BAB 3
HASIL PERCOBAAN DAN PEMBAHASAN
Tumbuhan uji yang digunakan adalah pegagan dan beluntas. Tumbuhan uji diperoleh dalam bentuk bahan yang sudah dikeringkan. Simplisia pegagan dan beluntas yang diperoleh digiling untuk mendapatkan serbuk simplisia. Hal ini dilakukan untuk memperluas tempat kontak simplisia dengan pelarut pada saat ekstraksi. Karakterisasi simplisia dilakukan untuk menjamin mutu simplisia. Kadar air simplisia pegagan adalah 7,21% sedangkan kadar air simplisia beluntas adalah 8,90%. Kadar air simplisia pegagan dan beluntas kurang dari 10%, hal ini menunjukkan bahwa kedua simplisia yang digunakan masih memenuhi persyaratan dalam Materia Medika Indonesia. Kadar sari larut air dan kadar sari larut etanol untuk simplisia pegagan adalah 8,28% dan 6,75% sedangkan kadar sari larut air dan kadar sari larut etanol untuk simplisia beluntas adalah 12,56% dan 6,72%. Kadar sari larut ini menunjukkan jumlah bahan aktif yang terekstraksi pada masing-masing pelarut. Semakin tinggi kadar sari larut artinya semakin banyak bahan aktif yang tertarik pada proses ekstraksi. Hal ini dapat digunakan sebagai salah satu pertimbangan dalam penentuan pelarut yang digunakan pada proses ekstraksi. Ekstraksi dilakukan terhadap serbuk simplisia menggunakan cara panas yaitu dengan metode refluks menggunakan air sebagai pelarut. Cara panas digunakan agar sesuai dengan penggunaan di masyarakat yaitu dengan cara digodog/direbus. Rendemen ekstrak pegagan yang diperoleh adalah 10,97% dan ekstrak beluntas sebanyak 15,84%. Rendemen ekstrak yang diperoleh digunakan untuk perhitungan dosis yang disesuaikan dengan penggunaan tumbuhan uji di masyarakat. Karakterisasi ekstrak dilakukan untuk melihat mutu ekstrak yang diperoleh. Karakterisasi ekstrak yang dilakukan adalah penetapan kadar air ekstrak dan penapisan fitokimia. Kadar air ekstrak ditentukan karena akan mempengaruhi jumlah bahan aktif yang masuk ke dalam tubuh. Semakin tinggi kadar air ekstrak maka jumlah bahan aktif yang masuk ke dalam tubuh akan semakin sedikit, dan begitu pula sebaliknya. Hasil karakterisasi ekstrak dan simplisia pegagan dan beluntas dapat dilihat pada Tabel 4.1.
18
19 Tabel 4.1 Karakterisasi Fitokimia Simplisia dan Ekstrak
Pegagan Simplisia Ekstrak
Jenis karakteristika Organoleptika : • Bentuk • Warna • Bau • Rasa
Beluntas Simplisia Ekstrak
serbuk hijau muda tajam pahit
serbuk coklat tua tajam pahit
serbuk hijau tua tajam pahit
serbuk coklat muda tajam pahit
Kadar air (% v/v)
7,21
7,9
8,90
3,89
Kadar sari larut air (% b/b)
8,28
X
12,56
X
Kadar sari larut etanol (% b/b)
6,75
X
6,72
X
Golongan senyawa yang diperiksa : + + + • Alkaloid + + + • Flavonoid + + • Saponin • Kuinon • Tanin • Steroid + + • Triterpenoid Keterangan : + = mengandung golongan senyawa yang diperiksa - = tidak mengandung golongan senyawa yang diperiksa X = tidak dilakukan
+ + -
