UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE. Verwantschap tussen SIV en HIV en het gebruik van diermodellen in het onderzoek naar AIDS

UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar 2007-2008

Verwantschap tussen SIV en HIV en het gebruik van diermodellen in het onderzoek naar AIDS

door

Minneke VAN DUIJN

Promotor: Prof. H. Nauwynck Medepromotor: Prof. K. Van Rompay

Literatuurstudie in het kader van de Masterproef

De auteur en de promotor geven de toelating deze literatuurstudie voor consultatie beschikbaar te stellen en delen hiervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting de bron uitdrukkelijk te vermelden bij het aanhalen van gegevens uit deze studie. Het auteursrecht betreffende de gegevens vermeld in deze literatuurstudie berust bij de promotor(en). De auteur en de promotor(en) zijn niet verantwoordelijk voor de behandelingen en eventuele doseringen die in deze studie geciteerd en beschreven zijn.

Inhoudsopgave Samenvatting

1

1. Inleiding

2

2. Lentivirussen

2

2.1. HIV

4

2.1.1.

HIV-1

5

2.1.2.

HIV-2

7

2.2. SIV

7

3. SIV & HIV

9

3.1. Genetisch

9

3.1.1.

Oorsprong HIV-1

9

3.1.2.

Oorsprong HIV-2

11

3.2. Overdrachtstheorieën

11

3.2.1.

Via bloed

12

3.2.2.

Poliovaccin

12

4. Niet-humane primaten als diermodel

12

4.1. Medicijnmodel

14

4.2. Vaccinmodel

15

5. Besluit

17

6. Referenties

18

Samenvatting De lentivirussen infecteren een groot aantal diersoorten, waaronder de aap en de mens. Besmetting met een lentivirus zoals HIV (Humaan Immunodeficiëntie Virus) wordt gekenmerkt door een lange incubatieperiode, gevolgd door een chronische ziekte. Er zijn echter varianten die niet pathogeen zijn voor hun natuurlijke gastheer, zoals sommige SIVs (Simian Immunodeficiëntie Virus). HIV heeft twee varianten, HIV-1 en HIV-2. HIV-1 veroorzaakt 99% van alle infecties en komt wereldwijd voor. HIV-2 is voornamelijk beperkt tot West-Afrika en India. SIV werd ontdekt vlak nadat HIV werd aangewezen als de oorzaak van AIDS. Er zijn verschillende SIV-isolaten gevonden in Afrika. Onderzoek heeft uitgewezen dat HIV afstamt van SIV, meer bepaald dat HIV-1 voortkomt uit SIVcpz (chimpansee) en HIV-2 van SIVsm (roetmangabey). De meest gangbare theorie over de transmissie van SIV naar de mens, is dat het is overgegaan via bloed en secreties van apen, doordat er wordt gejaagd op apen en omdat ze als huisdier worden gehouden. De theorie dat de overdracht zou hebben plaatsgevonden door menselijk toedoen, namelijk via een poliovaccin, is inmiddels verworpen. Niet-humane primaten worden veelvuldig als diermodel gebruikt in het onderzoek naar HIV en AIDS, met name spelen ze een rol in de ontwikkeling van medicijnen en vaccin.

1

Inleiding Het Simian Immunodeficiëntie Virus (SIV) behoort net als het Humaan Immunodeficiëntie Virus (HIV) tot de familie van de Retroviridae en daarbinnen tot het genus Lentivirinae. SIV en HIV hebben dan ook veel dezelfde karakteristieken. De Retroviridae hebben de unieke eigenschap dat ze RNA kunnen omzetten tot DNA, dit DNA kunnen inbouwen in het gastheer DNA en zo kunnen vermenigvuldigen. De lentivirussen komen voor bij verschillende diersoorten en worden gekenmerkt door een lange incubatieperiode, gevolgd door een chronische ziekte. Er wordt nu algemeen aanvaard dat SIV van apen de bron is van HIV bij de mens. HIV heeft twee varianten, het HIV-1 en HIV-2, welke genetisch verschillen en ook geografisch anders zijn verspreid. Hebben HIV-1 en HIV-2 dezelfde voorloper en hoe is de voorloper ontdekt? En hoe is SIV dan overgegaan op de mens? Er bestaan verschillende theorieën over de overdracht van SIV, welke zijn echter juist? SIV komt voor bij verschillende niet-humane primaten en deze hebben dan ook allemaal een eigen variant van het virus. Deze zullen kort worden overlopen. Het bijzondere van de natuurlijke SIV-infectie van de aap is, dat de meeste apen niet ziek worden. Hoe komt het dat veel apen geen ziekte ontwikkelen na besmetting met SIV, maar de mens wel AIDS krijgt van HIV? Er wordt veel gebruik gemaakt van niet-humane primaten in het onderzoek naar HIV en AIDS. Dit heeft voornamelijk als doel nieuwe inzichten te verkrijgen in het verloop van de infectie en zo een bijdrage te leveren aan de ontwikkeling van nieuwe medicijnen en vaccins. Wat is eigenlijk het ideale diermodel dat de infectie met HIV zo goed mogelijk nabootst? Zijn deze modellen wel zo waardevol als wordt gedacht? In deze literatuurstudie is het de bedoeling een kort en bondig beeld geven over de evolutionaire en genetische relatie tussen SIV en HIV, de overdrachtstheorieën en het belang van niet-humane primaatmodellen in het onderzoek naar medicijnen en vaccins voor AIDS. 2.

Lentivirussen

De lentivirussen behoren tot de virusfamilie Retroviridae. Deze familie bevat virussen met een RNA genoom. Er zijn verscheidene subfamilies, genera en species. In deze scriptie wordt alleen ingegaan op het genus met daarbinnen de species Humaan Immunodeficiëntie Virus (HIV) en Simian Immunodeficiëntie Virus (SIV). De retrovirussen bevatten twee identieke enkelstrengige, positieve RNA moleculen van 7000 tot 11000 nucleotiden. Ze zijn 80-100 nm groot en bezitten een envelop met glycoproteïnen. De glycoproteïnen worden onder andere gebruikt voor het binden aan de gastheercel (Malashkevich et al., 1998). Retrovirussen bezitten de enzymen reverse transcriptase, integrase en protease. Reverse transcriptase zorgt ervoor dat er DNA kopieën gemaakt kunnen worden van RNA moleculen. Integrase zorgt ervoor dat het retrovirale DNA

2

(pro-virus genoemd) wordt ingebouwd in het gastheer DNA. Op deze manier kan het virus vermenigvuldigen als onderdeel van het cellulair DNA. Retrovirussen bevatten gewoonlijk drie belangrijke genen die coderen voor proteïnen die gevonden worden in het mature virus. Het Gag gen (groep-specfieke-antigen) codeert voor de kern van het virion en de structurele eiwitten van het virus. Het Pol gen (polymerase) codeert voor reverse transcriptase, protease en integrase. Het Env gen (envelop) codeert voor de retrovirale eiwitten op de envelop. Aan elk eind van de lineaire RNA strengen zitten LTR sequenties (Long Terminal Repeat) van een honderdtal nucleotiden. Wanneer ze worden overgeschreven naar DNA, zorgen deze sequenties ervoor dat het inbouwen van het virale DNA in het gastheer DNA wordt vergemakkelijkt. Ook bevatten deze sequenties promotoren voor virale genexpressie (Murray et al., 2005). De replicatie start wanneer er een binding tot stand komt tussen de virale glycoproteïnen en de receptoren van de gastheercel. Het virale RNA, dat de eigenschap heeft van mRNA, wordt met behulp van reverse transcriptase overgeschreven naar enkelstrengig DNA. Hieraan wordt meteen een complementaire streng gemaakt, waardoor er dus een dubbelstrengige DNA molecule ontstaat. Ook deze stap wordt gekatalyseerd door reverse transcriptase. Dit proces vindt plaats in het cytoplasma. Vervolgens verplaatst het dubbelstrengige retrovirale DNA zich naar de nucleus, waar het wordt geïntegreerd met behulp van integrase in het gastheer DNA. Het retrovirale DNA wordt nu pro-virus genoemd en wordt elke keer dat de cel deelt, ook vermeerderd. De volgende stap is de transcriptie van het virale DNA, wat leidt tot de vorming van RNA transcripten die twee functies hebben.

Allereerst fungeren ze als

mRNAs, die zorgen voor de synthese van virale proteïnen. Ten tweede worden sommige van deze RNA transcripten samen verpakt met de virale proteïnen en vormen nieuwe viruspartikels. Deze nieuwe viruspartikels, die dus weer RNA bevatten, gaan door middel van budding uit de cel en kunnen nieuwe cellen infecteren. De cel wordt hierbij niet noodzakelijk gedood (Dimmock et al., 2007). Figuur 1: Evolutionaire relatie tussen de verschillende lentivirussen. Uit (Lewis & Johnson, 1995). FIV: feliene immunodeficiëntie virus (kat) ; MVV : Visna-Maedi virus (schaap); CAEV:

capriene

arthritis-encephalitis

virus

(geit);

SIVmac:

simian

immunodeficiëntie virus (rhesusmakaak); SIVsmm: simian immunodeficiëntie virus (roetmangabey);

HIV-2:

humaan

immunodeficiëntie virus type 2 (mens); SIVcpz: simian immunodeficiëntie virus (chimpansee);

HIV-1:

humaan

immunodeficiëntie virus type 1 (mens); SIVagm: simian immunodeficiëntie virus (groene

meerkat);

EIAV:

equine

infectieuze anemie virus (paard); BIV: boviene immunodeficiëntie virus (rund).

3

Lentivirussen infecteren een groot aantal diersoorten, van schaap tot chimpansee en ook de mens. Het woord ‘lenti’ is Latijn voor traag en de virussen worden dan ook gekenmerkt door een lange incubatieperiode, gevolgd door een chronische ziekte. Er zijn echter ook varianten die niet pathogeen zijn voor hun natuurlijke gastheer, maar wanneer ze een andere diersoort infecteren wel pathogeen zijn, zoals bijvoorbeeld varianten van SIV (Holmes et al., 1999). De lentivirussen specifiek voor primaten kunnen worden onderscheiden van de andere dieren, doordat zij het CD4-proteine gebruiken als receptor en meestal de ziekte AIDS veroorzaken (Malashkevich et al., 1998). Een aantal algemene eigenschappen van de lentivirussen zijn (Dimmock et al., 2007): ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦

infectie van beenmerg afkomstige cellen integratie van viraal DNA in gastheer DNA persisterende viremie levenslange infectie lange subklinische infectie zwakke neutraliserende antistoffenrespons continue virusmutatie en antigenic drift neuropathologie

In deze literatuurstudie gaan we in op de relatie tussen HIV en SIV. Beiden hebben een gelijkende RNA organisatie en uitgebreide genetische overeenkomsten (Desrosiers, 1990). Ze hebben drie open reading frames die algemeen zijn voor alle retrovirussen, env, gag en pol, coderend voor respectievelijk de envelop, kern en enzymatische proteïnen. Daarenboven hebben beide genomen een groot aantal genen die coderen voor niet-structurele proteïnen met complexe regulatorische functies (Geretti, 1999). Om HIV en SIV te kunnen vergelijken moeten we eerst wat meer in detail kijken naar de genetische variatie

en algemene

eigenschappen van de virussen. 2.1

HIV

Het humane immunodeficientië virus (HIV) is eigenlijk een relatief nieuw, seksueel overdraagbaar virus. Het is een snel muterend retrovirus en verantwoordelijk voor de ziekte AIDS (Acquired ImmunoDeficiency Syndrome - verworven immunodeficiëntie syndroom). AIDS werd eigenlijk eerder ontdekt dan het virus dat het veroorzaakte. In 1981 ontdekten clinici een ongewone pneumonie veroorzaakt door Pneumocystis carinii en identificeerden een zeldzame kanker (Kaposi’s sarcoma) in homoseksuele jonge mannen in New York en Californië. Sommige van hen hadden zowel het sarcoma als de pneumonie. Deze aandoeningen werden al snel toegeschreven aan immunodeficiëntie (Dimmock et al., 2007). In

1983

demonstreerde

de

Franse

onderzoeker

Charles

Dauguet

met

de

elektronenmicroscoop een nieuw virus uit een monster van een AIDS-patiënt. De Franse onderzoekers rapporteerden dat het ging om de isolatie van een T-lymfotroop retrovirus, maar konden de rol ervan in de etiologie van AIDS nog niet plaatsen (Barre-Sinoussi et al., 1983). Ze noemden het virus LAV, wat staat voor lymfadenopathie-geassocieerd-virus. Ondertussen hadden ook Amerikaanse onderzoekers, onder leiding van Gallo, een nieuw

4

virus gevonden en zij noemden hun virus HTLV, wat staat voor humaan T-cel leukemie virus en wat ook immunodeficiëntie veroorzaakt (Gallo et al., 1983). Dit heeft destijds voor een hoop opschudding gezorgd, maar uiteindelijk is er overeen gekomen dat de Fransen de eersten waren die het virus rapporteerden en dat de Amerikanen de eersten waren die het virus koppelden aan AIDS. In 1984 werd duidelijk dat het virus dat AIDS veroorzaakte tot een andere subfamilie behoorde dan HTLV. HTLV behoort tot de Oncovirinae, terwijl HIV tot de Lentivirinae behoort (Kallings, 2007). In 1985 kwamen de eerste antilichaamtesten beschikbaar voor diagnostische testen (Dimmock et al., 2007). HIV heeft 2 verschillende hoofdvarianten, HIV-1 en HIV-2. Beide infecteren voornamelijk T- lymfocyten en macrofagen (Gardner, 2003), gebruikmakend van de CD4 receptor. Bovendien maakt HIV gebruik van chemokine co-receptoren, vooral chemokine-receptor CCR5 en CXCR4 (Holmes, 2001). HIV kan zowel seksueel, via het bloed, als van moeder op kind worden overgedragen. Als er geen behandeling wordt ingesteld, volgt er eerst een lange asymptomatische incubatieperiode. Op het moment dat de CD4+ lymfocyten een zeer laag niveau hebben bereikt ( ≤ 200 cellen / µl bloed tegenover normaal 500-1500 cellen / µl bloed voor een volwassen persoon) (Wodarz & Levy, 2007), kan het immuunsysteem niet meer normaal werken en resulteert dit uiteindelijk in immunodeficiëntie en AIDS. The United Nations Programme on AIDS (UNAIDS 2007) schat dat wereldwijd 33,2 miljoen mensen geïnfecteerd zijn met HIV, waarvan ongeveer 16 miljoen vrouwen. Meer dan 95% van de nieuwe infecties ontstaan in de ontwikkelingslanden. Het epicentrum van HIV is de sub-sahara in Afrika met 1,7 miljoen nieuwe infecties in 2007, met de hoogste prevalentie in Swaziland en Botswana. Er is nog steeds geen effectief vaccin en genezende behandeling ontwikkeld, maar een combinatie van twee nucleoside analogen en een non-nucleoside analoog of een protease inhibitor is opmerkelijk succesvol in het stilleggen van virusreplicatie en de progressie van AIDS. Dit is ook gekend als HAART (highly active anti-retrovirus therapy / hoog-actieve anti-retrovirus therapie) en wordt gebruikt sinds 1994. Ondanks dat bij behandelde personen het virus in het plasma niet detecteerbaar is, wordt het virus toch niet geëlimineerd. Er is latent virus aanwezig in de rustende CD4+ geheugencellen en andere celreservoirs. Behandeling moet zonder onderbrekingen worden voortgezet, voor de rest van het leven van de patiënt, of het virus komt terug op zijn originele niveau en is dan vaak resistent aan de medicijnen. HAART is duur en beperkt zich voornamelijk tot de ontwikkelde landen (Dimmock et al., 2007). Slechts 23% van de Afrikaanse bevolking die behoefte heeft aan HAART, krijgt dit ook . 2.1.1.

HIV-1

HIV-1 is wereldwijd verspreid en veroorzaakt tot 99% van alle HIV-infecties. HIV is opmerkelijk goed in staat te muteren en zich aan te passen aan nieuwe omstandigheden. Reverse transcriptase speelt een grote rol in de diversiteit. Er treden frequent mutaties op, onder andere deleties, substituties, recombinaties en inserties. Elk van deze mechanismen

5

heeft invloed op één of meer nucleotiden. De hierdoor ontstane grote variabiliteit binnen HIV1 heeft een grote impact op diagnose, behandeling en epidemiologische studies (Requejo, 2006). Er bestaat een onderverdeling binnen HIV-1 op basis van de verschillen tussen de envelop (env) sequenties van het genoom (Kandathil et al., 2005). Er bestaan drie grote groepen: M (major), O (outlier) en N (non M/non O). Groep M is de meest voorkomende, grootste groep binnen HIV-1 en is verantwoordelijk voor de AIDS pandemie. Binnen de Mgroep is er een verdere opdeling in negen subtypes: A, B, C, D, F, G, H, J en K (Peeters, 2001; Robertson et al., 2000). Binnen deze negen subtypes kan er nog verder onderverdeeld worden in sub-subtypes. Subtype A kan bijvoorbeeld nog worden onderverdeeld in A1 en A2. Er bestaan ook recombinante vormen van de verschillende subtypes, circulerende recombinanten (CRF - Circulating Recombinant Forms) genoemd. Wanneer een individu wordt geïnfecteerd met twee verschillende HIV-1 subtypes, kan er een nieuwe recombinante vorm ontstaan die zich kan gaan manifesteren in een omgeving (Requejo, 2006).

Figuur 2: Globale verspreiding van HIV-1 types en recombinanten (Dimmock et al., 2007).

De verschillende groepen zijn geografisch zeer verspreid (zie Figuur 2), HIV-1 in de ontwikkelde wereld is meestal een sub-subtype B, in Afrika vinden we eerder A, C, D of een CRF en in India groep C. HIV-1 groep O is veel minder voorkomend en beperkt zich tot WestAfrika (Lemey et al., 2004) en de zeldzame groep N is geïdentificeerd in Kameroen (Simon et al., 1998). Er zijn ook recombinaties gekend die niet lijken op eerder geïdentificeerde CRFs en deze worden URFs genoemd (Unique Recombinant Forms). De meeste van deze URFs worden gedetecteerd in gebieden waar meerdere subtypes en CRFs circuleren (Requejo, 2006).

6

2.1.2.

HIV-2

HIV-2 is verantwoordelijk voor een miniem aandeel in de pandemie, is minder pathogeen en voornamelijk beperkt tot West-Afrika en India (Dimmock et al., 2007). Ondanks dat het grootste aantal HIV-infecties wereldwijd toe te schrijven is aan HIV-1, heeft HIV-2 in een aantal landen, zoals Guinee-Bissau en Portugal, een klein, maar niet verwaarloosbaar aandeel. De landen buiten West-Afrika waar HIV-2 wordt gevonden hebben meestal een historische socio-economische of epidemiologische link met West-Afrika (Gao et al., 1994). Hoewel HIV-1 en HIV-2 in vele aspecten op elkaar lijken, zijn er ook belangrijke verschillen, onder andere in virusevolutie, tropisme en pathogenese (Reeves & Doms, 2002). Personen geïnfecteerd met HIV-2 ondervinden langere latente periodes, de ziekteprogressie is trager en ze hebben een lager virusgehalte in de asymptomatische fase (Chen et al., 1997). Verticale (van moeder op kind) en horizontale transmissie van het virus zijn beduidend lager vergeleken met HIV-1 (Gao et al., 1994). Er is minder genetische variatie binnen HIV-2 dan binnen HIV-1. De subtypes van HIV-2, A tot en met H worden voornamelijk gevonden in West-Afrika, terwijl groep M van HIV-1 wereldwijd verspreid is. Van de groepen van HIV-2 circuleren voornamelijk A en B in de menselijke populatie en beperken C-H zich tot enkele unieke gevallen (Kandathil et al., 2005). 2.2.

