BAB 4 HASIL PERCOBAAN DAN PEMBAHASAN Pembuatan homogenat hati tikus dan proses sentrifugasi dilakukan pada suhu 4 oC untuk menghindari kerusakan atau denaturasi enzim karena pengaruh panas. Kebanyakan enzim meningkat aktivitasnya jika temperatur meningkat dari 10 - 40 oC. Oleh karena itu untuk mengurangi kehilangan aktivitas enzim disimpan pada suhu 2 – 6 oC. Apabila temperatur dinaikkan terus, energi kinetika molekul molekul enzim menjadi demikian besar sehingga akan memecah ikatan ikatan sekunder yang mempertahankan enzim dalam keadaan aslinya atau dalam keadaan katalitik aktif. Sentrifugasi pada pembuatan homogenat hati tikus bertujuan untuk memisahkan enzim dari partikel partikel lain yang lebih besar dengan kerapatan yang besar misalnya protein dengan berat molekul besar dan sel sel yang rusak pada saat pengukuran. Penentuan kadar protein dilakukan menggunakan larutan standar protein 4 g/dl yang ditambahkan reagen warna (dapar sitrat pH 4,2 30 mmol/l dan brocomol green 260 umol/l). Reagen warna ini ditambahkan untuk tujuan pembentukan kompleks warna pada larutan protein sehingga dapat diukur pada panjang gelombang 700nm.
Absorbansi
Tabel 4.1 Hasil pengukuran absorbansi larutan standar protein mg protein/ml
Absorbansi (700 nm)
4 5 6 7 8
0.2032 0.2537 0.3154 0.3565 0.4006
0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0
y = 0.0498x + 0.0073 2
R = 0.9948
0
2
4
6
8
10
mg protein/ml
Gambar 4.1 Kurva kalibrasi larutan protein standar
11
12 Dari kurva standar protein didapatkan persamaan garis yang selanjutnya digunakan untuk menentukan kadar protein dalam homogenat hati tikus. Inkubasi dilakukan pada suhu 37 oC dan menggunakan dapar fosfat pH 7 untuk mendapatkan kondisi optimum dari suspensi enzim mikrosomal hati tikus. Untuk kebanyakan enzim, temperatur optimal adalah temperatur sel dimana enzim enzim berada. Tabel 4.2 Pengukuran absorbansi kinin dengan optimasi kadar protein homogenat Absorbansi awal λ280 nm
Konsentrasi awal (mg/ml)
17,15 51,45 85,75 120,05 154,36
0,5495 0,5495 0,5495 0,5495 0,5495
0,9 0,9 0,9 0,9 0,9
konsentrasi kinin
Homogenat (mg protein/ml)
Absorbansi setelah inkubasi 60 menit/ 37 oC λ280 nm 0,4845 0,3971 0,2895 0,2885 0,2783
1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0
Konsentrasi setelah inkubasi 60 menit/ 37 oC (mg/ml) 0,79 0,65 0,47 0,46 0,45
280nm 0
20
40
60
80 100 120 140 160
konsentrasi homogenat (mg protein/ml)
Gambar 4.2 Kurva degradasi kinin dengan kenaikan konsentrasi protein homogenat Tabel 4.3 Pengukuran absorbansi sinkonin dengan optimasi kadar protein homogenat Homogenat (mg protein/ml)
Absorbansi awal λ300 nm
Konsentrasi awal (mg/ml)
17,15 51,45 85,75 120,05 154,36
0,5909 0,5909 0,5909 0,5909 0,5909
2,1 2,1 2,1 2,1 2,1
Absorbansi setelah inkubasi 30 menit/37 oC λ300 nm 0,5064 0,4977 0,4526 0,4422 0,4375
Konsentrasi setelah inkubasi 30 menit/ 37 oC (mg/ml) 1,79 1,76 1,61 1,57 1,55
konsentrasi sinkonin
13
3.0 2.0 300nm
1.0 0.0 0
20 40
60 80 100 120 140 160
konsentrasi homogenat (mg protein/ml)
Gambar 4.3 Kurva degradasi sinkonin dengan kenaikan konsentrasi protein homogenat Tabel 4.4 Pengukuran absorbansi sinkonidin dengan optimasi kadar protein homogenat Absorbansi awal λ315 nm
Konsentrasi awal (mg/ml)
17,15 51,45 85,75 120,05 154,36
0,4905 0,4905 0,4905 0,4905 0,4905
2,5 2,5 2,5 2,5 2,5
konsentrasi sinkonidin
Homogenat (mg protein/ml)
Absorbansi setelah inkubasi 30 menit/37 oC λ315 nm 0,3331 0,3266 0,2508 0,2301 0,2215
Konsentrasi setelah inkubasi 30 menit/ 37 oC (mg/ml) 2,05 1,99 1,81 1,59 1,49
3.0 2.0 315nm
1.0 0.0 0
20 40
60
80 100 120 140 160
konsentrasi homogenat (mg protein/ml)
Gambar 4.4 Kurva degradasi sinkonidin dengan kenaikan konsentrasi protein homogenat Dari gambar 4.2, 4.3 dan 4.4 ditunjukkan adanya degradasi dari ketiga senyawa kinin, sinkonin dan sinkonidin oleh suspensi enzim homogenate hati. Kemampuan degradasi suspensi dipengaruhi oleh kadar protein dalam enzim tesebut. Dari ketiga grafik di atas semakin tinggi kadar protein dalam suspensi enzim, kadar ketiga sampel juga menjadi semakin menurun.
