Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen

Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen

Jelátvitel

Dr. Berki Tímea – Dr. Boldizsár Ferenc – Dr. Szabó Mariann – Dr. Talabér Gergő – Dr. Varecza Zoltán

Jelátvitel (Orvosi biotechnológia) Berki Tímea MD, PhD –Boldizsár Ferenc MD, PhD – Szabó Mariann MD – Talabér Gergő MD, PhD – Varecza Zoltán MSc, PhD

„Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen” Azonosítószám:TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Pécsi Tudományegyetem – Pécs, 2011 © Berki Tímea MD, PhD; Boldizsár Ferenc MD, PhD; Szabó Mariann MD; Talabér Gergő MD, PhD; Varecza Zoltán MSc, PhD, 2011 A projekt az Európai Unió támogatásával az Európai Szociális Alap társfinanszírozásávalvalósul meg

Kézirat lezárva: 2011. november 11.

A kiadásért felel a: Pécsi Tudományegyetem Felelős szerkesztő: Berki Tímea MD, PhD, Boldizsár Ferenc MD, PhD és Bognár Rita Fordította: Szabó Mariann MD Műszaki szerkesztő: Bencze Zsolt, Csöngei Veronika és Czulák Szilvia Lektorálta: Dr. Miskei György Terjedelem: 159 oldal

Tartalom ÁBRAJEGYZÉK ............................................................................................................ 7 TÁBLÁZATOK ............................................................................................................ 13 JELMAGYARÁZAT.................................................................................................... 15 I

ÁLTALÁNOS JELÁTVITELI MECHANIZMUSOK ...................................... 17 I.1

BEVEZETÉS, AZ EXTRACELLULÁRIS JELÁTVITELI FOLYAMATOK ÁTTEKINTÉSE ................................................................................................... 17

I.2

EXTRACELLULÁRIS RECEPTORCSALÁDOK ....................................................... 22 I.2.1

Ion-csatorna receptorok ...................................................................... 23

I.2.2

7-transzmembrán-receptorok (7-TM) ................................................. 25

I.2.3

Enzim-kötött receptorok ..................................................................... 29

I.3

INTRACELLULÁRIS RECEPTOROK ..................................................................... 40

I.4

INTRACELLULÁRIS JELÁTVITELI MOLEKULÁK ................................................. 41

I.5

I.4.1

G-fehérjék ........................................................................................... 41

I.4.2

Másodlagos messengerek ................................................................... 43

I.4.3

A Ca2+-jel............................................................................................ 47

I.4.4

Transzkripciós faktorok ...................................................................... 53

A FŐ JELÁTVITELI ÚTVONALAK ÁTTEKINTÉSE ................................................. 62 I.5.1

cAMP-PKA útvonal ........................................................................... 62

I.5.2

PLCγ-DAG-PKC ................................................................................ 62

I.5.3

MAPK-útvonal ................................................................................... 63

I.5.4

PI3-kináz-PKB (Akt) .......................................................................... 63

Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

3

Jelátvitel (Orvosi biotechnológia) I.5.5

JAK-STAT .......................................................................................... 63

II RÉSZLETES (SZISZTÉMÁS) JELÁTVITELI MECHANIZMUSOK ............................................................................................ 65 II.1 JELÁTVITEL AZ IMMUNRENDSZERBEN .............................................................. 65 II.1.1 Jelátvitel a specifikus immunrendszerben 1.: B-sejt jelátvitel .................................................................................... 66 II.1.2 Jelátvitel a specifikus immunrendszerben 2.: T-sejt aktiváció és jelátvitel ................................................................ 69 II.1.3 Fcγ receptor jelátvitel .......................................................................... 74 II.1.4 Fcε receptor jelátvitel .......................................................................... 77 II.1.5 Citokin jelátvitel.................................................................................. 83 II.1.6 Kemokin jelátvitel ............................................................................... 91 II.1.7 Jelátvitel a veleszületett immunrendszerben, PRR jelátvitel .............. 94 II.2 HORMON ÉS NÖVEKEDÉSI FAKTOR JELÁTVITEL.............................................. 101 II.2.1 Tirozin kináz-kötött receptorok ........................................................ 101 II.2.2 G-protein-kapcsolt receptorok (epinefrin, szerotonin, glukagon) ...................................................... 108 II.2.3 Az intracellularis/nukleáris receptor jelátvitel (szteroid hormonok és a tiroxin) ....................................................... 110 II.2.4 Nem-genomikus szteroid hormon jelátvitel ...................................... 116 II.3 JELÁTVITEL A TUMOR SEJTEKBEN (EGF-R, HER-2R, ADHÉZIÓSMOLEKULÁK) ................................................... 122 II.4 APOPTÓZIS JELÁTVITEL ................................................................................. 127 4

A projekt az Európai Unió támogatásával az Európai Szociális Alap társfinanszírozásávalvalósul meg.

Tartalom II.5 RECEPTOR INTERAKCIÓK, JELÁTVITELI „CROSS-TALK” ................................. 133 II.6 WNT RECEPTOR JELÁTVITEL .......................................................................... 137 II.7 JELÁTVITEL AZ IDEGRENDSZERBEN ............................................................... 143 II.7.1 Az acetilkolin (Ack) ......................................................................... 144 II.7.2 Noradrenalin (NA)............................................................................ 147 II.7.3 Dopamin (D) ..................................................................................... 147 II.7.4 Szerotonin (5-HT) ............................................................................ 147 II.7.5 GABA ............................................................................................... 148 II.7.6 Glutamát ........................................................................................... 148 II.7.7 Glicin ................................................................................................ 148 II.7.8 ATP................................................................................................... 149 II.8 A JELÁTVITELI UTAK MÓDOSÍTÁSA GYÓGYSZEREKKEL ................................. 150 AJÁNLOTT IRODALOM ......................................................................................... 159

Identification number: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

5

Ábrajegyzék I.1-1. ábra: A receptorok fő típusai ................................................................................. 21 I.1-2. ábra: Intracelluláris receptor jelátvitel .................................................................. 21 I.2-1. ábra: Az extracelluláris receptorok fajtái .............................................................. 23 I.2-2. ábra: Cys-hurok ioncsatorna receptorok ............................................................... 24 I.2-3. ábra: Acetilkolin nikotin receptora........................................................................ 25 I.2-4. ábra: 7-transzmembrán receptorok szerkezete (7-TM) ......................................... 27 I.2-5. ábra: A 7-TM receptorok szerkezete ..................................................................... 28 I.2-6. ábra: A Receptor deszenzitizáció .......................................................................... 29 I.2-7. ábra: Kináz-foszfatáz egyensúly ........................................................................... 30 I.2-8. ábra: Protein Tirozin Foszfatázok ......................................................................... 31 I.2-9. ábra: Nátriuretikus peptid jelátvitel ....................................................................... 31 I.2-10. ábra: Receptor tirozin kináz család ..................................................................... 33 I.2-11. ábra: Receptor tirozin kináz jelátviteli útvonal ................................................... 34 I.2-12. ábra: Tirozin kináz receptor közvetítette jel........................................................ 35 I.2-13. ábra: A növekedési faktor receptor dimerizáció ................................................. 35 I.2-14. ábra: Növekedési faktor receptor jelátviteli utak ................................................ 36 I.2-15. ábra: MAPK/ERK a növekedésben és differenciációban ................................... 38 I.4-1. ábra: 7-TM receptorok (G-fehérje kapcsolt receptorok, GPCR) .......................... 42 I.4-2. ábra: G-fehérjék .................................................................................................... 42 I.4-3. ábra: cAMP-PKA útvonal ..................................................................................... 44 I.4-4. ábra: Több receptor, amelyek ugyanazt a másodlagos messenger rendszert használják .................................................................................................. 45 I.4-5. ábra: IP3 receptor útvonal ...................................................................................... 45 Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

7

Jelátvitel (Orvosi biotechnológia) I.4-6. ábra: A Ca2+-jel számos útvonal része ................................................................... 49 I.4-7. ábra: Az intra/extracelluláris Ca2+- jelátvitel kompartmentjei, Ca2+csatornák .................................................................................................... 50 I.4-8. ábra: A Ca2+-jelátvitel effektor mechanizmusai .................................................... 53 I.4-9. ábra: A transzkripció szabályozása........................................................................ 54 I.4-10. ábra: A transzkripciós faktorok funkcionális doménjei ....................................... 56 I.4-11. ábra: A transzkripciós faktorok csoportjai szerkezetük alapján .......................... 57 I.4-12. ábra: Transzkripciós faktorok szerepe a timociták fejlődésében ......................... 58 I.4-13. ábra: Th-Tc sejt döntés ........................................................................................ 59 I.4-14. ábra: Th differenciáció......................................................................................... 59 II.1-1. ábra: BcR jelátvitel ............................................................................................... 67 II.1-2. ábra: Rövid/hosszú távú BcR stimuláció ............................................................. 68 II.1-3. ábra: BcR jelátvitel ko-stimulációs útjai .............................................................. 69 II.1-4. ábra: Az „immunológiai szinapszis” molekulái ................................................... 70 II.1-5. ábra: A TcR/CD3 jelátviteli útvonal .................................................................... 71 II.1-6. ábra: T-sejt aktiváció ............................................................................................ 72 II.1-7. ábra: Ko-stimulációs utak, amik a TcR jelátvitelt szabályozzák ......................... 74 II.1-8. ábra: Az Fcγ receptorok fajtái .............................................................................. 75 II.1-9. ábra: Aktiváló és gátló Fcγ receptor jelátvitel ...................................................... 76 II.1-10. ábra: Az Fcγ receptor jelátvitel áttekintése ........................................................ 77 II.1-11. ábra: IgE kötött FcεR I ....................................................................................... 78 II.1-12. ábra: IgE kötött FcεR II ...................................................................................... 79 II.1-13. ábra: FcεR jelátvitel ........................................................................................... 81 II.1-14. ábra: FcεRI közvetített jelátvitel ........................................................................ 81

8


Ábrajegyzék II.1-15. ábra: A TcR és FcεR jelátvitel közti hasonlóságok ........................................... 82 II.1-16. ábra: Citokin receptorok .................................................................................... 84 II.1-17. ábra: A több láncból álló citokin receptorok jellemzői...................................... 85 II.1-18. ábra: A JAK és STAT fehérjék szerkezete ........................................................ 86 II.1-19. ábra: A citokin jelátvitel .................................................................................... 87 II.1-20. ábra: TNF receptor közvetítette apoptózis I. ..................................................... 89 II.1-21. ábra: TNF receptor közvetítette apoptózis II. .................................................... 90 II.1-22. ábra: Kemokin jelátvitel G-fehérje kapcsolt receptorokon keresztül ................ 93 II.1-23. ábra: Kemokin jelátviteli útvonalak ................................................................... 93 II.1-24. ábra: Toll-like receptorok-mintázat felismerés .................................................. 96 II.1-25. ábra: A komplement receptor (CR) és Toll-like receptor jelátvitel ................... 98 II.1-26. ábra: Toll-like receptor gátlók ........................................................................... 99 II.1-27. ábra: Komplement receptorok ......................................................................... 100 II.2-1. ábra: Növekedési faktor receptorok ................................................................... 102 II.2-2. ábra: Növekedési faktor receptorok és tirozin foszforilációjuk ......................... 104 II.2-3. ábra: EGF jelátvitel ............................................................................................ 104 II.2-4. ábra: A növekedési faktor jelátvitel általános jellemzői .................................... 105 II.2-5. ábra: A különböző növekedési faktor receptorok ugyanazokat a jelátviteli utakat használják...................................................................................... 105 II.2-6. ábra: Adrenerg receptorok ................................................................................. 109 II.2-7. ábra: Nukleáris receptor családok ...................................................................... 112 II.2-8. ábra: A nukleáris receptorok szerkezete ............................................................ 113 II.2-9. ábra: A szteroid receptorok hatásmechanizmusai .............................................. 114 II.2-10. ábra: Genomikus és nem-genomikus szteroid hatások .................................... 115 II.2-11. ábra: Genomikus és nem-genomikus glükokortikoid (GC) hatások ................ 117 Identification number: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

9

Jelátvitel (Orvosi biotechnológia) II.2-12. ábra: Nem-genomikus glükokortikoid hatások összefoglalása ........................ 118 II.3-1. ábra: Immunológiai szelekció a tumorok kialakulásában: nincs két egyforma tumor ........................................................................ 123 II.3-2. ábra: Tumor és aktivált T-sejt ............................................................................ 123 II.3-3. ábra: TGF-β szerepe a tumor jelátvitelben és a tumor fejlődésében .................. 124 II.3-4. ábra: Mi történik, ha a Fas-stimulált sejt rezisztens a sejpusztításra? ................ 124 II.4-1. ábra: A fő apoptózis útvonalak összefoglalása .................................................. 128 II.4-2. ábra: Mitokondriális apoptózis útvonal .............................................................. 129 II.4-3. ábra: Bcl-család .................................................................................................. 130 II.4-4. ábra: Apoptoszóma ............................................................................................. 130 II.4-5. ábra: Beavatkozás az apoptózis jelátvitelbe ....................................................... 132 II.5-1. ábra: Növekedési faktor receptor – integrin jelátvitel interakció ....................... 135 II.5-2. ábra: A jelátviteli utak konvergációja ................................................................ 136 II.6-1. ábra: β-katenin a sejt adhézióban ....................................................................... 138 II.6-2. ábra: Alzheimer betegség I. ................................................................................ 138 II.6-3. ábra: Alzheimer betegség II. .............................................................................. 139 II.6-4. ábra: Wnt jelátviteli útvonalak ........................................................................... 140 II.6-5. ábra: Kanonikus Wnt útvonal ............................................................................. 141 II.7-1. ábra: Neurotranszmisszió ................................................................................... 144 II.7-2. ábra: Acetilkolin ................................................................................................. 145 II.7-3. ábra: Acetilkolin receptorok ............................................................................... 145 II.8-1. ábra: Potenciális célpontok a jelátviteli utakban ................................................ 150 II.8-2. ábra: Az intervenció különböző szintjei ............................................................. 151 II.8-3. ábra: ERB jelátvitel gátlása ................................................................................ 152 II.8-4. ábra: Kalcineurin és rapamycin .......................................................................... 154 10


Ábrajegyzék II.8-5. ábra: Rapamycin ................................................................................................ 155 II.8-6. ábra: Proteoszóma gátlók-Bortezomib............................................................... 156 II.8-7. ábra: HSP-90 gátlók ........................................................................................... 157


11

Táblázatok I.2-1. táblázat: Receptor típusok ..................................................................................... 26 I.4-1. táblázat: Néhány fontos transzkripciós faktor ....................................................... 55 II.2-1. táblázat: Receptor osztályok .............................................................................. 103 II.2-2. táblázat: Az intracelluláris receptorok családjai ................................................ 111 II.6-1. táblázat: Wnt jelátvitel ....................................................................................... 137 II.8-1. táblázat: Klinikai fejlesztés alatt álló kináz gátlók ............................................ 151


13

Jelmagyarázat

Kináz Enzim Foszfatáz Kaszpáz Túlélést serkentő Ciklin,pro-apoptotikus Transzkriptciós faktor GAP/GEF GTP-áz


15

I

Általános jelátviteli mechanizmusok

I.1

Bevezetés, az extracelluláris jelátviteli folyamatok áttekintése

A szolubilis mediátorok az extracelluláris téren keresztül juttatják el az információt a különböző távolságban található célsejtekhez és biztosítják ezáltal a sejtek közötti kommunikációt. A lokális (kis távolságban létrejövő) jelátviteli folyamatok során néhány sejt a kommunikáció érdekében direkt kapcsolatot alakíthat ki egymással. A sejt-sejt jelátvitel azt jelenti, hogy a mediátorok sejtes junkciókon keresztül jutnak el egyik sejttől a másikig, ahogy ezt mind állatokban, mind növényekben megfigyelhetjük. A távoli jelátviteli folyamatokat hormonok közvetítik az állati vagy a növényi sejtek között (endokrin jelátvitel állatokban, növekedési faktorok által kiváltott folyamatok növényekben). A távoli jelátvitel egy további formája a szinaptikus jelátvitel, mely főként az idegrendszerben fordul elő. A növényekben és az állatokban extracelluláris jelátviteli molekulák irányítják a metabolikus folyamatokat, a szövetek növekedését és differenciációját, a fehérjék szintézisét és szekrécióját, valamint az intra-és extracelluláris terek elrendeződését.

Az extracelluláris jelek által kiváltott kommunikációs folyamat általában a következő hat lépésből áll: (1) Az extracelluláris mediátor molekula szintézise és felszabadulása a mediátort termelő sejtből. (2) A mediátor transzportja a célsejthez. (3) Recepció: A jel felismerése egy specifikus receptor fehérje által.


17

Általános jelátviteli mechanizmusok (4) Transzdukció: Az extracelluláris mediátor molekula kötődése a célsejten található specifikus receptorhoz, mely a célsejtben szubcelluláris reakciókat vált ki, amiket jelátviteli eseményeknek nevezünk. (5) Válasz: A receptor-jel komplexen keresztül érkező információ kiváltja a kívánt válaszreakciót, megváltoztatja például a sejtek anyagcseréjét, funkcióját vagy fejlődését. (6) Befejezés: A jel eltávolítása, mely a sejtes válasz befejezéséhez vezet.

A jelátviteli molekulák különböző távolságokból fejtik ki hatásukat A szekretált jelátviteli molekulát termelő sejt és a célsejt közötti távolság alapján három jelátviteli folyamatot különítünk el. Endokrin jelátvitel esetén nagy a távolság a mediátort termelő sejt és a célsejt között, a mediátorok olykor transzport fehérjékhez kötötten, a keringésen keresztül jutnak el a célsejtekhez. Parakrin jelátvitel során a mediátort termelő sejt és a célsejt viszonylag közel helyezkednek el, a mediátor egyszerű diffúzióval jut el a célsejthez. Autokrin folyamat esetén a mediátort termelő sejt és a célsejt megegyezik. Mindezek mellett egy sejt bizonyos membrán kötött fehérjéi direkt jelet is képesek küldeni a szomszédos sejteknek.

A receptor fehérjéket a ligand kötés és az effektor specificitás jellemzi Egy extracelluláris jelátviteli molekulára adott sejtes választ a molekula receptorhoz való specifikus kötődése határozza meg. A receptor lehet a célsejt felszínén, sejtmagjában vagy sejtplazmájában. A jelátviteli molekula (egy hormon, feromon vagy neurotranszmitter) ligandként viselkedik és a receptor meghatározott részéhez kötődik vagy „illeszkedik”. A ligand-receptor kötődés a receptor konformáció változásához

18


Bevezetés, az extracelluláris jelátviteli folyamatok áttekintése vezet, ami reakciók sorozatát indítja el és specifikus sejtes válasz kialakulását eredményezi. Egy sejt vagy egy szövet specifikus hormonokra adott válaszát a megfelelő hormon-receptor kötődés, valamint az az intracelluláris reakció határozza meg, amit ez a hormon-receptor kötődés elindít. A különböző típusú sejtek, ugyanarra a ligandra nézve, különböző receptorokkal rendelkezhetnek és a ligand eltérő hatásait közvetíthetik. Az is előfordulhat azonban, hogy ugyanaz a receptor expresszálódik különböző típusú sejteken és egy ligand kötődése eltérő választ vált ki a különböző sejt típusokban (pl. acetilkolin). A különböző sejtek tehát számos úton adhatnak választ ugyanarra a ligandra. A különböző receptor-ligand komplexek képesek azonban néhány sejt típusban ugyanazt a hatást kiváltani (pl. glukagon és epinefrin). Ezért a receptor fehérjéket a ligand kötés specificitásával jellemezzük, a kialakult hormon-receptor komplex pedig effektor specificitást mutat (azaz, specifikus sejtes választ közvetít).

A hormonokat oldhatóságuk és a receptoruk elhelyezkedése alapján osztályozhatjuk

A legtöbb hormon az alábbi három csoport egyikébe sorolható: (1) kis lipofil molekula, mely a pazma membránon keresztüli diffúzióra képes és intracelluláris receptorhoz kötődik (2) hidrofil vagy (3) lipofil molekula, mely sejtfelszíni receptorhoz kötődik). (1) Intracelluláris receptorral rendelkező lipofil hormonok: Számos lipid oldékony hormon diffúzióval jut át a plazmamembránon és a citoplazmában vagy a sejtmagban található receptorához kötődik. Az így kialakuló hormonreceptor komplex a DNS transzkripciót szabályozó régióihoz kötődik és Identification number: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

19

Általános jelátviteli mechanizmusok befolyásolja specifikus gének expresszióját. Ily módon hatnak a szteroidok (pl. kortizol, progeszteron, ösztradiol és tesztoszteron), a tiroxin és a retinolsav (I.1-1. és I.1-2. ábra). (2) Sejtfelszíni receptorral rendelkező vízoldékony hormonok: A vízoldékony jelátviteli molekulák nem képesek diffúzióval átjutni a plazma membránon, ezért sejtfelszíni receptorokhoz kötődnek. A vízoldékony hormonokat két csoportba sorolhatjuk: (a) a peptid hormonok mérete néhány aminosavtól a protein méretig terjed, pl. az inzulin, növekedési faktorok és a glukagon, (b) kis méretű, töltéssel rendelkező molekulák, aminosavak származékai és hormonként

vagy

neurotranszmitterként

vesznek

részt

a

jelátviteli

folyamatokban pl. epinefrin és hisztamin. Számos vízoldékony hormon a célsejtekben megtalálható enzim(ek) aktivitásában idéz elő változást. Ebben az esetben a felszínhez kötődő hormon azonnali jelet vált ki, aminek hatása azonban csak rövid ideig áll fenn. Ha ez a jel képes génexpressziós változásokat is előidézni, akkor a hormon által közvetített hatás órákig, vagy akár napokig is fennmaradhatnak. Így a vízoldékony molekulák által kiváltott jelek irreverzibilis változásokhoz, pl. sejt differenciációhoz is vezethetnek. (3) Sejtfelszíni receptorral rendelkező lipofil hormonok: Az elsődleges sejtfelszíni

receptorral

rendelkező

lipid

oldékony

hormonok

a

prosztaglandinok. Legalább 16 különböző prosztaglandin létezik, melyeket kilenc kémiai csoportba, PGA – PGI, sorolhatunk be. A prosztaglandinok azonban egy nagyobb család, a 20 szénatomot tartalmazó eikozanoid hormoncsalád tagjai, amely a prosztaglandinok mellett a prosztaciklineket, tromboxánokat és leukotriéneket is magába foglalja. Az eikozanoid

20


Bevezetés, az extracelluláris jelátviteli folyamatok áttekintése hormonok egy közös prekurzorból, az arachidonsavból szintetizálódnak. Az arachidonsav foszfolipidekből és diacil-glicerolból képződik.

Apoláros jel

Poláros jel

Extracelluláristér

Plazma membrán

Citoplazma Membrán-kötött receptor

Receptor

Intracelluláris tér

I.1-1. ábra: A receptorok fő típusai Jel

Extracelluláris tér

Plazma membrán Citoplazma

Receptor

Chaperone fehérje Sejmag Intracelluláris tér

I.1-2. ábra: Intracelluláris receptor jelátvitel


21


I.2

Extracelluláris receptorcsaládok

Bevezetés: extra/intracelluláris receptorok A különböző ligandok hidrofil vagy hidrofób tulajdonságuktól függően extra vagy intracelluláris receptorokhoz kötődnek (I.1-1. ábra). A hidrofób/lipofil molekulák (pl. szteroid hormonok, tiroid hormonok, D vitamin) a plazma membrán lipid rétegén keresztül diffundálnak és intracelluláris receptorukhoz kötődnek (I.1-2. ábra) (részleteket lásd II.2.3. fejezet, 110. oldal). A hidrofil/vízoldékony ligandok (pl. peptid hormonok, citokinek, kemokinek, neurotranszmitterek), nem képesek áthatolni a lipidben gazdag rétegen, ezért hatásuk kiváltásához a sejtmembránból kinyúló receptorokra van szükségük.

Extracellularis receptorok csoportjai Az extracelluláris receptoroknak az a feladatuk, hogy ligand kötése esetén a ligand által kiváltott jelet a sejt belsejébe továbbítsák. Az evolúció során számos jelátviteli útvonal fejlődött ki azért, hogy eleget tegyen ennek a feladatnak. Az extracelluláris receptorok 3 fő csoportba oszthatók (I.2-1. ábra): (1) Ion-csatorna receptorok (2) 7-transzmembrán receptorok (7-TM), G-fehérje-kapcsolt receptoroknak (Gprotein-coupled receptors-GPCR) is nevezik őket (3) Enzim-kötött receptorok

22


Extracelluláris receptorcsaládok ION-CSATORNA KÖTÖTT RECEPTOROK Ionok Jelátviteli molekula Plazma membrán

Citoplazma

G-FEHÉRJE KAPCSOLT RECEPTOROK Jelátviteli molekula

α

β

γ

α

Enzim

β

γ

α

Enzim

GTP

GDP

G-fehérje

Enzim

GTP

β

Aktivált G-fehérje

γ

Aktivált enzim

ENZIM-KÖTÖTT RECEPTOROK Jelátviteli molekula

Jelátviteli molekula dimerje

Enzim Inaktív katalitikus domén

Aktív katalitikus domén

Aktivált enzim

I.2-1. ábra: Az extracelluláris receptorok fajtái I.2.1

Ion-csatorna receptorok

A plazma membrán ligand vezérelt ioncsatornái (pl. GABAA, GABAC, iGlu, glicin, szerotonin, acetilkolin nikotin receptora, P2X receptorok) tartoznak ebbe a csoportba. Ezek a receptorok gyakran fordulnak elő az idegrendszerben és kontraktilis sejtekben (sima/harántcsíkolt/szívizom). Aktiváció hatására az ion-csatorna receptorok kinyílnak és az extra- és intracelluláris ionkoncentráció grádiens következtében ionok áramlanak a receptorokon

keresztül.

Az

átmeneti

ionkoncentráció

változás

a

célsejt

összehúzódásához vagy depolarizációjához vezet. Az ioncsatorna receptorokat 3 csoportba osztjuk: (1) Cys-hurok receptorok: pentamer szerkezetűek, minden alegységük 4 transzmembrán régiót tartalmaz (pl. acetilkolin nikotin receptora – Na+ csatorna; GABAA, GABAC, Glicin – Cl- csatornák [gátló szerep a központi idegrendszerben]) (I.2-2. ábra és I.2-3. ábra). Identification number: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

23

Általános jelátviteli mechanizmusok (2) Glutamát-aktivált kation csatornák: tetramer szerkezetűek, mindegyik alegység 3 transzmembrán régiót tartalmaz (pl. iGlu) [serkentő szerep a központ idegrendszerben]. (3) ATP-függő csatornák: három homológ alegységből állnak, minden alegység két transzmembrán régiót tartalmaz (pl. P2X purinreceptor).

Pórus N C N C

C N

N

N C

C

TM TM TM TM 1 2 3 4

Receptor típus

GABAA

α

Alegység diverzitás

β

GABAC γ

α1-6, β1-3, γ1-3, δ,ε,κ, és θ

p2

p1

p1-3

Glicin

β

α

α1-4, β

I.2-2. ábra: Cys-hurok ioncsatorna receptorok

24


Extracelluláris receptorcsaládok

Preszinaptikus neuron (axon végződés)

Szinaptikus vezikula

NT transzporter Feszültség-függő nátrium csatorna

+ Neurotranszmitter molekula Ligand-függő ioncsatorna (direkt serkentés vagy gátlás)

Posztszinaptikus neuron

GPCR (moduláló)

+

I.2-3. ábra: Acetilkolin nikotin receptora I.2.2

7-transzmembrán-receptorok (7-TM)

A 7-transzmembrán (7-TM) receptorok csoportjai A 7-TM receptor család gerincesekben az egyik legnagyobb géncsalád, melynek több mint 700 tagja van (I.2-1. táblázat). A receptorokat az alábbi osztályokba sorolhatjuk: (1) A osztály: Rodopszin-szerű receptorok (pl. prosztaglandinok, tromboxánok, szerotonin, dopamin, hisztamin, katekolaminok, acetilkolin (M), rodopszin, melatonin, kemokinek, bradikinin, szomatosztatin, ópioid, vazopresszin receptorok) (2) B osztály: Szekretin család (pl. glukagon, GnRH, PTH, CRH receptorok) (3) C osztály: Glutamát és GABA receptorok (metabotróp) (Glutamát, GABA, édes ízérző, szekretin receptorok) Identification number: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

25

Általános jelátviteli mechanizmusok (4) Frizzled receptorok (pl. Wnt, Hedgehog, keserű ízérző receptor) (5) Adhéziós család (pl. kondroitin szulfát receptor)

I.2-1. táblázat: Receptor típusok Receptor tulajdonságok

Ligandok

A ligand a 7 transzmembrán hélixek core régiójához kötődik

11-cisz-retinal (rodopszinban) acetilkolin katekolaminok Biogén aminok (hisztamin, szerotonin stb.) Nukleozidok és nukleotidok leukotriének, prosztaglandinok, prosztaciklinek, tromboxánok

A rövid peptid ligandok részben a core régióhoz és részben a külső hurokhoz kötődnek

peptid hormonok (ACTH, glukagon, növekedési hormon) mellékpajzsmirigy hormon, kalcitonin

A ligandok az N-terminális szegmenshez és a külső hurokhoz kötődnek

Hipotalamuszból felszabaduló glikoprotein faktorok (TRH, GnRH)

Beindítja az N terminális szegmens kiterjedt újraszerveződését

Neurotranszmitterek metabotrop receptorai (pl. GABA és glutamát) Ca2+-érzékelő receptorok, pl. mellékpajzsmirigy sejteken, pajzsmirigy C-sejtek (kalcitonit szekretálnak) és a vese juxtaglomerularis apparátusán

Proteináz aktivált receptorok

Trombin és tripszin receptorok

Itt kell megjegyeznünk, hogy annak ellenére, hogy számos ligand receptora azonosított, a 7-TM receptorok között több mint 200 az ún. „orphan” azaz „árva” (= ligandja még nem ismert) receptorok közé tartozik.