SIV

SIV werd ontdekt in 1985, vlak nadat HIV als de oorzaak van AIDS werd erkend. SIV werd ontdekt bij gevangen rhesusmakaken die symptomen hadden die leken op symptomen van het humane AIDS. Er werd gedacht dat deze Aziatische rhesusmakaken het virus kregen van Afrikaanse roetmangabey’s die in dezelfde kooien gehuisvest waren in het California Regional Primate Research Center. De rhesusmakaken, die geen natuurlijke SIV varianten hebben, werden ziek van de variant van de Afrikaanse apen. De ontdekking van SIV is dus eigenlijk per puur toeval gebeurd, door de gezamenlijke huisvesting (Gardner, 1996; 2003). Simian immunodeficiëntie virussen (SIVs) zijn primaatlentivirussen die niet minder dan 36 verschillende niet-humane primaten infecteren (Sharp et al., 2005). Er zijn verschillende soorten SIV-isolaten gevonden, waaronder bij de chimpansee, roetmangabey, mandril, groene meerkat en de diadeemmeerkat. Deze komen voor in Afrika, zijn endemisch en veroorzaken geen ziekte in hun natuurlijke gastheer. Apensoorten in Azië hebben in het wild geen natuurlijke SIV, maar wanneer ze experimenteel geïnfecteerd worden ontwikkelen ze wel ziekte, vergelijkbaar aan AIDS. Deze ziekte bij apen wordt SAIDS (simian AIDS) genoemd (Geretti, 1999). Tabel 1 geeft de belangrijkste SIV-isolaten en hun natuurlijke gastheer weer.

7

SIV

Species

Algemene naam

Engelse naam

Natuurlijke infectie

Afrika SIVsm

Cercocebus atys

roetmangabey

Sooty mangabey

Ja

SIVagm

Cercopithecus aethiops

groene meerkat

African green monkey

Ja

SIVsyk

Cercopithecus mitis

diadeem meerkat

Sykes' monkey

Ja

SIVmnd

Papio sphinx

mandril

Mandrill (baboon)

Ja

SIVcpz

Pan troglodytes

chimpansee

Chimpanzee

?

Azië SIVmac*

Macaca mulatta

rhesusaap

Rhesus macaque

Nee

SIVmne*

Macaca nemestrina

lampongaap

Pig-tailed macaque

Nee

SIVstm*

Macaca arctoides

beermakaak

Stump-tailed macaque

Nee

Tabel 1: SIV-isolaten en hun natuurlijke gastheer. Bewerkt uit (Geretti, 1999). *Nomenclatuur van deze SIV’s is gebaseerd op het feit dat deze SIV’s niet natuurlijk gevonden werden in deze apensoorten, maar werden ontdekt in gevangenschap na transmissie van SIV’s van Afrikaanse primaten.

De genetische diversiteit binnen de niet-humane primaatlentivirussen is enorm complex. Er zijn veel voorbeelden gekend van co-evolutie tussen virussen en hun gastheer, maar ook recombinatie tussen SIV-varianten is niet uitzonderlijk. Dit kan een verklaring zijn voor de transmissie van SIV naar andere diersoorten en de mens (Van Heuverswyn & Peeters, 2007). Twee virussen, SIVcpz van de chimpansee (Pan Troglodytes) en SIVsm van de roetmangabey (Cercocebus atys) hebben de speciesgrenzen overschreden en HIV type 1 en 2 veroorzaakt. Primaten die natuurlijk geïnfecteerd zijn met SIV, inclusief SIVcpz geïnfecteerde chimpansees, ontwikkelen gewoonlijk geen immunodeficiëntie of AIDS (Marx et al., 2004; Sharp et al., 2005; Wodarz & Levy, 2007). Daarentegen veroorzaakt HIV-infectie in de mens meestal een progressief verlies van CD4+ T lymfocyten en dus immunodeficiëntie. Natuurlijke SIV infectie wordt gekarakteriseerd door hoge virusreplicatie, met niveaus van viremie in het plasma die net zo hoog zijn, of zelfs hoger, dan deze die gezien worden in HIVgeïnfecteerde individuen (Chakrabarti et al., 2000; Rey-Cuille et al., 1998; Silvestri, 2005; Silvestri et al., 2003). De afwezigheid van ziekteontwikkeling, ondanks deze hoge virusreplicatie, is in nog meer apensoorten aangetoond (Broussard et al., 2001; Holzammer et al., 2001; Pandrea et al., 2003; Silvestri, 2005). Een groot probleem in het onderzoek is, dat apen wanneer ze natuurlijk geïnfecteerd zijn, meestal geen ziekteverschijnselen krijgen. Een recent onderzoek (Silvestri et al., 2007) heeft een aantal mogelijke oorzaken gevonden voor deze kwestie. Zij ontdekten dat apen met een besmetting met hun natuurlijke SIV, veel lagere niveaus van immuunactivatie lieten zien, vergeleken met HIV geïnfecteerde individuen of rhesusmakaken geïnfecteerd met SIV van de roetmangabey. Dit is dus een groot verschil tussen natuurlijke non-pathogene en nietnatuurlijke, pathogene HIV/SIV infecties. Er werd nog een andere immunologisch verschil gevonden, namelijk het niveau van CCR5 (chemokine-receptor 5) expressie op CD4+ T cellen. In natuurlijke SIV gastheren was deze expressie beduidend lager. Verder onderzoek naar deze twee fenomenen is nodig en zou misschien een belangrijke rol kunnen spelen in de strijd tegen AIDS.

8

3.

SIV en HIV

Tegenwoordig wordt algemeen aanvaard dat HIV afstamt van het SIV bij apen. Na HIV en SIV apart te hebben bekeken, kunnen we dieper ingaan op de relatie tussen beide. Daarbij kijken we naar het genetische aspect en de mogelijke overdrachtstheorieën. 3.1.

Genetisch

Er is de laatste 25 jaar veel onderzoek gedaan naar de evolutie en herkomst van HIV. Er werd voornamelijk gezocht naar de oorsprong, de bron van HIV, waarvan al snel vermoed werd dat deze lag bij de apen. Sinds er een connectie werd gemaakt tussen een eventuele relatie tussen HIV en SIV was er een enorme opkomst in onderzoeken en staan we inmiddels al veel verder dan 20 jaar geleden. HIV-1 en HIV-2 hebben veel overeenkomsten maar ook zeer veel verschillen. Bovendien hebben ze beiden een andere oorsprong. 3.1.1.

Oorsprong HIV-1

Het eerste vermoeden dat chimpansees misschien de bron konden zijn van HIV-1, ontstond begin jaren negentig toen in het wild geboren chimpansees (Pan Troglodytes) uit Gabon (West-Afrika) waren gevonden die het lentivirus SIVcpzGAB1 droegen, wat verwant was met HIV-1 (Huet et al., 1990; Sharp et al., 2005). Sera van deze dieren gaven een kruisreactie met alle HIV-1 proteïnen, inclusief de envelop-glycoproteïnen (Huet et al., 1990). Het SIVcpzGAB1 genoom droeg dezelfde negen open reading frames als HIV-1, met inbegrip van het vpu gen, wat tot dan toe alleen was geïdentificeerd in HIV-1. Daarenboven wezen fylogenetische studies uit dat HIV-1 meer gerelateerd was aan SIVcpzGAB1 dan aan elk ander SIV. Van vijftig in het wild gevangen chimpansees, getest op SIVcpz, waren er slechts twee (GAB1 en GAB2) die kruisreactieve antilichamen tegen HIV-1 hadden. Dit gaf een onverwacht lage SIVcpz infectie aan in vergelijking tot natuurlijke infectie met SIV van de andere apensoorten (Allan et al., 1991; Lowenstine et al., 1986; Peeters et al., 1989; Sharp et al., 2005). Dit verhoogde de kans dat chimpansees en mensen dit virus hadden gekregen van een andere, nog ongedefinieerde apensoort, dat het echte virusreservoir zou zijn (Huet et al., 1990). Vervolgens werd er door moleculaire karakterisatie van een SIVcpz stam uit een derde chimpansee (Noah), onderschept in een illegaal transport van Zaïre naar België, een derde virus ontdekt dat SIVcpzANT genoemd werd (Peeters et al., 1992). Dit virus droeg ook een vpu gen en kwam in fylogenetische stambomen overeen met SIVcpzGAB1 en HIV-1, maar wel twee maal zo ver van SIVcpzGAB1 en HIV-1 als deze van elkaar (Sharp et al., 2005; Vanden Haesevelde et al., 1996). Deze graad van diversiteit had men eerder alleen gezien bij SIV stammen van verschillende primatensoorten, dus was er weer een aanwijzing dat er een mogelijkheid was dat er een andere bron was voor zowel SIVcpz infectie in chimpansees, als HIV-1 infectie in de mens. Bovendien waren 43 andere in het wild gevangen chimpansees uit

9

dezelfde studie, antilichaam-negatief, wat de twijfel over chimpansees als reservoir nog groter maakte (Peeters et al., 1992). De nogal tegenstrijdige bevindingen over SIVcpz werden uiteindelijk duidelijker toen de fylogenie van SIVcpz geanalyseerd werd in de context van de subspecies origine van de geïnfecteerde chimpansee (Gao et al., 1999). Dat onderzoek wees uit dat twee chimpansee subspecies in Afrika, de Pan troglodytes troglodytes en de Pan troglodytes schweinfurthii, beide een SIV besmetting hadden (respectievelijk SIVcpzPtt en SIVcpzPts ) en dat hun virussen zich op twee zeer divergente, maar sub-speciesspecifieke, fylogenetische lijnen bevonden. Alle HIV-1 stammen die gekend zijn die de mens infecteren, inclusief HIV-1 groepen M, N en O, die alle HIV-1 infecties veroorzaken, zijn zeer nauw verwant aan slechts één van deze SIVcpz lijnen die gevonden werden in Pan troglodytes troglodytes. Opvallend was dat deze drie HIV-1 groepen niet elkaar nauwste verwanten waren, maar daarentegen tussen de verschillende SIVcpz werden ingeklemd. Dit is heel duidelijk te zien in Figuur 3. Alle SIVcpz stammen van Pan troglodytes troglodytes en alle drie de groepen van HIV-1 vormden een enkele monofyletische lijn. Deze gegevens waren sterk overtuigend dat HIV-1 infectie van de mens voortkwam als een resultaat van species tot species transmissie van SIVcpz van Pan troglodytes troglodytes (Gao et al., 1999; Hahn et al., 2000).

Figuur 3: Fylogeografie van SIVcpz en de relatie tot HIV-1. Bewerkt uit (Sharp et al., 2005). Rood: Pan troglodytes troglodytes; Blauw: Pan troglodytes schweinfurthii. Uit deze figuur is nogmaals duidelijk af te leiden dat HIV-1 afstamt van Pan troglodytes troglodytes.

Dat nu de nauwe fylogenetische relatie tussen SIVcpz en HIV-1 werd aangetoond, verklaarde nog niet waarom er zo’n lage frequentie van SIVcpz detectie was in de onderzochte, gevangen chimpansees. Extra onderzoeken brachten nieuwe SIV stammen aan het licht, zodat de natuurlijke infectie niet zo zeldzaam was als gedacht. Vier SIVcpz stammen (CAM3, CAM4, CAM5 en CAM13) werden verkregen uit chimpansees uit Kameroen (Corbet et al., 2000; Nerrienet et al., 2005; Sharp et al., 2005), twee uit Tanzania (TAN1 en TAN5) en een uit Congo (SIVcpzDRC1) (Santiago et al., 2002; Sharp et al., 2005; Worobey et al., 2004). Bovendien werd de bestaande theorie over de twee aparte lijnen, SIVcpzPtt (rood in figuur) en SIVcpzPts (blauw in figuur), bevestigd.

10

Figuur 3 laat zien dat de SIVcpz stammen van Tanzania (TAN) en Congo (DRC), die werden geïdentificeerd als Pan troglodytes schweinfurthii (blauw), het meest verwant waren met SIVcpzANT, gevonden in chimpansee Noah. Daarentegen waren de drie stammen uit Kameroen (CAM) meest gerelateerd aan SIVcpzPtt (rood). Al het bestaande bewijs tot nu toe wijst dus naar natuurlijk geïnfecteerde Pan Troglodytes troglodytes als het natuurlijke reservoir voor HIV-1 (Gao et al., 1999; Sharp et al., 2005). 3.1.2.

Oorsprong HIV-2

Voor HIV-2 ligt er daarentegen een ander virus aan de oorsprong, namelijk SIV van de roetmangabey (SIVsm) (Gao et al., 1999; Hirsch et al., 1989). Een onderzoek in 1992 wees al uit dat HIV-2, SIVsm en SIVmac (van de rhesusmakaak) een zeer specifieke groep van lentivirussen vertegenwoordigen, die niet in verschillende fylogenetische lijnen kan worden opgedeeld (Gao et al., 1992). Inmiddels is men te weten gekomen dat HIV-2 afstamt van SIVsm (Cercocebus torquatus atys). Er werd aangetoond dat HIV-2 en SIVsm een identieke genoomstructuur delen, namelijk dat elk virus codeert voor een eiwit Vpx, dat in geen enkel ander lentivirus werd aangetoond (Hirsch et al., 1989). Bovendien komen SIVsm en HIV-2 voor bij apen en mensen uit dezelfde geografische regio, wat een overdracht waarschijnlijker maakt (Chen et al., 1996). SIV infectie van roetmangabey’s is algemeen voorkomend, zowel in het wild als in gevangenschap, en blijkt te worden verkregen rond de tijd van seksuele maturiteit. SIV-geïnfecteerde roetmangabey’s behouden gewoonlijk normale aantallen CD4+ T-cellen en ontwikkelen geen SAIDS (Silvestri, 2005). 3.2.

Overdrachtstheorieën

De vraag over de afstamming van HIV is nu beantwoord, alleen hoe heeft de overdracht nu plaats kunnen vinden? Is er wel sprake van een ‘overdracht’ of is SIV gemuteerd en evolutionair veranderd in HIV, een variant voor de mens? Sommige onderzoekers zien de overdracht van SIV naar de mens als een zoönose, terwijl anderen vinden dat de ziekte AIDS niet aan de vereisten van een zoönose voldoet (Marx et al., 2004). Het moeizame van het bepalen wat nu juist de SIV/HIV overdracht is geweest, is dat men niet exact weet sinds wanneer er HIV besmettingen zijn. HIV is ontdekt in de jaren 80, maar inmiddels heeft men ook data van besmettingen in de jaren vijftig. Meerdere onderzoeken schatten de origine van de M groep van HIV-1 terug tot in de jaren twintig of dertig. Er is dus niet geweten of HIV al langer aanwezig is geweest in de menselijke populatie. In hoeverre is HIV geëvolueerd in de mens zelf? Hoever moeten we teruggaan? Er bestaan twee overdrachtstheorieën die kort worden besproken en waarvan de transmissie via bloed de gangbare theorie is.

11

3.2.1.

Via bloed

Deze hypothese suggereert dat SIVcpz en SIVsm zijn overgedragen door directe blootstelling van de mens aan geïnfecteerd apenbloed en andere secreties. Dit zou kunnen doordat er veel wordt gejaagd op apen voor de consumptie (Peeters et al., 2002) en dat veel dieren als huisdier worden gehouden (Chen et al., 1996; Gao et al., 1999; Holmes, 2001). Als directe blootstelling aan apenbloed het primaire mechanisme is van SIV transmissie naar mensen, dan moet zoönotische overdracht van deze lentivirussen gebeurd zijn gedurende de laatste eeuwen. Toch zijn er ook meerdere factoren nodig voor een virus om een pandemie te veroorzaken. In de twintigste eeuw kan een combinatie van verschillende factoren ervoor gezorgd hebben dat AIDS zich verspreidde: sociale verstoring, slavernij, verstedelijking, prostitutie, aanleg van grote transportwegen en andere sociaal-economische veranderingen. Dankzij deze omstandigheden kon het virus zich verspreiden en epidemische proporties aannemen (Hahn et al., 2000). 3.2.2.

Poliovaccin

Een andere hypothese was dat geattenueerd oraal poliovaccin, gebruikt tijdens grootschalige vaccinatieproeven in Belgisch-Congo in de late jaren vijftig, besmet waren met SIV. Bij de bereiding van dit vaccin zouden de nieren van besmette chimpansees en roetmangabey’s zijn gebruikt en zou zo het virus zijn overgedragen in de menselijke populatie (Hahn et al., 2000; Holmes, 2001). Inmiddels hebben onderzoekers deze theorie verworpen. In dit onderzoek werden SIV strengen geïsoleerd van chimpansees uit hetzelfde gebied waaruit destijds de chimpansees werden gehaald voor de bereiding van de vaccins. De resultaten van dit onderzoek wezen uit dat de SIVcpz van deze chimpansees verschillend waren aan HIV-1. Ook is er bewijs gevonden (o.a. via PCR) dat de originele poliovaccins niet bereid waren met behulp van niercellen van chimpansees, maar van makaken (Worobey et al., 2004). Dit geeft dus indicaties dat de apen die gebruikt werden voor de vaccinaties, niet de oorzaak zijn voor de AIDS-pandemie. 4.

Niet-humane primaten als diermodel

Veel onderzoek, met als doel de mysteries rond HIV-infectie en AIDS te ontrafelen, gebeurt met behulp van diermodellen. Een diermodel moet zoveel mogelijk dezelfde eigenschappen hebben met betrekking tot de virusbesmetting, als een mens besmet met HIV. Een samenvatting van de karakteristieken voor het ideale diermodel staat weergegeven in Tabel 2.

12

Proefdier     Agens  

Gebruiksklaar en voordelig te verkrijgen Makkelijk hanteerbaar en gehuisvest Goed gekende fysiologie en immunologie Gebruiksklaar verkrijgbare species-specifieke reagentia (bv. monoklonale antilichamen)

HIV-1 Nauw gerelateerd virus met gelijkaardig replicatiepatroon en genetische samenstelling

Pathogenese  Routes van infectie: intraveneus, mucosaal of perinataal.  Persisterende virale infectie met een sterke anti-virale immuunrespons van de gastheer  CD4+ cellen als target (CD4+-lymfocyten, monocyten, macrofagen)  Antilichamen van de gastheer gericht tegen de virale envelop  Ziekteverloop: progressief verlies van CD4+ T cellen in de perifere circulatie, daling van antivirale antilichamen, stijging in circulerend virus  Immunosupprssieve ziekte  Pathologie: primaire retroviraal-geinduceerde encephalitis, pneumonia, veranderingen in lymfoide organen (hyperplasie tot depletie) Tabel 2: Karakteristieken van een ideaal diermodel voor HIV-1 infectie. Bewerkt uit: (Lewis & Johnson, 1995).

Knaagdieren en katten zijn geschikt voor het initiële onderzoek, maar de meeste vooruitgang is geboekt met niet-humane primaatmodellen, die de HIV-infectie van de mens beter weerspiegelen (Lewis & Johnson, 1995). Niet-humane primaten zijn fylogenetisch het meest verwant met de mens, bovendien hebben ze grote overeenkomsten wat betreft fysiologie (medicijnmetabolisme, placentatie en foetale ontwikkeling inbegrepen) en immunologie. Een groot voordeel van een dierlijk model is dat het ook gebruikt kan worden om hypotheses te testen die moeilijk of onmogelijk uit te voeren zijn op de mens. Door verschillende variabelen te manipuleren, kunnen onderzoekers studies ontwerpen die voldoen aan zeer specifieke eisen (Van Rompay, 2005). Een samenvatting van de meest gebruikte niet-humane primaatmodellen en hun karakteristieken is weergegeven in Tabel 3. De meest voor de hand liggende diermodellen zijn de makaak en de chimpansee. Beide modellen hebben voor- en nadelen. Zo is de chimpansee genetisch het meest verwant met de mens, 98% van het menselijk DNA is ook aanwezig in de chimpansee. Hoewel chimpansees geïnfecteerd kunnen worden met HIV-1, is dit diermodel niet praktisch vanwege de lage beschikbaarheid, hoge kosten, lage virulentie en ethische kwesties (Novembre et al., 1997). Een nadeel is dat als de chimpansees al AIDS symptomen ontwikkelen, dit jaren kan duren. Bovendien is het een beschermde diersoort, het gebruik van deze dieren als proefdier valt slecht bij dierenrechtenactivisten. Chimpansees hebben veel verzorging en aandacht nodig. De makaak is daarentegen veel goedkoper, makkelijker verkrijgbaar en is eenvoudiger in onderhoud. Ze ontwikkelen sneller ziekte, maar kunnen er ook aan sterven. Elk model heeft dus zijn voor- en nadelen, en een diermodel moet dan ook zorgvuldig worden gekozen, op basis van het doel van het onderzoek (Lewis & Johnson, 1995). De meeste vooruitgang in de pathogenese en immunologie is geboekt in de studie met Aziatische makaken geïnfecteerd met Afrikaans SIV (Haigwood, 2004; Lewis & Johnson, 1995). Toch blijven chimpansees, volgens sommige onderzoekers, het beste diermodel voor preklinische testen van vaccins, omdat ze zo dicht bij de mens staan.

13

Virus SIVmac/sm

Experimentele gastheer Makaak

Viraemie Persisterend

Ziekte Ja

Gebruik bij • Studies in pathogenese • Testen antivirale therapieën

Eigenschappen • Ziekteprogressie met daling in CD4+ T cellen. • Hoeveelheid virus in plasma voorspelt tijdstip ontstaan ziekte.

