepracované a doplněné vydání Olomouc: Vydavatelství Univerzity Palackého v Olomouci. 65 s. ISBN 8070673087. Hoogstrall H., Aeschlimann A. 1982. Tick – Host Specifity. Bulletin de la Société Entomologique Suisse. vol. 55, p. 5 – 32. Hubálek Z., Rudolf I., 2007. Mikrobiální zoonózy a sapronózy. 2. vydání. Brno. 176 s. ISBN 978-80-210-4460-9. 105

James M. C., Fumess R. W., Bowman A. S., Forbes K. J., Gilbert L. 2011. The importance of passerine birds as tick hosts and in the transmission of Borrelia burgdorferi the agent of Lyme disease: a case study from Scotland. Ibis. vol. 153, p. 293 – 302. Kiffner C., Vor T., Hagedorn P., Niedrig M., Rühe F. 2011. Factors affecting patterns of tick parasitism on forest rodents in tick-borne encefalitis risk areas, Germany. Parasitol Res. vol. 108, p. 323 – 335. Klompen J. S. H., Black W. C. IV, Keirans J. E., Norris D. E. 1999. Systematics and Biogeography of Hard Ticks, a Total Evidence Approach. Cladistics. vol. 16, p. 79 – 102. Klompen J. S. H., Black W. C. IV. 1996. Evolution of ticks. Annual Review Entomology. vol. 41, p. 141 – 161. Knoz J., Opravilová V. 1992. Základy mikroskopické techniky. 1. vydání Brno: Masarykova univerzita. 195 s. ISBN 80-21-0473-8. Kosik – Bogacka D., Bukowska K., Kuźna-Grygiel W. 2002. Detection of borrelia burgdorferi sensu lato in mosquitoes (Culicidae) in recreational areas of the city of Szczecin. Annals of agricultural and enviromental medicine. vol. 9., p. 55 – 57. Kosik – Bogacka D., Kuźna-Grygiel W., Jaborowska M. 2007. Ticks and mosquitoes as vectors of Borrelia burgdorferi s. l. in the forested areas of Szczecin. Folia biologica. vol. 55., no. 3 – 4., p. 143 – 146. Krasnov B. R., Stanko M., Morand S. 2007. Host community structure and infestation by ixodid ticks: repeatability, dilution effect and ecological specialization. Oecologia. vol. 154, p. 185 – 194. Krotoszynski B., Gabriel G., O’Neill H. 1977. Characterization of human expired air: A promising investigative and diagnostic technice. Journal of Chromatography Sci. vol. 15, p. 239 – 244. Logan J. G., Birkett M. A., Clark S. J., Powers S., Seal N. J., Wadhams L. J., Mordue A. J., Pickett J. A. 2008. Identification of Human-Derived Volatile Chemicals that Interfere with Attraction of Aedes aegypti Mosquitoes. Journal of Chemical Ecology. vol. 34, p. 308 – 322. Mans B. J., Coetzee J., Louw A. I., Gaspar A. R. M. Neitz A. H. 2000. Disaggregation of aggregated platelets by apyrase from the tick, Ornithodoros savignyi (Acari: Argasidae). Experimental and Applied Acarology. vol. 24, p. 271 – 282. Mans B. J., Neitz A. W. H. 2004. Adaptation of ticks to a blood-feeding environment: evolution from a functional perspective. Insect Biochemistry and Molecular Biology. vol. 34, p. 1 – 17. 106

