Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Berki Tímea és Boldizsár Ferenc Jelátvitel
INTRACELLULÁRIS/ NUKLEÁRIS RECEPTOR JELÁTVITEL
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Történeti háttér • G. T. Beatson skót sebész inoperábilis emlőrák regresszióját írja le ovariektómia után • Az állatok kasztrációja javítja a hús minőségét • Ősi kínai orvoslás placenta extraktumot használ • 1926 Kendall ésReichstein kortizon és tiroxin • Butenandt/Doisy ösztrogén (terhes nő vizeletében) • Androszteron és progeszteron (sertés corpus luteumból izolálták) • “estrus” ~ “oistros” (Greek) = bögöly • 1961 Jensen: ösztrogén receptor • 1980-as évek: ER, GR, TR klónozása (Chambon, Evans és Vennström)
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Hatásmechanizmus • Nukleáris receptorok a sejtekben található fehérjék, amelyek a szteroid és thyroid hormonok és más lipofil molekulák érzékelését végzik • Ligand kötődése a nukleáris receptorhoz annak konformációváltozását idézi elő, amely aktiválódva, transzkripciós faktorként viselkedik • A receptor aktivációja gének átíródásának fokozását vagy gátlását eredményezi.
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Transzkripciós faktorok Transzkripciós faktorok: szekvencia-specifikus DNSkötő faktorok • Szabályozzák a DNS genetikai információjának átíródását mRNS-re • Aktivátorként hatnak (= segítik a génexpressziót) vagy represszorok (= gátolják a génexpressziót) szabályozva az RNS polimeráz toborzását
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Transzkripciós faktorok vizsgálata Transzkripciós faktor aktivitás: • Luciferáz teszt • Kromatin immunoprecipitáció (ChIP) • Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) Transzkripciós faktor interakció: • Ko-immunoprecipitáció
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Luciferáz riporter assay 1. A célsejt transzfekciója Luc Vectorral 2. A sejtek aktiválása 3. Signaling, TF aktiváció 4. Luciferáz szintézis 5. Fényelnyelődés mérése RNS polimeráz és transzkcripciós faktorok
Promóter
Reporter gén
Transzkripció mRNS Transzláció Reporter fehérje
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Ligandok
17-b-ösztradiol Ösztrogén receptor (ER)
A-vitamin Retinsav receptor (RAR)
Tesztoszteron Androgén receptor (AR)
Kortizol Glükokortikoid receptor (GR)
Trijódtironin (T3) Tiroid hormon receptor (TR)
Kalcitriol D-vitamin receptor (VDR)
Lipofil hormonok: A keringésben transzport fehérjékhez kapcsolódnak; a plazmamembránon transzport fehérjéhez kötődve vagy passzívan lépnek át
A nukleáris receptorok faji megoszlása
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
• A nukleáris receptorok állatokra jellemzőek, algákban, gombákban és növényekben nincsenek • A C. elegans-nak 270 ismert receptora van • Számos orphan receptor létezik!!! • Az emberi nukleáris receptorok száma 48, egérben és patkányban 49 illetve 47 nukleáris receptort találtak
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Intracelluláris receptorok Ösztrogén rec. (ER)
Ösztradiol
Glükokortikoid rec. (GR)
Kortizol
Mineralokortikoid rec. (MR)
Aldoszteron
Androgén rec. (AR)
Tesztoszteron
Progeszteron rec. (PR)
Progeszteron
Tiroid hormon rec.
Tiroid hormon rec. (TR)
T3
Retinoid rec.
Retinsav rec. (RAR)
All-transz-retinsav
Retinsav X rec. (RXR)
9-cisz-retinsav
D-vitamin rec.
D-vitamin rec. (VDR)
1,25-hidroxi-kolekalciferol
Lipid szenzorok
Máj X rec. (LXR)
Oxiszterolok
Farnesoid X rec. (FXR)
Epesavak
Peroxiszóma proliferátor aktivált rec.
Zsírsavak, eicosanoidok (pl. LT-k, PG-k)
Szteroid hormon rec.