• Testen vaccin strategieën HIV-2

Baviaan

Voorbijgaand

Nee

• Testen vaccins om infectie te voorkomen

Persisterend

Ja

• Studies in pathogenese

• Replicatie op een laag niveau en ziekte houdt niet aan.

• Testen antivirale therapieën • Testen vaccin strategieën HIV-2

Lampongaap

Voorbijgaand

Nee

• Studies in pathogenese

Persisterend

Ja

• Testen antivirale therapieën

HIV-1

Lampongaap

Voorbijgaand

Nee

• Testen vaccins om infectie te voorkomen

HIV-1

Chimpansee

Persisterend

Nee

• Testen antivirale therapieën en vaccins

SHIV

Makaak

Voorbijgaand

Nee

• Testen vaccins om infectie te voorkomen

• Geen aanhoudende replicatie en geen pathogenese. • Tijd tot ziekteontwikkeling gelijk aan mens. • Gebruiken CC5R5 receptor. Geen snelle afname CD4+ T-cellen.

• Testen antivirale therapieën Persisterend

Ja

• Gebruiken CXCR4 receptor. Snelle afname CD4+ T-cellen.

Tabel 3: Niet-humane primaatmodellen en hun karakteristieken. Samengesteld uit (Lewis & Johnson, 1995) en (Haigwood, 2004).

Niet-humane primaten kunnen dus dienen als diermodel in het onderzoek naar AIDS. Ze kunnen gebruikt worden in het onderzoek naar zowel medicijnen als vaccins. 4.1.

Medicijnmodel

Infectie van niet-natuurlijke gastheren, zoals makaken, met virulente SIV isolaten, resulteert in een ziekte die erg lijkt op het humane AIDS, ook wel simian AIDS (SAIDS) genoemd. Dezelfde laboratoriummerkers kunnen gebruikt worden om de ziekteprogressie te volgen (Haigwood, 2004). In contrast tot de mens, ontwikkelen de meeste makaken klinische symptomen binnen één tot drie jaar. In pasgeboren makaken, net zoals bij baby’s, is de ziekteprogressie versneld. Het is belangrijk om te beseffen dat makaken niet altijd sterven aan de ziekte, afhankelijk van de virulentie van het SIV waarmee ze worden geïnoculeerd. Voor anti-HIV medicijnstudies op makaken worden meestal de rhesusmakaken (Macaca mulatta) of de javamakaak (Macaca fascicularis) gebruikt. De SIV isolaten die het meest gebruikt worden zijn SIVmac, SIVsm en SIVmne. Deze stammen zijn gevoelig aan het grootste deel van dezelfde nucleoside RT (reverse transcriptase) inhibitoren (bv. zidovudine) , nucleotide RT inhibitoren (bv. tenofovir, adefovir), integrase en protease inhibitoren. Vanwege hun CCR5 chemokine co-receptor gebruik, zijn SIV isolaten ook gevoelig aan CCR5-

14

inhibitoren. Er zijn verschillende soorten SIV gecreëerd, met allemaal verschillende delen van het genoom van HIV, ook wel de SHIV virussen genoemd. Deze worden ook gebruikt in onderzoeken met primaten. Studies met makaken als model hebben een belangrijke rol gespeeld in het onderzoek naar verschillende aspecten van het HIV virus en AIDS: -

Preklinische effectiviteit van nieuwe medicijnen zoals tenofovir. Vanwege hun goedgelijkende fysiologie en metabolisme zijn makaken erg nuttig voor de studie van de toxiciteit en farmacokinetiek van antivirale medicijnen. Dit omvat ook de effecten van zwangerschap en medicijnoverdracht door de placenta en naar de moedermelk.

-

Voordelen van chemoprofylaxis, vroege behandeling en immunotherapeutische strategieën. Een aantal studies op makaken hebben de effectiviteit getest van antivirale stoffen tegen mucosale (intravaginale/intrarectale) infecties. Meer studies zijn er gedaan op het gebied van systemische medicijntoediening en de preventie van ziekte. Tenofovir is een medicijn dat het meest effectief was en is nu ook goedgekeurd voor therapeutisch gebruik bij de mens. Veel studies op makaken hebben uitgewezen dat, zelfs wanneer infectie niet was voorkomen, vroege behandeling met antivirale medicijnen de piek van acute viremie verlaagde of dat viremie vertraagd optrad. Dit komt de antivirale immuunrespons ten goede en vertraagt ziekteontwikkeling. In de meeste studies was tenofovir het meest effectief in het verlagen van de viremie.

-

In vivo virulentie en klinische betekenis van medicijn-resistente virusmutanten. Een dierlijk model kan erg nuttig zijn om de klinische gevolgen van medicijn-resistente virussen te onderzoeken. Een dier kan geïnoculeerd worden met medicijn-resistente virusmutanten en de replicatie en virulentie kan worden vergeleken tussen met medicijn behandelde en onbehandelde dieren. Het SIV-makaak model heeft aangetoond dat de relatie tussen in vitro eigenschappen en in vivo observaties vaak zwak is. De extrapolatie van resultaten van in vitro studies, met het oog op de behandeling van HIV patiënten, moet dus heel voorzichtig gebeuren (Van Rompay, 2005).

4.2.

Vaccinmodel

Sinds HIV en AIDS ontdekt zijn, is er druk gezocht naar een vaccin om nieuwe besmettingen te voorkomen. HIV is een bijzonder lastig virus met oog op het maken van een vaccin. De HIV-isolaten die de mens besmetten en AIDS veroorzaken zijn genetisch zeer verschillend. Dit bemoeilijkt het ontwikkelen van een effectief vaccin. Ook andere componenten van de HIV-infectie geven problemen in de vaccinontwikkeling. HIV wordt zowel seksueel als via het bloed overgedragen, waardoor een vaccin zowel goede mucosale immuniteit, maar ook systemische immuniteit moet induceren. Het moeilijkste aspect is dat infectie met HIV resulteert in hoge virale replicatie, die stand houdt ondanks dat er een stevige immuunrespons is van de gastheer (Letvin, 2002).

15

Omdat de vaccinstudie naar HIV al een onderwerp op zich is, wordt er in deze literatuurstudie alleen een kort overzicht gegeven. Het SIV-model van pathogene lentivirusinfectie wordt intensief gebruikt in vaccinstrategieën. Voor vaccinstudies voor HIV-1 worden vooral de chimpansee, de groene meerkat, de baviaan en de makaken gebruikt (Nath et al., 2000). Om een goed vaccin te kunnen ontwerpen is het belangrijk te weten wat het immuunsysteem voor acties onderneemt wanneer het lichaam besmet wordt. Het mooiste zou natuurlijk zijn dat het mogelijk was om vaccins te testen op apen besmet met het HIV-1 (Staprans & Feinberg, 2004). Dit is mogelijk bij de chimpansee, echter deze ontwikkelen maar zelden AIDS, waardoor ook dit geen perfect diermodel is. Bovendien is de chimpansee een beschermde diersoort en zijn ze erg duur, wat ze erg onpraktisch maakt als diermodel. Daarom wordt voornamelijk de rhesusmakaak (Macaca mulatta) gebruikt, omdat zijn immuunsysteem ook goed bestudeerd is en sterk lijkt op dat van de mens. Een groot nadeel is alleen dat de makaken niet met HIV-1 kunnen worden besmet, maar met SIV of SHIV (combinatie

SIV/HIV).

Hierop

worden

dan

de

vaccins

getest.

Er

is

nog

geen

overeenstemming welk model (welk soort makaak + welk SIV/SHIV) het beste is, want sommige vaccins werkten in een bepaald model, maar niet in een ander. Bijvoorbeeld het Ad5 vaccin, wat volledig faalde bij de mens, werkte in sommige makakenmodellen wel, en in andere niet, wat dus bewijst dat sommige modellen meer predictief zijn. Een vaccin dat dus 100% effectief zou zijn in apen, kan dus nog altijd ineffectief zijn bij de mens en het zal dus nodig blijven de vaccins op effectiviteit bij de mens te testen (Nath et al., 2000). De eerste jaren van onderzoek naar een vaccin waren gericht op het verkrijgen van humorale immuniteit, ook wel het verkrijgen van antilichamen tegen het virus. De antilichamen hadden echter weinig neutraliserend effect (Kallings, 2007). De studies die tot nu toe zijn gedaan, zowel studies op apen als eerste fase studies op mensen, wijzen uit dat de traditionele vaccins ineffectief zijn in het voorkomen van HIV-infectie (Nath et al., 2000). In Tabel 4 worden kort de traditionele vaccins weergegeven. Vaccin

Beperkingen

Levend verzwakt virus

Pathogeniteit

Geïnactiveerd virus met adjuvans

Beperkte specificiteit neutraliserende antistoffen. Afwezigheid van cytotoxische T-cellen. Geen neutraliserende antistoffen voor bepaalde HIV-isolaten. Afwezigheid van cytotoxische T-cellen.

Recombinant proteïne vaccin

Tabel 4: Traditionele ontwerpen voor een HIV-1 vaccin. Bewerkt uit (Letvin, 2002).

De meer recentere vaccinonderzoeken hechten meer belang aan de cellulaire immuniteit en het stimuleren van T-cellen. T-cel vaccins zijn al effectief gebleken in niet-humane primaten. Er lopen nu een aantal studies met dit soort vaccins. Bijvoorbeeld een levend recombinant vaccin, waarbij men belangrijke structuren van het HIV virus inbrengt in een vectorvirus dat onschadelijk is voor de mens. Een voorbeeld hiervan is het ALVAC-HIV, een variant van HIV die niet reproduceert, in combinatie met een kanariepokken-virus (Kallings,

16

2007). Dit vaccin wordt nu getest in een fase III studie in Thailand en de resultaten worden rond 2009/2010 verwacht. Een andere studie waarin veel hoop lag, met het Ad5-vaccin (HIV in combinatie met het verkoudheidsvirus adenovirus type 5) moest vroegtijdig worden beëindigd, omdat mensen die al eerder afweer hadden ontwikkeld tegen adenovirus type 5, een grotere kans hadden om besmet te raken met HIV (Johnston & Fauci, 2007). Wat dus duidelijk moet zijn, is dat hoewel een vaccin effectief kan zijn in een bepaald niethumaan primaatmodel, dit absoluut niet betekent dat het effectief is in de mens. Wel is het diermodel van grote waarde in het onderzoek. Ik denk dan ook dat het gebruik van niethumane primaten in het onderzoek essentieel is. Vaccins zullen altijd eerst moeten worden getest op dieren, aangezien er om ethische redenen pas getest mag worden op mensen, wanneer alle gevaar is uitgesloten. 5.

Besluit

De mens stamt af van de aap en dat wij dus ook verwante ziekten hebben is niet vreemd. Dat we weten van welke apensoort HIV-1 en HIV-2 komen, heeft al veel geholpen in het onderzoek, met name in het bepalen van het ideale diermodel. Ondanks het feit dat HIV-1 afstamt van de chimpansee, wijst de praktijk uit dat de chimpansee niet het meest voor de hand liggende model is. De rhesusmakaak heeft zich in al veel onderzoeken bewezen als het meest ideale model (Stump & VandeWoude, 2007). Natuurlijk zijn er beperkingen in het gebruik van niet-humane primaatmodellen. Geen enkel model weerspiegelt perfect de HIV-infectie van de mens. Elk model heeft zijn voor- en nadelen, maar geen enkel dierlijk model vervangt de kennis die verkregen wordt bij klinische testen bij de mens. Toch kunnen diermodellen ons heel veel leren over de verschillende aspecten van HIV en AIDS en kan het ons vooruit helpen in de ontwikkeling van medicijnen en vaccins (Van Rompay, 2005). Toen AIDS net ontdekt was in de jaren tachtig, werd er gedacht binnen een aantal jaren een vaccin op de markt te hebben. Momenteel is er echter nog steeds geen vaccin. Er zijn zelfs onderzoekers die menen dat het vaccin tegen AIDS er nooit zal komen. Toch denk ik dat we niet al te sceptisch moeten zijn, het kinkhoestvaccin was er pas na 89 jaar, het poliovaccin kostte 47 jaar onderzoek en voor mazelen duurde het 42 jaar. Maar hoe meer de wetenschap kan en weet, hoe sneller de wereld resultaten verwacht. Bovendien heeft men, mocht er op een dag een vaccin zijn, dan nog altijd het probleem dat mensen wel een vaccinatie moeten accepteren (Kallings, 2007). Nog steeds wordt AIDS in veel ontwikkelingslanden door de lokale bevolking en de kerk niet onder ogen gezien en is de ziekte taboe. Als mensen zouden beseffen dat ze risico lopen, dan zou de epidemie een stuk minder groot zijn. Acceptatie van en voorlichting over AIDS in ontwikkelingslanden is daarom een niet te vergeten component in de strijd tegen AIDS.

17

6.

Referenties

 Allan, J. S., Short, M., Taylor, M. E., Su, S., Hirsch, V. M., Johnson, P. R., Shaw, G. M. & Hahn, B. H. (1991). Species-specific diversity among simian immunodeficiency viruses from African green monkeys. Journal of virology 65, 2816-2828.  Barre-Sinoussi, F., Chermann, J. C., Rey, F., Nugeyre, M. T., Chamaret, S., Gruest, J., Dauguet, C., Axler-Blin, C., Vezinet-Brun, F., Rouzioux, C., Rozenbaum, W. & Montagnier, L. (1983). Isolation of a T-lymphotropic retrovirus from a patient at risk for acquired immune deficiency syndrome (AIDS). Science (New York, NY) 220, 868-871.  Broussard, S. R., Staprans, S. I., White, R., Whitehead, E. M., Feinberg, M. B. & Allan, J. S. (2001). Simian immunodeficiency virus replicates to high levels in naturally infected African green monkeys without inducing immunologic or neurologic disease. Journal of virology 75, 2262-2275.  Chakrabarti, L. A., Lewin, S. R., Zhang, L., Gettie, A., Luckay, A., Martin, L. N., Skulsky, E., Ho, D. D., Cheng-Mayer, C. & Marx, P. A. (2000). Normal T-cell turnover in sooty mangabeys harboring active simian immunodeficiency virus infection. Journal of virology 74, 1209-1223.  Chen, Z., Telfier, P., Gettie, A., Reed, P., Zhang, L., Ho, D. D. & Marx, P. A. (1996). Genetic characterization of new West African simian immunodeficiency virus SIVsm: geographic clustering of household-derived SIV strains with human immunodeficiency virus type 2 subtypes and genetically diverse viruses from a single feral sooty mangabey troop. Journal of virology 70, 3617-3627.  Chen, Z., Luckay, A., Sodora, D. L., Telfer, P., Reed, P., Gettie, A., Kanu, J. M., Sadek, R. F., Yee, J., Ho, D. D., Zhang, L. & Marx, P. A. (1997). Human immunodeficiency virus type 2 (HIV-2) seroprevalence and characterization of a distinct HIV-2 genetic subtype from the natural range of simian immunodeficiency virus-infected sooty mangabeys. Journal of virology 71, 3953-3960.  Corbet, S., Muller-Trutwin, M. C., Versmisse, P., Delarue, S., Ayouba, A., Lewis, J., Brunak, S., Martin, P., Brun-Vezinet, F., Simon, F., Barre-Sinoussi, F. & Mauclere, P. (2000). env sequences of simian immunodeficiency viruses from chimpanzees in Cameroon are strongly related to those of human immunodeficiency virus group N from the same geographic area. Journal of virology 74, 529534.  Desrosiers, R. C. (1990). The simian immunodeficiency viruses. Annual review of immunology 8, 557-578.  Dimmock, N. J., Easton, A. J. & Leppard, K. N. (2007). Introduction to Modern Virology: Blackwell Publishing.  Gaillard, P., Fowler, M. G., Dabis, F., Coovadia, H., Van Der Horst, C., Van Rompay, K., Ruff, A., Taha, T., Thomas, T., De Vincenzi, I. & Newell, M. L. (2004). Use of antiretroviral drugs to prevent HIV-1 transmission through breast-feeding: from animal studies to randomized clinical trials. Journal of acquired immune deficiency syndromes (1999) 35, 178-187.  Gallo, R. C., Sarin, P. S., Gelmann, E. P., Robert-Guroff, M., Richardson, E., Kalyanaraman, V. S., Mann, D., Sidhu, G. D., Stahl, R. E., Zolla-Pazner, S., Leibowitch, J. & Popovic, M. (1983). Isolation of human T-cell leukemia virus in acquired immune deficiency syndrome (AIDS). Science (New York, NY) 220, 865-867.  Gao, F., Yue, L., White, A. T., Pappas, P. G., Barchue, J., Hanson, A. P., Greene, B. M., Sharp, P. M., Shaw, G. M. & Hahn, B. H. (1992). Human infection by genetically diverse SIVSM-related HIV-2 in west Africa. Nature 358, 495-499.  Gao, F., Yue, L., Robertson, D. L., Hill, S. C., Hui, H., Biggar, R. J., Neequaye, A. E., Whelan, T. M., Ho, D. D., Shaw, G. M. & et al. (1994). Genetic diversity of human immunodeficiency virus type 2: evidence for distinct sequence subtypes with differences in virus biology. Journal of virology 68, 7433-7447.  Gao, F., Bailes, E., Robertson, D. L., Chen, Y., Rodenburg, C. M., Michael, S. F., Cummins, L. B., Arthur, L. O., Peeters, M., Shaw, G. M., Sharp, P. M. & Hahn, B. H. (1999). Origin of HIV-1 in the chimpanzee Pan troglodytes troglodytes. Nature 397, 436-441.  Gardner, M. B. (1996). The history of simian AIDS. Journal of medical primatology 25, 148-157.  Gardner, M. B. (2003). Simian AIDS: an historical perspective. Journal of medical primatology 32, 180-186.  Geretti, A. M. (1999). Simian immunodeficiency virus as a model of human HIV disease. Reviews in medical virology 9, 57-67.