Markowitz M. 1942. Practical Survey of Chemistry and Metabolism of the Skin. American Journal of Nursing. vol. 43, p. 519 McGavin G. C. 2000. Hmyz. Pavouci a jiní suchozemští členovci. 1. Vydání. London: Dorling Kindersley Limited. 255 s. ISBN 80-242-1340-0. Meijerink J., Braks M. A. H., Brack A. A., Adam W., Dekker T., Posthumus M. A., Van Beek T. A., Van Loon J. J. A. 2000. Identification of olfactory stimulants for Anopheles gambiae from human sweat samples. Journal of Chemical Ecology. vol. 26, no. 6, p. 13671382. Mejlon H. A., Jaenson T. G. T. 1997. Questing behaviour of host-seeking Ixodes ricinus (Acarina: Ixodidae). Experimental & Applied Acarology. vol. 21, p. 747 – 754. Mihalca A. D., Gherman C. M., Cozma V. 2011. Coendangered hard-ticks: threatened or threatening? Parasites & Vectors. vol. 4, p. 71. Morán-Cadenas F., Rais O., Humair P. - F., Douet V., Moret J., Gern L. 2007. Identification of host bloodmeal source and Borrelia burgdorferi sensu lato in field-collected Ixodes ricinus ticks in Chaumont (Switzerland). J. Med. Entomol. vol. 44, p. 1109 – 1117. Narusuye K., Kawai F., Matsuzaki K., Miyachi E. 2005. Linalool suppresses voltagegated currents in sensory neurons and cerebellar purkinje cells. Journal of Neural Transmission. vol. 112, p. 193 – 203. Nejedlá P., Norek A., Vostal K., Ţákovská A. 2009. What is the percentage of pathogenic borreliae in spirochaetal findings of mosquito larvae? Annals of agricultural and environmental medicine. vol. 16, p. 273 – 276. Nesnídalová V. 2010. Antigeny krevního systému AB0 ve tkáních a moţnosti jejich určování: bakalářská práce. Masarykova univerzita. Fakulta Přírodovědecká. 40s. Norte A. C., de Carvalho I. L., Ramos J. A., Goncalves M., Gern L., Núncio M. S. 2012. Diversity and seasonal patterns of ticks parasitizing wild birds in western Portugal. Experimental & Applied Acarology. vol. 58, p. 327 – 339. Nuttall P. A., Labuda M. 2004. Tick – host interactions : saliva-activated transmission. Parasitology. vol. 129, p. 177 – 189. Nuttall P. A., Paesen G. C., Lawrie C. H., Wang H. 2000. Vector - Host Interactions in Disease Transmission. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. vol. 2, no. 4, p. 3814 - 386. Ogden N. H., Hailes R. S., Nuttall P. A. 1998. Interstadial variation in the attachment sites of Ixodes ricinus ticks on sheep. Experimental & Applied Acarology. vol. 22, p. 227 – 232.

107

Oliver J. R. 1989. Biology and Systematics of Ticks (Acari:Ixodida). Annual Review of Ecology and Systematics. vol. 20, p. 397 – 430. Pejchalová K., Ţákovská A., Mejzlíková M., Halouzka J., Dendis M. 2007. Isolation, cultivation and identification of Borrelia burgdorferi genospecies from Ixodes ricinus ticks from the city of Brno, Czech Republic. Annals of agricultural and environmental medicine. vol. 14, no. 1, p. 75 – 79. Posey K. H., Barnard D. R., Schreck C. E. 1998. Triple cage olfactometer for evaluating mosquito (Diptera: Culicidae) attraction responses. Journal of Medical Entomology. vol. 35, p. 330 – 334. Poulsen B. O. 1994. Poison in Pitohui birds: Against predators or ectoparasites? Emu. vol. 94, p. 128 – 129. Poupon M. - A., Lommano E., Humair P.-F., Douet V., Rais O., Schaad M., Jenni L., Gern L. 2006. Prevalence of Borrelia burgdorferi sensu lato in ticks collected from migratory birds in Switzerland. Applied Environmental Microbiology. vol. 72, p. 976 – 979. Provazník K., Komárek L., Kříţ B., 1996. Manuál prevence v lékařské praxi – IV. Základy prevence infekčních onemocnění. 1. vydání. Praha: Fortuna. 128 s. ISBN 80-7168400-7. Randolph S. E., Storey K. 1999. Impact of microclimate on immature tick-rodent host interactions (Acari:Ixodidae): implications for parasite transmission. J. Med. Entomol. vol. 36, no. 6, p. 741 – 748. Sanogo Y. O., Halouzka J., Hubálek Z., Němec M. 2000. Detection of spirochetes in, and isolation from, culicine mosquitoes. Folia parazitologica. vol. 47, p. 79 – 80. Sauer J. R., Essenberg R. C., Bowman A. S. 1999. Salivary glands in ixodid ticks: control and mechanism of secretion. Journal of Insect Physiology. vol. 46, p. 1069 – 1078. Scott J. D., Fernando K., Banerjee S. N., Durden L. A., Byrne S. K., Banerjee M., Mann R. B., Morshed H. G. 2001. Birds Disperse Ixodid (Acari: Ixodidae) and Borrelia burgdorferi – Infected Ticks in Canada. Annual Review Entomology. vol. 38, no. 4, p. 493 – 500. Sedlák E. 2006. Zoologie bezobratlých. 2. vydání. Masarykova Universita Brno. 337 s. ISBN 80-210-2892-0 Service M. W. 2001. The Encyclopedia of Arthropod – transmitted Infections. Wallingford: CAB International. 579 s. ISBN 0-85199-473-3. Schmidt O., Dautel H., Newton J., Gray J. S. 2011. Natural isotope signatures of host blood are replicated in moulted ticks. Tick Tick Borne Dis. vol. 2, p. 225 – 227. 108

