Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Scholtz Beáta Molekuláris Terápiák – 2. előadás
FUNKCIONÁLIS GENOMIKA 2.
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
FUNKCIONÁLIS GENOMIKA 2.
A fejezet célja, hogy ismertesse a funkcionális genomika célkitűzéseit és legfontosabb módszereit. Konkrét példákon kereszül bemutatjuk, hogyan járulhat hozzá ez a tudományág az orvostudomány fejlődéséhez. 1.1 DEFINÍCIÓK 1.2 A BETEGSÉGEKRŐL 1.3 A BETEGSÉGMECHANIZMUSOK FELTÁRÁSÁNAK MÓDSZEREI 1.3.1 A génexpresszió szabályozásának alapesetei 1.3.2 Microarray-k: Funkcionális genomika a rákterápia fejlesztéséért 1.3.3 Genetikai aberrációk és betegségek 1.3.4 Genom microarray-k 1.3.4.1. Array összehasonlító genom hibridizáció (aCGH)
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011
Microarray-k: Funkcionális genomika a rákterápia fejlesztéséért • Ki tartozik a magasabb kockázatú csoportba (Prognózis) • Kinél várható jó (vagy gyenge) terápiás válasz
• Alternatívák a kemorezisztens rákok kezelésére • Létező és új gyógyszerek hatékonyabb alkalmazása • Gyógyszerek egyedi kombinációinak kidolgozása
4
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011
Herceptin: a páciensek kiválasztásának fontossága
Összes emlőtumoros páciens
Herceptin
10% válasz
Her2+ emlőtumoros páciensek
Herceptin
35-50% válasz
Alkalmazható-e ugyanez az általános kemoterápiás kezeléseknél is? Holly Dressman, IGSP, Genomes 101 2007
5
Előrehaladott stádiumú petefészekrák Jelenlegi protokoll
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011
Műtét
Primer kemoterápia Platina/taxán
70% teljes válasz 30% részleges válasz
Kiújuló betegség Másodlagos kemoterápia
10-20% válasz 80-90% nincs válasz
Inaktív ágensek - szükségtelen toxicitás Sok pácienst kezelnek eredmény nélkül Holly Dressman, IGSP, Genomes 101 2007
6
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011
Kemorezisztens tumorok kezelésének újabb lehetőségei NCI-60 sejtvonal panel rezisztens és érzékeny sejtvonalak azonosítása expressziós prediktor a válasz előrejelzésére
- Kemoterápiás válasz adatai - Affymetrix expressziós adatok
Kemoterápiás válasz prediktív profil
több mint 50 gén
rezisztens
érzékeny
14 sejtvonal
Holly Dressman, IGSP, Genomes 101 2007
7
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011
8
Potti et al. Nat Med 2006
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011
Expressziós mintázat egyéb kemoterápiás ágensekre ugyanaz az alapelv
Génlista NCI-60 sejtekre
Potti et al. Nat Med 2006
9
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011
Páciensadatok (petefészekrák) Már meglévő génexpressziós adatok a GEO adatbázisból Valószínűségi szám, Potti et al. által hozzárendelve Kemoterápiás válasz adata ua. kísérletből Potti et al. Nat Med 2006
10
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011
Korreláció onkogén szignál útvonalak aktivációja és kemorezisztenciák között: Kombinációs terápia az útvonalakat célzó gyógyszerekkel?
src: SU6656 PI3K: LY-294002
11
Potti et al. Nat Med 2006
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011
Miért tanulmányozzuk a tumorok DNS-ét? • A sejtbéli információ alapvető tárhelye
• Ugyanazok a DNS aberrációk ismétlődnek a tumorokban - nem hagyható figyelmen kívül! • Bizonyos fajta DNS aberrációkra nagyon hatékony, általános vizsgálómódszerek léteznek • A DNS meglehetősen stabil, és sokféleképpen kezelt mintákban is analizálható, pl. kórházi laborokból származó archív szövetmintákban.
12
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011
Sokféle genetikai aberráció okozhat fejlődési rendellenességet vagy betegséget
Pontmutáció - egy vagy néhány bázis megváltozása - megváltozik a protein vagy az expressziós szintje Gén egyik kópiája elvész - expressziós szint csökkenése (tumorszuppresszor elvesztése) Extra génkópia - expressziós szint nő (onkogén aktiváció) Génpromoter metilációja/demetilációja - expressziós szint csökken/nő (tumorszuppresszor elvesztése/ onkogén aktiváció) A DNS törése és a végek aberráns újracsatlakozása új géneket eredményezhet.
13
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011
Genetikai aberrációk térképezése Pozíció finomítása
Aberráció térképezése
Gén azonosítása
Prognózis, diagnózis, progresszió, stádiumok, terápia választás genetikai háttere
Génspecifikus terápia
Valószínűsíthető gén/útvonal teljes biológiai analízise
14
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011
Genom microarray-k Definíció:
Olyan microarray technológia, mely a kromoszóma aberrációkat detektálja
Felhasználás:
Klinikai laboratórium: fluroeszcens in situ hibridizációval (FISH) komplementer technológia Kutatólaboratórium: azonosíthatja a betegségek genetikai hátterét
Jelentőség:
Sok betegséget mikrodeléciók és olyan egyéb kromoszóma aberrációk okozhatnak, melyeket a FISH technika nem detektál. SNP array-k még jobb felbontást biztosítanak, és a genotípusról és kópiaszámról is adnak információt.
