Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen

Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Dr. Pongrácz Judit Háromdimenziós szövettenyésztés és „tissue engineering” – 9. Előadás

„SCAFFOLD”-OK ELŐÁLLÍTÁSA

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

„Scaffold” előállítás - Alapvető kritériumok I. • Biokompatibilitás – immunreakciók elkerülése • Felszíni kémia – sejtfunkciók támogatása • Egymással összeköttetésben lévő pórusok kialakítása – sejtek egyenletes eloszlásának és erek képződésének támogatása • Ellenőrzött biodegradáció – az új szövet kialakulásának lehetővé tétele

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

„Scaffold” előállítás - Alapvető kritériumok II. • Mechanikai tulajdonságok – a szerkezet és funkció stabilitása a beültetés után illetve a szöveti újraképződés során • Lehetőség különböző gyógyszermolekulák illetve bioaktív anyagok beágyazására és szabályozott felszabadulására • ECM interakció – beültetés után az ECM kialakulásának támogatása • Beültetés után az ECM helyettesítése

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

A „scaffold”-ok tulajdonságainak jelentősége • • • •

Biztosítják a sejtek számára a 3D környezetet Beültetés után átmenetileg az ECM-t helyettesíti Közvetlenül irányítják a sejtek differenciálódását Szerkezetük meghatározza az előállított szövetkonstrukciók tápanyagellátását

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Öntéses-kioldásos módszer (SCPL) I. • Az oldószerben feloldott „scaffold”-anyagot pórusképző részecskékkel töltött öntőformába öntik • Oldószer elpárologtatása • Pórusképző részecskék kioldása • „Scaffold” bevonat: az öntőformát a feloldott „scaffold” anyagba mártják • Egyszerű, könnyű, olcsó technika • Nem igényel speciális laboratóriumi felszerelést • A használt szerves oldószerek gyakran mérgezőek, maradványaik nehezen eltávolíthatóak

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Öntéses-kioldásos módszer (SCPL) II.

Oldószer

Polimer

Porózus szerkezetet kapunk

Öntőforma

Porogén

Oldószer elpárologtatása

Porogén kioldása

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Fázis szeparációs módszerek • A polimert két, egymással nem elegyedő oldószer keverékében oldják fel • A telített oldatot melegítik • A magas illetve alacsony polimer-tartalmú fázisok elkülönülnek egymástól • A hőmérséklet csökkentésével a polimer kiválik a fázishatáron a túltelített oldatokból • Az oldószert eltávolítják (kivonás, elpárologtatás, szublimáció)

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Magasszintű technikák Gázhabosítás 10 000

szilárd szuperkritikus állapot

1 000

Nyomás P (bar)

• Speciális felszerelést igényel • A „scaffold” anyagát nyomásálló kamrába töltik • A „scaffold” anyagát szuperkritikus állapotú széndioxidban „oldják” fel • A hőmérséklet csökkentésével gáz halmazállapotúvá válik • A fázishatáron kicsapódik a feloldott polimer

folyadék 100

kritikus pont 10

gáz hármas pont

1 200

250

300

Hőmérséklet T (K)

350

400

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Elektroszövés I. Injektor Polimer vagy kompozit oldat Fémtű

Magasfeszültségű áramforrás

V

Elektromosan töltött szál

Gyűjtőlemez

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Elektroszövés II. • Speciális felszerelést igényel • Sokoldalú, flexibilis technika • Nincs szükség extrém körülményekre (hő, koaguláció) • Többféle polimer használható, pl.: PLA, PLGA, selyem fibroin, chitosan, kollagén • Szálvastagság, pórusméret, szálorientáció könnyedén szabályozható

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Magasszintű technikák Szövött biotextíliák • Speciális felszereltséget igényel • Az így előállított „scaffold” szabályos, szövött szálakat tartalmaz • 2D illetve 3D „scaffold” szerkezet is előállítható • A pórusméret könnyen szabályozható • Sokoldalú technika, a „scaffold” anyag széles körben alkalmazható és kombinálható

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Szövött biotextília

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Magasszintű technikák Spontán „összeszerelődés” • Spontán „összeszerelődés” a molekulák spontán összeállása rendezett struktúrává • Oldott állapotban az amfofil peptidek nem-kovalens kötésekkel összekapcsolódnak

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Amfofil peptidek tervezése • Foszfoszerin-csoport serkenti a mineralizációt (csontszövet előállításánál) • RGD motívumok segítik az adhéziót (integrinkötőhelyek biztosítása) • Ciszteinek a molekulák közötti keresztkötések létrejöttét teszik lehetővé • GGG összekötő-motívumok a feji és farki rész között növelik a molekuláris szerkezet rugalmasságát