Singh S. K., Girschick H. J. 2003. Tick–host interactions and their immunological implications in tick-borne diseases. Current Science. vol. 85, no. 9, p. 1284 – 1298. Siński E., Pawełczyk A., Bajer A., Behnke J. M. 2006. Abundance of wild rodents, tich and environmental risk of Lyme borreliosis: A longitudinal study in an area of Mazury lakes district of Poland. Annals of agricultural and enviromental medicine. vol. 13, p. 295 – 300. Skinner W. A., Tong H. C., Maibach H. I., Skidmore D. 1970. Human skin-surface lipid fatty acid - Mosquito repellents. Experientia. vol. 26, p. 728 – 730. Smallegange R. C., Qiu Y. T., van Loon J. J. A., Takken W. 2005. Synergism between ammonia, lactic acid and carboxylic acids as kairomones in the host-seeking behavior of the malaria mosquito Anopheles gambiae sensu strigo (Diptera: Culicidae). Chem. Senses. vol. 30, p. 145 – 152. Soneshine D. E. 2004. Pheromones and other semiochemicals of ticks and thein use in tick control. Parasitology. vol. 129, p. 405 – 425. Soneshine D. E. 2006. Tick Pheromones and Their Use In Tick Control. Annual Review of Entomology. vol. 51, p. 557 – 580. Subak S. 2003. Effects of climate on variability in Lyme disease incidence in the Northeastern United States. American Journal of Epidemiology. vol. 157, p. 531 – 538. Tälleklint L., Jaenson G. T. 1997. Infestation of mammals by Ixodes ricinus tich (Acari:Ixodidae) in south-central Sweden. Experimental & Applied Acarology. vol. 21, p. 755 – 771. Wall R., Shearer D. 2001. Veterinary Ectoparasites: Biology, Pathology and Kontrol. 2nd edition. 262 s. ISBN 0-632-05618-5. Wikel S. K. 1999. Tick modulation of host immunity: an important factor in pathogen transmission. International Journal for Parasitology. vol. 29, p. 851 – 859. Willadsen P., Jongejan F. 1999. Immunology of the Tick – Host Interaction and the Control of Ticks and Tick-borne Diseases. Parasitology Today. vol. 15, no. 7., p. 258 – 262. Zwiebel L. J., Takken W. 2004. Olfactory regulation of mosquito – host interactions. Insect Biochemistry and Molecular Biology. vol. 34, p. 645 – 652. Ţákovská A. 2000. Monitoring the presence of borreliae in Ixodes ricinus ticks in Brno park Pisárky, Czech republic. Biológia Bratislava. vol. 55, no. 6, p. 661 – 666. Ţákovská A., Vostal K., Martiníková H. 2008. A longitudinal study of the prevalence of borreliae in ticks in the urban locality of Brno-Pisárky, Czech Republic. Journal of vector ecology. vol. 33, no. 2, p. 385 – 388.

109

Internetové zdroje URL 1: BROUWERS Lucas. Long Lost Relative of Ticks Pops Up Again [online]. 20118-30 [cit. 2013-3-28]. Dostupné na WWW < http:// blogs.scientificamerican.com/ thoughtomics/2011/08/30/a-long-lost-relative-of-ticks-pops-up-again/ >. URL 2: BROUWERS Lucas. Long Lost Relative of Ticks Pops Up Again [online]. 20118-30 [cit. 2013-3-28]. Dostupné na WWW < http:// blogs.scientificamerican.com/ thoughtomics/2011/08/30/a-long-lost-relative-of-ticks-pops-up-again/ >. URL 3: VINCENT Luděk. Klíšťová encefalitida. [online]. [cit. 2012-10-16]. Dostupné na WWW . URL

4:

HULÍNSKÁ

Dagmar.