A 7-transzmembrán (7-TM) receptorok szerkezete Amint arra a név is utal, a receptorok polipeptid lánca hétszer keresztezi a plazma membránt (I.2-4. ábra), az N-terminális extracellulárisan, míg a C-terminális intracellulárisan helyezkedik el. Az α-helikális transzmembrán (TM) doméneket extraés intracelluláris hurkok (EL és IL) választják el egymástól. Ezek a domének egy hordószerű konformációt hoznak létre a membránban, melyek közepén a ligand kötő hely található. Míg a receptor extracelluláris ligand kötő régiója variabilitást mutat, 26


Extracelluláris receptorcsaládok addig a transzmembrán és az intracelluláris részek nagy mértékben konzerváltak. A Cterminális cisztein maradékok palmitoilációja lehetővé teszi, hogy kapcsolat alakuljon ki a 7-TM receptor, valamint a koleszterolban és szfingolipidekben gazdag membrán mikrodomének („raft-ok”) között. Az IL2 és IL3 hurkok a G-fehérjékkel való asszociációban játszanak fontos szerepet (I.2-5. ábra) (lásd következő fejezet).

N N-Glikoziláció (Receptor ”folding, trafficking”)

EL1

EL2

EL3

Extracellulárishurkok (EL1-3) Plazma membrán

Interakciós felület Ligand-kötés

TM 1

Gα C-terminális farok Gα-kötés

TM 2

TM 3

TM TM TM 5 44

TM 6

TM 7

Transzmembrán hélix (TM1-7)

egyéb Gα felszínek Hélix 8 (Gβγ-kötés)

Intracellulárishurkok (IL1-3)

PKC foszforiláció (Deszenzitizáció)

IL1

E/DRY motívum (Receptor aktivitás és protein-protein interakció)

IL2

IL3

Palmitiláció (Lipid raft lokalizáció)

C

GRK foszforiláció (Deszenzitizáció)

PKC foszforiláció (Deszenzitizáció)

I.2-4. ábra: 7-transzmembrán receptorok szerkezete (7-TM)


27

Általános jelátviteli mechanizmusok Inaktív GPCR

Aktív GPCR

Oldalnézet

Agonista N

N

EL 3 EL2

Intracelluláris hurkok EL1 TM 5

TM 7

TM 6

TM 1

TM 7

TM 5 TM 3

TM 2

C

TM 1

TM 4

Extracelluláris hurkok

TM 6

C

TM 3

TM 2

IL3

TM 4

Gα

Gα

A Gα C-terminális farka

IL 1 IL2

Intracelluláris nézet Nem-kovalens kötés

C

C N

N

EL3

EL3 TM 7 TM 1 IL1

TM 2

IL3 TM 6 TM 3

EL1

TM 7

IL2

TM 5

Gα-kötő felület

TM 1 IL1

TM 4

EL2

TM 6

Gα

TM 2

TM 3 EL1

IL2

IL3 TM 5 EL2 TM 4

I.2-5. ábra: A 7-TM receptorok szerkezete 7-TM receptorok szabályozása (GPCR) (1) 7-TM receptor aktivációját a receptor C-terminálisának foszforilációja szabályozza. Ez létrejöhet a PKA (feedback foszforiláció), vagy a G-fehérje receptor kináz (GRK1-7) révén. (2) Transzlokáció: az aktív receptor internalizálódik az őt körülvevő membránnal együtt, defoszforilálódik savas vezikulában, majd újból a membrán felszínére kerül. (3) Arrestin kötés: arrestin molekulák kötődése meggátolja, hogy Gs fehérjék kötődjenek a receptorhoz (pl. a rodopszin a retinában); valamint alternatív útvonalakat is aktiválnak (pl. MAPK, PI3-K, PKB/Akt, Src) (I.2-6. ábra

28


Extracelluláris receptorcsaládok Deszenzitizált receptor

Aktív receptor

P

P

P

P

P

P

Arrestin ATP

ADP

GRK G-fehérje kapcsolt receptor kináz

I.2-6. ábra: A Receptor deszenzitizáció I.2.3

Enzim-kötött receptorok

Az enzim-kötött receptorok több alegységből álló transzmembrán fehérjék, melyek intracelluláris doménje saját (intrinsic) enzimatikus aktivitással rendelkezik, vagy a receptorok direkt asszociálódnak egy intracelluláris enzimmel (I.2-1. ábra, 23. oldal). Ligand kötés hatására konformáció változás jön létre a transzmembrán hélixben, ami az enzimatikus aktivitás kialakulásához és a jelátviteli kaszkád beindulásához vezet.

Receptorok, melyek saját enzim aktivitással rendelkeznek: (1) Receptor tirozin kinázok (RTK) (pl. PDGF, inzulin, EGF, VEGF és FGF receptorok) (I.2-7. ábra); (2) Receptor tirozin foszfatázok (pl. CD45 [cluster determinant-45] fehérje a Tsejteken és makrofágokon) (I.2-7. ábra és I.2-8. ábra); (3) Receptor guanilát ciklázok (pl. nátriuretikus peptid receptorok) (I.2-9. ábra) (4) Receptor szerin/treonin kinázok (pl. aktivin és TGF-β receptorok). (5) Tirozin-kináz asszociált receptorok: receptorok, melyek olyan fehérjékkel asszociálódnak, amik tirozin kináz aktivitással rendelkeznek. (citokin receptorok, T- és B-sejt receptorok, Fc receptorok) Identification number: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

29

Általános jelátviteli mechanizmusok Azok a receptorok, melyek saját tirozin kináz aktivitással rendelkeznek, autofoszforilációra és további szubsztrátok foszforilációjára is képesek. Több receptor azonban nem rendelkezik saját enzimaktivitással, hanem direkt fehérje-fehérje interakciók révén kötődik intracelluláris tirozin kinázokhoz (lásd lejjebb).

ATP

Foszforiláz kináz (szerin/treoninkináz)

Foszforiláz b Foszforiláz b

ADP

Foszforiláz a

P

Foszforiláz a

P

P Inaktív

Aktív

PP1c (szerin/treonin foszfatáz)

Foszforilálatlan

Inaktív p56Lck

p56Lck

Aktív p56Lck

CD45 (tirozin foszfatáz)

P

P

Y505

Y505

P Y394

Y394

Y394 ADP

ATP

Csk (tirozin kináz)

I.2-7. ábra: Kináz-foszfatáz egyensúly

30


Extracelluláris receptorcsaládok Receptor-szerű protein tirozin foszfatázok (PTP) (21) R1/R6

CD45 (RC)

R2B

PTPμ (RM) PTPκ (RK) PTPρ (RT) PTPλ (RU)

R2A

LAR (RF) PYPσ (RS) PTPδ (RD)

R4

PTPα (RA) PYPε (RE)

PTP domén PTP pszeudo-foszfatáz domén

PTPβ (RB) DEP1 (RJ) SAP1 (RH) GLEPP1 (RO) PTPS31 (RP)

PTPγ (RG) PYPζ (RZ1)

Nem-transzmembrán PTP-k(17) R8

R7

R3

R5

NT1

NT2

NT3

NT4

NT5

PTP1B (N1) TCPTPβ (N2)

SHP1 (N6) SHP2 (N11)

MEG2 (N9)

BDP1 (N18) PTP-PEST (N12) LYP (N220)

PTPH1 (N3) MEG1 (N14)

NT6

NT7

NT8

NT9

PTPD1 (N21) PTPD2β (142)

HDPTP (N23)

PTPTyP (N20)

PTPBAS (N13)

IA2 (RN) IA2β (RN2)

PCPTP1γ (RR) STEP (N5)

HePTP (N7)

Fibronektin III

Kadherin-szerű

Kináz-interakciós domén

SEC14 domén

PDZ domén

MAM domén

Glikozilált

RGDS motívum

Prolin-gazdag

BRO-1 homológia

IG-szerű

Karbonát anhidráz-szerű

Src homológia 2

FERM domén

Hisztidin domén

I.2-8. ábra: Protein Tirozin Foszfatázok

ANP

BNP

CNP

Nátriuretikus peptid P

Nátriuretikus peptid

P

Kináz

Receptor

NPR-C

NPR-A (GC-A)

NPR-B (GC-B)

ATP

Alap állapot Ligand-kötő domén P

P

Plazma membrán P P P P P P

Kináz homológia domén

P P P P P P

P P P P P

P P P P P

Hormon kötött

Deszenzitizált ATP

Hinge régió

ATP P

Foszfatáz

Guanilát-cikláz domén

GTP

cGMP

GTP

↑NP degradáció ↓cAMP? ↑ IP3?

↑ Vazorelaxáció ↑ Diurézis, natriurézis ↓ Renin, aldoszteron ↓ Sejt proliferáció ↓ Szív fibrózisa

P

cGMP GTP

Élettani válasz

P

↑ Vazorelaxáció ↓ Sejt proliferáció ↑ Hosszú csontok növekedése

cGMP

Aktív

I.2-9. ábra: Nátriuretikus peptid jelátvitel


31

Általános jelátviteli mechanizmusok I.2.3.1 Receptor tirozin kinázok

Bevezetés, definíciók A tirozin kinázok olyan jelátviteli fehérjék, melyek tirozin maradékokat képesek foszforilálni. A tirozin foszforiláció számos jelátviteli útvonal általános molekuláris eseménye. A tirozin kinázoknak két formáját különítjük el: (1) „Teljes” Receptor tirozin kinázok (RTK) sejtfelszíni receptorok, melyek saját kináz aktivitással rendelkeznek (azaz intracelluláris kináz doménnel rendelkeznek) [pl. növekedési faktor receptorok]. (2) „Hiányos” Nem-receptor tirozin kinázok (nRTK) citoplazmatikus vagy membrán kötött kinázok, melyek különböző sejtfelszíni receptorokhoz asszociálódnak és intracelluláris jelátviteli hálózatok felé közvetítik a receptorból érkező jelet [pl. Src családba vagy Syk családba tartozó kinázok].

A receptor tirozin kinázok családja és szerkezete Az emberi genomban 90 különböző tirozin kináz van, 58 közülük receptor tirozin kináz (RTK), melyek többsége növekedési faktor, citokin vagy hormon receptor (I.2-10. ábra). Az osztályok: I – EGFR család (ErbB); II – Inzulin receptor család; III – PDGF család; IV – FGF család; V – VEGF család; VI – HGF család (c-Met); VII – Trk család; VIII – Eph család; IX – AXL család; X – LTK család; XI – TIE család; XII – ROR család; XIII – DDR család; XIV – RET család; XV – KLG család; XVI – RYK család; XVII – MuSK család. Néhány közülük általánosan előfordul (EGFR), mások szövet specifikusan expresszálódnak (NGFR). Minden receptor tirozin kináz extracelluláris ligand kötő, transzmembrán és intracelluláris kináz domén(ek)ből áll. A ligand kötő domén szerkezete rendkívül 32


Extracelluláris receptorcsaládok variábilis, fibronektin III-, cisztein-gazdag-, VIII-faktor-szerű-, Ig-szerű-, leucingazdag-, EGF-szerű-, kringle-, C1r-szerű-, glicin-gazdag-, cadherin vagy savas box domének alkothatják, míg a transzmembrán és a kináz domének nagyfokú hasonlóságot mutatnak (I.2-10. ábra).

EGFR ErbB2 ErbB3 ErbB4

INSR IGF1R IRR

FGFR1 FGFR2 FGFR3 FGFR4

PDGFRα VEGFR1 Met PDGFRβ VEGFR2 Ron CSF1R VEGFR3 Sea Kit Kit2

Kináz

Cisztein gazdag

Fibronektin III

IG-szerű

Savas-box

Leucin-gazdag

TrkA TrkB TrkC

Axl Mer Sky

Tie Eph Ryk Tie2 Eck Eek Erk Elk Ehk1 Ehk2 Sek Hek Hek11 Cek-9 Myk-1 Myk-2

DDR Ros

Ret

Ltk Alk

Ror1 Ror2

Torpedo Torso

EGF-szerű

VIII-faktor-szerű

C1r-szerű

Kadherin

Glicine-gazdag

Kringle

I.2-10. ábra: Receptor tirozin kináz család Receptor tirozin kináz közvetítette jelátvitel RTK jelátvitel fő lépései (I.2-11. ábra, I.2-12. ábra és I.2-13. ábra): (1) Ligand kötődés (2) Dimerizáció (kivéve az inzulin receptort, mely tetramer szerkezetű) (3) Autofoszforiláció (4) Jelátviteli komplex (adapter fehérjék, kinázok stb.) Identification number: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

33

Általános jelátviteli mechanizmusok Ligand RTK

Dimerizáció

Plazma membrán P

P

Citoplazma

P P P P

P P

PI3K PDK1

GRB2

PLC

SOS

JAK

Ras

Akt

PKC

Src

Raf

STAT Erk

Transzkripció

Sejtmag Proliferáció

Túlélés

Migráció

Sejtciklus progresszió

I.2-11. ábra: Receptor tirozin kináz jelátviteli útvonal

34


Extracelluláris receptorcsaládok Növekedési faktor/Hormon

Plazma membrán

Receptor PTK

PI3K

SHC Y

Y

Y

Y

Y

Y

GRB2

SOS

Sejtplazma

RAS MEK

SRC

PKC

RAF MAPK

RSK

PLCγ FAK

Transzkripció szabályozás

Differenciáció Differenciáció/Növekedés Sejtmag

I.2-12. ábra: Tirozin kináz receptor közvetítette jel

Dimerizáció Plazma membrán

P

P

P

P

ATP

ATP

P

P P

Juxtamembrán régió

Citoplazma

P

P P

Aktivációs és katalitikus hurok (szubsztrát hozzáférése gátolt)

C-terminális régió

Aktivációs és katalitikus hurok (szubsztrát számára hozzáférhető)

I.2-13. ábra: A növekedési faktor receptor dimerizáció


35

Általános jelátviteli mechanizmusok A kezdeti jelátviteli komplex tagjai (I.2-14. ábra) : (1) enzimek/transzkripciós faktorok pl. Src/Syk család kinázai, SHP-1, PLCg, Sos, Vav, RasGAP, STAT1 (2) adapterek/szabályozók pl. Grb2, SLP-76, SOCS1, Nck, Shc, Crk-L, p85 (3) adapterek/dokkoló fehérjék pl. FRS2, IRS1, DOK1

Ligand RTK

Plazma membrán

P

P

PIP3

P P P P

P P P

P

P

GRB2 P

P P

GRB2

PIP2

GRB2

P P

PIP3

Targetek

PDK1

Akt

Targetek

Targetek

PI3K Shp2 GRB2

P

Shp2 GRB2

SOS

Ras

Erk

Targetek

Targetek

Ligand RTK P

Plazma membrán

P

PIP2

P P P P

P P

PH

PLC

SH2

SH2

IP3

Ca2+

DAG

PKC

SH3

PLC

Citoplazma

C2

P

Cbl

I.2-14. ábra: Növekedési faktor receptor jelátviteli utak Ligand kötés hatására a receptor tirozin kinázok dimerizálódnak, és kináz doménjük tirozin maradékai autofoszforilálódnak. Ez a folyamat a kezdeti jelátviteli komplex kialakulásához vezet, melyben adapter/dokkoló fehérjék is részt vesznek 36


Extracelluláris receptorcsaládok (I.2-14. ábra). Ezek az adapter fehérjék Src-homológia (SH) doménekkel rendelkeznek: az SH2 domének a receptorok autofoszforilálódott tirozin maradékaihoz kötődnek; míg az SH3 domének további jelátviteli molekulák prolinban gazdag doménjeihez asszociálódnak, mint pl. a guanin nukleotid kicserélő faktorhoz (guanine-nucleotid exchange factors -GEF; pl. Sos, Vav). A GEF a monomer G-fehérjék- Ras - GDPGTP kicserélődését katalizálja. A G-fehérjék központi szerepet játszanak abban, hogy a növekedési faktor receptorokból jeleket közvetítsenek (I.2-14. ábra). A GTP-kötött Ras aktív és aktiválja a mitogén aktivált protein kináz (MAPK) jelátviteli útvonalat. A Ras fehérjék csak alacsony GTP-áz aktivitással rendelkeznek, ezért gyors inaktivációjukhoz GAP-re (GTPase activating protein, GTPáz aktiváló fehérje) is szükség van.

A jelátviteli utak elágazódásai A RTK aktiválódása több intracelluláris jelátviteli utat indít el (I.2-11. ábra, 34. oldal): (1) Ras – Raf – MEK – ERK (MAPK út) (2) PLCγ – IP3 – Ca2+ (lásd I.5.3. fejezet, 63. oldal) (3) PLCγ – DAG – PKC (lásd I.5.3. fejezet, 63. oldal) (4) PI3 kináz (PI3K) - Protein kináz B (PKB) - Glikogén-szintáz kináz (GSK) (5) STAT aktiváció

A MAPK jelátviteli út A Ras aktiválja a Raf (MAP3K) szerin/treonin protein kinázt. A Raf a MEK-et (MAP2K) foszforilálja, mely egy kettős specificitású kináz, azaz célfehérjéjét tirozinon és treoninon is képes foszforilálni. A MEK szubsztrátja az ERK (MAPK), ami egy prolin-irányított kináz és a célfehérjéit szerin/treonin-prolinon képes foszforilálni. Az


37

Általános jelátviteli mechanizmusok ERK-nek számos célfehérjéje van, képes a sejtmagba transzlokálódni és ott különböző gének transzkripcióját befolyásolni. A MAPK által aktivált kinázok (MK) a következők: (1) Citoplazmatikus Riboszómális S6 kináz (RSK) [pl. transzláció iniciáló faktor, apoptozis, ösztrogén receptor, Sos]. Bizonyos estekben a foszforilált formájuk képes a sejtmagba transzlokálódni [pl. ATF4, c-Fos, SRF]. (2) Mitogén- és stressz- aktiválta kinázok (MSK) a sejtmagban fordulnak elő [pl. CREB, hiszton H3, HMGN1, ATF1]. (3) MAPK-interakciós kinázok (MNK) a transzlációt beindító komplex (translation initiation complex) tagjai.

RTK-ok

Integrinek

Ca2+ Ion csatornák Ca2+

Pax

RTK-ok

Tal

Rap1

SOS Shc GRB2 FRS2 IRS

CAS FAK

C3G

CRK

Ras

SOS GRB2

Fyn

PLCγ

PI3K Spry

Citoplazma

Src PAK cAMP

Rac

elF4B B-Raf rpS6

Spred

PKA

c-Raf

PKC

14-3-3 B-Raf

IκBα

Tpl2/ Cot1

c-Raf

Heterodimer p90RSK

Filamin A

PD98059 U0126

Ca2+

PYK2

PP1/ PP2At

MEK1/2

IMP

MEK1

C-TAK1

Erk1

KSR GSK-3 METTL1

eEF2 Kináz

DAPK nNos

BAD

TSC2

SOS

MNK1/2

Citoszkeletális fehérjék

Erk1/2 Bim

C/EBPβ Ran BP3

MITF ATF4

p90RSK

Nur77 Mad1

ERa ETV1

BUB1

C-Fos Myt1

SRF TIF1A

Transzláció kontroll Késői endoszóma Ion csatornák, receptorok

MPK-3

Sejt adhézió

PEA-15

PPARγ

P27 KIP1

P14 MP1

cPLA2

MSK1/2

ETV1

ATF1

HMGN1

Hiszton H3

Erk1/2

CREB

cdc25 Sejtciklus progresszió

MPK-1/2

FoxO3 Pax6

Sejtmag

TIF1A

Elk-1

Ets

ER

C-Myc/ N-Myc

C-Fos

UBF

Stat1/1

I.2-15. ábra: MAPK/ERK a növekedésben és differenciációban Több MAPK kaszkád létezik egymással párhuzamosan és ezeket különböző jelek aktiválják. A fent leírt „prototípus” MAPK jelátviteli út az ERK-út, amit mitogén jel aktivál (I.2-15. ábra). A sejtet ért stressz vagy citokin hatás a Jnk- vagy p38 38


Extracelluláris receptorcsaládok útvonalakat

aktiválja.

A

MAPK

kaszkád

tagjainak

intracelluláris

térbeni

elrendeződését scaffold fehérjék szabályozzák [pl. IMP, KSR1].

A jelátviteli út leállítása A MAPK- jelátviteli út szabályozása elengedhetetlen ahhoz, hogy a sejtek növekedése és differenciációja kontroláltan menjen végbe. Az aktiváció leállítását részben foszfatázok végzik [pl. PTP1B, SHP1/2, DEP1], amik defoszforilálják a jelátviteli út aktivált molekuláit. A GEF foszforilációja (pl. Sos) csökkenti az adapterek iránti affinitást (pl. Grb2), mely a kezdeti jelátviteli komplex disszociációjához vezet. A GAP fehérjék a Ras-t inaktiválják azáltal, hogy a GTP-t GDP-re cserélik. Végül a sejtfelszíni receptorok endocitózissal történő eltávolítása szintén hozzájárul az aktivitás leállításához.


39


I.3

Intracelluláris receptorok

Lásd II.2.3. fejezet:

Az intracellularis/nukleáris receptor jelátvitel (szteroid hormonok és a tiroxin), 110. oldal.

40


Intracelluláris jelátviteli molekulák

I.4


I.4.1

G-fehérjék

Trimer G-fehérjék A 7-TM receptorok G-fehérjékhez (=GTP-kötő fehérjék) kötődnek, ezért G-protein kötött receptornak (GPCR) is nevezzük őket (I.4-1. ábra). A G-fehérjék a receptor intracelluláris IL2 és IL3 részeihez kötődnek. A trimer G-fehérjék α-, β- és γ alegységekből álló komplexek. Inaktív formában a G-fehérje α alegysége GDP-t köt. Ligand kötés hatására a GDP GTP-re cserélődik, ami egy aktív formát eredményez. Az aktív Gα disszociál a komplexről és effektor fehérjékhez asszociálódik. Végül a GTP-t a Gα hidrolizálja és az inaktív Gα újból asszociálódik a Gβγ-7-TM receptor komplexhez. A Gγ alegység C-terminális izoprenil lánccal rendelkezik, ami az alegységet a plazma membránhoz horgonyozza (I.4-1. ábra). Funkciójuk alapján különböző Gα alegységeket különítünk el: (1) a Gαs: az adenilát-cikláz aktivációja révén emelkedett cAMP szintet eredményez, (2) a Gαi: az adenilát-cikláz gátlása révén csökkent cAMP szintet eredményez, (3) a Gαq: PLC-t aktivál és (4) a G12: RhoGEF-et aktivál. Az aktivált Gβγ alegységek K+- és Ca2+- csatornákat, valamint PI3-kináz izoformákat aktiválnak (I.4-2. ábra).


41

Általános jelátviteli mechanizmusok Jel molekula

G-fehérje kapcsolt receptor (GPCR)

α GDP

β

γ

α

γ

β

α

GDP

Inaktív G-fehérje

β

γ

GTP

GDP

GTP

Plazma membrán

α

Citoplazma

β

α

γ

β

γ

GTP

GTP

Aktivált G-fehérje alegységek

I.4-1. ábra: 7-TM receptorok (G-fehérje kapcsolt receptorok, GPCR)

G-fehérje kapcsolt receptor (GPCR)

Plazma membrán

α

Citoplazma

β

γ

GDP

α β

GTP

ATP

Giα

Gsα

Gqα

GTP

GTP

GTP

Adenilát cikláz

cAMP

ATP

Adenilát cikláz

G12/13α

γ

Ion csatorna PI3K Foszfolipázok Adenilát ciklázok Receptor kinázok

GTP

PLC cAMP

PIP2

DAG

Rho-t aktivál

IP3 Foszfolipázok Ion csatornák Ca2+

I.4-2. ábra: G-fehérjék

42


Intracelluláris jelátviteli molekulák Monomer G-fehérjék - Ras A monomer G-fehérjéket először transzformáló onkogénként fedezték fel Harvey (HRas) és Kirsten (K-Ras) szarkóma vírusokban; ezért az elnevezésük Ras (=Rat sarcoma). Az N-Ras-t először neuroblasztómában mutattak ki. A Ras egy 189 aminosavból álló polipeptid, amit lipid láncok horgonyoznak a membránhoz. Kiemelkedő fontosságukat az mutatja, hogy a Ras család valamely tagjának (Ras, Rho, Rab, Rap, Rheb) mutációja az emberi daganatok 20-30%-ában kimutatható. Az onkogén pontmutáció leggyakrabban a Ras GTP-kötő régióját érinti. A Ras aktivációját a guanin-nukleotid kicserélő faktorok (GEFs) szabályozzák, amik a Ras GDP-GTP kicserélődést katalizálják és Ras aktivációt idéznek elő. A Ras aktiváció másik szabályozója a GTPáz aktiváló fehérje (GAP), ami a Ras saját GTPáz aktivitását fokozza, így a Ras inaktivációjához vezet. A Ras a növekedési faktor receptor közvetítette jelátvitelben vesz részt a Ras-Raf-MEK-ERK (mitogén-aktivált protein kináz=MAPK) kaszkádon keresztül (I.2-15. ábra, 38. oldal). A fokozott Ras aktivitás (=„állandóan aktív Ras”) elősegíti a tumor transzformációt, pl. pontmutáció miatt bekövetkező fokozott G-nukleotid kicserélődés, GTPaz aktivitás, GAP hiány vagy inaktivitás révén.

I.4.2

Másodlagos messengerek

A másodlagos messengerek definíciója és típusai A jelátvitel egyik legfontosabb kérdése, hogy a ligand (hormon, peptidek, citokinek stb.), által aktivált extracelluláris receptorokból érkező információ, vagyis az extracelluláris jel, hogyan alakul át és hogyan érvényesül a sejtben. A jelátvitel ezen második szinjét a másodlagos messenger molekulák szabályozzák. A másodlagos Identification number: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

43

Általános jelátviteli mechanizmusok messengerek

kémiai

tulajdonságaikat

tekintve

nagyon

különbözőek,

lehetnek

(1) hidrofil molekulák pl. cAMP, cGMP, IP3, Ca2+; (2) hidrofób molekulák (lipidek) pl. diacil-glicerol (DAG), foszfatidilinozitolok; vagy (3) gázok: NO, CO, (H2S).

3’-5’ciklikus-AMP (cAMP): az „első” másodlagos messenger Az 1950-es években E. W. Sutherland felfedezte, hogy az adrenalin cAMP közvetítésével fejti ki hatását a májban. Ezért a felfedezéséért kapta 1971-ben az Élettani és Orvosi Nobel-díjat. A cAMP-t ATP-ből az adenilát-cikláz szintetizálja és a cAMP-foszfodiészteráz bontja le. A cAMP a protein kináz A-t aktiválja, a molekula regulátoros alegységéhez kötődve. A PKA célfehérjéi között találunk enzimeket, strukturális fehérjéket és transzkripciós faktorokat, mint a CREB (cAMP-responsive element binding factor, cAMP válasz elem kötő faktor) (I.4-3. ábra és I.4-4. ábra).

Gα-függő csatorna

α

β

γ

cAMP-függő csatorna

α

α

GTP

GTP

Adenylyl cyclase

PO4-függő csatorna

cAMP

Receptor

P P

GTP ATP

cAMP ADP

R

C

R

C

Inaktív PKA

cAMP cAMP R cAMP R cAMP

ATP

cAMP cAMP R

CREB C

C

C

C cAMP R cAMP

Aktívált PKA

P CREB CRE

P CREB

Gén expresszió Sejmag

cAMP Response Element

I.4-3. ábra: cAMP-PKA útvonal

44



ACTH

LH

FSH

Szekretin

Adrenalin

Glukagon

Adenilát cikláz ATP

cAMP

I.4-4. ábra: Több receptor, amelyek ugyanazt a másodlagos messenger rendszert használják IP3 és DAG A foszfolipáz C a plazma membránban található foszfatidil-inozitol-4,5-biszfoszfátot (PIP2) bontja szolubilis inozitol-triszfoszfátra (IP3) és membrán kötött diacil-glicerolra (DAG). A IP3 az intracelluláris Ca2+- szint emelkedését indukálja, a DAG a protein kináz C-t (PKC) aktiválja (I.4-5. ábra).

