MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA FYZIOLOGIE A IMUNOLOGIE

MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA FYZIOLOGIE A IMUNOLOGIE ŽIVOČICHŮ

IMUNITNÍ REAKCE VČEL Diplomová práce

Jaromír Flössler

Vedoucí práce: RNDr. Pavel Hyršl, Ph.D.

Brno 2013

Bibliografický záznam Autor:

Bc. Jaromír Flössler Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Fyziologie a imunologie ţivočichů

Název práce:

Imunitní reakce včel

Studijní program:

PřF N-EXB experimentální biologie, magisterský studijní program

Studijní obor:

PřF SPBI Speciální biologie

Vedoucí práce:

RNDr. Pavel Hyršl, Ph.D.

Akademický rok:

2012/2013

Počet stran:

63

Klíčová slova:

imunita včel; lysozym; antibakteriální aktivita; mor včelího plodu; sociální imunita; imunologie; fenoloxidáza; hemolymfa

Bibliographic Entry Author:

Bc.Jaromír Flössler Faculty of Science, Masaryk University Department of animal physiology and imunology

Title of Thesis:

Immune reaction of bees

Degree programme:

PřF N-EXB Experimental Biology, Master's degree programme

Field of Study:

PřF SPBI Special Biology

Supervisor:

RNDr. Pavel Hyršl, Ph.D.

Academic Year:

2012/2013

Number of Pages:

63

Keywords:

immunity of bees; lysozyme; antibacterial activity; American foul brood; social immunity; immunology; phenoloxidase; hemolymph

Abstrakt Ve své diplomové práci se věnuji imunitě včel. Včely jsou pro člověka hospodářsky velice významní ţivočichové. Pro porovnání imunitních parametrů včel, včetně jejich jednotlivých kast, vývojových stádií, zdravých a nemocných včelstev se ukázalo být prakticky pouţitelných několik metod imunologie hmyzu. Luminometricky lze stanovit antibakteriální aktivitu včelí hemolymfy jako sníţení viability bioluminiscenčních bakterií Escherichia coli K12 - měříme inhibici růstu bakterií způsobenou vlivem dané koncentrace hemolymfy. Oproti kontrole, kde není růst bakterií nijak ovlivněn, způsobuje včelí hemolymfa v 20% koncentraci pokles viability pouţitých bakterií o 30 aţ 60 %. Lysozymu mají včely v hemolymfě, na rozdíl od jiných známých druhů hmyzu jako Galleria melonella a Drosophila melanogaster, velmi málo. Pomocí radiální zónové difúze je jeho mnoţství měřitelné pouze v případě pouţití velkých objemů neředěného vzorku. Alternativou je vyuţití ELISA kitu, kterým se podařilo prokázat, ţe včelí larvy mají v hemolymfě vyšší koncentraci lysozymu neţ dospělci. Lze měřit i hladiny antioxidačních enzymů, jako jsou superoxiddismutáza, glutathion S-transferáza a marker oxidačního stresu malondialdehyd. Aktivita fenoloxidázy měřená kolorimetricky se jevila u všech vzorků velice nízká. Kdyţ se západně od Prahy v roce 2012 objevil mor včelího plodu, tak nám bylo umoţněno odebrat v této oblasti vzorky z nemocných, léčených i zdravých včelstev za účelem jejich porovnání pomocí výše zmíněných technik. Prozatím se nepodařilo prokázat výrazné rozdíly mezi nimi, ale doufám ţe se prokáţí v dalším výzkumu.

Abstract In my diploma thesis, I deal with immunity of bees. Bees are very economically important animals. Several methods used in an insect immunology proved to be applicable to compare the immune parameters of bees, including their castes, developmental stages and both healthy and diseased colonies. Luminometric can determine the antibacterial activity of bee hemolymph as a decrease in viability bioluminescent bacteria Escherichia coli K12 – we measure an inhibition of bacterial growth caused by the influence of the concentration of the hemolymph. Compared to the control, where is growth of bacteria not affected, causing in bee hemolymph 20% decrease caused the concentration of bacteria by 30 to 60%. Bees have very little concentrate of lysozyme in hemolymph, unlike other known species of insects such as Galleria melonella and Drosophila melanogaster.By the using of radio zone diffusion is amount of lysozyme measurable only in case of use large volumes of undiluted sample. An alternative is to use ELISA kit, which proved that bee larvae have higher hemolymph lysozyme concentration than adults. It can also measure the level of antioxidant enzymes such as superoxide dismutase, glutathione S-transferase and the marker of oxidative stress malondialdehyde. Activity of phenoloxidase measured by colorimetry appeared in all samples is very low. When the American foulbrood was appeared on the west of Prague in 2012 , we were able to take this samples from sick treated and healthy bee colonies in this area to compare with the above techniques. So far we failed to demonstrate significant differences between them, but I hope that the future research will show it.

Poděkování: Na tomto místě bych chtěl poděkovat především svému školiteli RNDr. Pavlu Hyršlovi, Ph.D. za pomoc při vypracování, kvalitní a odborné vedení, okamţité odpovědi na korespondenci a také za trpělivost, ochotu a čas, který mi věnoval. Dále bych chtěl poděkovat Mgr. Pavlu Dobešovi, Ph.D. a Mgr. Liboru Vojtkovi za pomoc při provádění pokusů v laboratoři a řešení výsledků našich pokusů. Také chci poděkovat všem svým kolegům, ale hlavně Bc. Lucii Prokopové a Bc. Jakubu Berkovi za spolupráci při většině experimentech. Mé poděkování patří i kolegům z řešitelského týmu grantu NAZV, se kterými jsme spolupracovali hlavně při odběrech vzorků. Také chci poděkovat všem ostatním, kteří mi při zpracování práce poskytovali pomoc a podporu.

Prohlášení Prohlašuji, ţe jsem svoji diplomovou práci vypracoval samostatně s vyuţitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány. Brno 1. května 2013

……………………………… Jméno Příjmení

Obsah: 1. Úvod.....................................................................................................9 1.1. Rozdělení imunity..........................................................................9 1.1.1. Buněčná imunita...................................................................9 1.1.2. Humorální imunita...............................................................10 1.1.3. Sociální imunita...................................................................11 1.2. Anatomicko-fyziologické bariéry.................................................13 1.3. Střevní mikroflóra.........................................................................14 2. Sloţení hemolymfy.............................................................................15 2.1. Fenoloxidáza ................................................................................16 2.2. Lysozym........................................................................................17 2.3. Antioxidační enzymy....................................................................18 2.4. Antibakteriální peptidy .................................................................19 3. Nemoci včel (parazité a patogeny) ....................................................20 3.1. Roztoči..........................................................................................20 3.2. Virové nákazy...............................................................................21 3.3. Bakteriální nákazy.........................................................................21 3.4. Prvoci............................................................................................24 3.5. Houbová onemocnění....................................................................24 3.6. Brouci............................................................................................25 3.7. Léčiva – sanguinarin.....................................................................25 4. materiál a metody................................................................................26 4.1. biologický materiál (odběry).........................................................26 4.2. Kolorimetrické stanovení fenoloxidázy (PO)...............................30 4.3. Antibakteriální aktivita (G- bakterie)............................................31 4.4. Stanovení aktivity lysozymu.........................................................31 4.4.1. Radiální difuze.....................................................................31 4.4.2. LSM kit................................................................................32 4.5. Antioxidační enzymy....................................................................34 4.5.1. SOD.....................................................................................34 4.5.2. GST......................................................................................35 4.5.3. MDA....................................................................................36 4.6. Stanovení nitritů dle Griesse.........................................................37 4.7. Nakaţení entomopatogenními hlísticemi......................................37 5. Chemikálie..........................................................................................38 6. Výsledky.............................................................................................38 6.1. PO, pPO........................................................................................38 6.2. Antibakteriální aktivita.................................................................40 6.3. Aktivita lysozymu.........................................................................42 6.3.1. Radiální difuze.....................................................................42 6.3.2. LSM kit................................................................................43 6.4. Antioxidační enzymy....................................................................44

6.4.1. SOD.....................................................................................44 6.4.2. GST......................................................................................47 6.4.3. MDA....................................................................................48 6.5. Stanovení nitritů dle Griesse.........................................................49 6.6. Nakaţení entomopatogenními hlísticemi......................................50 7. Diskuze................................................................................................51 7.1. PO, pPO.........................................................................................51 7.2. Antibakteriální aktivita..................................................................51 7.3. úroveň lysozymu...........................................................................52 7.3.1. radiální difuze......................................................................52 7.3.2. LSM kit................................................................................53 7.4. Antioxidační enzymy....................................................................53 7.4.1. SOD.....................................................................................53 7.4.2. GST......................................................................................54 7.4.3. MDA....................................................................................54 7.5. Stanovení nitritů dle Griesse.........................................................54 7.6. Nakaţení entomopatogenními hlísticemi......................................54 8. Závěr ...................................................................................................55 9. seznam zkratek....................................................................................57 10. pouţitá literatura..................................................................................57

1. Úvod Imunita hmyzu je předmětem zájmu jiţ dlouho, včelaření je známé jiţ od raného středověku a i přes to se toho o imunitě včel ví stále málo. Faktory ovlivňující zdravotní stav včel jsou fyzikální, chemické, biologické, důleţitou roli hraje i stav včelího organismu, chovatelské metody, metody diagnostiky, terapie a prevence chorob včel. Pro výzkum nových léčiv a preparátů k udrţení dobrého zdravotního stavu ve včelstvech je často potřeba pochopit mechanizmy imunity a fungování včelstva. Předpokladem zdravého včelstva je jeho síla, protoţe silný organizmus a stejně tak silné včelstvo jsou schopny se nemoci ubránit. Včely jsou pro člověka hospodářsky významné organismy a v přírodě mají nezastupitelný význam jako opylovači.

1.1.

Rozdělení imunity

Imunitní systém patří k základním homeostatickým mechanizmům organizmu. Jeho smyslem je ochrana před vnějšími vlivy, ať uţ běţnými podmínkami prostředí, nebo škodlivými ataky organizmů či mikroorganizmů, které se v přírodě vyskytují. Tyto patogenní organizmy jsou schopné vyvolat v organizmu nerovnováhu a způsobit tak nemoc, v krajním případě i smrt. Imunitní systém se během evoluce postupně vyvíjel zároveň s ţivočichy, ale stejně tak se vyvíjely i patogeny a parazité. Základní funkce imunitního systému jsou obranyschopnost (proti škodlivinám z okolí), autotolerance (rozpoznání vlastních tkání) a imunitní dohled (schopnost rozpoznat vlastní tkáně s pozměněnou funkcí, např. mutace) (Hořejší a Bartůňková 2005). Pochopit imunitní systém bezobratlých je podle mě prospěšné, protoţe mnoho druhů bezobratlých ţivočichů má pro člověka ekonomický význam, jako například včely Apis melifera, kterými se ve své práci zabývám. Myslím si, ţe pro včelařství je pochopení mechanismů imunity velmi prospěšné. Na rozdíl od obratlovců se však u bezobratlých nevyskytuje adaptivní imunita, pro niţ jsou charakteristické lymfocyty, specifické protilátky a imunologická paměť. Stějně jako u ostatních organizmů jsou základem ochrany před vnějším okolím fyzikální bariéry, které zamezí volnému prostupu látek i organizmů do těla. Imunita bezobratlých ţivočichů je zaloţena na reakcích vrozené (inátní) imunity, která je sice nespecifická, ale velmi rychlá (Hořejší a Bartůňková 2005). Imunitní systém ţivočichů lze rozdělit na tři základní části: • buněčná imunita • humorální imunita • vnější a vnitřní fyzikální bariéry

1.1.1.

Buněčná imunita

Buněčná imunita je část nespecifické imunity, jejíţ reakce jsou zprostředkovány imunitními buňkami. Buněčná i humorální imunitní sloţka imunity spolu kooperují a jsou velice úzce provázány. Mezi převáţně buněčné imunitní reakce patří fagocytóza, nodulace, enkapsulace a koagulace (Turner, 1994). Zdůraznil bych hlavně fagocytózu, jelikoţ fagocytující buňky musí nalézt, pohltit a zneškodnit různé mikroorganizmy, které by mohly vyvolat nemoc. Velmi důleţitou funkcí imunitních buněk je syntéza 9

humorálních imunitních faktorů a jejich uvolňování do organismu. Zpětně zase mohou sloţky humorální imunity působit na buněčnou imunitu tak, ţe působí jako chemoatraktanty nebo opsonizační molekuly (Hořejší a Bartůňková 2005).

1.1.2.

Humorální imunita

Humorální, nebo také látková imunita zahrnuje nejen buněčné produkty, ale také látky vyskytující se v organismu, které mají imunitní funkci (Turner, 1994). Hlavními sloţkami humorální imunity jsou fenoloxidázová kaskáda, aglutininy, antimikrobiální faktory a lysozym (příp. „lysozyme-like“ aktivita) a také zde je třeba uvést koagulační kaskádu (Obr. 1), jelikoţ vytvoření zátky v místě poranění si ţádá kooperaci jak humorální tak buněčné imunity (Hořejší a Bartůňková 2005).

Obr. 1: Srovnání sráţení hemolymfy hmyzu a krve obratlovců. Koagulace obratlovců zahrnuje dvě cesty (vnitřní a vnější) a zapojuje Trombin a Fibrin. V literatuře se čím dál častěji uvádí souvislosti o propojení komplementu a koagulace. Koagulace hmyzu zahrnuje paralelní aktivaci bílkovin Fondue, TG a PO. Cílem obou typů koagulace je vytvoření zátky v místě poranění a zamezení ztrátám tělních tekutin (Loof a kol. 2011). Reakce jsou zprostředkovány čtyřmi signálními drahami a to: Toll, IMD, JAK/STAT a JNK, které jsou nejlépe prostudovány na modelu Drosophila melanogaster (Lemaitre a Hoffmann 2007, Theopold a Dushay 2007). Cesty jsou obvykle aktivovány povrchovými strukturami bakterií, které chybí hostiteli, jako jsou lipopolysacharidy (LPS), přítomné u G- bakterií, peptidoglykany (G- i G+ bakterie), a b-glukan nacházející se v buněčných stěnách hub. Komplexní signalizační kaskády regulují transkripci cílových genů s konzervovaným NF-kB, jako jsou motivy, které kódují například antimikrobiální peptidy. Tyto malé imunitní peptidy byly intenzivně studovány jen u několika málo druhů hmyzu, a to Hyalophora cecropia, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Calliphora vicina, Anopheles gambiae a Bombus pascuorum (Rees a kol. 1997, Trenczek 1998, Chernysh a kol. 2000, Vizioli a kol. 2001, Hultmark 2003, Wang a kol. 2004) 10

1.1.3.

Sociální imunita

Hlavní zlom v chápání imunity včel nastal relativně nedávno. Byl zaveden termín „sociální imunita“, coţ je koordinované chování jedinců v kolonii, které ve výsledku buď zlepšuje imunitní reakce jedinců, nebo nějakým způsobem omezuje parazita (Cremer a kol. 2007). Patří sem i relativně jednoduché interakce mezi dvěma jedinci. Sociální imunitu vyuţívají někteří blanokřídlí ţijící v koloniích (včely, vosy, mravenci, termiti, čmeláci). Stovky aţ tisíce jednotlivců uvnitř včelstva vzájemně kooperují při výchově plodu, krmení včelstva a ochraně hnízda před patogeny i škůdci. Taková sociální imunitní odpověď na úrovni kolonie má obdobné vlastnosti jako komplexní imunitní systém mnohobuněčného organismu, jednotliví jedinci jsou v něm jako jednotlivé buňky imunitního systému (Cremer a Sixt 2009).

Obr. 2: Úrovně obrany včelstva: (a) individuální obrana a imunita (b) párová obrana jako péče a krmení (c) obrana kolonie, hlavně matky (d) minimalizace vstupu infekčních agens (e) pouţívání pryskyřic a dalších environmentálních faktorů při ochraně kolonie potaţmo úlu. (převzato z Evans a Spivak 2010) Dříve se projevy sociální imunity braly jen jako způsob ţivota. Vědci si lámali hlavu s tím, proč mají včely méně genů pro imunitu (asi o dvě třetiny) neţ ostatní druhy hmyzu, a přesto se jim daří zvládat infekční tlak okolí (Cremer a kol. 2007). Navíc v úlu ţije pohromadě spousta jedinců, a tím je přenos parazitů ještě více usnadněn. Včely tráví většinu svého ţivota uvnitř hnízda v úzkém kontaktu a neustále se navzájem krmí. Stejně jako ostatní hmyz včely nemají klasický adaptivní imunitní systém, vyuţívají pouze vrozenou imunitu. Místo toho se u nich vyvinulo několik obranných mechanismů, jak se s mikrobiální infekcí vyrovnat: 1) kooperativní sociální chování jednotlivých členů skupiny pro boj s chorobami a jejich přenos v kolonii (Cremer a kol. 2007) 2) fyzické překáţky pokoţky a epitelu střeva 3) kvalitní buněčné a humorální imunitní odpovědi, které jsou sloţkami vrozené imunity.

