Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen

Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011


Dr. Pongrácz Judit Háromdimenziós szövettenyésztés és „tissue engineering” – 15. Előadás

SEJT-AGGREGÁCIÓS KULTÚRÁK

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Aggregációs sejtkultúrák • Az aggregáció segítségével gyorsan alakíthatunk ki kisméretű szövetdarabkákat • Az aggregáció szoros kapcsolatot alakít ki a sejtek között, amely segít növelni a sejtek túlélését és megfelelő élettani funkcióinak végrehajtását

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Alapvető feltételek az aggregációs kultúrák kialakításához • Sejtadhéziós molekulák (CAM, cellular adhesion molecule) jelenléte a sejtfelszínen • Mátrix vagy mesterséges összetapadást segítő molekulák jelenléte, amely serkenti azon sejtek aggregációját, amelyek egyébként nem tapadnának össze

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Sejtadhézió

Oldott állapotú ECM

Sejt-sejt interakciók

Kadherinek

Sejt-mátrix interakciók

Integrinek Statikus ECM

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

A sejt-aggregáció kialakításának módszerei Aggregáció alacsony tapadóképességű anyagokhoz

Aggregáció scaffoldokon vagy kémiailag módosított felszínű anyagokon

Aggregáció forgó vagy szuszpenziós kultúrákban

Aggregáció bioreaktorokban

Aggregáció gravitációs kultúrákban

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Gravitációs sejtkultúrák A sejtek „gömböcskék”-ké, ún. szferoid-okká állnak össze természetes módon, természetes nagyságú vagy megnövelt gravitációs mezőben Gravitációs kultúrák típusai: • Szuszpenziós kultúrában kialakuló aggregátumok bioreaktorokban • Függőcsepp-kutúrák • Centrifugált aggregátumok

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Szuszpenzióban kialakuló aggregátum kultúrák • Magas sűrűségű sejtszuszpenziók szükségesek a kialakuláshoz • A tenyésztés dinamikusan mozgásban levő kultúrákban lehetséges, a sejt-sejt kapcsolatok kialakulásához szükséges találkozások számának növelése érdekében • A dinamikusan mozgásban levő sejtkultúrák kialakítására a sejtszuszpenziókat lehet mozgásban levő lemezeken, petricsészékben vagy bioreaktorokban tenyészteni

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Aggregáció forgó bioreaktorokban Forgó bioreaktor

Forgó bioreaktor

Sejtszuszpenziókhoz

Adherens sejtekhez Gravitációs erő

Töltőnyílás

Gravitációs Mintavevő erő nyílások

Mintavevő nyílások Forgásirány Töltőnyílás

Forgásirány

NG

LSMMG

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Bioreaktorok és sejt-aggregáció Rotációs bioreaktor: speciális bioreaktor, amelyben a sejtekre ható erők egyensúlya tartja szuszpenzióban a az aggregátumokoat. A nyíróerők minimálisak. Típusok: • High aspect rotation vessel (HARV) • Slow turning lateral vessel (STLV) Kevertetett bioreaktorok: különböző térfogatú edények léteznek, ipari célokra akár több, mint 100 l térfogat

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Különböző sejttípusok aggregátumainak tenyésztése bioreaktorban Bioreaktor típus Forgó bioreaktor

Sejttípus HepG2 sejtek, humán őssejtek, humán bőr fibroblasztok, humán embrionális vesesejtek

Porcsejtek, primer egér és patkány Kevertetett bioreaktor májsejtek, L6 mioblasztok, CHO sejtek

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Sejt-aggregátumok felhasználása

Sejt-aggregátumok

Felhasználás

CHO

Rekombináns fehérjék szintézise

Humán embrionális őssejtek

Embrionális test (EB) kialakulása és differenciáció

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Microgravitációs sejtkultúra – Függőcsepp I. A mintát kaccsal a fedőlemezre helyezzük Vazelin

Vájt tárgylemez

180° Olajcsepp

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Microgravitációs sejtkultúra – Függőcsepp II. Idő (napok) 0 180°

180° 2

5

Az embrionális testek növekedése és a spontán csíralemez-differenciálódás megkezdődik

180°

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Egyforma embrionális testek tenyésztéséhez és az intercelluláris kapcsolatok szabályozásához szükséges mikrolemezek

40 mm

150 mm

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Aggregáció alacsony adherenciájú felszínhez • Az alacsony adherenciájú felszín segíti a szuszpenziós sejtkultúrák kialakulását • A sejt-sejt kapcsolatok növekednek • Néhány ECM-származékkal (pl. Martigel) borított felszín növeli a sejtek motilitását és sejtek közötti aggregációt.

