Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Dr. Pongrácz Judit Háromdimenziós szövettenyésztés és „tissue engineering” – 19. Előadás
SZÖVETI REGENERÁCIÓ (3)
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Szívelégtelenség • Az egyik leggyakoribb betegség • Nagy morbiditás és mortalitási ok a fejlett országokban • Okok: – Veleszületett rendellenességek – Magas vérnyomás – Szívinfarktus – Mérgek, toxinok – Fertőzések
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Szívizom regenerációs terápiák A szívizom regenerációját célzó terápiák a kutatások fókuszában vannak: • A szívelégtelenség előfordulása egyre gyakoribb az életkor előrehaladásával • A fejlett országokban a populáció egyre inkább öregszik • A szívinfarktust túlélő betegek száma növekszik • A legtöbb MI túlélő szívelégtelenségben szenved
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
LVAD • A bal kamra pumpafunkcióját segíti • Pulzálás vagy • Folyamatos pumpálás • 7 év az LVAD-al viselési rekord
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Bal kamra kisegítő eszközök Szívtranszplantációra váró betegekben: • A megfelelő donor megtalálásáig életben tartja a szívelégtelenségben szenvedő beteget • A kezelés maga is segíti a sérült szívizom regenerációját • Javítja az életminőséget Transzplantációra alkalmatlan betegeknél: • Palliatív terápia • Javítja az életminőséget Szövődmények lehetnek: • Infekció veszélye • Alvadási rendellenességek veszélye • Embolizáció veszélye
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Csontvelői sejtek a szívizom regenerációban Csontvelő Mesenchimális őssejtek Hemopoetikus őssejtek Side population sejtek
Vérerek Endotél progenitor sejtek (hemangioblasztok)
Vázizom Szatellita sejtek Side population sejtek
Szív Side population sejtek Kit+ sejtek Sca-1+ sejtek Fúziós és nem-fúziós differenciációs út
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Sejtes terápiás lehetőségek a szívizom-regenerációban I. • Csontvelői sejtek (BMC) • Hemopoetikus őssejtek részt vehetnek a szívizom regenerációjában • Intenzíven tanulmányozott terület állatkísérletes modellekben különböző módon jelölt BMC-kkel • Eltérő nemű donortől származó graftok betegekben • Sérülés után BMC homing tapasztalható a sérült területre • GCSF moblizáció nem reprodukálja a BMC helyi injektálásának eredményeit
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Sejtes terápiás lehetőségek a szívizomregenerációban II. Intravenás infúzió Szelectív intrakoronáriás infusion Direkt intramiocardiális injekció
Fúzió a residens kardiomiocitákkal
Differenciáció a szívre jellemző fenotípussá
↓Kardiomiocita apoptosis Rezidens őssejtek toborzása Kardiomiocita proliferáció
Parakrin faktorok szekréciója
Matrix: Hegszövet kompozíció Granulációs szövet
↑Funkcionális kardiomiociták száma
Differenciáció érfal komponensekké
Pro-angiogén cytokinek Angiogén ligandok
↑Perfúzió
↑Szív teljesítménye
Perivaskuláris inkorporáció
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Sejtes terápiás lehetőségek a szívizomregenerációban III. • BMC transzdifferenciációjára szívizomsejtekké nincs direkt bizonyíték • Ha egyáltalán előfordul, nagyon ritka esemény • Talán az egyetlen nyilvánvaló terápiás előny a sérült szívizomszövet megnövekedett vaszkularizációja, amely a saját regenerációs kapacitást növeli.
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Sejtes terápiás lehetőségek a szívizomregenerációban IV. • A szívizomsejtek megtartott osztódási képessége bizonyított tény • Többfajta őssejt-markereket (Sca-1, CD31) és szívizom-markereket expresszáló, proliferáló sejttípus mutatható ki a szívizomban 5-azacitidinindukálta sérülés után • Rágcsálókban és emberekben is kimutatható • Jó proliferációs képesség
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Szívizom sejtes terápiája Szívizomsejt
Vázizomrost
• Egy sejtmag (centrális) • Gap junction (+) • Cx43 expresszió (+)
• Sokmagvú (perifériás) • Gap junction (-) • Cx43 expresszió (-)
???