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Magasszintű technikák Automatikus gyártási technológiák • „Rapid prototyping”: adott szerkezetű tárgy automatizált előállítása additív technológia felhasználásával • Gyors technológia, mely azonos minőségű, szerkezetű, mintázatú „scaffold”-ot eredményez • Drága módszer, számítógép vezérelt készüléket igényel

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Magasszintű technikák Fused deposition modeling (FDM) • Robotikusan vezérelt készülék • Polimer vagy más anyagból készült szálat tesz le a lerakófejen keresztül több rétegben • Szilárd felületre vagy • „Vonalkázva”: ekkor a később eltávolításra kerülő részekhez más anyagot használnak

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Magasszintű technikák Selective laser sintering (SLS) • A kicsivel az olvadáspontja alatt tartott, por vagy granulátum formájú „scaffold” anyagból egy réteget terítenek le (előreprogramozott minta szerint) • A számítógép-vezérelt lézersugár felmelegíti az anyagot, amely ennek hatására összeáll (összeolvad anélkül, hogy megolvadna) • Újabb réteget fektetnek le és olvasztanak össze • A tárgy 3D szerkezete így rétegenként épül fel

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Selective laser sintering (SLS) „Scaffold” anyagot mozgató rendszer

1

2

3

Szkenner

„Scaffold” réteg

Roller

Dugattyú Dugattyú

4

Dugattyú

5

6

7

Lézer

Éppen készülő tárgy

Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Dr. Pongrácz Judit Háromdimenziós szövettenyésztés és „tissue engineering” – 10. Előadás

BIOKOMPATIBILITÁS

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Biokompatibilitás - Definíció Az anyag azon képessége, hogy a befogadó szervezetben az alkalmazásának megfelelő választ vált ki. A biokompatibilitás a TE termékek előállításához használt „scaffoldok” vagy mátrixok azon képessége, hogy olyan szubsztrátként viselkednek, amely támogatja a megfelelő sejtműködést, vagyis megkönnyíti a molekuláris és mechanikai jelátviteli rendszerek működését az optimális szövetregeneráció érdekében, DE sem az adott sejtekben, sem pedig lokálisan vagy szisztémásan nem idéz elő nem kívánt válaszreakciót.

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Biokompatibilitás - Jelenlegi nézetek Régi koncepció: olyan bioanyagok használata, melyek nem lépnek interakcióba a befogadó szervezet („host”) szöveteivel A bioanyag-tervezés új célkitűzései: • A bioanyagok aktív módon interakcióba lépnek a „host” szöveteivel • Pozitív élettani választ váltanak ki • Támogatják a sejtek növekedését és differenciálódását

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Bioanyagok biokompatibilitása • A természetből származó anyagok természetüknél fogva biokompatibilisek (pl.: kollagén, fibrin, hyaluronsav) • A xenogén bioanyagokat a biokompatibilitás eléréséhez módosítani kell (pl.: borjúkollagén humán felhasználása előtt az immunogén szekvenciákat el kell távolítani emésztéssel) • Már rekombináns humán kollagén is kapható • Más xenogén anyagok (pl.: növényi eredetű poliszacharidok) biokompatibilitását tesztelni kell • Szintetikus anyagoknál szintén ellenőrizni kell azok biokompatibilitását

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Biokompatibilitás - Terminológia Biodegradálhatóság: in vivo makromolekuláris degradáció; a lebomlási termékek nem eliminálódnak a szervezetből Bioabszorbeálhatóság: a makromolekuláris komponensek az anyagcsere megváltozása nélkül jutnak be a szervezetbe Biológiai felszívódóképesség: a makromolekuláris alkotóelemek lebomlása és metabolizálódása, a molelulatömeg csökkenése, a végtermék kiválasztása

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Biokompatibilitás tesztelése • A vér/anyag vagy szövet/anyag határfelületnek a lehető legkisebbnek kell lennie • Álljon ellen a biodegenerációnak • Fontos, hogy a bioanyag természetes anyagként viselkedjen vér és szövet jelenlétében. • A beültethetőséget kizárja, ha az anyag: – Vérrögképződést indít el (Trombózisveszély) – Károsítja vagy szenzitizálja a vér sejtes elemeit – Megváltoztatja vérplazma fehérjéit (köztük enzimeket) nem kívánt reakciókat előidézve

– Káros immunreakciót indít el – Rákot okoz – Teratogén – Toxikus vagy allergiás választ vált ki – Elektrolitvesztést okoz – Sterilizálás hatással van rá