15
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011
Sokféle microarray, különböző célkitűzésekhez
16
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011
Array összehasonlító genom hibridizáció (comparative genomic hybridization, CGH)
Microarray alapú összehasonlító genom hibridizáció Nem az RNS, hanem a DNS mennyiségét méri Két mintát hasonlít össze: Teszt minta Referencia minta Nagy felbontás 1-3 Mb (teljes genom array CGH), vagy 10-25 kb (oligó aCGH) vs 5-10 Mb (kariotipizálás) Időigény : 3-4 nap (array CGH) vs 2-4 hét (kariotipizálás) Egyszerű DNS preparálás az aCGH-hoz, szemben a metafázisos kromoszómák analízisével 17
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011
Array CGH Tumorokban előforduló genetikai átrendeződések detektálása (tumor genom és normál genom összehasonlítása) Genom kópiaszám variációk analízise szegregálódó variánsok léteznek a populációban Bizonyos patogén variánsok betegségekkel asszociálódnak Beteg és egészséges egyének genomjának összehasonlítása Genetikai markerekkel kapcsolt, ismert próbák használata a betegségek jobb megértésehez vezethet
18
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011
Array CGH: azonosítja a DNS kópiaszám változásokat, és pozíciójukat a genomban
Teszt genom DNS
Referencia genom DNS
DNS vesztés a tumorban
Arány
Extra DNS kópiák a tumorban
pozíció a szekvenciában 19
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011
Egy tumorgenom array CGH analízise
Vesztett
Extra
20
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011
A tumorok kópiaszám profilja két folyamatot tükröz • Olyan génexpressziós változások szelekciója, melyek a tumor kialakulásának kedveznek. Bizonyos genetikai aberrációk együttesének megtartása szelektív előnyt jelent.
• A genetikaiminstabilitás többféle mechanizmus révén indukál változásokat a genomban. (Iniciáló onkogén események egérmodellekben és metotrexát rezisztencia MMR deficiens és proficiens sejtvonalakban)
21
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011
aCGH hasznosítása a rákkutatásban
• Az eredmények alapján jobb tesztek alakíthatók ki, melyek az onkogének és tumor szuppresszor gének kópiaszámát detektálják • Tumorprogresszió monitorozása, korai és metasztatikus léziók megkülönböztetése FISH próbákkal, melyek a több tumortípusban megfigyelhető kópiaszámváltozások régióit detektálják.
•További kópiaszám markerek azonosítása, melyek tumor predikcióra alkalmasak • A tumorok kialakulásában közreműködő gének azonosítása és analízise segíthet olyan új gyógyszerek tervezésében, melyek a diszfunkcionális géneket/útvonalakat veszik célba, és/vagy nem okoznak terápia rezisztenciát.
22
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011
Elváltozások egy tumorsejtvonal genomban: Kromoszomális és microarray alapú CGH megfeleltetése
Amplifikációk: aktivált onkogének Deléciók: Inaktivált gének (tumorszuppresszorok)
23
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011 A SNP array-k ereje: „loss-of-heterozygosity” detektálása, kópiaszám változás hiányában is Tan DSP et al. Laboratory Investigation 2007. 87:737
24
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011
SNP adatbázisok dbSNP az NCBI honlapon http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP Humán SNP adatbázis (Whitehead Institute) http://www.broad.mit.edu/tools/data/genvar.html A SNP Konzorcium (TSC) http://snp.cshl.org
J Pevsner: Bioinformatics and functional genomics
25
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011
26
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011
Új terápiás célpontok azonosítása: a „felülről lefelé” módszer
Tan DSP et al. Pathobiology 2008. 75:63
27
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011
Új terápiás célpontok azonosítása: a „lentről felfelé” módszer
Tan DSP et al. Pathobiology 2008. 75:63
28
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011
Myeloma multiplex aCGH analízise
55 MM sejtvonal, 73 páciens minta
Carrasco DR et al. Cancer Cell 2006. 9:313
29
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011
Myeloma multiplex aCGH analízise: prognosztikus besorolás
hiperdiploid: k1, k2
nem-hiperdiploid: k3,k4
Konklúzió: ch11 extra : jobb prognózis ch1q extra: rosszabb ch13 vesztés: rosszabb
Carrasco DR et al. Cancer Cell 2006. 9:313
30
Myeloma multiplex kombinált génexpressziós és aCGH analízise
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011
Carrasco DR et al. Cancer Cell 2006. 9:313
31
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011
Laphámsejtes tüdőrák aCGH analízise
A: Összes minta
B: Magas kópiaszám változások PIK3CA 3q26.2-q27.3
Boelens MC et al. Lung Cancer 2009. 66:372
32
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011
Laphámsejtes tüdőrák aCGH analízise: PIK3CA expressziós szintek és amplifikáció korrelációja
Új terápiás célpont?
Boelens MC et al. Lung Cancer 2009. 66:372
33
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011
A PIK3/Akt/mTOR szignál transzdukciós útvonal
34
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011
Klinikai kipróbáláson levő PI3K inhibitorok jellemzői
Ihle N T , Powis G Mol Cancer Ther 2009;8:1-9
35