BAB 4
HASIL PERCOBAAN DAN PEMBAHASAN Penandaan falerin dengan 131I adalah jenis penandaan tak seisotop. Falerin ditandai dengan menggunakan
131
I yang tidak terdapat dalam struktur falerin. Proses yang terjadi dalam
reaksi adalah reaksi oksidasi
131
I2 pada larutan Na131I oleh oksidator ”Iodogen” (1,3,4,6–
tetrakloro-3α,6α–difenilglikouril). Reaksi oksidasi terjadi pada dinding tabung reaksi yang mana ”Iodogen” akan mengoksidasi iodida menjadi ion iodinium (131I+). Kemudian ion 131 +
I yang bersifat elektrofil akan menyerang atom C atau O tertentu dalam struktur
falerin melalui reaksi substitusi aromatik elektrofilik. 131
I
O HO
HO
HO
OCH3 O
O
Na131I
HO
OCH3 O
Iodogen
+ HI
O OH
OH HO
HO
HO
O
OH
HO
OH
Gambar 4.1 Reaksi iodinasi falerin Pada percobaan telah dilakukan optimasi terhadap jumlah falerin dan jumlah “Iodogen” untuk menghasilkan hasil penandaan yang tinggi. Hasil penandaan optimal didapatkan pada jumlah falerin 20 µg , jumlah ”Iodogen” 100 µg, dan penambahan larutan Na131I dengan aktivitas 1 mCi. Pada reaksi iodidasi dilakukan penambahan 20µL larutan dapar fosfat pH 7,4 dengan molaritas 0,5 M untuk menurunkan pH yang tinggi yang terjadi saat reaksi iodinasi terjadi. Setelah 1 menit reaksi berlangsung, reaksi dihentikan dengan menambahkan larutan dapar fosfat 0,05 M pH 7,4. Hasil penandaan falerin dengan mencapai 90,2% ± 2,8 dengan pengulangan 7 kali.
17
131
I
18 Kromatografi cair kinerja tinggi digunakan untuk mengetahui apakah reaksi iodinasi menghasilkan falerin bertanda
131
I. Hasil penandaan falerin dengan
131
I dibandingkan
dengan hasil reaksi antara ”Iodogen” dengan larutan Na131I dan falerin tidak bertanda. Pada analisis dengan kromatografi cair kinerja tinggi digunakan fasa gerak metanol 70%. Kromatogram hasil pembacaan detektor ultraviolet menunjukkan pada hasil penandaan falerin dengan
131
I terdapat 4 puncak pada waktu retensi 5,8 menit, 6,6 menit, 6,8 menit
dan 8,8 menit. Sedangkan pada pembanding yang merupakan hasil reaksi antara ”Iodogen” dengan larutan Na131I terdapat tiga puncak yaitu pada waktu retensi 6 menit, 6,7 menit dan 7,1 menit. Falerin tidak bertanda memiliki puncak pada waktu retensi 6,8 menit. Puncak radioaktivitas
131
I yang terukur oleh detektor radioaktif muncul pada menit ke 4,6
sedangkan puncak radioaktivitas hasil reaksi iodogen dengan larutan Na131I pada menit ke 5,1 dan 7,4. Puncak radioaktivitas falerin bertanda yang diukur dengan ”gamma counter” muncul pada waktu retensi mendekati menit ke-9. Dengan demikian dapat diketahui bahwa falerin berhasil ditandai dengan adanya puncak radioaktivitas tersebut dan puncak hasil pembacaan detektor ultraviolet sinar tampak pada waktu retensi 8,8 menit .
Gambar 4.2 Kromatogram falerin murni
19
Gambar 4.3 Kromatogram sampel falerin hasil penandaan
Gambar 4.4 Kromatogram sampel falerin hasil penandaan dan hasil reaksi ”Iodogen” dengan Na131I Perolehan hasil penandaan dianalisis dengan menggunakan kromatografi lapis tipis dengan menggunakan pelat silika gel GF254 dengan pengembang campuran kloroform - metanol (9:2). Setelah dikembangkan dalam bejana kromatografi dikeringkan kemudian dihitung cacahan radioaktivitasnya dengan menggunakan alat ”Single Channel Analyzer” dengan detektor NaI (TI). Pada kurva radioaktivitas dapat diketahui besar persentase perolehan hasil penandaan dan Rf hasil penandaan yang ditunjukkan dengan posisi terdapatnya puncak pada kurva. Rf falerin bertanda 131I dengan pengembang tersebut adalah 0,2 – 0,3.
