Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Csősz Éva Molekuláris terápiák – 7. előadás
REKOMBINÁNS ANTITESTEK ÉS A PHAGE DISPLAY TECHNIKA
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
A 7. fejezet célja, hogy bemutassa a terápiák során felhasznált antitestek termelésének lehetőségeit és korlátait. A fejezet során bemutatásra kerül az antitestek termelődésének folyamata, a terápiás antitestek termelése hibridómákban illetve a nagyfokú antitest diverzitás biztosítása fág diszplay segítségével.
A 7. fejezet témakörei 7.1. Áttekintés 7.1.1. Az antitestek szerkezete és termelődése a szervezetben 7.1.2. Antigén – antitest kölcsönhatás 7.2. A terápiás antitestek termelése 7.2.1. Antitestek termelése hibridómákban 7.2..2. Humanizált antitestek 7.2.3. Humán antitestek termelése 7.3. Antitestek termelése fág diszplay segítségével 7.3.1. A fág diszplay technika bemutatása 7.3.2. Fág könyvtárak készítése 7.4. A terápiás antitestek alkalmazása
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Az antitestek szerkezete
Szupervariábilis régió NH3+ NH3+
NH3+
VH
VH
VL
NH3+
VL CH1 CH1 CL COO-
Könnyű lánc: CLkonstans régió, variábilis régió COOHinge régió
CH2
Nehéz lánc: konstans régió, variábilis régió
Diszulfid hidak
Fab régió
CH3 COO- COO-
Fc régió
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Az antitestek nehéz láncának szerkezete
kb. 85 gén
kb. 27 gén
VH1 VH2 VH3 VH4 VHn
DH1 DHn
kb. 6 gén
JH1 JH2 JH3 JHn
Nehéz lánc
VH4 DH1 JH2 C
IgG
Cµ C C C C α
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Az antitestek könnyű láncának szerkezete
kb. 35 kappa gén
kb. 5 kappa gén
VL1 VL2 VL3 VL4 VLn
JL1 JL2 JL3 JLn
kb. 30 lambda gén
kb. 4 lambda gén
VL2 JL3 C
C
kappa könnyű lánc
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Az antitestek termelése a B sejtekben
B sejt Antitest
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
A klonális szelekció és klonális expanzió
Y
Rekombináció Kapcsolódási diverzitás Szomatikus hipermutáció
Y YY
B sejt
BCR
Klonális szelekció
Antigén/epitóp
B sejt Klonális expanzió
Plazma sejt
Specifikus antitest
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Poliklonális antitestek
Y Y B sejt
Y
B sejt
Antitest Antigén Antitest
B sejt
Y
Epitóp
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Monoklonális antitestek
B sejt
Antitest Antigén
Epitóp
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Antitestek termelése hibridómákban Antigén Mielóma sejtek
HGPRT Antitest termelés
Egér immunizálása Lépsejtek izolálása HGPRT Antitest termelés
Lépsejtek és mielóma sejtek fúziója, a hibridóma sejtek létrehozása Hibridómák szűrése és szaporítása
Y Y Y Y Y Y Y
Antitestek izolálása
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Humanizált antitestek
Humán antitest
Egér antitest
Humanizált antitest / kiméra antitest
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Humán antitestek termelése génmódosított egerekben
Egér immunoglobulin gén
Humán immunoglobulin gén
Humán vagy humanizált antitestek termelése
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Az M13 bakteriofág szerkezete
M13 bakteriofág 5 db p6 DNS - 6.4 kb
5 db p9 5 db p7
2700 db p8 900 nm
5 db p3 F-pilus
E. coli
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Az immobilizált fehérjékhez kötött fágok specifikus elúciója
Specifikus elúció
Immobilizált fehérje / affinitás mátrix
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Enzim fág diszplay
mátrix
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Szubsztrát fág diszplay I.
mátrix
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Szubsztrát fág diszplay II.
mátrix
mátrix
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Enzim-szubsztrát fág diszplay I.
mátrix
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Enzim-szubsztrát fág diszplay II.
mátrix
mátrix
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Fág könyvtárak készítése
Változatos szekvenciák sokasága Fágmid
Rekombináns fágmid
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Proteáz szubsztrát fág könyvtár készítése
Változatos szekvenciák létrehozása Proteáz szubsztrát szekvencia hGH gén hGH gén
Proteáz szubsztrát
Proteáz szubsztrát
M13 gIII gén
Fágmid vektor Fágmid vektor
Fág könyvtár
M13 gIII gén
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Szubsztrát fág diszplay – proteáz hasítóhelyek fejlesztése
Proteáz érzékeny szekvenciák Proteáz hGH receptor
Proteáz
Alacsony pH mátrix
Proteáz rezisztens szekvenciák
Szekvenálás
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
In vivo fág diszplay – ér endothel sejtek térképezése
A fágok az erek falán expresszált fehérjékhez kötődnek Biopszia
Fág könyvtár beadása intravénásan
A kötődött fágok lemosása
A fágok által hordozott peptidek/fehérjék azonosítása
A kötődött fágok szaporítása
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Antitest könyvtárak készítése teljes vérből
Teljes vér (Immunizált donor) Antitest gének
Limfociták Antitest specifikus primer
Fágmid
mRNS
E. coli sejtek cDNS
108 különböző antitest génjét tartalmazzák
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Antitest függő citotoxicitás mechanizmusa
Tumor ellenes antitestek
Fc receptor
Tumor sejt Ölő sejt (NK sejt vagy monocita)
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Immunszupresszáns hatású terápiás antitestek alkalmazása
Monoklonális antitestek • Adalimumab • Infliximab • Golimumab • Cetrolizumab pegol
Basiliximab Humán-egér kiméra antitest
• Pszoriázis • Reumatoid arthritisz • Crohn betegség • Spondilitisz TNFalfa
IL2 receptor alfa lánc
Transzplantáció utáni szervkilökődés megakadályozására, főként veseátültetések esetén
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
A terápiás antitestek változatai
Bispecifikus antitest (kb. 300 kDa)
IgG - scFv (Fab – scFv)2
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
A kisméretű terápiás antitestek változatai
Fab
scFv
F(ab’)2
Tandem scFv
Diabody S-S
Fv S-S
dsFv
Nanobody
scFv2
Triabody
Bispecifikus antitest