18

 Hahn, B. H., Shaw, G. M., De Cock, K. M. & Sharp, P. M. (2000). AIDS as a zoonosis: scientific and public health implications. Science (New York, NY) 287, 607-614.  Haigwood, N. L. (2004). Predictive value of primate models for AIDS. AIDS reviews 6, 187-198.  Hirsch, V. M., Olmsted, R. A., Murphey-Corb, M., Purcell, R. H. & Johnson, P. R. (1989). An African primate lentivirus (SIVsm) closely related to HIV-2. Nature 339, 389-392.  Holmes, K. K., Sparling, P. F., Mardh, P., Lemon, S. M., Stamm, W. E., Piot, P. & Wasserheit, J. N. (1999). Sexually Tansmitted Diseases: McGraw-Hill.  Holmes, E. C. (2001). On the origin and evolution of the human immunodeficiency virus (HIV). Biological reviews of the Cambridge Philosophical Society 76, 239-254.  Holzammer, S., Holznagel, E., Kaul, A., Kurth, R. & Norley, S. (2001). High virus loads in naturally and experimentally SIVagm-infected African green monkeys. Virology 283, 324-331.  Huet, T., Cheynier, R., Meyerhans, A., Roelants, G. & Wain-Hobson, S. (1990). Genetic organization of a chimpanzee lentivirus related to HIV-1. Nature 345, 356-359.  Johnston, M. I. & Fauci, A. S. (2007). An HIV vaccine--evolving concepts. The New England journal of medicine 356, 2073-2081.  Kallings, L. O. (2007). The first postmodern pandemic:25 years of HIV/AIDS. J Intern Med 263, 218-243.  Kandathil, A. J., Ramalingam, S., Kannangai, R., David, S. & Sridharan, G. (2005). Molecular epidemiology of HIV. The Indian journal of medical research 121, 333-344.  Lemey, P., Pybus, O. G., Rambaut, A., Drummond, A. J., Robertson, D. L., Roques, P., Worobey, M. & Vandamme, A. M. (2004). The molecular population genetics of HIV-1 group O. Genetics 167, 1059-1068.  Letvin, N. L. (2002). Strategies for an HIV vaccine. The Journal of clinical investigation 110, 15-20.  Lewis, A. D. & Johnson, P. R. (1995). Developing animal models for AIDS research--progress and problems. Trends in biotechnology 13, 142-150.  Lowenstine, L. J., Pedersen, N. C., Higgins, J., Pallis, K. C., Uyeda, A., Marx, P., Lerche, N. W., Munn, R. J. & Gardner, M. B. (1986). Seroepidemiologic survey of captive Old-World primates for antibodies to human and simian retroviruses, and isolation of a lentivirus from sooty mangabeys (Cercocebus atys). International journal of cancer 38, 563-574.  Malashkevich, V. N., Chan, D. C., Chutkowski, C. T. & Kim, P. S. (1998). Crystal structure of the simian immunodeficiency virus (SIV) gp41 core: conserved helical interactions underlie the broad inhibitory activity of gp41 peptides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 95, 9134-9139.  Marx, P. A., Apetrei, C. & Drucker, E. (2004). AIDS as a zoonosis? Confusion over the origin of the virus and the origin of the epidemics. Journal of medical primatology 33, 220-226.  Murray, P. R., Rosenthal, K. S. & Pfaller, M. A. (2005). Medical Microbiology Fitht Edition: Elsevier Mosby.  Nath, B. M., Schumann, K. E. & Boyer, J. D. (2000). The chimpanzee and other non-humanprimate models in HIV-1 vaccine research. Trends in microbiology 8, 426-431.  Nerrienet, E., Santiago, M. L., Foupouapouognigni, Y., Bailes, E., Mundy, N. I., Njinku, B., Kfutwah, A., Muller-Trutwin, M. C., Barre-Sinoussi, F., Shaw, G. M., Sharp, P. M., Hahn, B. H. & Ayouba, A. (2005). Simian immunodeficiency virus infection in wild-caught chimpanzees from cameroon. Journal of virology 79, 1312-1319.  Novembre, F. J., Saucier, M., Anderson, D. C., Klumpp, S. A., O'Neil, S. P., Brown, C. R., 2nd, Hart, C. E., Guenthner, P. C., Swenson, R. B. & McClure, H. M. (1997). Development of AIDS in a chimpanzee infected with human immunodeficiency virus type 1. Journal of virology 71, 4086-4091.  Pandrea, I., Onanga, R., Kornfeld, C., Rouquet, P., Bourry, O., Clifford, S., Telfer, P. T., Abernethy, K., White, L. T., Ngari, P., Muller-Trutwin, M., Roques, P., Marx, P. A., Simon, F. & Apetrei, C. (2003). High levels of SIVmnd-1 replication in chronically infected Mandrillus sphinx. Virology 317, 119-127.  Peeters, M., Honore, C., Huet, T., Bedjabaga, L., Ossari, S., Bussi, P., Cooper, R. W. & Delaporte, E. (1989). Isolation and partial characterization of an HIV-related virus occurring naturally in chimpanzees in Gabon. AIDS (London, England) 3, 625-630.  Peeters, M., Fransen, K., Delaporte, E., Van den Haesevelde, M., Gershy-Damet, G. M., Kestens, L., van der Groen, G. & Piot, P. (1992). Isolation and characterization of a new

19

 

  

 

 

 



     

 

chimpanzee lentivirus (simian immunodeficiency virus isolate cpz-ant) from a wild-captured chimpanzee. AIDS (London, England) 6, 447-451. Peeters, M. (2001). The genetic variability of HIV-1 and its implications. Transfus Clin Biol 8, 222225. Peeters, M., Courgnaud, V., Abela, B., Auzel, P., Pourrut, X., Bibollet-Ruche, F., Loul, S., Liegeois, F., Butel, C., Koulagna, D., Mpoudi-Ngole, E., Shaw, G. M., Hahn, B. H. & Delaporte, E. (2002). Risk to human health from a plethora of simian immunodeficiency viruses in primate bushmeat. Emerging infectious diseases 8, 451-457. Reeves, J. D. & Doms, R. W. (2002). Human immunodeficiency virus type 2. The Journal of general virology 83, 1253-1265. Requejo, H. I. (2006). Worldwide molecular epidemiology of HIV. Revista de saude publica 40, 331345. Rey-Cuille, M. A., Berthier, J. L., Bomsel-Demontoy, M. C., Chaduc, Y., Montagnier, L., Hovanessian, A. G. & Chakrabarti, L. A. (1998). Simian immunodeficiency virus replicates to high levels in sooty mangabeys without inducing disease. Journal of virology 72, 3872-3886. Robertson, D. L., Anderson, J. P., Bradac, J. A., Carr, J. K., Foley, B. & Funkhouser, R. K. (2000). HIV-1 nomenclature proposal. Science (New York, NY) 288, 55-56. Santiago, M. L., Rodenburg, C. M., Kamenya, S., Bibollet-Ruche, F., Gao, F., Bailes, E., Meleth, S., Soong, S. J., Kilby, J. M., Moldoveanu, Z., Fahey, B., Muller, M. N., Ayouba, A., Nerrienet, E., McClure, H. M., Heeney, J. L., Pusey, A. E., Collins, D. A., Boesch, C., Wrangham, R. W., Goodall, J., Sharp, P. M., Shaw, G. M. & Hahn, B. H. (2002). SIVcpz in wild chimpanzees. Science (New York, NY) 295, 465. Sharp, P. M., Shaw, G. M. & Hahn, B. H. (2005). Simian immunodeficiency virus infection of chimpanzees. Journal of virology 79, 3891-3902. Silvestri, G., Sodora, D. L., Koup, R. A., Paiardini, M., O'Neil, S. P., McClure, H. M., Staprans, S. I. & Feinberg, M. B. (2003). Nonpathogenic SIV infection of sooty mangabeys is characterized by limited bystander immunopathology despite chronic high-level viremia. Immunity 18, 441-452. Silvestri, G. (2005). Naturally SIV-infected sooty mangabeys: are we closer to understanding why they do not develop AIDS? Journal of medical primatology 34, 243-252. Silvestri, G., Paiardini, M., Pandrea, I., Lederman, M. M. & Sodora, D. L. (2007). Understanding the benign nature of SIV infection in natural hosts. The Journal of clinical investigation 117, 31483154. Simon, F., Mauclere, P., Roques, P., Loussert-Ajaka, I., Muller-Trutwin, M. C., Saragosti, S., Georges-Courbot, M. C., Barre-Sinoussi, F. & Brun-Vezinet, F. (1998). Identification of a new human immunodeficiency virus type 1 distinct from group M and group O. Nature medicine 4, 10321037. Staprans, S. I. & Feinberg, M. B. (2004). The roles of nonhuman primates in the preclinical evaluation of candidate AIDS vaccines. Expert review of vaccines 3, S5-32. Stump, D. S. & VandeWoude, S. (2007). Animal models for HIV AIDS: a comparative review. Comparative medicine 57, 33-43. UNAIDS 2007. AIDS epidemic update. http://data.unaids.org/pub/EPISlides/2007/2007_epiupdate_en.pdf Van Heuverswyn, F. & Peeters, M. (2007). The Origins of HIV and Implications for the Global Epidemic. Curr Infect Dis Rep 9, 338-346. Van Rompay, K. K. (2005). Antiretroviral drug studies in nonhuman primates: a valid animal model for innovative drug efficacy and pathogenesis experiments. AIDS reviews 7, 67-83. Vanden Haesevelde, M. M., Peeters, M., Jannes, G., Janssens, W., van der Groen, G., Sharp, P. M. & Saman, E. (1996). Sequence analysis of a highly divergent HIV-1-related lentivirus isolated from a wild captured chimpanzee. Virology 221, 346-350. Wodarz, D. & Levy, D. N. (2007). Human Immunodeficiency Virus evolution towards induced replicative fitness in vivo and the development of AIDS. Proc R Soc B 274, 2481-2490. Worobey, M., Santiago, M. L., Keele, B. F., Ndjango, J. B., Joy, J. B., Labama, B. L., Dhed, A. B., Rambaut, A., Sharp, P. M., Shaw, G. M. & Hahn, B. H. (2004). Origin of AIDS: contaminated polio vaccine theory refuted. Nature 428, 820.

20

UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar 2008-2009

Het Capriene Arthritis Encephalitis Virus: Een overzicht

door

Minneke VAN DUIJN

Promotor: Prof. H. Nauwynck

Studieproject in het kader van de Masterproef

De auteur geeft de toelating deze studie voor consultatie beschikbaar te stellen voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting de bron uitdrukkelijk te vermelden bij het aanhalen van deze studie. Het auteursrecht betreffende de gegevens vermeld in deze literatuurstudie berust bij de promotor(en). Het oorspronkelijke auteursrecht van de individueel geciteerde studies en eventueel bijhorende documentatie, zoals tabellen en figuren, blijft daarbij gevrijwaard. De auteur en de promotor(en) zijn niet verantwoordelijk voor de behandelingen en eventuele doseringen die in deze studie geciteerd en beschreven zijn.

Inhoudsopgave Samenvatting

1

1.

Inleiding

2

2.

Etiologie en viruseigenschappen

2

3.

Epidemiologie

3

4.

Pathogenese

4

5.

Kliniek

5

6.

Pathologische letsels

7

7.

Immuunreactie

7

8.

Diagnose

8

8.1. Virusisolatie

8

8.2. Serologie

10

8.3. Detectie virale nucleïnezuur

11

9.

Behandeling

11

10.

Controle en bestrijding

11

11.

Besluit

12

12.

Referenties

13

Samenvatting Het Capriene Arthritis Encephalitis virus (CAE) behoort tot de familie van de Retroviridae en daarbinnen

tot

het

genus

Lentivirinae.

CAE

veroorzaakt

verschillende

progressieve

ziektecomplexen in geiten. In landen met een intensieve geitenhouderij ziet men hoge prevalenties van CAE. Het zijn voornamelijk de melkrassen die zijn aangetast, mogelijk is hiervoor een erfelijke predispositie. De belangrijkste manier van overdracht is moeder naar lam via de colostrum en de melk. Horizontale transmissie komt voor en ook een subklinisch besmette geit kan het virus verspreiden. CAE veroorzaakt een persisterende infectie van de stamcellen van de monocyten, maar er worden pas actieve viruspartikels gevormd wanneer de monocyt rijpt tot macrofaag. Er zijn vijf verschillende klinische ziektebeelden van CAE gekend; arthritis bij volwassen geiten en leuco-encephalomyelitis bij lammeren zijn de meest voorkomende vormen. Voor diagnose zijn er een aantal methoden beschikbaar. Voor serologie zijn de agar gel immunodiffusie test en de antistoffen ELISA de meest gebruikte testen. meestal gedaan

met behulp

van

perifere

bloed

mononucleaire

Virusisolatie wordt

cellen

(PBMCs)

op

synoviaalmembraan cellen van de geit (GSM-celculturen) of op Foetale Lam Long (FLL)celculturen. Men kan het virale nucleïnezuur detecteren met behulp van PCR. Er is geen afdoende behandeling voor besmette geiten. Er is geen gecommercialiseerd vaccin beschikbaar. De meest gebruikte methode voor controle is het CAE-vrij opfokken van de lammeren door ze meteen na de geboorte te scheiden van de moeder, zodat ze geen besmet colostrum kunnen opnemen.

1.

Inleiding

Het Capriene Arthritis Encephalitis virus (CAE) veroorzaakt verschillende progressieve ziektecomplexen in geiten. CAE behoort tot de familie van de Retroviridae en daarbinnen tot het genus Lentivirinae. De Retroviridae hebben de unieke eigenschap dat ze RNA omzetten tot DNA en dit DNA inbouwen in het gastheer DNA. De lentivirussen komen voor bij verschillende diersoorten en de mens en worden gekenmerkt door een lange incubatieperiode, gevolgd door een chronische ziekte (fig.1). CAE blijkt toch nog regelmatig voor te komen op geitenbedrijven, met name bij melkgeiten. De volwassen geiten ontwikkelen meestal een chronische arthritis, voornamelijk van het carpusgewricht. Lammeren besmet met CAE krijgen daarentegen leuco-encephalomyelitis. Er is veel onderzoek gedaan naar CAE, zowel in het kader van de verbetering van de geitensector, als in het HIV-onderzoek, waar men nog steeds zoekt naar het meest geschikte diermodel. In deze scriptie is helaas geen plaats voor deze laatste problematiek, omdat dat een onderwerp op zich is. In deze literatuurstudie ga ik mij verdiepen in de verschillende aspecten van CAE met nadruk op de diagnose. Volgend jaar, het laatste deel van mijn Masterproef, ga ik kijken naar de interactie van het CAE virus met monocyten. Ik ga dan een aantal laboratoriumtechnieken aanleren. We gaan onder andere trachten om CAE te isoleren uit besmette geiten. Ik ben echter van mening dat het belangrijk is om zoveel informatie over het virus te vergaren, voordat men in het labo onderzoeken gaat doen. Hiervoor dient dan ook deze literatuurstudie. 2.

Etiologie en viruseigenschappen

CAE is een retrovirus. De retrovirussen bezitten de enzymen reverse transcriptase, integrase en protease. Reverse transcriptase zorgt ervoor dat er DNA kopieën gemaakt kunnen worden van RNA moleculen. Integrase zorgt ervoor dat het retrovirale DNA (pro-virus genoemd) wordt ingebouwd in het gastheer DNA. Op deze manier kan het virus vermenigvuldigen als onderdeel van het cellulair DNA (Murray et al., 2005). CAE is antigenisch het meest verwant met het Visna-Maedi Virus (MVV) van het schaap. Natuurlijke overdracht van CAE en MVV komt niet voor. Experimenteel kunnen wel kruisbesmettingen geïnduceerd worden tussen schaap en geit (Mary C. Smith, 2007). De lentivirussen van het schaap en de geit veroorzaken, in tegenstelling tot HIV, geen immunosuppressie. Dit komt doordat ze niet in staat zijn om de CD4+ lymfocyten te infecteren, iets wat HIV wel doet. CAE en MVV hebben tropisme voor de monocyt/macrofaag cellijn. Vergeleken met HIV veroorzaken de beide virussen ook veel lagere virustiters in het bloed (Peterhans et al., 1999).

2

Figuur 1: Evolutionaire relatie tussen de verschillende lentivirussen. Uit (Lewis & Johnson, 1995) FIV: feliene immunodeficiëntie virus (kat) ; MVV : Visna-Maedi virus (schaap); CAEV: capriene arthritis-encephalitis virus (geit); SIVmac: simian immunodeficiëntie virus (rhesusmakaak);

SIVsmm:

immunodeficiëntie

virus

simian

(roetmangabey);

HIV-2:

humaan immunodeficiëntie virus

type

2

(mens);

SIVcpz:

simian

immunodeficiëntie virus (chimpansee); HIV1: humaan immunodeficiëntie virus type 1 (mens); SIVagm: simian immunodeficiëntie virus

(groene

infectieuze

meerkat);

anemie

virus

EIAV:

equine

(paard);

BIV:

boviene immunodeficiëntie virus (rund).

Het CAE virus is een non-oncogeen retrovirus (Clements et al., 1980). Een glycoproteïne met een moleculair gewicht van 140 000 dalton (gp140) is gelokaliseerd in de virale envelop. Dit is het antigeen dat verantwoordelijk is voor het opwekken van neutraliserende antilichamen. Het p28 proteïne zit in de kern van het virion en heeft veel antigene sites en deze zijn gelijk aan die van MVV. De vermeerderingscyclus van het virus in cultuur bedraagt 15 tot 20 uur. De meeste mature virions komen vrij door budding via de celmembraan, maar een aantal ook door endocytose uit het endoplasmatisch reticulum in intracytoplasmatische vesikels. Spreiden van het virus in cultuur gebeurt door celfusie. Hierdoor worden grote syncytia gevormd, wat het meest voorkomende cytopathische effect is van het virus (Narayan et al., 1980). 3.

Epidemiologie

De neurologische vorm van CAE werd voor het eerst beschreven in de Verenigde Staten in 1974 (Cork et al., 1974). De retrovirus etiologie van capriene arthritis encephalitis werd voor het eerst beschreven in 1980, waarna de naam (virale leukoencephalomyelitis) werd vervangen door de huidige (Crawford et al., 1980). De hoogste prevalentie ziet men in landen met een intensieve geitenhouderij, met name in Canada, Frankrijk, Noorwegen, Zwitserland en de Verenigde Staten. In deze landen stijgt de prevalentie tot boven de 65 %. Het zijn voornamelijk de melkrassen die zijn aangetast, maar de reden hiervoor is tot nog toe onduidelijk (Burgu et al., 1994; Mary C. Smith, 2007). Er is mogelijk een erfelijke predispositie bij bepaalde rassen en familielijnen (Ruff & Lazary, 1988). De prevalentie varieert niet tussen beide geslachten, maar stijgt wel bij toenemende leeftijd. Ook managementfactoren blijken een rol te spelen. 3

De belangrijkste manier van overdracht is van moeder op jong via colostrum of melk. Het virus kan zowel vrij als celgeassociëerd voorkomen in de melk. Ook een subklinisch besmette moeder kan virus uitscheiden (Mary C. Smith, 2007). Vooral rond de partus kan het virus reactiveren (Morin T., 2003). Horizontale overdracht kan plaatsvinden en speelt een belangrijke rol in de verspreiding van CAE. Het samenbrengen van geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde geiten leidde maar zeldzaam tot seroconversie, en dat na 12 maanden. Als men daarentegen de geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde dieren samen melkte, leidde dit vaker tot seroconversie en dat binnen 10 maanden. Mogelijke overdrachtsmechanismen zijn speeksel en andere excreties. In utero transmissie en overdracht bij de partus zijn niet waarschijnlijk. Ook is er geen bewijs van seksuele transmissie (Mary C. Smith, 2007). 4.

Pathogenese

CAE heeft bepaalde eigenschappen waardoor het virus in staat is een persisterende infectie te veroorzaken. De inbouw van het provirus-DNA gebeurt in het DNA van de stamcellen van de monocyten. Hierdoor worden er steeds nieuwe geïnfecteerde monocyten gevormd. Toch is het virus in de monocyten nog niet productief en is er dus beperkte replicatie (Horzinek, 1990). Pas wanneer de monocyten rijpen tot macrofagen worden er infectieuze partikels gevormd (Narayan et al., 1983). In de macrofagen die worden gevonden in de organen met de laesies, vindt ook de sterkste vermeerdering plaats (Horzinek, 1990). Deze beperking in replicatie is een mechanisme dat ervoor zorgt dat het lange tijd duurt tot het virus gedetecteerd wordt door andere cellen van het immuunsysteem. Dat de immuuncellen zelf de gastheercellen zijn voor het virus verklaart ook waarom de gastheer niet in staat is de infectie te controleren (Zink et al., 1990). Wanneer lammeren colostrum of melk met geïnfecteerde macrofagen en vrij virus opnemen,

worden

reticuloendotheliale

deze

opgenomen

systeem.

ter

Vervolgens

hoogte gaan

van

de

de

darm

geïnfecteerde

en

dringen

monocyten

in

het

naar

de

doelweefsels zoals het synoviaalvlies, het longinterstitium en de plexus choroïdeus, om daar virus te gaan produceren als de monocyten rijpen tot macrofagen. Uiteindelijk induceert CAE een sterke humorale en celgemediëerde immuunrespons, maar beide zijn niet beschermend. Eigenlijk is capriene arthritis encephalitis een immunopathologische ziekte, waarbij de laesies het resultaat zijn van de immuunreactie tegen de oppervlakte glycoproteïnen (Mary C. Smith, 2007). Deze stelling wordt ondersteund door een aantal onderzoeken,

waarbij

gevaccineerde

geiten

ergere

letsels

ontwikkelden

wanneer

zij

experimenteel besmet werden. Ook blijkt uit deze onderzoeken dat de mate van aantasting van de gewrichten in relatie staat tot de aanwezigheid van virus en antilichamen in het gewricht. Bovendien worden de laesies gedomineerd door lymfocyten en macrofagen (McGuire et al., 1986).

4

5.

Kliniek

CAE kan subklinisch voorkomen. Soms is een hoog aantal geiten geïnfecteerd zonder dat deze symptomen vertonen. Er zijn vijf verschillende klinische vormen van CAE bekend. 1. De meest voorkomende vorm is arthritis bij volwassen geiten. Deze vorm kan optreden in het eerste levensjaar, is het meest voorkomend op een leeftijd van twee jaar, maar kan ook oudere geiten aantasten. Het begin van de infectie kan onopgemerkt blijven, maar kan ook acuut optreden. Het klinisch verloop is variabel, het kan een acuut verloop kennen, maar vaker verloopt het chronisch en progressief over een periode van maanden tot jaren. Gewrichten, bursae en pezen kunnen letsels vertonen, maar het meest opvallend is de verdikking van de carpaalgewrichten (fig. 2). Daarnaast kunnen ook de tarsus, knie, kogelgewrichten, de atlanto-occipitale bursa en finaal het coxofemoraal gewricht aangetast worden. Eén of meerdere gewrichten kunnen tijdens het ziekteproces aangetast worden. De eerste tekenen van arthritis kunnen subtiel zijn. De geiten zijn stijf, kunnen moeilijk opstaan en verliezen gewicht. De eventuele gezwollen gewrichten kunnen pijnloos zijn. Wel blijven de dieren vaak alert. De geiten kunnen deze conditie maanden tot jaren volhouden, of er kunnen intermitterende periodes van arthritis zijn. In de beginnende fase is er een toename van het synoviaalvocht dat de zwellingen van de gewrichten veroorzaakt. Het synoviaalvocht is minder viskeus dan normaal, er is vaak bijmenging van bloed en het bevat veel cellen. Deze cellen zijn voornamelijk lymfocyten, plasmacellen en macrofagen. Vaak bevat het ook fibrine, fragmenten van het synoviaalmembraan en gemineraliseerde celdebris. De eerste laesies zijn voornamelijk gekenmerkt door proliferatie van het synoviale membraan, waarbij er villi ontstaan tot in het lumen van het gewricht. Hierdoor ontstaat er een inflammatoire reactie.

