BAB 4
HASIL PERCOBAAN DAN PEMBAHASAN
Sistem kromatografi yang digunakan merupakan kromatografi fasa balik, yaitu polaritas fasa gerak lebih polar daripada fasa diam, dengan kolom C-18 (n-oktadesil silan) sebagai fasa diam. Dalam sistem ini analit yang lebih non polar akan tertahan lebih lama pada fasa diam sehingga akan keluar dari kolom lebih lama daripada analit lain yang lebih polar.
TBHQ, BHA, BHT memiliki gugus kromofor, yaitu cincin aromatik dan gugus auksokrom sehingga dapat dideteksi dengan KCKT yang menggunakan detektor UV pada panjang gelombang 280 nm. Kondisi optimum KCKT diperoleh pada sistem gradien dari campuran fasa gerak metanol : asetonitril : asam asetat 1% (Tabel 1) dan diperoleh pemisahan dengan resolusi (R) ≥ 1,5 dengan waktu analisis 12 menit. Tabel 4.1 Sistem Elusi Gradien
t (menit) 0 6 9 11 12
Metanol Asetonitril (%) (%) 60 20 60 25 60 30 60 30 60 20
Asam asetat 1% (%) 20 15 10 10 20
Laju alir (mL/menit) 1 1 1 1,2 1
Metanol dan asetonitril digunakan sebagai fasa gerak karena dapat mengelusi TBHQ, BHA, BHT dan merupakan pelarut polar yang umum digunakan dalam kromatografi fasa balik. Asam asetat berfungsi untuk mengendalikan keasaman sistem sehingga dapat menahan ionisasi analit. Sistem elusi gradien dipilih karena dapat memberikan pemisahan dengan resolusi yang baik dan puncak yang bagus (tidak berekor).
17
18
TBHQ BHA
BHT
Gambar 4.1 Larutan baku TBHQ, BHA, BHT
Tabel 4.2 Resolusi Puncak Kromatogram TBHQ, BHA, BHT
Antioksidan
tR (menit)
W
Resolusi
TBHQ
2,775
0,157
-
BHA
4,126
0,191
7,764
BHT
10,701
0,224
31,687
Untuk mendapatkan hubungan antara konsentrasi antioksidan (dalam bpj) dengan respon dari alat berupa AUC (area under curve), dibuat kurva kalibrasi yang memplotkan konsentrasi antioksidan terhadap AUC. Koefisien korelasi (r) dari kurva kalibrasi yang diperoleh mendekati 1 dan nilai koefisien variasi fungsi regresi (Vx0) < 5% (Tabel 3). Berarti dengan metode ini, alat KCKT dapat memberikan respon yang sebanding terhadap konsentrasi TBHQ, BHA, dan BHT (memiliki kelinieran yang baik). Dari perhitungan nilai t gawat diperoleh thitung lebih besar dari ttabel (pada aras keberartian 0,05) maka H0 ditolak, berarti ada korelasi yang signifikan antara nilai AUC dengan konsentrasi antioksidan.
19
Kurva Kalibrasi TBHQ
200
10,24
9,7
150
150
7,76 100
AUC
AUC
Kurva Kalibrasi BHA
200
5,82 4,85 3,88
50
8,2
100
6,15 5,12 4,1
50
2,05
1,94
0
0 0
5 10 Konsentrasi (bpj)
0
15
5 10 Konsentrasi (bpj)
15
Kurva Kalibrasi BHT
100
10,4
AUC
80
8,32
60
6,24 5,2 4,16
40
2,08
20 0 0
5 10 Konsentrasi (bpj)
15
Gambar 4.2 Kurva kalibrasi TBHQ, BHA, BHT
Tabel 4.3 Kelinieran Metode
r
Vx0
TBHQ
Hubungan Konsentrasi (bpj) dengan AUC y = 14,923x + 7,2424
0,9989
2,595
42,593 2,776 ditolak
BHA BHT
y = 16,486x + 4,0659 y = 7,7698x + 12,119
0,9982 0,9975
3,295 3,923
33,273 2,776 ditolak 27,936 2,776 ditolak
Antioksidan
thitung
ttabel
H0
Batas deteksi adalah jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi yang masih memberikan respon signifikan. Batas kuantisasi adalah jumlah terkecil analit yang dapat ditetapkan secara kuantitatif dan masih dapat memenuhi kriteria cermat dan seksama. Batas deteksi dan batas kuantisasi menunjukkan kepekaan metode dan diperoleh dari kurva kalibrasi melalui perhitungan secara statistika. Tabel 4.4 Kepekaan Metode
Antioksidan
Batas Deteksi (bpj)
Batas Kuantisasi (bpj)
TBHQ
0,99
3,02
BHA
0,65
1,97
BHT
0,78
2,38