Pada uji terhadap respon imun non spesifik, dilakukan uji bersihan karbon untuk menilai aktivitas sel-sel retikuloendotelial dalam tubuh. Kadar karbon dalam dalah menurun seiring dengan bertambahnya waktu karena adanya eliminasi tersebut. Kadar karbon dalam darah pada waktu tertentu setelah penyuntikan karbon dapat dilihat pada Tabel 4.2. Tabel 4.2 Kadar Karbon dalam Darah Pada Uji Bersihan Karbon Dosis (mg/kg bb) 0
T0
T4
T8
T12
T16
T20
40,22±2,83
61,65±6,63
56,90±3,78
49,78±11,60
47,76±7,61
47,18±6,83
Ekstrak Pegagan
37,5 75 150
33,48±1,89 35,98±1,85 38,20±3,62
65,66±14,50 63,91±8,65 65,92±5,84
60,36±7,19 58,32±7,90 52,71±8,90
49,52±6,91 51,38±5,18 46,52±6,53
46,95±8,93 47,05±6,44 41,82±6,44
45,90±5,50 44,48±6,37 37,33±6,37
Ekstrak Beluntas
37,5 75 150
36,62±2,93 36,86±1,05 38,03±1,49
46,53±2,25 59,22±13,97 55,68±12,74
42,77±7,05 61,86±8,23 47,02±8,19
41,64±4,27 54,11±9,39 42,00±6,82
43,80±3,19 52,25±8,91 38,60±7,71
39,32±6,42 46,80±3,82 38,10±2,77
10
33,47±1,49
55,87±8,12
55,70±11,10
52,80±8,48
48,47±8,99
42,58±9,38
Kelompok Uji Kontrol
Zymosan A
100 - %T
20 Dari Tabel 4.2 dapat dilihat bahwa penurunan kadar karbon dalam darah paling besar diberikan oleh ekstrak pegagan dosis 150 mg/kg bb. Kecepatan eliminasi karbon diperoleh dari dari kemiringan garis regresi linear dari grafik 100-%T terhadap waktu. Kecepatan eliminasi karbon dapat diolah lebih lanjut untuk memperoleh parameter lain yaitu indeks fagositik (k). Indeks fagositik diperoleh dengan cara membandingkan kecepatan eliminasi kelompok ekstrak dan pembanding dengan kecepatan eliminasi kelompok kontrol. Aktifitas imunostimulan dapat diklasifikasikan berdasarkan indeks fagositiknya. Seperti terlihat pada Tabel 4.3, kelompok yang memiliki indeks fagositik paling besar adalah kelompok ekstrak pegagan dosis 150 mg/kg bb. Menurut Wagner (1989), nilai k kurang dari 1 tidak menunjukkan adanya efek imunostimulasi, nilai k antara 1-1,5 menunjukkan efek imunostimulasi sedang, dan k lebih dari 1,5 menunjukkan efek imunostimulasi kuat. Berdasarkan klasifikasi efek imunostimulasi di atas, maka ekstrak pegagan dosis 37,5 dan 75 mg/kg bb
dan ekstrak beluntas dosis 50 mg/kg bb dapat dinyatakan berkhasiat
imunostimulasi sedang, sedangkan ekstrak pegagan dosis 150 mg/kg bb berkhasiat imunostimulasi paling kuat dengan indeks fagositik 1,78. Tabel 4.3 Indeks Fagositik pada Uji Bersihan Karbon
Kelompok uji Kontrol
Dosis (mg/kg bb) 0
Kecepatan eliminasi (K) -0,95
Indeks fagositik (k) 1
Klasifikasi efek imunostimulasi -
Ekstrak Pegagan
37,5 75 150
-1,29 -1,25 -1,70
1,35 1,26 1,78
Imunostimulasi sedang Imunostimulasi sedang Imunostimulasi kuat
Ekstrak Beluntas
37,5 75 150
-0,41 -0,92 -1,22
0,43 0,97 1,28
Tidak Berefek Tidak Berefek Imunostimulasi sedang
10
-1,09
1,14
Imunostimulasi sedang
Zymosan A
Indeks organ juga dapat digunakan sebagai salah satu parameter untuk menilai pengaruh ekstrak terhadap respon imun non-spesifik mencit. Timus merupakan organ limfoid primer yang berperan dalam proliferasi sel-sel imun. Hati, walaupun bukan termasuk organ limfoid, sangat berperan dalam sistem imun karena banyak mengandung makrofag terfiksasi
yaitu
sel
Kupffer.
