Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Dr. Pongrácz Judit Háromdimenziós szövettenyésztés és „tissue engineering” – 3. Előadás
ŐSSEJTEK (2)
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Köldökzsinórvér-őssejtek (CBE) • Kb. 130 millió gyermek születik évente – a regeneratív gyógyászat számára a köldökzsinórvér jelenti a legnagyobb potenciális őssejt-forrást • Az elmúlt 36 évben több, mint 10000 beteget kezeltek köldökzsinórvér-őssejtekkel • Több, mint 80 különböző betegség kezelésére alkalmaztak köldökzsinórvér eredetű őssejteket
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Köldökzsinórvér-őssejtek és magzati őssejtek Köldökzsinórvér gyűjtése (Születés után)
1
2
3
Keverés és ülepítés
Sejtek koncentrálása
Sejtek fagyasztása
35 perc
10 perc
Köldökzsinórvér hozzáadása
A köldökzsinórvér sejteket speciális zsákban vagy kapszulában fagyasztják le
Folyékony nitrogén tartály (-150°)
A vér vizsgálata Sejt szeparáció
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Krioprezerváció (Mélyfagyasztás) • A primer sejtek krioprezervációja hosszú távon lehetséges (akár 20 évig) • Az alacsony hőmérsékletet (-150-196oC) folyékony nitrogén biztosítja
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Köldökzsinórvér feldolgozása 1. Vörösvértestek eltávolítása (Ficoll, Hetastarch, Lymphoprep, Prepacyte) 2. A kisebb tárolási méret érdekében a plazma eltávolítása 3. A kinyert sejtek tesztelése (fertőzés, térfogat, cellularitás, őssejt-szám, CD34+)
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Köldökzsinórvér feldolgozása és krioprezerváció • A köldökzsinórvér elsősorban hematológiai betegségek kezelésében hasznos • A köldökzsinórvért születéskor gyűjtik • Azonnal feldolgozzák vagy tisztítás nélkül DMSO hozzáadásával folyékony nitrogénben lefagyasztják
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Köldökzsinórvér bank • Ideális esetben valamennyi nagyvárosban rendelkezésre áll, egy nemzetközi adatbázishálózathoz csatlakozik, ahol valamennyi tárolt sejt HLA-tipizálásának adatai hozzáférhetőek. • A köldökzsinórvér hosszú távú tárolása költséges
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
A köldökzsinórvér-őssejtek pluripotenciája Köldökzsinórvér Tisztítás
Őssejtek CBE MSC
Endodermális
Mezodermális
Ektodermális
Hepatobiliáris
Vér
Neurális
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Őssejtpopuláció a köldökzsinórvérben Adherens
MSC
Pre-MSC
CBE Nem adherens
Lin-
CD133+
CD34+
Köldökzsinórvér Csontvelő Perifériás vér
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Köldökzsinórvér-őssejtekkel gyógyítható betegségek I. Onkológiai betegségek
Immundeficienciák
Akut limfoid leukémia
Ataxia telangiektázia
Akut mieloid leukémia
Porc-haj hipoplázia
Autoimmun limfoproliferatív betegségek
Krónikus granulomatózus betegség
Burkitt limfóma
DiGeorge szindróma
Krónikus mieloid leukémia
Hipogammaglobulinémia
Monoszómia okozta citopénia
IKK gamma deficiencia
Familiáris hisztiocitózis
Autoimmun poliendokrin szindróma
Hodgkin-kór
II-es típusú mukolipidózis
Juvenilis mielomonocitás leukémia
Myelokathexis
Langerhans sejtes hisztiocitózis
Súlyos kombinált immunhiányos betegség
Mielodiszpláziás szindrómák
Wiscott-Aldrich szindróma
Non-Hodgkin limfóma
X-hez kötött agammaglobulinémia, immunhiány, limfoproliferatív szindróma
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Köldökzsinórvér-őssejtekkel gyógyítható betegségek II. Hematológiai betegségek
Anyagcsere betegségek
Autoimmun neutropénia
Adrenoleukodisztrófia
Ciklikus neutropénia
Alfa mannozidózis
Diamond Blackfran anémia
I-es típusú diabétesz
Evan szindróma
Gaucher-kór
Vörösvértest aplázia
Gunther -kór
Refrakter anémia
Hermansky-Pudlak szindróma
Súlyos aplasztikus anémia
Hurler szindróma
Sarlósejtes anémia
Hurler-Scheie szindróma
Thalasszémia
Krabbe-kór
Fanconi anémia
Maroteau-lamy szindróma
Glanzmann-kór
Metakromatikus leukodisztrófia
Kongenitális szideroblasztos anémia
II-es és III-as típusú mukolipidózis
Juvenilis dermatomiozitisz és xanthogranulomák, stb.
