BAB 4
HASIL PERCOBAAN DAN PEMBAHASAN Pada penelitian ini rimpang jahe merah dan buah mengkudu yang diekstraksi menggunakan pelarut etanol menghasilkan rendemen ekstrak masing-masing 9,44 % dan 17,02 %. Ekstrak air bawang putih yang digunakan dalam pengujian diketahui setara dengan 3,25% alliin dan ekstrak kunyit setara dengan 20,95% kurkuminoid berdasarkan data penetapan standar ekstrak dalam Certificate of Analysis (CA) dari masing-masing sumber. Karakterisasi ekstrak dilakukan untuk mengetahui mutu ekstrak uji yang digunakan dalam pengujian efek antioksidan. Hasil penentuan kadar air menunjukkan bahwa semua ekstrak yang digunakan memenuhi persyaratan kadar air dalam ekstrak yaitu kurang dari 10%. Penapisan fitokimia ekstrak dilakukan untuk mengetahui golongan senyawa yang terdapat di dalam ekstrak dan memperkirakan senyawa yang dapat memberikan efek dalam pengujian farmakologi. Hasil karakterisasi ekstrak dan penapisan fitokimia dapat dilihat pada Tabel 4.1. Tabel 4.1 Karakteristik dan Penapisan Fitokimia Ekstrak Parameter Alkaloid Flavonoid Kuinon Saponin Tanin Steroid/Triterpenoid Susut pengeringan (% v/b) Kadar air (% v/b) Kadar sari larut air (% b/b) Kadar sari larut etanol (% b/b) Kadar abu total (% b/b) Bobot jenis (g/ml)
Bawang putih + + 10,32 6,05 78,17 0,32 3,30 -
Ekstrak Kunyit Jahe merah + + + + + 3,31 31,21 2,55 4,97 70,63 9,81 11,63 29,01 0,23 4,97 1,0509
Mengkudu + + + 38,53 7,48 52,29 45,37 7,48 1,0507
Kromatografi lapis tipis dilakukan untuk mengetahui kebenaran ekstrak yang didapat berdasarkan ada atau tidaknya senyawa identitas dengan menggunakan pembanding alliin untuk bawang putih, curcuminoid untuk kunyit dan skopoletin untuk mengkudu. Selain itu
25
26 dilakukan pula pengujian pola kromatogram ekstrak jahe merah namun tidak terdapat pembanding. Pola kromatografi lapis tipis masing masing ekstrak dapat dilihat pada Gambar 4.1- 4.3.
Gambar 4.1
1 2
1 2
1 2
1 2
(a)
(b)
(c)
(d)
Pola kromatogram senyawa identitas ekstrak air bawang putih dengan pengembang butanol-asam asetat-air (4:3:3). 1 = bercak ekstrak, 2 = bercak pembanding Alliin, (a) sinar tampak, (b) sinar tampak setelah disemprot asam sulfat 10% dalam metanol , (c) UV λ=254 nm, (d) UV λ=366 nm.
1
2 (a)
Gambar 4.2
1
2 (b)
1 2 (c)
1
2 (d)
Pola kromatogram senyawa identitas ekstrak etanol kunyit dengan pengembang kloroform-etanol 95%-asam asetat glasial (95:5:1). 1 = bercak pembanding kurkuminoid, 2 = bercak ekstrak, (a) sinar tampak, (b) sinar tampak setelah disemprot asam sulfat 10% dalam metanol, (c) UV λ=254 nm, (d) UV λ=366 nm.
27
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
Gambar 4.3 Pola kromatogram ekstrak etanol jahe merah dengan pengembang toluenaetil asetat (93:7). (a) sinar tampak, (b) sinar tampak setelah disemprot asam sulfat 10% dalam metanol, (c) UV λ=254 nm, (d) UV λ=366 nm, (e) UV λ=366 nm setelah disemprot asam sulfat 10% dalam metanol.