Peningkatan
bobot
ketiga
organ
tersebut
dapat
menggambarkan adanya peningkatan proliferasi sel-sel imun atau jumlah sel imun yang
21 ada di organ tersebut. Pada Tabel 4.4 dapat dilihat bahwa indeks hati kelompok mencit yang diberi ekstrak pegagan dosis 150 mg/kg bb dan ekstrak beluntas dengan dosis 75 dan 150 mg/kg bb lebih tinggi dan bermakna (p<0,05) dibanding terhadap kelompok kontrol. Hasil serupa terlihat pada indeks hati kelompok Zymosan A (pembanding). Hal ini menunjukkan bahwa Zymosan A dan kedua ekstrak dapat meningkatkan proliferasi sel Kupffer di hati. Indeks limpa ekstrak pegagan dosis 37,5 dan 75 mg/ kg bb menunjukkan hasil yang lebih rendah dan bermakna dibandingkan terhadap kelompok kontrol. Indeks limpa kelompok Zymosan A lebih tinggi dan bermakna (p<0,05) dibandingkan terhadap kelompok kontrol. Seperti pada indeks hati, Zymosan A memiliki
aktifitas untuk
meningkatkan proliferasi sel imun di limpa. Indeks timus kelompok yang diberi ekstrak pegagan 75 dan 150 mg /kg bb dan ekstrak beluntas 37,5 dan 75 mg/ kg bb juga besar dan bermakna dibandingkan terhadap kelompok kontrol. Indeks timus kelompok Zymosan A juga lebih tinggi dari kelompok kontrol tetapi tidak bermakna secara statistika. Besarnya indeks timus mencit pada kelompok yang diberi ekstrak diduga karena adanya stimulasi proliferasi sel-sel sistem imun di timus oleh ekstrak tersebut. Tabel 4.4 Indeks Organ Setelah Pemberian Ekstrak Uji
Kelompok uji Kontrol
Dosis (mg/kg bb) 0
Ekstrak Pegagan
Ekstrak Beluntas Zymosan A
Hati 4,58 ± 0,29
Indeks organ (%) Limpa 0,41 ± 0,05
Timus 0,15 ± 0,02
37,5 75 150
5,06 ± 0,96 5,22 ± 0.58 6,04 ± 0,43a
0,28 ± 0,03a 0,33 ± 0,03a 0,45 ± 0,08
0,16 ± 0,03 0,21 ± 0,03a 0,20 ± 0,01a
37,5 75 150
4,85 ± 0,46 5,75 ± 0,53a 5,76 ± 0,86a
0,41 ± 0,05 0,46 ± 0,12 0,37 ± 0,04
0,21 ± 0,01a 0,23 ± 0,03a 0,17 ± 0,03
10
5,49 ± 0,78a
0,58 ± 0.12a
0,19 ± 0,02
Keterangan : a = p<0,05 dibandingkan terhadap kontrol Selain uji bersihan karbon dan indeks organ, pada penelitian ini juga dilakukan uji untuk menilai aktivitas fagositosis PBMC dengan menggunakan sel ragi sebagai model bahan asing. Pada Tabel 4.5 dapat dilihat bahwa nilai absorbansi kelompok mencit yang diberi tetapi pada kelompok mencit yang diberi ekstrak pegagan dan beluntas nilai absorbansinya lebih tinggi dari kelompok kontrol tetapi tidak bermakna secara statistika. Hal ini
22 menunjukkan bahwa kedua ekstrak pada dosis uji tidak meningkatkan aktivitas fagositosis PBMC dalam mengeliminasi sel ragi karena peningkatan absorbansi menunjukkan peningkatan eliminasi sel ragi oleh PBMC. Nilai absorbansi kelompok mencit yang diberi Zymosan A lebih tinggi dan bermakna dibandingkan terhadap kelompok kontrol (p<0,05), sehingga Zymosan A dapat meningkatkan aktivitas fagositosis PBMC terhadap sel ragi. Tabel 4.5 Nilai Absorbansi pada Uji Aktivitas Fagositik PBMC terhadap Sel Ragi
Kelompok uji
Dosis (mg/kg bb)
Absorbansi
0
0,31 ± 0,07
Ekstrak Pegagan
37,5 75 150
0,35 ± 0,09 0,41 ± 0,07 0,42 ± 0,07
Ekstrak Beluntas
37,5 75 150
0,23 ± 0,08 0,42 ± 0,10 0,40 ± 0,07
10
0,56 ± 0,15a
Kontrol