A és B típusú Neimann Pick szindróma Sandoff szindróma Sanfilippo szindróma Tay Sachs betegség
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Zsírszövet-eredetű őssejtek (ASC) Zsírszövet-eredetű őssejtek (ASC): • Könnyen izolálható • Állandó immunfenotípus jellemzi • A csontvelői őssejtekhez (BMSC) hasonló • Multipotens • Genetikailag módosítható
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
A zsírszövetek típusai
Típus
Funkció
1
Csontvelői zsírszövet
Azon terek kitöltése, amelyek a hemopoézisben már nem vesznek részt
2
Barna zsírszövet (BAT)
Az újszülöttek létfontosságú szerveinek védelme
3
Ektópiás zsírszövet
Abnormális zsír felhalmozódás a májban, a szív- és vázizomzatban (pl.: metabolikus szindrómában)
4
Emlő zsírszövete
Szoptatás – energia és tápanyagforrás
5
Mechanikai zsírszövet
Mechanikai traumától való védelem
6
Fehér zsírszövet (WAT)
Hőszigetelés, energia raktározás, rezervoár, endokrin szerv
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Zsírszöveti őssejtek izolálása
Mosás PBS-ben
Zsírsejtek leszívása
300g, 5 perc
Emésztés kollagenázzal 37oC-on, 1 óra
Stróma-vaszkuláris frakció (SVF)
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
A zsír eredetű őssejtek immunfenotípusa Pozitív markerek Marker
Név
Marker
Név
CD9
Tetraspan
CD55
Decay accelerating factor
CD10
Közös akut limfoid leukémia antigén
CD59
Protektin
CD13
Aminopeptidáz
CD71
Transzferrin
CD29
b1-integrin
CD73
5’-ektonukleotidáz
CD34
Szialomucin
CD90
Thy1
CD44
Hialuronsav receptor
CD105
Endoglin
CD49d
a4-integrin
CD146
Muc-18
CD54
Intracelluláris adhéziós molekula
CD166
Aktivált leukocita sejtadhéziós molekula
HLA-ABC
Hisztokompatibilitási lókusz antigén-ABC
a-SMA
a-simaizom aktin
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
A zsír eredetű őssejtek immunfenotípusa Negatív markerek Marker
Név
Marker
Név
CD11b
ab-integrin
CD50
Intracelluláris adhéziós molekula-3
CD14
LPS receptor
CD56
Idegsejt adhéziós molekula
CD16
Fc receptor
CD62
E-szelektin
CD18
b2-integrin
CD104
B4-integrin
CD45
Közös leukocita antigén
HLA-DR
Hisztokompatibilitási lókusz antigén-DR
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
A zsírszövet eredetű őssejtek citokinprofilja CITOKIN
FUNKCIÓ
• Adiponektin • Leptin • Plazminogén aktivált inhibitor-1
Adipokinek
• Hepatocita növekedési faktor • Pigment epitél eredetű faktor • Vaszkuláris endoteliális növekedési faktor
Angiogén
• • • • •
Flt-3 ligand GCSF Leukémia inhibitor faktor IL-7 MCSF
• IL-6, IL-8, IL-11 • Leukémia inhibitor faktor • TNFa
Hemopoetikus
Pro-inflammatorikus
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
A zsírszövet eredetű őssejtek immunogenitása • Az immunogenitás hiánya annak köszönhető, hogy a felszínükről hiányoznak a II-es típusú fő hisztokompatibilitási antigének (HLA-DR). • Immunszuppresszív tulajdonságuk a prosztaglandin E2 termeléshez kapcsolódik.