Hormon Ca2+ csatorna

Pumpa

Receptor

Plazma membrán Ca2+

α GTP

β

γ

PIP2

DAG α

Citoplazma

PLC

GTP

G-fehérje Ca2+

IP3

- + IP3 IP3R

Ca2+

Ca2+ Ca2+

Ca2+

Ca2+ Ca2+

Ca2+

Pumpa Simaizom endoplazmatikus retikulum lumene

I.4-5. ábra: IP3 receptor útvonal


45

Általános jelátviteli mechanizmusok Nitrogén-monoxid (NO) és egyéb gázok Számos kutatócsoport egymástól függetlenül jutott arra a felfedezésre, hogy endotél sejtek olyan mediátor(ok) termelésére képesek, amik vazodilatációt okoznak. 1983-ban bebizonyosodott,

hogy

az

„endothelium-derived

relaxation

factor”

(EDRF)

tulajdonképpen a NO. A NO „karrierje gyorsan ívelt felfelé”: 1992-ben az „év molekulájának” nevezte el a Science tudományos folyóirat, megalapították a „Nitrogén Monoxid Társaságot” és a NO felfedezéséért 1998-ban Élettani és Orvosi Nobel-díjat kapott F. Murad, R. F. Furchgott és L. Ignarro. A NO-ot a NO-szintáz szintetizálja, melynek három formája ismert: az endotél sejtek

folyamatosan

expresszálják

az

eNOS-t;

az

iNOS

indukálható

(pl.

makrofágokban); az nNOS pedig neuronokban expresszálódik. A NOS-nak 2 fő doménje van: az N-terminális oxigenáz (hasonló a hem-tiolát fehérjékhez), a Cterminális reduktáz (hasonló a NADPH-citokróm P450 reduktázhoz) és egy linker: kalmodulin kötő szekvencia. A NO L-argininből szintetizálódik, a kémiai reakció során az L-arginin citrulinná alakul NO képződése közben. A NO egy rendkívül aktív szabadgyök, mely oxidatív stresszt indukál. A simaizom sejtekben a NO a guanilát-ciklázt aktiválja, ami a GTP-t cGMP-vé alakítja. A cGMP a protein kináz G-t egy szerin/treonin protein kinázt aktivál. A PKG-t vaszkuláris simaizom sejtek, trombociták, endotél sejtek, a szívizom, fibroblasztok, leukociták, a vese és az idegrendszer sejtjei expresszálják. A kináz részt vesz a simaizom relaxációjában, a trombocita funkció szabályozásában, a spermium sejtek anyagcseréjében, a sejtosztódásban és a nukleinsav szintézisben.

46


Intracelluláris jelátviteli molekulák A NO hatásait orvosi terápiában is alkalmazzák: (1) Vazodilatáción alapul az erekre kifejtett hatása pl. nitroglicerint alkalmaznak koronária betegségek kezelésére (Angina pectoris). Erekciós diszfunkció estén is alkalmazzák, mert a pénisz ereiben is vazodilatációt okoz (Viagra). (2) A szívizomra gyakorolt hatásai révén csökkenti az izom kontraktilitását és a szívfrekvenciát. Az immunrendszerben a makrofágok a baktériumok elpusztítására termelnek NOot, DE súlyos szisztémás fertőzés esetén (szepszis), a fokozott NO termelés generalizált vazodilatációhoz és SOKKHOZ vezethet (szeptikus sokk).

A Ca2+-jel

I.4.3

A Ca2+ élettani szerepe S. Ringer fedezte fel, hogy Ca2+ jelenlétében az izolált béka szív órákig megtartja aktivitását, ezért a Ca2+ nélkülözhetetlen a szív működéséhez. Locke írta le, hogy a Ca2+ hiánya gátolja a neuromuszkuláris ingerületátvitelt. Kamada és Kimoshita fedezték fel 1943-ban, hogy ha Ca2+-ot juttatnak az izomrostokba, az izomrostok összehúzódnak. Although Otto Loewi mondta, hogy „Ca2+ ist alles.” (=a Ca2+ minden). A Ca2+ volt a cAMP-t követően azonosított második másodlagos messenger. A Ca2+ -ot 3 formában találjuk meg a szervezetben: szabad vagy kötött formában, vagy komplexek részeként (hidroxiapatit kalcifikálódott szövetekben pl. csont, fog). A plazma Ca2+-szintje szigorúan szabályozott, mivel a hiperkalcémia csökkent neuromuszkuláris átvezetéshez, szívizom diszfunkcióhoz és letargiához vezet, míg a hipokalcémia megnövekedett membrán ingerlékenységet, tetániás rohamot és halált okozhat. Identification number: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

47

Általános jelátviteli mechanizmusok A Ca2+-szintje a plazmában vagy extracelluláris folyadékban 1-2mM; az intracelluláris térben/ citoplazmában 50-100nM, az intracelluláris Ca2+ raktárokban pedig 30-300mM. A citoplazmatikus Ca2+- szintet a plazmában és az ER-ban (SERCA) található Ca2+-ATPázok és a plazma membrán Na+/Ca2+ kicserélői szabályozzák. Az ionofórok lipid oldékony, membrán pepmeábilis ion-szállítók pl. az A23187 (524kDa) vagy az ionomicin (709kDa), amit Streptomyces fajból izoláltak.

Az intracelluláris Ca2+- szint mérése (1) Klasszikusan az intracelluláris Ca2+-koncentráció változásának kimutatására Ca2+ szenzitív fotofehérjéket például Aequorin-t [melyet medúzából (Aequoria victoria) izoláltak] használtak. Ha Aequorin-t mikroinjektáltak a célsejtekbe [pl. óriás tintahal axonba] és ezt követően stimulálták azokat, az Aequorin Ca2+-kötés hatására kék fényt emittált. (2) Fluoreszcens indikátorokat, például Quin-2, Fura-2 (UV) vagy Fluo-3, Fluo4 (látható fény) használhatunk sejt szuszpenziókban az intracelluláris Ca2+szint

meghatározására.

A

méréseket

áramlási

citométerrel

vagy

spektrofotométerrel végezhetjük. Ebben az esetben a kapott jel az egyedi szinkronizálatlan események összességét mutatja. Egy sejt vizsgálata fluoreszcens vagy konfokális mikroszkóppal lehetséges. Ilyenkor a Ca2+-jel tüske vagy hullám formájában jelenik meg. (3) Genetikailag tervezett indikátorokat pl. aequorin-transzfektált sejteket vagy kalmodulin-miozin könnyű lánc kináz-GFP-t is lehet Ca2+ mérésre használni.

48


Intracelluláris jelátviteli molekulák Foszfolipáz Cγ (PLCγ) közvetítette Ca2+ -jel A sejtfelszíni receptorokból érkező jelek (pl. GPCR) a PLCγ aktivációjához vezetnek. A PLCγ egy membrán közeli jelátviteli fehérje, ami a foszfatidil-inozitol-biszfoszfátot (PIP2) inozitol-triszfoszfátra (IP3) és diacil-glicerolra (DAG) bontja. Az IP3 Ca2+ -ot szabadít fel az endoplazmás retikulumból, míg a DAG a protein kináz C-t (PKC) aktiválja. Ez a lépés a PLCγ jelátvitel fontos elágazási pontja (I.4-5. ábra, 45. oldal). Az útvonalat számos extracelluláris stimulus aktiválja, amiket különböző receptorok közvetítenek (I.4-6. ábra).

Depolarizáció/ Feszültség CRAC Ca2+

Acetilkolin, Glutamát, Szerotonin, ATP

Antigén BCR

DHPR Feszültség Ligandfüggő függő csatorna csatorna

Hormonok, Neurotranszmitterek, Növekedési faktorok, Hormonok, Neurotranszmitterek Ozmolaritás

Növekedési Antigén faktorok TCR

RTK

Src

GPCR

RAS

β γ

TRPC TRPA TRPV

Fény, Szag, Íz molekulák

PMCA

NCX

Ca2+

Ca2+

GPCR

CNG

G14/15 Gq/11

GI/0

Gs,Golf, Gt

DAG PIP2

PIP2

Ca2+

PIP2

PLCγ

PLCε

PLCβ

DAG

DAG

DAG

PIP2

Na+

PLCδ

AC Ca2+

cAMP

Ca2+ Ca2+

ADP-ribóz, Arachidonsav, Szfingozin

IP3 IP3R

ATP

Ca2+

Ca2+

GC cGMP

GTP

GC

Ca2+

RyR IP3R

PKC NAADP

Ca2+

Sph

Ca2+ Ca2+

RyR

Ca2+ Ca2+

cADPR

PMR1

Ca2+

Ca2+ Ca2+

Ca2+ Ca2+

Ca2+

P

Ca2+

HDAC RyR

Calm

CamK-IV

Ca2+

NFAT

CBP

CREB

MEF2

p300

SERCA Cain

Ca2+

IP3R

Mitokondriális uniporter

Gén expresszió

Na+/H+ cserélő

Ca2+

Hipertrófia

PTP

I.4-6. ábra: A Ca2+-jel számos útvonal része


49

Általános jelátviteli mechanizmusok Az endoplazmatikus retikulum Ca2+ -csatornái (I.4-7. ábra) (1) Rianodin receptor (RyR): ingerelhető sejtekben expresszálódik (váz- és szívizom) és négy 560 kDa-os alegységből áll. Működését a Ca2+, ATP, kalmodulin, FKBP12 (immunofilin) szabályozzák. (2) IP3 receptor (IP3R): négy 310 kDa-os alegységből áll.

Ca2+-csatorna (ligand-függő)

Ca2+ -csatorna (feszültség-függő)

Ca2+ -csatorna (Ca2+-raktár kiürülése szabályozza)

Ca2+

Ca2+

Külső Ca2+ készlet (mM) Ca2+

NCX

Ca2+

Ca2+

Belső Ca2+ készlet (~100 nM)

Szolubilis Ca2+-szenzor fehérjék SERCA pumpa MNCX Ca2+ Ca

Ca2+

2+

Ca2+

Sejtmag

Uniporter ER csatorna

Ca2+

Endoplazmatikus retikulum Mitokondrium

I.4-7. ábra: Az intra/extracelluláris Ca2+- jelátvitel kompartmentjei, Ca2+-csatornák Ca2+-indukálta Ca2+ felszabadulás (CICR) Ha a citoplazmatikus Ca2+- szint emelkedik, a szomszédos Ca2+-csatornák fokozatosan aktiválódnak és kinyílnak, ami egy Ca2+ „hullám” kialakulásához vezet. Ez egy pozitív feedback folyamat. 50


Intracelluláris jelátviteli molekulák Az IP3 mellett, „Alternatív” Ca2+ -felszabadító másodlagos messengerek is léteznek (1) A ciklikus-ADP-ribózt (cADPR) az ADP-ribozil cikláz állítja elő (pl. CD38 ektoenzim). A hasnyálmirigy β-sejtjeinek glükózra adott válaszában és a Tsejt jelátvitelben játszik szerepet. (2) A nikotinsav adenin dinukleotid foszfátot (NAADP) először a tengeri csillag petéjében írták le. A CCK serkenti a NAADP termelődést és szerepet játszik a hasnyálmirigy acinus sejtjeinek működésében és a T-sejt jelátvitelben. (3) Szfingozin-1-foszfátot (S1P) a szfingozin-kináz szintetizálja ceramidból Fc receptor, növekedési faktor receptor (PDGF, VEGF), vagy citokin receptor (IL-1, TNFa) aktivációját követően. S1P szállítását a membránon keresztül az ABCC1 végzi, sejtfelszíni receptorok: S1P1, S1P5.

Ca2+-beáramlás a plazma membrán csatornákon keresztül (I.4-7. ábra, 50. oldal) (1) Feszültség-függő csatornákat (VOCCs) ideg- és izom sejtekben találunk. A csatornák depolarizáció hatására nyílnak meg. L, N, P/Q, R és T típusait különítjük el. (2) Receptor-függő csatornák (pl. Glutamát NMDA receptora). (3) TRPM2 csatornákat az ADP-ribóz vagy az oxidatív stressz aktiválja.

Raktár-függő Ca2+-belépés (SOCE) A folyamat kapacitatív Ca2+ belépésként (1986.) is ismert. Ha az intracelluláris kalcium raktárak kimerültek, a plazma membrán Ca2+ -csatornái megnyílnak és az extracelluláris térből Ca2+ áramlik a sejtekbe. A folyamatban TRP (transient receptor potential) fehérjék, CRAC (Ca2+ release-activated Ca2+ current) csatornák pl. Orai 1 (33kDa) és a


51

Általános jelátviteli mechanizmusok STIM1 (77kDa Ca2+- szenzor transzmembrán fehérje az ER-ban) vesznek részt. A STIM1 három potenciális mechanizmus révén fejti ki hatását: (1) Az ER és a plazma membrán direkt interakciója (2) STIM1 mozgása az ER-ból a plazma membránhoz (3) Szolubilis mediátorok révén– CIF (Ca2+-influx factor) (1993.)

Ca2+-szabályozta célfehérjék (1) Kalmodulin-függő (I.4-8. ábra): A kalmodulin foszforilálja a CaM kinázt, az EF2 kinázt, a foszforiláz kinázt és a miozin-könnyű lánc kinázt (MLCK); és defoszforilálja a kalcineurint, ami pedig az NFAT-t (Nuclear Factor of Activated T cells) aktiválja. A kalmodulin szabályozza a Ca2+ szállítást a plazma membrán Ca2+-ATPáz révén, a ciklikus nukleotid anyagcserét az adenilát-cikláz és a ciklikus nukleotid foszfodiészteráz révén, valamint a sejtváz komponensek (pl. MAP-2, Tau, fodrin, neuromodulin) és a nitrogénoxid szintáz működését (NOS). (2) Kalmodulin-független célfehérjék: a) Idegi Ca2+-érzékelők b) Kalpain (Ca2+-aktivált Cys protáz) c) Szinaptotagmin – exocitózis d) DAG kináz – DAG inaktiválása e) Ras GEF és GAP fehérjék f) Sejtváz fehérjék: aktinin, gelszolin

52


Intracelluláris jelátviteli molekulák Fehérje foszforiláció

Nitrogén-monoxid képződés

Ca2+

CaM kináz I,II és IV Elongációs faktor-2 kináz Foszforiláz kináz Miozin könnyű lánc kináz

Kalmodulin

Fehérje defoszforiláció

Citoszkeleton

Kalcineurin

MAP-2 Tau Fodrin Neuromodulin

Ca2+ transzport

Ciklikus nukleotid metabolizmus

Plazma membrán Ca2+ ATPáz

Adenilát cikláz Ciklikus nukleotid foszfodiészteráz

I.4-8. ábra: A Ca2+-jelátvitel effektor mechanizmusai A Ca2+- kötés szerkezeti alapja: (1) EF-kéz motívumok: hélix-hurok-hélix-ek, a hurok ~12 aminosavból áll, kialakítja a Ca2+-kötő helyet, és általában párokat (=egység) hoz létre. (2) C2 domén ~130 aminosavból épül fel, merev 8-szálú antiparalel β-lemezt alkot.

I.4.4

Transzkripciós faktorok

Definíció A transzkripciós faktorok (TF) szekvencia specifikus DNS-kötő faktorok, amik a genetikai információ DNS-ről mRNS-re történő átíródását szabályozzák. Lehetnek aktivátorok (=gének expresszióját serkentik) vagy represszorok (=gátolják a gén expressziót) azáltal, hogy az RNS polimeráz traszkripciót iniciáló komplexhez való kötődését befolyásolják (I.4-9. ábra).


53

Általános jelátviteli mechanizmusok Poszt-transzkripciós szabályozás MikroRNSek, alternatív splicing, alternatív poliadeniláció, RNS-kötő fehérjék stb.

miRNS-ek

TF

TF

mRNS-ek

Transzkripció szabályozás Transzkripciós faktorok, kromatin állapota, kombinációs kontroll, ko-faktorok, alternatív promóterek stb.

I.4-9. ábra: A transzkripció szabályozása Csoportosításuk funkciójuk alapján (1) Általános transzkripciós faktorok: állandóan aktívak, minden sejtben, mindig megtalálhatóak, TATA box-hoz kötődnek, preiniciációs komplexet alkotnak pl. TFIIA-H. (2) Specifikus transzkripciós faktorok/upstream transzkripciós faktorok csak bizonyos esetekben aktívak (I.4-1. táblázat). A) Fejlődés során (sejt specifikus) pl. GATA, MyoD, Hox, Winged hélix B) Jeltől függően a) extracelluláris ligand (pl. sejtmag receptorok) b) intracelluláris ligand (pl. SREBP, p53) c) sejt membrán receptor függő d) rezidens sejtmagi pl. CREB, AP-1, Mef-2 e) látens citoplazmatikus pl. STAT, NFAT, NFkB, Notch

54


Intracelluláris jelátviteli molekulák I.4-1. táblázat: Néhány fontos transzkripciós faktor Reprezentatív transzkripciós faktorok

Funkciók

Hox

Hoxa-1, Hoxb-2, etc.

Tengely kialakulása

POU

Pit-1, Unc-86, Oct-2

Hipofízis fejlődés, idegrendszeri fejlődés

LIM

Lim-1, Forkhead

Fej fejlődés

Pax

Pax1, 2, 3, etc.

Idegi specifikáció; szem fejlődés

Bázikus hélix-hurokhélix (bHLH)

MyoD, achaete, daughterless

Ideg és izom specifikáció; Drosophila nemének meghatározása

Bátikus leucin cipzár (bZip)

C/EBP, AP1

Máj fejlődés; zsír sejt specifikáció

Standard

WT1, Krüppel, Engrailed

Vese, gonád és makrofág fejlődés, Drosophila segmentáció

Nukleáris hormon receptorok

Glükokortikoid receptor, ösztrogén receptor, tesztoszteron receptor, retinolsav receptor

Másodlagos nem meghatározás ; craniofaciális fejlődés, végtag fejlődés

Sry-Sox

Sry, SoxD, Sox2

DNS görbület; emlős elsődleges nem meghatározás; ektoderma differenciáció

Család Homeodomén

Zink ujj

A gén transzkripció komplexen szabályozott folyamat: az alap transzkripciós gépezet (általános transzkripciós faktorok és az RNS polimeráz) számos ko-regulátorral lép interakcióba (specifikus transzkripciós faktorok). Az aktivátorok a DNS enhancer, a represszorok a DNS csendesítő elemeihez kötődnek a TATA box-tól upstream (5’ vég felé), habár az ilyen szabályozó DNS-elemek pontos helye nagy mértékben variábilis.

Szerkezet A transzkripciós faktorok általában (1) egy DNS-kötő doménből (DNA-binding domain, DBD), (2) egy jelérzékelő doménből (signal-sensing domain, SSD) és (3) egy transzakcivációs doménből (transactivation domain, TAD) állnak (I.4-10. ábra). A DBD a DNS response elemekhez (DNA response element, DNS válasz elem) való direkt kötődésért felelős. A SSD az extracelluláris jeleket érzékeli pl. ligand kötés, míg a TAD a transzkripcóis ko-regulátorokkal lép kölcsönhatásba. A legtöbb transzkripciós Identification number: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

55

Általános jelátviteli mechanizmusok faktor hélix-hurok-hélix, cink-ujj vagy leucin-cipzár motívumokat tartalmaz és dimer formájában kötődik a DNS-hez (I.4-11. ábra).

Transzaktiváció

Dimerizáció Hinge régió

N-terminális domén

A/B

C

D

DNS-kötő domén (DBD)

C-terminális domén

F

E Ligand-kötő domén (LBD)

Ligand

I.4-10. ábra: A transzkripciós faktorok funkcionális doménjei

56


Intracelluláris jelátviteli molekulák Bázikus hélix-hurok-hélix

Hélix

Cink-ujj transzkripciós faktorok

Hélix

C C

Hurok

Hurok

Hélix

C

Transzaktiváció

Hélix

Zn

H

C

Zn

H H

H

DNS kötés

Transzaktiváció

Bázikus leucin cipzár

DNS-kötő domén

DNS-kötő domén

H2N

NH2

I.4-11. ábra: A transzkripciós faktorok csoportjai szerkezetük alapján A transzkripciós faktorok csoportjai szerkezetük alapján (Szuperosztályok): (1) Hélix-hurok-hélix pl. MyoD, c-Myc (2) Leucin-cipzár pl. AP-1, CREB (3) Cink-koordinált DNS-kötő domén pl. cink ujj: a szeroidok magreceptorai, tiroid hormon; GATA faktorok (4) Hélix-turn-hélix pl. Homeobox; Forkhead / Winged hélix (5) Béta scaffold faktorok, melyek a DNS kisebb görbületéhez kapcsolódnak pl. NFkB. NFAT, STAT, p53 (6) Egyebek

Transzkripciós faktorok szabályozzák a T-sejt differenciációt A T-limfociták az adaptív immunológiai folyamatok központi szereplői. Közös limfoid prekurzorból származnak, majd a korai progenitorok a tímuszba vándorolnak, ahol Identification number: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

57

Általános jelátviteli mechanizmusok centrális differenciációs lépéseken mennek keresztül, amiket a transzkripciós faktorok szigorúan szabályoznak (I.4-12. ábra). Végül a helper (CD4+) vagy citotoxikus (CD8+) T-sejtek elhagyják a tímuszt, ezt az irány elköteleződést (lineage decision) is tanszkripciós faktorok szabályozzák (I.4-13. ábra). A perifériás limfatikus szervekben megy végbe a naïve CD4+ T-sejtek végső differenciációja: Th1, Th2, Th17 és Treg alcsoportok alakulnak ki, amit a T-bet, GATA-3, RORγ és FoxP3 transzkripciós faktorok szabályoznak (I.4-14. ábra).

HES-1, GATA-3

Sox4, HEB, NFATc

Transzkripciós faktorok Ikaros

Felszíni receptorok

E2A, STAT5

Notch-1

c-Kit, IL-7Rα-γc

TCF-1-Lef-1, NF-κB, p53

Frizzled receptor, Halál receptor, pre-TCR

TCRαβ CD4CD8+

SP CD44+ CD25-

HSC

DN1

CD44+ CD25+

DN2

CD44CD25+

DN3

CD44CD25-

DN4

CD4+ CD8+

DP

β-szelekció

Elköteleződés

Pre-TCR ellenőrző pont

CD4+ CD8-

TCRαβ Ellenőrző pont

SP

I.4-12. ábra: Transzkripciós faktorok szerepe a timociták fejlődésében

58


Intracelluláris jelátviteli molekulák Elköteleződés Pozitív szelekció

Utó-elköteleződés

CD8+ CD4-

Nincs TOX RUNX Nincs RUNX TOX CD4hi CD8hi

CD4mid CD8mid

CD4hi CD8mid

Nincs hPOK

Nincs GATA3 vagy MYB

Apoptózis

ThPOK GATA3 CD4+ CD8-

GATA3

CD4+ CD8-

MYB

I.4-13. ábra: Th-Tc sejt döntés

Naív CD4+ T-sejt Th1

T-bet

Th17

IFNγ RORγt

RUNX3 RUNX1

IL-17

Th2 citokin lókusz

Th2

IL-12Rβ2

Treg

FOXP3

GATA3 Th2 citokin lókusz

RUNX1

IL-2

I.4-14. ábra: Th differenciáció


59

Általános jelátviteli mechanizmusok Transzkripciós faktorok betegségekben Néhány transzkripciós faktor direkt szerepet játszik betegségek kialakulásában. Például: (1) IPEX szindróma (Immunodysregulation Polyendocrinopathy Enteritis Xlinked, Immundiszreguláció, poliendokrinopártia, enteritisz, X-hez kötött), „korpás” fenotípus egérben– FoxP3 (2) Rett-szindróma – MECP2 (3) Li-Fraumeni-szindróma – p53

A transzkripciós faktorok vizsgálata (1) A transzkripciós faktorok aktivitását az alábbi módszerekkel lehet vizsgálni: a) Luciferáz riporter esszé: A célsejt transzfekciója olyan luciferáz gént tartalmazó plazmiddal, ami a vizsgálni kívánt promóter kontrollja alatt áll.

Transzkripciós

faktor

kötődés

hatására

fény

kibocsátását

detektálhatjuk. b) Kromatin immunprecipitáció (ChIP): a biológiai kezelést követően, az aktivált transzkripciós faktorokat formaldehiddel fixáljuk a DNS-hez, majd a genomikus DNS-t izoláljuk és fragmentáljuk. Az így kapott fragmenseket a transzkripciós faktorra specifikus antitesttel precipitáljuk. A precipitált DNS-t leválasztjuk az antitestről és gén-specifikus PCR-t vagy szekvenálást végzünk a tisztított DNS-ből. A ChIP technikát microarray-vel (ChIP-on-chip) is lehet kombinálni. Így génhálózatok és az őket szabályozó tanszkripciós faktorok nagy teljesítményű tesztelése is lehetővé válik.

60


Intracelluláris jelátviteli molekulák c) Elektroforetikus Mobilitás Shift Assay (EMSA) azon alapul, hogy a transzkripciós fakrorokkal komplexet alkotó DNS migrációs sebessége megváltozik. (2) Transzkripciós

faktorok

interakcióját

(fizikai

asszociációját)

ko-

immunprecipitációval is vizsgálhatjuk.


61


I.5

A fő jelátviteli útvonalak áttekintése

I.5.1

cAMP-PKA útvonal

7-TM receptorok

G-fehérjék (trimer) Gαi Gαs

ATP Adenilát cikláz cAMP

Protein kináz A (PKA)

CREB (cAMP-Responsive-Element Binding protein cAMP-válasz-elem kötő fehérje)

I.5.2

PLCγ-DAG-PKC

7-TM receptorok

PLCγ

G-fehérjék (trimer) Gαq

DAG

Protein kináz C (PKC)

IP3

Ca2+

PIP2

Kalmodulin Kalcineurin NFAT

62


A fő jelátviteli útvonalak áttekintése I.5.3

MAPK-útvonal

ERK útvonal

p38 útvonal

Ligandok/ mitogének aktivátorok Rec.tirozin kinázok

JNK útvonal

stressz/citokinek

Ras MAP3K

Raf

MEKK1, DLK, MLK2, ASK1, TAK1, TAO1&2

MAP2K

MEK1, 2

MEK3, 6

MEK4, 7

MAPK

ERK

p38α,β,γ,δ

JNK1, 2, 3

MK

I.5.4

PI3K

I.5.5

RSKok MSKok

MNKok

MKok

PI3-kináz-PKB (Akt)

PKB (Akt)

mTOR

JAK-STAT

Citokin receptor

JAK


STAT

63

II

Részletes (szisztémás) jelátviteli mechanizmusok

II.1

Jelátvitel az immunrendszerben

Az immunrendszer veleszületett és adaptív mechanizmusok finom szabályozása révén működik. Fontos jellemzője, hogy képes a saját és nem saját struktúrák felismerésére és megkülönböztetésére. Az immunológiai egyensúly állandó fenntartása egy részről az idegen betolakodók és tumor sejtek elpusztításán és eliminálásán, más részről fontos, saját antigénekkel szembeni tolerancia kifejlődésén alapul. Az immunológiai felismerő molekulák sejtfelszíni receptorok (T-sejt receptor, B-sejt receptor, Fc receptorok, komplement receptorok, Toll-like receptorok stb.), amik a legtöbb esetben nem rendelkeznek saját enzimaktivitással, ezért citoplazmatikus nem-receptor tirozin kinázokat és adapter molekulákat használnak a receptorból érkező jel továbbítására. A tirozin foszforiláció gyakori esemény az immunológiai jelátvitelben, ezért az immunrendszerben speciális tirozint tartalmazó szignál szekvencia motívumok alakultak ki: ITAM (Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif) és ITIM (Immunoreceptor Tyrosine-based Inhibition Motif). Ezen receptorokon keresztül közvetített jelek számos biológiai válasz kifejlődéséhez vezethetnek: proliferáció, differenciáció, fagocitózis, apoptozis vagy anergia.


65

Részletes (szisztémás) jelátviteli mechanizmusok II.1.1

Jelátvitel a specifikus immunrendszerben 1.: B-sejt jelátvitel

A B-sejt receptor (BcR) komplex A B-limfociták az adaptív immunrendszer sejtes elemei. Antigén felismerő receptoruk a B-sejt receptor (BcR), ami egy sejtfelszínhez kötött monomer immunglobulin molekula. Mivel a BcR-nek rövid a transzmembrán és az extracelluláris része, a receptor Igα/β láncokhoz asszociálódik, amik ITAM motívumokat tartamaznak. A BcR komplex további ko-stimulációs molekulákat tartalmaz: CD19, CD20, CD21, CD23 és CD45.

Az antigén aktiválta BcR és B-sejt jelátviteli útvonalak A BcR-t az antigén keresztkötés aktiválja (II.1-1. ábra és II.1-2. ábra). A különböző epitópokat tartalmazó fehérje antigének (T-dependens antigének) csak korlátozott számú BcR keresztkötésére képesek, ami önmagában inkomplett B-sejt aktivációhoz vezet. Ezért az antigén keresztkötéssel szimultán, második aktivációs jel, a helper Tsejtekből származó citokin jel is nélkülözhetetlen a B-sejt aktivációhoz. Ezzel szemben a poliszaharid és lipid antigének nagy számú, ismétlődő epitópokkal rendelkeznek, ezért számos BcR keresztkötés kialakítására képesek és T-sejtek nélkül is teljes B-sejt aktivációt váltanak ki (T-independens antigén).