Zymosan A
Keterangan : a = p<0,05 dibandingkan terhadap kontrol
Jika dibandingkan dengan uji bersihan karbon, uji aktivitas fagositosis dengan menggunakan sel ragi memberikan hasil yang berbeda. Perbedaan tersebut diantaranya disebabkan oleh sel-sel fagosit yang terlibat dan model bahan asing yang digunakan. Pada uji bersihan karbon, partikel karbon banyak dieliminasi di organ sistem retikuloendotelial antara
lain
hati
dan
limpa,
sehingga
lebih
menggambarkan
retikuloendotelial. Sedangkan, pada uji aktivitas menggunakan
aktivitas
sel-sel
sel ragi, sel-sel yang
terlibat adalah PBMC (Peripheral Blood Monocyte Cell). Pada uji bersihan karbon, partikel asing yang digunakan adalah partikel karbon yang tentu saja memiliki sifat dan ukuran yang berbeda dibandingkan dengan sel ragi. Selain itu, uji bersihan karbon merupakan uji in vivo sedangkan uji menggunakan sel ragi merupakan uji ex vivo sehingga lebih banyak faktor dari luar yang mempengaruhi. Pada uji bersihan karbon, partikel karbon yang disuntikkan sebagian besar dieliminasi oleh makrofag di hati dan di organ lain pada sistem retikuloendotelial. Hal ini dapat terlihat dengan adanya akumulasi partikel karbon pada organ-organ tersebut (Roit, 1989). Sedangkan pada uji menggunakan sel ragi, eliminasi dilakukan oleh sel-sel fagosit berupa PBMC di aliran darah sehingga metode ini lebih menggambarkan aktivitas fagositosis PBMC.
23 Nitrit oksida merupakan salah satu senyawa toksik yang disekresikan oleh makrofag untuk mengeliminasi patogen intraselular. Adanya peningkatan kadar nitrit oksida oleh makrofag diduga dapat meningkatkan eliminasi patogen intraselular oleh makrofag. Peningkatan absorbansi sebanding dengan konsentrasi nitrit oksida yang dihasilkan. Pada Tabel 4.6 dapat dilihat bahwa kelompok mencit yang diberi ekstrak pegagan dosis 75 mg/kg bb dan ekstrak beluntas dosis 150 mg/kg bb, terlihat adanya peningkatan nilai absorbansi nitrit oksida tetapi tidak bermakna secara statistika, begitu pula pada kelompok mencit yang diberi Zymosan A. Dari penelitian ini belum dapat dipastikan bahwa ekstrak pegagan dan beluntas dapat meningkatkan produksi nitrit oksida oleh makrofag. Hasil yang diperoleh pada penetapan kadar nitrit oksida yang dihasilkan oleh makrofag tidak sesuai dengan hasil uji bersihan karbon dan uji aktivitas fagositosis PBMC terhadap sel ragi. Hal ini mungkin terjadi karena makrofag dapat pula mengeliminasi bahan asing dengan memproduksi senyawa toksik lain selain nitrit oksida, seperti hidrogen peroksida. Tabel 4.6 Nilai Absorbansi Pengukuran Nitrit Oksida
Kelompok uji
Dosis (mg/kg bb)
Absorbansi
0
0,21 ± 0,03
Ekstrak Pegagan
37,5 75 150
0,16 ± 0,03 0,23 ± 0,03 0,19 ± 0,02
Ekstrak Beluntas
37,5 75 150
0,18 ± 0,02 0,20 ± 0,07 0,26 ± 0,11
10
0,25 ± 0,10
Kontrol
Zymosan A
Keterangan : a = p<0,05 dibandingkan terhadap kontrol Selain pengujian efek terhadap respon imun non spesifik, dilakukan pula pengujian terhadap respon imun spesifik mencit. Pengujian ini meliputi penentuan titer antibodi total sebagai respon imun humoral dan reaksi hipersensitivitas tipe lambat sebagai respon imun selular. Pada penetapan titer antibodi total, kelompok mencit yang diberi ekstrak dan Zymosan A menunjukkan adanya titer antibodi primer yang lebih besar dibandingkan terhadap kelompok kontrol. Titer antibodi terbesar diberikan oleh kelompok Zymosan A dan mencit