20 Kecermatan metode ditentukan dengan metode simulasi (spiked-placebo method). Dalam metode simulasi, sejumlah antioksidan yang telah dilarutkan dalam minyak ditambahkan ke dalam campuran matriks mie kemudian campuran tersebut dianalisis dan hasilnya dibandingkan dengan kadar antioksidan yang ditambahkan. Antioksidan diekstraksi dari mie dengan etil asetat karena pelarut tersebut dapat melarutkan TBHQ, BHA, dan BHT. Etil asetat diuapkan seluruhnya dan residunya direkonstitusi dengan metanol karena etil asetat tidak dapat bercampur dengan fasa gerak sehingga bila ekstrak etil asetat langsung disuntikkan ke dalam alat KCKT akan tertahan di kolom (fasa diam). Kecermatan ditunjukkan oleh perolehan kembali, yaitu untuk TBHQ 93,8-98,3%; BHA 87,2-98,3%; dan BHT 76,2-92,3%. Tabel 4.5 Kecermatan Metode
TBHQ
BHA
BHT
Konsentrasi*
Perolehan
Konsentrasi*
Perolehan
Konsentrasi*
Perolehan
(bpj)
Kembali (%)
(bpj)
Kembali (%)
(bpj)
Kembali (%)
2,70
96,94 ± 7,76
3,00
98,33 ± 9,57
2,70
76,19 ± 10,87
4,95
98,32 ± 12,02
5,50
90,22 ± 8,90
4,95
90,87 ± 15,02
7,20
93,81 ± 2,56
8,00
87,20 ± 5,90
7,20
92,27 ± 5,60
Rentang
93,8-98,3
Rentang
87,2-98,3
Rentang
76,2-92,3
* Konsentrasi antioksidan hasil ekstraksi (pengenceran 10 kali dari konsentrasi dalam mie)
TBHQ
BHA BHT
Gambar 4.3 Hasil analisis mie simulasi
21 Keseksamaan adalah ukuran yang menunjukkan kesesuaian antara hasil uji individual, diukur melalui penyebaran hasil individual dari rata-rata jika prosedur diterapkan secara berulang pada sampel-sampel yang diambil dari campuran yang homogen. Keseksamaan yang dilakukan adalah keseksamaan intra-day yang dilakukan dalam satu hari dan keseksamaan inter-day yang dilakukan dalam tiga hari yang berbeda dengan larutan baku antioksidan yang baru setiap harinya karena larutan antioksidan tidak stabil bila disimpan lebih dari 2 hari. Tujuan penentuan keseksamaan adalah untuk melihat kinerja alat dan metode analisis yang digunakan. Kriteria yang harus dipenuhi (menurut Horwitz) adalah nilai koefisien variasi tidak lebih dari 2(1-0,5 logC), dengan C adalah konsentrasi analit dalam fraksi desimal. Kriteria lain untuk keseksamaan adalah nilai F, yaitu Fhitung < Ftabel yang berarti antara hasil pengukuran hari pertama, kedua, dan ketiga tidak ada perbedaan berarti. Tabel 4.6 Keseksamaan Intra-day
Antioksidan
Konsentrasi (bpj)
AUC Rata-rata
KV (%)
Batas KV (%)
TBHQ
4,85
75,52 ± 1,92
2,43
12,61
BHA
5,12
81,68 ± 1,94
2,26
12,51
BHT
5,20
51,1 ± 0,40
0,74
12,48
Tabel 4.7 Keseksamaan Inter-day TBHQ
Konsentrasi (bpj) 4,85
AUC Rata-rata 81,70 ± 4,88
7,76 9,70
KV (%)
Batas KV (%)
Fhitung
Ftabel
7,77
12,61
2,34
9,28
126,51 ± 3,89
4,00
11,75
2,11
9,28
159,42 ± 6,92
5,65
11,37
2,52
9,28
Tabel 4.8 Keseksamaan Inter-day BHA
Konsentrasi (bpj) 5,12 bpj
AUC Rata-rata 86,02 ± 3,16
8,20 bpj 10,24 bpj
KV (%)
Batas KV (%)
Fhitung
Ftabel
4,79
12,51
1,79
9,28
136,71 ± 4,10
3,90
11,66
2,01
9,28
174,32 ± 13,83
10,32
11,27
2,60
9,28
22 Tabel 4.9 Keseksamaan Inter-day BHT
Konsentrasi (bpj) 5,20 bpj
AUC Rata-rata 54,63 ± 4,24
8,32 bpj 10,40 bpj
KV (%)
Batas KV (%)
Fhitung
Ftabel
10,1
12,48
1,99
9,28
86,07 ± 5,17
7,81
11,63
2,59
9,28
107,11 ± 8,44
10,25
11,25
2,93
9,28
Penetapan kadar antioksidan dalam sampel mie instan di pasaran diperoleh hanya TBHQ yang terdeteksi dengan kadar rata-rata 1,35 µg per gram mie instan. Setelah dikonversi terhadap perolehan kembali TBHQ, yaitu 93,8-98,3% maka diperoleh kadar TBHQ dalam mie instan adalah 1,37-1,44 µg per gram mie instan.
TBHQ
Gambar 4.4 Hasil analisis sampel mie instan
Walaupun hanya TBHQ yang terdeteksi tidak berarti dalam minyak yang digunakan untuk menggoreng mie instan tidak terdapat antioksidan lain, tetapi karena TBHQ memiliki ketahanan yang baik terhadap penggorengan pada suhu tinggi maka TBHQ dapat terdeteksi pada produk akhir makanan.
23 Tabel 4.10 Penetapan Kadar Sampel Mie Instan
Pengukuran
Kadar TBHQ (µg/g mie)
1
1,47
2
1,44
3
1,22
4
1,30
5
1,36
6
1,28
Rata-rata
1,35
KV (%)
7,21