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Természetes aggregáció Májsejt HGF-R EGF-R Integrin Egyéb

Epevezeték

Fas E-Kadherin ASGP-R

PVLA potenciálisan jól használható mesterséges máj kialakítására a különböző koncentrációjú borítások révén

PVLA (Poli-N-p-vinil venzil D-laktóz lakton amid)

A magas proliferációs képességgel rendelkező májsejtek szelekciója

Sejtalak szabályozása

Szferoid kialakulása +EGF

Májsejtek ASGP-Ralacsony gyors proliferáció Májsejtek ASGP-Rmagas lassú proliferáció

15-20 ng/ml PVLA-val borított edény

Kitapadás

Lekerekedés

1 mg/ml PVLA bevonat

100 mg/ml PVLA bevonat

PVLA bevonat koncentrációja

Szferoid

100 mg/ml PVLA-val borított edény

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Sejtaggregáció serkentése mesterséges módszerekkel Polimerből álló híd képzése a sejtek között. Típusok: • Természetes adhéziós molekula • ECM-eredetű molekula része • Polimer mátrix

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Mesterséges sejt-aggregáció

Bifunkcionális polimer

Sejtek

Aggregálódott sejtek

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Sejtek keresztkötése biotinnal

Biotin hidrazid Perjodát-funkcionalizált sejtek

Avidin

Sejtaggregátum

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Felszínek kémiai módosítása • Chitosan, természetes, biodegradábilis polimer (molekulatömeg: 810 kDa) • Kémiailag módosított PEG (polietilén glikol) • Laktonnal módosított eudragit • PLGA nanogyöngyök • Lektinek és származékaik

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Chitosan

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Kémiailag módosított PEG MA(PEG)n Methyl-PEGn-Amine Methyl-(#ethyleneglycol) amine O

H2N

O

O

MA(PEG)8 M.W. 383.48 Spacer arm 29.7 Å

H2N

[

O

]

8

O


CH3 H2N

[

O

]

12

CH3


CH3 H2N

[

O

]

24

CH3

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Lakton-módosított eudragit Ellenionok COO

-+

-

Ko-ionok -

COOH + HOOC

-

COO

COOH

pH > 6

+

+

-OOC

COOH HOOC

+ COO COOH

-

-OOC

+

+

-

COO +

-

-

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

PLGA nanogyöngyök Diszperziós fázis

Pumpa

Magasnyomású víz kifolyás

Oldott polimer (PLGA) Előkeverés Pumpa

Mágneses keverő Magasnyomású víz befolyás

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Lektinek és származékaik I. • A sejtfelszíni molekulák szénhidrátcsoportjait képesek megkötni a lektinek • A lektinek, vagy fitohemagglutininek (PHA), olyan fehérjék, melyeknek nincsen sem enzimatikus sem immunológiai aktivitásuk, és reverzibilisen képesek szénhidrátokhoz kötődni azok megváltoztatása nélkül • Mivel a lektinek specifikus, reverzibilis sejt-sejt adhéziós reakcióban vesznek részt, jól alkalmazhatóak sejtfelszíni molekulák keresztkötésén keresztül a sejtadhézió serkentésére

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Lektinek és származékaik II. • Hat lektin család ismeretes: – Legume lektinek (a pillangósvirágúak családjában) – Gabona-eredetű lektinek, – P-, C-, és S-típusú lektinek (állati fehérjék) – A pentraxinok (állati fehérjék) • A lektinek sokfajta sejttípushoz kötődnek, amelyek különböző sejtfelszíni glikoproteinek vagy glikolipidek alkotórészei. A sejtek lehetnek vörösvértestek, leukémiás blasztok, élesztőgombák vagy baktériumok. • A lektinek szénhidrátspecificitása is különböző lehet, mannóz, galaktóz, N-acetil-glükózamin, N-acetil-galaktózamin, L-fruktóz, és N-acetilneraminsav. • Mivel egy lektinmolekulán több szénhidrát-kötőhely található, képes agglutinálni a sejteket. • A lektinek kötődése az egyes szénhidrátokra specifikus.