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
A zsírszövet eredetű őssejtek differenciáciálódási potenciálja • • • • • • • • •
Zsírsejt Szívizomsejtek Porcsejtek Endodermális és ektodermális sejtvonalak Endotél és simaizom sejtek Hemopoetikus sejtek Neuronális sejtvonal Oszteoblasztok Harántcsíkolt izomsejtek
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Zsírsejtekké történő differenciáció A SEJTEK EREDETE Fehér zsírszövet
INDUKÁLÓSZER
INDUKÁLT MARKEREK
FELHASZNÁLÁS
Forskolin (AMP agonista)
Neutrális zsírok
Funkcionális zsírpárnák
Methylisobutylxanthine (AMP agonista)
Adiponektin
Plasztikai sebészet
Glükokortikoid receptor ligandok (dexamethasone)
CAAT/enhancer kötő protein-a zsírsav-kötő fehérje (aP2)
Kozmetikai és helyreállító sebészet
PPAR-g2 ligandok (thiazolidinedione)
Leptin
Inzulin
Lipoprotein lipáz
bFGF
PPAR-g2
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Szívizomsejtekké történő differenciáció A SEJTEK EREDETE
INDUKÁLÓSZER
INDUKÁLT MARKEREK
Barna zsírszövet
5-azacytadine
Szarkomer aktinin
Fehér zsírszövet
Szívizomsejt kivonat
Konnexin-43 Dezmin troponin-I
FELHASZNÁLÁS Ischaemiás károsodás után a sérült szívizomszövet helyreállítása
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Porcsejtekké történő differenciáció A SEJTEK EREDETE
INDUKÁLÓSZER
INDUKÁLT MARKEREK
Csontvelői zsírszövet
Aszkorbinsav
Aggrecan
Barna zsírszövet
Dexamethasone
Kondroitin-szulfát
Fehér zsírszövet
TGF-b
II-es típusú kollagén
3D struktúra
IV-es típusú kollagén
BMP-6
Porcsejt-specifikus proteoglikánok
FGF
FELHASZNÁLÁS Térd, csípő porcszövet
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Oszteocitákká történő differenciáció A SEJTEK EREDETE
INDUKÁLÓSZER
INDUKÁLT MARKEREK
FELHASZNÁLÁS
Fehér zsírszövet
Aszkorbinsav
Oszteokalcin
Csont implantáció
Csontvelői zsírszövet
Dexamethasone
DMP-1
Csonttörés helyreállítása
1,25-dihidroxikolekalciferol
Oszteoadherin
B-glicerolfoszfát BMP-2 BMP-7
Runx2
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Harántcsíkolt izomsejtekké történő differentáció A SEJTEK EREDETE
INDUKÁLÓSZER
INDUKÁLT MARKEREK
FBS alacsony koncentrációja
myoD
Ló szérum
Miogenin Miozin könnyűlánc kináz
FELHASZNÁLÁS
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Idegsejtekké történő diferenciáció A SEJTEK EREDETE
INDUKÁLÓSZER
Indomethacin
Gliális fibrilláris savas fehérje (GFAP)
Inzulin
Nestin
Metlizobutilxantin
Intermedier filamentum Glutamát receptor alegységek S-100 B-III tubulin
INDUKÁLT MARKEREK Központi idegrendszer sérülései
FELHASZNÁLÁS
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Differenciáció endodermális és ektodermális sejtvonalakká A SEJTEK EREDETE Csontvelői zsírszövet
INDUKÁLÓSZER
INDUKÁLT MARKEREK
Hepatocita növekedési faktor
Albumin
Oncostatin M
A-fetoprotein
DMSO és HGF, bFGF, nicotinamid együtt
Urea
ATRA
Citokeratin-18
FELHASZNÁLÁS Máj
Epitél szövet helyreállítás (Crohn-betegség)
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Endotél és simaizom sejtekké történő differenciáció A SEJTEK EREDETE Fehér zsírszövet
INDUKÁLÓSZER
INDUKÁLT MARKEREK
FELHASZNÁLÁS
CD31
Vaszkuláris trauma
kalponin
Urogenitális trauma