Gambar 4.4
1 2
1 2
1 2
1 2
(a)
(b)
(c)
(d)
Pola kromatogram senyawa identitas ekstrak etanol mengkudu dengan pengembang n-heksan-etil asetat (6:4). 1 = bercak ekstrak, 2 = bercak pembanding skopoletin, (a) sinar tampak, (b) sinar tampak setelah disemprot asam sulfat 10% dalam metanol, (c) UV λ=254 nm, (d) UV λ=366 nm.
Pada penelitian ini dilakukan uji peredaman aktivitas radikal bebas DPPH (1,1-difenil-2pikril hidrazil) secara in vitro oleh ekstrak uji dan pembanding. DPPH merupakan radikal bebas sintetik yang mudah menerima elektron atau atom hidrogen membentuk molekul diamagnetik yang stabil (Di Mambro, 2003). Hal ini terkait dengan kemampuan senyawa yang terkandung di dalam ekstrak untuk mereduksi radikal bebas DPPH dengan cara mendonorkan atom hidrogen. Aktivitas ini ditunjukkan dengan terbentuknya senyawa hasil reduksi DPPH yaitu DPP-hidrazin yang berwarna kuning.
28
Tabel 4.2 Hasil Uji Peredaman DPPH Kelompok Uji
Ekstrak air umbi bawang putih
Ekstrak etanol rimpang kunyit
Ekstrak etanol rimpang jahe merah
Ekstrak etanol buah mengkudu
Asam askorbat
Kontrol
Konsentrasi (µg/ml) 500 1000 2000 3000 4000 5000 25 50 75 100 150 200 25 50 75 100 150 200 500 600 700 800 900 1000 2 5 10 15 20 25 -
% Peredaman (n=5) 6,40 ± 3,86 10,42 ± 2,14 23,75 ± 4,14 35,17 ± 2,26 47,14 ± 1,09 58,61 ± 0,37 18,08 ± 6,44 28,75 ± 3,29 45,85 ± 2,72 45,79 ± 0,82 68,16 ± 2,10 82,67 ± 0,65 17,33 ± 0,78 37,99 ± 4,08 48,90 ± 0,51 55,52 ± 1,32 68,04 ± 1,12 76,74 ± 0,47 26,71 ± 0,70 28,84 ± 0,48 31,44 ± 1,70 38,74 ± 0,75 45,81 ± 1,37 61,61 ± 0,37 18,69 ± 1,35 29,43 ± 0,55 47,33 ± 0,45 60,75 ± 2,62 92,11 ± 1,06 96,56 ± 0,20 0
EC50 (µg/ml)
4237,61
104,91
97,61
917,37
10,74
-
Keterangan: Semua kelompok sangat berbeda bermakna terhadap kontrol (p<0.001) kecuali asam askorbat 2 µg/ml
Daya peredaman radikal bebas DPPH dinyatakan sebagai konsentrasi larutan uji yang mampu meredam 50 % DPPH atau dikenal sebagai konsentrasi efektif 50 % (EC50). Dari hasil pengujian seperti terlihat pada Tabel 4.2 dapat dilihat bahwa semua ekstrak uji memiliki aktivitas peredaman radikal bebas dengan nilai EC50 yang beragam. Ekstrak jahe memiliki aktivitas peredaman DPPH paling tinggi, sedangkan bawang putih memiliki aktivitas peredaman yang paling rendah. Ekstrak kunyit juga memiliki aktivitas yang hampir setara dengan ekstrak jahe. Asam askorbat sebagai pembanding memiliki aktivitas reduksi yang kuat terhadap DPPH. Dengan demikian, ekstrak kunyit, jahe, dan asam askorbat termasuk ke dalam antioksidan kuat dengan EC50 peredaman DPPH lebih kecil dari 200 µg/ml. Perbedaan aktivitas peredaman DPPH ini juga dapat dilihat pada Gambar 4.5.