14 Tabel 4.5 Pengukuran absorbansi kinin dengan optimasi waktu inkubasi Absorbansi awal λ280 nm
Konsentrasi awal (mg/ml)
30 60 90 120
0,5463 0,5463 0,5463 0,5463
0,9 0,9 0,9 0,9
konsentrasi kinin(mg/ml)
Waktu inkubasi (menit)
Absorbansi setelah inkubasi 37 oC λ280 nm 0,4835 0,3001 0,3806 0,4725
1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0
Konsentrasi setelah inkubasi 37 oC (mg/ml) 0,79 0,49 0,63 0,78
280nm
0
30
60
90
120
waktu inkubasi (menit)
Gambar 4.5 Kurva degradasi kinin dengan kenaikan waktu inkubasi Tabel 4.6 Pengukuran absorbansi sinkonin dengan optimasi waktu inkubasi Absorbans awal λ300 nm
Konsentrasi awal (mg/ml)
30 60 90 120
0,6047 0,6047 0,6047 0,6047
2,1 2,1 2,1 2,1
konsentrasi sinkonin(mg/ml)
Waktu inkubasi (menit)
Absorbansi setelah inkubasi 37 oC λ300 nm 0,5311 0,5545 0,5554 0,5722
Konsentrasi setelah inkubasi 37 oC (mg/ml) 1,84 1,93 1,92 1,98
2.2 2.1 300nm
2.0 1.9 1.8 0
30
60
90
120
waktu inkubasi (menit)
Gambar 4.6 Kurva degradasi sinkonin dengan kenaikan waktu inkubasi
15
Tabel 4.7 Pengukuran absorbansi sinkonidin dengan optimasi waktu inkubasi Absorbansi awal λ315 nm
Konsentrasi awal (mg/ml)
30 60 90 120
0,6998 0,6998 0,6998 0,6998
2,5 2,5 2,5 2,5
konsentrasi sinkonidin(mg/ml)
Waktu inkubasi (menit)
Absorbansi setelah inkubasi 37 oC λ315 nm 0,5694 0,6041 0,6456 0,6874
Konsentrasi setelah inkubasi 37 oC (mg/ml) 2,03 2,15 2,30 2,45
3.0 2.0
315nm
1.0 0.0 0
30
60
90
120
waktu inkubasi (menit)
Gambar 4.7. Kurva degradasi sinkonidin dengan kenaikan waktu inkubasi Pada percobaan selanjutnya (gambar 4.5, 4.6, dan 4.7) dilakukan variasi waktu inkubasi antara 30-120 menit. Pada kinin respon positif didapat hingga 1 jam inkubasi, sedangkan sinkonin dan sinkonidin didapat waktu inkubasi optimum selama 30 menit. Ini menunjukkan kinin dapat lebih lama terdegradasi oleh homogenat hati dibandingkan sinkonin, sinkonidin. Tabel 4.8 Pengukuran absorbansi dengan optimasi konsentrasi kinin konsentrasi kinin (mg/ml)
Absorbansi awal λ280 nm
0,9
0,5268 0,5711 0,6467 0,6786 0,6988
1,3 1,7 2,1 2,5
Absorbansi setelah inkubasi 60 menit/37 oC λ280 nm 0,4378 0,5236 0,6316 0,6468 0,6592
Konsentrasi setelah inkubasi 60 menit/ 37 oC (mg/ml) 0,75 1,19 1,66 2,01 2,36
16
Absorbansi
0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.0
1.0
280nm 280nm inkubasi
2.0
3.0
konsentrasi kinin (mg/ml)
Gambar 4.8 Kurva degradasi dengan peningkatan konsentrasi kinin Tabel 4.9 Pengukuran absorbansi dengan optimasi konsentrasi sinkonin Konsentrasi sinkonin Absorbansi (mg/ml) awal λ300 nm 0,5488 0,7371 0,7532 0,7990 0,8008
Absorbansi
0,9 1,3 1,7 2,1 2,5
Absorbansi Konsentrasi setelah inkubasi setelah inkubasi 30 menit/37 oC 30 menit/ 37 oC (mg/ml) λ300 nm 0,4744 0,77 0,6858 1,21 0,7091 1,60 0,7280 1,91 0,7653 2,38
1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.0
1.0
300nm
2.0
3.0
konsentrasi sinkonin (mg/ml)
300nm inkubasi
Gambar 4.9 Kurva degradasi dengan peningkatan konsentrasi sinkonin Tabel 4.10 Pengukuran absorbansi dengan optimasi konsentrasi sinkonidin Konsentrasi sinkonidin (mg/ml)
Absorbansi awal λ315 nm
0,9 1,3 1,7 2,1 2,5
0,4083 0,4494 0,5806 0,7033 0,6620
Absorbansi setelah inkubasi 30 menit/37 oC λ315 nm 0,2974 0,3531 0,3414 0,3491 0,3227
Konsentrasi setelah inkubasi 30 menit/ 37 oC (mg/ml) 0,78 1,17 1,64 1,59 1,58
17
Absorbansi
0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.0
315nm
1.0
2.0
3.0
konsentrasi sinkonidin (mg/ml)
315nm inkubasi
Gambar 4.10 Kurva degradasi sinkonidin dengan peningkatan konsentrasi sinkonidin Optimasi konsentrasi ketiga senyawa dilakukan dari konsentrasi 0,9 – 2,5 mg/ml. Dari gambar 4.8, 4.9, dan 4.10 didapat kinin dapat bereaksi secara optimum dengan suspensi enzim homogenat hati dengan konsentrasi 0,9 mg/ml, sinkonin 2,1 mg/ml dan sinkonidin 2,5 mg/ml. Dari data ketiga gambar diatas terlihat bahwa kinin dapat terdegradasi dengan konsentrasi yang lebih rendah dibandingkan sinkonin dan sinkonidin.