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Inkompatibilitás miatt fellépő komplikációk • • • • • •

A beültetett anyag elleni immunreakció Krónikus gyulladás Hegszövet képződés Fokozott véralvadás (érgraft inkompatibilitás) Graft elégtelenség Kilökődés

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Normál sebgyógyulás A sebgyógyulás több fázisra osztható, az egyes szakaszokra a bennük szerepet játszó sejtpopulációk illetve sejtfunkciók egyaránt jellemzőek: 1. Véralvadás 2. Gyulladás 3. Sejtek inváziója és szöveti újraképződés

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Idegentest reakció I. Az implantátum jelenléte megváltoztatja a gyógyulási folyamatot, ez az un. idegentest reakció (Foreign Body Reaction, FBR), részei: • Fehérje adszorpció • Makrofágok • Sokmagvú idegentest óriássejtek • Fibroblasztok • Érképződés Az implantátum folyamatos jelenléte egy végső készenléti állapot eléréséhez vezethet (resolution). Az implantátum sorsa ezután a következő 3 folyamat egyike lehet: • Reszorpció • Integráció • Enkapszuláció (fibrózis)

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Idegentest reakció II. Az abszorbeált plazmafehérjék granulocita és makrofág választ indítanak el

A frusztrált fagocitózis a makrofágok aktivációjához és óriássejtek képződéséhez vezet

Ér Endotél

Monociták

Sejt-vándorlás Idegentest típusú óriássejtek

Makrofágok

Fibroblasztokat és kollagént tartalmazó réteg Makrofágokat tartalmazó réteg

Bioanyag

Bioanyag

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Bioanyagok Ideiglenes implantátumok: • A szöveti regeneráció és gyógyulás átmeneti segítése • Csont graftok, biológiailag felszívódó sebészeti varratok Állandó implantátumok: • Hosszú távú fizikai integritás és mechanikai teljesítmény • Szervműködés hosszú távú helyettesítése • Műbillentyűk, ízületek, stb.

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Biológiailag inert anyagok Poli-tetrafluor-etilén (PTFE, Teflon®): • A szervezet számára inert • Rendkívül alacsony súrlódási együttható (0,05-0,10 a polírozott acélhoz képest) • Biológiailag inert, az élő szövetekkel nem lép interakcióba • Ízületi protézisek valamint műbillentyűk felszínének borítására használják

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Szilikon származékok • A szilikonok olyan polimerek, amelyek a biokompatibilis polimerek által általánosan tartalmazott C, H, N, O elemek mellett Si-t is tartalmaznak • A szilikonok gyógyászati osztályozása: nem beültethető, rövid- illetve hosszútávra beültethető szilikonok • Katéterek, csövek, mellimplantátumok, óvszerek előállításához

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Biokompatibilis fémek • Titánium ötvözetek ízületi protézisekhez és fogpótlásokhoz • Kitűnő mechanikai sajátságok • Nem toxikusak, és nem lökődnek ki • Egyedülálló osseointegrációs képesség • A beültetést megelőzően alkalmazott hidroxiapatit borítás elősegíti az osseointegrációt

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Hidroxiapatit kerámiák • A hidroxiapatit (HA) természetes állapotban a csontokban és a fogakban megtalálható • HA kristályokat gyakran más polimerekkel kombinálják a „scaffold” előállítás során • Mikrokristályos HA táplálékkiegészítőként is kapható a csontritkulás megelőzésére • Jobb, mint a CaCO3 az oszteoporózis megelőzésében

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Poli-a-hidroxi-savak: bioabszorbeálható polimerek • Leggyakrabban használt bioanyagok • Fő felhasználási terület: felszívódó varratok, gyógyszerhordozó „scaffold”-ok, ortopédiai protézisek • Poliészter láncok • Egyszerű hidrolízissel történő biodegradáció • A keletkező a-hidroxi-savak különböző anyagcsereutakon át eliminálódnak (pl.: citromsav ciklus) vagy módosítás nélkül a vizelettel távoznak

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Poli-a-hidroxi-savak biodegradációja I. (CH2)nCO(CH2)n C O

Poliészter

O

H2O

HO(CH2)n CO

+

(CH2)COH

O

Hidroxi-terminális

O

Karboxi-terminális

Leggyakrabban használt poli-a-hidroxi-savak: • Poli-tejsav (PLA) • Poli-glikolsav (PGA) • Poli-kaprolakton (PCL) Degradációs termékeik a citrátkörbe lépnek be