11

Vybrané části sociální imunity: 1) péče Individuální péče včely o sebe sama (tzv. auto-grooming), nebo vzájemná péče o druhou včelu (tzv. allo-grooming). Cílem je odstranění cizorodých částic z těla, např. pylu, prachu, parazitů (Jander, 1976), ale je také důleţitým mechanismem obrany proti tracheálnímu roztoči Acarapis woodi (Danka a Villa 2000). Některé druhy včel jsou schopny se tímto způsobem vyrovnávat i s parazity roztoče Varroa destructor (hlavně asijské poddruhy, které jsou vůči tomuto parazitovi odolnější i geneticky) (Rath 1999). Řadí se sem i vzájemné krmení a krmení matky. 2) hygienické chování Hygienické chování je specifický druh obecné hygieny hnízda. V případě včel je hygienické chování kolektivní reakci dospělých včel na přítomnost nemocných a parazitovaných dělnic a plodu (larvy a kukly) (Rothenbuhler a Thompson 1956, Wilson-Rich a kol. 2009). Například jsou včelstva, která jsou schopna rozpoznat plod nakaţený virem P. larvae nebo roztoči V. destructor a takovýto plod odvíčkovat a zlikvidovat (Park a kol. 1937, Woodrow a Holst 1942, Rothenbuhler 1964). Citlivý čich na plísně zase umoţňuje zjistit a eliminovat plísňové nákazy (Gramacho a Spivak 2003). 3) „pohřební sluţba“ neboli undertaking (nekroforické chování) Jde o odstranění odumřelých dospělců (příp. i larev) z úlu, nebo hnízda. Cílem je sníţením kontaktu s potenciálními patogeny. Tato forma sociální imunity je nejznámější u mravenců (Howard a Tschinkel 1976, Hart a Ratnieks 2001). Je to efektivní způsob omezení kontaktu s patogeny. Místo s mrtvými mravenci je fyzicky oddělené od zbytku hnízda, starají se o něj specializovaní jedinci, kteří mají malý kontakt se zbytkem kolonie. Včely zase vyhazují mrtvé jedince před česno na zem, kde se o ně postarají běţní konzumenti (Robinson a Page 1988, Breed a kol. 2002). Pokud se do úlu dostane hlodavec a je včelami zabit, je příliš velký, aby jej včely vynesly z úlu, a tak jej ošetří vrstvou propolisu a zamezí tak šíření patogenů do nitra úlu (Visscher 1980). 4) úprava hnízda a prostředí Včely vyvinuly strategie, díky kterým klimatizují úl. Jsou schopny jej zahřát, ochladit i provzdušnit (Seeley a Visscher 1985). Pokud je plod v hnízdě, udrţují teplotu mezi 32-34 °C a tlumí výkyvy vlhkosti. Tato schopnost termoregulace je pouţívána i jako obrana proti biologickým hrozbám. Jednotlivé včely se mohou seskupit a kolektivně zvýšit teplotu na 45 °C, čímţ zabijí vosy, sršně, nebo i cizí královnu. Dělnice jsou schopny tuto teplotu krátkodobě snést (Esch 1960, Ono a kol. 1987). Existuje i několik studií o moţnosti indukovat „horečku“ jako obranu před patogeny, které nesnesou vyšší teploty. Takto je moţné bojovat proti plísňovým onemocněním, která je moţné omezit úpravou teploty (Bailey a Ball 1981), a dokonce i vývoj V. destructor můţe být teplotou narušen (Garadew a kol. 2003).

12

Včely jsou schopny vyprodukovat jistý druh pryskyřice, tzv. propolis, kterým kryjí shnilé či zaplísněné dřevo, vytvoří pevnou krustu a podhoubí jí nepronikne. Navíc propolis zabraňuje další hnilobě díky antifungálním vlastnostem (Lavie 1968, Seeley a Morse 1976). Propolis slouţí jako hydroizolační vrstva pro utěsnění trhlin a štěrbin, aby se zabránilo vniknutí organizmů a slunečního světla do hnízda, a také aby byly včely schopny udrţet správnou cirkulaci vzduchu. Má do jisté míry antibiotické a bakteriostatické účinky (Ribbands 1953, Visscher 1980). 5) dělba práce Temporální polyetismus je druh dělby práce, v němţ je plnění různých úkolů na základě věku. Ve včelstvu to můţe zvýšit zranitelnost patogenů na určité pracovní skupiny, ale můţe také představovat jistou překáţku pro přenos patogena. Například létavky (včely sbírající pyl, nektar a medovici) shromaţďují zdroje pro kolonii, ale zároveň přinášejí do úlu i parazity z venkovního prostředí (Naug a Camazine 2002). Jsou to nejstarší dělnice a za normálního stavu opouštějí úl těsně před svou smrtí, aby nepřidělávaly práci uvnitř kolonie. Toto je známo i u včel infikovaných nosematózou (Evans a Spivak 2010). Mezi další faktory ovlivňující odolnost včelstev vůči nákazám můţeme zahrnout i krátký generační cyklus během léta. Jejich rychlá výměna můţe mnoţení parazitů zkomplikovat. V zimě zase nevyletují mimo úl, a tak je sníţen přínos nových parazitů do úlu.

1.2.

Anatomicko-fyziologické bariéry

Včela medonosná je stejně jako ostatní ţivočichové citlivá na mnoho infekčních nemocí a parazitujících cizopasníků (Strachetska 2008). Jednotlivé včely, ale i celé včelí společenství si vybudovaly soubor zabezpečujících mechanizmů bránících vniknutí patogenů do těla. Vrchní vrstva těla, tzv. kutikula plní stejnou funkci, jako kůţe vyšších ţivočichů, je známa ale spíš jako vnější kostra, která chrání organizmus hlavně před mechanickým poškozením. Tato trojvrstevná povrchová krycí vrstva je sloţena z chitinu, sklerotinu a lipidů. Na jejím povrchu se nacházejí mastné kyseliny, vosky a dihydroxyfenoly, které působí proti bakteriím a plísním. Mechanickou ochranu před mikroorganizmy zajišťují i chloupky na povrchu těla. Citlivými místy pro vnik mikroorganizmů do těla jsou mezisegmentové blanky spojující jednotlivé části tvrdých povrchů. Obecně jsou na infekce a patogeny více citlivé larvy a mladý hmyz s povrchem těla ještě nezpevněným. Stářím a tvrdnutím chitinového povrchu se odolnost vůči mikroorganizmům zvyšuje. Dýchací ústrojí: Dýchací ústrojí je tvořeno systémem vzdušnic, které jsou spojeny s vnějším okolím. Výstelka těchto vzdušnic je ale pokryta stejným povlakem jako povrch těla a získává tak odolnost tvrdnutím a stárnutím stejně jako povrch těla (Strachetska 2008). Trávicí ústrojí: Trávicí ústrojí je nejcitlivějším místem pro napadení hmyzího organizmu mikroorganizmy (Strachetska 2008). S potravou se nákaza dostává do trávicího ústrojí, které je tvořené ze tří částí, a sice střeva předního, středního a zadního. Z těchto částí je na nákazu nejvíce citlivé střevo střední, protoţe neobsahuje chitinovou výstelku. Moţná právě proto se ve středním střevě vytváří mikroflóra, která bojuje proti nákazám 13

pocházejícím z potravy. Vysoký obsah jednoduchých cukrů (např. glukózy) a přitom nízký obsah kyslíku omezuje mnoţení bakterií. Důleţitou roli hraje i vzájemný boj o potravu mezi ve střevě jiţ existujícími bakteriemi.

1.3.

Střevní mikroflóra

Včela medonosná Apis mellifera, má charakteristickou střevní mikroflóru sloţenou z mnoha druhů mikroorganismů, které se zdají být specifické pro sociální hmyz. Udrţování této stabilní a odlišné mikroflóry se odvíjí od sociálního stylu ţivota tohoto hmyzu. Stejně jako u ostatních zvířat, bakterie ve střevech včel zřejmě řídí funkce důleţité pro zdraví hostitele. Nedávno byly popsány a zařazeny dle metagenomu bakterie střevní mikroflóry A. mellifera (Engel a Moran 2013). Dále byl zjištěn vysoký stupeň genetické rozmanitosti v rámci kaţdého z těchto druhů, kterou získaly pravděpodobně během koevoluce se svými včelími hostiteli. Některými vlastnostmi se podobají střevní mikroflóře člověka a jiných savců (Kau a kol. 2011, Royet 2011, Clemete a kol. 2012, Nicholson a kol. 2012). Střevní mikroflóra ţivočichů obvykle přispívá k vývoji, imunitě a výţivě a tím hraje velkou roli ve zdraví hostitele. Důleţitá je ovšem i časová a prostorová dynamika tohoto systému (Ley a kol. 2005, Claesson a kol. 2012, Pédron a kol. 2012).

Obr. 3: Metagenomové sekvence ze střeva včely (růţová barva), spadají do několika fylogenetických linií. Hlavní funkce dané skupiny bakterií jsou uvedeny v rámečcích. Barvy v trávicím traktu obrázku včely odpovídají barevnému označení ve fylogenetickém stromu dle místa, kde se nejčastěji vyskytují jednotlivé kmeny (lokalizace dvou Alphaproteobacteria a Bifidobacterium nejsou známy) (upraveno podle Engel a Moran 2013).

14

Sociální interakce mezi jedinci, například mateřská péče, nebo vzájemné krmení a krmení larev usnadňuje přenos střevních bakterií. Díky tomu je zde moţná koevoluce s hostiteli a vznik specializovaných symbiotických linií a konkurenční vyloučení nespecifických kolonizátorů. U mnoha bezobratlých se potomstvo vyvíjí nezávisle na rodičích a musí získat střevní bakterie z prostředí v kaţdé nové generaci. Nicméně, přenos u sociálního hmyzu, jako jsou termiti, mravenci, včely a vosy, je rozdílný. Kontakt matky s potomky a další sociální interakce jsou zdrojem symbiotické aktivace (Martinson a kol. 2001, Babendreier a kol. 2007, Cox-Foster a kol. 2007, Moran a kol. 2012, Sabree a kol. 2012). Hlavními zástupci jsou dva druhy, jeden gammaproteobakteriální, jemuţ byl nedávno přidělen oficiální název Gilliamella apicola a druhý Gamma-2, který byl také nedávno pojmenován Betaproteobacterium snodgrassella alvi. Dále sem patří také rody Firmicutes, Alphaproteobacteria, Bifidobacteria a Bacteroidetes (Kwong a Moran 2012). Někteří zástupci těchto druhů byli také nalezeni v útrobách různých druhů čmeláků (rodu Bombus)(Koch a Schmid-Hempel 2011). Přehled bakteriálních kmenů včel je na obr 3. Nesociální hmyz má střevní bakterie, které většinou spadají do známých bakteriálních rodů běţných v mnoha prostředích, coţ naznačuje, ţe mikroflóra je získána přes opakované kolonizace z oblasti ţivotního prostředí. Většina bakteriálních druhů vyskytujících se u rodů Apis a Bombus nebyla nalezena u včel samotářek, ani jinde v ţivotním prostředí (Matrinson 2011). V současnosti probíhá několik studií na téma probiotické bakterie. Spekuluje se o tom, zda by mohly být potravinovým doplňkem při krmení včel a zda by zvýšily jejich odolnost a podpořily imunitu. Hlavními cíli jsou Paenibacillus larvae, Varroa destructor, Nosema apis nebo ceranae ale i další onemocnění a paraziti včel. Tento výzkum je ovšem zatím pouze v začátcích a výsledků je jen málo (Evans a Lopez 2004).

2. Sloţení hemolymfy Oběhový systém hmyzu je otevřený, stejně jako u ostatních druhů členovců. K rozvodu ţivin do všech částí hmyzího těla slouţí tzv. hemolymfa, coţ je cirkulující tekutina naţloutlé, průsvitné barvy, která obsahuje mnoţství organických i anorganických látek. Na rozdíl od krve nerozvádí hemolymfa dýchací plyny, tuto úlohu zajištuje síť vzdušnic (trachejí), proto je oběhový systém poměrně jednoduchý. Funkci srdce zastává velká hřbetní céva, která pumpuje hemolymfu k mozkovým gangliím a dále do celého těla, kde omývá vnitřní orgány a je vedena i do nohou, tykadel a křídel. Její zpětná cirkulace se zajišťuje pomocí otvorů (ostií) po stranách hřbetní cévy, které při otevření nasají hemolymfu zpět z tělní dutiny do hřbetní cévy (Vácha a kol. 2004). Cirkulující hemocyty mohou napomáhat ke sníţení zatíţení nemoci. Například fagocytární hemocyty, které pohlcují bakterie které jiţ invadovaly do organismu. U dobře prostudovaného organismu Drosophila melanogaster jsou popsány tři hlavní třídy imunitních buněk – hemocytů. Jsou to plasmatocyty, krystalové buňky, a lamellocyty (Williams 2007). Podobné typy buněk, nebo jejich analogy, jsou pravděpodobně přítomny i u včel (De Graaf a kol. 2002). U D. melanogaster byly popsány i geny, které podmiňují fagocytózu bakterií (Kurucz a kol. 2007), hub (Li a kol. 2008), a dokonce i virů (Zambon a kol. 2005).

15

2.1.

Fenoloxidáza

Fenoloxidázová kaskáda (Obr. 4) je jednou ze základních částí vrozené imunity většiny bezobratlých ţivočichů. Cílem je aktivace enzymu fenoloxidázy (PO), který pak podporuje počátek melanizační kaskády. Melanizace se projevuje tvorbou barevného pigmentu melaninu. Dochází k ní u bezobratlých v místě poranění nebo někdy také v okolí patogena, který pronikl do těla. PO se kromě melanizace podílí i na koagulaci hemolymfy, tvorbě zátky v místě poranění, nodulaci, enkapsulaci a agregaci bakterií. Během PO kaskády buď vznikají, nebo jsou chemotakticky přitahovány také proteiny se schopností rozpoznávat cizí struktury, s antimikrobiální a opsonizační funkcí a proteiny zesilující degranulaci hemocytů, pohyb a adhezi buněk (Turner 1994, Gupta 2001, Cerenius a Soderhall 2004).

Obr. 4: Obecné schéma fenoloxidázové kaskády. Imunitní odpověď je spouštěna cizorodými částicemi, nebo strukturami na jejich povrchu, které jsou rozpoznány strukturami organizmu (BP = „binding protein“, coţ je protein vázající danou strukturu: glukan, lipopolysacharid či peptidoglykan) způsobují aktivaci kaskády serinových proteáz. Na konci této kaskády je enzym ppA (fenoloxidázu aktivující enzym), který aktivuje fenoloxidázu proteolytickým štěpením. Ten dále katalyzuje přeměnu chemických látek, jejímţ konečným produktem je pigment melanin. Celá kaskáda je regulována a to jak pozitivně mediátory imunitní odpovědi např. peroxinektinem tak negativně inhibitory proteáz. Přítomnost homologů serinových proteáz se vyskytuje jen u některých druhů ţivočichů, a proto jsou označeny čárkovaně (upraveno Pavlem Dobešem 2007 podle Söderhäll a Cerenius 1998, 2004).

16

Fenoloxizázová aktivita u včel není přítomna u larev do dvou dnů stáří, ale poté se prudce zvýší. Současná data ukazují na to, ţe hladina profenoloxidázy (proPO) koreluje pozitivně s věkem (Chan a Foster 2008). PO aktivita byla dobře zjistitelná u čtvrtého a pátého instaru včelí larvy (Marchler-Bauer a kol. 2005). Aktivita PO zabraňuje také pronikání spor P. larvae do včelích larev a je to jedno z moţných vysvětlení, proč jsou mladé larvy včel náchylnější k tomuto onemocnění a hynou.

počet dní po vylíhnutí Graf 1: Test PO činnosti. Koncentrace proteinů normalizované hemolymfy byly shromáţděny v průběhu prvních pěti dnů larválního vývoje. Aktivitu PO zde představuje absorbance při 520 nm. Všechna měření PO byla prováděna třikrát. Chybové úsečky = 2 standardní odchylky. Upraveno podle Chan a kol. (2009). Data z pokusu Chan a kol. z r. 2009 (viz graf 1) podporují model, ve kterém hostitelská larva reaguje na infekci a to nejen tím, ţe produkuje bílkoviny, které mohou bojovat přímo proti infekci, ale také prostřednictvím zapojení metabolických cest a stimulací zdrojů energie potřebných k jejich podpoře (Chan a kol. 2009). Schopnost larev vyuţívat melanizaci jako obranný mechanizmus byla zpochybňována, protoţe hladiny proPO jsou mnohem niţší neţ u dospělců (Randolt a kol. 2008). Ovšem Chan a kol. potvrdili velice citlivou metodou (metodou zaloţenou na bázi iontové výměny LC-MS/MS analýzy na LTQ-OrbitrapXL), ţe starší larvy jsou jiţ schopny PO cestu obrany proti infekci vyuţívat (Chan a kol. 2009).

2.2.

Lysozym

Lysozym (LSM) je bazický enzym tvořený 129 aminokyselinami o molekulové hmotnosti přibliţně 14,4 kDa. Existuje přinejmenším pět různých tříd lysozymů označovaných jako C-type (chicken type), G-type (goose type), bakteriofágový, houbový a bakteriální typ (URL 3). Lysozymy bezobratlých vykazují největší sekvenční podobnost s lysozymy obratlovců a to především s C-type lysozymy izolovanými z kuřete (Vilmos a Kurucz 1998). Všechny molekuly lysozymů obsahují charakteristické intramolekulární disulfidické můstky zpevňující jejich strukturu. K expresi genů kódujících lysozym dochází v různých částech trávícího traktu, v imunitních buňkách, epidermálních buňkách a u hmyzu také v tukovém tělese (Ponnuvel

17

a Yamakawa 2002). Produkce lysozymu probíhá v organismu neustále, bylo však prokázáno, ţe bakteriální infekce jeho syntézu posiluje. Primární funkcí lysozymu (LSM) je degradace peptidoglykanového obalu G+ bakterií, proto se dá očekávat, ţe bude hrát podstatnou roli při obraně proti P. larvae, kterým je G+ tyčinkovitá bakterie. Včely mají dva typy lysozymu a to c-typ (chicken-type) a i-typ (invertebrate-type). Ale při mikrobiálním ataku je více aktivován c-typ lysozymu (Evans a kol. 2006). Tyto dvě formy jsou odlišné. V některé literatuře se uvádí ţe LSM v reakcích chybí a v jiných zase ţe je ho málo, ale nejčastěji je moţné se setkat s tzv. lysozym-like aktivitou. LSM často spolupracuje s ostatními enzymy (hymenoptaecin, defensin a abaecin) i kdyţ o jejich kooperaci existuje velice málo dostupné literatury (Bilikova a kol. 2001, Evans a kol. 2006, Randolt a kol. 2008).