24 yang diberi ekstrak pegagan dosis 75 dan 150 mg/kg bb dan ekstrak beluntas dosis 150 mg/kg bb. Peningkatan titer antibodi primer dapat disebabkan karena adanya peningkatan aktivitas sel Th yang menstimulasi sel B untuk pembentukan antibodi dan peningkatan aktivitas sel B dalam pembentukkan antibodi. Pada titer antibodi sekunder, semua kelompok ekstrak dan Zymosan A menunjukkan adanya peningkatan titer antibodi jika dibandingkan dengan titer antibodi primernya, tetapi tidak lebih tinggi dari kelompok kontrol. Hal ini menunjukkan bahwa Zymosan A maupun ekstrak pegagan tidak dapat meningkatkan aktivitas sel B memori pada proses pembentukkan antibodi. Titer antibodi total mencit dapat dilihat pada Tabel 4.7. Tabel 4.7 Titer Antibodi Total Mencit pada Uji Efek Ekstrak terhadap Respon Imun Spesifik
Kelompok uji Kontrol
Dosis (mg/kg bb)
Titer antibodi
0
Primer 1 : 16
Sekunder 1 : 256
Ekstrak Pegagan
37,5 75 150
1 : 32 1 : 128 1 : 128
1 : 256 1 : 256 1 : 256
Ekstrak Beluntas
37,5 75 150
1 : 64 1 : 64 1 : 128
1 : 256 1 : 128 1 : 128
10
1 : 128
1 : 256
Zymosan A
Reaksi Hipersensitivitas tipe lambat melibatkan aktifitas sel Th. Meningkatnya aktifitas sel Th meningkatkan pula aktivitas makrofag sehingga dapat meningkatkan reaksi inflamasi yang pada pengujian ini ditandai dengan kebengkakan di telapak kaki di sekitar tempat penyuntikkan antigen (Roit, 1989). Dari Tabel 4.8, dapat dilihat bahwa kelompok yang diberi ekstrak pegagan dan beluntas dosis 37,5 mg/kg bb menunjukkan kenaikan tebal kaki yang lebih tinggi dan bermakna dengan kelompok kontrol (p<0,05) dan kelompok mencit yang diberi Zymosan A menunjukkan kenaikan tebal kaki yang lebih tinggi dibandingkan terhadap kelompok kontrol tetapi tidak bermakna secara statistika (p<0,05).
Hal ini
menunjukkan adanya peningkatan aktivitas sel Th pada kelompok mencit yang diberi ekstrak pegagan dan beluntas dosis 37,5 mg/kg bb yang menunjukkan adanya peningkatan respon imun selular. Baik ekstrak pegagan maupun ekstrak beluntas menunjukkan penurunan persen perubahan tebal kaki seiring dengan peningkatan dosis.
25 Tabel 4. 8 Perubahan Tebal Kaki Mencit
Kelompok Uji Kontrol
Dosis (mg/kg bb) 0
% Perubahan tebal kaki T24 T48 23,84 ± 7,42 23,76 ± 5,81
Ekstrak Pegagan
37,5 75 150
49,84 ± 7,95a 33,58 ± 11,87 29,37 ± 6,39
25,39 ± 9,04 12,21 ± 6,97 14,02 ± 2,89
Ekstrak Beluntas
37,5 75 150
41,92 ± 10,55a 33,74 ± 9,64 26,14 ± 7,15
22,28 ± 8,27 11,52 ± 4,54a 20,96 ± 12,16
10
31,17 ± 7,73
28,39 ± 7,82
Zymosan A
Keterangan : a = p<0,05 dibandingkan terhadap kontrol Dengan adanya peningkatan respon imun selular pada mencit yang diberi ekstrak pegagan dan beluntas dosis 37,5 mg/kg bb diduga bahwa kedua ekstrak pada dosis tersebut memiliki kemampuan untuk mengeliminasi patogen intraselular seperti Mycobacterium tuberculosis.