Figuur 2: Geit met arthritis ten gevolge van CAE-besmetting met de typische gezwollen carpaalgewrichten. Uit (Horzinek, 1990).

Bij de meeste geiten verloopt de arthritis progressief. De geiten krijgen steeds meer pijn en verliezen gewicht en krijgen een ruwe vacht. Ze vertonen geen koorts. De gewrichten 5

raken ontstoken en mineralisatie van het gewrichtskapsel kan voorkomen. Vaak gaan de geiten kreupelheden vertonen. Als het de carpus betreft gaat het dier op den duur de carpus in een gebogen positie houden, en als beide poten aangetast zijn, zal het dier in een knielende houding zitten. In dit latere stadium ontstaat er necrose van de gewrichtskapsels, pezen, peesscheden, ligamenten en bursae. (Horzinek, 1990; Mary C. Smith, 2007). 2. De induratieve virale mastitis vorm, ook wel ‘vleesuier’ genoemd. De aangetaste uier is gezwollen en hard en vertoont agalactie. De huid van de uier is zacht, niet warm, niet erythemateus en vertoont geen oedeem. De melk die eventueel geproduceerd wordt heeft geen afwijkende kwaliteit. De geiten vertonen geen andere systemische ziektesymptomen (Smith & Cutlip, 1988). 3. De neurologische vorm (leuco-encephalomyelitis) komt het meest voor bij lammeren van twee tot zes maanden, maar kan bij alle leeftijden voorkomen. De ziekte verloopt traag over een periode van weken en uit zich als eerst door progressieve parese en ataxie van de achterpoten, en kan zowel uni- als bilateraal zijn. In het beginstadium zijn de dieren nog alert en blijven ze eten, ondanks de neurologische symptomen. Wanneer de symptomen eenmaal zijn opgetreden verslechteren de lammeren snel, met paralyse binnen

twee

tot

vier

weken.

Geiten

kunnen

herstellen,

maar

kunnen

verlammingsverschijnselen blijven vertonen. Geïnfecteerde lammeren die geen leucoencephalomyelitis vertonen kunnen op latere leeftijd wel arthritis krijgen (Horzinek, 1990; Mary C. Smith, 2007) 4. Chronisch progressieve interstitiële pneumonie bij volwassen geiten. Het eerste symptoom is dyspnee, vaak voorafgegaan door een periode van lichamelijke stress zoals een partus of mastitis. Inspanning resulteert in dyspnee, en er kan hoest optreden. Ook wordt er productieverlies opgemerkt. Sommige geiten, maar lang niet allemaal, hebben gezwollen carpaalgewrichten. Secundaire bacteriële pneumonieën kunnen optreden, maar hierbij kunnen antibiotica tijdelijk een verlichting van de symptomen geven. 5. Progressief gewichtsverlies bij volwassen geiten. Deze vorm treedt het meest op bij een leeftijd tussen 1 en 2 jaar, met een grote variabiliteit in de progressie en ernstigheid. Gewichtsverlies is vaak het eerste symptoom dat vooraf gaat aan de arthritis-vorm, en treedt ook vaak op bij de pneumonie-vorm. Het kan als losstaand fenomeen voorkomen, zonder de gewrichts- of longaandoeningen. Omdat CAE een chronische infectie is kan het gewichtsverlies een effect zijn van endogene cytokine release, en is het mogelijk dat het niet komt door verminderde voederopname (Mary C. Smith, 2007).

6

6.

Pathologische letsels

Detectie van serum antistoffen tegen CAE bevestigt infectie, maar bewijst niet dat de klinische verschijnselen resultaat zijn van CAE. CAE komt namelijk frequent subklinisch voor en er zijn tal van andere oorzaken voor arthritis bij geiten (Mary C. Smith, 2007). Zink et al. (1990) onderzochten pathologische stalen van 18 geiten met klassieke CAE letsels. De stalen werden histologisch en door middel van in situ hybridisatie (gebruikmakend van moleculair gekloond CAE DNA) vergeleken om vast te stellen welke weefsels en cellen van natuurlijk geïnfecteerde geiten werden gebruikt voor virusreplicatie. Bij lammeren met de neurologische vorm van CAE werden in de hersenen en het ruggenmerg multifocale letsels van necrose en malacie gevonden, met er omheen geïnfiltreerde macrofagen en lymfocyten. Het was niet mogelijk een associatie te maken tussen de locatie van de letsels, de graad van de neurologische letsels en de klinische bevindingen. Er waren een aantal lammeren die ook letsels vertoonden van chronische progressieve interstitiële pneumonie. Onder de volwassen geiten was arthritis het meest voorkomende letsel, maar er bleken ook een aantal volwassen jonge geiten te zijn met de pneumonie en de encephalitis vorm. De weefsels die de klassieke letsels van CAE vertoonden, waren ook vaak positief bij in situ hybridisatie. In sommige gevallen waren er minder viraal-RNA positieve cellen dan men verwacht had op basis van de ergheid van de histologische letsels. In het centraal zenuwstelsel kwamen de viraal-RNA positieve cellen vooral voor in gebieden met inflammatie, focale gliosis en aan het endotheel en lumen van bloedvaten. In de long werden de meeste geïnfecteerde cellen gevonden in het ontstoken peribronchiale weefsel en lijnden ze de interalveolaire septa af, een plaats die normaal bezet is door alveolaire macrofagen. In de melkklier werd viraal RNA gevonden in cellen die de lymfoïde follikels omringden. Ook werden veel positieve cellen gevonden in myelopoëtische haarden in het beenmerg. Virale transcripten werden dus het meest gevonden in ontstoken weefsel. Chemotactische factoren geproduceerd in dit weefsel trekken macrofagen aan, welke virus kunnen bevatten. Dit resulteert in het verhogen van de hoeveelheid virus in ontstoken gebieden. Ook in nietinflammatoire gebieden werd viraal RNA gevonden, onder andere in Kupfercellen, alveolaire macrofagen, epitheelcellen van de darm en nieren en in de schildklier. Uit dit onderzoek bleek dus dat het virus niet alleen in macrofagen wordt teruggevonden, maar ook andere cellen, wel minder in aantal, kunnen het virus bevatten. 7.

Immuunreactie

Zowel de humorale als de cellulaire immuunrespons spelen een belangrijke rol in de infectie, maar beide hebben geen voordeel voor de gastheer. Er worden antistoffen gevonden enkele weken, tot maanden na de infectie. Er is weinig geweten over de IgM antilichaam respons. Grote hoeveelheden van IgG virusspecifieke antistoffen zijn wel gevonden, voornamelijk deze in de IgG1 klasse. De affiniteit van deze antistoffen voor gp140 en hun neutraliserend effect is nog niet 7

onderzocht, maar de antistoffen binden wel stevig aan het p28 polypeptide. Dit kan aangetoond worden met een groot aantal testen, onder andere de AGID, IF en ELISA. Antistoffen vindt men in het serum, maar ook in het synoviaalvocht van aangetaste gewrichten en in het cerebrospinaal vocht. De cellulaire respons bestaat voornamelijk uit lokale infiltratie van lymfocyten. Er zijn aanwijzingen dat de cellulaire immuunrespons aan de basis ligt van de letsels. Deze zijn dus van immunopathologische aard en niet veroorzaakt door het virus zelf (Mary C. Smith, 2007); (Horzinek, 1990). 8.

Diagnose

Om een diagnose van CAE te stellen kan men gebruik maken van verschillende methoden. In de praktijk wordt meestal gekozen voor serologie met een antistoffen ELISA, omdat dit de meest snelle en de goedkoopste methode is. Men kan ook virus isoleren en het virale nucleïnezuur detecteren door middel van PCR. Hieronder volgt een uitleg over de verschillende methoden van diagnose. Er is voor CAE geen ‘gouden standaard’ voor handen, en resultaten worden daarom best vergeleken met een andere test. 8.1.

Virusisolatie Er zijn verschillende methoden beschreven voor de isloatie van CAE. Als staal worden meestal PBMCs ((Perifere Bloed Mononucleaire Cellen) genomen, maar ook synoviaalvocht, de synoviale membraan, choroïd plexus en de milt zijn al eens gebruikt. Men maakt gebruik van twee soorten celculturen: synoviaalmemebraan cellen van de geit (GSM) en foetale lam long celculturen (FLL). Deze beide methoden zijn onderzocht: GSM-celculturen: De PBMCs werden gescheiden door middel van Ficoll-sodium diatrizoaat (1,077 x g) centrifugatie. De PBMCs werden daarna op Mycoplasma-vrije geit synoviaal membraan culturen geënt. Deze culturen waren voorbereid met Dulbecco-modified Eagle’s medium (DMEM), wat 10% foetaal runderserum, penicilline (100 U/ml), streptomycine (100 mg/mL) en 2 µM L-glutamine bevat. De monolayers werden tweemaal per week gecheckt op cytopathisch effect en er werd elke twee weken een passage gemaakt

(tot zes maanden lang) totdat de

karakteristieke reuzencellen (syncytia) verschenen (fig. 3) (Daltabuit Test et al., 1999).

8

Figuur 3: Capriene synoviaal membraancellen, gecocultiveerd met PBMCs van een seropositieve geit. Let op de syncitiumvorming (250x). Uit (Daltabuit Test et al., 1999).

Figuur 4: Syncitiavorming in een FLL cultuur geïnoculeerd met synoviaalvocht van een geit met arthritis. Na drie passages en gekleurd met Giemsa. Uit (Konishi et al., 2004).

FLL-celculturen: De cellen werden ingebed in een medium bestaande uit 10% foetaal kalfsserum en 90% Eagle’s minimum essential medium (EMEM). De PBMCs 6

werden op een concentratie van 1 x 10 /ml gebracht en 2 ml hiervan werd in een petrischaal met FLL cellen gebracht. Gewrichtsvocht en synoviaalcellen werden direct zonder voorbereiding op de cellen aangebracht. Omdat de FLL cellen geen CPE vertoonden wanneer ze geïnoculeerd werden met virus, werden ze

9

gecocultiveerd met geïnfecteerde cellen. Met virus geïnfecteerde FLL cellen die CPE begonnen te vertonen werden behandeld met trypsine en gemengd met 4 a 5 maal zoveel normale FLL cellen. Gecocultiveerde cellen werden geïncubeerd voor 4 of 5 dagen en het medium werd eraf gegoten als er CPE werd geobserveerd in meer dan 80% van de cellen (fig.4) (Konishi et al., 2004). 8.2.

Serologie Na infectie produceren de dieren antivirale antistoffen, maar seroconversie kan weken tot een aantal maanden duren. Voornamelijk de monocyten en macrofagen zijn geïnfecteerd, met het beenmerg als reservoir van infectie. CAE kan klinisch gediagnosticeerd worden, maar lang niet alle geïnfecteerde dieren ontwikkelen klinische symptomen. Best is om serologie intermitterend uit te voeren. Er zijn een aantal testen voor handen, maar de relatieve sensitiviteit (maat voor aantal vals negatieven) en specificiteit (maat voor aantal vals positieven) van deze testen zijn niet systematisch vergeleken (Knowles, 1997). Vals positieve resultaten komen theoretisch niet voor, behalve bij neonaten die virusvrije colostrum hebben opgenomen met maternale antistoffen tegen CAE. Deze lammeren moeten na 12 weken nogmaals getest worden. Vals negatieven komen daarentegen wel voor, vooral bij de AGID test (Mary C. Smith, 2007). De voornaamste testen zijn de agar gel immunodiffusie test (AGID) en de enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). De radio-immunoprecipitatie-test (RIPA), de radio-immunoassar (RIA) en western blotting (WB) kunnen ook gebruikt worden, vaak als bevestiging of aanvulling op de twee eerst genoemde (Knowles, 1997)

1. Agar gel immunodiffusie test De AGID test gebruikt volledig virus dat men heeft geconcentreerd uit cultuur supernatans en toont men antilichamen aan tegen het p28 antigen van CAE. Uit vergelijkende studies blijkt dat de AGID test een lage sensitiviteit heeft vergeleken met RIPA, ELISA en WB (de Andres et al., 2005). De AGID was vroeger de meest gebruikte test voor CAE, maar inmiddels is ELISA meer aangewezen (Knowles, 1997). 2. ELISA Er zijn meer dan 30 publicaties verschenen over het detecteren van lentivirussen van kleine herkauwers. Deze assays gebruiken ofwel volledig virus, ofwel recombinante proteïnen als antigenen (Saman et al., 1999). Ook worden competitieve ELISA gebruikt op basis van antivirale monoklonale antistoffen. Verschillende experimenten hebben uitgewezen dat ELISAs waarbij volledig virus wordt gebruikt meer sensitief zijn dan single recombinante ELISAs. Er zijn ook commerciële ELISAs beschikbaar, hiervan is echter de sensitiviteit en specificiteit niet gekend (de Andres et al., 2005). 10

8.3.

Detectie virale nucleïnezuur Omdat seroconversie soms pas laat na de besmetting optreedt (Rimstad et al., 1993), werd er gezocht naar een methode om CAE ook in het vroege stadium te diagnosticeren. Een groot aantal onderzoeken heeft inmiddels aangetoond dat de Polymerase Chain Reaction (PCR) een efficiënte methode is om CAE aan te tonen (Knowles, 1997). In deze test kan men gebruik maken van bloed (PBMCs), maar ook van melk en synoviaalvocht (Reddy et al., 1993). Er zijn diverse sets van oligonucleotiden ontwikkeld die CAE detecteren. De gebruikte primers zijn afgeleid van het gag en het pol gen. Problemen met PCR voor de detectie van CAE zijn variatie in virusstammen en lage virustiters in vivo. Studies hebben uitgewezen dat PCR lagere sensitiviteit heeft dan antistoffen ELISA, maar dat de test in staat is geïnfecteerde dieren kan detecteren vóór seroconversie. Dit suggereert dat de combinatie van PCR en serologie een ideale combinatie zou zijn voor het detecteren van CAE (Knowles, 1997) (de Andres et al., 2005).

9.

Behandeling

Er is geen afdoende behandeling voor geiten met klinische CAE. Dieren met milde arthritis verschijnselen kan het comfortabeler gemaakt worden door goede hoefverzorging, een zachte ondergrond en eventueel orale analgesie onder de vorm van aspirine of fenylbutazone. Voor ernstiger gevallen is euthanasie de meest aangewezen oplossing (Mary C. Smith, 2007). 10.

Controle en bestrijding

Vroege diagnose is belangrijk voor efficiënte preventie en controle. Diagnose kan beter niet gebaseerd zijn op klinische waarnemingen, aangezien symptomen pas laat verschijnen. Beter is het dus om antistoffen en/of virus te detecteren. Met periodieke serologische testen kan men de prevalentie bekijken en kan men het bedrijf monitoren. Geiten worden het liefst elk half jaar getest. Testen aan het begin van het lammerenseizoen is handig (Reina et al., 2008). Vaccineren tegen CAE wordt momenteel niet gedaan. De eerste poging tot het maken van een vaccin tegen CAE, was met het gebruik van geattenueerd virus. Dit had echter weinig succes (Pepin et al., 1998). Immunisatie met virale klonen, genetisch gemodificeerd virus of recombinante plasmiden zijn meer recente alternatieven voor klassieke immunisatie. Wanneer men geiten immuniseert met recombinante plasmiden met env, tat, interferon (IFN)-γ, of interleukine (IL)-12 genen, verkrijgt men een goede T-helpercel respons en bescherming tegen CAE (Cheevers et al., 2001; Cheevers et al., 2003). Daarentegen resulteerde immunisatie met Gag-peptide (dat T-cel epitopen bevatte) in hogere provirus-spiegels na experimentele besmetting (Nenci et al., 2007). Immunisatie met genetisch gemodificeerd CAE (modificatie en/of deletie in de vif, tat en dUTPase genen) zorgde voor een verlaging van de virustiter en 11

verminderde het voorkomen van laesies. Infectie met virus of proviraal DNA met een tat-deletie zorgde voor een persisterende infectie, maar gaf wel bescherming na experimentele besmetting met pathogeen CAE (Harmache et al., 1998). Tot dus ver zijn immunsatiestrategieën niet erg succesvol gebleken, ondanks dat ze vaak wel voor behoorlijke bescherming zorgen. Ze vinden nog geen toepassing in de huidige geitenhouderij. Een mogelijke oorzaak hiervan zou de hoge kostprijs kunnen zijn. Totale eradicatie van CAE zou een optie kunnen zijn in het controleren van CAE. Voor het Visna-Maedi virus zijn er al een groot aantal Europese landen die een succesvol eradicatieprogramma hebben uitgevoerd (Reina et al., 2008). Voordeel van eradicatie is dat wanneer de prevalentie laag gehouden wordt, er minder klinische gevallen optreden en productieverlies dus voorkomen wordt. Bovendien verbetert hierdoor het dierenwelzijn en bespaart men op dierenartskosten. In kleine bedrijven is het mogelijk om te saneren, wat wil zeggen dat men alle seropositieve dieren opruimt en vervangt door seronegatieve dieren. Ook wordt aangeraden dan het nageslacht van de seropositieve moederdieren op te ruimen, tenzij deze nog geen colostrum hebben opgenomen (Berriatua et al., 2003). Men kan er ook voor keizen om seropositieve en seronegatieve geiten apart op te stallen. Dit is echter bedrijfstechnisch niet altijd mogelijk (Reina et al., 2008), (MacKenzie et al., 1987). Een aardig efficiënte methode is de CAE vrije opfok. Dit is de meest gebruikte methode voor controle van CAE. Het doel is om blootstelling van de lammeren aan het virus te voorkomen. Dit doet men door lammeren te scheiden van de moederdieren meteen na de geboorte, dus voor ze colostrum kunnen opnemen. Ze worden vervolgens totaal gescheiden en geïsoleerd van de moeder opgevoed. Ze moeten verhit colostrum, rundercolostrum of colostrum van nietgeïnfecteerde geiten krijgen (Reina et al., 2008). 11.

Besluit

CAE is een wereldwijd voorkomend virus wat vooral in landen met een intensieve geitenhouderij een hoge prevalentie kent en voor problemen zorgt. Er bestaat geen behandeling. Toch is er nog geen enkel land dat een eradicatieprogramma trachtte uit te voeren, terwijl dit toch redelijk eenvoudig gebeurde voor het Visna-Meadi virus, een virus wat veel overeenkomstige eigenschappen vertoont. Ook is er ondanks dat er veel onderzoek is gedaan, blijkbaar weinig interesse in een vaccin. Misschien omdat het niet rendabel is? Voor de diagnose van CAE bestaat nog geen ‘gouden standaard’. Misschien is hier ook wel geen nood aan en voldoen de huidige testen. Er zijn in verschillende onderzoeken meerdere testen met elkaar vergeleken, maar er kwam steeds geen ‘winnaar’ uit de bus, of het nou gaat om praktische redenen, kostprijs of sensitiviteit. Regelmatig serologie en CAE-vrije opfok is nu de meest gebruikte methode in probleembedrijven. Wel is er weinig bekend over mogelijk subklinisch besmette bedrijven en hun rol in de verspreiding van CAE. 12

Een interessant punt, wat om meer onderzoek vraagt, is de kliniek van CAE. Waarom krijgen sommige volwassen geiten arthritis, andere pneumonie en weer andere beide? Waarom krijgt een volwassen geit bijna nooit leuco-encephalomyelitis? In de literatuur wordt hier niet over gerept, men weet dat het zo gebeurt en schenkt er verder weinig aandacht aan. Heeft dit verschillend ziektebeeld te maken met het afweersysteem, dat nog moet ‘rijpen’ bij lammeren? Zitten de monocyten er voor iets tussen? Heeft het te maken met de verscheidene manieren van overdracht? Worden de verschillen veroorzaakt door andere virus varianten? Ik denk dat het zeer interessant is om dit aspect verder te onderzoeken. Mogelijk levert het meer informatie op over de strategie van het virus en kan het ons helpen in de controle van het CAE-virus.