66


Jelátvitel az immunrendszerben BCR

Antigén

CRAC-csatorna

CD19

Ca2+

FcgRIIB1

Lipid raft aggregáció

BCR Internalizáció

Igα

Gab

Igβ

P13K p110 p85

BCAP

SHIP2

Shc

PIP3

GRB2 SHIP2

SHIP1 Cbl Bam32

clathrin

CD22

PTEN

RhoA

Lyn

Syk

ezrin

Dok-3

SHIP1 Pl(4,5)P2

PIR-B

Glükóz felvétel

Ca2+

SHIP2 Nck

BLNK Lyn

PRK2

STIM1

Btk

CD45

CD19

VAV

Bam32 Rac/ cdc42

Rho

GRB2

Rac

LAB

SOS RapL

TSC2 TAK1

GSK-3

CARMA1

Ras GAP

Ras

Ca2+

PKC

Ras GRP

DAG

Riam

ATP képződés

ER

BLNK DAG

Citoszkeletális újraszerveződé s és integrin aktiváció

Bam32

Ca2+-raktár

PLCγ2 CD19

PIP3

Glikolízis Akt

IP3 R Intracelluláris

IP3

Rheb

Bcl10 CaM MALT1

Rap

MEKK

Dok-1

c-RAF MKK3/4/6

mTOR

FcgRIIB1

CD19

IKK

MKK4/7 Ca2+

PKC

MEK1/2

Proteoszómális degradáció lκB

Sejtmag

p38

JNK1/2

Erk1/2

p38

JNK

Erk1/2

CREB

ATF-2

Jun

Bcl-6

Egr-1

NF-κB

Elk-1

Bcl-xL

Bfl-1

P70 S6K

lκB

CD40 Citoplazma

Kalcineurin

NF-κB

NFAT

CaMK

Oct-2

Ets-1

NFAT

Fehérje szintézis Növekedés gátlása, apoptózis

Akt

Transzkripció

FoXO

Transzkripció

II.1-1. ábra: BcR jelátvitel


67

Részletes (szisztémás) jelátviteli mechanizmusok Antigén BCR

Akut antigén jelátvitel

PlP2

Igα

PlP3

Igβ PI3K

P

P

P

P

SYK

SYK P

P

P

P

LYN

LYN

BTK

PLCγ2

BLNK

VAV

GRB2

SOS

DAG

PKC

IP3

Ca2+

RAS

ERK


Proliferáció, aktiváció és antitest szekréció

BCR

Krónikus antigén jelátvitel

PI(4,5)P2

Igα

Igβ

P

P

PI3K P

P

P

P

P

PI(3,4)P2

LYN

BTK

PLCγ2

BLNK

VAV

GRB2

Migráció

?

SHIP1

P

LYN

SOS

BAFFR

PI(3,4,5)P3

SYK

SYK

CXCR4

DAG

PKC

IP3

Ca2+

RAS

ERK

DOK


Túlélés Proliferáció, aktiváció és antitest szekréció

II.1-2. ábra: Rövid/hosszú távú BcR stimuláció Mindkét esetben az antigén keresztkötés az Src család két kinázának, a Fyn és Lyn molekuláknak, az aktivációjához vezet. Ezek a kinázok foszforilálják az Igα/β láncok ITAM motívumait. A foszforilált tirozinok dokkoló helyként szolgálnak a Syk SH2 doménjei számára. A Syk nem-receptor tirozin kináz a B-sejt jelátvitel központi molekulája. A Syk aktiválja a Grb2-t és PLCγ-t, ami a DAG és IP3 közvetítette jelátviteli utakat indítja be és PKC aktivációhoz, valamint az intracelluláris Ca2+-szint emelkedéséhez vezet. A kalmodulin aktiválja a kalcineurint, ami NFAT aktivációhoz vezet. További jelátviteli utak, mint a MAPK, NFκB és PI3K-Akt utak is aktiválódnak (ezt a CD19 ko-stimulációs molekula szabályozza). A nem-kanonikus NFκB út is aktiválódik a BAFFR (TNF receptor család tagja) által és ez a B-sejtek túléléséhez vezet (II.1-3. ábra). Végül transzkripciós faktorok- NFAT, AP-1, NFκB és ERK – aktivációja génexpressziót eredményez. A BcR jelátvitel legfontosabb biológiai hatása a B-sejtek 68


Jelátvitel az immunrendszerben klonális proliferációja és perifériás differenciációja (plazma és memória B-sejtek kialakulása).

BCR CD19 BAFFR Plazma membrán PIP2 LYN

PIP3

PI3K

Igα

Igβ

TRAF3

SYK

ITAM

TRAF3

AKT1

P

TRAF2

DAG

P IP3

PLCγ2

BLNK

PKCβ

GRB2

RAS

Nemkanonikus NF-κB1 út

NIK

BTK CARMA1 Ca2+

MALTI

RAF

BCL10

p100

RELB

p52

RELB

IKKα MEK IKKβ

IKKγ

Kanonikus NF-κB1 út NFAT

p50

p65

ERK

NF-κB2

NF-κB1 Citoplazma REL

P100

Anti-apoptotikus fehérjék mint BCL-XL és MCL1

Sejtmag

II.1-3. ábra: BcR jelátvitel ko-stimulációs útjai II.1.2

Jelátvitel a specifikus immunrendszerben 2.: T-sejt aktiváció és jelátvitel

A T-sejt receptor (TcR) komplex A T-limfociták szerteágazó funkciókat töltenek be az adaptív immunrendszerben: citokineken és citotoxikus effektor funkciókon keresztül szabályozzák az immunválasz centrális szakaszát. A T-sejtek antigén felismerő molekulája a T-sejt receptor (TcR), amit vagy α/β vagy γ/δ láncok alkotnak. A TcR a több láncból felépülő CD3 molekulával alkot komplexet, melynek ζ lánca ITAM szekvenciát tartalmaz (II.1-4.


69

Részletes (szisztémás) jelátviteli mechanizmusok ábra). A TcR/CD3 komplex sejt- felszíni akcesszórikus (pl. CD4, CD8, CD45 etc.) és ko-stimulációs (pl. CD28, CTLA-4, PD-1L, ICOS etc.) molekulákkal egészül ki.

T sejt

APC CD44

CD43

CD45 CD4/CD8

LFA1-ICAM1

CD3

Talin Peptid-MHC

TCR

LCK ZAP70

CD28

CD80/CD86

CTLA4

CD80/CD86

CD2

CD48/CD59

LFA1

ICAM1

TCR-CD3-peptid-MHC CD28-CD80/CD86 CTLA4-CD80/CD86 Agrin PKCθ

PI3K

SHIP2

CD44

CD4 LCK

CD45 CD2-CD48/CD59

CD43

II.1-4. ábra: Az „immunológiai szinapszis” molekulái Aktiváció és jelátvitel a TcR-en keresztül A B-sejtekkel ellentétben a T-sejtek csak akkor aktiválódnak, ha számukra antigén prezentáló sejtek MHC I vagy II molekulához kötött antigén fragmenseket (8-20 aminosavból álló peptid) mutatnak be („MHC-restrikció”). Az MHC-peptid és TcR kapcsolódása jelátviteli utak sorozatát indítja el (II.1-5. ábra).

70



CRAC Channel

LFA1

TCR

CD4

CD45

CD28

Ca2+ α

Csoportosulás

LAT

δ ε ε γ

GADS

PLCγ1

ζ ζ

VAV

GRB2

Actininin Talin

β

SLP76

Lck NCK

SOS

PIP2

CaM

PI3K

Zap70

ADAP

Ca2+

PKCθ PIP3

Calpain Calcineurin

DAG

Carma1

F-Aktin

Bcl 10 Malt1 Akt

Wasp Rac/ cdc42

Ca2+

IP3

Ras GRP

MEKKK

Rel lκBβ

Ras

NF-κB

NIK

Intracelluláris Ca2+ raktár

MEKK

ER

NFAT

Raf IKKγ

lκBβ

Proteoszómális degradáció

MKK3/6

MKK4/7

IKKβ

IKKα

MEK1/2 Rel lκB

NFAT

p38

JNK

Erk

NF-κB lκB

Proteoszómális degradáció

Citoplazma NFAT

Fos

Jun

NF-κB

Rel

Sejtmag

IL-2 Gén

II.1-5. ábra: A TcR/CD3 jelátviteli útvonal Elsőként a CD45 foszfatáz egy gátló foszfát csoportot távolít el az Src családba tartozó Lck kinázról, ami ezt követően a CD3 ζ lánc ITAM-ját foszforilálja. Ezt követően a ZAP-70 (70kDa Zeta-chain Associated Protein kinase), mely a B-sejtekben és hízósejtekben megtalálható Syk-kel homolog, a CD3 ζ lánc foszforilálódott ITAMján dokkol. A dokkolt ZAP-70-et az Lck és önmaga is foszforilálja (autofoszforiláció). Az aktivált ZAP-70 a downstream T-sejt jelátviteli utak fő szabályozója. A ZAP-70 kináz célfehérjéje 2 adapter molekula, a LAT és az SLP-76. A két molekula foszforilációja egy multimolekuláris komplex kialakulásához vezet, melyben a GRB2, Itk, GADS és Vav is részt vesznek és a folyamat végül a PLCγ1 aktivációjához vezet. A PLCγ1 ezt követően a PIP2-t hasítja: IP3 és DAG képződik. A DAG két fő jelátviteli út Ras és PKCθ - aktivációját indítja el. A Ras a MAP-kináz kaszkádot indítja be, ami


71

Részletes (szisztémás) jelátviteli mechanizmusok végül transzkripciós faktorok aktivációjához vezet (pl. AP-1), míg a PKCθ az NFκB útvonalat aktiválja, ami szintén a transzkripció szabályozásához vezet. Az IP3 Ca2+-ot szabadít fel az endoplazmatikus retikulumból (intracelluláris Ca2+raktár), amit a plazma membrán Ca2+-csatornáinak megnyílása követ (kapacitatív influx). A megnövekedett intracelluláris Ca2+-szint aktiválja a kalcineurint, a kalmodulint és végül az NFAT transzkripciós faktort. A fent leírt jelátviteli kaszkádok aktivációjának következményeként számos transzkripciós faktor aktiválódik (AP-1, NFAT, NFκB), ami az aktivált T-sejtek teljes génexpresszióját megváltoztatja (II.1-6. ábra).

Aktiváció

Apoptózis

L

Allopeptid

CD80 CD86

IL-2

FasL TNFα

R

CD4 TCR CD3 αβ γδεζη

CD28

IL-2Rα IL-2Rβ IL-2Rγ

Fas TNFaR

PIP2

T

Lck

PLCγ1

ZAP70 PIP2

Ras

IP3 DAG

Raf-1 MEK MAPK

Ras

IP3 DAG Ca2+

E

Fyn

Ras

Lyk

Syk

Fyn

SHC

JAK1 JAK3

PIP2

FADD Mort1

CaM

CaN

N/RE

PKCα PKCβ PKCφ

Raf-1 MEK MAPK

Raf-1 MEK MAPK

STAT3 STAT5a STAT5b

IP3 DAG

NFATc, NF-κB, Jun/Fos, NFATn, c-Rel, IkB, Oct-1

Bcl-2, Bcl-x, Kip1, cyclinE/Cdk2

Kaszpáz 1-14

Citokin termelés

Sejt proliferáció

Apoptózis

II.1-6. ábra: T-sejt aktiváció Lipid raftok és az immunológiai szinapszis A membránt érintő újabb sejtbiológiai kísérletek kimutatták, hogy a plazma membrán nem egyformán szabadon diffundáló lipid molekulák hatalmas óceánja, hanem fontos szerkezeti aszimmetriákat tartalmaz. A plazma membrán koleszterol és szfingolipid

72


Jelátvitel az immunrendszerben gazdag mikrodoménjei, amiket lipid-raftoknak is nevezünk, felelősek a fent leírt jelátviteli folyamatok precíz szervezéséért. Ezek a raftok színteret biztosítanak a TcR jelátviteli

komplex

molekuláinak,

és

szabályozzák

a

finom

molekuláris

kölcsönhatásokat. A lipid raftok szoros kapcsolatban vannak a citoszkeletális hálózattal is. A sikeres T-sejt aktivációhoz önmagában a TcR-en keresztül érkező jel nem elégséges, másodlagos kostimulációs jelekre is szükség van (II.1-7. ábra). Az immunológiai szinapszis (A. Kupfer és M. Dustin) felszínt hoz létre a T-sejt és az antigén

prezentáló

sejt

között.

A

szupramolekuláris

aktivációs

komplex

(Supramolecular Activation Complex, SMAC) i) egy centrális (c) régióból (TcR komplex, CD4, CD28 molekulák) és ii) egy perifériás (p) régióból (adhéziós molekulák pl. LFA-1) épül fel (II.1-4. ábra, 70. oldal). A szinapszisban létrejövő ligand-receptor kötődés mellett a CD45 foszfatáz kizárása is fontos eseménye a T-sejt aktivációnak. A CD28 ko-stimuláció megléte vagy hiánya dönti el, hogy a T-sejtben aktivácó vagy anergia (funkcionális inaktivitás) jön létre (II.1-7. ábra).


73

Részletes (szisztémás) jelátviteli mechanizmusok Aktiváció

Anergia

TCR

TCR CD28

CD28

CD3 α β

CD3 α β Plazma membrán

δ ε ε γ

ζζ

δ ε ε γ

ζζ

DAG

DAG

Foszfolipidek P

GRB2 ZAP70

ZAP70

SOS

DGKα

RAS

RAS

GTP

GDP RAS GRP1

Kalcium áram, NFAT aktiváció

MAPK aktiváció, AP1 kialakulás

Kalcium áram, NFAT aktiváció

AP1

Sejtmag

NFAT

GRB2

FOS

RAS GRP1

SOS

Sejtmag

JUN

IL-12

NFAT

IL-12

II.1-7. ábra: Ko-stimulációs utak, amik a TcR jelátvitelt szabályozzák II.1.3

Fcγ receptor jelátvitel

Bevezetés Az Fc receptorok (FcR) az immunglobulin molekula konstans Fc régiójának megkötésére képesek. Az immunglobulinok izotípus-specificitása alapján a következő FcR csoportokat különíthetjük el: FcαRI (IgA), Fcα/μR, Fcγ receptorok (I, IIa/b/c, IIIa/b) (IgG), FcεRI/II (IgE), FcRH1-6, FcRX és FcRY.

Fcγ receptorok szerepe és expressziója A leukociták Fc receptorai a fagocitózist és az opszonizált részecskék elpusztítását segítik elő, valamint jeleket közvetítenek, amik a leukociták mikrobicid aktivitását stimulálják. A fagociták legfontosabb Fc receptorai az Fcγ receptorok, amik IgG immunkomplexek megkötésére képesek (II.1-8. ábra). Az aktív Fc receptorok a fagocita 74


Jelátvitel az immunrendszerben és citotoxikus sejteket stimulálják, hogy antitest-mediálta fagocitózis vagy antitestfüggő sejt közvetítette citotoxicitás (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity – ADCC) révén pusztítsák el a mikrobákat és a fertőzött sejteket.

Aktiváló Fcγ Receptorok FcγRI

Gátló Fcγ Receptorok

FcγRII

FcγRIV

FcγRIIB

Egér α

N

α

N

α

γ2 N

N

α

γ2

N

N

C

γ2

N

N

C

N

ITIM

C

ITAM

C C

Affinitás

N

C

C

Nagy FcγRI

C

C

Kis-Közepes FcγRIIA

C

Kis-Közepes

FcγRIIC

FcγRIIIA

Kis-Közepes

FcγRIIIB

FcγRIIB

Humán α

N

γ2 N

α

N

α

N

α

α

N

N

α

N

γ2

N

N

N

GPI C C

ITAM

C C

Affinitás Allélok

ITIM

C

Nagy

C

C

C C

Low-medium FcγRIIA131H FcγRIIA131R

Kis-Közepes

C

Kis-Közepes

Kis-Közepes

FcγRIIIA158V FcγRIIIA158F

Kis-Közepes FcγRIIB232I FcγRIIB232T

II.1-8. ábra: Az Fcγ receptorok fajtái Fcγ receptorok ITAM/ITIM A BcR-hez és a TcR-hez hasonlóan az Fcγ receptorok is ITAM-okon keresztül továbbítják a jeleket (II.1-9. ábra). ITAM található például az FcγRIIA és C intracelluláris farkában, és az FcγRI és FcγRIIIA γ láncaiban. Ligand kötés hatására az ITAM-ok tirozin (Y) maradékait kinázok foszforilálják és jelátviteli kaszkádot indítanak el a sejtben.


75

Részletes (szisztémás) jelátviteli mechanizmusok Immunkomplex

FcγRIII

γ2

α

Ca2+

γ2

α

Plazma membrán PIP2 Citoplazma

PIP3

LYN

BTK

PLCγ

P SYK

ITAMs

PI3K

RAC

DAG

IP3

RHO

PKC

Ca2+

Ca2+

P SOS

RAS

Downstream jelátviteli útvonalak (ERK, p38, JNK) Citokin felszabadulás

Immunkomplex

ADCC

Fagocitózis

Oxidative burst

Szimultán keresztkötés

BCR

FcγRIIB

α

ER

Sejt aktiváció

FcγRIIB

α

α

PIP2

ITIM

BTK

LYN

cABL

P

ITIM

P SHIP DOK

JNK

Apoptózis

Igα

SHC

PIP3 Nincs membrán toborzás BTK

Igβ

PLCγ

RAS Kalcium áram és proliferáció gátlása

II.1-9. ábra: Aktiváló és gátló Fcγ receptor jelátvitel Az FcγRIIB1 és FcγRIIB2 receptorokban ezzel szemben ITIM szekvenciákat találunk, ezek a receptorok tehát gátló Fc receptorok: nem fagocitózist indukálnak, hanem gátolják az antigén-indukálta BcR jelátvitelt és leállítják a B-sejt aktivációt. Gátló jeleiket az SHP-1 és SHIP-foszfatázok szabályozzák.

Fcγ receptor közvetítette jelátviteli útvonalak Az Fcγ receptorok csoportosulása IgG1-el vagy IgG3-mal beborított részecskék vagy sejtek hatására aktivációs jelet küld a fagocita sejteknek (II.1-10. ábra). Az aktivációs jelhez az szükséges, hogy az FcR α láncait kötött Ig molekulák (pl. Ig fedett mikrobák, immunkomplexek) kössék keresztbe. A jelátvitel az ITAM-ok Src kináz mediálta foszforilációjával kezdődik, ezt követi a Syk család kinázainak SH2 domén mediálta 76


Jelátvitel az immunrendszerben ITAM kötődése, a PI-3 kináz aktivációja, és adapter molekulák, mint az SLP-76 és BLNK toborzása, majd enzimek, mint a PLC-γ és a Tec család kinázainak aktivációja. Ennek eredményeként IP3 and DAG képződik és intracelluláris szabad Ca2+ mobilizálódik. A fent leírt jelátviteli út aktivációja leukocitákban citokinek, gyulladásos mediátorok és mikrobicid enzimek génjeinek transzkripciójához, valamint a citoszkeleton mobilizációjához vezet, ami fagocitózist, sejt migrációt és degranulációt eredményez.

IgG

Antigén

γ2

α

FcγRI

FcγRIIB

FcγRIIA

α

α

FcγRIIIA

γ2

α

Ca2+

CaCn P

ITIM P

P

ITAM

P

SHIP

PIP3

SYK

P

P

SYK

P

P

P

P

P

P

Src család PTKok

SYK Ko-ligáció az aktivációs partnerhez

Ca2+

PI3K Rho család GTPázok Src család PTKok

IP3R SYK

VAV

PYK2

PLCγ

BTK BLNK

RAS

DAG

IP3

Aktin polimerizáció és remodelling

Ca2+

ER

Kalcium jelátvitel

Fagocitózis

Aktin polimerizáció RAC

PKCα MAPK útvonal

Fagocitózis JNK

Degranuláció

ADCC

Citokin felszabadulás

p38 Proinflammatorikus válaszok Sejt proliferáció

II.1-10. ábra: Az Fcγ receptor jelátvitel áttekintése II.1.4

Fcε receptor jelátvitel

Az FcεR-ok IgE megkötésére képesek. Amíg az FcεRI funkciójáról sok ismeret áll rendelkezésre, FcεRII szerepének pontos megismerése további vizsgálatokat igényel.


77

Részletes (szisztémás) jelátviteli mechanizmusok Az FcεR-ok szerkezete és expressziója Az FcεRI (nagy affinitású IgE receptor) (II.1-11. ábra) α, β és γ láncokból áll. A hízósejteken és bazofil granulocitákon αβγ2 tetramer, a humán antigén prezentáló sejteken, monocitákon, eozinofil granulocitákon, trombocitákon és simaizom sejteken αγ2 trimer formájában expresszálódik. Az α láncnak 2 extracelluláris doménje van, amik az IgE megkötéséért felelősek. A β és γ lánc intracelluláris részei ITAM-okat (immunoreceptor

tyrosine-based

activation

motifs)

tartalmaznak,

amiknek

a

jelátvitelben van fontos szerepük.

IgE Kötődött IgE

N

α

FcεR I N

β

C

N

P

N

LYN

P

N

SYK P

γ N

β

P

C

FcεR I

α

γ

C

P

P

P

P

P

ITAMok

P C

N

C

C

C

ITAMok

II.1-11. ábra: IgE kötött FcεR I Az FcεRII (CD23, alacsony affinitású receptor) (II.1-12. ábra) szerkezetileg különbözik valamennyi immunglobulin kötő receptortól, mivel a C-típusú lektin szupercsaládba tartozik. 3 C-típusú lektin domén fej, egy C-terminális farok, egy extracelluláris trimer coiled coil „szár” és 2 splice variáns formában létező rövid intracelluláris N-terminális szekvencia alkotja. A coiled coil „szár” proteolízis során hasadhat és így a CD23 szolubilis formája jöhet létre. A CD23 nem csak IgE-t, hanem 78


Jelátvitel az immunrendszerben CD21-et is köt (ami B-sejteken, follikuláris dendritikus sejteken, aktivált T-sejteken és bazofil granulocitákon expresszálódik), ami fontos lehet az allergiás folyamatokban és az IgE komplement rendszeren keresztüli szabályozásában.

FcεR II Fej domén

IgE C-terminális farok

Coiled-coil „szár”

FcεR II N-kötött glikolizáció

N

N

N

II.1-12. ábra: IgE kötött FcεR II FcεRI közvetítette jelátviteli folyamatok Az I típusú hiperszenzitív reakciók, mint pl. az anafilaxia, a szénanátha, az étel allergiák, az allergiás megbetegedések, vagy az asztma a legfontosabb FcεRI közvetítette reakciók. Az immunrendszer felismeri az allergéneket, pl.: növényi polleneket, rovarok mérgét és IgE típusú antitestet termel ellenük. Az IgE a hízósejtek felszínén lévő FcεRI-hez kötődik. Ezt a lépést nevezzük szenzibilizációnak. Ha szervezetünk ugyanazzal az allergénnel másodszor is találkozik, az allergén keresztköti az FcεRI kötött IgE molekulákat és aktiválja a sejteket (II.1-13. ábra és II.1-14. ábra). Az FcεRI aggregációt követően az FcεRI ITAM-jai foszforilálódnak, és a FYN és LYN Identification number: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

79

Részletes (szisztémás) jelátviteli mechanizmusok protein tirozin kinázok aktiválódnak. A kinázok aktivációja a Syk nem-receptor tirozin kináz és Gab2 (growth-factor-receptor-bound protein 2 (Grb2)-associated binding protein 2) foszforilációjához vezet. Az FcεRI jelátvitel ezen kezdeti lépései hasonlóságokat mutatnak a TcR jelátvitel kezdeti lépéseivel (II.1-15. ábra). A Gab2 a foszfatidilinozitol 3-kinázhoz kötődik (PI3K) és a PI3K aktivációja a PLC BTK (Bruton's tyrosine kinase)- függő foszforilációjához vezet, ami kalcium mobilizációt eredményez. A PI3K a PLD közvetítette szfingozin kináz aktivációja révén is okozhat kalcium mobilizációt. A PI3K-val párhuzamosan a MAP-kináz kaszkád is aktiválódik. A megnövekedett kalcium jel a hízósejtek degranulációjához vezet, melynek során vazoaktív aminok (pl.: hisztamin) és proteázok szabadulnak fel. A MAP-kináz kaszkád aktivációja a megnövekedett kalcium szinttel közösen különböző gének transzkripciós aktivitását fokozza, pl. citokin gének, amik gyulladásos citokinek pl. TNF termeléséhez vezet.

Az

arachidonsav

enzimatikus

módosulása

lipid

mediátorok,

mint

a

prosztaglandinok és leukotriének termelődéséhez vezet. A fent említett anyagok felelősek a hiperszenzitív reakciók tüneteiért pl.: vaszkuláris szivárgás, bronchus konstrikció, gasztrointesztinális hipermotilitás, gyulladás és szövetkárosodás.

80


Jelátvitel az immunrendszerben Allergén

P

P P

P

P

P

P

P

P

Jelátviteli útvonalak

P

Citokin gének transzkripcionális aktivációja

Granulumok preformált mediátorokkal

Arahidonsav enzimatikus modifikációja

Citokinek

Granulum exocitózisa

Lipid mediátorok

Szekréció

Szekréció

Proteázok

Vazoaktív aminok

Citokinek, pl., TNF

Leukotriének

Prosztaglandinok

Szövet károsodás

Ér dilatáció, simaizom kontrakció

Gyulladás (leukocita toborzás)

Simaizom kontrakció

Ér dilatáció

II.1-13. ábra: FcεR jelátvitel

α

FcεR I γ

NTAL

?

β

Lipid raft PIP2

PLCγ

SYK

SK

PI3K LYN

P

Y

P

Y

P

GAB2 GRB2 GDP

RAS

GTP

RAS

MAPKKK vagy RAF

SOS

MAPKK

Y

S1P

Szfingozin

BTK

FYN SYK

Plazma membrán

PIP3

P

PLD

GRB2 VAV

MAPKok

IP3


Ca 2+

Citokinek

Degranuláció

II.1-14. ábra: FcεRI közvetített jelátvitel Identification number: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

81


IgE

TCR

Antigén-specifikus receptor

α

β

α

CD3

CD3

FcεRI

δ ε ε γ

ζ ζ

γ γ β

Lck

Lyn

ITAM

ZAP-70

ZAP-70

Syk

ZAP-70 T sejtekben, NK sejtekben és a CLL egy alcsoportjában expresszálódik

ITAM

Syk a legtöbb hematopoetikus sejtben megtalálható Src-család kináz Syk-család kináz

II.1-15. ábra: A TcR és FcεR jelátvitel közti hasonlóságok Ezen patológiás reakcióban betöltött szerepe mellett, az FcεRI fontos funkciója a paraziták elleni védekezés. A férgeket az immunrendszer felismeri és ellenük IgE-t termel. Az IgE a parazita megfelelő epitópjához kötődik. Az eozinofil granulociták nagy affinitású FcεRI-ral rendelkeznek és a parazitát beborító IgE kötését követően granulumaikat kiürítik. Az exocitózis során az eozinofilek granulumaiból kationos fehérjék pl: major bázikus fehérjék, eozinofil bázikus fehérjék valamint enzimek, mint pl. az eozinofil peroxidáz szabadulnak fel és a parazita elpusztításához vezetnek.

FcεRII (CD23) közvetítette folyamatok Különböző modellek szerint a CD23 az IgE szintézis pozitív és negatív szabályozásában is részt vehet. Az IgE szintézis negatív szabályozása akkor következik be, ha a membrán-kötött CD23-at és IgE-t az allergén-IgE komplex ko-ligálja. A CD23 fontos szerepet játszhat étel allergiák patogeneziséban is, az allergén bél lumenből a mukózába 82


Jelátvitel az immunrendszerben történő szállításában. A CD23 gátló funkciója arra utal, hogy a molekula a jövőben antiallergiás gyógyszerek fejlesztésének alapjául szolgálhat.

II.1.5

Citokin jelátvitel

Definíció A citokinek alacsony molekulasúlyú glikoproteinek, amik alacsony koncentrációban hatnak nagy affinitású, specifikus sejtfelszíni receptorokon. A legtöbb citokin a közelében elhelyezkedő sejten/sejteken hat (parakrin hatás), de autokrin (a célsejt és a citokint termelő sejt azonos) vagy endokrin (a keringésen keresztül) hatásokat is közvetíthetnek.

Osztályozás, csoportosítás Szerkezetük alapján a citokineket 3 csoportba oszthatjuk: (1) 4 α-helix köteg család (tartalmazza az IL-2-, IFN- és IL-10 alosztályokat); (2) IL-1 család; és iii) IL-17 család. A funkciójukat tekintve elkülönítjük (1) a haematopoetikus citokineket (pl. GMCSF, G-CSF, M-CSF, eritropoetin, trombopoetin); (2) a limfocita aktivációt és differenciációt szabályozó citokineket (immunregulátoros citokinek); és (3) a gyulladásos citokineket (IL-1, IL-6, TNFα). Az immunregulátoros citokineket tovább osztályozhatjuk az alapján, hogy melyik T helper sejt alcsoport termeli őket: a) Th1 citokinek: IL-2, TNFα, IFNγ; b) Th2 citokinek: IL-4, 5, 13 c) Th17: IL-17A-F d) Treg: TGFβ, IL-10


83

Részletes (szisztémás) jelátviteli mechanizmusok Receptorok Az alábbi citokin receptor osztályokat tudjuk elkülöníteni: I osztály (hematopoetin család), II osztály (IFN, IL-10), és TNF-receptor család (II.1-16. ábra). Az I osztályba tartozó receptorok heterodimer/ trimer molekulák és további alcsoportjaikat különítjük el: (1) eritropoetin, növekedési hormon és IL13 receptorok, (2) közös β lánccal rendelkező receptorok (IL-3, IL-5, GM-CSF); (3) közös γ lánccal rendelkező receptorok (IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15); és (4) közös gp130 alegységgel rendelkező receptorok (IL-6 receptor alosztály) (II.1-17. ábra).