2.3.

Antioxidační enzymy

Jsou důleţitou součástí imunity ţivočichů, protoţe zabraňují poškození tkání oxidativním stresem, který je vyvoláván radikály kyslíku a dusíku. Jsou to kataláza, superoxiddismutáza (SOD) a glutathion-S-transferáza (GST). U včel jsou tyto enzymy důleţité hlavně při rozmnoţování, jelikoţ královna musí ve své spermatéce uchovat semeno trubců po dlouhou dobu. Jelikoţ včelí spermie jsou uchovány v aerobním prostředí a během skladování si zachovávají určitou metabolickou aktivitu (Blum a Taber 1965). Rozdílné hladiny katalázy jsou například u královen oplodněných a neoplodněných, na rozdíl od SOD, která je přibliţně ve stejných hladinách u obou. Rozmnoţovací ústrojí trubců rovněţ vykazuje jistou úroveň katalázy, SOD i GST. Tyto enzymy byly však detekovány i v ostatních tkáních včel ovšem v niţších koncentracích (Collins a kol. 2004). Antioxidační enzymy jsou důleţité i při rozmnoţování jiných druhů hmyzu (např. Drosophila melanogaster), i kdyţ tyto druhy hmyzu nemusí uchovat sperma tak dlouho jako královny sociálního hmyzu, kterým jsou kromě včel ještě třeba mravenci (Wolfner 2002). Například SOD konvertuje superoxidové aniony H2O2, které jsou zčásti odstraňovány katalázovou aktivitou. U mnoha eukaryot zase GST katalyzuje reaktivní metabolity kyslíku a jiné toxické molekuly, coţ je prvním krokem při jejich odstranění z těla (Ball a kol. 2000). V literatuře jsem nalezl pouze informace o třech antioxidačních enzymech. Jsou to kataláza, superoxiddismutáza (SOD) a glutathion-S-transferáza (GST) (Collins M. 2004). V naší laboratoři měříme ještě jeden marker oxidačního stresu, který vzniká peroxidací lipidů a tím je malondialdehyd (MDA) a naopak hladinu katalázy jsme neměřili. Existuje více antioxidačních enzymů, ale tyto jsou nejdůleţitější. Nejen kladení vajíček, ale také létání představuje důleţitou činnost spojenou s vysokou metabolickou aktivitou a nároky na energii, je tedy třeba odbourávat oxidativní metabolity hlavně v létacích svalech, ale i v jiných částech těla. V prvních 2-3 týdnech ţivota jsou včely dělnice zaměstnány v úle jako chovatelky, kojičky a krmičky a čističky a mimo úl nevyletují, takţe jejich oxidativní stres není tak velký. Největšímu oxidativnímu stresu jsou vystaveny hlavně létavky a to při běţných denních aktivitách, protoţe ty mohou nalétat i několik hodin za den během cest za pylem a nektarem. Během včelího letu se pravděpodobně produkují vysoké hladiny reaktivních forem kyslíku v létacích svalech. Jak je známo, největším producentem kyslíkových radikálů jsou 18

mitochondrie (Barazzoni a kol. 2000). Postupem času antioxidační aktivita slábne a včely stárnou díky neodbourávajícím se kyslíkovým metabolitům rychleji, jelikoţ jim metabolity poškozují tkáně, podobně jako ostatním ţivočichům (Pacifici a Davies 1991, Sohal a kol. 2002). Během léta včely dělnice pracují tak intenzivně, ţe délka jejich ţivota je 25-35 dní (Fluri a kol. 1982). Naproti tomu zimující včely nelétají, starají se o udrţení teploty v zimním chomáči a jejich ţivot trvá aţ 6 měsíců. Královna vyletí jen jednou na snubní let a délka jejího ţivota je 3-5 let (Winston 1987, Omholt a Amdam 2004).

2.4.

Antibakteriální peptidy

Repertoár nebuněčné imunity včel se u včel skládá hlavně ze čtyř polypeptidů, jejichţ tvorba je indukována bakteriální infekcí. Do hemolymfy jsou ale sekterovány, i kdyţ infekce zrovna neprobíhá. Jsou to apidaecin, hymenoptaecin, abaecin a včelí defendin. U včel se vyvinulo poměrně široké spektrum antibakteriální obrany, pravděpodobně kvůli častému výskytu G- bakterií asociovaných s rostlinami. Jeden z prvních objevených antimikrobiálních peptidů u včel byl royalisin, nalezen v mateří kašičce (Fujiwara a kol. 1990). Jako druhý byl pak objeven v hemolymfě z bakteriálně infikovaných včel další enzym, který byl nazván defensin1 podle Klaudiny a kol. (2005) (Casteels-Josson a kol. 1994). Později byly nalezeny ještě 3 další: apidaecin (Casteels a kol. 1989), abaecin (Casteels a kol. 1990), hymenoptaecin (Casteels a kol. 1993). Apidaeciny představují novou rodinu peptidů. Tyto tepelně stabilní, nehelikální peptidy jsou aktivní proti širokému spektru bakterií asociovaných s rostlinami a proti některým lidským patogenům. Projevují se spíše bakteriostatickými více neţ lytickými procesy. Chemicky syntetizované apidaeciny vykazují stejný baktericidní účinek jako jejich přirozené protějšky. Zatímco v hemolymfě dospělých včel jsou pouze aktivní antibakteriální peptidy, včelí larvy mají velké mnoţství neaktivních prekurzorů (Casteels a kol. 1989). Vybrané antibakteriální peptidy: apidaeciny – jsou převládající antibakteriální peptidy ve včelí hemolymfě, (Casteels a kol. 1989). Mají rychlý nástup a okamţitou antibakteriální aktivitu. Jsou selektivně baktericidní proti G- bakteriím. abaecin – je polypeptid sloţený ze 34 aminokyselin, který má široké antibakteriální účinky, ale pozdější nástup antibakteriální aktivity neţ apidaeciny. Pravděpodobně působí synergisticky s ostatními antibakteriálními peptidy (Casteels a kol. 1989). Jeho zvláštností je ztráta antibakteriální aktivity v přítomnosti fosfátového pufru. Je specifický proti G- bakteriím asociovaným s rostlinami. hymenoptaecin – je polypeptid sloţený z 93 aminokyselin, má hydrofilní vlastnosti (Casteels a kol. 1993). Inhibuje viabilitu G- i G+ bakterií.

19

3. Nemoci včel (parazité a patogeny) Stejně jako ostatní ţivočichové jsou chované a volně ţijící včely napadány různými parazity, viry, bakteriemi, plísněmi, roztoči a brouky. Ti mohou vyvolat u včelstva různá onemocnění. Nemoci často souvisejí s fázemi vývoje včelstev v jednotlivých ročních obdobích. V poslední době je kritickým obdobím podzim, jelikoţ v tuto dobu se včely připravují na zimování. Období se stane kritickým tehdy, kdyţ se mnoţství včel ve včelstvu rychle sníţí a zůstane jich málo na vytvoření zimního chumáče. Takové včelstvo zimu nepřeţije. V průběhu hlavní snůšky je život včel nejkratší, ale když se blíží podzim, život jednotlivých generací dělnic se prodlužuje. Zimní včely žijí i několik měsíců a mají větší hmotnost. Ovšem liší se nejen hmotností, ale i biochemickým složením organizmu zimních včel, neboť s pylem nabírají do svého těla také rezervní ochranné látky. Tím jsou úplně jinak vybaveny k obraně proti patogenům a nemocem různých obdobích roku. Existuje smnoho různých nemocí a parazitů napadajících včely, chtěl bych se zmínit o nejzávažnějších z nich. Zvláště nebezpečné jsou pro včely roztoči, kteří umožňují přístup bakterií a virů skrze rány, které včelám způsobují.

3.1.

Roztoči

Varroáza: Včelu medonosnou napadá parazit Varroa destructor (Obr. 5), český název kleštík včelí se příliš neujal (URL 1). Je to parazit nepůvodní - dovezený z Asie. Tamní včela východní je díky dlouhověkému soužití s roztočem geneticky vybavena schopnostmi, jak jeho populaci ve včelstvu udržet v míře, která včelstvo nezahubí. Naše včely vůči němu nemají přirozenou obranyschopnost a varroáza (tak se napadení tímto roztočem nazývá) by je zničila. Varroáza je velkým problémem obzvlášť na podzim, kdy zpomaluje fyziologický rozvoj zimních včel v důsledku svého prudkého rozvoje a šíření (Hanousek 1991). V důsledku parazitace na plodu se líhnou slabší včely s nižší hmotností, což je obzvlášť před zimou velmi nežádoucí. Tento roztoč využívá pro svůj život včelí ochranné látky. Ty čerpá z hemolymfy jak dospělých včel tak i ze včelího poldu. Samička je zhruba 1,2 mm dlouhá, oválného tvaru a zrzavě hnědého zbarvení. Má čtyři páry nohou s přísavnými polštářky. Včely ji přenášejí na svém těle a když zaletí do jiného včelstva, je velká pravděpodobnost, že tam roztoč zůstane. "Úspěšní" jsou v tomto směru zejména trubci, kteří se toulají od úlu k úlu - včely je vpouští dovnitř, i když nejsou "jejich". Oplozené samičky roztoče se nechají zavíčkovat společně s larvou v buňce (URL 1). Zde nakladou vajíčka, z kterých se vylíhne další generace roztočů. Z prvního vţdy sameček, z ostatních samičky. Ještě před vylíhnutím včelí larvy se v buňce spáří a samečkové potom zahynou. 
Roztoči sají z včelích kukel i dospělců hemolymfu. Takto narozené včely se rodí s různým stupněm poškození, které zkracuje jejich ţivot. Včelstvo tak postupně slábne, aţ nakonec zahyne zcela (nejčastěji v průběhu zimy, kdy se ţádné včely nelíhnou). Včely většinou před smrtí opustí úl. 
Nezanedbatelný je i přenos viróz roztočem. Podobně jako klíště u člověka, patří do stejného řádu - roztoči.

20

Obr. 5: foto Václav Švamberk - roztoči Varroa destructor

3.2.

Virové nákazy

Virové nákazy se projevují různě - včely se rodí se zakrnělými křídly, černají matečníky, mají pytlíčkovitý plod. Nejčastější z nich jsou uvedeny v tabulce T1. Samy názvy virů napoví mnoho o jejich projevech. Virózy nebyly takovým problémem do příchodu varroázy, protoţe je tento roztoč jejich významným přenašečem (Bowen-Walker a kol. 1999, Chen a kol. 2004, Shen a kol. 2005, Gisder a kol. 2009). Klasická cesta přenosu je mezi jedinci ve včelstvu nebo z královny na potomky (Chen a kol. 2006, de Miranda a Fries 2008). Platí pravidlo, ţe slabší včelstva jsou k virovým nákazám náchylnější neţ silnější (URL 1, Chen a Siede 2007, de Miranda a kol. 2010). Název viru virus deformovaných křídel virus akutní paralýzy včel virus chronické paralýzy včel virus pytlíčkovitého plodu virus černání matečníků kašmírský virus

Zkratka DWV APV (ABPV) CPV (CBPV) SBV BQCV KBV

Význam zkratky Deformed Wing Virus Acute (Bee) Paralysis Virus Chronic (Bee) Paralysis Virus Sacbrood Virus Black Queen Cell Virus Kashmir Bee Virus

T1 – nejčastější virové nákazy včel a jejich zkratky. Existuje jich samozřejmě více, ale tyto jsou nejvýznamnější (převzato z URL 1).

3.3.

Bakteriální nákazy

Jako nejčastější bakteriální nemoci jsou v literatuře uváděny nejvíce hniloba včelího plodu a mor včelího plodu. Dále pak méně závaţné jako jsou Septikemie včel, kdy působení metabolitů nebo toxinů v hemolymfě vyvolává hynutí včel, nebo Rickettsióza, která se někdy vyskytuje společně s nosematózou a septikémií (URL 5).

21

Hniloba včelího plodu Toto onemocnění je způsobeno širokou škálou bakterií, které napadají ještě nezavíčkovaný plod (URL 5). Hlavně jsou to ale dva zástupci a to Melissococcus pluton a Paenibacillus alvei. Obvykle napadené larvy hynou ještě před zavíčkováním. Ty co přeţijí mají ve výkalech bakterie, které se tak dále šíří. Pokud se vyvinou a vylíhnou jsou dospělé včely menší a šíří patogenní zárodky dál. Pokud je včely čističky z úlu neodstraní, pak v buňkách uschnou. Hniloba včelího plodu hrozí během jara, obzvlášť, kdyţ je vlhké. Napadená včelstva slábnou a obvykle hynou. Protoţe se jedná o nebezpečnou nemoc, je třeba při její diagnóze okamţitě informovat Státní veterinární správu. Je vymezeno ohnisko vzniku a také vytyčena ochranná pásma v okolí nákazy. Mor včelího plodu (Paenibacillus larvae) Paenibacillus larvae je tyčinkovitá G+ bakterie (Obr. 6). Jde o původce včelího moru, který tvoří v úlu velice odolné spory (Obr. 7). Ty jsou přizpůsobeny na dlouhodobému přeţívání v nepříznivých podmínkách. Ţivotnost spor při běţné teplotě je několik desítek let, teplotu 120 °C přeţívají spory moru několik hodin a jsou poměrně odolné i vůči chemickým preparátům (URL 2). V laboratoři se přítomnost těchto bakterií dá dokázat kultivací na běţné ţivné půdě (Obr. 8). Klinickým důkazem je potom tzv. sirkový test, kdy se mrtvá, nakaţená larvička „táhne“ jako vlákno z buňky (Obr. 9). Na tuto nákazu jsou nejvíce náchylné mladé larvy (do druhého instaru), starší larvy a dospělci uţ získávají proti těmto sporám určitý druh odolnosti (Brødsgaard 1998). Spory vyklíčí ve střevě larev, bakterie se začnou mnoţit. Přitom vylučují enzymy, které poruší membránu ţaludku a napadají buňky výstelky ţaludeční stěny. Po poškození a likvidaci těchto buněk má mikrob otevřenou cestu do hemolymfy a do tkání těla larvy. Dochází k silnému namnoţení mikroba v tukovém tělese, epitelu vzdušnic, kutikule a hemolymfě. V té době uţ zavíčkovaná larva, těsně před zakuklením, hyne a dochází k jejímu rozkladu kvůli systémovému kolapsu. Po vyčerpání všech ţivin z těla larvy se namnoţené bakterie opět mění na spory. Ţiviny z jedné larvičky umoţní namnoţení několika miliard bakterií. Bakterie se přemění na spory a ty jsou pak zdrojem nákazy pro další larvy v úlu. Včely se snaţí odstranit rozloţenou hmotu larvy a tím dochází k rozšiřování infekce a kontaminaci potravy mladých larev (URL 2). Problémem je také dlouhověkost spor přeţívajících ve dřevě, proto je častou příčinou vzniku tohoto onemocnění pouţívání starých úlů nebo příliš dlouhodobá recyklace rámků (včelařství 2009). Kdyţ infekce zasáhne včelstvo v plné síle, tak ubývá larviček a tím i dospělých včel. Včelstvo postupně slábne, přestává střeţit česno, takţe jeho kolaps bývá urychlen loupeţí včel z okolních včelstev, které se současně kontaminují astronomickými počty spor a mohou způsobit infekci ve svých včelstvech (URL 2).

22

Obr. 6: Původce moru včelího plodu Paenibacillus larvae tyčinkovité vegetativní stadium. (Optický mikroskop, zvětšení 2000x) převzato z URL 2

Obr. 7: Příčný a podélný řez sporou Paenibacillus larvae. Na obrázku jsou zřetelné početné ochranné obaly, díky nimţ je spora nesmírně odolná. (Elektronový mikroskop) převzato z URL 2

Obr. 8: Typický růst v laboratoři.

P.

larvae

na

ţivné

půdě

převzato z URL 2

23

Obr. 9: Tzv. „sirkový test“. Kdyţ larva v buňce uhyne, plyny nafouknou víko, nebo jej jinak poškodí. Při kontrole se pak taková buňka odvíčkuje a při zaboření sirky do takovéto buňky se táhne tkáň mrtvé larvy jako vlákno. převzato z URL 2

Byla dokumentována účinnost antimikrobiálního peptidu defensinu proti P. larvae v testech inhibice růstu (Bilikova a kol. 2001, Bachanova a kol. 2002). Očekává se, ţe P. larvae by měl být důvodem zvýšené hladiny některých antimikrobiálních peptidů a také antibakteriálních enzymů jako lysozymu a fenoloxidázy. Kromě toho lze odhadovat, ţe protein, který zajišťuje odolnost u staších larev, se u mladých vyskytuje ve velice nízkých koncentracích, nebo vůbec (Chan a kol. 2009). Chan a kol. uvádí ve své práci z roku 2009, ţe byli schopni v jejich laboratoři identifikovat čtyři nízkomolekulární proteiny, a to: lysozym, hymenoptaecin , apidaecin a defensin. V porovnání se zdravými larvami byla hladina lysozymu zvýšena třináctinásobně a hladina hymenoptaecinu aţ šestnáctinásobně. U ostatních imunitních faktorů, které byly zkoumány nebyla iniciace G+ bakteriemi prokázána (Chan a kol. 2009).