20 Hasil reaksi iodinasi untuk menandai senyawa falerin dengan
131
I dimurnikan dengan
kromatografi eksklusi-ukuran menggunakan kolom sephadex G-25 dan eluen larutan basa fosfat pH 7,4 0,05 M. Kolom sephadex G-25 yang digunakan memiliki diameter 0,5 cm dengan tinggi kolom 2,5 cm. Kolom sephadex G-25 memiliki kemampuan untuk memisahkan senyawa berdasarkan besar berat molekul. Kolom ini stabil terhadap semua jenis larutan dapar yang umum digunakan. Hasil reaksi iodinasi pasti masih mengandung
131
I bebas yang memiliki radioaktivitas.
Pemisahan dengan berdasarkan pada ukuran molekul ini memungkinkan falerin bertanda 131
131
I terpisah dari
I bebas karena berat molekulnya lebih besar. Setiap fraksi yang
ditampung dari hasil elusi diukur cacahan radioaktivitasnya dengan alat ”Gamma Counter” dan dilihat profil kenaikan serta penurunan cacahan radioaktivitasnya sehingga fraksi yang berisi falerin bertanda
131
I dapat dipisahkan dari
131
bebas yang berat molekulnya lebih
kecil. Hasil pemurnian mencapai 96,0 ± 0,4% pada pengulangan sebanyak 3 kali. Tabel 4.1. Nilai Penimbunan Falerin Bertanda dalam Berbagai Jaringan Kelompok Mencit
Nilai Penimbunan Relatif Falerin Bertanda Darah
Sehat (1 jam)
8,3 ± 1,9
5,0 ± 4,3 2,7 ± 2,0
3,1 ± 1,6
ParuLimpa Paha Paha paru kanan kiri 2,1 ± 0,1 4,1 ± 2,8 5,7 ± 4,0 2,1 ± 1,5 1,0 ± 0,9 1,0 ± 0,8
Sehat (4jam)
11,6 ± 0,4
3,6 ± 0,8 2,8 ± 1,0
2,8 ± 0,4
2,5 ± 0,6 4,4 ±1,5 6,3 ± 2,4 1,8 ± 0,5 1,4 ±0,1 1,1 ± 0,1
Sehat (24 jam)
6,6 ± 0,9
1,8 ± 0,9 2,6 ± 2,2
1,3 ± 0,2
1,5 ± 0,3 2,6 ± 0,1 4,9 ± 0,9 1,0 ± 0,1 1,5 ± 0,4 1,3 ± 0,1
Radang (1 jam)
13,4 ± 8,4
4,1 ± 1,0 1,8 ± 0,7
3,1 ± 2,0
3,6 ± 1,5 5,0 ± 2,2 3,4 ± 0,7 1,6 ± 0,4 1,8 ± 1,0 1,1 ± 0,4
Radang (4jam)
8,4 ± 1,0
3,1 ± 0,3 2,1 ± 0,3
2,4 ± 0,1
2,1 ± 0,3 3,0 ± 1,5 3,0 ± 0,3 1,3 ± 0,2 1,8 ± 0,7 1,3 ± 0,4
Radang (24jam)
6,4 ± 0,7
1,9 ± 0,4 1,3 ± 0,3
1,3 ± 0,4
1,2 ± 0,3 1,8 ± 0,2 3,2 ± 1,7 0,9 ± 0,1 1,6 ± 0,2 1,2 ± 0,1
Radang,disuntik falerin (1 jam)
12,1 ± 3,8
4,9 ± 2,8 2,6 ± 1,1
2,3 ±1,2
2,7 ± 0,9 4,7 ± 2,3 5, 7 ±2,7 2,4 ± 1,2 1,6 ± 1,0 1,3 ± 0,9
Falerin bertanda
Ginjal
131
Usus
Lambung
Hati
Jantung
I yang telah murni diuji biodistribusinya pada mencit sehat, mencit
yang radang dan pada mencit yang radang kemudian disuntik dengan falerin tidak bertanda dengan dosis 22,5 mg/kg bb yang terbukti menghambat radang. Mencit dipilih sebagai hewan percobaan karena sampel yang akan diamati biodistribusinya sangat kecil sehingga diharapkan dengan menggunakan mencit cacahan biodistribusi dapat diamati dengan baik pada organ dan sampel darah hewan percobaan. Biodistribusi dilakukan pada tiga rentang waktu yaitu 1, 4 dan 24 jam untuk mengetahui pola perubahan biodistribusi falerin bertanda 131I dalam tubuh hewan percobaan.