α

β

Eritropoetin, növekedési hormon és IL-13

I osztályú citokin receptor (hemopoietin receptor) család

IL-3, IL-5 és GM-CSF receptor, közös CD131 vagy βc láncuk van (közösbéta lánc)

IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 és IL-15 közös CD132 vagy γc láncuk van (közös gamma lánc). Il-2 receptornak egy harmadik lánca is van, egy nagy affinitású alegység IL-2Rα (CD25)

II osztályú citokin receptor

TNF-receptor család

Kemokin receptor család

Interferon-α, -β, -γ receptorok, IL-10 receptor

Tumor nekrózis faktor (TNF) receptorok I és II, CD40, Fas (Apo1, CD95), CD30, CD27, ideg növekedési faktor receptor

CCR1-10, CXCR1-5, XCR1, CX3CR1

II.1-16. ábra: Citokin receptorok

84



GM-CSF receptor alcsoport (közös β alegység)

Il-6 receptor alcsoport (közös gp130 alegység)

CNTF

IL-6

GM-CSF

IL-3

Il-2 receptor alcsoport (közösγ alegység)

LIF/OSM

IL-11

IL-5

IL-2

IL-15

IL-2Rα GM-CSFRα

IL-3R

IL-5R

IL-2Rβ β

IL-9

IL-4

γ

γ

γ

IL-15Rα

CNTFR γ

β

IL-7

β

gp130

gp130

gp130

γ

IL-2Rβ

IL-7R

IL-9R

gp130

IL-4R

II.1-17. ábra: A több láncból álló citokin receptorok jellemzői Janus kinázok (JAK-ok) (120–140 kDa) A JAK-ok (JAK1,2,3 és TYK2) a citokin receptorok citoplazmatikus részéhez asszociálódnak. Először „Just Another Kináznak”, lésőbb „Janus (a kapuk istene a római mitológiában, akinek a két arca ellentétes irányba néz) kináznak” nevezték őket. Az utóbbi elnevezésnek szerkezeti magyarázata van: valamennyi JAK-nak szomszédos kináz és pszeudokináz doménje van. A JAK-ok alap szerkezeti elemei a „JH” domének (Janus homology domains). A JH1: kináz, a JH2: pszeudokináz, a JH3: SH2, a JH4-7: FERM (= 4.1 köteg, ezrin, radixin és moesin) domén (II.1-18. ábra). A FERM domén a citokin receptorok membrán közeli prolinban gazdag részeihez kötődik. A kináz domén 2 szomszédos tirozin maradékának foszforilációja kritikus lépés a molekula aktivációja szempontjából. Az I.1. és I.2. (lásd fent) osztályba tartozó citokin receptorok a JAK2vel; I.3. osztályba tartozók a JAK 1-el és JAK3-mal; az I.4. és II osztályba tartozók pedig a JAK1, JAK2 és TYK2-vel asszociálódnak.


85


JAK szerkezete JH7

JH6

JH5

JH4

FERM 0

200

JH3

JH2

JH1

"SH2"

ψKI

KI

400

600

STAT szerkezete NH2 0

Coiled coil 200

800

1000

1200

P

DBD 400

Lk

SH2 600

Y

TAD 800

II.1-18. ábra: A JAK és STAT fehérjék szerkezete STAT-ok (Signal Transducer and Activator of Transcription -STAT) A JAK-ok fő célmolekulái a STAT fehérjék (II.1-18. ábra). A STAT-ok egy NH2 doménből (dimerizáció, DNS-kötés és nukleáris transzport), egy „coiled-coil”-ból (szabályozó fehérjéket köt), egy DNS-kötő doménből (DBD), egy linkerből (Lk), egy SH2 (receptor toborzás és dimerizáció) és egy transzkripciós aktiváló doménből (TAD) épülnek fel. Az SH2 és TAD domének közötti tirozin maradékok foszforilációja kritikus a molekula aktivációjához. A STAT1 és 2 az IFN jelátvitelben játszanak szerepet; a STAT3 az IL-6 és IL-10 család hatásait közvetíti, valamint az IL-21 és IL-27 jelátviteli utakon keresztül szabályozza a Th17 differenciációt. A STAT-4 az IL-12 és IL-23 jelátviteli utakon keresztül szabályozza a Th1 differenciációt. A STAT5a és b az IL-3, IL-5 és GM-CSF jelátvitelt szabályozzák. A STAT-6 az IL-4, IL-13 jeleket közvetíti, amik a Th2 differenciációt és az allergiás immunválaszt szabályozzák.

Citokin jelátvitel Ligand kötés hatására a citokin receptorok dimerizálódnak, ami a JAK-hoz való kötődést és aktivációt eredményez (II.1-19. ábra). Az aktivált JAK-ok egymást és a 86


Jelátvitel az immunrendszerben receptor láncait foszforilálják. A STAT-ok a foszforilált receptorhoz kötődnek és a JAK-ok által foszforilálódnak. Az aktivált STAT-ok dimereket alkotnak, a sejtmagba transzlokálódnak és transzkripciós faktorként működnek. Például az I típusú IFN-ok (IFNα és IFNβ) a STAT1/2 heterodimert aktiválják, amik ISRE (=IFN-sensitive response elements) szekvenciákhoz kötődnek, míg a II típusú IFN (IFNγ) jelátvitel a STAT1 homodimert aktiválja, ami GAS (=IFNγ-activated site) szekvenciához kötődik.

A citokin receptorok legalább két láncból állnak, amelyek citoplazmatikus deménje Janus kinázokhoz (JAK) kötődik.

Citokin kötés hatására a a receptorok dimerizálódnak, összekapcsolják a citoplazmatikus JAKokat, amelyek egymást aktiválják és foszforilálják a receptort.

P JAK

JAK

JAK

JAK

P JAK

JAK

P JAK P

STAT

P JAK P

Transzkripciós faktorok (STATok) kötődnek a foszforilálódott receptorhoz és az aktiválódott JAKok foszforilálják őket.

P JAK

A foszforilálódott STATok dimereket képeznek, a sejtmagba transzlokálódnak és új gének transzkripcióját indítják el.

P JAK

P

P

P

P

P

P

P

P

STAT

II.1-19. ábra: A citokin jelátvitel A JAK/STAT jelátvitel szabályozása A JAK/STAT jelátviteli út 4 fő mechanizmus által szabályozott. (1) SHP-1/2 foszfatázok és a CD45 defoszforilálják a JAKot, míg az SHP-2, a PTP1B, a TC-PTP és a PTP-BL STAT fehérjéket defoszforilálnak. (2) A nukleáris export/import szabályozása a NES (nuclear export sequence) vagy az NLS (nuclear localization sequence) által.


87

Részletes (szisztémás) jelátviteli mechanizmusok (3) SOCS (suppressors of cytokine signaling) pl. PIAS=Protein Inhibitor of Activated STATs (4) Szerin-foszforiláció, a TAD acetilációja vagy O-glikozilációja.

Klinikai vonatkozások: JAK gátlók A JAK gátlókat (eg. Lestaurtinib; Tofacitinib; Ruxolitinib) hematológiai betegségek pl. policitémia vera, trombocitémia, mieloid metaplázia, mielofibrózis és autoimmun betegségek pl. pszoriázis és reumatoid artritisz kezelésében tesztelték.

A TNF receptor jelátvitel Ligand kötés hatására a TNF receptor láncok trimerizálódnak, ami konformációjuk megváltozásához vezet, majd a gátló SODD (=silencer of death domains) disszociál az intracelluláris „halál doménről”. A TRADD (=tumor necrosis factor receptor type 1associated DEATH domain protein) adapter fehérje a halál doménhez kötődik és további fehérjék asszociációjához biztosít helyet (II.1-20. ábra és II.1-21. ábra).

88


Jelátvitel az immunrendszerben FasL

TNF-α

Fas/ CD95

TNFR-1

Daxx ASK1

TNF-α

DAPK TRADD

FADD Kaszpáz-8,-10

FADD

RIP

TNFR2

c-IAP1/2 TRAF2 RAIDD

RIP TRAF2

Kaszpáz-8,-10

APO-3L/TWEAK

ASK1

APO-2L/TRAIL

DR4/5

DR3 APO-3

FADD

TRADD RIP

Kaszpáz-8,-10

FADD

TRAF2

Kaszpáz-8,-10

II.1-20. ábra: TNF receptor közvetítette apoptózis I.


89

Részletes (szisztémás) jelátviteli mechanizmusok FasL

TNF-α

TNF-α

Fas/ CD95

Daxx ASK1

TNFR-1

DAPK TRADD RAIDD Kaszpáz-8,-10 FADD RIP RIP TRAF2

FADD

TNFR2

UB

APO-2L/TRAIL

DR3 APO-3

c-IAP1/2 TRAF2

ASK1 Kaszpáz független sejthalál

APO-3L/TWEAK

DR4/5

TRADD RIP

UB

FADD FADD Kaszpáz-8,-10

TRAF2

NIK

FLIP Bid IKK Smac lκB

tBid MKK7

NF-κB

HtrA2

NF-κB

Bcl-2

JNK

FLIPs

Cytc

Bcl-2

xIAPs

Apaf-1 Kaszpáz-9 Kaszpáz-6

Lamin A

Kaszpáz-3

Actin

Fodrin

Gas2

Rock-1

Kaszpáz-7

Acinus

ICAD

PARP

CAD Sejt zsugorodás Membrán kitüremkedés

Kromatin kondenzáció

DNS fragmentáció

DNS repair

Apoptózis

II.1-21. ábra: TNF receptor közvetítette apoptózis II. Három fő jelátviteli útvonal aktiválódik: (1) NF-κB útvonal: TRAF2 (=TNF receptor-associated factor 2) és RIP (=receptor interacting protein) a TRADD-hoz kötődik. A RIP szerin/treonin kináz aktiválja az IKK-t (IκB kinase), ami pedig az NF-κB-t aktiválja. Az aktivált NF-κB a sejtmagba transzlokálódik és a sejt túlélésben, proliferációban, gyulladásban és apoptozisban szerepet játszó gének transzkripcióját szabályozza (általában anti-apoptotikus). (2) A MAPK út aktivációja: TNF receptor aktivációt követően a 3 fő MAPK út közül a JNK közvetítette stressz válasz útvonal erősen, a p38 út mérsékelten, míg az ERK út minimálisan aktiválódik. A TRAF2 a MEKK1-hez (=Mitogen-activated protein kinase kinase kinase 1) és ASK1-hez 90


Jelátvitel az immunrendszerben (=Apoptosis signal-regulating kinase 1) kötődik, ami a MKK7-et foszforilálja (=Mitogen-activated protein kinase kinase 7). A MKK7 a JNK-t foszforilálja (=c-Jun N-terminal kinase), ami a sejtmagba transzlokálódik és a c-Jun és ATF2 (=Activating transcription factor 2) transzkripciós faktorokat aktiválja. Ez az útvonal a sejt differenciációban, proliferációban valamint apoptozisban részt vevő géneket szabályoz (általában pro-apoptotikus). (3) Halál jelátvitel (lásd részletesen „Külső faktorok által elindított (extrinsic) apoptotikus út”, II.4. fejezet, 127. oldal): TNFR1 nem indukálja olyan erősen ezt az utat, mint pl. a Fas molekula. A TRADD az FADD-t köti, ami a prokaszpáz-8-at toborozza. Autokatalitikus hasítás aktiválja a kaszpáz-8-at, ami az apoptotikus kaszkád downstream eseményeit indítja el: a kaszpáz-3 és Bid (=BH3 interacting domain death agonist), valamint a Bcl-2 család proapoptotikus tagjai citokróm C felszabadulását indukálják a mitokondriumból.

II.1.6

Kemokin jelátvitel

Definíció A kemokinek 90-130 aminosavból álló polipeptidek, amik a különböző leukociták kemotaxisát szabályozzák. Szabályozzák mind a normális leukocita forgalmat, mind a gyulladás helyére történő sejttoborzást. A kemokinek fokozzák a sejt adhéziót, aktiválják az effektor leukocitákat, és hozzájárulnak a gyulladásos reakció kialakulásához és a limfoid szövetek fejlődéséhez.


91

Részletes (szisztémás) jelátviteli mechanizmusok Nevezéktan, csoportosítás és receptorok A kemokineket a szerkezetileg konzervált első cisztein (C) maradékaik elhelyezkedése alapján csoportosítjuk. A CXC kemokinek esetében (α kemokinek) a ciszteineket egy aminosav választja el egymástól; a CC kemokineknél (β kemokinek) a ciszteinek egymás mellett helyezkednek el. A C kemokineknek (γ kemokinek) csak 2 cisztein maradékuk van: egy N-terminálisan és egy downstream. A CX3C kemokinek (δ kemokinek) estében a ciszteinek között 3 másik aminosav található. A receptoraikat az alapján nevezzük el, hogy milyen típusú citokint kötnek pl.CXCR, CCR.

Jelátvitel A kemokin receptorok a 7-transzmembrán (7-TM) / G-fehérje kapcsolt receptor családba tartoznak. Aktiválják a PLC > PIP2 > IP3 > Ca2+-jel, a PLC > PIP2 > DAG > PKC és MAPK útvonalakat (II.1-22. ábra és II.1-23. ábra). Ezek az útvonalak aktin polimerizációt, citoszkeletális átrendeződést és adhéziós molekulák expresszióját segítik elő és együttesen kemotaxishoz vezetnek.

92


Jelátvitel az immunrendszerben Kemokin receptor

Ca2+ -csatorna

α

β

γ

GDP

G-fehérje

α

β

γ

GTP

Adenilát cikláz DAG

IP3

PKC

Ca 2+

?

?

?

PLCβ2

Ras

cAMP

Aktin polimerizáció

Adhézió

Differenciáció, proliferáció

Citoszkeletális újraszerveződés

Kemotaxis

II.1-22. ábra: Kemokin jelátvitel G-fehérje kapcsolt receptorokon keresztül Ca 2+ csatorna

Kemokinek

Ca2+

Kemokin receptor

Plazma membrán

STAT5

Citoplazma

JAK2

α

β

PLCβ

γ

PIP 2

γ

β

GDP

Ca2+

PKC Ca2+ α PLCγ

PYK2

PI3K

Crk

IP3

GTP

CAS GRK

PTK

Rho

β-Arrestin

MAPK útvonal

GRB2

DAG

PDK

Akt/ PKB

RAS PLA2

Akt/PKB pathway

p38

JNK

NF-κB

c-Jun

Elk-1

Internalizáció Degradáció Újrahasznosítás

Sejtmag

Sejt aktiváció

Elk-1

Rho útvonal

Ras útvonal

PKCβ

SRF

Elk-1

NF-κB

c-Fos

Génexpresszió és apoptózis

II.1-23. ábra: Kemokin jelátviteli útvonalak Identification number: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

93

Részletes (szisztémás) jelátviteli mechanizmusok Alkalmazásuk betegségekben A folyamatosan expresszálódó kemokin receptorok (pl. CCR6,8,10,11; CXCR4,5,6) a homingot és a leukociták vándorlást, míg az indukálható kemokin receptorok (pl. CCR1-5,7; CXCR1-3) a gyulladást szabályozzák. A CCR1,2 és 5 szklerózis multiplex, reumatoid artritisz, asztma és nepfritis, a CCR5 és CXCR4 az AIDS; a CXCR1 és 2 a szepszis és ateroszklerózis patogenezisében játszhatnak szerepet.

II.1.7

Jelátvitel a veleszületett immunrendszerben, PRR jelátvitel

A veleszületett immunrendszer mikrobiális molekulákat ismer fel, amiket patogénasszociált molekuláris mintázatoknak (pathogen-associated molecular patterns – PAMPs) is nevezzük. A PAMP-ok nélkülözhetetlenek a mikrobiális organizmusok túlélése szempontjából, emlősökben ilyen molekulákat nem találunk. A legtöbb fagocita sejten találhatóak mintázat felismerő receptorok (pattern-recognition receptor-PRRs), amik a PAMP-okat ismerik fel, de számos, a vérben található szolubilis PRR is felismerheti őket, amik opszoninként működnek és a komplement rendszer aktivációjához vezetnek. A veleszületett immunrendszer hozzávetőlegesen 103 mikrobiális molekuláris mintázatot ismer fel.

Endocitotikus mintázat felismerő receptorok Az endocitotikus mintázat felismerő receptorok, amiket a fagocita sejtek felszínén találunk, elősegítik a mikroorganizmusok kapcsolódását a fagocita sejtekhez, ami ezt követően a mikroorganizmusok bekebelezéséhez és elpusztításához vezet. Az alábbi csoportjaikat különítjük el: (1) mannóz receptorok a fagociták C-típusú lektinjei, melyek mannózban gazdag glikánokat kötnek meg, a terminális cukor molekulán –mannózon vagy 94


Jelátvitel az immunrendszerben fruktózon-

keresztül,

amit

gyakran

megtalálunk

mikrobiális

glikoproteinekben és glikolipidekben. (2) scavenger receptorok bakteriális sejtfal komponensek pl. LPS, peptidoglikán és teikolsav, valamint fertőzött, sérült és stresszen átesett sejtek megkötésére képes. Scavenger receptorok pl. a CD36, a CD68 és a SRB-1. (3) opszonin receptorok a mikrobákat kötik a fagocitákhoz. Az opszoninok egy része PAMP-hoz kötődik a mikrobák felszínén, a másik része a fagocita sejtek egy specifikus receptorához kötődik. Opszoninok például az akut fázis fehérjék, mint a mannóz kötő lektin (mannose-binding lectin, MBL), a Creaktív protein (CRP), C3b C4b komplement faktorok, surfactant proteinek, az alveolusokban SP-A és SP-D , valamint az IgG antitest molekula is viselkedhet opszoninként. (4) N-formil Met receptorok N-formil metionint kötnek, ami az első aminosav a bakteriális fehérjékben, mivel az f-met-tRNS baktériumokban rendelkezik egy antikodon komlementer AUG start kodonnal.

Jelátvitel mintázat felismerő receptorokon keresztül A mikrobiális PAMP-ok a nekik megfelelő PPR-ekhez kötődnek és elősegítik intracelluláris szabályozó molekulák, pl. citokinek szintézisét és szekrécióját, amik döntő szerepet játszanak a veleszületett és az adaptív immunvédekezés beindításában. Gyulladásos citokinek az interleukin-1 (IL-1), a tumor nekrózis faktor-alfa (TNF-alfa) és az interleukin-12 (IL-12). A folyamatban kemokinek, az interleukin-8 (IL-8), a MCP1 és a RANTES is szerepet játszanak. A citokinek további, a védekezésben részt vevő sejtek citokin receptoraihoz kötődnek.


95

Részletes (szisztémás) jelátviteli mechanizmusok Extracelluláris TLR-ek A Toll receptort először Drosophilában azonosították, mint a fejlődő embrió dorzoventrális mintájának kialakításában nélkülözhetetlen receptort. 1996-ban Hoffmann és munkatársai ismertették, hogy a Toll-mutáns legyek jóval hajlamosabbak a gombás fertőzésekre. Ez a tanulmány rámutatott arra, hogy az immunrendszer, különösen a veleszületett immunitás ügyes mechanizmusokkal rendelkezik a mikrobiális invázió észlelésére. Ezt követően egymás után azonosították a Toll receptorok emlős homológjait és Toll-like receptoroknak (TLR- Toll-szerű receptor) nevezték el őket (II.1-24. ábra). A TLR-ek citoplazmatikus része nagymértékben hasonlít az interleukin (IL)-1 receptor család intracelluláris részéhez, ezért Toll/IL-1 receptor (TIR) doménnek nevezzük.

Peptidoglikán (G+) Lipoprotein Lipoarabinomannán (Mycobaktérium) LPS (Leptospira) LPS (Porphyromonas) GPI (Trypanosoma cruzi) Yymosan (Élesztő) Kettős szálú RNS

TLR1

TLR2

TLR2

TLR6

TLR3

Lipoteikolsav (G+) RVS F fehérje LPS (G-)

CD14

Flagellin

MD-2 TLR4

Nem-metilált CpG DNS

TLR5

TLR9

II.1-24. ábra: Toll-like receptorok-mintázat felismerés A TLR-ek családjai Emlősökben összesen 13 különböző TLR-t azonosítottak, melyek intracelluláris doménje konzervált TIR domént, az extracelluláris doménjük pedig egy egyéni,

96


Jelátvitel az immunrendszerben leucinban gazdag ismétlődő domént tartalmaz. Ezt a hasonlóságot leszámítva a két receptor típus extracelluláris részének szerkezete különböző (II.1-24. ábra). A TLR1, TLR2, TLR4, TLR5 és TLR6 a sejtfelszínen, míg a TLR3, TLR7, TLR8 és TLR9 az endoszómális-lizoszómális membránokon expresszálódnak.

TLR jelátvitel és funkció PAMP felismerést követően a TLR jelátvitel (II.1-25. ábra) azonnal beindítja az veleszületett immunválasz mechanizmusait, amik adapter molekulákon keresztül – pl. MyD88 (myeloid differentiation factor 88), TIRAP (Toll/interleukin (IL)-1 receptor (TIR) domain containing adaptor protein), TRIF (TIRdomain containing adaptor inducing interferon) és TRAM (TRIF-related adaptor molecule) – aktiválják az NFκB, AP-1 és IRF (interferon regulatory factors) transzkripciós faktorokat, melyek antibakteriális és antivirális választ indukálnak. A TLR jelátvitel gének ezreit aktiválja, ami arra utal, hogy a folyamat fontos szerepet tölt be a gén modulációban.


97

Részletes (szisztémás) jelátviteli mechanizmusok Baktériumok

Vírusok C3b

C5 iC3b C1q

C5a CR3

TLR

C5aR

PI3K

Erk1/2

IRF-1, IRF-8 Sejtmag

gC1qR

CD46

TLR4-indukálta IL-12, amit poszttranszkripciós mechanizmusok gátolnak

IL-12p35 IL-12/IL-23p40 IL-23p19 IL-27p28

II.1-25. ábra: A komplement receptor (CR) és Toll-like receptor jelátvitel Endoszómák/fagolizoszómák membránjában található PRR-ek jelátviteli folyamatai A TLR-3, 7, 8 egyes vagy kettős szálú virális RNS-hez; a TLR-9 – nem-metilált citozin-guanin dinukleotid szekvenciákhoz (CpG DNS) kötődik. A legtöbb TLR virális komponensekhez kötődik és inerferonok szintézisét idézi elő, ami meggátolja a fertőzött gazdasejtben a vírus replikációját.

Citoplazmában találhat PRR-ek jelátviteli folyamatai (1) NOD1

és

2

(NOD – nucleotide-binding

oligomerization

domain)

citoplazmatikus fehérjék, amik peptidoglikán komponensek intracelluláris felismerését teszik lehetővé (valamennyi baktérium muramil dipeptidje), melyek olyan gének aktivációjához vezetnek, melyek gyulladásos citokineket

98


Jelátvitel az immunrendszerben pl. IL-1, TNF-alpha, IL-8 és IL-12 kódolnak, hasonlóan, mint a sejtfelszíni TLR-ek. (2) CARD-domént tartalmazó fehérjék (CARD – caspase activating and recruitment domain), mint a RIG-1 (retinoic acid-inducible gene-1) és a MDA-5 (melanoma differentiation-associated gene-5), citoplazmatikus szenzorok, melyek mindketten vírus fertőzött sejtekben termelt kettős szálú és egyes szálú RNS molekulákat ismernek fel és interferonok szintézisét váltják ki, amik a fertőzött gazdasejtben megakadályozzák a vírus replikációját, hasonlóan, mint ahogy azt az endoszómális TLR-ek végzik (II.1-26. ábra).

LPS Polymixin B LBP

TLR2 OxPAPC

TLR4

MD2

CD14 Kettős szálú RNS

CLI095 Chloroquine MyD88

MyD88 TLR9 JAK2

TLR7

TLR3

RIG-1

MDA-5

AG490

LY294002

IPS1 PI3K

Wortmannin IKKε mTOR

Rapamycin

MyD88

PepinhMYD

BX795

PepinhTRIF PKA

H-89

TAK1

PKR

PD98059

2-Aminopurin Bay11-7082

MKKok

lκB p50

U0126 SB203580

TBK1

TRIF

p65 p38

JNK

Celastrol

SP600125

II.1-26. ábra: Toll-like receptor gátlók Komplement receptor jelátvitel A különböző típusú komplement receptorok (CR1-4, C3aR, C5aR) számos immunológiai folyamatban vesznek részt (II.1-27. ábra). A CR1-et (CD35) Identification number: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

99

Részletes (szisztémás) jelátviteli mechanizmusok vörösvérsejtek,

monociták,

neutrofil

granulociták

és

B-sejtek

expresszálják,

legfontosabb feladatuk az immunkomplexek eltakarítása a vérből. A CR2-t (CD21, EBV receptor) főként B- és follikuláris dendritikus sejtek expresszálják és aktivátoros ko-receptor szerepet játszik a B-sejt aktivációban. A CR3 és CR4 CD11b-ből vagy CD11c-ből és CD18-ból épül fel, neutrofil granulociták, NK-sejtek, és makrofágok expresszálják őket, funkciójukat tekintve PRR-ek, így serkentik a fagocitózist. A C3aR és C5aR a 7-TM receptor csoportba tartoznak és jelátvitelük G-fehérje függő (további részleteket lásd: I.2.2. fejezet, 25. oldal és I.4.1. fejezet, 41. oldal).

APC

T sejt CR1

Antigén felismerés és felvétel

CR1

Gátolja a sejt proliferációt Expresszió <15%

CR2 CR2 CR3 CR3 CR4

Ismeretlen Expresszió <5%

CR4 Patogén felismerés és/vagy tisztítás

TH1/TH2 elköteleződés modulációja Antigén felismerés és felvétel

Citokin moduláció és APC érés

CRIg SIGNR1 C3aR

Citokin moduláció Expresszió aktiváció hatására

C5aR

C5aR

T-sejt vándorlás Upreguláció aktiváció hatására

C1qR

C1qRP

CD46

CD46

CD55

CD55

CD59

CD59

C3aR

Citokin moduláció

Aktiváció/proliferáció citokin moduláció és irány elköteleződés

II.1-27. ábra: Komplement receptorok

100


Hormon és növekedési faktor jelátvitel

II.2

Hormon és növekedési faktor jelátvitel

II.2.1

Tirozin kináz-kötött receptorok

II.2.1.1 Növekedési faktor jelátvitel

Definíció A növekedési faktorok (Growth factors, GFs) kis molekulasúlyú szolubilis mediátorok, amik a proliferációt, a túlélést, a metabolizmust és a szöveti differenciációt szabályozzák. A tumorok kialakulásában is fontos szerepet játszanak. Történet A növekedési faktorok izolálása és jellemzése szorosan összefügg az in vitro szövet /sejt tenyésztési technikák fejlődésével. A sejtek in vitro körülmények közötti fenntartása a 19-20. század fordulóján kezdődött. Rous csirke tumor (szarkóma) sejtekkel végzett kísérleteket (RSV). Carrel kísérletei kimutatták, hogy egyszerű, pufferelt só oldatban a sejtek nem proliferálnak, és ő végezte el az első vizsgálatokat hígított plazmával/szérummal. Temin és Dulbecco dolgozták ki a szövettenyésztés precíz követelményeit és figyelték meg, hogy a tumor sejtek szérum igénye alacsonyabb, mint a többi sejté, amit azzal magyaráztak, hogy a tumor sejtek nagyobb a kapacitással adnak választ a proliferációs jelre („growth factors”). Azt is megfigyelték, hogy a szérum nagyobb mértékben támogatta a sejtnövekedést, mint a plazma, ami mint később kiderült azzal magyarázható, hogy a PDGF az aktivált trombocitákból származik. R. Levi-Montalcini és S. Cohen jellemezték először az NGF-et és EGF-et, az első növekedési faktorokat.


101

Részletes (szisztémás) jelátviteli mechanizmusok Csoportok PDGF: (platelet-derived growth factor, trombocita eredtű növekedési faktor); EGF: (epithelial growth factor, epiteliális növekedési faktor); NGF: (neuronal growth factor; neuronális növekedési faktor) FGF: (fibroblast growth factor, fibroblaszt növekedési faktor); TGF: (transforming growth factor, transzformáló növekedési faktor), IGF: (insulin-like growth factor, inzulin-szerű növekedési faktor) (II.2-1. ábra és II.2-1. táblázat).