3.4.

Prvoci

Nosemóza: Nosemóza je onemocnění zaţívacího traktu dospělých včel (URL 1). Způsobuje jej prvok patřící do rodu Mikrosporidie a to Nosema apis, (případně Nosema ceranae, která je odolnější, agresivnější a onemocnění má rychlejší průběh), který se mnoţí v ţaludku včely. Včely nedokáţí strávit řádně potravu, mají průjmy a kálí i v úlu. Ve výkalech je mnoho nestrávené sladiny, která láká další včely a tak se onemocnění šíří. Nosemóza napadá včelstva zejména na jaře, kdy včely nemají dostatek příleţitostí k pročišťovacím proletům. Prvok špatně snáší vysokou teplotu. Platí pravidlo, ţe slabší včelstva jsou k virovým nákazám náchylnější neţ silnější. V letním období potom onemocnění mizí (Zander 1909, Fries a kol. 1996, Fries 2010).

3.5.

Houbová onemocnění

Houbová onemocnění (plísně): Zvápenatění včelího plodu je u nás nepříliš častým onemocněním včelího plodu se projevuje mumifikací larev způsobenou Ascosphaera apis (Qin a kol. 2006, Aronstein a Murray 2010). Larvy se infikují potravou; onemocnění propukne v jejich střevech. 24

Houba spotřebovává veškerou potravu, kterou larva dostane, nakonec ji zcela vyhladoví. Poté prorůstá a poţírá celé tělo, které "zvápenatí". Barva mumií bývá nejčastěji bílá nebo má různé odstíny šedé. Spóry přeţívají aţ 15 let. Zkamenění včelího plodu je taktéţ u nás vzácné onemocnění včelího plodu způsobené houbou Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus či Aspergillus niger (u člověka mohou tyto bakterie způsobit plicní onemocnění). Projevuje se mumifikací včelího plodu. Všechny tyto druhy bakterií se běţně vyskytují v přírodě - zejména v půdě. Ze střev onemocnění proroste celým tělem larvy, kterou postupně rozloţí. Mumie velmi rychle ztvrdne - odtud název onemocnění. Můţe napadnout i dospělé včely (URL 1, Morse a Flottum 1997).

3.6.

Brouci

Tumidóza: Malý úlový brouk lesknáček úlový - Aethina tumida je parazit původem z Afriky (URL 1). Nenapadá dospělé včely, ale včelí plásty s pylovými a medovými zásobami a také larvy, které poţírá. Naše včela medonosná nemá obranné mechanismy proti tomuto škůdci na rozdíl od afrických včel. Brouci umí oklamat stráţkyně, v úlu nakladou aţ 30.000 vajíček. Vylíhlé larvy zničí plásty, larvy a znehodnotí med výkaly. Zakuklí se v zemi před úlem a po vylíhnutí koloběh pokračuje. Brouk se můţe ţivit i sladkým ovocem - není na včelách závislý. Obrana proti tumidóze zatím není vyvinuta. Nejúčinnější by bylo zabránit importu přenašeče.

3.7.

Léčiva – sanguinarin

Doplňkové látky ve výţivě včel se pouţívají pro tlumení a prevenci včelích onemocnění. Existují různá antibiotika, fungicidní látky, chemikálie i rostlinné silice, které je moţné pouţít na podporu imunity včel. Pro moji práci je nejvíce důleţitý sanguinarin, coţ je přírodní kvartérní benzo[c]fenan-tridinový alkaloid (Tůmová 2010). Tento druh alkaloidů se nachází v kořenech rostlin Sanguinaria canadensis a Macleaya cordata a je hořký a jedovatý. Má však hojivé účinky. Jak uvádí prof. V. Šimánek (URL 4) v Číně a Japonsku jsou tyto rostliny vyuţívány v tradiční medicíně při léčbě plísňových koţních onemocnění, k desinfekci koţních poranění a při infekcích v ústní dutině. Hlavní sloţkou extraktu je směs alkaloidů sanguinarinu a chelerytrinu. Metabolismus sanguinarinu není bohuţel zatím plně objasněn. Na ČZU v Praze se zabývali schopností larev čelit infekčnímu tlaku patogenního mikroorganismu Paenibacillus larvae po podání sanguinarinu ve dvou různých koncentracích 0,1 mg/ml a 0,01 mg/ml. Bylo zjištěno, ţe ve skupině larev s přidaným sanguinarinem v koncentraci 0,01 mg/ml bylo mnoţství larev, které přeţily o 14 % vyšší neţ v kontrolní skupině. Ve skupině s koncentrací sanguinarinu v krmivu 0,1 mg/ml bylo procento larev, které přeţily o 10,2 % vyšší neţ v kontrolní skupině, ale niţší neţ po podání antibiotik. Z důvodu vyšší směrodatné odchylky jsou zjištěné rozdíly statisticky neprůkazné, podávání sanguinarinu ale ukazuje trend zvýšení přeţití neinfikovaných larev a larev infikovaných P. larvae (Havlík 2012). Ve Výzkumném ústavu včelařském se jiţ několik let pod vedením ing. Titěry pracuje na vývoji léčiva proti moru včelího plodu,

25

v němţ je jako účinná látka pouţit sanguinarin. Pomocí krmné placky se dostává do krmné kašičky a tím k nejmladšímu plodu, kde ničí spory moru.

4. materiál a metody 4.1.

biologický materiál (odběry)

Odběry pro první pokusy probíhaly v Rousínově, protoţe zde mám vlastní včelstva (Obr. 10). Vyřezával jsem plod z plodových plástů (Obr.12) a v laboratoři jsme vytahovali jednotlivé larvičky z buněk. Plod byl různého stáří, nejčastěji však čerstvě před zavíčkováním a nebo brzy po zavíčkování (Obr. 13).

Obr. 10: Úly v Rousínově (usazování roje). Následně se z plodu odebírala hemolymfa. Několik larev se poloţilo na Parafilm a natrhla se jim kutikula (Obr. 11). Hemolymfa byla poté odebrána jako směsný vzorek do Ependorfovy zkumavky s PTU (nebo bez PTU pro stanovení PO) a následně byla buď pouţita čerstvá ihned nebo zmrazená a uchovaná pro pozdější pouţití.

26

Obr. 11: Odběr hemolymfy z nesegmentovaných larviček na parafilmu.

Obr. 12: Vyřezaný čtvereček plodového plástu s několika vytaţenými larvičkami.

27

Obr. 13: Segmentovaný plod, světlý je mladší neţ zbarvený.

18.9.2012 jsme měli moţnost odebrat včely ze včelnice Včelařského výzkumného ústavu v Dole. Tyto zdravé včely bylo následně moţné pouţívat jako kontrolní (Obr. 14).

Obr. 14: Plodový plást s plodovou deskou a zásobami medu. Včely na této včelnici byly klidné a daly se odebírat rukou uchopením včely za křidélka. Odebírali jsme po deseti dospělých včelách z kaţdého úlu a vyřezali jsme kousek plodu. Celkově jsme takto odebrali vzorky z deseti úlů.

28

Obr. 15: Odběr hemolymfy z abdomenu pomocí skleněné kapiláry. Entomologický špendlík zapíchneme mezi 3. a 4. článkem abdomenu (Obr. 15). Včela musí fixovaná, ale ţivá, aby měla hemolymfa tlak a bylo moţné ji odebrat pomocí kapiláry (případně automatické pipety), která se poté vyprázdnila do Ependorfovy zkumavky. Je moţné, kromě vlastního pumpování zadečku, pomocí pinzety jemně masírovat, abychom odebrali co největší moţné mnoţství hemolymfy. Je nutné pracovat opatrně, abychom nekontaminovali vzorky vnitřním obsahem střeva nebo tkáněmi zadečku. Po odběru jsme včelu dekapitovali. Obr. 16: 19.9.2012 jsme odebírali vzorky na včelnici západně od Prahy. Toto stanoviště bylo určeno k likvidaci kvůli nakaţení morem včelího plodu (Paenibacillus larvae). Na tomto a ještě dvou dalších stanovištích od stejného majitele se odebraly vzorky ze 12ti úlů. Odebrali jsme zde zdravé, nemocné i sanguinarinem léčené včely.

29

4.2.

Kolorimetrické stanovení fenoloxidázy (PO)

Fenoloxidázová kaskáda je typická imunitní reakce bezobratlých ţivočichů, jejímţ výsledkem je hlavně melanizace hemolymfy. Je moţné ji měřit spontánní, nebo pomocí aktivace různými alkoholy. Spektrofotometrické stanovení PO aktivity bylo provedeno podle modifikovaného protokolu dle Goldsworthy a kol. (2002) a Benešová a kol. (2009). Protokol: 1. Fosfátový pufr (10 mM; pH 7,0): - roztok A: Na2HPO4.12H2O (Mr = 358,14;) → 89,535 mg Na2HPO4.12H2O se rozpustí v 25 ml destilované vody. - roztok B: NaH2PO4.2H2O (Mr = 156,01;) → 39,0025 mg NaH2PO4.2H2O se rozpustí v 25 ml destilované vody - přikapáváním roztoku B (má vyšší pH neţ A) do roztoku A upravíme na pH metru pH na 7,0 (celkově se přidá aţ 15 ml B, čímţ dostaneme asi 40 ml fosfátového pufru) 2. Roztok DOPA (3,4-dihydroxyphenylalanin; Mr = 197,2): koncentrace 3 mg/ml fosfátového pufru, 1 ml roztoku DOPA stačí na 5 jamek 3. 5 μl hemolymfy odebrat přímo do 95 μl fosfátového pufru (ředění hemolymfy 1:20). 4. promíchat otočením eppendorfky a centrifugovat v chlazené centrifuze (4°C) 5 min při 10000 g 5. 40 μl supernatantu přepipetovat do jamky na destičce a přidat 160 μl roztoku DOPA 6. na ELISA readeru měřit absorbanci při 492 nm během 30 min 7. změřené hodnoty převést do grafu (bodový graf závislosti absorbance na čase), proloţit přímkou a zobrazit rovnici regrese. Směrnice přímky vyjadřuje aktivitu PO – změna absorbance za min (au492/min). 8. au492/min vztáhnout na μl hemolymfy Kolorimetrické stanovení profenoloxidázové (pPO) aktivity 1.-4. stejné jako při stanovení PO aktivity 5. 40 μl supernatantu hemolymfa/fosfátový pufr smíchat se 40 μl čistého metanolu. 10 μl vzniklého roztoku přepipetovat do jamky na destičce a přidat 190 μl roztoku DOPA. 6.-7. stejný postup jako u PO 8. au492/min vztáhnout na μl hemolymfy

30

4.3.

Antibakteriální aktivita (G- bakterie)

Tato metoda se běţně pouţívá k měření aktivity komplementu u ryb či savců (Tolarová a kol. 2011), je ale pouţitelná i pro měření antibakteriální aktivity proti G- bakteriím hmyzích vzorků, v tomto případě měříme aktivitu antibakteriálních peptidů. Dle ţivočišného druhu probíhá měření při různé teplotě. Laboratorní teplota pro rybí a hmyzí vzorky, 37° C pro savčí vzorky. Protokol: Kultivace bakterií: Do růstového média (LB, Müller) 25 g/litr, sterilizovaného při 116°C/ 1,8 ATM/20 přidat Ampicilin (100 µg/ml) a 50 µl bakterií ze zamraţené suspenze E. coli kmen K12pluxAmp. Kultivace probíhá při 37°C a intenzivním třepání. Dále je třeba centrifugovat při 2000 ot/min/10min a 1x promýt pomocí PBS. Na závěr upravit optickou hustotu bakteriální suspenze na OD620=0,25 ± 0,05. Sloţení PBS pufru: 3,8 g Na2HPO4 * 12 H2O do 100 ml fyziologického roztoku, upravit pH na 7,4. Postup: Do jamek na destičku pipetujeme 160 µl bakt. suspenze a 40 µl hemolymfy s PTU. Vzorky i kontrolu pipetujeme v duplikátech. Měříme 1 hodinu v luminometru.

4.4.

Stanovení aktivity lysozymu

4.4.1.

Radiální difuze

Mnoţství lysozymu lze stanovit in vitro radiální difúzí v agaróze. Metoda vyuţívá Micrococcus luteus (CCM 169), který patří k nejcitlivějším mikroorganismům rozpouštěným tímto enzymem (Powning a Davison 1973) a je běţně pouţívána ke stanovení lysozymu ve vzorcích bezobratlých (Hyršl a Šimek 2003) a obratlovců (Tolarová a kol. 2007). Protokol: 1. Příprava půdy pro Micrococcus luteus : 2.8g nutričního agaru smícháme s 1.0g glukózy a doplníme dH2O na 100ml. připravenou půdu sterilizujeme min 30 min. v sušárně vyhřáté na 200°C. Po rozlití okamţitě uzavřeme Petriho misky a necháme ztuhnout zhruba 2 hodiny v laboratorní teplotě, aby se vytvořil pevný povrch.

31

2. Očkování Micrococcus luteus: M. luteus (CCM 169) očkujeme vyţíhanou kličkou na agarové plotny. Naočkované plotny obrátíme dnem vzhůru a necháme růst v laboratorní teplotě 3 – 4 dny. 3. Agarózový gel: 1,25g agarózy smícháme se 105 ml Britt. – Robinsonova pufru (0,492 g H3BO3 + 0,782 g konc. H3PO4 + 0,480 g konc. CH3COOH + 0,840 g NaOH do 305 ml dH2O, pH 7,0) a přidáme Micrococcus luteus. Vaříme ve vodní lázni a mícháme skleněnou tyčinkou. Gel naléváme na vyváţené podloţce do plastových víček na mikrotitrační destičky. Gely uchováváme vţdy ve vlhké komůrce. Jamky vysekáváme do gelu pomocí zbroušené jehly a vývěvy.

4. Nanášení vzorků: Kaţdá plotna, protoţe jsou různě silné, musí mít kalibraci. Kalibrace lysozymu - Sigma EC3.2.1.17 : 1. 2 mg/ml lys. / Britt-Robins. pufr 2. 5 mg/ml 3. 10 mg/ml 4. 15 mg/ml 5. 20 mg/ml Do jedné jamky obvykle kalibrační roztok nebo vzorek - v případě včelí hemolymfy bylo třeba pouţít mnoţství 50 μl neředěného vzorku. Kaţdý vzorek nanášíme do dvou jamek, poté z nich vypočítáme průměr. Inkubace plotny ve vlhké komůrce za laboratorní teploty probíhala 24 – 48 hodin. Odečet druhé mocniny průměru difúzní zóny pomocí probíhal s pouţitím speciálního měřítka IDP – SEVAC oproti tmavému podkladu. Mnoţství lysozymu ve vzorku bylo nakonec přepočítáno podle kalibrační křivky na mg/ml.

4.4.2.

LSM kit

Elisa kit pro měření lysozymu (LSM) Radiální zónovou difuzí jsme zjistili přítomnost LSM v hemolymfě včel ve velmi malém mnoţství, navíc bylo spotřebováváno velké mnoţství vzorku. Proto jsme hledali další, přesnější metodu, jak zjistit hladinu LSM. Jako pouţitelný se ukázal kit dodávaný firmou USCN, který bylo moţné pouţít na více organizmů testovaných v naší laboratoři.

32

Při prvním testu jsme u včelí hemolymfy naměřili hodnoty, které neodpovídaly předpokládanému výsledku, jelikoţ jsme pouţili ředění 10x a 100x . Dále jsme porovnávali proti sobě různé stáří a kasty včel (trubci, dělnice, larvy, dospělci) a také zdravé a nemocné včely (včely s morem, zdravé a léčené). Vzorky jsme ředili 10x coţ bylo moţné, ale stále ne zcela nejvhodnější ředění vzorků. Kvůli výsledným hodnotám, které měly příliš velký rozptyl pro stejný typ jedné skupiny vzorků, jsme hledali nejvhodnější ředění. Princip: Mikrotitrační destička v tomto kitu je předem potaţená protilátkou specifickou pro LSM. Standardy nebo vzorky se pak přidají do příslušných jamek mikrotitrační desky s biotin-konjugovanými specifickými protilátkami pro LSM. Dále Avidin konjugovaný s křenovou peroxidázou. Po přidání roztoku TMB substrátu dojde ke změně zabarvení. Reakce enzymu se substrátem je ukončena přidáním roztoku kyseliny sírové, coţ se projeví změnou barvy a měří se spektrofotometricky při vlnové délce 450 nm ± 10 nm. Koncentrace LSM ve vzorcích se pak stanoví na základě porovnání absorbance vzorků na standardní křivky. Protokol: Příprava reagencií: 1) Standard – ředění kontroly (Obr. 17):

Obr. 17 Jelikoţ jsme nepouţívali celou desku pro jedno měření, stačilo míchat menší mnoţství kalibračních roztoků. A to tak, aby finální mnoţství bylo 200 μl v kaţdé mikrozkumavce. Ze zásobní lahvičky s kontrolním vzorkem (koncentrace 400ng/mL) přepipetovat 30 μl (Standard) do 270 μl ředícího roztoku (Standard Diluent). Dále přidat 100 μl z předchozí mikrozkumavky do 200 μl Standard Diluent. Mnoţství je moţné upravit dle počtu jamek, které se pro jedno měření vyuţijí. 2) Assay Diluent A a Assay Diluent B – oba 2x naředit. Do 6 ml se přidá 6 ml dH2O 3) Detection Reagent A a Detection Reagent B – 100x zředit na pracovní koncentraci s pomocí ředících roztoku (A či B) připravených v kroku 3) 1 μl + 99 μl 4) Wash Solution – zředit 20 ml koncentrátu 580 ml dH2O 5) TMB substrate - neředěný Příprava vzorku: Vhodné ředění pro včelí hemolymfu je mezi 15x - 60x. Vzorek je dobré ředit pomocí Standard Diluent, jelikoţ není jisté zda běţný roztok pro ředění hemolymfy (fyziologický roztok pro G. mellonella) neovlivňuje výsledky .