29
EC50 (μ g/ml)
4237,61
917,37
104,91
97,61
Kunyit
Jahe merah
10,74
Keterangan:
Bawang putih
Mengkudu
Asam askorbat
Gambar 4.5 Diagram EC50 aktivitas peredaman DPPH ekstrak uji dan pembanding. Pengujian aktivitas peredaman radikal peroksidasi lipid secara in vitro dilakukan menurut metoda Xiu-Wei Yang yang dimodifikasi untuk mengetahui kekuatan ekstrak uji, beberapa kombinasinya, dan pembanding untuk meredam peroksidasi lipid yang terjadi di organ hati. Produk peroksidasi lipid seperti malondialdehid selalu dihasilkan ketika lipid hidroperoksida dimetabolisme di dalam sistem biologi tubuh, dan identifikasi jumlahnya merupakan
indeks
secara
tidak
langsung
adanya
kerusakan
oksidatif
dimana
malondialdehid akan bereaksi dengan asam tiobarbiturat menghasilkan kompleks berwarna merah muda (Punchard, 1996). Daya peredaman peroksidasi lipid dinyatakan sebagai konsentrasi larutan uji yang mampu meredam 50 % peroksidasi lipid dan dikenal sebagai konsentrasi efektif 50 % (EC50). Dari Tabel 4.3 dapat dilihat bahwa ekstrak jahe merah memiliki aktivitas peredaman peroksidasi lipid yang paling tinggi dari semua ekstrak uji. Kekuatannya hampir sebanding dengan asam askorbat, sedangkan bawang putih memiliki aktivitas yang paling kecil. Kombinasi ekstrak bawang putih dan kunyit memiliki aktivitas yang lebih tinggi dari masing-masing tunggalnya dari tunggalnya, sedangkan kombinasi ekstrak jahe merah dan mengkudu memiliki aktivitas peredaman yang lebih rendah dari masing-masing tunggalnya. Dalam uji ini digunakan juga pembanding α-tokoferol yang merupakan antioksidan larut lemak dan terdeposit salah satunya dalam organ hati serta dapat meredam radikal peroksil lebih kuat dari asam askorbat (Combs, 1992). Perbedaan aktivitas peredaman peroksidasi lipid dapat dilihat pada Gambar 4.6.
30
Tabel 4.3 Hasil Uji Peroksidasi Lipid secara in vitro Kelompok Uji
Ekstrak air umbi bawang putih
Ekstrak etanol rimpang kunyit
Kombinasi ekstrak bawang putih dan kunyit (1:1)
Ekstrak etanol rimpang jahe merah
Ekstrak etanol buah mengkudu
Kombinasi ekstrak jahe merah dan mengkudu (1:1)
Asam askorbat
α-tokoferol
Kontrol
Konsentrasi (µg/ml) 50 100 250 500 750 1000 50 100 250 500 750 1000 50 100 250 500 750 1000 50 100 250 500 750 1000 50 100 250 500 750 1000 50 100 250 500 750 1000 50 100 250 500 750 1000 50 100 250 500 750 1000 -
% Peredaman (n=5) 2,84 ± 0,88* 7,14 ± 1,66* 9,14 ± 1,54* 9,39 ± 1,17* 13,01 ± 1,15** 14,91 ± 0,57** 10,26 ± 4,47** 10,75 ± 5,68** 10,99 ± 4,39** 19,35 ± 5,06** 21,50 ± 2,68** 30,62 ± 3,09** 11,99 ± 2,45** 19,27 ± 3,92** 23,59 ± 1,10** 26,55 ± 1,71** 30,74 ± 1,37** 35,96 ± 3,37** 17,32 ± 2,65** 19,94 ± 5,87** 30,27 ± 1,72** 34,09 ± 1,20** 36,11 ± 1,55** 50,76 ± 10,64** 14,67 ± 4,74** 17,83 ± 4,63** 25,07 ± 2,46** 25,91 ± 3,64** 30,56 ± 1,89** 43,98 ± 20,83** 8,59 ± 2,33* 13,13 ± 1,54** 16,98 ± 1,51** 21,11 ± 2,61** 24,01 ± 2,16** 30,84 ± 1,51** 2,23 ± 1,89* 7,15 ± 1,32* 12,73 ± 1,21** 24,98 ± 0,86** 35,26 ± 0,29** 48,47 ± 2,46** 25,54 ± 3,12** 45,13 ± 3,26** 52,37 ± 0,41** 57,55 ± 1,42** 60,60 ± 1,54** 63,47 ± 1,61** 0
EC50 (µg/ml)
4270,10
2001,12
1631,13
1044,71
1341,22
1952,35