a-simaizom aktin
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Hemopoetikus utánpótlás A SEJTEK EREDETE
INDUKÁLÓSZER
INDUKÁLT MARKEREK
ASC-k szekretálják: IL6,IL7, IL8, IL11, SCF, TNFa, MCSF, GMCSF
CD34+ a T, NK sejteken, Bsejt markerek
FELHASZNÁLÁS Nagydózisú kemoterápiát követő hemopoetikus őssejt-helyreállítás
Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Dr. Pongrácz Judit Háromdimenziós szövettenyésztés és „tissue engineering” – 4. Előadás
ŐSSEJTEK (3)
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
ESC-k és ASC-k felhasználása Embrionális fejlődés
Endoderma
Blasztociszta
Tüdő
Ektoderma
Belső sejttömeg ESC
Agy Neuron
Asztrocita
NSCs Szubventrikuláris zóna niche Hippokampusz niche (gyrus dentalis )
Pluripotens ESC BASCs BADJ niche
Mezodermális őssejt
Endodermális őssejt
Tüdőbetegségek
Ektodermális őssejt
Agyi és gerincvelői rendellenességek
Hemangioblaszt
Szem
Hasnyálmirigy Inzulin-termelő b-sejtek
Exockrin acinusok
Cukorbetegség
RSCs Csillós epitél niche
Mesoderma Endokrin Langerhans szigetek
Szív
Cornea
Szívizomsejtek
CSCs Pitvar niche Szívcsúcs niche
PSCs Hasnyálmirigyvezeték feltételezett niche
Máj
Szembetegségek
Bőr
Szívbetegségek EPC HSCs Endoszteum felszín niche Hajszálér hálózat niche
HDCs Epevezeték (Hering csatorna)
HSC Közös mieloid prekurzor
MSCs Perivaszkuláris felszín niche
Hemopoetikus és Immunrendszeri megbetegedések
Eritrocita
Közös limfoid prekurzor
Vérlemezkék Eritrociták Granulociták Monociták
Neutrofil
HSC Bazofil
EPC Új endotélsejt
Eozinofil
Oszteoblasztok Porcsejtek Zsírsejtek Mioblasztok
NK-sejtek T-limfociták B-limfociták Dendritikus sejtek
Keringési betegségek
Véráram
Makrofág T-limfocita Dendritikus sejt
Media Vaszkulogén zóna
Bőrbetegségek
SKPs Tüsző papilla
Génterápiák NK-sejt
Monocita
KSCs Alapréteg niche bESCs eNCSCs „Bulge” régió niche
MSC
Makrofágok
Érlumen Vérlemezke
CESCs Limbus niche
Retina
Csont
Májsejtek
Májbetegségek
Oligodendrocita
Érfalban található őssejtek EPCs and MSCs
B-limfocita
Intravénás injekción
Genetikailag módosított őssejtek
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Génsebészet és génátvitel ASC-k felhasználásával • ASC sejtek transzdukciója lentivirális vektorokkal • Egyéb rekombináns virális vektorok • Nukleofekció
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Az őssejt-szaporodás és differenciáció irányítására alkalmazott módszerek Sejtvonal-specifikus génekkel történő transzdukció segítheti a differenciáció irányítását. Riporterek (pl.: GFP) alkalmazása megkönnyíti a sejtek szelekcióját (pl.: FACS) illetve a génaktiváció helyének és idejének ellenőrzését. Sejt-szortoló technikák alkalmazásával (MACS vagy FACS) a kívánt sejtek kiválogathatóak (vagy a nem kívánt sejtek eltávolíthatóak) sejtfelszíni antigéneket kötő antitestek felhasználásával vagy fluoreszcens markerek, például GFP expresszió alapján.
Gén Riporter (pl. GFP)
FACS
MACS
Egyes specifikus sejttípusok szelekciója adhéziós assay-el specifikus ECM fehérjék vagy receptor ligandok felhasználásával a sejtszubsztrát interakciók affinitása és kinetikája alapján. Ide tartozik a kolónia formáló egység (CFU) assay is.