Onemocnění

přenášená

klíšťaty

v České

republice: Babesióza [online]. 2008-05-07 [cit. 2012-10-15]. Dostupné na WWW . URL 5: CASTILLO Javier. Bartonellosis Enfermedad Reemergente. [online]. 2006-5-10 [cit. 2012-10-15]. Dostupné na WWW . URL 6: BENEŠ Jiří. Erlichióza [online]. [cit. 2012-10-16]. Dostupné na WWW . URL 7: FRITZ R. Virus klíšťové encefalitidy odhalil svůj přístupový kód [online]. 20133-18 [cit. 2013-3-18]. Dostupné na WWW . URL 8: VINCENT Luděk. Klíšťová encefalitida. [online]. [cit. 2012-10-16]. Dostupné na WWW . URL 9: Lookfordiagnosis.com. Érythéme Chronique Migrateur [online]. Duben 2009 [cit.

2012-10-16].

Dostupné

na

WWW


//www.lookfordiagnosis.com

/mesh_info.php ?term = %C3% 89ryth% C3%A8me+ Chronique+ Migrateur&lang=4>. URL 10: Wikipedia, the free encyclopedia. Q-fever. [online]. 2013-3-1 [cit. 2012-1017]. Dostupné na WWW . URL 11: Virtual Biology Lab. Pathogenicity Project – Rickettsia Prowazekii. [online]. 2012-3-12 [cit. 2012-10-17]. Dostupné na WWW . URL 12: Wikipedia, the free encyclopedia. Francisella tularensis. [online]. 2013-3-13 [cit. 2012-10-17]. Dostupné na WWW .

110

URL 13: Firma Pařez. Katalog škůdců: Klíšťák holubí [online]. 2009 [citováno dne 5. 3. 2012]. Dostupné na www: . URL 14: KOŘÍNEK Milan. BioLib.cz. [online]. 2010-7-17 [cit. 2012-10-17]. Dostupné na WWW . URL 15: Wikipedia, Die freie Enzyklopädie. Yersinia pestis. [online]. 2013-3-11 [cit. 2012-10-17]. Dostupné na WWW . URL 16: Wikipedia, the free encyclopedia. Bed bug. [online]. 2013-3-12 [cit. 2012-1017]. Dostupné na WWW . URL 17: KROČKOVÁ Taťána. Parazitů se zbavíte i pomocí bylinek. [online]. 2012-711 [cit. 2012-10-17]. Dostupné na WWW . URL 18: GREER Ken. Rocky Mountain Spotted Fever infection on a human leg, a tickborne disease caused by the bakterium. [online]. 2011-9-2 [cit. 2012-10-17]. Dostupné na WWW . URL 19: SZÁBÓ Silvestr. BioLib.cz. [online]. 2007-4-27 [cit. 2012-10-17]. Dostupné na WWW . URL20: PAZDERA Josef. Transgenní komáři. [online]. 2003-3-23 [cit. 2012-10-17]. Dostupné na WWW . URL 21: BARANOVIČ Roland. Ovad bzučivý. [online]. 2008-6-29 [cit. 2012-10-18]. Dostupné na WWW . URL 22: MedicalLook. Anthrax. [online]. 2013 [cit. 2012-10-18]. Dostupné na WWW . URL 23: About.com, Chemistry. DEET or Diethyltoluamide. [online]. 2013-6-21 [cit. 2013-3-1].

Dostupné na WWW


//chemistry.about.com/

od/

factsstructures/

ig/Chemical-Structures---D/DEET-or-Diethyltoluamide.htm>. URL 24: RXList, The Internet Drug Index. Acticin. [online]. 2004-8-12 [cit. 2013-3-1]. Dostupné na WWW . URL 25: Google. Mapy Google. [online]. 2013 [cit. 2013-4-23]. Dostupné na WWW . URL 26: Google. Mapy Google. [online]. 2013 [cit. 2013-4-23]. Dostupné na WWW . 111