PPAR
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Nukleáris receptor családok Szteroid Recetorok GR
Glükokortikoid
MR
Mineralokortikoid
PR
Progeszteron
AR
Androgén
RXR Heterodimerek
GR
GR
Dimer „Orphan”- Árva Receptorok RXR COUP HNF-4 TR2 TLX GCNF
T3R
Tiroid hormon
RAR
All-transz RA
VDR
1,2,5-(OH)2-VD
PPARa
Zsírsavak
PPARg
15d-Δ12,14-PGJ
EcR
Ekdizon
FXR
Epesav
CAR
Androsztán
LXR
Oxiszterol
PXR/SXR
Xenobiotikumok
RXR
Monomer „Orphan” - Árva Receptorok
9-cisz RA RXR
RXR
NGFI-B SF-1 Rev-erb ROR ERR
RXR
R
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
A nukleáris receptorok szerkezeti felépítése 50-500 aminosav, variábilis Dimerizáció Hinge régió
N-terminális domén
A/B AF-1
C
D
C-terminális domén
E Ligand-kötő domén (LBD)
DNS-kötő domén (DBD)
200-250 aminosav, mérsékelten konzervált 70 aminosav, konzervált
AF-1: aktivációs funkció 1 (ligand-független) AF-2: aktivációs funkció 2 (ligand-függő)
F AF-2
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
A szteroid receptorok hatásmechanizmusai Hormon
Plazma membrán Citoplazma
HSP
GR
GR
HSP
GR
GR
Sejtmag
RXR
R
Ko-represszor
Ko-aktivátor
Ko-aktivátor HRE
RNS polimeráz
RNS polimeráz Ko-represszor
GR
GR
HRE
Ko-aktivátor RNS polimeráz
Transzkripció
RXR
HRE
R
Ko-aktivátor RNS polimeráz
Transzkripció
RXR
Ko-aktivátor RXR RNS polimeráz
HRE
Transzkripció
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
A GC hatás időbeli lefolyása Szabályozás szintjei
Órák-napok
Ezredmásodperc (?)
Másodpercek -percek (?)
CBG kötés a vérben MDR a membránban
Metabolizmus és a nukleáris receptor sorsa
Molekulák találkozása
? Kötődés
? TF-ok
Ko-regulátorok
Dimerizáció
Sejtmag
Transzkripció
GRE Szteroid
MR/GR
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
NR-ok típusai • I-típusú nukleáris receptorokhoz tartoznak a 3-as alcsoport receptorai, mint az androgén receptor, ösztrogén receptorok, glükokortikoid receptor és progeszteron receptor • II-típusú nukleáris receptorokhoz főleg az 1-es alcsoport tartozik, mint a retinsav receptor, retinoid X receptor és tiroid hormon receptor
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
I-típusú receptor hatás Hormon Plazma membrán Citoplazma HSP
NR
HSP
Fehérje NR
NR
Megváltozott sejtműködés
NR mRNS
Sejtmag Ko-aktivátor RNS polimeráz
mRNS NR
NR
Ko-aktivátor RNS polimeráz
HRE Célgén
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
I-típusú NR jellemzői • Ligand hiányában a citoszolban találhatóak • Hormon kötődése a receptor disszociációját okozza a hősokkfehérjéről (Hsp), majd annak dimerizációja után a receptor nukleáris transzlokációját • A sejtmagban specifikus DNS szakaszokhoz (Hormone Response Element, HRE) kapcsolódik • A NR-DNS komplex egyéb fehérjék toborzását indítja el, amelyek felelősek a transzkripció és új fehérjék transzlációjának elindításáért, amely végül a sejt funkciójának megváltozását eredményezi
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
A citoplazmatikus receptor komplex • Hsp90, 70, 40 + ko-chaperone p23 + immunophilin (pl. FKBP52): dynein-hez (motorfehérje) kapcsolja a komplexet • Dinamikus összekapcsolódás-szétkapcsolódás • Ligand-kötött receptorok a mikrotubulusok mentén transzportálódnak a nukleáris pórusokhoz
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
II-típusú receptor hatás Hormon Plazma membrán Citoplazma Megváltozott sejtműködés
Fehérje
mRNS Sejtmag Ko-aktivátor Ko-represszor RNS polimeráz
RXR
HRE
TR
Ko-represszor
mRNS
RXR
TR
Ko-aktivátor RSA polimeráz
HRE Célgén
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
II-típusú NR-ok • A ligand jelenlététől függetlenül a sejtmagban helyezkednek el, általában hetero-dimer formában (általában RXRel) kapcsolódnak a DNS-hez • Ligand hiányában a II-típusú nukleáris receptorok gyakran ko-represszor fehérjékkel kapcsolódnak
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Nukleáris receptor heterodimer formája
PPRgamma (zöld) és RXR alpha (kék) kettősszálú DNS-sel komplexben (lila), NCOA2 ko-aktivátor peptiddel (piros).