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Poli-a-hidroxi-savak biodegradációja II. PHB

Észteráz

b-Hidroxi-butirát

PDS

Szerin

Glicin

Glikolsav

Piruvát

Tejsav

H2O

H2O

PGA

PLA

CO2 H2O

Vizelet

Acetoacetát

Acetil-KoA

PGA = poli-(glikolsav) PLA = poli-(tejsav) PDS = poli-(d-dioxán) PHB = poli-(hidoroxi-butirát)

Citromsav Citrátkör

CO2

H2O Oxidatív foszforiláció

ATP

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Poli-a-hidroxi-savak felhasználása Típus

Poliészter

Polimer

Jelenlegi felhasználás

Politejsavak

• Felszívódó varratok • Csontprotézisek • Csont-, máj- és idegszövet konstrukció számára „scaffold”-ként • Gyógyszerhordozóként (többféle)

Poli-(L-tejsav), [PLLA] Poli-(D, L-tejsav), [PDLLA]

Poliészter

Poliészter

Tejsav-glikolsav kopolimer, [PLGA]

• Szabályozott hatóanyag-leadási rendszerként (fehérjék és kismolekulájú gyógyszerek) • TE „scaffold” • Gyógyszerhordozóként (többféle) • Génátvitel

Poli-(ε-kaprolakton), [PCL]

• Lassú szabályozott hatóanyagleadási rendszerként – gyógyszerhordozóként (pl.: > 1 év)

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Poli-(Glikolsav), (PGA) • PGA merev, erősen kristályos anyag • Kizárólag erősen apoláros szerves oldószerekben oldódik • Főként felszívódó varratokban használják (Dexon®) • SCPL technikával „scaffold” előállítás • Tömeg-degradáció • Természetes lebomlási termék (glikolsav)

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Poli-(tejsav), PLA és PGA kopolimerek • D, L izoformák és racémek keverékei • Leggyakrabbab az L izoformát használják együtt PGA-val: PLGA kopolimer • PLGA egyike azon kevés polimernek, amelyet humán felhasználásra fejlesztettek ki • PGA és PLLA kopolimerjei széles körben felhasználhatóak • A degradáció sebessége illetve típusa a kopolimer összetételétől függ

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Politejsavak biodegradációja • Általános lépés az észterkötések random hidrolízise • A degradáció típusa és sebessége az összetételtől függ • A lebomlási termékek nem toxikusak, nem váltanak ki gyulladást • Nagyméretű ortopédprotézisek esetén azok savas degradációja toxikus termékeket eredményezhet • Kisebb darabok törhetnek le az implantátumról, melyek gyulladást okozhatnak

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Poli-(kaprolakton), (PCL) • Szemikristályos polimer • Nagyon lassú degradáció (a tiszta PCL 3 év alatt bomlik le, más kapronokkal alkotott kopolimerjei könnyebben degradálódnak) • Hosszabb távú gyógyszerhordozásra használják • A PCL-t biokompatibilis, nem toxikus anyagként tartják számon

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Polimer erózió • A víz beszivárog az anyagba, a polimer amorf fázisának kémiai kötéseit hasítja, így a hosszú polimerláncokat rövid vízoldékony darabokra bontja. • Ennek következtében a molekulatömeg csökken, a fizikai tulajdonságok viszont nem változnak, hiszen a kristályos fázisok összetartják a polimert. A víz átjárja az anyagot, és a fragmensek metabolizálódását és tömegerózióját indítja el. • A polimer felületi eróziójáról akkor beszélünk, ha a polimer gyorsabban alakul át vízoldékony anyagokká, mint ahogy a víz beszivárog a konstrukcióba.

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Bioanyagok degradációjának típusai Felületi erózió

Tömegerózió Degradáció

Idő

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Degradáció I. • Biológiailag lebomló hidrogélek: a vízoldékony polimerláncok közötti kémiai keresztkötések hasítása • Felületi erózió a jellemző • A tömegveszteség lineáris a degradáció során

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Degradáció II. A polimerlánc hasítása vízoldékony monomereket eredményez CH3

CH3

H2O −(CH − C − O − CH − C − O −)x−(CH2 − C − O − CH2 − C − O)y− O

O

O

O

CH3 −HO − CH − C − OH + OH − CH2 − C − OH O

O

Krebbs ciklus CO2 + H2O

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Degradáció III. • Polimer hidrofóbicitás: a hidrofóbicitás növekedése nagyobb stabilitást eredményez • Bulky szubsztitúciós csoportok (pl.: metil-csoport PLA esetén) növeli a degradációs időt (PGA