33

Postup pokusu: 1) 7 jamek pro ředící standardní řadu, 1 jamka pro blank a ostatní pro vzorky. Pipetujeme 100μl standardu, blanku a vzorky do jamek. Inkubace 2 hodiny pro hmyzí hemolymfu jsme zvolili inkubační teplotu 29°C a to při všech krocích, kdy je třeba vzorky inkubovat. 2) Odstraníme kapalinu ze všech jamek, nepromývat. 3) Dáme 100 μl Detection Reagent A do kaţdé jamky. Inkubujeme 1 hodinu při teplotě 29°C. 4) Odstraníme roztok ze všech jamek a promyjeme 350μl Wash solution do kaţdé jamky pomocí multikanálové pipety, a nechat 1~2 minuty. Takto promyjeme jamky celkem 3x. Po posledním promytí odstraníme zbývající roztok. Přidáme 100 μl Detection reagent B do kaţdé jamky. Inkubujeme 30 minut při teplotě 29°C. 5) Opakujeme promytí celkem 5x, stejný postup jako v kroku 4. 6) Přidáme 90 μl Substrate Solution. Inkubujeme 15-25 minut na 29°C (Nepřekročit 30 minut). Chránit před světlem. Kapalina zmodrá přidáním substrátu. 7) Přidáme 50 μl Stop Solution. Kapalina se změní na ţlutou.. Měříme na Elisa readeru při 450 nm. Výpočet: absorbanci je třeba převést přes (exponenciální) rovnici regrese vypočítanou z hodnot kalibrace. Je třeba znát tzv. Eulerovo číslo 2.71828.

4.5.

Antioxidační enzymy

4.5.1.

SOD

Celkovou superoxiddismutázu (SOD) je možné stanovit pomocí metody dle Marklund and Marklund 1974. Protokol: 1) připravíme Tris-EDTA a dáme vychladit Tris-EDTA 50mM Tris 0.605 g m.w.121.14 10 mM EDTA 0.372 g m.w.372.24 rozmícháme v 100 ml dH2O pH upravíme pomocí Hcl nebo NaOH na pH 8.2 2) Do Ependorfovy zkumavky napipetujeme 20 µl hemolymfy s PTU a 33.3 µl chlazeného Tris-EDTA 3) promícháme pomocí vortexu 4) do jednotlivých Ependorfových zkumavek dáme požadované množství supernatantu (zdroj enzymu) a doplníme Tris-EDTA: 0 µl vzorku + 1 ml Tris-EDTA (blank) 10 µl vzorku + 0.990 ml Tris-EDTA

34

15 µl vzorku + 0.985 ml Tris-EDTA 20 µl vzorku + 0.980 ml Tris-EDTA 5) přeneseme 120 µl na destičku s jamkami 6) přidáme 180 µl 200 µM Pyrogallolu do každé jamky postupně ředíme: Ependorfova zkumavka: 12.6 mg Pyrogallolu v 1 ml Tris-EDTA (0.1 M) zkumavka 1: 200 µl (Eppendorf) + 9.8 ml Tris-EDTA (2 mM) zkumavka 2: 1ml (zkumavka 1) + 9 ml Tris-EDTA (0.2 mM) 7) měříme rychlost autooxidace při vlnové délce 440 nm na Spektrofotometru 20 minut v intervalu 2 minut. 8) vyhodnocení – byla vypočítána inhibice enzymatické reakce pro jednotlivá ředění vzorku a vyhodnocena oproti blanku.

4.5.2.

GST

Stanovení antioxidačních enzymů glutathion S-transferáz (GST), které hrají významnou roli při odbourávání xenobiotik a dalších endogenních látek. Postup byl proveden podle Buyukguzel a kol. (2010). Protokol: 1) Přepipetujeme 30 l vzorku (hemolymfa s PTU) do Ependorfovy zkumavky s 30 l 50 mM fosfátového bufferu, pH 7.0 (870 mg K2HPO4 ve 100 ml dH2O a 680 mg KH2PO4 ve 100 ml dH2O) 3) vezmeme 50 l vzorku a přidáme ho do Ependorfovy zkumavky, která obsahuje 830 l fosfátového pufru pH 7.0 4) Přidáme 70 l 20mM GSH 30.7 mg GSH v 5 ml 50 mM fosfátového pufru K2HPO4, pH 7.0 5) Přidáme 50 l 25 mM CDNB čerstvé/citlivé na světlo 25.3 mg CDNB v 5 ml (3 ml ethanol 96% vortex + 2 ml dH2O) 6) Vše smícháme dohromady a promícháme (Blank: 880 l 50 mM fosfátovího bufferu, pH 7.0 + 70 l 20 mM GSH + 50 l 25 mM CDNB) 7) Přeneseme 300 µl na destičku s jamkami pro Elisa Reader 8) Zvýšení absorbance měříme při 340 nm po dobu 10 minut Specifická aktivita GST je vyjádřena jako nmol GSH-CDNB vytvořeného konjugátu/min/mg proteinu, s použitím extinkčního koeficientu 9.6 mM-1 cm-1.

35

A=Є.c.l A = změna absorbance Є = extinční koeficient (9.6) c = enzymatická aktivita l = optická délka jamky (1cm)

4.5.3.

MDA

Malondialdehyd (MDA) je konečným produktem radikály zprostředkované lipoperoxidace polynenasycených mastných kyselin. Určujeme jej z toho důvodu, ţe je markerem oxidačního stresu a tím umoţňuje zjištění aktivity antioxidačních enzymů. MDA je toxická molekula reagující s lipidy, proteiny či DNA, čímţ ovlivňuje fyziologické mechanismy v těle. Protokol dle Jain a Levine (1995). Stanovení Malondialdehydu (MDA) Minimální mnoţství vzorku je 0.2ml hemolymfy Peroxidaci lipidů v hemolymfě je moţné měřit pomocí vzniklého malondialdehydu (MDA)(konečný produkt peroxidace mastných kyselin) pouţitím thiobarbiturové kyseliny (TBA) jakoţto aktivní látky (TBARS) (Jain a Levine, 1995). MDA reaguje s TBA, vytvoří se barevný komplex, jehoţ absorbanci měříme pomocí filtru 532 nm. Supernatant (0.2ml) z hemolymfy (s PTU- nemá nepříznivý vliv na test) smícháme v Eppendorfově zkumavce s 0,8 ml fosfátového pufru (PBS, pH 7,4) který obsahuje 18mM NaCl), a 18mM Na2HPO4 a 0.025 ml butathyl-hydroxytoluenu (BHT 0.04 M v 96% ethanolu), abychom zabránili umělému zvyšování MDA během experimentu. Pak přidáme do zkumavky s 0.5 ml kyseliny trichloroctové (TCA 30%) a chladíme na ledu po dobu nejméně dvou hodin za občasného protřepání. Po inkubaci odstředíme při 2000g po dobu 15 min a 1 ml supernatantu přepipetujeme do Eppendorfovy zkumavky s 0,075ml 0,1 M EDTA a 0,25 ml kyseliny thiobarbiturové (TBA, 1% w/v v 0.05 M roztoku NaCl). Poté protřepeme a inkubujeme ve vroucí vodní lázni po dobu 45 minut. Vzorek ochladíme na pokojovou teplotu, přepipetujeme na destičky (300μl do kaţdé jamky) a měříme absorbanci produktů TBARS při 532 nm. Nakonec TBARS koncentraci stanovíme za pouţití extinkčního koeficientu barevného komplexu 1,56 x 105 M-1 cm-1, coţ vyjadřuje jeden mg proteinu. Obsah v hemolymfě vyjádříme v nmol/mg proteinu. Koncentrace proteinu v supernatantu byla stanovena pomocí procedury od BioRad Kit s pouţitím bovinního séra jako standardu pro albumin. A=є.c.l



c = A/є

є (M-1cm-1) je extinční koeficient = 1.56 x 105 M-1cm-1 c je enzymatická aktivita (mol/l → mmol/ml → celkové proteiny → mmol/mg proteinů → nmol/ng proteinů)

36

l je dálka jamky = 1cm

4.6.

Stanovení nitritů dle Griesse

Za přítomnosti kyslíku podléhá oxid dusnatý autooxidaci. Ve vodném roztoku vznikají z NO tímto procesem nitrity (NO2-) a nitráty (NO3-). Griessovou metodou spektrofotometricky stanovujeme nitrity po diazotaci sulfanilamidu a kopulaci s N-(1-naftyl)ethylendiaminem. Protokol dle Krishnan a kol. (2006). Protokol: Zásobní roztok NaNO2 (SS) – 17.6 mg NaNO2 + 500 ml dH2O = 520 μM NO2Kalibrační křivka: Zředíme zásobní roztok 10x v pufru nebo v mediu pouţitém na experiment 100 μl SS + 900 μl pufru nebo media = nejvyšší bod kalibrační křivky 52 μM NO2Poté vytvoříme 8 mnohonásobných ředění 0.5 ml : 0.5 ml = 26, 13, 6.5, 3.25, 1.625, 0.813, 0.406, 0.203, a 0.5 ml samotného pufru nebo media jako poslední bod křivky 1. 100 μl SS + 900 μl media = 52 μM 2. 500 μl (52 μM NO2-) + 500 μl media = 26 μM 3. 500 μl (26 μM NO2-) + 500 μl media = 13 μM 4. 500 μl (13 μM NO2-) + 500 μl media = 6.5 μM 5. 500 μl (6.5 μM NO2 ) + 500 μl media = 3.25 μM 6. 500 μl (3.25 μM NO2-) + 500 μl media = 1.625 μM 7. 500 μl (1.625 μM NO2-) + 500 μl media = 0.813 μM 8. 500 μl (0.813 μM NO2-) + 500 μl media = 0.406 μM 9. 500 μl (0.406 μM NO2-) + 500 μl media = 0.203 μM 10. 500 μl media nebo pufru Vlastní Griessova reakce: -Vzorky centrifugovat při 5000 x g/5 min/4°C -Pipetovat na deštičku v paralelách: 150 μl vzorku nebo kalibračního roztoku 150 μl Griessova činidla (Sigma) -Inkubovat 15 minut -Změřit absorbanci při 546 nm na spektrofotometru -Kalibrační řada: odečíst pozadí od vzorků, průměry z paralelních hodnot, dosadit koncentrace vzorků podle kalibrační křivky, spojnice trendu a regresní rovnice

4.7.

Nakaţení entomopatogenními hlísticemi

Infekce včelího plodu entomopatogenními hlísticemi (EPN) V naší laboratoři se zabýváme mimo jiné i infekčností EPN na larvy hmyzu. EPN jsou běţné v přírodě, kde pomáhají udrţet rovnováhu. Napadají některé larvy hmyzu.

37

K tomu jim pomáhají symbiotické bakterie, které po invazi do těla hostitele pomáhají rozloţit celý obsah larvy (Dobeš a kol. 2012). Infekční juvenilní stádia (infective juveniles - IJs) EPN (Heterorhabditis bacteriophora) se namnoţila v larvách G. mellonella. IJs byly uchovány v H2O. Na Petriho misku s kouskem buničiny se poloţilo několik larev včelího plodu a k nim se napipetovala suspenze IJs ve vodě. Infekce probíhala při laboratorní teplotě.

5. Chemikálie aceton – Merci s.r.o., Česká republika butathyl-hydroxitoluen (BHT) – Sigma-Aldrich, USA 1-chloro-2,4-dinitrobenzen (CDNB) – Aldrich, USA 3,4-dihydroxyphenilalanin (DOPA) – Lachema, Česká republika EDTA – Fluka, Nizozemí glutathion (GSH) – Sigma-Aldrich, USA Griessovo činidlo – Sigma, Německo kyselina thiobarbiturová (TBA) – Sigma-Aldrich, USA kyselina trichloroctová (TCA) – Sigma, Německo LSM kalibrace – Sigma, Německo LSM kit – USCN, USA phenylmethanesulfonil fluorid (PMSF) – Sigma, Německo Protein assay – bio-rad, USA Pyrogallol – LOBA Feinchemie, Rakousko SDS – Fluka, Nizozemí Tris – Penta, Česká republika Ostatní běţně pouţívané chemikálie například pro přípravu pufrů a různé soli jsou z Lachema Brno, Česká republika.

6. Výsledky 6.1.

PO, pPO

Postup výpočtu aktivity PO vysvětlím na jednom vzorku trubčí larvy. Měří se spontání PO, metanolem aktivovaná pPO a také reakce s PTU, kde by měly antikoagulační účinky rapidně sníţit aktivitu PO. 1. Nejprve je třeba vypočítat průměr duplikátů z naměřených hodnot na elisa readeru. trubec - čas (min) PO PTU pPO 0 0.148 0.168 0.107 5 0.180 0.192 0.109 10 0.202 0.203 0.112 15 0.217 0.206 0.114 20 0.228 0.207 0.117 25 0.239 0.208 0.119 30 0.247 0.208 0.121 38

T2 2. graf proloţíme regresní přímkou a pomocí rovnice regrese zjistíme změnu absorbance za minutu, neboli aktivitu PO.

graf 2 3. na závěr vztáhneme aktivitu na 1 μl hemolymfy. Coţ v případě PO znamená vydělit 2 (2 μl hemolymfy v jamce) a v případě pPO vynásobit 4 (0.25 μl hemolymfy v jamce) trubec PO PTU pPO změna absorbance/min 0.031 0.011 0.0005 aktivita PO/1 μl hemolymfy 0.0155 0.0005 0.0025 T3 – výsledná fenoloxidázová aktivita v 1 μl hemolymfy trubčí larvy. Stejným způsobem je dopočítána aktivita vzorků dělničí hemolymfy (T4) kadáveru (T5)

a

čerstvá hemolymfa dělnice PO PTU pPO změna absorbance/min 0.0024 0.0012 0.0006 aktivita PO/1 μl hemolymfy 0.0012 0.0006 0.0024 T4 – výsledná fenoloxidázová aktivita v 1 μl hemolymfy dělničí larvy. čerstvý kadáver PO PTU změna absorbance/min 0.0018 0.0005 aktivita PO/1 μl hemolymfy 0.0009 0.0002 T5 – výsledná fenoloxidázová aktivita v 1 μl kadáveru.

pPO 0.0003 0.0016

39

graf 3: porovnání aktivity PO vzorků v 1 μl hemolymfy

6.2.

Antibakteriální aktivita

Všechny vzorky pocházejí z larev dělnic odebraných v Rousínově. Antibakteriální aktivita (% inhibice) byla počítána u všech vzorků v čase 10 minut, jelikoţ v tomto čase byla všecna měření poměrně lineární a ustálená, nijak výrazně neklesala, ani nestoupala.

graf 4 (čerstvá hemolymfa)

graf 5 (čerstvá hemolymfa)

Při prvním měření hemolymfy dělničích larev byl naměřen 32% úbytek bakterií (viabilita je úměrná liminiscenci) proti kontrole po deseti minutách měření, při druhém měření stejného vzorku byl zaznamenán 30% pokles.

40

graf 6 (čerstvá hemolymfa, čerstvá hemolymfa znečištěná tukovým tělesem, zmraţená hemolymfa, zmraţená hemolymfa znečištěná tukovým tělesem) (zkratky v grafu: H = hemolymfa, z = zmraţená, č = čerstvá, t = tukové těleso) Největší antibakteriální aktivitu vykázal vzorek čerstvé hemolymfy, který dosáhl 67% inhibice. Vysoké hodnoty byly naměřeny i u vzorků znečištěných jinými tkáněmi a to 64% u čerstvé a 56% u zmraţené hemolymfy, opět po deseti minutách měření. Nejslabší inhibici 45% jsme pak naměřili u zmrazeného vzorku čisté hemolymfy (graf 6).

graf 7: (modrá - zmraţená hemolymfa, graf 8 (zmrazená hemolymfa) červená - zmrazená hemolymfa bez PTU) Inhibice u zmrazené hemolymfy s PTU byla 38% a 31% a 40% inhibice nastala u zmraţené hemolymfy bez PTU. V grafu 7 prudce klesá červená linie, protoţe se hemolymfa bez přidání antikoagulantu (PTU) sráţí a černá díky aktivaci koagulační a fenoloxidázové kaskády. V tomto případě se nejedná o zvýšení mortality bakterií, ale o “zastínění” bakterií černým melaninem.

41

6.3.

Aktivita lysozymu

6.3.1.

Radiální difuze

1. měření: Cílem bylo zjistit koncentraci lysozymu (LSM) a ředění hemolymfy. Bylo vyzkoušeno ředění 1.5x, 2x, 3x, 5x, 8x, 6x, 10x, 11x, 20x a koncentrovaná hemolymfa v mnoţství 5 µl na jamku. Kalibrace vyšla dle očekávání, ale veškerá ředění pro tento pokus jsou nepouţitelná, jelikoţ se kolem jamky s 5 μl koncentrované hemolymfy vytvořilo po 48 hodinách vyčeření podobné 0.1 μl kontrolního LSM. Bylo nutné zvýšit objem vzorku v jamkách pro přesnější výsledek. 2.měření: Změnou oproti běţnému protokolu byla vyšší vrstva agarózového gelu s M. luteus na Pertiho misce tak, aby se do jamek dalo napipetovat 50 μl vzorku. vzorky: č1 – larvy dělnic s PTU, č2 – larvy dělnic (kadaverozní), č3 – larvy trubců bez PTU Čísla v tabulce T6 jsou hodnoty druhé mocniny průměru difúzních zón.