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
DNS kötés DNS kötőhelyek (= Response Elements): • 2x6 bázispár • Szteroid rec. (homodimer): palindrom, invert ismétlődő szakaszok 3bp spacer-rel elválasztva (IR3) – GR, MR, PR, AR: 5’-AGAACA-3’ – ER: 5’-AGGTCA-3’ • Nem-szteroid rec.: 5’-AGGTCA-3’direkt ismétlődő szakaszok (DRn, n=spacerek száma) – homodimerek (pl. TR, VDR) – heterodimerek (pl. TR, VDR, RAR, LXR, FXR, PXR, CAR, PPAR)
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
A NR-ok genomikus hatása
Ligand LBD RE
DBD
A DNS-kötő domén (DBD) szerkezete
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
A humán progeszteron receptor DNS-kötő doménjének dimerje (kék és zöld) és kettősszálú DNS (lila) komplexe. A cinkatomokat szürke pontok jelölik.
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Gén szabályozás Transzaktiváció: • Ligand-kötött receptor ko-aktivátorokat toboroz → transzkripció aktiválása: interakció általános transzkripciós faktorokkal + kromatin felnyitása (ATP-dependens kromatin remodeling/hiszton acetiláció) • Ligand-kötés → ko-represszor disszociáció → ko-aktivátor kötése Transrepresszió: • Ligand hiányában a transzkripció folyamatos, ligand-kötés gátolja a transzkripciót
Transzrepresszió – ligand szelektivitás
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
• Bizonyos nukleáris receptorok nemcsak közvetlenül kapcsolódnak DNS szakaszokhoz, hanem képesek transzkripciós faktorokhoz is kötődni. Ez a kötődés általában a másik transzkripciós faktor inaktiválását eredményezi. • Bizonyos GR ligandok, un. szelektív glükokortikoid receptor agonisták (SEGRA-k) képesek a GR-t úgy aktiválni, hogy az erősebb transzrepressziós, mint transzaktivációs hatású • Ez a ligand-szelektivitás lehetővé teszi olyan ligandok kifejlesztését, amelyek erősebb gyulladásgátló hatásúak, kevesebb nemkívánatos metabolikus mellékhatást okozva
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
A NR-ok szabályozása A transzkripciós aktivitás növelése: • Foszforiláció: – Ser maradványok az N-terminális A/B doménen – Ciklin-dependens kinázok – PKC, PKA – ERK – PKB/Akt – JNK/SAPK – p38-MAPK • AF-1: CDK, ERK, JNK, p38-MAPK, PKB • AF-2: Src az ER-nál
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
A NR-ok szabályozása A transzkripciós aktivitás gátlása: • A DNS-kötő domén (DBD) foszforilációja PKC vagy PKA által
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Terápiás lehetőségek – hormon analógok
• Glükokortikoidok: anti-inflammatorikus, immunoszupresszív kezelések (pl. autoimmun betegségek, transzplantáció, egyes leukémiák) • Szexuál szteroidok: szubsztitúciós terápia (endokrin betegségek), fogamzásgátlás, emlőrák • Tiroxin: tiroidectomia után szubsztitúciós therápia • A/D-vitamin deficiencia