Ros

Alk

VEGFR

Met

PTK7

Ret ErbB

InsR

Tie PDGFR Eph

MuSK Trk

Axl

Ror

DDR

FGFR Ryk

STYK1

LMR

EGFR ErbB2 ErbB3 ErbB4

InsR IGF1R InsRR

Kináz EGF

PDGFRα PDGFRβ CSF1R/ Fms Kit/SCFR Flt3/Flk2

VEGFR1/ Flt1 VEGFR2/ KDR VEGFR3/ Flt4

FGFR1 FGFR2 FGFR3 FGFR4

PTK7/ CCK4

Cisztein-gazdag

Leucin-gazdag

Sam

Efrin-kötő domén

TrkA TrkB TrkC

Ror1 Ror2

MuSK

Fibronektin III-as típus Kadherin

Met Ron

Ig-szerű

Axl Mer Tyro3

Tie Tie2

EphA1-8 EphA10 EphB1-4 EphB6

Ret

Ryk

DDR1 DDR2

Ros

LMR1 LMR2 LMR3

Savasbox

Kringle

Fz

Psi

Discoidin

YWTD propeller

Ldla

Mam domén

Ltk Alk

SuRTK106/ STYK1

SAM WIF

II.2-1. ábra: Növekedési faktor receptorok

102


Hormon és növekedési faktor jelátvitel II.2-1. táblázat: Receptor osztályok Osztály

Példák

Szerkezeti jellemzők

I

EGF receptor, NEU/HER2, HER3

Cisztein-gazdag szekvenciák

II

Inzulin receptor, IGF-1 receptor

Cisztein-gazdag szekvenciák; diszulfid kötött heterotetramerek jellemzik

III

PDGF receptorok, c-Kit

5 immunglobulin-szerű domént tartalmaz; van kináz inzert

IV

FGF receptorok

3 immunglobulin-szerű domént és kináz inzertet is tartalmaz, valamint savas domént

V

Vaszkuláris endoteliális növekedési faktor (VEGF) receptor

7 immunoglbulin-szerű domént és kináz inzertet tartalmaz

VI

Hepatocita növekedési faktor (HGR) és scatter faktor (SF) receptorok

Heterodimer, mint a II osztályú receptorok, kivéve, hogy az egyik protein alegység teljesen extracelluláris. A HGF receptor egy proto-onkogén,amit MET onkgénként fedeztek fel

VII

Neurotrofin receptor család (TRKA, TRKB, TRKC) és NGF receptor

Nincs vagy kevés cisztein-gazdag domén; NGFR-nek leucinban gazdag doménje van

Receptor dimerizáció és jelátvitel A növekedési faktor receptorok a receptor tirozin kináz család tagjai (a növekedési faktor receptor jelátvitel részleteit lásd I.2.3.1. Receptor tirozin kinázok fejezetben, 32. oldal). A ligand kötése a receptor dimerizációjához vezet, ami a kináz domén foszforilációját és aktivációját indukálja (II.2-2. ábra – II.2-5. ábra). A különbözö receptorok különböző dimerizációs/aktivációs stratégiát használnak: pl. a PDGF egy dimer, ami két sejtfelszíni PDGF receptor monomer között létesít keresztkötést. Az EGF kötődése a receptorához a receptor konformáció változását indukálja, ami a receptor dimerizációját segíti elő. A FGF a heparinnal alkot komplexet és két FGF(R)-t köt keresztbe. Az inzulin esetében a receptor dimer formában van jelen a sejtfelszínen és a ligand kötődése konformáció változást és autofoszforilációt eredményez (további részletekért lásd az inzulin jelátvitelt a következő fejezetben).


103

Részletes (szisztémás) jelátviteli mechanizmusok PDGFR

EGFR

Foszfotirozin

Foszfotirozin

Y559 Y581 Y716 Y741 Y751 Y771 Y1009 Y1021

Y992 Y1045 Y1068 Y1086 Y1148 Y1173

P P

P P

P

P

P

P

P

P

PLCγ P

P

P

P

P

P

P

P

P

P Ras-Gap P

P P

Shc

PI3K

Cbl

IRS-1

Abl

SLP76

GRB2

p120

P

Crk

SHP-1

Nck

STAT1

SRC

II.2-2. ábra: Növekedési faktor receptorok és tirozin foszforilációjuk

EGF

Vav2 EGFR

PTP

+

E2Ub

-

-

H2O2 Cbl NADPH szintézis

Gab1

DAG

SOS

+ Rac

STAT3

IP 3

Shc Cdc42 /Rac

STAT1

PLCγ

GRB2

-

Célgének

Ca2+

-

PKC

PI3K

Ras

PIP3

Raf

Src MEKK

MEKK4

MKK2

MKK4

Akt

DOK

ADAM

PDK1 MAPKK Targetek

-

Targetek

Ras GAP Nck

+

GRB2

-

FAK

HB-EGF MAPK

p38

JNK

Bad

FKHR

MAPK

Gab1

Src

PAK1 RSK2

p53

Jun

C-Fos

MAPK

Paxillin

Shp2 CAS

AP1

JNK

WASP

Rac

Apoptózis CREB

Sejtciklus

Citoszkeleton

II.2-3. ábra: EGF jelátvitel

104


Hormon és növekedési faktor jelátvitel Bemenő jel Diverz bemenő jelek (Multiple RTK-ok)

+

Konzervált core folyamatok

Szisztéma kontroll

-

+

+

Diverz kimeneti események (transzkripciós válasz, citoszkeletális változások, stb) Kimenő jel

II.2-4. ábra: A növekedési faktor jelátvitel általános jellemzői EGF TGFα β-cellulin Amfiregulin Nem specifikus Heregulinok ligandok HB-EGF

P

P

P P

P

P

P P P P

EGFR

P P

P

P

P P

PDGF-C β-cellulin NRG2 NRG3 VEGF-B

P P

P P

Her2

GRB2 SOS

P

P

P P

VEGF-C

P P

P P

Her4

Ras

Rac

VEGFR1

CDC42

JNK útvonal

VEGF-D PDGF-A

P P

P

P

P P P P

P P

P

P

P P

Her3

ERK útvonal

P

P

P P P P

VEGF-A

P P

P P

VEGFR2

P

P

P P

PDGF-B PDGF-D

P P

VEGFR3

P P

P

P

P P P P

PDGFR-a

P P

MEK1/2

P P P P

PDGFR-b

Erk

PI3K

Akt

MKK3/6

p38

Proliferáció Metasztázis

P P

c-kit

Rho

Tak

JNK

Sejt túlélés

P P

P38 útvonal

MEKK

MKK4/7

P

P

P P

Sorafenib Raf

SCF

mTor

Apoptózis rezisztencia

Sirolimus

Panitumumab

Temsirolimus

Erlotinib

Midostaurin

Gefitinib

Motesanib

Lapatinib

Pazopanib

Leflunomide

Enzastaurin

Trastuzumab

Sunitinib

Imatinib

Vandetanib

Everolimus

Bevacizumab Cetuximab

Érújdonképződés

II.2-5. ábra: A különböző növekedési faktor receptorok ugyanazokat a jelátviteli utakat használják Identification number: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

105

Részletes (szisztémás) jelátviteli mechanizmusok Növekedési faktor jelátvitel tumorokban A növekedési faktorok és a receptor tirozin kinázok, valamint az általuk közvetített jelátviteli utak, nemcsak a sejt növekedést és differenciációt szabályozzák, hanem a malignus daganatok kialakulásában is szerepet játszanak. Nem csak patogenetikus és prognosztikus markerek, hanem tumorterápiák ígéretes célpontjai is. Az EGFR számos malignus tumorfajtában expresszálódik: pl. nem- kis sejtes tüdő (NSCLC), feji és nyaki szkvamózus sejtes karcinóma (SCCHN), kolorektális karcinoma, glioblasztóma, prosztata-, petefészek- és emlőtumor. Például HER2 (human epidermal growth factor receptor-2) pozitív emlőtumorokat sikeresen lehet olyan monoklonális antitesttel kezelni, ami a receptort ismeri fel (Herceptin). Az antitest meggátolja az EGF jelátvitelt és ennek következményeként a tumor proliferációját. Az EGFR által közvetített jelek a tumorok angiogenezisében is fontos szerepet játszanak és a tumor növekedéséhez és fokozott metasztázis képződéséhez vezet. A PDGFR és a VEGFR szintén szerepet játszanak a tumorok fejlődésében, inhibitoruk gátolja a tumorok növekedését és az angiogenezist.

II.2.1.2 Inzulin jelátvitel Az inzulin egy hormon, amit a hasnyálmirigy béta sejtjei termelnek megnövekedett vér glükózszint esetén és ami a szervezet szénhidrát és zsír metabolizmusát szabályozza. Az inzulin indukálja a máj-, izom- és zsírsejtek glükóz felvételét a vérből és a glikogén raktárakból. Az inzulin elősegíti a glükóz raktározását, mivel számos metabolikus enzim aktivációját szabályozza foszforiláció és defoszforiláció révén és így gátolja a máj glükóz termelését és glükóz kibocsátását. Emellet az inzulin szabályozza gének expresszióját is, amik olyan májenzimeket kódolnak, melyek a glükoneogenezisben is

106


Hormon és növekedési faktor jelátvitel részt vesznek. Inzulin hiányában vagy az inzulin receptor működési zavara esetén (inzulin rezisztencia) súlyos metabolikus zavar, diabétesz mellitus alakul ki. Az inzulin-szerű növekedési faktor egy 7,6 kDa-os peptid, amit a máj szekretál növekedési hormon stimulus hatására. Az inzulin receptor egy transzmembrán fehérje dimer, ami diszulfid hidakkal kovalansen kötött 2 alfa és 2 béta láncból áll.

Az inzulin receptor jelátvitel (PI3K-Akt/PKB útvonal) Az inzulin/IGF receptor ligand indukálta tirozin foszforilációja az inzulin receptor szubsztrát 1 (IRS-1) SH2 doménen keresztüli citoplazmatikus toborzásához vezet. Az IRS-1 az inzulin/IGF-1 receptorból a PI3K/Akt és az ERK/MAPK utaknak küld jeleket. Az IRS-1 is fontos mediátora mind az anyagcserét, mind a növekedést serkentő jelátviteli utaknak: IRS-1-/- egér csak enyhe diabéteszt, de jelentős növekedésbeli retardációt mutat (súlya 50%-a a normál egérének). Az IRS-1-t overexpresszáló transzgénikus egérben pedig emlő tumor alakul ki. A PI3-kináz rendkívül sokféle sejtes funkciót szabályoz pl.: sejt növekedést, proliferációt,

differenciációt,

mortalitást,

túlélést

és

intracelluláris

transzport

folymatokat. Ezen funkciók nagy része annak az eredménye, hogy az I osztályba tartozó PI3-kinázok aktiválják a protein kináz B-t. Akt/PKB, egy szerin/treonin kináz, ami számos sejtes folyamatban, pl.: glükóz anyagcserében, proliferációban, apoptozisban, transzkripcióban és sejt migrációban vesz részt. Az aktivált Akt foszforilálja a glikogén szintáz kináz 3-at (GSK3). A GSK3 fő szubsztrátja a glikogén szintáz, egy olyan enzim, ami a glikogén szintézis utolsó lépését katalizálja. A glikogén szintáz GSK3 általi foszforilációja gátolja a glikogén


107

Részletes (szisztémás) jelátviteli mechanizmusok szintézist, ezért a GSK3 Akt-n keresztüli gátlása elősegíti a glükóz glikogén formájában történő raktározását.

II.2.2

G-protein-kapcsolt receptorok (epinefrin, szerotonin, glukagon)

II.2.2.1 Epinefrin (adrenalin) Epinefrin (adrenalinként is ismert) egy katekolamin hormon, ami a mellékvese velőállományában képződik fenilalaninból vagy tirozinból. Az epinefrin megnöveli a szívfrekvenciát, összehúzza a vérereket, tágítja a légutakat és részt vesz a veszélyhelyzetek által kiváltott komplex adaptációs folyamatokban („fight-or-flight”). Az epinefrin elnevezés a görög epi- és nephros, míg az adrenaline a latin ad- és renes szóösszetételekből származik, mindkét szó azt jelenti „a vesén”, ami a mellékvese anatómiai elhelyezkedésére utal.

Történet Adrenalin kivonatot, ami adrenalint és egyéb katekolaminokat tartalmaz, először egy lengyel élettanász, N. Cybulski izolált 1895-ben. J. Takamine K. Uenaka izolálta az adrenalint 1901-ben. Az arenalint először F. Stolz és H. D. Dakin szintetizálta az előbbi munacsoportoktól függetlenül 1904-ben.

Adrenerg receptorok Az adrenalin receptorok (II.2-6. ábra) a G-fehérje kapcsolt receptorok közé tartoznak (7-TM), altípusaik az α1/2, β1/2/3/ receptorok. Az α1 receptorok Gq fehérjékhez kötődnek és a PLC-t aktiválják, az α2 receptorok Gi-hez, míg a β receptorok Gs-hez kötődnek, az előbbi gátolja, míg az utóbbi aktiválja az adenilát-ciklázt. A G-fehérje 108


Hormon és növekedési faktor jelátvitel kapcsolt receptorok jelátviteli folyamatainak részleteit lásd részletesen az I.2.2. fejezetben (25. oldal) és az I.4.1. fejezetben, (41. oldal).

Adrenalin, Noradrenalin

Receptor

α1

α2

Gq

Gi

Foszfolipáz C PIP2

β

Gs

Adenilát cikláz

Adenilát cikláz ATP

DAG

cAMP

ATP

cAMP

IP3 Ca2+

Simaizom összehúzódás

Ca2+

Simaizom relaxáció

Transzmitterfelszabadulás gátlása

Szívizom összehúzódás Simaizom relaxáció Glikogenolízis

II.2-6. ábra: Adrenerg receptorok II.2.2.2 Glukagon A glukagon egy hormon, amit a Langerhans- szigetek α-sejtjei termelnek. A glukagon emeli a vér glükóz szintjét, az inzulinnal ellentétes hatásokat vált ki. A glukagon receptor egy 62 kDa molekulasúlyú fehérje, a G-fehérje kapcsolt receptor család (B osztály) tagja. A glukagon receptor a Gs-el asszociál, aktiválja az adenilát ciklázt, a cAMP–szint növekedéséhez és PKA aktivációhoz vezet. A G-fehérje kapcsolt receptorok jelátviteli folyamatainak részleteit lásd az I.2.2. fejezetben (25. oldal) és az I.4.1. fejezetben, (41. oldal).


109

Részletes (szisztémás) jelátviteli mechanizmusok II.2.2.3 Szerotonin Szerotonin vagy 5-hidroxitriptamine (5-HT) egy monoamin neurotranszmitter (nem hormon), ami triptofánból szintetizálódik. Az 5-HT számos szövetben/sejtben megtalálható: gasztrointesztinalis rendszerben (forrás: enterokromaffin sejtek), a trombocitákban és a központi idegrendszerben. A szerotonin egyik fontos hatása, hogy pozitív érzéseket indukál, ezért más néven „happiness hormonnak” nevezzük. Ennek egyik fontos következménye, hogy a szerotonin alkalmazható depresszió és más hangulatzavarok kezelésére. Az 5-HT részt vesz továbbá az étvágy, az alvás, az izom összehúzódás és néhány kognitív funkció pl. a memória és a tanulás szabályozásában. A szerotonin receptorok, 5-HT receptorként is ismertek, vagy G-fehérje kapcsolt receptorok vagy ligand kötött ioncsatornák a központi és perifériás idegrendszerben, ahol serkentő vagy gátló neurotranszmisszióban is részt vehetnek. Az 5-HT1/5 receptorok Gi kötött gátló; az 5-HT2 receptor Gq kötött serkentő, az 5-HT4/6/7 receptorok Gs kötött serkentő funkciójúak, a 5-HT3 receptor ligand függő Na+/K+ -csatorna. A G-fehérje kapcsolt receptorok jelátviteli folyamatainak részleteit lásd az I.2.2. fejezetben (25. oldal) és az I.4.1. fejezetben, (41. oldal).

II.2.3

Az intracellularis/nukleáris receptor jelátvitel (szteroid hormonok és a tiroxin)

Az

intracelluláris/nukleáris

receptorok

ligand-függő

transzkripciós

faktorok.

Szerkezetüket tekintve nagy fokban konzerváltak, funkciójuk viszont rendkívül szerteágazó.

110


Hormon és növekedési faktor jelátvitel Történet Egy skót sebész G.T. Beatson figyelte meg először, hogy az inoperábilis emlőtumorok regressziót mutattak a petefészek eltávolítását követően. Egyéb megfigyelések arra utaltak, hogy kasztrált állatokban megnő a hústömeg, valamint az ősi kínai orvoslásban is használtak placenta kivonatokat különböző betegségek kezelésére. Kendall és Reichstein jellemezték először a kortizont és a tiroxint 1926-ban. Butenandt és Doisy mutatták ki az ösztrogént terhes nők vizeletéből. Ezt követte az aldoszteron és a progeszteron (először disznók sárgatestjéből izolálták) felfedezése. 1961-ben Jensen jellemezte az ösztrogén receptort, és az 1980-as években Chambon, Evans és Vennström klónozták az ösztrogén (ER), a glükokortikoid (GR) és a tiroxin (TR) receptorokat.

II.2.3.1 Az intracelluláris receptorok családjai (II.2-7. ábra)

II.2-2. táblázat: Az intracelluláris receptorok családjai Család

Receptor

Ligand(ok)

Szteroid hormon rec.

ösztrogén rec. (ER) glükokortikoid rec. (GR) mineralokortikoid rec. (MR) androgén rec. (AR) progeszteron rec. (PR)

ösztradiol kortizol aldoszteron tesztoszteron progeszteron

Tiroid hormon rec.

tiroid hormon rec. (TR)

T3

Retinoid rec.

retinol sav rec. (RAR) retinol sav X rec. (RXR)

all-transz-retinol sav 9-cis-retinol sav

D-vitamin rec.

D-vitamin rec .(VDR)

1,25-hidroxi-kolekalciferol

Lipid szenzorok

máj X rec. (LXR) farnezoid X rec. (FXR)

oxiszterolok epesavak

PPAR

peroxiszóma proliferátor aktivált rec.

zsírsavak, eikozanoidok (pl. LTs, PGs)


111

Részletes (szisztémás) jelátviteli mechanizmusok Emberben 48 receptor ismert, C. elegansban pedig 270(!):tehát számos orphan receptor (árva receptor) létezik.

Szteroid Recetorok

RXR Heterodimerek

GR

Glükokortikoid

T3R

Tiroid hormon

MR

Mineralokortikoid

RAR

All-transz RA

PR

Progeszteron

VDR

1,2,5-(OH)2-VD

AR

Androgén

PPARa

Zsírsavak

PPARg

15d-Δ12,14-PGJ

EcR

Ekdizon

FXR

Epesav

CAR

Androsztán

LXR

Oxiszterol

PXR/SXR

Xenobiotikumok

GR

GR

Dimer „Orphan”- Árva Receptorok

RXR COUP

RXR

R

Monomer „Orphan” - Árva Receptorok

9-cisz RA RXR

RXR

NGFI-B

RXR

SF-1

HNF-4

Rev-erb

TR2

ROR

TLX

ERR

GCNF

II.2-7. ábra: Nukleáris receptor családok A nukleáris receptorok szerkezete A receptorok 6 doménből épülnek fel (II.2-8. ábra). A molekula N-terminális régiója (A/B doménok) variábilis (50-500 aminosav); a centrális (C domén) DNS-kötő domén (DNA binding domain, DBD) nagy mértékben konzervált (70 konzervált) dupla cinkujj. A mérsékelten konzervált (200-250 aminosav) ligand-kötő domén (ligand-binding domain, LBD; E domén) a hinge domén (D) és a variábilis hosszúságú C-terminális (F) domén között helyezkedik el. Az aktivációs funkciójú (AF)-1/2 szekvenciák az N-/Cterminális doménben találhatóak, ligand függő vagy független funkciójúak. A nukleáris receptor család számos tagja homo vagy heterodimert alkot, a DNS- és a ligand- kötő domének játszanak fontos szerepet a folyamatban.

112


Hormon és növekedési faktor jelátvitel Transzaktiváció

Dimerizáció Hinge régió

N-terminális domén

A/B

C

D

DNS-kötő domén (DBD)

C-terminális domén

F

E Ligand-kötő domén (LBD)

Ligand

II.2-8. ábra: A nukleáris receptorok szerkezete Nukleáris receptor közvetítette jelátvitel Az inaktív (nem ligandkötött) I. osztályú receptorok (pl. GR) hősokk fehérjékkel (Hsp90, 70, 40), a ko-chaperon p23-mal és immunofilinekkel (pl. FKBP52, ami dineinhez köti a komplexet) alkot citoplazmatikus receptor komplexet. Ligand hiányában a komplex dinamikus felépülést-lebomlást mutat. Ligand kötés hatására a receptor disszociál a komplexről és a mikrotubulusok mentén a nukleáris pórusokhoz szállítódik (II.2-9. ábra). II. osztályú receptorok (pl. RXR, TR), ezzel szemben ligand hiányában is a sejtmagban találhatók.


113


Hormon

Plazma membrán Citoplazma

HSP

HSP GR

GR

GR

GR

Sejtmag

RXR

R

Ko-represszor

Ko-aktivátor

Ko-aktivátor HRE

RNS polimeráz

RNS polimeráz Ko-represszor

GR

GR

Ko-aktivátor RNS polimeráz

RXR Transzkripció

HRE

HRE

R

Ko-aktivátor RNS polimeráz

Transzkripció

RXR

Ko-aktivátor RXR RNS polimeráz

Transzkripció

HRE

II.2-9. ábra: A szteroid receptorok hatásmechanizmusai DNS kötés Az intracelluláris receptorok DNS-kötő elemeit reszponzív elemeknek nevezzük (RE), általában 2x6 bázispár szekvenciát ismernek fel. A szteroid receptor család tagjai homodimereket képeznek és palindroma, invert ismétlődésekhez kötődnek, amiket 3 bázispárnyi spacer 8 (IR3) választ el egymástól. (pl. GR, MR, PR, AR: 5’-AGAACA3’; ER: 5’-AGGTCA-3’). A nem-szteroid receptorok a 5’-AGGTCA-3’ szekvencia direkt ismétlődéseihez kötődnek (DRn, direct repeats, n = a spacerek száma) és homodimereket (pl. TR, VDR) vagy heterodimereket (pl. TR, VDR, RAR, LXR, FXR, PXR, CAR, PPAR) alkotnak.

A transzkripció szabályozása Az aktivált intracelluláris receptorok transzaktivátorként működnek (II.2-10. ábra): (1) A ligand kötött receptor ko-aktivátorokat toboroz, amik up-regulálják a célgének transzkripcióját azáltal, hogy általános transzkripciós faktorokkal lépnek kölcsönhatásba. Fontos, hogy a transzkripció beindításához a 114


Hormon és növekedési faktor jelátvitel kromatinnak felnyílt állapotban (ATP-függő kromatin remodeling / hiszton acetiláció) kell lennie. (2) A ligand kötés ko-represszor disszociációhoz is vezethet, így a ko-aktivátor a tanszkripciós iniciációs komplexhez tud kötődni. Transzrepresszió estében a ligand hiányában a transzkripció folyamatosan megy végbe, a ligand kötés pedig meggátolja a transzkripciót. A transzkripció további részleteit lásd az I.4.4. fejezetben (53. oldal).

Szabályozás szintjei

Ezredmásodperc (?)

Órák-napok

G-fehérje kapcsolt receptor

Másodpercek -percek (?)

Ion csatorna

Ionotróp receptor

Ion pumpa

CBG kötés a vérben MDR a membránban

Metabolizmus és a nukleáris receptor sorsa

Molekulák találkozása

? Kötődés

? TF-ok

Fehérjék

Ko-regulátorok

RNS-ek

Dimerizáció

Sejtmag

Sejtmag

TF-ok Transzkripció

GRE

Szteroid

GRE

MR/GR

G-fehérje

RE

Neurotranszmitter

II.2-10. ábra: Genomikus és nem-genomikus szteroid hatások A nukleáris receptorok szabályozása Az intracelluláris receptorok transzkripciós aktivitását az N-terminális szerin maradékainak foszforilációja up-regulálhatja. A foszforilációt ciklin-függő kinázok PKC, PKA, ERK, PKB/Akt, JNK/SAPK, p38-MAPK végzik. Az AF-1-et a CDK, az ERK, a JNK, a p38-MAPK vagy a PKB foszforilálhatja, míg az AF-2-t az Src


115

Részletes (szisztémás) jelátviteli mechanizmusok foszforilálja az ösztrogén receptor esetében. A transzkripciós aktiváció downregulációját a DBD PKC-n vagy PKA-n keresztüli foszforilációja okozhatja.

Terápiás alkalmazások – hormon analógok Számos hormon analógját használják különböző betegségek kezelésére. A szintetikus glükokortikoid analógok gyulladáscsökkentő, immunszupresszív szerek (pl. autoimmun betegségek, transzplantáció, néhány leukémia). A szexuál szteroidokat szubsztitúciós terápiákra (endokrin betegségekben), fogamzásgátlásra és emlőtumorok kezelésére használjuk. A tiroxint tiroidektómia utáni szubsztitúciós terápiában, az A/D vitaminokat vitaminhiány estén alkalmazzuk.

II.2.4

Nem-genomikus szteroid hormon jelátvitel

Bevezetés A fent leírt intracelluláris receptor mediált jelátviteli utakat klasszikus vagy genomikus utaknak is nevezzük (lásd II.2.3. fejezet, 110. oldal), mivel gének transzkripcióját szabályozzák (II.2-11. ábra). Hosszú időre (órákra) van szükség ahhoz, hogy a az aktív hormon receptor a sejtmagba transzlokálódjon és ott a transzkripció és a transzláció végbe menjen, vagyis a hatás lassan alakul ki. Néhány szteroid hatást azonban már percek után kimutathatunk pl. ion áram változásokat, membránváltozásokat, vagy foszforiláció változásokat (II.2-11. ábra). A glükokortikoid analógokat széles körben használják akut állapotok, asztma, allergia vagy sokk kezelésére, ahol a nagy dózisban alkalmazott szteroidok azonnal kifejtik hatásukat. Egyre több adat bizonyítja azt is, hogy a glükokortikoid hormon apoptozis indukciója a tímuszban - legalábbis részben- független a genomikus hatásoktól. Ezen 116


Hormon és növekedési faktor jelátvitel hatások gyors bekövetkezése kizárja azt a lehetőséget, hogy a folyamat genomikus úton megy végbe. Ezek a szteroid hatások tehát a hormon expozíciót követően percek alatt bekövetkeznek nem-genomikus vagy alternatív jelátviteli útvonalak közvetítésével (II.2-11. ábra). Ismereteink nagy része a nem-genomikus szteroid hatásokról főkén glükokortikoidokkal és ösztrogénekkel végzett kutatásokból származnak.