číslo vzorku 1 1 2 3 3 kalibrace 0.1 kalibrace 0.2 kalibrace 0.5 kalibrace 1.0 kalibrace 2.0 kalibrace 3.0

po 24 hodinách 73.95 75.70 72.25 68.90 72.25 44.90 56.25 77.45 106.10 148.85 171.60

k 0.5 k 0.2

k 1.0

č2 – larvy dělnic (kadaverozní) k 2.0 k 0.1

k 3.0 č3 – larvy dělnic s PTU č1 – larvy trubců bez PTU

Obr. 18: fotka z 2. měření. 42

(Obr. 18) Okolí jamek není pročeřeno jako u kontrolních, ale je zabarveno do ţluta aţ ţlutohněda. To je způsobeno tím, ţe vzorky hemolymfy nebyly ideálně čisté, takţe příměsi tkání znečistily okolí jamek a u vzorku trubčí hemolymfy je zabarvení vice do hněda kvůli absence antikoagulantu (PTU)

6.3.2. 1.měření: vzorek larva dělnice larva trubec dospělec dělnice homogenát dospělců homogenát dospělců T7

LSM kit ředění 100x 100x 10x 100x 10x

absorbance 0.915 0.318 1.137 1.083 0.772

ng/ml 191.7 19.6 44.7 364.1 11.1

Metoda je funkční, ale hodnoty mají příliš velké rozpětí. 2.měření vzorek (ředění 10x) H dosp. MOR L3 H dosp. MOR L8 H dosp. MOR L1 H dosp. léčené M6 H dosp. léčené M11 H dosp. léčené M17 H dosp. zdravé 5 H dosp. zdravé 10 H dosp. zdravé 20 larvy MOR l-MOR larvy léčené M6 larvy zdravé 5 mladušky Dol 5 mladušky Dol 10 mladušky Dol 20 H = hemolymfa

absorbance 0.182 0.440 1.239 0.891 0.551 0.338 0.764 0.227 0.909 1.306 1.068 1.293 1.104 0.649 0.287

ng/ml 0.348 1.401 105.144 16.034 2.553 0.808 8.072 0.443 17.673 151.018 41.731 140.773 50.693 4.336 0.613

Jelikoţ jsou odchylky hodnot pro stejné skupiny příliš velké, bylo třeba ještě zjistit vhodné ředění. Vyšší hodnoty jsou ale patrné u larev oproti dospělcům, coţ nám částečně nastínilo jiţ první měření.

43

3.měření larva dělnice – absorbance ředění Koncentrovaná H 0.280 5x 0.318 10x 0.364 20x 0.286 30x 0.197 40x 0.194 50x 0.177 60x 0.145 80x 0.162 100x 0.141

ng/ml 0.339 2.202 6.037 7.074 5.765 7.530 8.377 8.073 12.094 13.091

Vhodné ředění včelí hemolymfy pro LSM kit je mezi 20x-60x. Průměrný obsah LSM pro vzorek (larvy dělnice z 3.9.2012) je 7.1 ng/ml

6.4.

Antioxidační enzymy

6.4.1.

SOD

1. měření Měřili jsme larvu dělnice, larvu trubce a pro porovnání ještě modelový organismus Galeria mellonella. všechny vzorky byly pipetovány v duplikátech. Cílem bylo zjistit zda je úroveň SOD měřitelná u včelí hemolymfy, jelikož u G. mellonella ji měřit lze. U tohoto prvního pokusu je popsán postup výpočtu na vzorku dělničí larvy: dělnice Čas (min) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 nárůst za min

průměry absorbancí z duplikátů 10 µl 15 µl 0.0410 0.0405 0.0420 0.0415 0.0430 0.0425 0.0430 0.0425 0.0440 0.0435 0.0440 0.0435 0.0440 0.0445 0.0450 0.0445 0.0450 0.0450 0.0450 0.0455 0.0460 0.0455 0.0460 0.0455 0.0002 0.0002

20 µl 0.0450 0.0460 0.0460 0.0465 0.0470 0.0470 0.0480 0.0480 0.0485 0.0490 0.0490 0.0490 0.0002

blank 0.0305 0.0315 0.0325 0.0335 0.0345 0.0355 0.0360 0.0365 0.0375 0.0385 0.0395 0.0400 0.0004

T8: Průměry hodnot ze spektrofotometru

44

graf 9: ukazuje kinetiku reakce jednotlivých koncentrací v čase (min).

graf 10: inhibice u jednotlivých koncentrací vzorků dělnice 10 μl (47.3%), 15 μl (47.4%), 20 μl (57.9%) Přepočet: V prvním kroku bylo přepočítáno množství hemolymfy dělnice v μl na jamku, se zohledněním ředění uvedeného v protokolu. vzorek obsahoval na počátku 20 μl hemolymfy, výsledné množství v jamce bylo 0.45 μl V dalším kroku bylo bráno množství proteinu ve vzorku dělnice, bylo stanoveno na 15.7914 μg proteinu na jamku.

45

Dále byla z grafu inhibice použita rovnice regrese k výpočtu množství vzorku potřebného k 50% inhibici přeměny pyrogallolu, tímto byla definována jedna jednotka SOD. Finální výsledek je uvedený v U na mg hemolymfy. V tomto měření vyšla aktivita SOD u dělnice 41.135 U v 1 mg (viz graf 11). Spolu s larvou dělnice jsme měřili i vzorky hemolymfy z trubčích larev a zavíječe voskového (Galleria mellonella). Porovnání těchto tří skupin je uvedeno v grafu 11.

graf 11: porovnání aktivity SOD u dělničího plodu, trubčího plodu a G. mellonella Z prvního pokusu je patrné že antibakteriální aktivita dělničího plodu je vyšší než u trubčího, který má podobnou hodnotu jako u larev G. mellonella. Vzhledem k tomu že se jedná o směsné vzorky ze zhruba 10ti jedinců, jsou zde uvedeny pouze průměry. Tento pokus sloužil k optimalizaci metody a v dalších pokusech byli jedinci použiti za jiných podmínek.

graf 12

graf 13

46

Ve druhém a třetím experimentu byly mezi sebou porovnávány různá stáří a kasty larev (graf 12 a graf 13): 1. mladý zavíčkovaný plod, 2. plod trubce, 3. léčený nesegmentovaný plod, 4. léčený segmentovaný plod, 5. larvy dělnic s morem, 6. larvy segmentované - bílé oči, 7. larvy segmentované - tmavé oči, 8. larvy nesegmentované, 9. kadávery

6.4.2.

GST

V první řadě šlo o to vyzkoušet měřitelnost hladiny GST u vzorků, jež byly zkoumány u nás v laboratoři v souběžném čase. Tím se nám naskytla možnost porovnání nejen bezobratlých mezi sebou, ale také bezobratlých s obratlovci. enzymatická aktivita: c = A / Є . l

graf 14 vzorek včely: nezavíčkovaná larva dělnice z 3.9.2012, 1x rozmražená hemolymfa čas (min) B -blank K -karas S -slepice G– V -včela G. mellonella změna absorbance 0.057 0.049 0.077 0.123 0.291 ATBakt/min 0.011 0.009 0.015 0.024 0.058 nmol/mg/min 0.006 0.006 0.008 0.013 0.030 T9

47

graf 15: hodnoty aktivity GST - rozdíly mezi druhy. Pilotní studie s použitím pouze jednoho vzorku od každého druhu bez opakování.

6.4.3.

MDA

Absorbance včelího vzorku byla 0.032, blanku 0.03 a po odečtu byla hodnota 0.002. enzymatická aktivita: A = є . c . l (c= A/ε.l nmol/ml/min) l= 1cm , є = 156000 M/cm = 0.0000000128 mmol/ml celkové proteiny: (ředění vzorku na proteiny bylo 60x) je potřeba dát do vztahu s ředěním na MDA. Absorbance Proteiny (mg/ml) St 0.1 0.062 0.1 St 0.5 0.195 0.5 St 1 0.314 1 St 1.5 0.335 1.5 St 2 0.358 2 St 3 0.558 3 T10: celkové proteiny

graf 16: rovnice regrese pro kalibraci u MDA

48

Z regresní rovnice přepočtem proteinů získáme hodnotu 0.73 a tu musíme vynásobit ředěním (60x). Máme 0.03 mg proteinů v jedné jamce (jedna jamka = 0.66 μl vzorku). U včely bylo naměřeno 0.44 nmol/mg MDA.

6.5.

Stanovení nitritů dle Griesse

I kdyţ kalibrace vyšla dle očekávání (Obr. 19), vzorky byly na barevné úrovni velice nízkých koncentrací (T11). Typ vzorku:

hemolymfa, dělnice, nezavíčkovaný plod s PTU částečně znečištěna jinými tělními komponenty

Centrifugace proběhla v laboratorní teplotě a ne při 4°C jak je uvedeno v protokolu. Pro ředění vzorku byl pouţit fyziologický roztok pro hmyz s pH 6,8. Neředěná hemolymfa byla zakalená, coţ přístroj zaznamenal jako barevnou změnu, bohuţel nebyl fialové barvy, proto si troufám tvrdit ţe nitrity neobsahuje. Vzorky byly pipetovány v duplikátech.

0.832

0.463

0.263

0.161

0.105

0.078

0.065

0.059

0.056

0.050

Obr. 19: intenzita zbarvení kalibrace při pokusu a hodnoty ze spektrofotometru

Typ vzorku čistá hemolymfa

vzhled

průměrná absorbance 1.023

hodnocení Vzorek zakalený, ale ne fialový

10x zředěná hemolymfa

0.208

Bez reakce

100x zředěná hemolymfa

0.735

Bez reakce

sliny

1.138

Kontrola, jelikoţ ve slinách jsou nitrity obsaţeny

T11: vyhodnocení barevné změny v pokusu stanovení nitritů

49

6.6.

Nakaţení entomopatogenními hlísticemi

Pilotní studie potvrdila moţnost proniknutí EPN do včelích larev, coţ se projevilo černými tečkami pod povrchem larev a u některých i zbarvením těla, jelikoţ bakterie Heterorhabditis bacteriophora vypouští do hostitele symbiotické bakterie Photorhabdus luminescens a ty způsobují zbarvení kadaveru do červena.

místo vniku H. bacteriophora do larvy černá díky enkapsulaci

mrtvé larvy zbarvené do červena přítomností Photorhabdus luminescens

50

7. Diskuze 7.1.

PO, pPO

Měření hladiny fenoloxidázy (PO) a profenoloxidázy (pPO) bylo provedeno pouze jednou, jelikoţ se jednalo pouze o pilotní studii, jejímţ cílem bylo vyzkoušet citlivost metody na včelí hemolymfě. Vzorky byly měřeny v duplikátech, ale to pro statistické vyhodnocení pokusu nestačí. Rychlost melanizace a tím i aktivita PO v hemolymfě byla dle mých měření nízká v porovnání s úrovní u G. mellonela a D. melanogaster. Moje domněnka, ţe PO kaskáda u včel skoro nefunguje, byla podpořena, kdyţ včelí larva, která byla ponechána mrtvá v laboratorní teplotě, černala velmi pomalu na rozdíl od mrtvé larvy G. mellonella. Z toho jsem usoudil na nízkou hladinu PO, případně pPO. V současné literatuře se uvádí, ţe hladina profenoloxidázy (pPO) koreluje pozitivně s věkem (Chan a Foster 2008, Wilson-Rich a kol. 2008), PO aktivitu je moţné dobře zjistit u čtvrtého a pátého instaru včelí larvy (Marchler-Bauer a kol 2005). Schopnost larev vyuţívat melanizaci jako obranný mechanizmus byla zpochybňována, protoţe hladiny proPO jsou mnohem niţší neţ u dospělců (Randolt a kol 2008). Já jsem měřil hodnoty staršího nezavíčkovaného plodu, a domnívám se, ţe úroveň PO není tak velká jak uvádí literatura. Pravděpodobně díky nedostatečně citlivé metodě, kterou jsem pouţil. Ovšem Chan a kol. potvrdili velice citlivou metodou zaloţenou na bázi iontové výměny (LC-MS/MS analýzy na LTQ-OrbitrapXL), ţe starší larvy jsou jiţ schopny PO cestu obrany proti infekci vyuţívat (Chan a kol 2009). Metoda stanovení PO a pPO u včel tedy vyţaduje ještě další optimalizaci.

7.2.

Antibakteriální aktivita

Při prvních dvou měřeních jsem se snaţil zjistit, zda je metoda stanovení antibakteriální aktivity pomocí inhibice bakterií E. coli K12, které jsou schopny luminiscence, aplikovatelná na stanovení antibakteriální aktivity hemolymfy včel. Protoţe se při odběru hemolymfy často stalo, ţe hemolymfa byla znečištěná jinými tkáněmi, snaţil jsem se v dalším kroku ověřit, zda má toto znečištění vliv na antibakteriální aktivitu. Také jsem potřeboval zjistit, zda má na antibakteriální aktivitu vliv zmraţení vzorku. Ukázalo se, ţe zmraţení má jen nepatrný vliv, ale znečištění okolními tkáněmi je znatelné, jak je vidět v grafu (graf 17). Při čtvrtém měření jsem se snaţil ověřit důleţitost PTU ve vzorku. Díky aktivaci koagulační a fenoloxidázové kaskády, se hemolymfa bez přidání antikoagulantu (PTU) sráţí a černá. Ukazuje to klesající červená křivka v grafu 7. Na první pohled by se mohlo zdát, ţe zde dochází k výraznému zvýšení mortality bakterií, ale dochází pouze k “zastínění” luminiscenčního signálu bakterií černým melaninem. Zároveň dochází k inaktivaci antibakteriálních peptidů, coţ by mělo znamenat niţší účinnost baktericidních vlastností. Tmavý melanin ale zastíní signál natolik, ţe se nárůst antibakteriální aktivity při detekci neprojeví.

51

graf 17: 1) zmrazená H, 2) čerstvá H, 3) čerstvá H s tkáněmi, 4) zmrazené H s tkáněmi, 5) čerstvá H bez PTU (H = hemolymfa) Z grafu je patrné, ţe rozdíl mezi zmrazenou (sloupec 2) a čerstvou (sloupec 1) hemolymfou je jen nepatrný, ale antibakteriální aktivita se lehce sníţí opětovným rozmrazováním vzorku. Stejná tendence je vidět i u vzorků s tukovým tělesem (sloupce 3 a 4). Také je vidět, ţe znečištění vzorku hemolymfy tukovým tělesem zvyšuje antibakteriální aktivitu u čerstvé i zmrazené hemolymfy, coţ pravděpodobně znamená, ţe přítomné tkáně vykazují také antibakteriální aktivitu. Inhibice čerstvé hemolymfy bez PTU (sloupec 5) svou hodnotou odpovídá hodnotám čerstvé hemolymfy, jelikoţ zvolený čas pro výslednou antibakteriální aktivitu byl 10 minut a v tak krátkém čase se melanizace vzorku neprojevila. T-test ovšem ukázal, ţe statisticky významné jsou pouze rozdíly mezi zmrazenou hemolymfou oproti zmrazené i nezmrazené s tukovým tělesem. Ţe se tento rozdíl nepotvrdil u čerstvé hemolymfy, je dáno velkým rozptylem hodnot těchto vzorků.

7.3.

úroveň lysozymu

7.3.1.

radiální difuze

Hemolymfa včely obsahuje maximálně do 0.5 mg/ml lysozymu (LSM). Nevýhodou metody je vysoká spotřeba vzorku pro jedno měření (celých 50 μl hemolymfy). Touto metodou se dá hladina LSM poměrně snadno určit například u G. mellonella, jelikoţ tento modelový organizmus chováme v laboratoři a z jedné larvy je dostatek hemolymfy (Hyršl a Marek 1999, Hyršl a Šimek 2003, Hyršl a kol. 2009). Hlavním důvodem je vyšší obsah LSM v hemolymfě Galleria mellonela oproti Apis mellifera. Pro hodnocení obsahu LSM ve včelí hemolymfě je to metoda nepříliš vhodná, jelikoţ spotřeba vzorků je hodně vysoká a citlivost metody nedostatečná, vzhledem k nízkým koncentracím LSM.

52

7.3.2.

LSM kit

Lysozym je v hmyzí hemolymfě vţdy přítomen, jen u kaţdého druhu hmyzu v jiné hladině, která se zvyšuje při napadení bakteriální infekcí. Při měření LSM kitem jsem nenaměřil výrazný rozdíl mezi zdravými včelami a včelami postiţenými morem včelího plodu, coţ je onemocnění bakteriálního původu způsobené Paenibacillus larvae. Výrazný rozdíl jsme naměřili jen mezi dospělými včelami a larvami. Plod má vyšší hladinu LSM, moţná proto, ţe plod je fixovaný pouze na jednom místě (v buňce plástu) a proto musí mít kvalitní obranu proti typu bakteriálních infekcí, proti kterým se můţe bránit právě zvýšením mnoţství LSM. Naměřil jsem také rozdíl mezi léčenými, morovými a zdravými včelami, ale nemohu s jistotou říci, zda je tento rozdíl způsoben fyziologickými hodnotami léčených včel. Bylo by vhodné v dalších experimentech ověřit domněnku, zda Sanguinarin, preparát proti Paenibacillus larvae, neovlivňuje obranyschopnost včel proti jiným neţ bakteriálním infekcím. Metabolizmus sanguinarinu zatím není zcela objasněn a navíc je velice málo literatury o účincích tohoto přírodního alkaloidu na P. larvae.