1042,88
416,51
Keterangan: * Berbeda bermakna terhadap kontrol (p<0,05) ** Sangat berbeda bermakna terhadap kontrol (p<0,001)
-
31
EC50 (μ g/ml)
4270,10
2001,2
1952,35
1631,13 1044,71
1341,22
1042,88 416,51
Keterangan:
Bawang putih Bawang putih:kunyit (1:1) Mengkudu Asam askorbat
Kunyit Jahe merah Jahe merah:mengkudu (1:1) α-tokoferol
Gambar 4.6 Diagram EC50 aktivitas peredaman peroksidasi lipid secara in vitro ekstrak uji dan pembanding. Pengujian aktivitas peredaman peroksidasi lipid secara ex vivo dilakukan pada hewan uji yang terlebih dahulu diberi bahan uji. Tujuannya adalah membandingkan kekuatan beberapa dosis ekstrak bawang putih, kunyit, dan kombinasinya terhadap kontrol yang hanya diberi suspensi natrium karboksimetil selulosa 0,5 % serta pembanding. Dalam pengujian ini digunakan dua dosis asam askorbat yaitu 6,5 dan 130 mg/kg bb. Hal ini bertujuan untuk melihat aktivitas antioksidan asam askorbat dengan dosis yang mengacu pada RDA (Recommended Daily Allowance) yaitu 50 mg/hari (antara 45-90 mg/hari) dengan dosis tinggi asam askorbat, yaitu 1000 mg/hari (>500 mg/hari) (Mc Evoy, 2005). Dosis tinggi ini telah digunakan sebagai pencegahan penyakit kanker, yang dapat dipicu juga salah satunya oleh kerusakan oksidatif inti sel yang mengakibatkan mutasi gen. Asam askorbat merupakan antioksidan utama dalam plasma dan diduga memiliki aktivitas baik pada dosis tinggi. Sedangkan dosis pembanding α-tokoferol dikonversi dari dosis manusia 400 IU/hari. Hasil pengujian dapat dilihat pada Tabel 4.4. Pengujian menunjukkan pemberian ekstrak bawang putih dan kunyit dosis 100 mg/kg bb secara tunggal selama 7 hari tidak memberikan efek antioksidan karena tidak memberikan peredaman positif terhadap peroksidasi lipid dan memiliki hasil yang tidak berbeda bermakna terhadap kontrol. Adanya kemungkinan induksi peroksidasi lipid oleh bahan uji belum dapat dibuktikan secara jelas dalam berbagai penelitian antioksidan.
32
Tabel 4.4 Hasil Uji Peroksidasi Lipid secara ex vivo Bahan uji Ekstrak air bawang putih
Dosis (mg/kg bb) % Peredaman (n=6) 100 -6,79 ± 3,00 200 35,40 ± 9,87* Ekstrak etanol kunyit 100 -20,94 ± 14,14 200 22,71 ± 19,09* Kombinasi ekstrak 50-50 19,75 ± 5,16* bawang putih-kunyit 200-200 34,55 ± 18,83* Asam askorbat 6,5 -5,38 ± 19,62 130 28,44 ± 10,82* α-tokoferol 87,87 ± 6,24* 52# Kontrol (CMC-Na 0,5%) 0 # Keterangan: Dosis dalam IU/kg bb * Meredam peroksidasi lipid secara berbeda bermakna pada p<0,05
Ekstrak bawang putih dan kunyit dosis 200 mg/kg bb secara tunggal memberikan hasil peredaman positif dan berbeda bermakna terhadap kontrol (p<0,05) dengan peredaman peroksidasi lipid bawang putih lebih besar dari kunyit, yaitu 35,40 %. Ekstrak bawang putih dosis 200 mg/kg bb ini memiliki efek antioksidan lebih besar dari asam askorbat 130 mg/kg bb, namun tidak berbeda bermakna secara statistik. Kombinasi ekstrak bawang putih-kunyit berefek antioksidan pada dosis rendah (50-50 mg/kg bb) dan dosis lebih tinggi (200-200 mg/kg bb) dan juga memberikan peredaman positif serta berbeda bermakna terhadap kontrol (p<0,05). Namun, kombinasi 200-200 mg/kg bb ini tidak memberikan peredaman