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

A lektinek által felismert N-glikánok típusai Type

PHA

Phaseolus vulgaris Erythroagglutinin Bisected di-, tridiantennary (E-PHA) complex-type N-glycan Inhibitor: GalNAc Tri- and tetraantennary complex-type N-glycan

Phaseolus vulgaris Leukoagglutinin (L-PHA) Inhibitor: GalNAc

Tri- and tetraantennary complex-type N-glycan

Datura stramonium Agglutinin (DSA) Inhibitor: Chitotriose (GlcNAc3)

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Sejt-aggregáció scaffoldokon • Homogén és heterogén sejtpopulációk aggregációja • Sejtfelszíni fehérjék biotinálása és avidin alkalmazása keresztkötő ágensként

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Nanoszerkezetű scaffold-ok • Spontán összeszerelődő scaffold-ok • Nanokompozit anyagok • Nanoszálak

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Nanoszerkezetű anyagok felhasználása

Anyag

Jellemzők

Felhasználás

Fullerének

Szénatomok hexagonális és pentagonális térszerkezetbe rendeződve

Gyógyszerek enkapszulációja, képalkotó vizsgálatok

Fluoreszcens „Quantum dot”-ok

Félvezetőkből készült nanokristályok

Bioszenzorok, képalkotás

Liposzómák

Foszfolipid membránnal burkolt vezikulák

Gyógyszerek leadása, génterápiás alkalmazás

Dedrimerek

Polimer szerkezetek

Gyógyszerek leadása, génterápiás alkalmazás

Arany nanorészecskék

Kolloid arany

Bioszenzorok, sejtszintű képalkotás

Szuper-paramágneses vas-oxid

Vas-oxid

MRI kontrasztanyag


Dr. Pongrácz Judit Háromdimenziós szövettenyésztés és „tissue engineering” – 16. Előadás

SZÖVETEK NYOMTATÁSA

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

A szövetnyomtatás alapjai • • • •

Scaffoldmentes konstrukció Tisztított sejtek aggregált halmazait alkalmazzák A sejthalmazokból áll a „biotinta” A 3D szövetkonstrukciók felépítése a sejthalmazok spontán fúziós képességén alapul

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Sejthalmazok fúziója 3D szövetkonstrukciókká I.

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Sejthalmazok fúziója 3D szövetkonstrukciókká II.

Közel helyezett sejtaggregátumok és embrionális szív mezenchima fragmentek gyűrű vagy csőszerű struktúrákká egyesülnek

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Szervek nyomtatása 3D nyomtatás: a sejthalmazokat gyors, automatizált módszerrel rétegenként, biokompatibilis anyaggal körülvéve helyezzük egymásra, így alakul ki a 3D szerkezet. Szövetnyomtatás típusok: • Lézernyomtatás (osteoszarkóma, embrionális carcinoma) • Tintasugaras nyomtatás (hippocampális és kortikális neuronok)

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Az első szövetnyomtató

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Érett, szervspecifikus primer sejtek I.

Sejtkultúra Biopszia

Tisztítás

TE-ben használható sejtek

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Érett, szervspecifikus primer sejtek II.

Tisztítás

Biopszia

Szövetspecifikus rezidens őssejtek

Differenciálódott szöveti sejtek

Sejtkultúrák

TE-ben használható sejtek

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Érett, differenciálódott sejtek alkalmazása TE céljára • • • •

Forrás: biopszia vagy reszekció Tisztítás Expanzió in vitro tenyésztés során Újradifferenciáltatás

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Vérerek képzése szöveti nyomtatással

Fontos a megfelelő nyomóerő alkalmazása

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

TE-vel előállított erek potenciális alkalmazása • • • •

Koszorúér betegség, bypass készítése Trombózis kezelése Baleseti érsérülés Komplex szöveti szerkezetek kialakítása TE-vel

Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen

Recommend Documents