12.

Referenties

Berriatua, E., Alvarez, V., Extramiana, B., Gonzalez, L., Daltabuit, M. & Juste, R. (2003). Transmission and control implications of seroconversion to Maedi-Visna virus in Basque dairy-sheep flocks. Preventive veterinary medicine 60, 265-279. Burgu, I., Akca, Y., Alkan, F., Ozkul, A., Karaoglu, T. & Cabalar, M. (1994). Antibody prevalence of caprine arthritis encephalitis virus (CAEV) in goats in Turkey. Dtw 101, 390-391. Cheevers, W. P., Beyer, J. C. & Hotzel, I. (2001). Plasmid DNA encoding caprine interferon gamma inhibits antibody response to caprine arthritis-encephalitis virus (CAEV) surface protein encoded by a co-administered plasmid expressing CAEV env and tat genes. Vaccine 19, 3209-3215. Cheevers, W. P., Snekvik, K. R., Trujillo, J. D., Kumpula-McWhirter, N. M., Pretty On Top, K. J. & Knowles, D. P. (2003). Prime-boost vaccination with plasmid DNA encoding caprine-arthritis encephalitis lentivirus env and viral SU suppresses challenge virus and development of arthritis. Virology 306, 116-125. Clements, J. E., Narayan, O. & Cork, L. C. (1980). Biochemical characterization of the virus causing leukoencephalitis and arthritis in goats. The Journal of general virology 50, 423427. Cork, L. C., Hadlow, W. J., Crawford, T. B., Gorham, J. R. & Piper, R. C. (1974). Infectious leukoencephalomyelitis of young goats. The Journal of infectious diseases 129, 134-141. Crawford, T. B., Adams, D. S., Cheevers, W. P. & Cork, L. C. (1980). Chronic arthritis in goats caused by a retrovirus. Science (New York, NY 207, 997-999. Daltabuit Test, M., de la Concha-Bermejillo, A., Espinosa, L. E., Loza Rubio, E. & Aguilar Setien, A. (1999). Isolation of caprine arthritis encephalitis virus from goats in Mexico. Canadian journal of veterinary research = Revue canadienne de recherche veterinaire 63, 212-215.

13

de Andres, D., Klein, D., Watt, N. J., Berriatua, E., Torsteinsdottir, S., Blacklaws, B. A. & Harkiss, G. D. (2005). Diagnostic tests for small ruminant lentiviruses. Veterinary microbiology 107, 49-62. Harmache, A., Vitu, C., Guiguen, F., Russo, P., Bertoni, G., Pepin, M., Vigne, R. & Suzan, M. (1998). Priming with tat-deleted caprine arthritis encephalitis virus (CAEV) proviral DNA or live virus protects goats from challenge with pathogenic CAEV. Journal of virology 72, 6796-6804. Horzinek, M. C. (1990). Virus Infections of Ruminants. 441-452. Knowles, D. P., Jr. (1997). Laboratory diagnostic tests for retrovirus infections of small ruminants. The Veterinary clinics of North America 13, 1-11. Konishi, M., Tsuduku, S., Haritani, M., Murakami, K., Tsuboi, T., Kobayashi, C., Yoshikawa, K., Kimura, K. M. & Sentsui, H. (2004). An epidemic of caprine arthritis encephalitis in Japan: isolation of the virus. The Journal of veterinary medical science / the Japanese Society of Veterinary Science 66, 911-917. Lewis, A. D. & Johnson, P. R. (1995). Developing animal models for AIDS research--progress and problems. Trends in biotechnology 13, 142-150. MacKenzie, R. W., Oliver, R. E., Rooney, J. P. & Kagei, H. (1987). A successful attempt to raise goat kids free of infection with caprine arthritis encephalitis virus in an endemically infected goat herd. New Zealand veterinary journal 35, 184-186. Mary C. Smith, D. M. S. (2007). Goat Medicine. 73-79. McGuire, T. C., Adams, D. S., Johnson, G. C., Klevjer-Anderson, P., Barbee, D. D. & Gorham, J. R. (1986). Acute arthritis in caprine arthritis-encephalitis virus challenge exposure of vaccinated or persistently infected goats. American journal of veterinary research 47, 537-540. Morin T., G. D., Bouzar B., Villet S., Greenland T., Guiguen F., Fornazéro C., Mornex J-F., Chebloune Y. (2003). Experimental model of lentivirus reactivation for virological and immunological studies in caprine arthritis-encephalitis virus (CAEV) infected goats. Bull Vet, Inst Pulawy 47, 275-286. Murray, P. R., Rosenthal, K. S. & Pfaller, M. A. (2005). Medical Microbiology Fitht Edition: Elsevier Mosby. Narayan, O., Clements, J. E., Strandberg, J. D., Cork, L. C. & Griffin, D. E. (1980). Biological characterization of the virus causing leukoencephalitis and arthritis in goats. The Journal of general virology 50, 69-79. Narayan, O., Kennedy-Stoskopf, S., Sheffer, D., Griffin, D. E. & Clements, J. E. (1983). Activation of caprine arthritis-encephalitis virus expression during maturation of monocytes to macrophages. Infection and immunity 41, 67-73. Nenci, C., Zahno, M. L., Vogt, H. R., Obexer-Ruff, G., Doherr, M. G., Zanoni, R., Peterhans, E. & Bertoni, G. (2007). Vaccination with a T-cell-priming Gag peptide of caprine arthritis encephalitis virus enhances virus replication transiently in vivo. The Journal of general virology 88, 1589-1593. 14

Pepin, M., Vitu, C., Russo, P., Mornex, J. F. & Peterhans, E. (1998). Maedi-visna virus infection in sheep: a review. Veterinary research 29, 341-367. Peterhans, E., Zanoni, R. & Bertoni, G. (1999). How to succeed as a virus: strategies for dealing with the immune system. Veterinary immunology and immunopathology 72, 111117. Reddy, P. G., Sapp, W. J. & Heneine, W. (1993). Detection of caprine arthritis-encephalitis virus by polymerase chain reaction. Journal of clinical microbiology 31, 3042-3043. Reina, R., Berriatua, E., Lujan, L., Juste, R., Sanchez, A., de Andres, D. & Amorena, B. (2008). Prevention strategies against small ruminant lentiviruses: An update. Vet J. Rimstad, E., East, N. E., Torten, M., Higgins, J., DeRock, E. & Pedersen, N. C. (1993). Delayed seroconversion following naturally acquired caprine arthritis-encephalitis virus infection in goats. American journal of veterinary research 54, 1858-1862. Ruff, G. & Lazary, S. (1988). Evidence for linkage between the caprine leucocyte antigen (CLA) system and susceptibility to CAE virus-induced arthritis in goats. Immunogenetics 28, 303-309. Saman, E., Van Eynde, G., Lujan, L., Extramiana, B., Harkiss, G., Tolari, F., Gonzalez, L., Amorena, B., Watt, N. & Badiola, J. (1999). A new sensitive serological assay for detection of lentivirus infections in small ruminants. Clinical and diagnostic laboratory immunology 6, 734-740. Smith, M. C. & Cutlip, R. (1988). Effects of infection with caprine arthritis-encephalitis virus on milk production in goats. Journal of the American Veterinary Medical Association 193, 6367. Zink, M. C., Yager, J. A. & Myers, J. D. (1990). Pathogenesis of caprine arthritis encephalitis virus. Cellular localization of viral transcripts in tissues of infected goats. The American journal of pathology 136, 843-854.

15

UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar 2010-2011

Capriene Arthritis Encephalitis Virus Het opstellen van een capriene synoviaal celcultuur.

door

Minneke VAN DUIJN

Promotor: Prof. Dr. H. Nauwynck Copromotor: Dierenarts Lennert Steukers

Studieproject in het kader van de Masterproef

1

De auteur geeft de toelating deze studie voor consultatie beschikbaar te stellen voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting de bron uitdrukkelijk te vermelden bij het aanhalen van deze studie. Het auteursrecht betreffende de gegevens vermeld in deze literatuurstudie berust bij de promotor(en). Het oorspronkelijke auteursrecht van de individueel geciteerde studies en eventueel bijhorende documentatie, zoals tabellen en figuren, blijft daarbij gevrijwaard. De auteur en de promotor(en) zijn niet verantwoordelijk voor de behandelingen en eventuele doseringen die in deze studie geciteerd en beschreven zijn.

2

Voorwoord

Mijn interesse voor de virologie, en dan specifiek voor de lentivirussen, is opgewekt door een e

gastcollege van Koen Van Rompay toen ik nog in 3 Bachelor diergeneeskunde aan de universiteit van Antwerpen zat. Hij gaf een presentatie over het Simian Immunodeficiëntie Virus (SIV), een variant van HIV, bij apen. Hij doet in Amerika al jaren onderzoek naar AIDS, waarbij hij vooral gebruik maakt van apen, aangezien HIV hier van afstamt. Wat mij toen vooral boeide was de manier waarop hij de diergeneeskunde combineerde met de humane geneeskunde. Bovendien zette hij zich privé enorm in voor de AIDS problematiek met zijn eigen organisatie voor AIDS weeskinderen. Zijn vakgebied en de combinatie met e

ontwikkelingssamenwerking inspireerde mij enorm. Toen bekend werd dat er in 1 Master een masterproef geschreven moest worden, was het onderwerp dan ook snel gekozen. Ik heb toen (met Koen Van Rompay en professor Hans Nauwynck als promotoren) de relatie tussen e

het HIV en het SIV bestudeerd door middel van een literatuurstudie. In de 2 Master wilde ik een vervolg maken op deze eerste studie en heb toen samen met professor Hans Nauwynck besloten om het lentivirus van de geit te bestuderen, aangezien dit een gemakkelijkere diersoort is om nog eventueel onderzoek mee te doen, dan apen. Ik heb wederom een literatuurstudie gedaan, ditmaal dus over het capriene arthritis encephalitis virus (CAEV). Mijn laatste Masterproef heeft u nu in handen en is eigenlijk een verdieping en uitbreiding op de vorige. Ditmaal ben ik met mijn co-promotor dierenarts Lennert Steukers het labo ingegaan, waarbij wij met succes een synoviaal celcultuur van de geit hebben opgesteld. Dit is in de literatuur al beschreven, maar in België niet verkrijgbaar. Het doel is om uiteindelijk een celcultuur te hebben voor diagnostiek voor CAEV. Lennert heeft mij een aantal laboratoriumtechnieken aangeleerd, wat ook een onderdeel was van deze Masterproef. Ik ben zelf erg tevreden met het resultaat van de afgelopen drie Masterjaren. Ik heb veel geleerd van zeer intelligente en inspirerende mensen. Misschien komt in de toekomst de virologie wel weer op mijn pad en ga ik ermee verder als de gelegenheid zich voordoet. Voor nu: veel plezier met het lezen van mijn derde en laatste Masterproef, ik hoop dat u er wat van opsteekt.

3

Dankwoord Deze Masterproef was niet tot stand gekomen zonder de fantastische inzet en hulp van Lennert Steukers. Hij heeft mij waardevol advies gegeven wanneer dit nodig was, maar liet vooral mijn eigen ideeën en initiatief doorwegen. Daarvoor wil ik hem heel erg bedanken. Verder wil ik graag professor Hans Nauwynck bedanken die mijn onderzoek mogelijk heeft gemaakt. Ook Dominique Olyslaegers heeft ons enorm geholpen in het labo; we hebben veel aan haar gehad. Kortom, iedereen bedankt die de tijd heeft vrijgemaakt om mij in dit project te begeleiden; het was een prettige samenwerking en ik heb veel ervaring opgedaan in het labo. Daarnaast wil ik mijn ouders bedanken, die mij gedurende mijn hele studie hebben bijgestaan.

4

Inhoudsopgave Deel 1: Literatuurstudie: Capriene Arthritis Encephalitis Virus Samenvatting

1

1.

Inleiding

2

2.

Etiologie

3

2.1. Classificatie

3

2.2. Viruseigenschappen

4

Pathogenese

7

3.1. Algemene Pathogenese

7

3.2. Histopathologie

7

Symptomen en Letsels

8

4.1. Algemene symptomen

9

4.2. Letsels

11

5.

Immuunrespons

13

6.

Diagnostiek

14

6.1. Differentiaal diagnose arthritis/synovitis

14

6.2. Differentiaal diagnose pneumonie

14

6.3. Differentiaal diagnose encephalitis

15

6.4. Virusisolatie

15

6.5. Serologie

17

6.6. Polymerase Chain Reaction (PCR)

18

Prevalentie

19

7.1. Europa

19

7.2. Verenigde Staten

20

7.3. Canada

20

7.4. Mexico

20

7.5. Brazilië

20

8.

Behandeling

20

9.

Economisch belang

20

9.1. Melkproductie

21

9.2. Geboortegewicht

21

10. Controle en Bestrijding

21

3.

4.

7.

Deel 2 : Eigen onderzoek: Het opstellen van een synoviaal celcultuur 1.

Inleiding

23

2.

Materiaal en methoden

24

3.

2.1 Isolatie

24

2.2 Karakterisatie

27

Resultaten

28

3.1 Isolatie

28

3.2 Karakterisatie

30

4.

Besluit

31

5.

Referenties

32

5

Samenvatting

Het retrovirus Capriene Arthritis Encephalitis virus (CAEV) veroorzaakt verschillende progressieve ziektecomplexen in geiten. CAEV is het meest gerelateerd met het Maedi-Visna virus (MVV) van het schaap. CAEV veroorzaakt een infectie van cellen van de monocytmacrofaag lijn en persisteert levenslang. Colostrum, melk maar ook horizontale transmissie zijn de belangrijkste manieren van overdracht. Een CAEV-infectie kan ziekte veroorzaken, waarbij vooral de arthritisvorm het belangrijkst is, maar kan ook subklinisch verlopen. Momenteel wordt voor de diagnostiek het meest gebruik gemaakt van serologie. Voor de isolatie van CAEV wordt in de meeste gevallen gebruik gemaakt van synoviaal celculturen. In dit onderzoek werd er getracht een dergelijke celcultuur te maken door via een punctie de fibroblast-achtige synoviaal cellen uit het carpaalgewricht van geslachte geiten enzymatisch los te maken. Identificatie gebeurde aan de hand van enkele parameters. Na een eerste morfologische karakterisatie werden de geïsoleerde cellen verder gekarakteriseerd via immunofluorescentiekleuringen. De morfologische karakterisatie en de kleuringen wezen uit dat er inderdaad een celcultuur was opgesteld met fibroblast-achtige synoviocyten (FAS). Deze cultuur zal in de toekomst gebruikt worden voor de diagnostiek van CAEV binnen het laboratorium voor virologie.

1

Deel 1: Literatuurstudie: Capriene Arthritis Encephalitis Virus 1.

Inleiding

Het Capriene Arthritis Encephalitis virus (CAEV) veroorzaakt verschillende progressieve ziektecomplexen in geiten. CAEV behoort tot de familie van de Retroviridae en daarbinnen tot het genus Lentivirus. De Retroviridae hebben de unieke eigenschap dat ze RNA omzetten tot DNA en dit DNA inbouwen in het gastheer DNA. De lentivirussen komen voor bij verschillende

diersoorten

en

de

mens.

Ze

worden

gekenmerkt

door

een

lange

incubatieperiode, gevolgd door een chronische ziekte. CAEV lijkt genetisch en qua ziektebeeld het meest op het Maedi-Visna virus (MVV). CAEV is een wereldwijd voorkomend, doch goed controleerbaar virus, dat hoofdzakelijk problemen veroorzaakt in de melkgeitensector. CAEV tast geiten van verschillende leeftijdscategorieën aan en geeft aanleiding tot een variërend symptoombeeld. Ook zijn er veel asymptomatisch besmette geiten, wat mogelijk een verkeerd beeld geeft van de prevalentie van CAEV. De meerderheid van de volwassen geiten ontwikkelt een progressieve arthritis, mastitis en/of pneumonie. Een groot probleem is de transmissie van moeder naar jong via het colostrum. Hierdoor kunnen de jongen bij een CAEV besmetting te maken krijgen met een ernstige encephalitis. Deze transmissieweg heeft gevolgen voor het biestmanagement op een geitenbedrijf. Het management is een heel belangrijke factor in de controle van CAEV. Er is de afgelopen 30 jaar veel onderzoek gedaan naar CAEV en dan vooral in relatie tot het HIV virus, dat tot dezelfde virusfamilie behoort. Er wordt namelijk nog steeds naar een ideaal diermodel gezocht met het oog op de AIDS problematiek. CAEV zou hierin mogelijk een rol kunnen gaan spelen. Een onderwerp dat veel aandacht heeft gekregen de laatste jaren, en dan vooral in het kader van de geitenhouderij, is de diagnostiek. Er zijn momenteel vele methoden om CAEV te diagnosticeren, maar ze zijn niet allemaal even ideaal en praktisch uitvoerbaar. Momenteel is de serologie, of het opsporen van antistoffen, routinematig de meest gebruikte methode. Er zijn veel prevalentie studies gedaan over de gehele wereld. Er zijn echter nog geen data voor België en Nederland bekend. Het economische belang van CAEV besmetting situeert zich voornamelijk in een verlaging van de melkproductie en het geboortegewicht. Er bestaat geen afdoende behandeling tegen CAEV. Bovendien is vaccineren tegen CAEV niet erg succesvol gebleken. Het doel van deze scriptie is het verstrekken van een uitgebreide theoretische achtergrond van CAEV, waarbij onder andere symptomatologie, diagnostiek, behandeling en preventie uitgebreid aan bod zullen komen. In het tweede deel van deze scriptie zal er een onderzoek op poten worden gezet, waarbij er getracht wordt een synoviaal celcultuur te maken, zodat dit gebruikt kan worden voor diagnostiek en prevalentiestudies in België.

2

2.

2.1.

Etiologie

Classificatie

Het Capriene Arthritis Encephalitis virus (CAEV) behoort tot de familie van de Retroviridae en daarbinnen tot de subfamilie Orthoretrovirinae en het genus Lentivirus. Onder normale omstandigheden zijn lentivirussen species-specifiek, met zeer weinig cross-species overdracht. Toch blijkt dat het humane immunodeficiëntie virus (HIV) ooit is ontstaan door overdracht van apen, besmet met het simian immunodeficiëntie virus (SIV), naar de mens. De pathologie en kliniek van een lentivirus infectie is niet uniform onder de verschillende diersoorten (Tabel 1). Ondanks het verwijzen van de term lentivirus naar een zich langzaam (lenti = traag) ontwikkelende ziekte, komt er toch bij een aantal diersoorten een acute initiële respons op infectie voor. Bovendien kan een infectie met een lentivirus in sommige gevallen hyperacuut verlopen met fatale afloop, maar soms ook subklinisch met een mild verloop. Vanuit klinisch en pathogenetisch oogpunt is er wel bij alle stammen zowel een latente als een productieve fase aanwezig, afhankelijk van het soort cel dat geïnfecteerd wordt en van de immuunrespons van de gastheer. Een van de eerste belangrijkste onderzoeken naar lentivirussen werd gedaan met schapen en het Maedi-Visna virus (MVV) in 1954. In 1970 werd ontdekt, mede vanwege de zich ontwikkelende moleculaire biologie, dat de retrovirussen een reverse transcriptase systeem hebben. Met de huidige technologie is de familie van de retrovirussen, en dan met name HIV, een van de meeste bestudeerde virusfamilies (Figuur 1). Met name het feliene immunodeficiëntie virus (FIV) en SIV worden veel gebruikt als diermodellen in het onderzoek naar HIV. Mogelijk is daar ook een rol weggelegd voor de lentivirussen van de kleine herkauwers (Campbell & Robinson, 1998).

Figuur 1: Phylogenetische boom die de onderlinge relaties tussen de lentivirussen weergeeft. Jembrana disease virus (JDV), boviene immunodeficiëntie virus (BIV), humaan immunodeficiëntie virus (HIV), simian immunodeficiëntie virus (SIV), feliene immunodeficiëntie virus (FIV), Maedi-Visna virus (MVV), capriene arthritis encephalitis virus (CAEV), equine infectieuze anemie virus (EIAV) (Uit: Campbell & Robinson, 1998).