Myotubulus
Myoblaszt (szatellita sejt)
• Sokmagvú • Gap junction (-) • Cx43 expresszió (-)
• Egy sejtmag • Gap junction (+) • Cx43 expresszió (+) • Proliferáció (+)
Fúzió és differenciáció
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Vázizom myoblasztok • Biopsziából származó vázizom mioblasztokat alkalmaztak korai stádiumú klinikai kipróbálás során • Szívizom teljesítmény és életminőség növekszik: – Csökken a NO szükséglet – Javul az NYHA besorolás – Javul a fizikai terhelhetőség • A betegeknél kamrai aritmiák fordultak elő • Néha ICD beültetése vált szükségessé • A vizsgálatokban részt vett betegek száma alacsony volt • Nem volt kezeletlen kontroll csoport ezekben a vizsgálatokban
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Embrionális őssejtek • A szívizommá differenciálódási képesség bizonyított • hESC-eket beültetés előtt differenciáltatni szükséges • A sérülés önmagában nem indukálja a hESC növekedését és a szívizommá való differenciációt, sőt, gyulladásos citokinek károsíthatják a beültetett sejteket • Gyulladáscsökkentő és más védő anyagok alkalmazása szükséges a graft támogatásához (IGF-1, pán-kaszpáz inhibitorok és NO blokkolók) • A differenciálódott szívizomsejtek immunválaszt váltanak ki immunkompetens egerekben. • Teratoma kialakulása is kockázatot jelent. Jelenleg kérdéses a klinikai alkalmazás jövője.
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Tissue engineering megoldások fogpótlásban • A fogazat nagyon fontos a gerincesek táplálkozásában • A fogzási rendellenességek vagy a hiányos szájhigiéné nem életet veszélyeztető kondíció a fejlett országokban • Ennek ellenére a fogazat károsodása és betegségei jelentősen csökkentik az életminőséget
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Fogfejlődés • Kölcsönös jelátviteli események az epitélium és az alatta lévő mesenchyma között
• A morfogenezis és a végleges differenciáció megkezdődése
Fogkorona Zománc
Odontoblaszt
Cement
Pulpaüreg
Fogíny rost Periodontális membrán Sharpey rost
1. Csíra szakasz 2. Epitéliális sapka szakasz (körbeveszi a mesenchymát) 3. Harang szakasz 4. Koronai szakasz
Dentin
Foggyökér Vérér
Fogágy csont
Idegrost
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Fogbél eredetű őssejtek (DPSC) • A DPSC-k multipotens sejtek a fogbélben (pulpa dentis) • Fontos szerep a dentin sérülés utáni regenerációjában • Odontoblasztok jelennek meg a sérülés helyén • Differenciálatlan mezenchymális sejtek folyamatosan vándorolnak a mélyebb rétegekből a dentin felé és odontoblaszt irányú differenciáció figyelhető meg • Kísérleti bizonyítékok utalnak arra, hogy a migráló sejtek a DPSC-k.
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
A DPSC-k differenciációs képessége • Emberi DPSC-k tenyésztése mineralizációt serkentő körülmények között • A sejtek odontoblaszt-szerű sejtekké differenciálódnak, dentint termelnek és nestinpozitívak • A DPSC-k fenotípusosan az MSC-kre emlékeztetnek, de a dentin-termelő képességük egyedi
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Tissue engineering a fogpótlásban Fogképző sejtek screenelése
Sejt ko-kultúra 3D körülmények között
Fogcsíra szövetkonstrukció transzplantációja
Epitéliális sejtek Fogcsíra szövetkonstrukció
Betegből izolált őssejtek
Mezenchymális sejtek In vitro tenyésztett fogkonstrukció Transzplantáció
A transzplantált szövetkonstrukció foggá fejlődik
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Fog előállítása mesterséges körülmények között I. Scaffold-alapú foggyökér: • Biokompatibilis anyagból készült gyökérimplantátum, amelyre mesterséges (pl. porcelán) koronát rögzítenek • A sejtek belenőnek a scaffold anyagába, így biztosítják a rögzítést • Sertés állatmodellen végzett kísérletek bizonyítják a megvalósíthatóságot
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Fog előállítása mesterséges körülmények között II. Az embrionális fogfejlődés mesterséges reprodukálása: • Az embrionális fogfejlődés tökéletesen azonos funkciójú fogat eredményez • A foggyökér és a korona is kifejlődik • Rágcsáló kísérletek sikeresek voltak • Nem csak embrionális, hanem újszülött vagy felnőtt eredetű sejtek is képesek voltak a fog kinövesztésére • Scaffold alapú és scaffoldmentes rendszerek is kipróbálásra kerültek
Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Dr. Pongrácz Judit Háromdimenziós szövettenyésztés és „tissue engineering” – 20. Előadás
SZÖVETI REGENERÁCIÓ (4)
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Húgyivari szervek sérülésének okai Húgyivari szervek sérülései vagy funkcióvesztése: • • • •
Fejlődési rendellenességek Trauma Fertőzés, gyulladás Orvosi beavatkozás mellékhatása (iatrogén ok)
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Megoldások a húgyivari szervek szöveti regenerációjában Saját nem-húgyivari eredetű szövetek: • Bőr • Gasztrointeszinális eredetű szövetek • Más szervekből kivett nyálkahártya Allogén eredetű szövetek: • Kadáver vagy élődonoros eredetű vesegraft • Kadáver eredetű fascia
Xenogén anyagok: • Szarvasmarha kollagén Mesterséges anyagok: • Szilikon • Polyuretán • Teflon
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Sejtek izolálása szöveti regeneráció céljára • Autológ vagy allogén • Végstádiumú szervelégtelenség gyakran behatárolja a szöveti regenerációra alkalmas sejtek mennyiségét • In vitro tenyésztési eredmények különbözőek: – In vitro tenyészett hólyag simaizomsejtek: alacsony kontraktilitás • Alacsony sejtszám behatárolja a regenerációs lehetőségeket • Őssejtek jelenthetik a megoldást • Terápiás klónozás is megoldást jelenthet
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Bioanyagok a húgyivari szervek rekonstrukciójában I. • Mesterséges anyagok • ECM funkciók pótlása: – 3D struktúra kialakítása a szövet kialakulásának támogatására – Sejtdifferenciáció szabályozása és serkentése bioaktív molekulák tárolása és leadása útján – Sejtek injektálása a megfelelő scaffold támogatása nélkül nem eléggé hatékony
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Bioanyagok a húgyivari szervek rekonstrukciójában II. Természetes eredetű bioanyagok • Kollagén • Alginát • Sejtmentes szöveti alapanyagok: – Hólyagi submucosa – Vékonybél submucosa (SIS) Szintetikus polimerek • PLA, PGA, PLGA
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Urothelium – különleges funkciók • Kiválasztó, nem felszívó funkció • Jelenlegi sebészeti rekonstrukciós megoldások a gasztrointesztinális autograftokat részesítik előnyben a húgycső, húgyvezeték vagy a hólyag sérüléseinek a rekonstrukciójában • Az intesztinális hám és az urothelium különböző szerkezete és funkciója gyakran okoz mellékhatásokat, amelyeknek súlyos következményeik is lehetnek
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Húgycső rekonstrukció I. Szűkületek, sérülések, trauma, fejlődési rendellenességek (pl. hypospadiasis) Leggyakrabban a bukkális nyálkahártyát használják graftként a rekonstrukciós sebészetben: • A graftot a pofa vagy az ajkak belső felszínéről veszik • A hám vastag és a nyálkahártya erezete gazdag • Emiatt a graft ellenálló a fertőzésekkel szemben
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Húgycső rekonstrukció II. Hólyag-eredetű urotélium: • Megfelelőnek bizonyult a rekonstrukcióban nyulakban • Klinikai kipróbálás eddig nem volt Sejtmentes kollagén szövetek: • Az anyag szükség szerint rendelkezésre áll • Az eredmények jók a „csak” rekonstrukciós sebészeti megoldások esetében • A szűkületek gyakoriak, ha a húgycsövet teljes átmérőjében, tubularizáltan kell rekonstruálni
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Húgycső rekonstrukció III. Sejtmentesített és tubuláris scaffold konstruktok, amelyekre autológ urotéliumot növesztettek: • Állatkísérletes eredmények biztatóak • A szövetkonstrukciók hisztológiai szerkezete a natív urotéliumhoz hasonlatos • Kollagén scaffold sejtek kiültetése nélkül szűkületet eredményezett
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Hólyag rekonstrukció I. Leggyakrabban intesztinális eredetű nyálkahártyát használnak rekonstrukcióra: • Az intesztinális hám különbözik az urotéliumtól • Az intesztinális hám szerepe a táplálék abszorpció és a nyákszekréció • Szövődmények: infekció, vesekő, anyagcsere rendellenességek, perforáció, megnövekedett nyákszekréció, rosszindulatú daganatok kialakulása Az ellentmondásos eredmények miatt alternatív terápiás lehetőségek felé fordult az érdeklődés
