Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Tőzsér József Molekuláris Terápiák – 5-6. előadás
FEHÉRJÉK PÓTLÁSÁN ALAPULÓ TERÁPIÁK
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Fehérjéken alapuló terápiák • • • • • •
Hiányzó vagy hibás fehérjék pótlása (pl. inzulin) Szignálútvonalak befolyásolása (pl. interferonok) Növekedési faktorok pótlása (pl. PDGF) Hemosztázis befolyásolása (pl. tPA) Molekulák lebontása enzimekkel (pl. aszparagináz) Fehérjevakcinák alkalmazása (pl. rekombináns HPV vakcina)
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Példák pótolt fehérjékre • • • • • • •
Inzulin (diabétesz) Albumin (hipoalbuminémia) Laktát (laktóz intolerancia) VIII-as faktor (vérzékenység) IX-es faktor (vérzékenység) Protein C (protein C deficiencia) Béta-glükocerebrozidáz (Gaucher kór)
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Példák terápiás fehérjekészítményekre • • • • • • •
Humulin (inzulin) Novolin (inzulin) Flexbumin 25% (albumin) Lactaid (laktóz) ReFacto (F VIII) BeneFix (F IX) Ceprotin (aktivált protein C)
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Terápiás fehérjék • Az első "fehérje vakcina" alkalmazás a tehénhimő felhasználása volt a feketehimlő megelőzésére (Jenner, 1796) • Az első fehérjegyógyszerként az inzulint alkalmazták (Banting és Best, 1922) • Az USA-ban már több mint 200 peptid- illetve gyógyszerfehérjét hagytak eddig jóvá terápiás alkalmazásokra • A terápiás fehérjék különböző forrásokból származhatnak
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Terápiás fehérjék – forrás szerint Fehérje
• • • • • • •
Albumin Inzulin VIII-as faktor IX-es faktor Kalcitonin Anti-venom β-glükocerebrozidáz
Eredeti forrás
Emberi donor vér Sertés, marha pancreas Emberi donor vér Emberi donor vér Lazac Ló vagy kecskevér Human placenta
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Terápiás fehérjék – forrás szerint • A természetes forrás gyakran ritka és drága • Nehéz a termék izolálása • Nehéz az igényeket kielégíteni • Immunreakcióhoz vezethet (pl. állati fehérje esetében) • virális és patogén szennyezések fordulhatnak elő
• Napjainkban a legtöbb fehérjegyógyszert rekombináns technológiával állítják elő • Olcsóbb, biztonságosabb, korlátlan forrás
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Inzulin, az első fehérjepótló gyógyszer • 1922 januárjában Banting és Best alkalmazott először inzulin készítményt a 14 éves Leonard Thomson-on. • Leonard az injekció hatására még betegebb lett, ugyanakkor a glükóz szintje lecsökkent, ezért a készítmény további javítása és alkalmazása mellett döntöttek. • 6 héttel később egy jobb minőségű kivonat már 520 mg/dL-ről 120 mg/dL-re csökkentette a vércukor szintet 24 h alatt. • Leonard további 13 évig élt még, pneumóniában halt meg, 27 évesen.
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Az inzulin szerkezete Két polipeptid lánc, A.lánc: 21 aminosav B-lánc: 30 aminosav A láncokat diszulfid híd köti össze Az inzulin gén a 11-es kromoszómán található
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Terápiás fehérjék – vérből • Az emberi test mintegy 6 liter vért tartalmaz. • A vér 60-70%-a plazma, 8-9%-a fehérje: ezért jelentős fehérjegyógyszer forrásként szolgál(t). • A plazma mintegy 10,000 különböző fehérjét tartalmaz. • Mintegy 20 fehérje adja a plazma teljes fehérjetartalmának a 99%-át • Évente több millió liter lejárt transzfúziós plazma keletkezik, ami kiváló, nagy mennyiségben rendelkezésre álló fehérjeforrás
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Példák vérfehérje termékekre • • • • • •
VIII-as faktor (hemofília korrekció) IX-es faktor (hemofília korrekció) Albumin (hipoalbuminémia korrekció) Intravénás IgG (fertőzésekben) Antitrombin III (véralvadási zavarokban) Alfa I-PI (emfizéma)
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
A Cohn frakcionálás • A Cohn frakcionálás eredeti eljárását 1946-ban dolgozták ki. • A Cohn frakcionálás során a vérplazmát differenciális fehérjekicsapásoknak vetik alá, melyben etanolt, pH-változást, kisózást, hőmérsékletváltozást alkalmaznak. • A frakciók elkülönítése centrifugálással történik.
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Rekombináns technikák • Az 1970-es 80-as években fejlesztették ki • Paul Berg (1973): restrikciós enzimek • Herbert Boyer (1978): az emberi inzulin gén klónozása E. coliban - Genentech • Két alapvető megközelítés – Izolált sejtekben történő expresszió – Expresszió transzgenikus növényben vagy állatban
Véralvadási kaszkád
XIIa XIa Ca2+
Extrinsic út VII + TF, Ca2+
VIIa TF, Ca2+
X Közös út
XII
XI
IX
IXa, VIII PL Ca2+
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Intrinsic út
Xa V PL Ca2+
protrombin
XIII
trombin fibrinogén
Az intrinsic út mindegyik komponense benne van a véráramban. Az extrinsic útvonalat a TF indítja, mely a véredényen kívülről származik. Kaszkád (lavina) modell.
fibrin
XIIIa + Ca2+ keresztkötött fibrin
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Hemofília A és B • A hemofília A a VIII-as faktor, hemofília B a IX-es faktor hiányában lép fel • Hemofilia A előfordulása férfiakban ~1/5,000 Hemofilia B előfordulása férfiakban ~1/30,000 • Recesszív, X-kromoszóma kötött betegségek (az anya tünetmentes hordozó) • Terápiában VIII-as vagy IX-es faktor koncentrátum alkalmazható • Rekombináns FVIII vagy FIX • Génterápiás próbálkozások
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Hemofilia A - génterápia • Súlyos tünetek (ízületek, létfontosságú szervek spontán bevérzése) csak ha a normál szint FVIII 1 %-a van jelen, ezért kis mennyiségű FVIII biztosítása is terápiás jelentőségű. • Az FVIIIexpresszió szoros kontrollja nem szükséges • A széles terápiás index következtében a túladagolás kockázata minimális • A véráramba juttatása nem igényli a májban történő expressziót • A B domén nem szükséges a funkcióhoz, hiányában fokozottabb az expresszió.
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