21
14
1 jam 4 jam 24 jam
10 8 6 4 2 0 darah
ginjal
usus
lambung
hati
jantung paru-paru
limpa
paha kanan
paha kiri
sampel darah dan organ
Gambar 4.5 Biodistribusi falerin bertanda pada mencit sehat 1, 4 dan 24 jam setelah penyuntikan
16
1 jam 4 jam 24 jam
14
12 penimbunan relatif phalerin bertanda
penimbunan relatif phalerin bertanda
12
10
8
6
4
2
0 darah
ginjal
usus
lambung
hati
jantung
paru-paru
limpa
paha kanan paha kiri
sampel darah dan organ
Gambar 4.6 Biodistribusi falerin bertanda pada mencit radang 1, 4 dan 24 jam setelah penyuntikan
22 14 12 10 8 6 4 2
Paha kiri
Paha kanan
Limpa
Paruparu
Jantung
Hati
Lambung
Usus
Ginjal
Darah
0
Gambar 4.7 Biodistribusi falerin bertanda pada mencit radang yang telah disuntik falerin pada waktu satu jam setelah penyuntikan Biodistribusi pada mencit yang telah diinduksi radang menunjukkan bahwa pada rentang waktu satu jam setelah penyuntikan nilai penimbunan relatif falerin bertanda pada paha kanan memiliki perbedaan yang bermakna (p<0,05) dengan paha kanan mencit sehat. Setelah 4 dan 24 jam penimbunan relatif falerin bertanda131I pada paha kanan mencit radang tidak memilki perbedaan yang bermakna dengan mencit sehat akan tetapi masih lebih besar daripada mencit sehat.
2 1.8 1.6 1.4 1.2 1
mencit normal
0.8
mencit radang
0.6 0.4 0.2 0 1 jam
4 jam
24 jam
Gambar 4.8 Penimbunan relatif falerin bertanda pada paha kanan mencit Jika dibandingkan penimbunan relatif falerin bertanda
131
I pada bagian paha kanan antara
mencit radang dan mencit sehat, pada rentang waktu satu jam setelah penyuntikan terdapat
23 kenaikan mengalami kenaikan sebesar 69,2%. Pada waktu empat jam setelah penyuntikan nilai penimbunan relatif falerin bertanda
131
I pada paha kanan mencit radang lebih besar
26,4% dibandingkan dengan penimbunan pada paha kanan mencit sehat. Sedangkan pada waktu 24 jam setelah penyuntikan, nilai penimbunan falerin bertanda
131
I pada paha
kanan mencit radang lebih besar 4,7% dibandingkan dengan penimbunan pada paha kanan mencit sehat pada waktu yang sama. Data tersebut menunjukkan bahwa terjadi penimbunan falerin bertanda
131
I pada lokasi
radang dan penimbunan tersebut dapat
diamati dengan jelas pada biodistribusi pada waktu satu jam setelah penyuntikan. Falerin bertanda
131
I digunakan sebagai perunut radioaktif untuk mengetahui dampak penandaan
falerin dengan isotop radioaktif
131
I pada lokasi radang. Oleh karena itu dilakukan pula
pengamatan biodistribusi pada mencit yang telah diinduksi radang pada paha kanan kemudian disuntik falerin tidak bertanda dengan dosis yang terbukti menghambat radang 36,7% pada jam kedua dan 23,4% pada jam kelima. Pengamatan biodistribusi ini dilakukan pada waktu satu jam setelah penyuntikan karena pada waktu tersebut menunjukkan perbedaan yang bermakna antara penimbunan relatif falerin bertanda
131
I pada paha kanan
mencit radang dan pada paha kanan mencit sehat. Hasil pengamatan biodistribusi pada paha kanan menunjukkan bahwa nilai penimbunan falerin bertanda
131
I lebih besar 51,9% dibandingkan dengan nilai penimbunan pada paha
kanan mencit sehat. Data ini menunjukkan bahwa masih terjadi penimbunan di lokasi radang pada hewan yang telah disuntik dengan falerin tidak bertanda pada dosis yang telah terbukti menghambat radang.