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Hólyag rekonstrukció II. Hólyag megnagyobbító megoldások: • A húgyhólyag progresszív dilatációja a leggyakrabban alkalmazott konzervatív megoldás • Augmentációs cisztoplasztika: a hólyag megnagyobbítása húgyvezeték-eredetű urotéliummal • Jobb eredmények érhetőek el ezzel a megoldással, mint a gasztrointesztinális eredetű graftokkal
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Hólyag rekonstrukció III. Sejtmentes ECM-eredetű anyagok: • Xenogén SIS → sejtmentesített kollagén-alapú szöveti mátrix → nincsen mukózális izomréteg (str. muscularis mucosae) • A graft hámosodása rendben lezajlott • Az izomréteg miatt a kontrakciós compliance akadályoztatott Scaffold-okra ültetett hám- és simaizomsejtek: • Az izomréteg sikeresen kialakult, a kontrakciós compliance megfelelő • Scaffold-ok: PGA és kollagén kombinációja
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Húgyvezeték rekonstrukció Húgyvezeték rekonstrukció állatokban: • Sejtmentes scaffold-ok beültetésével sikeres volt a húgyvezeték fal minden rétegének a regenerációja patkányokban • Merev anyagokból készült csövek (teflon) beültetése nem bizonyult sikeresnek kutyákban • 3cm hosszú csőszerű sejtmentes scaffold-ok beültetése kutyákban szűkület kialakulásához vezetett • Sejtes scaffoldok beültetése sokkal kielégítőbb eredményekhez vezetett kutyakísérletekben
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Vesepótló kezelések Jelenleg rutinszerűen két típusú kezelést alkalmaznak a végstádiumú veseelégtelenség (ESRF) kezelésében: • Művesekezelés (Dialízis) • Vesetranszplantáció
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Dialízis • Hemodialízis, hemofiltráció – Dializátorok: szintetikus anyagból készült porózus rostok alkalmazása a leggyakoribb – Alvadásgátolt vénás vért eresztenek át a dializáló berendezésen, ellenáramú dializáló oldatot alkalmaznak • Hasi (Peritoneális) dialízis – A dializáló oldatot katéteren keresztül a hasüregbe vezetik • A toxikus metabolitok és a felhalmozódott víz eltávolítása a betegből a plazma és a dializáló folyadék közötti ozmotikus különbségeken alapul • Szív- és érrendszeri, metabolikus és mozgásszervrendszeri szövődmények előfordulása gyakori
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Vesetranszplantáció • A leggyakrabban átültetett parenchimás szerv • Kadáver vagy élő donor • A dializált betegekhez képest jelentősen javul az életminőség • Allogén eredetű graft beültetése után immunszupresszív kezelés szükséges • Az immunszuppresszív kezelés mellékhatásai: fertőzések és malignus daganatok kialakulására való hajlam növekedése, máj- és vesetoxicitás, szív- és érrendszeri, valamint metabolikus mellékhatások
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
TE vese előállítása I. Bioartificiális megközelítés: • A dializáló gépek helyettesítése biológiai művesével • Extrakorporeális és beültethető változatok is • Preklinikai kísérletek kutyákon sertés vese tubulus sejtekből kialakított biológiai művesével: sikeres karbamid és kálium-szint kontroll • Legnagyobb hátrány: a beteg még így is géphez kötve éli az életét
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Biológiai művese Rostok fala
Hőcserélő Pumpa 2 5-7 ml/min
Lumen Proximális tubulus sejtek
5-10 mm Hg
RAD dializátor
Extrakapilláris tér
Pressure monitor Szürlettartály 10-25 mm Hg
Hőcserélő
Ultrafiltrátum (RAD lumenbe)
Hemofilter
Hemofilterből jövő vér (RAD extrakapilláris térbe)
Dializátorból jövő vér
Feldolgozott szűrlet (vizelet)
Plazmapótló folyadék Pumpa 3 70-80 ml/min
Pumpa 1 80 ml/min Vénás vér
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
TE vese előállítása II. In vivo megközelítés: • Humán vesesejteket tubuláris polikarbonát scaffoldkonstrukcióra ültettek • Immundeficiens egérbe való beültetés során megfelelő sűrűségű érhálózat alakult ki • Vizeletszerű folyadék termelése: karbamid és kreatinin tartalom • A hámsejtek tubuláris differenciáció jeleit mutatták
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
In vitro előállított egér vese Sejtek
Bimbó
Bimbó
Wolff cső
Sejtek Metanefrikus mesenchyma 4-6 nap