3

Virus

Diersoort

Klinische vertoning

JDV, BIV

Grote herkauwers

acuut, maar voorbijgaand; normaal klinisch herstel

HIV, SIV, FIV

Primaten,mens, kat

acuut; chronisch progressief; opportunistische infecties

MVV, CAEV

Kleine herkauwers

chronisch progressieve arthritis, pneumonie, encephalitis

EIA

Paard

acute episodische koorts, hemolytische anemie

Tabel 1: De lentivirussen van de verschillende diersoorten en hun klinische vertoning (Naar: Campbell & Robinson, 1998).

De lentivirussen van kleine herkauwers, MVV en CAEV, kunnen onderverdeeld worden in twee grote genetische clusters, namelijk A en B. Daarnaast zijn er een aantal kleine; C, D en E. MVV is hoofdzakelijk genotype A, CAE voornamelijk genotype B (Reina et al., 2009). Verder bestaat er ook een Noors isolaat met genotype C, bekomen uit geiten met arthritis. Tenslotte is er ook nog een genotype D, welke enkel is geïdentificeerd in Zwitserland en Spanje. Een recente studie in Italië heeft een nieuw genotype (E) aangetoond (Grego et al., 2009). 2.2

Viruseigenschappen

CAEV is een niet-oncogeen retrovirus. CAEV en MVV bezitten, net als alle andere lentivirussen, een envelop en zijn 80-100 nm groot. Ze hebben twee identieke enkelstrengige RNA moleculen. De virale envelop heeft transmembranaire proteïnen en glycoproteïnen (Figuur 2).

Figuur 2: Het structuur van het virion van het CAE virus (Uit: Chebloune, 1999).

Sequentieanalyse van het RNA van verschillende lentivirussen demonstreert dat ze een gelijkaardige genomische organisatie hebben. Net als andere retrovirussen, hebben de genomen van lentivirussen ‘long terminal repeats’ (LTRs), die de cis signalen geven die nodig zijn voor transcriptie en polyadenylatie van het virale RNA. Lentivirussen bevatten ook genen 4

die coderen voor de structurele proteïnen gag, pol en env. Deze structurele proteïnen zijn bewaard gebleven bij alle Retroviridae (Schoborg et al., 1994). Het gag gen codeert voor de kernproteïnen (oa. p28) en een precursor proteïne dat wordt opgesplitst in grote eiwitten: het matrixproteïne (MA), het kapsiedproteïne (CA) en het nucleokapsiedproteïne (NC). Het MA proteïne is

verantwoordelijk voor de binding

van het precursorproteïne

met het

plasmamembraan van de cel. Het is noodzakelijk voor de samenstelling van het virus en voor het maken van infectieuze virions. Het kapsiedproteïne vormt de hydrofobe kern van het virion. Het zorgt voor de sterke antistoffenrespons van de gastheer tijdens infectie. Hoewel ze het virus niet neutraliseren zijn ze wel van belang voor het diagnosticeren van infectie. Het nucleokapsiedproteïne zorgt binnen het virionkapsied voor een coating van het virale RNA. Het pol gen codeert voor de enzymatische eiwitten van het virus. Het RNA-afhankelijke DNA polymerase, reverse transcriptase (RT) zorgt voor een conversie van het enkelstrengige RNA tot het dubbelstrengige DNA. De integrase proteïnes (IN) zorgen voor de integratie van het provirale DNA in het gastheer DNA. Daarenboven codeert het pol gen in verschillende nonprimate lentivirussen, waaronder CAEV en MVV, voor dUTPase activiteit, wat deze virussen een voordeel blijkt te bieden wat betreft groei in de monocyt/macrofaag-lijn. Het env gen codeert voor het oppervlakteglycoproteïne gp 135 en het transmembraan glycoproteïne gp 41 (Narayan, 1993; Chebloune, 1999). De lentivirussen kunnen worden onderscheiden van de andere retrovirussen door de aanwezigheid van kleine ORFs in hun genomen, die coderen voor regulatoire eiwitten. De locatie van deze regulatoire genen varieert tussen de lentivirussen; CAEV en MVV hebben er drie, terwijl een meer complex virus als HIV-1 er wel zeven heeft (Saltarelli et al., 1990; Sonigo et al., 1985). Twee van deze regulatoire genen, tat en rev, zijn beide nodig voor efficiënte replicatie van CAEV (Schoborg et al., 1994) (Figuur 3).

Figuur 3: Het genoom van het Maedi-Visna en het CAE virus (Uit: Narayan, 1993).

Lentivirussen

veroorzaken

chronische

ziekten

in

verschillende

zoogdieren,

gekarakteriseerd door een lange incubatieperiode (Zink et al., 1990). Capriene en oviene 5

lentivirussen gebruiken een andere strategie om in hun gastheer te blijven persisteren dan lentivirussen van primaten. CAEV en MVV zijn niet in staat om CD4+ T lymfocyten te infecteren, wat een reden kan zijn dat immunosuppressie niet wordt waargenomen bij CAEV of MVV besmetting. CAEV en MVV hebben een tropisme voor de monocyt/macrofaag-cellijn. Monocyten dragen het viraal genoom, maar produceren geen nieuwe virionen. Ze transporteren het virus wel door het lichaam, en worden niet herkend door het immuunsysteem (Peterhans et al., 1999). De replicatiecyclus van CAEV is beter gekend in vitro dan in vivo. Het virus wordt meestal gecultiveerd in capriene synoviaal celculturen. De replicatiecyclus van het virus in deze culturen varieert van 15 tot 20 uur. Een in vitro inoculatie van fibroblast-achtige cellen resulteert in binding van het virus aan nog niet geïdentificeerde cellulaire receptoren. Dit wordt gevolgd door internalisatie van het virus door een pH-afhankelijk fusiemechanisme tussen de virale glycoproteïnen en het plasmamembraan van de synoviocyt. Internalisatie wordt gevolgd door het verwijderen van de coating van het virion, reverse transcriptie van het virale RNA, binnendringen van het provirale DNA in de nucleus en integratie van het virale DNA in het gastheer DNA. De meeste virionen worden geproduceerd via ‘budding’ met het celmembraan en/of via exocytose uit het endoplasmatisch reticulum in intracytoplasmatische vesikels. De replicatie wordt bijgestaan door celfusie, wat de efficiëntie van vermeerdering aanzienlijk vergroot. Dit resulteert namelijk in een duidelijk cytopathisch effect (CPE), namelijk de vorming van syncytia (Horzinek, 1990b; Narayan et al., 1980; Narayan, 1993). De mechanismen in vivo zijn nog slechter gekend. Wat zeker is, is dat de monocyt/macrofaag-lijn geïnfecteerd wordt en dat de productie van nieuwe virions gelinkt is aan de maturatiestatus van de monocyten (Figuur 4).

Figuur

4:

Mechanismen

van

de

lentivirussen om de cel binnen te komen. A: binding op een nog ongekende receptor, gevolgd door fusie met de plasmamembraan en vrijlating van het ribonucleotidencomplex in het cytosol. B: binding van het virion op de receptor gevolgd door endocytose. C: binding met een Ig molecule (lage affiniteit) en het virion wordt vervolgens opgenomen door internalisatie van het hele complex. D: hoge affiniteitbinding met Ig molecule, gevolgd door endocytose en vorming van een

fagolysosoom.

Het

viruspartikel

wordt gelyseerd ( Uit: Narayan, 1993).

6

CAEV is gevoelig aan de meeste desinfectantia, vanwege de fragiele lipoproteïneenvelop van het virion. Het agens wordt geïnactiveerd gedurende 10 minuten aan 56 °C (Narayan et al., 1980). 3.

Pathogenese

3.1

Algemene pathogenese

CAEV veroorzaakt een infectie van de monocyt/macrofaag-cellijn. Deze infectie persisteert levenslang, ondanks de humorale en cellulaire immuunrespons (Phelps & Smith, 1993). Of er al dan niet replicatie van het virus plaatsvindt, blijkt af te hangen van de maturatiestatus van de geïnfecteerde cel. Alleen wanneer monocyten rijpen tot macrofagen wordt het CAEV genoom gekopieerd. Dit fenomeen, wat gekend is als beperkte replicatie, zorgt ervoor dat CAEV veilig in de monocyten kan zitten voor langere periode, zonder dat het gedetecteerd wordt door het immuunsysteem (Zink et al., 1990). Colostrum en melk worden gezien als de meest belangrijke routes van transmissie van CAEV van moeder op jong (East, 1993). Het virus kan zowel vrij als celgeassociëerd voorkomen in de melk. Ook een subklinisch besmette moeder kan virus uitscheiden (Mary C. Smith, 2007). Vooral rond de partus kan het virus reactiveren (Morin, 2003). Een andere aanpak van het management op geitenbedrijven, namelijk door de jongen direct na de geboorte weg te halen bij de moeder, heeft de prevalentie van CAEV doen dalen, wat bevestigt dat dit een belangrijke transmissieroute betreft (Peterhans et al., 2004). Echter colostrum en melk zijn niet de enige manieren van overdracht. Horizontale overdracht kan plaatsvinden en speelt een belangrijke rol in de verspreiding van CAEV. Het samenbrengen van geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde geiten leidde maar zeldzaam tot seroconversie, en dat na 12 maanden. Als men daarentegen de geïnfecteerde en nietgeïnfecteerde dieren samen melkte, leidde dit vaker tot seroconversie en dat binnen 10 maanden. Mogelijke overdrachtsmechanismen zijn speeksel (aërosol) en andere excreties (Smith, 2007d). De betekenis van intra-uteriene virale transmissie blijft nog onduidelijk. Een publicatie over MVV suggereert dat intra-uteriene transmissie kan optreden bij 10% van de besmette drachtige ooien (Brodie et al., 1994). Antistoffen tegen CAEV kunnen aangetoond worden in het semen van geitenbokken (Ramirez et al., 2009). Het is echter nog niet duidelijk of het semen een mogelijke bron van besmetting is bij de coïtus (Peterhans et al., 2004). 3.2

Histopathologie

Zink et al. (1990) onderzochten pathologische stalen van 18 geiten met klassieke CAE letsels. De stalen werden histologisch en door middel van in situ hybridisatie (gebruikmakend 7

van moleculair gekloond CAEV DNA) vergeleken om vast te stellen welke weefsels en cellen van natuurlijk geïnfecteerde geiten door het virus werden gebruikt voor virusreplicatie. Bij lammeren met encephalitis werden in de hersenen en het ruggenmerg multifocale letsels van necrose en malacie gevonden, met er omheen geïnfiltreerde macrofagen en lymfocyten. Het was echter niet mogelijk een associatie te maken tussen de locatie van de letsels, de graad van de neurologische letsels en de klinische symptomen van het aangetaste lam. Er waren een aantal lammeren die ook letsels vertoonden van chronische progressieve interstitiële pneumonie. Onder de volwassen geiten was arthritis het meest voorkomende letsel, maar er bleken ook een aantal jong volwassen geiten te zijn met pneumonie en encephalitis symptomen. De weefsels die de klassieke letsels van CAE vertoonden, waren ook vaak positief bij in situ hybridisatie. In sommige gevallen waren er minder viraal-RNA positieve cellen dan men verwacht had op basis van de ergheid van de histologische letsels. In het centraal zenuwstelsel kwamen de viraal-RNA positieve cellen vooral voor in gebieden met inflammatie, focale gliosis en aan het endotheel en lumen van bloedvaten. In de long werden de meeste geïnfecteerde cellen gevonden in het ontstoken peribronchiale weefsel en lijnden ze de interalveolaire septa af, een plaats die normaal bezet is door alveolaire macrofagen. In de melkklier werd viraal RNA gevonden in cellen die de lymfoïde follikels omringden. Ook werden veel positieve cellen gevonden in myelopoëtische haarden in het beenmerg. Virale transcripten werden dus het meest gevonden in inflammatoir weefsel. Chemotactische factoren geproduceerd in dit weefsel trekken macrofagen aan, welke virus kunnen bevatten. Dit resulteert in het verhogen van de hoeveelheid virus in inflammatoire gebieden. Ook in niet-inflammatoire gebieden werd viraal RNA gevonden, onder andere in Kupfercellen, alveolaire macrofagen, epitheelcellen van de darm, nieren en in de schildklier. Uit dit onderzoek bleek dus dat het celtropisme van CAEV zich niet louter beperkt tot de macrofagen en lymfocyten, maar dat ook andere cellen het virus kunnen bevatten. 4.

Symptomen en letsels

Symptomen treden meestal langzaam op na een initiële CAEV infectie. Zoals eerder vermeld blijft het virus persisteren onder latente vorm in monocyten tot deze rijpen tot macrofagen. De macrofagen migreren dan naar de verschillende weefsels zoals de melkklier, de plexus choroïdeus in de hersenen, synoviaalmembranen, long en geassocieerde lymfeknopen. Veel geiten blijven symptoomloze dragers van het virus. De klinische symptomen en letsels zijn geassocieerd met virale replicatie in geïnfecteerde macrofagen op de voorkeursplaatsen. Actieve virale replicatie zorgt voor een sterke, maar niet beschermende humorale en cellulaire immuunrespons. De ziekte komt voor in vijf verschillende vormen (Matthews, 2009a).

8

4.1

Algemene symptomen

Arthritis – Dit ziektebeeld wordt normaal alleen gezien bij jaarlingen of jong volwassen geiten. Het komt soms voor bij lammeren vanaf zes maanden oud. CAEV tast alle synoviaalmembranen aan, inclusief deze van de gewrichten, pezen en bursae. Het induceert een chronisch progressieve synovitis en arthritis met een overmaat aan synoviaalvocht tot gevolg. Het carpaalgewricht is vaak het ergst aangetast en kan enorm vergroot zijn (Figuur 5a,b). Ook andere gewrichten kunnen aangetast zijn, met name de schouder, de knie, de kogel en de tarsus. De symptomen kunnen acuut of langzaam optreden en het ziekteverloop kent een variabel karakter. Sommige dieren vertonen een licht manken gedurende een aantal jaren, zonder daar al teveel hinder van te ondervinden. Anderen zijn acuut kreupel met sterke zwelling van de gewrichten en kennen een zeer snelle progressie van de ziekte. Het rondlopen op de carpi is ook een typisch verschijnsel (Figuur 6). De eerste tekenen van ziekte kunnen zeer subtiel zijn; de gewrichten voelen normaal aan, maar de geit is wat futloos, eet minder, komt zichtbaar moeilijker recht en verliest gewicht. Toch komt het ook vaak voor dat de geiten een goede eetlust blijven houden (Matthews, 2009a; Smith, 2007a).

Figuur 5a: Zwelling van de carpi

Figuur 5b: Zwelling van de capri

(Uit: Matthews, 2009a).

(Uit: Smith, 2007a).

Figuur 6: Knielen op de carpi vanwege CAEV infectie (Uit: Smith, 2007a).

Induratieve mastitis / vleesuier – Hierbij vinden we een harde, gezwollen uier bij jonge geiten (vaak primipare geiten), weinig melkproductie en ook het toeschieten van de melk is minimaal. Zelfs na toediening van oxytocine en warme kompressen is er geen verbetering van de melkgift. De huid van de uier is normaal van kleur en vrij van oedeem. Therapie voor oedemateuze uiers (oa. diuretica) is niet effectief. De melk lijkt er normaal uit te zien, zonder 9

tekenen van bacteriële mastitis. Vaak is het celgetal verhoogd. Na een aantal weken ziet men meestal een toename van de melkproductie en een zachtere uier. Deze blijft echter suboptimaal vanwege induratieve veranderingen in het uierweefsel. Verder zijn er geen tekenen van algemeen ziek zijn (Matthews, 2009a; Smith & Cutlip, 1988; Smith, 2007a; 2007b). Interstitiele pneumonie – Lammeren besmet met CAEV kunnen een subklinische interstitiële pneumonie vertonen en sommige adulten ontwikkelen een chronisch progressieve pneumonie, gekarakteriseerd door een chronische hoest en gewichtsverlies. Vaak zijn de eerste tekenen deze van dyspnee na stress en inspanning, zoals na de partus of na het melken. Sommige geiten hebben ook vergrote carpi. Secundaire bacteriële infecties treden sporadisch op. Antibiotica kunnen hier tijdelijk verlichting geven (Matthews, 2009a; Phelps & Smith, 1993; Smith, 2007a; 2007c). Encephalitis – Dit ziektebeeld wordt gezien bij lammeren van 2 tot 6 maanden oud. Soms zijn ook oudere geiten aangetast. Er is vaak een ascenderende infectie van het ruggenmerg. Spinale reflexen blijven intact. Er kan koorts worden waargenomen, maar dit is niet altijd aanwezig. De lammeren zijn helder en alert in het beginstadium, tremor is dan vaak aanwezig. Vaak worden de dieren mank, verliezen ze de proprioceptie en vertonen ze progressieve ataxie (Figuur 7). De ziekte kan verergeren gedurende een aantal dagen, met hemiplegie, tetraplegie, cirkelgang, excitatie, blindheid en neerliggen met torticollis tot gevolg (Matthews, 2009a; Smith, 2007d).

Figuur 7: Verlies van proprioceptie ten gevolge van CAEV infectie (Uit: Smith, 2007d).

Progressief gewichtsverlies – Dit wordt vaak gezien in combinatie met andere klinische symptomen, of als alleenstaand symptoom. Meestal zijn de geïnfecteerde geiten met dit ziektebeeld tussen 1 en 2 jaar oud, met een grote variatie in de ergheid van de symptomen. Omdat CAEV een chronische infectie veroorzaakt, kan het gewichtsverlies het gevolg zijn van endogene cytokine vrijstelling en is het mogelijk onafhankelijk van de voedselopname (Matthews, 2009a; Smith, 2007a; 2007e).

10

4.2

Letsels

Arthritis – Het voornaamste letsel dat gezien wordt, is een chronische diffuse synovitis, waarbij het carpaalgewricht het vaakst is aangetast. Microscopisch bestaan de laesies uit een hyperplasie van de synoviaal cellen, subsynoviale mononucleaire infiltratie, villushypertrofie, vasculaire lekkage, fibrineafzetting en necrose (McGuire et al., 1990) (Figuur 9). Er kan erge mineralisatie van de peri-articulaire weefsels optreden met bovendien erosies van het gewrichtsoppervlak (Wilkerson et al., 1995) (Figuur 8). Het synoviaalvocht kan normaal zijn, maar is vaak bruin tot rood van kleur, heeft een lage viscositeit, een hoog volume en een 3

hoog celgetal (1000 tot 20000 cellen/mm , met 90% mononucleairen waarvan 60-70 % macrofagen) (Phelps & Smith, 1993). De mate van de arthritis in de chronisch geïnfecteerde geiten is gecorreleerd met antistoffen tegen het CAEV oppervlakte glycoproteïne (gp135) in het synoviaalvocht. Deze neutraliserende antistoffen zijn echter niet in staat het virus te elimineren. Bovendien vormt CAEV ook antigene varianten waardoor er aan het immuunsysteem ontsnapt kan worden. Er is aangetoond dat bij latent besmette geiten de arthritis veroorzaakt wordt door de immuunrespons op het aanwezige CAEV in de synoviaal cellen (Knowles et al., 1990).

Figuur 8: Radiografische veranderingen van de carpus van een geit met CAEV. Bemerk de mineralisatie van het zachte weefsel (Uit: Smith, 2007a).

Figuur 9: Carpus van een geit met arthritis. Bemerk de verdikking van het weefsel en prominente synoviale villi (Uit: Wilkerson et al., 1995).

11

Induratieve mastitis / vleesuier – De letsels die voorkomen bij dit ziektebeeld zijn bestudeerd na zowel experimentele als natuurlijke besmetting. Microscopisch ziet men mononucleaire infiltratie van het periductale stroma, wat leidt tot vernietiging van de normale structuren. Dit resulteert in necrotiserende foci in het uierweefsel (Adams et al., 1980a; McGuire et al., 1990; Phelps & Smith, 1993). Interstitiele pneumonie – Meestal zijn de caudale longkwabben het meest aangetast. De longen voelen vast aan, zijn grijsroze van kleur, hebben diffuse witte foci en zijn niet gecollabeerd. De bronchiale lymfeknopen zijn vergroot. Histologisch ziet men een chronische interstitiële pneumonie met infiltratie door mononucleaire cellen in de alveolaire septa en in peribronchiaal en perivasculair weefsel. Chronische interstitiële pneumonie als dusdanig wordt alleen gezien bij geiten geïnfecteerd met CAEV (Phelps & Smith, 1993). Encephalitis

– De

grote zichtbare

laesies

bij de neurologische

vorm omvatten

asymmetrische, bruinrode gezwollen zones in het centraal zenuwstelsel, met mogelijk atrofie van omliggend weefsel. Er zijn multifocale, mononucleaire inflammatoire letsels, met variërende graden van demyelinisatie en malacie. Er kan slechts één plek in de hersenen zijn aangetast, maar meestal zijn er multifocale laesies (Figuur 10). Meestal is het cervicale en het lumbosacrale ruggenmerg aangetast. Het cerebrospinaal vocht heeft een hoge eiwitconcentratie (40-700 mg/dl) en een hoge witte bloedceltelling (5 tot >250 WBC/µl). Dominante celtypes zijn lymfocyten en macrofagen (Campbell & Robinson, 1998; Phelps & Smith, 1993).