Nem-genomikusGC hatások

Genomikus GC hatások Glükokortikoid

mGR Plazma membrán

Citoplazma cGR

Specifikus mGR függő hatások

Nem-specifikus GC hatások

Specifikus cGR függő hatások

STAT NFκB

IL-2

IκB

TF

GRE

nGRE Transzrepreszió

Lassú

pGRE

Transzmembrán ionáram Foszforilációs események Kálciumszint változások

TCR MAPK

Transzaktiváció

Közepes

Gyors

II.2-11. ábra: Genomikus és nem-genomikus glükokortikoid (GC) hatások


117

Részletes (szisztémás) jelátviteli mechanizmusok Nem-genomikus glükokortikoid receptor (GR) jelátvitel

Hormon

mReceptor

Plazma membrán

Citoplazma ? Más citoplazmatikus jelátviteli fehérjék

HSP90 cReceptor

Gén expresszió RE

Mitokondrium

Sejtmag

II.2-12. ábra: Nem-genomikus glükokortikoid hatások összefoglalása (1) Direkt membránhatások A glükokortikoidok (GC), különösen nagy dózisban, lipid oldékony tulajdonságuk révén képesek a plazma membrán fiziko-kémiai tulajdonságait megváltoztatni. Ilyen hatásokat figyeltek meg humán vörösvérsejteken. Emlős tumor sejtvonalakban a nagy dózisú szteroid kezelés befolyásolja a membrán lipid mobilitást, és szintén megnöveli az LPS kezelt B-limfociták membrán lipid mobilitását. A plazma membránon keresztüli Na+- és Ca2+-transzport gátlását és a mitokondrium megnövekedett H+ felvételét is megfigyelték nagy dózisú glükokortikoid kezelést követően. Kutya vese epitél sejtjein a dexamethasone (egy szintetikus glükokortikoid analóg) direkt hatott a tight junction-ok

118


Hormon és növekedési faktor jelátvitel képződésére. 20 perces kortizol kezelés megváltoztatja a principális bazolaterális amygdala neuronok ingerlékenységét. (2) Membrán GR Membrán kötött glükokortikoid receptort (GR) rágcsáló és humán limfoid sejtvonalakban és kétéltűek agyában mutatták ki. Egy humán leukémia sejtvonal korrelációt mutatott a mGR expresszió és a sejtciklus függő GC-indukálta apoptozis érzékenység között, így a mGR jelenléte korrelál egy sejttípus glükokortikoid rezisztenciájával. mGR-t humán B-sejtekben és monocitákban is találtak és a mGR+ monociták előfordulása gyakoribb reumatoid artritiszben, SLE-ben és spondilitisz ankilopoetikában, ami arra utal, hogy a mGR expressziónak lehetnek patogenetikus következményei. A mGR aktiválta jelátviteli útvonalak azonban továbbra is ismeretlenek. (3) Kölcsönhatás a GR és más jelátviteli fehérjék között Ahogy azt a II.2.3. fejezetben (110. oldal) már ismertettük, ligand hiányában a GR multimolekuláris komplexet alkot a citoplazmában. A humán T-sejteken végzett újabb vizsgálatok kimutatták, hogy a chaperon molekulák mellett (hősokk fehérjék és immunofilinek), a GR citoplazmatikus jelátviteli fehérjékkel is asszociálódik. Például a ligand kötött glükokortikoid receptor asszociálódik vagy asszociációja megnő a T-sejt jelátvitel számos molekulájával (pl. Lck, Fyn vagy ZAP-70). Ez az asszociáció pl. az Lck, Fyn vagy ZAP-70 molekulák foszforilációs változásaihoz vezet. A GR és TcR jelátviteli utak közti „cross-talk” fontos a glükokortikoid analógok immunszupressziós hatásának kialakulásában. (4) A mitokondriális GR Ligand kötés hatására a glükokortikoid receptor direkt transzlokálódik a mitokondriumba mind limfoid, mind nem-limfoid sejtekben, és elindítja az apoptotikus Identification number: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

119

Részletes (szisztémás) jelátviteli mechanizmusok kaszkádot. A ligand indukálta mitokondriális GR trasnszlokáció szoros összefüggést mutat a különböző sejttípusok apoptozis érzékenységével. A CD4+CD8+ (kettős pozitív, DP) timociták esetében a GR inkább a mitokondriumba transzlokálódik és nem a magba rövid idejű in vitro GC kezelés hatására, ami korrelál a kettős pozitív timociták magas GC indukált apoptozis érzékenységével. A mitokondriumban a GR számos mechanizmus útján fejtheti ki hatását: a) mitokondriális transzkripciós faktorként viselkedhet b) további mitokondriális transzkripciós faktorokkal kerülhet kölcsönhatásba c) pro- és anti-apoptotikus fehérjékkel kerül kölcsönhatásba (pl. a Bcl-2 család fehérjéivel). d) csökkenti a mitokondriális membrán potenciált.

További szteroid hormonok nem genomikus hatásai Az ösztrogénekről kimutatták, hogy számos változást hoznak létre a jelátviteli kaszkádban. Membrán ösztrogén receptort (mER) is sikerült kimutatni és szerkezeti adatok azt támasztják alá, hogy a mER-ek G-fehérje kapcsolt receptorok. Az ösztrogén receptor mitokondriális transzlokációja is ismert. A progeszteron befolyásolja a sejtmembrán permeabilitását és stimulálja a progeszteron membrán komponens 1-et vagy komplexeit. A plazmamembrán közelében lévő progeszteron receptor foszforilációt és az intracelluláris kalcium szint megváltozását indukálja. Membrán kötött progeszteron receptort már szintén azonosítottak. Az androgének a MAPK kaszkádot aktiválják a nem-receptor tirozin kináz c-Srcn keresztül és a PKA-n keresztül is kifejthetik hatásukat. A tesztoszteron receptor

120


Hormon és növekedési faktor jelátvitel membrán kötött formája is feltehetően részt vesz a nem-genomikus aldoszteron hatások kialakításában. A nem-genomikus aldoszteron hatások foszforilációt és kalcium szint változást okoznak, valamint befolyásolják a Na+-K+-2Cl- - transzportert. A membrán aldoszteron receptor feltehetően szintén G-fehérje kapcsolt receptor. A tiroid hormonok és a D-vitamin jelátviteli fehérjék foszforiláció változását és az intracelluláris kalcium jel megváltozását indukálják.


121


II.3

Jelátvitel a tumor sejtekben (EGF-R, Her-2R, adhéziósmolekulák)

A normál sejtek proliferációja/ osztódása szigorúan ellenőrzött folyamat. Ahogy azt a korábbi fejezetben tárgyaltuk, a növekedési faktor receptor által elindított jelátviteli utak csak korlátozott ideig aktívak és különböző mechanizmusok által azonnal downregulálódnak/leállítódnak (részleteket lásd II.2.1.1. „Növekedési faktor jelátvitel” c. fejezetben, 101. oldal). Ezen jelátviteli utak állandó aktivációja kontrollálatlan proliferációhoz, tumor kialakulásához vezet. Malignus tumorok esetén további genetikai módosulások jelennek meg, amik mutációk sorozatának következményei. A sejtek elvesztik polaritásukat és adhéziójukat az eredeti extracelluláris mátrixhoz képest, új adhéziós molekulákat expresszálnak, áttörik az eredeti szövet bazális membránját és invazívak lesznek, így a metasztatikus tumor sejtek a test távoli részeihez is eljutnak a véráramon vagy a nyirokkeringésen keresztül. Normál körülmények között a folyamatosan képződő tumorsejteket az „immun surveillance” mechanizmusok kontrollálják: például NK-sejtek, citotoxikus sejtek vagy makrofágok. Ha ezek a védekező mechanizmusok meggyengülnek, vagy a tumor sejtek kitérnek előlük, akkor a transzformálódott sejtek „megmenekülnek” („escape”) az immunrendszer elől és szisztémás megbetegedést okoznak (II.3-1. ábra és II.3-2. ábra). A tumor escape mechanizmusok során megváltozik a tumor sejt MHC-I expressziója, a tumor sejtek pro-apoptotikus fehérjéket termelnek vagy gátolják a ko-stimulációs molekulák működését. A tumor sejtek sűrű extracelluláris mátrixot termelhetnek, ami fizikailag meggátolja, hogy az immunrendszer sejtjei elérjék őket. A TGFβ-nak központi szerepe van a tumorok növekedésében: indukálja a tumort körülvevő sejtek proteáz termelését; az érújdonképződést és gátolja az immunrendszer sejtjeinek

122


Jelátvitel a tumor sejtekben (EGF-R, Her-2R, adhéziósmolekulák) működését. (II.3-3. ábra). A tumor sejtek apoptozis rezisztenssé válhatnak, például akkor, ha elveszítik a Fas iránti érzékenységüket (II.3-4. ábra).

Iniciáció, proliferáció, diverzifikáció

Mikroevolúció, az immunrezisztencia szelektálódása

Megmenekülés az immunrendszer elől „escape” szabályozatlan proliferáció

II.3-1. ábra: Immunológiai szelekció a tumorok kialakulásában: nincs két egyforma tumor

Aktivált T-sejt

„Immun-escape”

Tumor sejt

Citokinek

Citokin receptorok RCAS1R

RCAS1

Növekedés gátlása CTLA4 B7-1/2 CD28 Proliferáció TCR

MHC I

Sejt halál Fas FasL

FasL DcR3

DF3/MUC1

II.3-2. ábra: Tumor és aktivált T-sejt


123


Stróma sejt

Tumorsejt

Látens TGF-β

Proteázok Trombospondin Integrinek

Dekorin TGFBR3 AktívTGF-β

Tumorsejtre kifejtett hatások

A tumor környezetére kifejtett hatások Stróma

Endotél sejtek

↑Proteázok ↑ECM termelés

↑Érújdonképződés

Immunrendszer sejtjei ↓Fas-L aktivitás ↓ NK-sejtek

↓ T-sejtek ↓ B-sejtek

Növekedés gátlása (kezdetben) Invázió(később)

II.3-3. ábra: TGF-β szerepe a tumor jelátvitelben és a tumor fejlődésében

Citokinek?

FasL

Fas

Szöveti környezet? Immunrendszer sejtjei

Tumorsejt

II.3-4. ábra: Mi történik, ha a Fas-stimulált sejt rezisztens a sejpusztításra?

124


Jelátvitel a tumor sejtekben (EGF-R, Her-2R, adhéziósmolekulák) EGFR, HER-2 Az EGFR szerepét először malignus tumorokban, metasztatikus emlő tumorokban mutatták ki. Ezt a rossz prognózisú megbetegedést hatékonyan lehet kezelni EGFR (HER-2) ellenes monoklonális antitesttel. A trastuzumab (Herceptin) a receptorhoz kötődik és meggátolja a természetes ligand (EGF) receptorhoz való kötődését és a receptor dimerizációt (II.8-5. ábra, 155. oldal). Ez blokkolja azt a jelátviteli utat, ami a folyamatos proliferációt eredményezi (MAPK útvonal, PI3K/Akt). Fontos, hogy a kezelés megkezdése előtt meg kell vizsgálni, hogy a tumor overexpresszálja-e a HER-2t. A HER-2 gén amplifikációját kimutatták gyomor, petefészek és endometrium tumorokban is. HER-2 mutációt találtak tüdő adenokarcinómában, fej-nyaki tumorokban, kolorektális karcinómákban és melanómában. A Ras szabályozza az EGFR jelátviteli utak 75%-át (lásd bővebben II.2.1.1. „Növekedési faktor jelátvitel” c. fejezetben, 101. oldal); ezen kulcsmolekula mutációja alternatív jelátviteli utak, PI3K, Akt vagy PKC aktivációjához vezet. Fontos, hogy a Ras mutációi terápia rezisztens tumor sejt fenotípushoz vezethetnek.

Vese tumor A von-Hippel Lindau (VHL) tumor szuppresszor gén mutációja gyakran fordul elő vese tumorokban. A VHL fehérje az ubiquitinációs folyamatokban vesz részt, különösen fontos célfehérjéje a HIF-1 (hypoxia inducible factor 1). A VHL funkcióvesztő mutációja emelkedett HIF szinthez vezet, ami csökkent apoptózishoz és angiogén faktorok túltermeléséhez (pl. VEGF) vezet, mindkét folyamat szerepet játszik a tumor növekedésben.


125

Részletes (szisztémás) jelátviteli mechanizmusok Integrin jelátvitel Fiziológiásan, az integrinek horgonyozzák a sejteket az extracelluláris (ec) mátrix molekuláihoz és fontos jeleket közvetítenek az ec mátrix komponensektől, pl. a kollagéntől vagy a fibronektintől. Az integrin az ILK-n (integrin-linked kinase), a FAKon (focal-adhesion kinase) és az Src kinázon keresztül továbbítja a jeleket és szabályozza a sejtek túlélését, az apoptózist, a differenciációt és a proliferációt. Az integrin jelátvitel modulálja a növekedési faktor jelátvitelt az NCK és a PINCH révén.

126


Apoptózis jelátvitel

II.4

Apoptózis jelátvitel

Bevezetés Az apoptózis, (programozott sejthalál) a soksejtes organizmusokban zajló folyamat, ami jellemző morfológiai változásokhoz (sejt membránváltozások, sejt zsugorodás, sejtmagi DNS kondenzációja, fragmentációja stb.) és a sejt halálához vezet. Az így keletkezett membránnal körülvett sejt fragmenseket „apoptotikus testeket” a fagocita sejtek felismerik, bekebelezik és gyorsan eltávolítják, mielőtt a sejtek tartalma kiürülne és szövet károsodást és gyulladást okozna.

A kaszkád kezdete Az apoptózist számos jelátviteli út szabályozza. Az apoptotikus enzim kaszkád (kaszpáz) elindításában számos fehérje játszik szerepet, de a szabályozásnak két fő módját azonosították: az egyik a mitokondriális funkciót érinti, a másik adapter fehérjéken keresztül direkt továbbítja a jelet az apoptotikus mechanizmusokhoz.

Külső faktorok által elindított (extrinsic) apoptotikus út Az extraceluláris/extrinsic utat beindító molekulák: toxinok, hormonok, növekedési faktorok, nitrogén monoxid vagy citokinek (II.4-1. ábra) A TNF-receptor csládba tartozó molekulák (TNF-R1, Fas receptor - FasL) összekapcsolódása direkt indukálja a jelátvitelt és intermedier membrán fehérjéken pl. TRADD (TNF receptor-associated death domain) és FADD (Fas-associated death domain protein) keresztül indítja el az apoptozist. Létrejön a DISC (death-inducing signaling complex), ami a FADD, a kaszpáz-8 és a kaszpáz-10 molekulákból épül fel (II.1-20. ábra, 89. oldal és II.1-21. ábra, 90. oldal). Identification number: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

127

Részletes (szisztémás) jelátviteli mechanizmusok Belső faktorok által elindított (intrinsic) apoptoikus út Az intracelluláris/intrinsic út elindítói: pl. stressz, glükokortikoid hormon, hő, sugárzás, tápanyag hiány, vírusfertőzés, hipoxia és megnövekedett intracelluláris kalcium szint, amik membránkárosodáshoz vezetnek és a károsodott sejtben intracelluláris apoptotikus jelek felszabadulását indukálják (II.4-1. ábra).

EXTRINSZIK

INTRINSZIK

Halál ligandok (FasL, TRAIL, TNF)

Stimulus (Citokin hiány, vírusfertőzés, DNS-károsodás, irradiáció, sejtes stressz)

Halál receptorok (FasL, TRAIL, TNF)

FADD

DISC

BH3 only molekulák Anti-apoptotikus Bcl-2 család tagjai

FLIP ProKaszpáz-8 Kináz

Bax

Aktív Kaszpáz-8

Enzim

Bak

Smac Mitokondrium

Foszfatáz Kaszpáz

Cytc

Túlélést serkentő Ciklin, pro-apoptotikus Transzkripciós faktor

Apaf-1 Effektor Kaszpázok

Apoptoszóma

Kaszpáz-9

GAP/GEF

IAPs

XIAP cIAP-1 cIAP-2 Survivin

GTP-áz

Apoptózis

II.4-1. ábra: A fő apoptózis útvonalak összefoglalása A mitokondriális út: Az apoptotikus fehérjék membrán pórusok formálása révén a mitokondrium duzzadását okozzák, vagy a mitokondrium membrán permeabilitását növelik, ami apoptotikus effektorok kiszivárgásához vezet (II.4-2. ábra). A mitokondriális külső membrán permeabilizáló pórust (MAC) a Bcl-2 család (II.4-3. ábra) számos fehérjéje szabályozza, melyek serkenthetik vagy gátolhatják az apoptózist a MAC/MOMPP-ra 128


Apoptózis jelátvitel gyakorolt direkt hatásukon keresztül. A Bax és/vagy a Bak pórust formál, míg a Bcl-2, a Bcl-xL vagy a Mcl-1 gátolja a pórus kialakulását. A megnövekedett permeabilitás következtében SMAC-ok (Second mitochondria-derived activator of caspases) szabadulnak fel és jutnak a citoplazmába. A SMAC IAP-okhoz (inhibitor of apoptosis proteins) kötődik és deaktiválja azokat. A citokróm c szintén a mitokondriumból szabadul fel és az APAF-1-hez (apoptotic protease activating factor-1) és a prokaszpáz-9-hez kötődik és kialakítják az apoptoszómának nevezett fehérje komplexet (II.4-4. ábra). Ha a kaszpáz-9 aktiválódik, aktiválja az effektor kaszpáz-3-at.

Apoptotikus jel Bcl-2 P

Bcl-2

Bad P P

Bcl-2

Bad

P

Bad Mitokondrium

P P

Bax Bax Cytc PT Pórus

Cytc

Apaf-1 Apoptoszóma

Kaszpáz-9

Bcl-2 Bax Kaszpáz kaszkád

II.4-2. ábra: Mitokondriális apoptózis útvonal


129


BH4

BH3

BH1

BH2

TM

Anti-apoptotikus

Bcl-2, Bcl-XL Mcl1, CED9

BH4

BH3

BH1

BH3

BH4

Pro-apoptotikus

BH3

BH1

BH2

BH1

BH4

A1, Bfl-1

BH2

BH2

BH3

BH3

BH3

TM

Bax, Bak

TM

Diva

TM

Bcl-Xs

TM

Bik, Bim

Bad, Bid, Egl-1

II.4-3. ábra: Bcl-család Apoptoszómakialakulása Cytc

Pro-kaszpáz-9 toborzása Prokaszpáz -9

Cytc

Cytc

Apaf-11

Cytc

Cytc

Kaszpáz aktiváció

Cytc

Cytc

II.4-4. ábra: Apoptoszóma A kaszpáz kaszkád A kaszpázok cisztein-függő aszpartát irányította proteáz (ciszein proteázok) család tagjai, gyors aktivációra képesek. A 12 ismert humán kaszpáz közül az iniciátor kaszpázok (pl. kaszpáz-2,-8,-9, és -10) az effektor kaszpázok inaktív, pro-formáit hasítják, miközben aktiválják őket. Az effektor kaszpázok (pl. kaszpáz -3, -6,-7) a sejtben található más fehérje szubsztrátokat hasítanak az apoptotikus folyamatok beindításához. Inaktív pro-kaszpáz formában szintetizálódnak, ami egy prodomént 130


Apoptózis jelátvitel tartalmaz, melyben vagy CARD domén (pl. kaszpáz-2 és -9) vagy DED domén (death effector domain, pl. kaszpáz-8 és -10) található, ami lehetővé teszi, hogy a kaszpázok kölcsönhatásba kerüljenek olyan molekulákkal, melyek az aktivitásukat szabályozzák. A kaszpáz kaszkád aktivációját idézi elő: (1) Granzim B: (Tc és NK sejtekből szabadul fel) kaszpáz-3-at és -7-et aktivál (2) Halál receptorok: (Fas, TRAIL receptorok és TNF receptor), kaszpáz-8-at és -10-et aktiválnak (3) Apoptoszóma (citokróm c és a Bcl-2 család által szabályozott), kaszpáz-9-et aktivál. A kaszpázok végső célmolekulái: (1) nukleáris lamiok (2) ICAD/DFF45 (inhibitor of caspase activated DNase or DNA fragmentation factor 45) (3) PARP (poly-ADP ribose polymerase) (4) PAK2 (P 21-activated kinase 2). Az apoptózis kaszkádot számos ponton lehet befolyásolni engedélyezett vagy még fejlesztés alatt álló szerekkel (II.4-5. ábra).


131


TRAIL DR4/DR5

Kemoterápia

HDAC inhibitorok

FADD

Bcl-2 inhibitorok

Kaszpáz-8 Bcl-2

c-FLIP

Bcl-xL tBid

Bid

Pro-kaszpáz-3

Bax Bak Cytc

p53

Kaszpáz-9

Smac/ Diablo

IAPs

Kaszpáz-3

IAP inhibitorok

P lκB

lκB

APOPTÓZIS

P

Proteoszóma inhibitorok

NF-κB Proteoszóma

NF-κB

DNS-károsodás

c-IAP1 c-IAP2 XIAP

Bcl-2 Bcl-XL Bfl-1/A1 c-FLIP DcR1

II.4-5. ábra: Beavatkozás az apoptózis jelátvitelbe

132


Receptor interakciók, jelátviteli „cross-talk”

II.5

Receptor interakciók, jelátviteli „cross-talk”

Bevezetés Ahogy azt az előző fejezetekben tárgyaltuk, az evolúció során számos jelátviteli útvonal alakult ki. Habár a jel specificitása miatt szükség van az egyes jelátviteli utak precíz elkülönítésére, egy komplex élettani stimulus párhuzamosan több jelátviteli utat aktivál, ami alapot ad az utak közti interakcióra. A jelátviteli útvonalak funkcionális hálózatok. Néhány fehérje több jelátviteli út tagja is lehet és így a jelátviteli utak módosíthatják egymás funkcióját (szinergizmus/antagonizmus). Ezek a hálózatok alapulhatnak direkt fehérje interakción, ilyen például egy nagy jelátviteli komplex, amit scaffold fehérjék és a citoszkeleton szerveznek össze, vagy lehetnek funkcionális interakciók, mint a poszttranszlációs módosulások pl. foszforiláció/defoszforiláció. Praktikus szemszögből nézve, még azoknak a gyógyszereknek is lehetnek mellékhatásaik, melyeket egy jelátviteli útra a legspecifikusabbnak tartunk (további részletekért lásd a „A jelátviteli utak módosítása gyógyszerekkel” a következő fejezetben), éppen a jelátviteli „crosstalk” eredményeként.

A jelátviteli „cross-talk”„szintjei” (1) Receptor interakciók A sejtfelszíni receptorok multimer komplexeket alkotnak és befolyásolják egymás funkcióját. A receptor-receptor interakciók fontos szerepet játszanak a jelek integrálásában: a bejövő jelek szűrésében és az együtt érkező jelek egységbe rendezésében. A G-fehérje kapcsolt receptorok ismert heterodimerizációját tartották az intramembrán receptor-receptor kölcsönhatás alap molekuláris modelljének. A


133

Részletes (szisztémás) jelátviteli mechanizmusok heterodimerizáció a különböző típusú receptor monomerek receptor specifikus interakcióján alapul. A

GABAB

heterodimer

receptorok

felfedezését,

számos

7-TM/GPCR

heterodimerizációjának pl. δ/κ opioid receptorok megfigyelése követte. Bizonyos típusú GPCR-ek heterodimerizációjának felfedezése pl. somatostatin SSTR5/dopamin D2 és adenozin A1/dopamin D1 mérföldkövet jelentettek a receptor interakciók vizsgálatában. Ezek a heterodimer komplexek vagy direkten intramembrán receptor-receptor interakció, vagy néha indirekten adapter fehérjék közvetítése révén jönnek létre. A GPCR-ek ioncsatorna receptorokkal is asszociálódhatnak, például a GABAA/dopamin D5 receptor heterodimerizációja esetén. A központi idegrendszer ilyen receptor mozaik komplexei speciális integratív funkcióval bírnak, és a tanulás és a memória molekuláris alapját képezhetik. A növekedési faktor receptorok (receptor tirozin kinázok) gyakran lépnek kölcsönhatásba

integrinekkel,

amik

extracelluláris

mátrix

fehérjék

kötésére

specializálódtak (II.5-1. ábra).

134


Receptor interakciók, jelátviteli „cross-talk” Növekedési faktorok

ECM

Integrinek

PI3K

PTEN

-

ILK

IRS1 Pinch Nck2

IBP-k -

+

GSK3

+ β-katenin LEF1 PKB

+ -

+ AP1 Apoptózis gátlása

Érújdonképződés

Ciklinek

Kadherinek

Invázió, proliferáció

II.5-1. ábra: Növekedési faktor receptor – integrin jelátvitel interakció A veleszületett immunrendszer receptorai, a komplement receptor 3 és a Toll-like receptorok között is írtak le párbeszédet. (2) Plazma membrán proximális jelátviteli komplexek Gyakori téma néhány jelátviteli útvonallal kapcsolatban, hogy receptor aktivációt követően plazma membrán közeli jelátviteli komplexek alakulnak ki. Ezeket a komplexeket gyakran adapter vagy scaffold fehérjék tartják össze. Ilyen komplexek alakulnak ki a BcR/TcR jelátvitel és a növekedési faktor jelátvitel kezdeti lépései során. (3) Citoplazmatikus jelátviteli komplexek, a jelátviteli utak elágazódása és egyesülése Scaffold fehérjék, chaperonok és a citoszkeleton rendezik össze a citoplazmatikus jelátviteli komplexet (II.5-2. ábra). Az útvonalak elágazódása és egyesülése gyakori ezen a szinten. Például a Ras fontos elágazódási pontja a növekedési faktor receptor mediálta jelátviteli hálózatnak. A glükokortikod receptor (GR) és a ZAP-70 szintén Identification number: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

135

Részletes (szisztémás) jelátviteli mechanizmusok citoplazmatikus komplexet alkot a T-sejtekben (részleteket lásd a II.2.4. „Nemgenomikus glükokortikoid receptor (GR) jelátvitel” c. fejezetben, 118. oldal). A kinázhorgonyzott fehérjék (AKAP) 3 jelátviteli utat integrálnak: a Ras-MAPK, a cAMP-PKA és a Ca2+-utakat.

Trombociták Keringő sejtek és mediátorok

EGF TNFα ANG II

PDGF

5HT (szerotonin)

ALK/End vagy BMPR 1-2 Sejtfelszíni receptorok

BMPk vagy TGFβ

5HT transzporter Gfehérje

O-2

P Angiopoetin

NO TIE MAP Kinázok B A

VEGF KDR

K+-csatornák

ERK JNH

Apoptózis SMC tónus

Növekedés Citokinek ↓Apoptózis

NO helyreállítja hypoxia blokkolja

Intracelluláris jelátvitel

SMA-k

Endotelin

Anorexigének

Nukleáris Transzkripciós Faktorok

ES Receptor

Vírus infekció? HIV, HHV-8

Ösztrogén

AML Gén aktiváció vagy represszió

Apoptózis

Egyéb termékek

Proliferatív fenotípus

Elasztáz Tenascin-c

II.5-2. ábra: A jelátviteli utak konvergációja (4) Transzkripciós faktorok Végül, ahogy azt az I.4.4. fejezetben (53. oldal) leírtuk, a transzkripciós faktorok kölcsönhatásba lépnek azért, hogy a transzkripciós gépezet aktivációját szabályozzák. Például a GR kölcsönhatásba léphet az AP-1, CREB, NFκB, T-bet, STAT és PU.1 faktorokkal. A TNFR és GR jelátviteli utak a transzkripció szabályozás szintjén egyesülnek.

136


Wnt receptor jelátvitel

II.6

Wnt receptor jelátvitel

Áttekintés A Wnt (a név egy Drosophilában leírt mutációból származik: „wingless”= szárny nélküli) jelátvitel az egész életen keresztül kulcsszerepet játszik, az embrionális fejlődéstől kezdve, a különböző fajta tumorok kialakulásán át, a különböző öregedési folyamatokig. A Wnt jelátvitel számos szervben széles körben szabályoz fejlődési eseményeket és sejtes funkciókat, ami arra utal, hogy a nagymértékben komplex Wnthez kapcsolódó intracelluláris jelátviteli események szigorú szabályozást igényelnek. Az alábbi táblázat egérben, Drosophilában és C. elegansban leírt Wnt mutációk fenotípusos következményeit foglalja össze.

II.6-1. táblázat: Wnt jelátvitel Gén

Szervezet

Fenotípus

Wnt-1

Egér

Középagy és a kisagy elvesztése

Wnt-2

Egér

Placenta defektusok

Wnt-3A

Egér

Kaudális somiták és farokkezdemény hiánya

Wnt-4

Egér

Vese defektus

Wnt-7A

Egér

Végtagok ventraliációja

wingless

Drosophila

Szegmens polaritás, ízületfejlődés, sok egyéb

Dwnt-2

Drosophila

Izom defektus, herefejlődés

lin-44

C. elegans

Aszimmetrikus sejtosztódás zavara

mom-2

C. elegans

Endoderma indukció defektus

(After: A. Wodarz and R. Nusse; Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 1998. 14:59–88)

A Wnt jelátvitel szerepét feltételezik a sejt adhézió és az Alzheimer-kór patogenezisében is (II.6-1. ábra – II.6-3. ábra). Identification number: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

137


Wnt

Axin

Kadherin

β-katenin

P

β-katenin

β−katenin

GSK3b

Kadherin

α−katenin

α−katenin

Kadherin

Dsh

α-katenin

β-katenin

Kadherin

β-katenin

α-katenin

Frizzled

APC

β-katenin + Wnt jel

Nincs Wnt jel

P β-katenin degradáció

Adherens junkció

β-katenin LEF/ TCF

Transzkripció

Sejtmag Citoplazma

Plazma membrán

II.6-1. ábra: β-katenin a sejt adhézióban βAP

Excitotoxicitás

Activált mikroglia

Sejtciklus aktiváció Abnormális DNS szintézis

NO DNS károsodás

+ p53

Bax

Dkk1

Gyors bAP toxicitás

Wnt

Apoptózis

Késleltetett bAP toxicitás

NFT-k kialakulása

II.6-2. ábra: Alzheimer betegség I. 138


Wnt receptor jelátvitel Korai állapot

Késői állapot

Wnt

Wnt

Wnt Frizzled

Frizzled

Frizzled Dkk1

Dkk1

βAP

Krm

Krm

Akt

PI3K

PI3K

Akt

Akt

Dsh

P

GSK3β β-katenin

GSK3β

GSK3β

↓ Tau foszforiláció

↑ Tau foszforiláció

Sejtmag β-katenin LEF/ TCF

GD3 szintázciklin D1

II.6-3. ábra: Alzheimer betegség II. A Wnt jelátvitel számos más jelátviteli kaszkáddal létesít kapcsolatot például Bmp/Noggin,

Notch/Delta,

fibroblaszt

növekedési

faktor

(FGF),

epidermális

növekedési faktor (EGF) és Hedgehog utakkal, és így komplex sejtes folyamatok szabályozásában vesz részt. A Wnt család 19 szekretált glikoproteinből áll és számos fejlődési folyamatot pl. sejt proliferációt, sejt differenciációt, sejt polaritást és sejt migrációt szabályoz. A receptoraik a Frizzled 7-TM receptor család tagjai, azonban egy aktív Wnt-Fz receptor komplex kialakulásához koreceptorok, a LRP5/6 (low-density lipoprotein related protein 5 and 6), jelenlétére is szükség van. A receptor komplexből két fő jelátviteli útvonal indul ki (II.6-4. ábra): a kanonikus vagy β-katenin függő és a nem-kanonikus út. A Wnt molekulákat az alapján csoportosítjuk, hogy melyik Wnt jelátviteli utat aktiválják: megkülönböztetjük a kanonikus (Wnt1, Wnt3, Wnt3a, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8) és a nem-kanonikus (Wnt5a, Wnt4, Wnt11) út aktivátorokat, habár a nem szabályszerű viselkedés, mind a ligandokra, mind a receptorokra jellemző. Identification number: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

139

Részletes (szisztémás) jelátviteli mechanizmusok Wnt/Ca2+

Kanonikus útvonal

„Planar” sejt polaritás

LRP5/6 Wnt

Wnt5a

Wnt11

Frizzled

Frizzled

Frizzled

Stbm

Plazma membrán

Citoplazma Axin

? G -fehérjék?