7.4.

Antioxidační enzymy

7.4.1.

SOD

Protože imunita živočichů je ovlivňována oxidačním stresem, měřili jsme několik antioxidačních enzymů. Enzym superoxiddismutáza (SOD) je jednou ze součástí antioxidačního systému. Oproti dalším zkoumaným antioxidačním činitelům (malondialdehyd, glutathion-S-transferáza) je její koncentrace v hemolymfě včel měřitelná. Výrazný rozdíl v aktivitě SOD je mezi larvami trubců a dělnic. Dělnice mají SOD průměrně 50 U/mg a trubci jen 15 U/mg, což je srovnatelné s aktivitou SOD u larev Galleria mellonella. Porovnávali jsme mezi sebou i vzorky různého stáří. Nejnižší hodnoty měly vzorky trubců, léčeného nesegmentovaného plodu a kadávery. Ostatní skupiny (mladý zavíčkovaný plod, segmentované i nesegmentované zdravé larvy, léčený nesegmentovaný plod a také i larvy nakažené morem včelího plodu) měli 8 - 14 U/mg. Při dvou nezávislých měřeních stejných vzorku, ovšem o dva dny později, byly naměřené hodnoty téměř identické. Poměry zůstaly stejné, jen ve druhém měření jsou celkově nižší hodnoty asi o 2 U/mg. Opakovaným rozmrazováním tudíž pravděpodobně antibakteriální aktivita hemolymfy klesá. Různé kasty bych rád ještě změřil několikrát, abych mohly být určeny průkazné rozdíly mezi kastami, ale hlavně abych mohl určit rozdíly mezi zdravými a nemocnými jedinci. Z literatury víme, ţe antioxidační enzymy jsou důleţité při ochraně před oxidačním stresem, ale také pomáhají při obraně proti účinkům patogenů a látek, které vytváří(Ball a kol. 2000). Proto jsou důleţité při boji s nemocemi a pravděpodobně by měly být hodnoty mezi zdravými a nemocnými jedinci měřitelné. Literatury je o tomto tématu poměrně málo.

53

7.4.2.

GST

Úrověň GST u včel se zdá být vysoká. Pilotní studie ukazuje vyšší hladiny GST neţ mají obratlovci a zdá se, ţe i mnohem vyšší, neţ u G. mellonella, jak lze vidět ve výsledném grafu (graf 15). Je třeba potvrdit tuto domněnku několika dalšími měřeními. Zvýšené hladiny antioxidačních enzymů u včelích vzorků ale mohou být zapříčiněny i převozem vzorků do laboratoře a následným odběrem, protoţe to vše je pro včelu veliký stres a proto je nutné ve vyšší míře odbourávat reaktivní metabolity kyslíku. Glutathion transferázy jsou rozmanitá rodina enzymů nalezených u aerobních organismů. Jejich hlavními úlohami jsou detoxikace cizorodých látek, intracelulární transport, biosyntéza hormonů a ochrana proti oxidačnímu stresu. U hmyzu se vědecký zájem soustředuje hlavně na jejich schopnost metabolizovat insekticidy, které jsou pak vylučovány snadněji. Hladiny antioxidačních enzymů jsou výrazně ovlivňovány stravou. Také přispívají k odstranění toxických kyslíkových volných radikálů produkovaných působením pesticidů. Genomy Anopheles gambiae a Drosophila melanogaster obsahují velmi mnoho zástupců této enzymatické rodiny. Metoda v tomto znění a nebo její drobné alternativy se pouţívají pro měření hladiny GST po celém světě (Habig a kol. 1974, Ahmad a Pardini 1990, Enayati a kol. 2005, Hyršl a kol. 2007).

7.4.3.

MDA

MDA je u včel přítomno, ale dle mých výsledků ne v takové míře jako ostatní antioxidační enzymy. U včely bylo naměřeno 0.44 nmol/mg MDA v hemolymfě. Je to velice malé mnoţství oproti ostatním druhům hmyzu, proto je tato metoda nevhodná pro porovnávání jednotlivých kast, jelikoţ by při malých rozdílech v hodnotách vznikalo poměrně hodně chyb.

7.5.

Stanovení nitritů dle Griesse

Stanovení nitritů Griessovou metodou se u včelí hemolymfy se ukázalo jako nepouţitelné, jelikoţ hemolymfa nereagovala barevnou změnou. To je zřetelně vidět například u slin (T11), o nichţ víme ţe obsahují velké mnoţství nitritů. Protokol v tomto znění funguje u jiných vzorků, jako například u plazmy obratlovců a v upravené verzi i pro stanovení nitritů v moči.

7.6.

Nakaţení entomopatogenními hlísticemi

Vyzkušeli jsme přirozený infekční model vyuţívající entomopatogenní hlístice. V přírodě se včely s EPN nesetkají, jelikoţ včelí larvy jsou pouze v plástech uvnitř úlu a hlístice zase v půdě. V laboratořích se pouţívají hlístice pro modelové nákazy hmyzích larev pomocí nematod a poté se zkoumají jejich imunitní reakce (Hallem a kol. 2007). Lze porovnávat různě genově vybavené larvy D. melanogaster, jelikoţ je u nich dobře prozkoumán jejich genom,a zjištovat mortalitu různých mutantů. Tomuto tématu se věnoval můj kolega Jakub Berka, který porovnával wild type D. melanogaster a blackcells mutanty a svoje výsledky prezentoval formou posteru na konferenci v Brně (Berka a kol. 2013).

54

8. Závěr Zaměřil jsem se na optimalizaci metod, které běţně pouţíváme v naší laboratoři na jiných hmyzích modelových organismech. Pro porovnání imunitních parametrů včel, jejich jednotlivých kast, vývojových stádií, zdravých a nemocných včelstev se ukázalo být prakticky pouţitelných několik imunologických metod. Luminometricky lze stanovit antibakteriální aktivitu včelí hemolymfy jako sníţení viability bioluminiscenčních bakterií Escherichia coli K12. Bylo zjištěno, ţe včely mají v hemolymfě, na rozdíl od jiných studovaných druhů hmyzu jako Galleria mellonella a Drosophila melanogaster, velmi málo lysozymu. Z antioxidačních enzymů je pouţitelné měření aktivity SOD. Dále jsou pouţitelné i metody pro měření LSM radiální zónovou difúzí, ovšem při velké spotřebě vzorku. Měření GST a MDA se ukázalo jako velice málo citlivé, a pro měření PO a pPO je nutné ověřit její aktivitu ještě na dalších vzorcích. Nákaza entomopatogenními hlísticemi je také moţná a v budoucnu by se daly zkoumat imunitní parametry po nákaze včelího plodu těmito parazity. Z předběţných výsledků zatím nelze vyčíst rozdíly v imunitních parametrech zdravých a nemocných včel. Vše ale budeme testovat v další sezóně na větším počtu dospělých včel i plodu. Tato práce je podporována grantem QJ1210047 NAZV-KUS2012 ve spolupráci s ČZU v Praze a s Výzkumným ústavem včelařství v Dole. Měl jsem moţnost některé svoje výsledky prezentovat na konferenci Zoologické dny 2013 ve formě posteru, viz Příloha.

55

Příloha: Poster z konference Zoologické dny 2013

56

9. seznam zkratek CCM – Česká sbírka mikroorganizmů GST – Glutathion S-transferáza G+ – grampozitivní G- – grammnegativní H – hemolymfa LPS – lipopolysacharidy LSM – lysozym MDA – malondialdehyd PO – superoxiddismutáza pPO – profenoloxidáza PTU – fenilthiomočovina SOD – superoxyddismutáza T – tabulka TG – transglutamináza

10. pouţitá literatura Ahmad S., Pardini R.S. (1990) Mechanisms for regulating oxygen toxicity in phytophagous insects. Free Radical Biology and Medicine, 8(4):401-413. Aronstein K., Murray K.D. (2010) Chalkbrood disease in honey bees. Journal of Invertebrate Pathology, 103(Suppl 1):20-29. Babendreier D., Joller D., Romeis J., Bigler F., Widmer F. (2007) Bacterial community structures in honeybee intestines and their response to two insecticidal proteins. FEMS Microbiology Ecology, 59(3):600-610. Bachanova K., Klaudiny J., Kopernicky J., Simuth J. (2002) Identification of honeybee peptide active against Paenibacillus larvae larvae through bacterial growth-inhibition assay on polyacrylamide gel. Apidologie, 33:259-269. Bailey L., Ball B.V. (1981) Honeybee Pathology, second ed. Academic Press, London, UK. Ball B.A., Gravance C.G., Medina V., Baumber J., Liu I.K. (2000) Catalase activity in equine semen. American Journal of Veterinary Results, 61(9):1026-1030. Barazzoni R., Short K.R., Nair K.S. (2000) Effects of aging on mitochondrial DNA copy number and cytochrome c oxidase gene expression in rat skeletal muscle, liver, and heart. The Journal of Biological Chemistry, 275(5):3343-3347. Benešová J., Dobeš P., Hyršl P. (2009) Developmental changes in phenoloxidizing activity in the greater wax moth Galleria mellonella. Bulletin of Insectology, 62(2):237-243. Berka J., Dobeš P., Hyršl. P. (2013) Koagulace hemolymfy hmyzu a její úloha v imunitních reakcích. Zoologické dny, 2013. ISBN 978-80-87189-14-6. Bilikova K., Wu G., Simuth J. (2001) Isolation of a peptide fraction from honeybee royal jelly as a potential antifoulbrood factor. Apidologie, 32:275-283. Blum M.S., Taber III S. (1965) Chemistry of the drone honey bee reproductive system-III. Dehydrogenases in washed spermatoza. Insect Physiology, 11:1489-1501. Bowen-Walker P.L., Martin S.J., Gunn A. (1999) The transmission of deformed wing virus between honeybees (Apis mellifera L.) by the ectoparasitic mite Varroa jacobsoni Oud. Journal of Invertebrate Pathology, 73(1):101-106.

57

Breed M.D., Williams D.B., Queral A. (2002) Demand for task performance and workforce replacement: undertakers in honeybee, Apis mellifera, colonies. Journal of Insect Behavior, 15:319-329. Brødsgaard C.J., Ritter W., Hansen H. (1998) Response of in vitro reared honey bee larvae to various doses of Paenibacillus larvae larvae spores. Apidologie, 29:569-578. Buyukguzel E., Hyrsl P., Buyukguzel K. (2010) Eicosanoids mediate hemolymph oxidative and antioxidative response in larvae of Galleria mellonella L. Comparative Biochemistry and Physiology, Part A, 156(2):176–183. Casteels P., Ampe C., Jacobs F., Tempst P. (1993) Functional and chemical characterization of hymenoptaecin, an antibacterial polypeptide that is infection-inducible in the honeybee (Apis mellifera). The Journal of Biological Chemistry, 268(10):7044-7054. Casteels P., Ampe C., Jacobs F., Vaeck M., Tempst P. (1989) Apidaecins: antibacterial peptides from honeybees. The EMBO Journal, 8(8):2387-2391. Casteels P., Ampe C., Riviere L., Van Damme J., Elicone C., Fleming M., Jacobs F., Tempst P. (1990) Isolation and characterization of abaecin, major antibacterial response peptide in the honey bee (Apis mellifera). European Journal of Biochemistry, 187(2):381-386. Casteels-Josson K., Zhang W., Capaci T., Casteels P., Tempst P. (1994) Acute transcriptional response of the honeybee peptide-antibiotics gene repertoire and required post-translational conversion of the precursor structures. The Journal of Biological Chemistry, 269(46):28569-28575. Casteels-Josson K., Zhang W., Capaci T., Casteels P., Tempst P. (1994) Acute Transcriptional Response Of the Honeybee Peptide-Antibiotics Gene Repertoire and Required Post-translational Conversion Of the Precursor Structures. The Journal of Biological Chemistry, 269(46):1-6. Cerenius L., Soderhall K. (2004) The prophenoloxidase-activating system in invertebrates. Immunological Review, 198:116-126. Claesson M.J., Jeffery I.B., Conde S., Power S.E., O'Connor E.M., Cusack S., Harris H.M., Coakley M., Lakshminarayanan B., O'Sullivan O., Fitzgerald G.F., Deane J., O'Connor M., Harnedy N., O'Connor K., O'Mahony D., van Sinderen D., Wallace M., Brennan L., Stanton C., Marchesi J.R., Fitzgerald A.P., Shanahan F., Hill C., Ross R.P., O'Toole P.W. (2012) Gut microbiota composition correlates with diet and health in the elderly. Nature, 488(7410):178-84. Clemente J.C., Ursell L.K., Parfrey L.W., Knight R. (2012) The impact of the gut microbiota on human health: an integrative view. Cell, 148(6):1258-1270. Collins M., Williams V., Evans J. D. (2004) Sperm storage and antioxidative enzyme expression in the honey bee, Apis mellifera. Insect Molecular Biology, 13(2):141-146. Cox-Foster D.L., Conlan S., Holmes E.C., Palacios G., Evans J.D., Moran N.A., Quan P.L., Briese T., Hornig M., Geiser D.M., Martinson V., van Engelsdorp D., Kalkstein A.L., Drysdale A., Hui J., Zhai J., Cui L., Hutchison S.K., Simons J.F., Egholm M., Pettis J.S., Lipkin W.I. (2007) A metagenomic survey of microbes in honey bee colony collapse disorder. Science, 318(5848):283-287. Cremer S., Armitage S.A.O., Schmid-Hempel P. (2007) Social immunity. Current Biology, 17(16):R693-R702. Cremer S., Sixt M. (2009) Analogies in the evolution of individual and social immunity. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences, 364(1513):129-142. Danka R.G., Villa J.D. (2000) Inheritance of resistance to Acarapis woodi (Acari: Tarsonemidae) in first-generation crosses of honey bees (Hymenoptera: Apidae). Journal of Economic Entomology, 93(6):1602-1605. de Miranda J.R., Fries I. (2008) Venereal and vertical transmission of deformed wing virus in honeybees (Apis mellifera L.). Journal of Invertebrate Pathology, 98(2):184-189. de Miranda J.R., Genersch E. (2010) Deformed wing virus. Journal of Invertebrate Pathology, 103:S48S61. Dobeš P. (2007) Humorální imunita bezobratlých: bakalářská práce. Brno: Masarykova univerzita, Přírodovědecká Fakulta.

58

Dobeš P., Wang Z., Markus R., Theopold U., Hyršl P. (2012) An improved method for nematode infection assays in Drosophila larvae. Fly, 6(2):75-79. Enayati A. A., Ranson H., Hemingway J. (2005) Insect glutathione transferases and insecticide resistance. Insect Molecular Biology, 14(1):3–8. Engel P., Moran N.A. (2013) Functional and evolutionary insights into the simple yet specific gut microbiota of the honey bee from metagenomic analysis. Gut Microbes, 4(1):60-65. Esch H. (1960) Uber die Korpertemperaturen und den Warmehaushalt von Apis mellifera. Zeitschrift fur Vergleichende Physiologie, 43:305-335. Evans J. D., Aronstein K., Chen Y. P., Hetru C., Imler J.-L., Jiang H., Kanost M., Thompson G. J., Zou Z., Hultmark D. (2006) Immune pathways and defence mechanisms in honey bees Apis mellifera. Insect molecular biology, 15(5):533-718. Evans J.D., Aronstein K., Chen Y.P., Hetru C., Imler J.L., Jiang H., Kanost M., Thompson G.J., Zou Z., Hultmark D. (2006) Immune pathways and defence mechanisms in honey bees Apis mellifera. Insect Molecular Biology, 15(5):645-656. Evans J.D., Lopez D.L. (2004) Bacterial probiotics induce an immune response in the honey bee (Hymenoptera: Apidae). Journal of Economic Entomology, 97(3):752-756. Evans J.D., Spivak M. (2010) Socialized medicine: individual and communal disease barriers in honey bees. Journal of Invertebrate Pathology, 103(Suppl 1):S62-S72. Fluri P., Lüsher M., Willie H., Gerig L. (1982) Changes in weight of the pharyngeal gland and haemolymph titers of juvenile hormone, protein and vitellogenin in worker honey bees. Journal of Insect Physiology, 28:61-68. Fries I. (2010) Nosema ceranae in European honey bees (Apis mellifera). Journal of Invertebrate Pathology, 103(Suppl 1):S73-S79. Fries I., Feng F., Da Silva A., Slemenda S.B., Pieniazek N.J. (1996) Nosema ceranae n. Sp. (Microspora, Nosematidae), morphological and molecular characterization of a microsporidian parasite of the Asian honey bee Apis cerana (Hymenoptera, Apidae). European Journal of Protistology, 101(3):204-209. Fujiwara S., Imai J., Fujiwara M., Yaeshima T., Kawashima T., Kobayashi K. (1990) A potent antibacterial protein in royal jelly. The Journal of Biological Chemistry, 265(19):11333-11337. Garadew A., Schmolz E., Lamprecht I. (2003) Microcalorimetric and respirometric investigation of the effect of temperature on the anti Varroa action of the natural bee product-propolis. Thermochimica Acta, 399:171-180. Gisder S., Aumeier P., Genersch E. (2009) Deformed wing virus (DWV): viral load and replication in mites (Varroa destructor). Journal of General Virology, 90(2):463-467. Goldsworthy G., Opoku-Ware K., Kuklen L. (2002) Adipokinetic hormone enhances laminarin and bacterial lipopolysaccharide-induced activation of the prophenoloxidase cascade in the African migratory locust, Locusta migratoria. Journal of Insect Physiology, 48(6):601-608. Gramacho K.P., Spivak M. (2003) Differences in olfactory sensitivity and behavioral responses among honey bees bred for hygienic behavior. Behavioral Ecology and Sociobiology, 54:472-479. Gupta A.P. (2001) Immunology of invertebrates: Humoral. Encyclopedia of life sciences, John Wiley and Sons. Ltd. Habig W.H., Pabst M.J., Jakoby W.B. (1974) Glutathione S-transferases: the first enzymatic step in mercapturic acid formation. Journal of Biological Chemistry, 249(22):7130-7139. Hallem E.A., Rengarajan M., Ciche T.A., Sternberg P.W. (2007) Nematodes, bacteria, and flies: a tripartite model for nematode parasitism. Current Biology, 17:898-904. Hanousek L. (1991) Začínáme včelařit. Vydání první. Praha, Zemědělské nakladatelství Brázda. 128 stran. ISBN 80-209-0194-9. Hart A.G., Ratnieks F.L.W. (2001) Why do honey-bee (Apis mellifera) foragers transfer nectar to several receivers? Information improvement through multiple sampling in a biological system. Behavioral Ecology and Sociobiology, 49:244-250.