A tenyésztőmédiumhoz adott különböző biokémiai faktorok (szérumot beleértve) stimulálják a differenciációt. Ehhez szükséges azon faktorok ismerete, amelyek valószínűleg elősegítik a differenciációt, ugyanakkor ritka a 100%-os hatékonyság. A többféle méretben és típusban kapható bioreaktorok növelik a tápanyagok illetve bomlástermékek cseréjének hatékonyságát, elősegítik a növekedési faktorok transzportját, lehetővé téve a sejtkultúrák hosszú távú fenntartását, és így nagyobb sejtszám vagy nagyobb szövetméret elérését. A kívánt sejtekkel vagy szövetekkel (pl.: szövetregeneráció céljára) létrehozott ko-kultúrák a közvetlen fizikai kontaktus és/vagy közvetett biokémiai jelek útján elősegíthetik a differenciációt.
A „scaffold”-ok fizikai (pl.: felszíni érdesség, porozitás, stb.) és biokémiai (pl.: beágyazott növekedési faktorok szabályozott felszabadulása) sajátságai elősegítik a sejtek tapadását, toborzását, differenciálódását, illetve megkönnyíti a sejtek szállítását.
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Újraprogramozás Vírus szállítja az újraprogramozáshoz szükséges faktorokat a szomatikus sejt magjába
Pluripotens iPSC sejtvonal
Szomatikus sejt újraprogramozása
Tenyésztés hESC-ként
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Sejtek differenciálódása I. Prekurzor sejt
Szabályozó fehérje 1
Sejtosztódás
Szabályozó fehérje 2
Szabályozó fehérje 3
Sejt A
Sejt B
Sejt C
Szabályozó fehérje 2
Szabályozó fehérje 3
Sejt D
Sejt E
Szabályozó fehérje 3
Sejt F
Sejt G
Szabályozó fehérje 3
Sejt H
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Sejtek differenciálódása II. Ivarsejtek
Gasztrula
Spermium
Petesejt
Ektoderma (Külső réteg)
Blasztociszta Zigóta
Epidermisz bőrsejtjei
Agy neuronjai
Pigmentsejt
Mezoderma (Középső réteg)
Szívizom
Harántcsíkolt izomsejtek
Vörösvértestek
Endoderma (Belső réteg)
Tüdősejt (Alveroláris sejt)
Pajzsmirigy sejt
Hasnyálmirigy sejt
Simaizom
Vesetubulus sejtek
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Érett, szervspecifikus primer sejtek I.
Sejtkultúra Biopszia
Tisztítás
TE-ben használható sejtek
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Érett, szervspecifikus primer sejtek II.
Tisztítás
Biopszia
Szövetspecifikus rezidens őssejtek
Differenciálódott szöveti sejtek
Sejtkultúrák
TE-ben használható sejtek
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Az epidermisz differenciálódása Elszarusodó envelope
Lipid envelope
Epidermális differenciáció
Lipidek felszabadulása a lamelláris granulumokból
Stratum corneum
Szemcsés réteg
Filaggrin, loricin, trichohyalin, involucrin, SPRRs, S100 fehérjék Keratin-2e
Stratum spinosum
Keratin-1, -10
Alapréteg
Keratin-5, -14
Alapmbrán
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Érett szövetspecifikus sejtek „tissue engineering”-ben • Biopszia vagy reszekció • Tisztítás • A proliferációs képesség visszaállítása sejtkultúrában • Re-differenciáció
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Szabályozási kérdések I. Sejtek • GLP • GMP • Engedély embrionális őssejtekkel történő munkához
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Szabályozási kérdések II. Állatok • Engedély állatokkal végzett kísérletekhez • UK: Home Office Licence 1986 • EC 1394/2007
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Szabályozási kérdések III. Humán embrionális őssejtek A humán embriók őssejt-forrásként való felhasználása körüli etikai viták (etikai kérdések)
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Regeneratív medicina • Szervek regenerációja saját regeneratív biokémiai és celluláris folyamataik révén • Szervregeneráció in vitro létrehozott egész szervek vagy egy szerv specifikus szöveteinek hozzáadásával
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Szervelégtelenség • Betegség, baleset vagy öregedés miatt fellépő szervműködési elégtelenség esetén a teljes szerv pótlására vagy regenerációjára van szükség • Ideális esetben a beteg számára a saját (autológ) szövetei szolgálnak „bioalapanyagként „e szervek létrehozásához