Dsh DIX

PDZ

DEP PLC

Prickle

Dsh DIX

PDZ

?

Ca2+

DEP Daam1

RhoA

Rac

ROCK

JNK

GSK3b Axin

PKC

β-katenin

Kalcineurin β-TrCP

Nincs Wnt jel

CaMKII

APC

P

NFAT

Citoszkeletális újraszerveződés β-katenin

β-katenin Sejtmag

LEF/ TCF

NFAT

Gén transzkripció

II.6-4. ábra: Wnt jelátviteli útvonalak Kanonikus út A kanonikus vagy β-katenin/Tcf függő Wnt jelátvitel (II.6-5. ábra) részleteiben vizsgált folyamat, amiről kimutatták, hogy nagyon sokféle sejtben jelen van pl. a fejlődő timocitákban vagy a tímusz epitéliumban. A kanonikus Wnt-k hiánya esetén a glikogén szintáz kináz-3β (GSK-3β) aktív marad, ami a β-katenin és az axin foszforilációjához vezet a „scaffolding” fehérje komplexben (II.6-4. ábra, 140. oldal). A foszforilált βkatenin ubiquitináció és 26S protoszómális degradáció célpontja, ezért a β-katenin citoplazmatikus szintje csökken. Wnt-ok jelenlétében azonban, a Wnt-Fz-LRP6 komplexből érkező jelek a Dishevelled citoplazmatikus jelátviteli molekula (Dvl) három doménjének foszforilációjához vezetnek. A Dvl aktivációja végül a GSK-3β foszforilációjához és ennek következtében gátlásához vezet. A GSK-3β gátlása a βkatenin stabilizációjához és citoplazmatikus felhalmozódásához vezet, ami a sejtmagba transzlokálódik és aktív transzkripciós komplexet képez a T-sejt faktor (LEF1, TCF1, 140


Wnt receptor jelátvitel TCF3, TCF4) transzkripciós faktor család tagjaival és a transzkripció iniciátor p300-zal. A transzkripciós komplex sikeres összeszerveződése számos célgén aktivációjához vezet pl. ciklin-D1, c-myc, c-jun, Fra-1 VEGFR, stb. (további célgének a Further target Nusse’s Wnt honlapon: http://www.stanford.edu/~rnusse/wntwindow.html tekinthetők meg).

LRP5/6 Wnt8 Frizzled Dkk1 Plazma membrán

Citoplazma Krm Dsh Axin

DIX

PDZ

DEP

β-katenin

TCF3 Sejtmag Anterior gének

II.6-5. ábra: Kanonikus Wnt útvonal


141

Részletes (szisztémás) jelátviteli mechanizmusok Nem –kanonikus út A nem-kanonikus jelátviteli út (II.6-4. ábra, 140. oldal) független a β-katenintől és a „poláris sejt polaritás” (PCP) vagy c-Jun-N Terminális Kináz (JNK)/Aktiváló Protein (AP1) függő és a Ca2+ vagy Protein kináz C (PKC)/Kalmodulin Kináz (CaMKII)/ NFAT (Nuclear Factor of Activating T- cells) függő útvonalakba ágazik.

A Wnt-ok szerepe a T-sejt fejlődésben A Wnt-ok és a szolubilis Fz-k manipulálása a T-sejt fejlődés zavarához vezet, ami a Wnt-függő

jelátviteli

utak

fontosságát

mutatja

T-sejt

proliferációban

és

differenciációban. A Wnt ligandok és receptorok különböző expressziója a tímusz egyes sejttípusaiban arra világít rá, hogy a T-sejt fejlődést indirekt események befolyásolják, amiket a tímusz epitélen belüli Wnt jelátvitel vált ki. A Wnt-k és a Fz-k expressziója különbözik a kortikális és a medulláris epitél sejtekben. Míg a kortexben hiányzik a Fz9, a medulla az összes ismert Wnt receptort expresszálja. A kortex-szel összehasonlítva a medulláris epitél sejtekben megnő a nem-kanonikus Wnt-k expressziója, különösen a Wnt5a és Wnt11expresszió, ami arra utal, hogy a különböző Wnt-k expressziója fontos szerepet játszhat a tímusz epitélium sejtek differenciációjában.

142


Jelátvitel az idegrendszerben

II.7

Jelátvitel az idegrendszerben

Neurotranszmissziónak nevezzük azt a folymatot, amikor egy jel neuronok között továbbítódik. Az akciós potenciál a preszinaptikus neuron plazmam membránja mentén terjed, amíg el nem éri a sejt határát. Ahhoz hogy a jelet továbbadhassa a posztszinaptikus neoronnak, neurotranszmittereket szabadít fel, melyek a szinaptikus résbe jutnak. A kémiai messengerek hidat képeznek a két neuron közti fizikai akadály között és biztosítják, hogy a posztszinaptikus sejt átvegye a jelet (I.2-3. ábra, 25. oldal). A neurotranszmitterek két fő receptortípushoz kötődnek: ligand függő- ioncsatorna vagy metabotróp (általában a 7-TM családba tartozó) receptorokhoz (II.7-1. ábra) (a receptor típusok további részleteit lásd a I.2. fejezetben, 22. oldal). A ligandfüggő ion-csatorna receptorok a ligand kötéséért felelős receptorok és az ion csatornák kombinációi. A metabotróp receptorok általában G-fehérjéket aktiválnak és indirekt módon másodlagos messengerek és jelátviteli kaszkádok révén változtatják meg az ioncsatornák működését. A további receptorok lehetnek tirozin kinázok vagy guanilát ciklázok.


143

Részletes (szisztémás) jelátviteli mechanizmusok Ionok Neurotranszmitter

Plazma membrán

Citoplazma Ion csatorna

Neurotranszmitter

Receptor

Plazma membrán

Citoplazma

α

β

γ

α GTP

GTP

Effektor fehérje

Intracelluláris messengerek

G-fehérje aktiváció G-fehérje alegységek vagy intracelluláris messengerek módosítják az ion csatornák működését

II.7-1. ábra: Neurotranszmisszió II.7.1

Az acetilkolin (Ack)

Az Ack-t az kolin acetiltranszferáz enzim szintetizálja, ami a kolinhoz egy acetát csoportot kapcsol. A kolint a kolinerg idegek nagy affinitású transzport folyamat során veszik fel (nátrium-kolin kotranszport), ami a Na+/K+ ATPázhoz indirekten kötött. Az Ack a neuronok végzőréseiben preformált neurotranszmitter formájában raktározódik; a felszabadulása depolarizáció függő, amit a kalcium ion beáramlása direkt módon közvetít. Az Ack muszkarin és nikotin receptorokan fejti ki hatásait (II.7-2. ábra és II.7-3. ábra).

144


Jelátvitel az idegrendszerben Acetilkolin nikotin receptora (nAChR) H3C

O

NH2

CH3

nAChR egy alegysége

N H3C

Ligand kötő hely

O

COOH

CH3

Acetilkolin

Acetilkolin muszkarin receptora (mAChR) Acetilkolin Extracelluláris TM 1

Extracelluláris

M1, M3, M5

TM 2

TM 3

TM 4

4 hidrofób transzmembrán domén (TM1-4)

M2, M4 Citoplazmatikus

TM TM TM TM TM TM TM 2 4 6 1 3 5 7

Citoplazmatikus

TM TM TM TM TM TM TM 2 4 6 1 3 5 7

Gq/11

5 összekapcsolódó alegység (2xα + 3xβ nAChR) Ionok áramlanak a póruson keresztül

Gi/0

Neurotranszmitter kötő hely ↑ [Ca2+]

↓ Adenilát cikláz

↑ MAP kinázok

↑ MAP kinázok

↑ PLCβ

↑ GIRK csatornák

↓ M áram

↓ Feszültség-függő Ca2+-csatornák

Extracelluláris

α

β

Citoplazmatikus

Intracelluláris ion koncentráció változás

II.7-2. ábra: Acetilkolin

Nicotin izom Fenilltrimetil-ammónium Elapid a-toxinsok d-Tubokurarin

Nicktin Junkcionális [(a1)2bed] Nikotin Embrionális [(α1)2βγδ] Nikotin Idegi α2 (α-toxin inszenzitív)

Nikotin

Nikotin Idegi β2

Nikotin

Nikotin Idegi α3 (α-toxin inszenzitív)

d-Tubokurarin

Nikotin Idegi β3 Nikotin Idegi α4 (α-toxin inszenzitív)

Nicotin ideg (α +β )

Nikotin Idegi β4

Dimethylphenyl-piperazinuim, Cystine

Nikotin Idegi α5 (α-toxin inszenzitív)

Trimethaphan Neuronal bungarotoxin

Nikotin Idegi β5

Kolinerg

Nikotin Idegi α5 (nem-funkcionál αalegységek nélkül)

Acetilkolin

Nikotin Idegi α6 (α-toxin inszenzitív) Nikotin Idegi α7 (α-toxin szenzitív) Nikotin Idegi α8 (α-toxin szenzitív) Nikotin Idegi α9 Muszkarin m1-M1 Pirenzepin

Muszkarin

Oxotremorin

Muszkarin, Pilokarpin

Propillbenzililkolin mustár Quinuklidinil benzilát

Atropin

Muszkarin m2-M2 Metoktramin Muszkarin m4-M4 Himbakin Muszkarin m3 -M3 Hexahidro-siladifénidol Muszkarin m5 -M5

II.7-3. ábra: Acetilkolin receptorok


145

Részletes (szisztémás) jelátviteli mechanizmusok Muszkarin receptorok a 7-TM receptor család tagjai, hét transzmembrán régióból, három extra- és három intracelluláris hurokból épülnek fel (I.2-4. ábra, 27. oldal és I.2-5. ábra, 28. oldal). Az agonisták a transzmembrán régiók extracelluláris részei és a szomszédos extrecelluláris hurkok által együttesen alkotott régiókhoz kötődnek. A muszkarin receptorok G-fehérjékhez kötődnek a harmadik intracelluláris hurok révén. A muszkarin receptorok öt típusa ismert: M1, M2, M3, M4 és M5. Az M2 és M4 receptorok a Gi fehérjékat aktiválják, amik az adenilát cikláz gátlása révén csökkentik cAMP szintet. Az M1, M3 és M5 receptorok a Gq-n keresztül aktiválják foszfatidil-inozitol-specifikus

foszfolipáz

C-t,

ami

az

IP3

közvetítésével

az

endoplazmatikus retikulumban található kalcium felszabadulásához vezet. A nikotin receptorok (I.2-3. ábra, 25. oldal) pentamer molekulák, amik 2α, egy β, γ (ε a vázizmokban) és δ alagységekből épülnek fel és együtt ion csatornát alkotnak. Az α alegységek felelősek az Ack megktötéséért; mindkét α alegységnek meg kell kötnie egy acetilkolin molekulát ahhoz, hogy az ioncsatorna kinyíljon. A nikotin receptoroknak négy transzmembrán doménjük van (TM1, TM2, TM3, TM4) , mind az N-, mind a C-terminális domének extracellulárisak. A TM2 alkotja az ioncsatorna falát, az ebben a régióban elhelyezkedő aminosavak határozzák meg a molekula vezetőképességét és ion szelektivitását. Az N-terminális közelében egy elég nagy extracelluláris domén található, ami az Ack kötéséért felelős. A nikotin receptorok aktivációja az intracelluláris kalcium szint emelkedéséhez vezet. A megnövekedett intracelluláris kalcium szint aktiválja az adenilát-ciklázt, a protein kináz A-t és C-t, kalcium–kalmodulin-dependens protein kinázt (CaM-kináz) és a foszfatidil-inozitol 3kinázt (PI3K). Ezek további downstream célmolekulákat foszforilálnak, köztük a MAPkinázokat, amik transzkripciós faktorok aktiválásához vezetnek.

146


Jelátvitel az idegrendszerben II.7.2

Noradrenalin (NA)

A NA szintézisekor először a tirozin oxidációja során L-DOPA (a tirozin 3monooxigenáz által) képződik, ami dekarboxilálódik dopaminná, majd oxidáció során NA keletkezik. Egy további metilációs lépés során, amit a feniletanolamin Nmetiltranszferáz végez (PNMT-phenylethanolamine N-methyltransferase) az adrenerg neuronok citoplazmájában és a mellékvese velő sejtjeiben a noradrenalinból adrenalin (A) képződik. Az adrenalin és a noradrenalin α- és β receptorokon keresztül fejtik ki hatásukat (II.2-6. ábra, 109. oldal). Molekuláris klónozás segítségével három α1 altípust: α1A, α1B, és α1D; három α2 altípust: α2A, α2B, és α2C; és három β-adrenalin receptor altípust : β1, β2, és β3 sikerült azonosítani. Az adrenalin receptor jelátvitel további részleteit lásd a II.2.2.1. fejezetben (108. oldal).

II.7.3

Dopamin (D)

A dopamin bioszintézisét már fent ismertettük. A dopamin receptorok a 7-TM G fehérje-kapcsolt receptor család tagjai. A dopamin receptoroknak legalább öt altípusa létezik: D1, D2, D3, D4, és D5. A D1 és D5 receptorok Gs fehérjéhez kötődnek és az adenilát ciklázt aktiválják, míg a D2/D3/D4 receptorok a gátló Gi-hez kötődnek és gátolják az adenilát cikláz aktivitását.

II.7.4

Szerotonin (5-HT)

A szerotonin 5-HT receptorokon keresztül hat. Az 5-HT receptorok és jelátviteli folyamataik ismertetését lásd a II.2.3. fejezetben (110. oldal).


147

Részletes (szisztémás) jelátviteli mechanizmusok II.7.5

GABA

A GABA az egyik fő gátló neurotranszmitter az emlősök központi idegrendszerében. A GABA az idegsejtekben az L-glutaminsav dekarboxilációjakor képződik, amit az Lglutaminsav

dekarboxiláz

végez. A

osztályozzuk: GABA A, GABA

B

GABA

receptorokat

a

következőképpen

és GABAC. A GABAA és GABAC ligand függő

ioncsatornák (I.2-2. ábra, 24. oldal), míg a GABAB G-fehérje kapcsolt receptorokon keresztül hat.

II.7.6

Glutamát

Legalább

négy

glutamát

receptort

különíthetünk

el

az

emberi

agyban.

Megkülönböztetünk ionotróp és metabotróp glutamát receptorokat. Az NMDA, AMPA és kainát receptorok ionotróp receptorok, ligand függő nem-szelektív kation csatornák, melyek a K+, Na+ és néha Ca2+ áramlását teszik lehetővé glutamát kötés hatására. A glutamátnak nyolc különböző típusú metabotróp receptora van, valamennyi G-fehérje kapcsolt receptor amiket I, II, és III csoportokba osztunk.

II.7.7

Glicin

A glicin lehet neurotranszmitter is. A glicin receptorok öt különböző glikozilált membrán fehérjéből épülnek fel, amik α és β alegységeket alkotnak (I.2-2. ábra, 24. oldal). A β alegység hiányában az α alegységek homodimer glicin receptor kiaakítására képesek. Ha glicin kötődik a receptorhoz, a pórus kinyílik és a Cl− passzívan diffundálhat a membránon keresztül.

148


Jelátvitel az idegrendszerben II.7.8

ATP

Az ATP receptorok vagy ionotróp P2X vagy G-fehérje kapcsolt receptorok P2Y. Az ionotróp receptorok a kalcium jelen keresztül befolyásolják a sejtek működését, míg a G-fehérje kapcsolt receptorok hatásait a IP3 és a DAG közvetítik.


149


II.8

A jelátviteli utak módosítása gyógyszerekkel

Bevezetés Ahogy azt láthatjuk, a sejtekben egy rendkívül komplex hálózat felelős a jelátviteli folyamatokért. A legtöbb esetben a sejtfelszíni receptor számos molekulán keresztül jut el a specifikus célgénekig. Ez a komplexitás lehetőséget biztosít arra, hogy számos molekula terápiás beavatkozások célpontja legyen (II.8-1. ábra, II.8-2. ábra és II.8-1. táblázat). Az elmúlt évek biotechnológiai fejlődése különböző monoklonális antitestek és más molekulák termelését/szintézisét tette lehetővé, amik interferálhatnak bizonyos jelátviteli utakkal. Például a HER2 jelátviteli út hatékonyan gátolható a receptor elleni monoklonális antitesttel, kináz gátlókkal, Hsp-90 gátlóval, vagy DNS szinten szekvencia specifikus antiszensz oligonukleotidokkal. (II.8-3. ábra).

G-fehérje kapcsolt receptorok

RAS

RAS

GTP

G-fehérjék

PLC

SOS

GRB2

PIP2

PIP3

PIP3

PI3K

PDK

AKT

PIP2 PTEN

GDP

E

PKC

C

RAF AC

Receptor és nem-receptor tirozin kinázok

A

mTOR

B

PKA

4-EBP

p70S6

D

MEK1/2

F

↑ Transzláció Riboszóma fehérje rRNS MAPK 1,2,3

↑ Sejtciklus CDK4, 6 Cyclin D c-Jun

c-Myc

NF-IL6

S

Ciklin D

Ciklin A,E

G1

ATF

CDK2

G2

Specifikus gén termékek

CDK1

M Sejtmag

Ciklin B

II.8-1. ábra: Potenciális célpontok a jelátviteli utakban

150


A jelátviteli utak módosítása gyógyszerekkel D

C

B

A

Proteolízis

E

F

Szubsztrát

G

Fehérje ATP

DNS

RNS

P

II.8-2. ábra: Az intervenció különböző szintjei II.8-1. táblázat: Klinikai fejlesztés alatt álló kináz gátlók Célmolekula

EGFR

Növekedésifaktor receptor gátlók

Gyógyszer IMC-C225 cetuximab (Erbitux, Imclone) ABX-EGF (Abgenix) EMD 72000 (Merck KgaA Darmstadt) RH3 (York Medical Bioscience) ZD1839 gefitinib (Iress; AstraZeneca) MDX-447 (Medarex/Merc KgaA) OSI-774 eriotinib (Tarceva; OSI-Pharmaceuticals) CI-1033/PD183805 (Pfizer) EKB-569 (Wyeth Ayerst) GW2016/572016 (GlaxoSmithKLine)

Szerkezet

Fejlesztés szintje

Monoklonális anttest Monoklonális antitest Monoklonális antitest Monoklonális antitest Monoklonális antitest bivalens Kis-molekula kináz gátló Kis-molekula kináz gátló

Fázis III Fázis II Fázis I Fázis II Fázis I Fázis III Fázis III

Kis-molekula kináz gátló Kis-molekula kináz gátló Kis-molekula kináz gátló

Fázis II Fázis I Fázis I

HER2/neu

Trastuzumab (Herceptin; Genentech) MDX-210 (Medarex/Novartis) 2C4 (Genentech) 17-AAG (Kosan)

Monoklonális antitest Monoklonális antitest Monoklonális antitest geldanamycin származék HSP90-et gátol

Regisztrált Fázis I Fázis I Fázis I

PDGFR/c-Kit/ BCR-ABL

Imatinib (STI571/Gleevec; Novartis)

Kis-molekula kináz gátló

Regisztrált

Ras gátlók

Ras

ISIS 2503 (Isis Pharmaceuticals) R115777 (Johnson and Johnson) SCH66336 (Schering-Plough) BMS214662 (Bristol-Myers-Squibb)

Antiszensz oligonukleotid Farnezil transzferáz gátló Farnezil transzferáz gátló Farnezil transzferáz gátló

Fázis II Fázis II/Fázis III Fázis II Fázis II

Raf

ISIS 5132/CGP698-46A L-779, 450 (Merck) BAY 43-9006 (Onyx/Bayer)

Antiszensz oligonukleotid Kis-molekula kináz gátló Kis-molekula kináz gátló

Fázis II

Raf gátlók

MEK

PD 184352/CI-1040 (Pfizer) U-0126 (Promega)

Kis-molekula kináz gátló Kis-molekula kináz gátló

Fázis II Fázis I

MEK gátlók

mTOR gátlók

mTOR

CCI-779 (Wyeth) RAD001 (Novartis) Rapamacyn/sirolimus (Wyeth)

Ciklin-függőkináz gátlók

mTOR kináz gátló, az FKBP12 kötéssel mTOR kináz gátló, az FKBP12 kötéssel mTOR kináz gátló, az FKBP12 kötéssel

Fázis II Fázis I daganat terápiában Fázis II/III mint immunszupresszáns Regisztrált immunszupresszáns

CDK

Flavopirodol/HMR-1275 (Aventis) E7070 (EISAI) CYC202 (Cyclacel) BMS-387032 (Bristol-Myers-Squibb)

PKC

ISIS 3521/LY900003 Affinitak (Isis Pharmaceuticals) CGP41251PKC412 (Novartis) Bryostatin-1 (GPC Biotek) UCN-01 (Kyowa Hakko Kogyo)

PKC-b

LY333531 (BI Lilly)

Kis-molekula kináz gátló

Fázis I onkológia Fázis II/III diabetikus neuropátia

PDK1

UCN-01 (Kyowa Hakko Kogyo)

Staurosporin analóg

Fázis I/II

További célmolekulák és szerek


Kis-molekula kináz gátló Kis-molekula kináz gátló Kis-molekula kináz gátló Kis-molekula kináz gátló

Fázis II

Antiszensz oligonukleotid Staurosporin analóg Kis-molekula kináz gátló Staurosporin analóg

Fázis II Fázis I Fázis I Fázis I Fázis III Fázis II Fázis II Fázis I/II

151

Részletes (szisztémás) jelátviteli mechanizmusok Anti-ErbB antitest (pl. Herceptin) ErbB dimer

Inaktív ErbB dimer

Ligand

Tirozin kináz inhgátlók (pl. trifosztinok)

Hsp90 gátlók (pl. geldanamycin)

Foszfoproteinek és downstream jelátviteli események Hsp90

scFvs Triplex-képző oligók, antiszensz oligók

Éretlen ErbB

Transzkripció Transzláció

ER/Golgi

ErbB gén Sejtmag

Ribozimek

II.8-3. ábra: ERB jelátvitel gátlása A jelátviteli folyamatokat több szinten tudjuk befolyásolni (II.8-1. ábra, II.8-2. ábra és

II.8-1. táblázat): (1) gátolhatjuk a sejtfelszíni receptort (2) gátolhatjuk a jel továbbítását (pl. kináz gátlók); vagy (3) beavatkozhatunk a számunkra fontos fehérje turnoverébe (pl. proteoszómális degradáció, siRNS). Néhány gyógyszer nagy fokban szelektív, azaz egy specifikus molekulát gátol, míg más gyógyszerek általánosabb módon fejtik ki hatásukat, pl. párhuzamosan több molekulára hatnak, vagy csak egy molekulára, de az az egy molekula több jelátviteli út tagja.

Növekedési faktor receptor gátlók A következő monoklonális antitestek állnak rendelkezésre EGFR gátlására: cetuximab, gefitinib, erlotinib. A Trastuzumab (szintén monoklonális antitest) a HER2-t blokkolja.

152


A jelátviteli utak módosítása gyógyszerekkel Kináz gátlók A kináz gátlók ígéretes molekulák malignus daganatok kezelésében. Kinázokat gátolnak, amik részt vesznek a tumor sejt jelátvitelében és így gátolják a sejt növekedését, proliferációját és az inváziót. A BCR-c-ABL-t az imatinib (Gleevec, Novartis) gátolja. Számos kis-molekulájú kináz gátló áll rendelkezésre a Ras, Raf, MEK, PKC és a ciklin-depenedens kináz (CDK) gátlására.

Kalcineurin blokád A ciklosporinA és takrolimusz (FK-506) kalcineurin (részleteket lásd I.4.3. [47. oldal], II.1.1. [66. oldal] és II.1.2. [69. oldal] fejezetekben) gátlók. A molekula blokádja gátolja a T- és B- sejt aktivációt, ezért ezek a szerek hatékony immunszupresszánsok (II.8-4. ábra). A kalcineurin foszfatáz aktivitása gátlódik a ciklosporinA-CypA és az FK-506-FKBP-12 gátló komplexek által.


153


FKBP12

FKBP12

FK506

R

CyPA CsA

FRB

B

mTOR Kalcineurin A

T-sejt aktiváció

CaM

Kation stressz

Transzláció

Sejtciklus

II.8-4. ábra: Kalcineurin és rapamycin mTOR gátlók A Sirolimus (vagy Rapamycin) immunszupresszív hatása az FKBP-12-hez való kötődésen és mTOR (mammalian target of Rapamycin) gátlásán alapul (II.8-4. ábra és II.8-5. ábra). A TOR-t először Sacharomyces cerevisiae-ben írták le, míg az mTOR a PI3K-PKB(Akt) jelátvitelben vesz részt. A Wortmannin és az LY294002 PI3K gátlók, amik az mTOR upstream szabályozói.

154


A jelátviteli utak módosítása gyógyszerekkel IL2

IL2R α

β

γ

PI3K ? R

mTOR

AKT

PHASI

FKBP12

p70S6K

Apoptózis P27kip1

Bcl-2

G1

S fázis

II.8-5. ábra: Rapamycin Proteoszóma gátlók A proteoszóma komplex ubiquitinálódott intracelluláris fehérjék degradációjáért felelős, ami a proteoszóma fontosságára utal a sejt fehérjéinek normális turnoverében. Jelátviteli fehérjék proteoszómális degradációja egy fontos szabályozó mechanizmus, továbbá ígéretes terápiás célpont is (II.8-6. ábra). A Bortezomib egy proteoszóma gátló, amit myelóma multiplex és köpeny-sejtes leukémia kezelésére használnak. Kimutatták, hogy a Bortezomib gátolja az IκB proteaszómális degradációját, így gátolja az NF-κB jelátvitelt (II.8-5. ábra).


155


Citokinek sejtfelszíni receptorokat aktiválnak O N

H N

N H

OH B

↓ Citokinek

OH

NF-κB aktiváció IκB degradáció révén

O N

p105 Bortezomib

Processzált P105 prekurzor

↓ Anti-apoptotikus faktorok

p50 lκB p65 Proteoszóma

↓ Gyulladásos molekulák

lκB p65

Sejtmag

p50 p50 Degradálódott IκB

p50 NF-κB

p65

p65

NF-κB aktiválja a transzkripciót

aktivált NF-κB a sejtmagba transzlokálódik

↓ Sejt adhéziós molekulák

II.8-6. ábra: Proteoszóma gátlók-Bortezomib Hsp-90 gátlás A Hsp-90 egy fontos citoplazmatikus chaperon fehérje, ami számos jelátviteli és szerkezeti fehérje szerveződésében vesz részt. A Geldanamycin a HSP-90 ATP-kötő részéhez kapcsolódik, így meggátolja specifikus kliens fehérjék kötődését, ami a fehérjék ubiquitinációjához és proteoszómális degradációjához vezet (II.8-7. ábra). Tumor sejtekben például a mutálódott v-Src, Bcr-Abl és p53 fehérjék lebontásának van előnyös hatása.

156


A jelátviteli utak módosítása gyógyszerekkel Érett komplex Intermedier komplex

H S P 9 0

ADP ATP

H S P 9 0

KLIENS HOP HSP40

KLIENS

CDC37 p23 Immunofilin HARC AH1

HSP70

Geldanamycin a HSP-90 ATP-kötő részéhez kötődik

Korai komplex

HSP40

+

KLIENS UB UB

HSP70

UB UB

Proteoszóma

UB KLIENS

Ubiquitin ligáz CHIP

Ubiquitin proteoszóma-függő degradáció

II.8-7. ábra: HSP-90 gátlók


157

Ajánlott irodalom (1) Gomperts B.D., Kramer I.M., Tatham P.E.R.: Signal Transduction (2nd edition; Academic Press, 2009)

(2) Darnell J, Lodish H, Baltimore D: Molecular cell Biology, Chapters 16&17

(3) Stryer L, Berg J, Tymoczko J: Biochemistry, Chapter 15

(4) Karin M., Hunter T.: Transcriptional control by protein phosphorylation: signal trasmission from the cell surface to the nucleus. Current Biology 1995, 5 (7): 747– 753.

(5) Spiegel S., Foster D., Kolesnick R.: Signal transduction through lipid second messengers. Current Opinion in Cell Biology 1996, 8: 159–167.

(6) Hamm H.E., Gilchrist A.: Heterotrimeric G proteins Current Opinion in Cell Biology 1996, 8: 189–196.

(7) Gether U.: Uncovering molecular mechanisms involved in activation of G protein coupled receptors


159

Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen

Recommend Documents