59

Komárová T. (2012) Přírodní látky v léčbě a prevenci včelího moru: diplomová práce. ČZU Praha, Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů. Hořejší V., Bartůňková J. (2005) Základy imunologie. TRITON, 4. vydání. Howard D., Tschinkel W. (1976) Aspects of necrophoric behavior in the red imported fire ant, Solenopsis invicta. Behaviour, 56:158-180. Hultmark D. (2003) Drosophila immunity: paths and patterns. Current Opinion on Immunology, 15(1):12-19. Hyršl P., Büyükgüzel E., Büyükgüzel K. (2007) The effects of boric acid-induced oxidative stress on antioxidant enzymes and survivorship in Galleria mellonella. Archives of Insect Biochemistry and Physiology, 66(1):23-31. Hyršl P., Dobeš P., Vašíček O. (2009) Vybrané metody studia imunitního systému hmyzu. Sborník abstraktů Zoologické dny Brno 2009, ISBN 978-80-87189-03-0. Hyršl P., Marek M. (1999) Influence of proleg ligature on the protein level in haemolymph of Bombyx mori (L.) larvae. Biological Bulletin of Poznaň, 36(2):103-110. Hyršl P., Šimek V. (2003) The protein spectrum changes of two silkworm (Bombyx mori L.) hybrids during the development. Študentská vedecká konferencia, Zborník abstraktov prác diplomantov a doktorandov. Slovenská akadémia ved, str 25. Chan Q.W., Foster L.J. (2008) Changes in protein expression during honey bee larval development. Genome Biology, 9(10):R156. Chan Q.W., Melathopoulos A.P., Pernal S.F., Foster L.J. (2009) The innate immune and systemic response in honey bees to a bacterial pathogen, Paenibacillus larvae. BMC Genomics, 10:387. Chen Y., Pettis J.S., Evans J.D., Kramer M., Feldlaufer M.F. (2004) Transmission of Kashmir bee virus by the ectoparasitic mite Varroa destructor. Apidologie, 35:441-448. Chen Y.P., Higgins J.A., Feldlaufer M.F. (2005) Quantitative real-time reverse transcription-PCR analysis of deformed wing virus infection in the honeybee (Apis mellifera L.). Applied and Environmental Microbiology, 71(1):436-441. Chen Y.P., Pettis J.S., Collins A., Feldlaufer M.F. (2006) Prevalence and transmission of honeybee viruses. Applied and Environmental Microbiology, 72(1):606-611. Chen Y.P., Siede R. (2007) Honey bee viruses. Advances in Virus Research, 70:33-80. Chernysh S.I., Gordja N.A., Simonenko N.P. (2000) Diapause and immune response: induction of antimicrobial peptides synthesis in the Blowfly, Calliphora vicina R.-D. (Diptera: Calliphoridae). Entomolgy Science, 3:139-144. Jain S.K., Levine S.N. (1995) Elevated lipid peroxidation and vitamin E-quinone levels in heart ventricles of streptozotocin-treated diabetic rats. Free radical biology and medicine, 18(2):337-41. Jander R. (1976) Grooming and pollen manipulation in bees (Apoidea): the nature and evolution of movements involving the foreleg. Physiological Entomology, 1:179-194. Kau A.L., Ahern P.P., Griffin N.W., Goodman A.L., Gordon J.I. (2011) Human nutrition, the gut microbiome and the immune system. Nature, 474(7351):327-336. Koch H., Schmid-Hempel P. (2011) Bacterial communities in central European bumblebees: low diversity and high specificity. Microbial Ecology, 62(1):121-133. Krishnan N., Hyršl P., Šimek V. (2006) Nitric oxide production by hemocytes of larva and pharate prepupa of Galleria mellonella in response to bacterial lipopolysacharide: cytoprotective or cytotoxic? Comparative Biochemistry and Physiology, Part C: Toxicology & Pharmacology, 142(1-2):103-110. Kurucz E., Markus R., Zsamboki J., Folkl-Medzihradszky K., Darula Z., Vilmos P., Udvardy A., Krausz I., Lukacsovich T., Gateff E., Zettervall C.J., Hultmark D., Andi I. (2007) Nimrod, a putative phagocytosis receptor with EGF repeats in Drosophila plasmatocytes. Current Biology, 17(7):649-654. Kwong W.K., Moran N.A. (2012) Cultivation and char-acterization of the gut symbionts of honey bees and bumble bees: Snodgrassella alvi gen. nov., sp. nov., a member of the Neisseriaceae family of the Betaproteobacteria; and i gen. nov., sp. nov., a member of Orbaceae fam. nov., Orbales ord. nov., a sister

60

taxon to the Enterobacteriales order of the Gammaproteobacteria. International Journal of Systematic and Evolutional Microbiology, (publikace elektronické verze před tiskem). Lavie P. (1968) Les Substances Antibiotiques dans la Colonie D’abeilles. Masson et Cie, Paris. Lemaitre B., Hoffmann J. (2007) The host defense of Drosophila melanogaster. Annual Review of Immunology, 25:697-743. Ley R.E., Backhed F., Turnbaugh P., Lozupone C.A., Knight R.D., Gordon J.I. (2005) Obesity alters gut microbial ecology. Proceedings of the National Academy of Science USA, 102(31):11070-5. Li H.J., Shim J., Joon S.Y., Kim B., Kim J., Kim-Ha J., Kim Y.J. (2008) Identification and functional analysis of antifungal immune response genes in Drosophila. PLoS Pathogens, 4(10):e1000168. Loof T.G., Schmidt O., Herwald H., Theopold U. (2011) Coagulation systems of invertebrates and vertebrates and their roles in innate immunity: The same side of two coins?. Journal of Innate Immunity, 3:34-40. Marchler-Bauer A., Anderson J.B., Cherukuri P.F., DeWeese-Scott C., Geer L.Y., Gwadz M., He S., Hurwitz D.I., Jackson J.D., Ke Z., Lanczycki C.J., Liebert C.A., Liu C., Lu F., Marchler G.H., Mullokandov M., Shoemaker B.A., Simonyan V., Song J.S., Thiessen P.A., Yamashita R.A., Yin J.J., Zhang D., Bryant S.H. (2005) Conserved Domain Database for protein classification. Nucleic Acids Research, 33:D192-196. Marklund S., Marklund G. (1974) Involvement of the superoxide anion radical in the autoxidation of pyrogallol and a convenient assay for superoxide dismutase. European Journal of Biochemistry, 47(3):469-74. Martin S.J. (2001) The role of Varroa and viral pathogens in the collapse of honeybee colonies: a modelling approach. Journal of Applied Ecology, 38:1082-1093. Martinson V.G., Danforth B.N., Minckley R.L., Rueppell O., Tingek S., Moran N.A. (2011) A simple and distinctive microbiota associated with honey bees and bumble bees. Molecular Ecology, 20(23):619628. Moran N.A., Hansen A.K., Powell J.E., Sabree Z.L. (2012) Distinctive gut microbiota of honey bees assessed using deep sampling from individual worker bees. PLoS One, 7(4):e36393. Morse R.A., Flottum K. (Eds.) (1997) Honey Bee Pests Predators and Diseases. A.I. Root Co., Medina, Ohio. Naug D., Camazine S. (2002) The role of colony organization on pathogen tramsisison in social insects. Journal of Theoretical Biology, 215(4):427-439. Nicholson J.K., Holmes E., Kinross J., Burcelin R., Gibson G., Jia W., Pettersson S. (2012) Host-gut microbiota metabolic interactions. Science, 336(6086):1262-1267. Omholt S.W., Amdam G.V. (2004) Epigenetic regulation of aging in honeybee workers. Science of Aging Knowledge Enviroment, 26:pe28. Ono M., Okada I., Sasaki M. (1987) Heat production by balling in the Japanese honeybee, Apis cerana japonica as a defensive behavior against the hornet, Vespa simillima xanthoptera (Hymenoptera: Vespidae). Experientia, 43:1031-1034. Pacifici R.E., Davies K.J. (1991) Protein, lipid and DNA repair systems in oxidative stress: the freeradical theory of aging revisited. Gerontology, 37(1-3):166-180. Park O., Pellet F., Paddock F. (1937) Disease resistance and American foulbrood. Journal of Economic Entomology, 30:504-512. ., Mulet C., Dauga C., Frangeul L., Chervaux C., Grompone G., Sansonetti P.J. (2012) A cryptspecific core microbiota resides in the mouse colon. MBio, 3(3). pii: e00116-12. Ponnuvel K.M., Yamakawa M. (2002) Immune responses against bacterial infection in Bombyx mori and regulation of host gene expression. Current Science, 83(4):447-454. Powning R.F., Davidson J. (1973) Studies on insect bacteriolytic enzymes. Lysozyme in haemolymph of Galleria mellonella and Bombyx mori. Comparative Biochemistry and Physiology 45B:669-681.

61

Qin X., Evans J.D., Aronstein K.A., Murray K.D., Weinstock G.M. (2006) Genome sequences of the honey bee pathogens Paenibacillus larvae and Ascosphaera apis. Insect Molecular Biology, 15(5):715718. Randolt K., Gimple O., Geissendörfer J., Reinders J., Prusko C., Mueller M.J., Albert S., Tautz J., Beier H. (2008) Immune-related proteins induced in the hemolymph after aseptic and septic injury differ in honey bee worker larvae and adults. Archives of Insect Biochemistry and Physiology, 69(4):155-167. Rath W. (1999) Co-adaptation of Apis cerana Fabr. and Varroa jacobsoni Oud. Apidologie, 30:97-110. Rees J.A., Moniatte M., Bulet P. (1997) Novel antibacterial peptides isolated from a European bumblebee, Bombus pascuorum (Hymenoptera, Apoidea). Insect Biochemestry and Molecular Biology, 27(5):413-422. Ribbands C. (1953) The Behaviour and Social Life of Honeybees. Bee Research Associacion. University of Minnesota. Robinson G.E., Page R.E. Jr. (1988) Genetic determination of guarding and undertaking in honey-bee colonies. Nature, 333:356-358. Rothenbuhler W. (1964) Behaviour genetics of nest cleaning in honey bees IV. Responses of F1 and backcross generations to disease-killed brood. American honey bees: I. Differential survival of larvae of different genetic lines. Journal of Zoologist, 4:111-123. Rothenbuhler W.C., Thompson V.C. (1956) Resistance to American foulbrood in honey bees. I. Differential survival of larvae of different genetic lines. Journal of Economic Entomology, 49(4):470475. Royet J. (2011) Epithelial homeostasis and the underlying molecular mechanisms in the gut of the insect model Drosophila melanogaster. Cellular and Molecular Life Science, 68(22):3651-3660. Sabree Z.L., Hansen A.K., Moran N.A. (2012) Independent studies using deep sequencing resolve the same set of core bacterial species dominating gut communities of honey bees. PLoS One, 7(7):e41250. Seeley T.D., Morse R.A. (1976) The nest of the honey bee (Apis mellifera L.). Insectes Sociaux, 23:495512. Seeley T.D., Visscher P.K. (1985) Survival of honeybees in cold climates: the critical timing of colony growth and reproduction. Ecological Entomology, 10:81-88. Shen M., Yang X., Cox-Foster D., Cui L. (2005) The role of Varroa mites in infections of Kashmir bee virus (KBV) and deformed wing virus (DWV) in honey bees. Virology, 342(1):141-149. Söderhäll K., Cerenius L. (1998) Role of the prophenoloxidase-activating system in invertebrate immunity. Current Opinion in Immunology, 10(1):23-28. Söderhäll K., Cerenius L. (2004) The prophenoloxidase-activating system in invertebrates. Immunological Reviews, 198:116-126. Sohal R.S., Mockett R.J., Orr W.C. (2002) Mechanisms of aging: an appraisal of the oxidative stress hypothesis. Free Radical Biology and Medicine, 33(5):575-586. Strachetska A. (2008) Anatomicko-fyziologické bariéry proti nakaţení včel. Pasieka, 5:38-41. Sumpter D.J.T., Martin S.J. (2004) The dynamics of virus epidemics in Varroa-infested honey bee colonies. Journal of Animal Ecology, 73:51-63. Theopold U., Dushay M.S. (2007) Mechanisms of Drosophila immunity-an innate immune system at work. Current Immunology Reviews, 3:276-288. Tolarová S., Vetešníková-Šimková A., Rohlenová K., Flajšhans M., Lojek A., Lilius E-M., Hyršl P. (2011) The seasonal changes in innate immunity of the common carp (Cyprinus carpio). Aquaculture 2011, roč. 318, 1-2:169-175. Tolarová, S., Hyršl P., Dušková M. (2007) Stanovení bakteriolytické aktivity komplemetu u různých druhů obratlovců metodou biolouminiscence. Zoologické dny Brno 2007. ISBN 978-80-903329-7-3. Trenczek T. (1998) Endogenous defense mechanisms of insects. Zoology, 101:298-315. Tůmová L. (2010) Rostlinný alkaloid sanguinarin a jeho deriváty: bakalářská práce. Praha: Karlova univerzita, Fakulta Přírodovědecká.

62

Turner R.J. (1994) Immunology - A Comparative Approach. John Wiley and Sons, Chichester, New York, Brisbane, Toronto, Singapore. Vácha M., Bičík V., Petrásek R., Šimek V., Fellnerová I. (2004) Srovnávací fyziologie ţivočichů. Vydala Masarykova univerzita v Brně. Včelařství (2009) Mor včelího plodu se dá úspěšně potlačit. autor článku Vít Marada, září(9):270-273. Vilmos P., Kurucz É. (1988) Insect immunity: evolutionary roots of the mammalian innate immune system. Immunology Letters, 62(2):59-66. Visscher P. (1980) Adaptations of honey bees (Apis mellifera) to problems of nest hygiene. Sociobiology, 5:249-260. Vizioli J., Bulet P., Hoffmann J.A., Kafatos F.C., Müller H.M., Dimopoulos G. (2001) Gambicin: a novel immune responsive antimicrobial peptide from the malaria vector Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Science USA, 98(22):12630-12635. Wang Y., Zhang P., Fujii H., Banno Y., Yamamoto K., Aso Y. (2004) Proteomic studies of lipopolysaccharide-inducedpolypeptides in the silkworm, Bombyx mori. Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 68(8):1821-1823. Williams M.J. (2007) Drosophila hemopoiesis and cellular immunity. Journal of Immunology, 178(8):4711-4715. Wilson-Rich N., Dres S.T., Starks P.T. (2008) The ontogeny of immunity: development of innate immune strength in the honey bee (Apis mellifera). Journal of Insect Physiology, 54(10-11):1392-1399. Wilson-Rich N., Spivak M., Fefferman N.H., Starks P.T. (2009) Genetic, individual, and group facilitation of disease resistance in insect societies. Annual Review of Entomology, 54:405-423. Winston M.L. (1987) The Biology of the Honey Bee. Harvard University Press, Cambridge, MA. Wolfner M. F. (2002) The gifts that keep on giving: physiological functions and evolutionary dynamics of male seminal proteins in Drosophila. Heredity, 88(2):85-93. Woodrow A., Holst E. (1942) The mechanism of colony resistance to American foulbrood. Journal of Economic Entomology, 35:327-330. Zambon R.A., Nandakumar M., Vakharia V.W., Wu L.P. (2005) The Toll pathway is important for an antiviral response in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 102(20):7257-7262. Zander E. (1909) Tierische Parasiten als Krankheitserreger bei der Biene. Leipziger Bienenztg, 24(147150):164-166.

Internetové zdroje: URL 1: http://www.vcelky.cz/nemoci.htm URL 2: www.kr-jihomoravsky.cz/Default.aspx?PubID=111590&TypeID=7 Situační studie, Monitoring choroby Mor včelího plodu na území Jihomoravského kraje, květen 2008, Vypracoval Výzkumný ústav včelařský, s.r.o. ve spolupráci se základními organizacemi Českého svazu včelařů a Krajskou veterinární správou v Brně URL 3: http://www.expasy.org/prosite/PDOC00119 URL 4: http://www.nutris.net/sanguinarin-nejen-proti-paradontoze/ URL 5: http://www.vceliobchudek.cz/vceliobchudek/5-O-VCELACH-A-VCELARENI/7NEMOCI-VCEL

63