lebih tinggi dari ekstrak tunggalnya. Secara umum, ekstrak bawang putih dan kunyit dosis 200 mg/kg bb, kombinasinya pada dosis 5050 dan 200-200 mg/ kg bb, serta asam askorbat dosis 130 mg/ kg bb tidak berbeda bermakna setelah diuji statistik. Asam askorbat dosis 6,5 mg/kg bb tidak memberikan efek antioksidan pada pemberian bahan uji selama 7 hari dan tidak berbeda bermakna terhadap kontrol, sedangkan pada dosis 130 mg/ kg bb memberikan hasil peredaman peroksidasi lipid yang positif sebesar 28,44 %. α-tokoferol memberikan efek antioksidan paling tinggi dari semua bahan uji, yanitu dengan persen peredaman sebesar 87,87 %. Perbedaan aktivitas peredaman peroksidasi lipid oleh ekstrak dan pembanding juga dapat dilihat pada Gambar 4.7. Ekstrak bawang putih baik pada kedua uji in vitro menunjukkan efek antioksidan yang sangat kecil. Namun pada uji ex vivo, bawang putih dapat meredam peroksidasi lipid secara
33 bermakna tergantung kepada dosis yang digunakan. Hal ini menimbulkan dugaan bahwa efek antioksidan dari bawang putih tidak berkaitan dengan mekanisme penangkapan radikal bebas yang telah terbentuk. Efek antioksidan bawang putih kemungkinan berkaitan erat dengan mekanisme antioksidan pada tahap inisiasi, yaitu mencegah radikal bebas terbentuk sebelum sempat bereaksi. Ekstrak bawang putih diduga memiliki kemampuan menurunkan pembentukan hidrogen peroksida yang dapat memicu terbentuknya radikal hidroksil, meningkatkan aktivitas enzim superoksida dismutase, glutation peroksidase, dan katalase pada sel endotel vaskular (Ebadi, 2007). Penyakit kardiovaskular dan kanker yang dapat dicegah dengan ekstrak bawang putih kemungkinan terkait dengan mekanisme ini atau dari faktor resiko lainnya.
% Peredaman
87,87
35,40
34,55 22,71
28,44
19,75
-5,38
-6,79 -20,94 Keterangan: Bawang putih 100 mg/kg bb Kunyit 100 mg/kg bb Bawang putih-kunyit 50-50 mg/kg bb Asam askorbat 6,5 mg/kg bb α-tokoferol 52 IU/kg bb
Bawang putih 200 mg/kg bb Kunyit 200 mg/kg bb Bawang putih-kunyit 200-200 mg/kg bb Asam askorbat 130 mg/kg bb
Gambar 4.7 Diagram persen peredaman peroksidasi lipid secara ex vivo ekstrak uji dan pembanding. Ekstrak kunyit dapat menangkap radikal bebas baik secara in vitro dan ex vivo tergantung kepada dosis yang digunakan. Kombinasi ekstrak bawang putih dan kunyit mampu menangkap radikal bebas lebih baik dari tunggalnya berdasarkan uji peroksidasi lipid secara in vitro. Kombinasi ini juga meredam radikal peroksidasi lipid pada uji ex vivo dengan dosis 50-50 mg/kg bb dan 200-200 mg/kg bb.
34 Dari uji yang telah dilakukan, terdapat keterkaitan antara efek antioksidan ekstrak bawang putih, kunyit dan kombinasi dalam beberapa dosis, yaitu kombinasi ekstrak tersebut memberikan peredaman radikal bebas yang lebih besar namun tidak berbeda secara bermakna setelah diuji statistik. Jahe merah dan mengkudu menunjukkan aktivitas peredaman radikal bebas secara in vitro dan jahe merah memiliki aktivitas paling tinggi. Kedua ekstrak ini diduga berperan sebagai antioksidan melalui mekanisme penangkapan radikal bebas, namun diperlukan pengujian efek lebih lanjut secara ex vivo untuk mengkajinya.