Figuur 10:

Ruggenmerg van

een geit met erge meningoencephalitis ten gevolge van een

CAEV

infectie

(Uit:

Campbell & Robinson, 1998)

Naast deze ‘typische’ letsels zijn er bij geïnfecteerde geiten nog tal van andere letsels gevonden. Men

zag

ook:

mineralisatie

van

weke

weefsels; pericarditis; pleuritis;

amyloidafzetting; interstitiële nefritis; en lymfocyteninfiltratie van darm, nier, long en schildklier (Phelps & Smith, 1993; Zink et al., 1990).

12

5.

Immuunrespons

De humorale en de cellulaire immuunrespons spelen een belangrijke rol tijdens infectie met CAEV, maar beide blijken weinig positief effect te hebben voor de gastheer. Er worden antistoffen gevonden enkele weken, tot maanden na de infectie. Er is weinig geweten over de IgM antilichaam respons. Grote hoeveelheden van IgG virusspecifieke antistoffen zijn wel gevonden, voornamelijk deze in de IgG1 klasse. Antistoffen vindt men in het serum, maar ook in het synoviaalvocht van aangetaste gewrichten en in het cerebrospinaal vocht. Aangenomen wordt dat veel van deze antistoffen geproduceerd worden door plasmacellen die in grote hoeveelheid aanwezig zijn in de ontstoken synovia van de geïnfecteerde geiten (Narayan, 1993). De mate van de arthritis in de chronisch geïnfecteerde geiten is gecorreleerd met antistoffen in het synoviaalvocht tegen het CAEV envelop glycoproteïne (gp135) en het transmembraan glycoproteïne (gp 38) (von Bodungen et al., 1998). Deze neutraliserende antistoffen zijn echter niet in staat het virus te elimineren. Bovendien vormt CAEV ook antigene varianten waardoor er aan het immuunsysteem ontsnapt kan worden. Er is aangetoond dat bij latent besmette geiten de arthritis veroorzaakt wordt door de immuunrespons op het aanwezige CAEV in de synoviaal cellen (Knowles et al., 1990). De cellulaire respons bestaat voornamelijk uit lokale infiltratie van lymfocyten. Er zijn aanwijzingen dat de cellulaire immuunrespons aan de basis ligt van de letsels. Deze zijn dus van immunopathologische aard en worden niet veroorzaakt door het virus zelf (Horzinek, 1990a; Smith, 2007d). De synoviaalmembraan bij geiten met arthritis wordt voornamelijk geïnfiltreerd door CD5- CD45R+ B lymfocyten. Daarnaast zijn er MHC-klasse II geactiveerde macrofagen en klasse II geactiveerde CD4+ en CD8+ T lymfocyten (Wilkerson et al., 1995). Er worden in de alveoli en in de alveolaire septa van geiten met chronische interstitiële pneumonie veel grote niet-specifieke esterase-positieve macrofagen gevonden. Deze cellen worden echter ook gevonden bij geiten die deze pneumonie niet vertonen. Deze macrofagen kunnen dienen als een bron van het virus voor continue antigene stimulatie van de immuunrespons tegen CAEV (Ellis et al., 1988). Infectie met CAEV lijkt de productie van cytokines (IL-2, IL-6, IL-8, IL-12, TNFα en INFγ) in macrofagen te verhogen. Van enkele van deze cytokines is gekend dat ze de immuunrespons verhogen en dat ze worden gezien bij humane patiënten met reumatoïde arthritis (Werling, 2004).

13

6.

Diagnostiek

6.1

Differentiaal diagnose arthritis/synovitis

Meestal is er bij gezwollen gewrichten sprake van arthritis. Het is belangrijk om te differentiëren tussen een gewone arthritis en periarticulaire of oppervlakkige zwelling. Geiten die op stal worden gehouden, voornamelijk op harde ondergrond, ontwikkelen altijd een verharde, verdikte huid ter hoogte van de carpi, de hakken en het sternum, wat een gezwollen indruk kan geven. Geiten zijn ook gepredisponeerd voor carpale hygroma’s; dit zijn zachte, fluctuerende periarticulaire zwellingen aan het dorsale vlak van de carpi. Toch kan overvulling van de carpale bursa een van de eerste tekenen zijn van een arthritis geïnduceerd door CAEV en moet men toch alert blijven. Infectieuze oorzaken van arthritis omvatten CAEV en een groot aantal bacteriële agentia. De meest voorkomende zijn: Mycoplasma spp., Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Corynebacterium spp., Actinomyces spp. en coliformae. Polyarthritis in neonati of jonge geiten is meestal bacterieel en dan meestal ten gevolge van Mycoplasma spp. (DaMassa et al., 1992). Arthritis veroorzaakt door Chlamydia is een bekende oorzaak van arthritis bij schapen, maar er is geen sluitend bewijs dat dit ook bij geiten een belangrijke oorzaak is. Men moet zich realiseren dat al deze bovengenoemde infecties meestal met koorts gepaard gaan, terwijl bij infecties van het gewricht met CAEV de lichaamstemperatuur normaal blijft. Nutritionele en metabole oorzaken van gezwollen gewrichten zijn rachitis en nutritionele arthritis. Rachitis is een botaandoening die ontstaat door een tekort aan vitamine D en calcium, waarbij er een vergroting optreedt van de onvoldoende gecalcificeerde epifyses, resulterend in een gezwollen gewricht. Nutritionele arthritis is het gevolg van een overmaat aan calcium in het voeder en wordt voornamelijk gezien bij bokken gehouden op een geitenmelkerij, door onaangepaste voeding. Trauma aan de gewrichten is veelvoorkomend bij geiten vanwege hun vechtgedrag en hun drang om te klimmen en ontsnappen. Zwelling kan ook optreden secundair aan een avulsie van de pezen en ligamenten, dislocaties en hemartrose. Hoogdrachtige geiten ontwikkelen soms oedemateuze zwellingen rond de kogels, voornamelijk aan de achterpoten. Dit is waarschijnlijk te wijten aan circulatoire problemen en lost zich meestal vanzelf op na de partus. In een uitzonderlijk geval kan het geassocieerd worden met drachtigheidstoxemie. Degeneratieve osteoarthritis kan worden gezien, dan voornamelijk bij oude geiten of geiten met erge standafwijkingen (Smith, 2007a). 6.2

Differentiaal diagnose pneumonie

Virale pneumonie kan acuut of chronisch zijn. Mogelijke ziektenverwekkers van acute virale pneumonie zijn parainfluenza-type 3, adenovirus en het respiratoir syncitieel virus. Deze tasten vooral de lammeren aan. Chronische pneumonie kan veroorzaakt worden door CAEV 14

en in een zeldzaam geval door pulmonaire adenomatose, ook wel gekend als jaagziekte bij het schaap. Mycoplasma (verschillende species en subspecies), Chlamydia psitacci en Ricketssia kunnen ook een pneumonie veroorzaken. Bacteriële pneumonie wordt meestal veroorzaakt door Pasteurella multocida en Mannheimia hemolytica, welke beide onder normale omstandigheden ook aanwezig zijn in de bovenste luchtwegen van geiten. In de acute fase van een infectie met Pasteurella is er koorts en mucopurulente neus- en oogvloei. Lethargie, anorexie, dyspnee en pijnlijke hoest vervolledigen het ziektebeeld. Het heeft normaal een acuter verloop dan CAE (Midwinter et al., 1986). Corynebacterium pseudotuberculosis kan abcessen vormen in het longparenchym of in de mediastinale lymfeknopen, waardoor er zich een chronische pneumonie ontwikkeld. De incubatieperiode is lang. De klinische symptomen komen erg overeen met deze van CAE, namelijk dyspnee, inspanningsintolerantie en gewichtsverlies (Brown et al., 1985). In landen waar tuberculose nog voorkomt, moet ook aan een infectie met Mycobacterium bovis worden gedacht in de differentiaal diagnose. Recentelijk kan ook Q-koorts (Coxiella burnetii) als oorzaak worden toegevoegd. Pneumonie veroorzaakt door schimmels komen weinig voor bij geiten. Parasitair moet er gedacht worden aan longwormen, voornamelijk Dictyocaulus filaria. Hierbij is er in de prepatente periode polypnee; in de latere fase van een infectie ontwikkelt zich dyspnee. Deze dieren hebben wel een duidelijke eosinofilie. Wormen kunnen aangetoond worden met de Baerman techniek (Lloyd & Soulsby, 1978). Bij lammeren met erge coccidiose (Eimeria spp.) wordt er soms hoesten gezien. Leverbot (Fasciola hepatica, Fascioloides magna en Dicrocoelium dendriticum) kan ook occasioneel naar de longen migreren en daar letsels veroorzaken. Dit geeft echter een heel herkenbaar beeld op autopsie (Matthews, 2009b; Smith, 2007c). 6.3

Differentiaal diagnose encephalitis

Hierbij moet worden gedacht aan Listeria monocytogenes, Clostridium perfringens enterotoxemie, scrapie en rabiës (Matthews, 2009c). 6.4

Virusisolatie

Virusisolatie van CAEV kan worden gedaan op verschillende manieren. De eerste mogelijkheid, die ook het meest wordt gebruikt, is isolatie op celculturen van synoviaal cellen van de geit (Fibroblast-achtige synoviocyten - FAS culturen) (Daltabuit Test et al., 1999). Er werden perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) geïnoculeerd op capriene synoviaal celculturen. De PBMC werden gescheiden door middel van Ficoll-sodium diatrizoaat (1,077 x g) centrifugatie. De PBMC werden daarna op Mycoplasma-vrije geit FAS culturen geënt. Deze culturen waren gecultiveerd met Dulbecco-modified Eagle’s medium (DMEM), gesupplementeerd met 10% foetaal kalfserum, penicilline (100 U/ml), streptomycine 15

(100 mg/mL) en 2 µM L-glutamine. De monolagen werden tweemaal per week bekeken op cytopathisch effect en er werd elke twee weken een passage gemaakt totdat de karakteristieke reuzencellen (syncytia) verschenen (Figuur 11). Om te bevestigen dat het om CAEV ging werd een deel van het CAEV gag gen geamplificeerd met behulp van PCR.

Figuur 11: Capriene synoviaal membraancellen, gecocultiveerd met PBMC van een seropositieve geit. Let op de syncytiavorming (250x) (Uit: Daltabuit Test et al., 1999).

Ten tweede kan er ook gebruik worden gemaakt van foetale lam long (FLL) celculturen. Konishi et al. deden dit in 2004. De FLL celculturen werden bereid volgens standaard weefselcultuur methodes. Voor virusisolatie werden culturen gebruikt met Eagle’s minimum essential medium die minder dan vijf passages hadden ondergaan. De cellen werden hierin gecultiveerd, gesupplementeerd met 10% foetaal kalfserum. PBMC van seropositieve geiten 6

met arthritis werden op een concentratie van 1 x 10 /ml gebracht en toegevoegd aan FLL cellen. Naast PBMC werden er ook gewrichtsvocht en synoviaal cellen direct zonder voorbereiding op FLL cellen aangebracht. Vervolgens werden er een aantal passages gemaakt van deze FLL cellen. Ze werden bestudeerd op cytopathisch effect en syncitiavorming en er werd een PCR en indirecte immunofluorescentie gedaan om de CAEV infectie te bevestigen (Figuur 12) (Konishi et al., 2004).

16

Figuur 12: Syncytiavorming in een FLL cultuur geïnoculeerd met synoviaalvocht van een geit met arthritis. Beeld geeft een weergave van de cultuur na drie passages en is gekleurd met Giemsa (Uit: Konishi et al., 2004).

6.5 Serologie Serologie wordt routinematig gebruikt om CAEV te diagnosticeren. Er kan gebruik worden gemaakt van agar gel immunodiffusie (AGID), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoprecipitatie (RIPA) en western blotting (WB). In België en Nederland worden vooral de AGID test en de ELISA gebruikt (Matthews, 2009a). Agar gel immunodiffusie test – In de AGID test gebruikt men volledig virus dat men heeft geconcentreerd uit supernatans (de Andres et al., 2005). De gevoeligheid van deze test hangt af van welk antigeen er gebruikt wordt. Een test die gebruik maakt van het gp135 oppervlakteproteïne heeft een grotere sensitiviteit dan wanneer het p28 kernproteïne gebruikt wordt (Adams & Gorham, 1986). Vergeleken met RIPA, ELISA en WB heeft de AGID test een lage sensitiviteit (Knowles, 1997). Bovendien kan men met ELISA seroconversie eerder detecteren dan met een AGID (Saman et al., 1999). Tegenwoordig is de AGID test bijna geheel vervangen door de ELISA (Matthews, 2009a). ELISA – Er zijn meer dan 30 verschillende publicaties verschenen over de detectie van CAEV antistoffen (de Andres et al., 2005). De meeste hiervan zijn indirecte ELISAs, maar er zijn ook een aantal competitieve ELISAs gebruikmakend van monoklonale antistoffen beschreven. Bij de indirecte ELISAs wordt er zowel gebruik gemaakt van volledig virus of van recombinante proteïnen als antigenen (Saman et al., 1999). Uit al de onderzoeken is gebleken dat ELISAs die gebruik maken van volledig virus een betere sensitiviteit hebben. 17

Het is ook mogelijk om een ELISA uit te voeren op colostrum of melk. Meestal wordt er gebruik gemaakt van gepaarde sera (de Andres et al., 2005; Knowles, 1997). 6.6

PCR

Met behulp van de polymerase chain reactie (PCR) kan er al in een vroeg stadium CAEV infectie gedetecteerd worden. Dit omdat seroconversie pas laat optreedt (Rimstad et al., 1993). De moeilijkheid van PCR voor de detectie van CAEV is de variatie en de lage virustiters in vivo. De doelsequenties voor de primers liggen verspreid over het hele genoom en omvatten de LTR, en de gag, pol en env genen. De meeste studies gebruiken de PBMC 6

als doelcellen voor de PCR. Ondanks dat er maar 1x10 virushoudende cellen nodig zijn, mislukken de PCR assays soms omdat er weinig virus in de cellen aanwezig is (Peterhans et al., 1999). Zanoni et al., (1990) beschrijven PCRs gebaseerd op MVV gag primers en CAE pol primers. Hieruit bleek dat de pol primers superieur zijn aan de gag primers. In een latere studie bleek dat de primers gericht tegen de LTR sequentie nog beter waren (Zanoni et al., 1992). In 1993 beschrijven Reddy et al. een methode om CAEV te detecteren met behulp van PBMC, synoviaalvocht cellen (SVC) en melkcellen (MC). Hierbij werd er gebruikt gemaakt van zowel gag als pol primers. Door middel van centrifugatie werden er uit ofwel bloed, synoviaalvocht of melk respectievelijk PBMC, SVC of MC bekomen. Contaminerende erytrocyten in deze drie stalen werden verwijderd door ze te behandelen met een 0,85% ammonium chloride oplossing en daarna te wassen met PBS. De PBMC, SVC en MC werden 6

tot een concentratie van 6 x 10 cellen per ml gebracht en daarna gelyseerd gedurende 1 uur op 56 °C in een PCR bufferoplossing gesupplementeerd met 60 µg proteïnase K per ml. Primers en probes werden gemaakt op basis van de gepubliceerde sequentie van CAEV stammen (Tabel 2) (Saltarelli et al., 1990).

Tabel 2: Primers en probes gebruikt bij de amplificatie van CAEV (Uit: Reddy et al., 1993).

In zowel PBMC, SVC en MC werd CAEV gedetecteerd. Er werd hier ook vergeleken met de AGID test en hieruit bleek dat de sensitiviteit van de PCR op de PBMC 91% bedroeg. De specificiteit was 97%. De resultaten uit al deze studies wijzen uit dat PCR een lagere sensitiviteit heeft dan veel ELISAs, maar dat PCR wel veel eerder in staat is om CAEV te detecteren, namelijk al voor de seroconversie. Dit suggereert dat een combinatie van serologie en PCR de optimale benadering is om CAEV te detecteren. Op bedrijfsniveau kan dit betekenen dat geïnfecteerde maar nog seronegatieve geiten met PCR kunnen worden getest, om zo deze geiten al tijdig te kunnen elimineren (de Andres et al., 2005). 18

7.

Prevalentie

CAEV komt wereldwijd voor, maar wordt het meest gezien in landen waar er veel geitenmelkerij bedrijven zijn (Daltabuit Test et al., 1999). Over de prevalentie in Nederland en België zijn er tot op heden geen gegevens bekend. Wel zijn er in veel andere landen prevalentie studies uitgevoerd, waarvan hieronder een kort overzicht. 7.1

Europa

Bij de eerste studie die gedaan werd in Duitsland in 1983 waren 23 van de 73 (31,5%) onderzochte geiten seropositief (Straub, 1983). Bij een tweede prevalentie onderzoek in 1991 waren 57 van de 426 onderzochte serumstalen (13,4%) seropositief. Er waren kleine significante rasverschillen, waarbij een geringere prevalentie bij de Witte Duitse Edelgeit werd vastgesteld (Truyen et al., 1991). In Frankrijk zag men een stijging van de seroprevalentie van 61% in 1987 met 23,4% in 1995 (Saunders, 1998). In Italië werd in 1985 de seroprevalentie onderzocht en bedroeg toen 34% (Straub, 2008). In een later onderzoek in Zuid-Tirol in Italië werd er een grootschalig prevalentie onderzoek opgezet waarbij 24% van de geiten CAEV-positief bleek. Er werden geen significante gelachts- of rasverschillen vastgesteld (Gufler et al., 2007). In Noorwegen werd in 1997 een seroprevalentie van 45% vastgesteld (Nord, 1997). In Oostenrijk werden in 1990 390 geiten uit 45 bedrijven onderzocht. Hiervan waren er 48 geiten seropositief voor CAEV (12,3%). Voornamelijk Saanen geiten en de Bonte Duitse Edelgeit bleken gevoelig. De hoogste prevalentie lag boven de 50% binnen 5 bedrijven (Schöpf & Schönbauer, 1990). Polen importeert veel geiten uit Frankrijk, met als gevolg een hoge seroprevalentie van 84%, waar de inheemse seroprevalentie maar 15% bedroeg (Platt-Samoraj et al., 2003). In Zwitserland zijn ze erg actief geweest in het prevalentie onderzoek naar CAEV. Bij een onderzoek waren 42% van de 5974 geiten seropositief. Bij 20-30% waren arthritis en mastitis de voornaamste ziektebeelden (Krieg & Peterhans, 1990). In Spanje werden er in 1998 bij 12,1% uit de 2513 onderzochte lacterende geiten antistoffen aangetoond tegen CAEV (Contreras et al., 1998). In het Verenigd Koninkrijk is er in 1985 een prevalentiestudie verricht onder 330 veestapels met in totaal 2792 geiten. Daarvan waren er 120 (4,3%) seropositief, waarvan de grootste besmetting werd gezien in Engeland, en veel minder in Schotland en Wales (Straub, 2008).

19

7.2

Verenigde Staten

In 196 bedrijven verdeeld over 28 staten waren in 1992 van de 3790 geiten 31% seropositief (Cutlip et al., 1992). In een Californische studie in 1992 waren er van de 2777 geiten 54,7% seropositief, waarbij de Bonte Edelgeit duidelijk minder vaak besmet was dan de Saanen geit en de Toggenburger geit (Rowe et al., 1992). 7.3

Canada

In 53 Canadese bedrijven waren van de 3228 geiten 82,5% van de melkgeiten en 2,7% van de Angorageiten seropositief (Belanger & Leboeuf, 1993). 7.4

Mexico

In een studie die is uitgevoerd in Mexico in 1985 varieerde de seroprevalentie onder de geïmporteerde geiten van 17% tot 35%, met een gemiddelde van 27%. Er was geen infectie van inheemse geiten (Daltabuit Test et al., 1999). 7.5

Brazilië

Binnen de intensieve geitenhouderij bedroeg de seroprevalentie in 2001 31,8%, waar er bij extensief gehouden geiten een seroprevalentie was van slechts 13,1% (Lamara et al., 2001). 8.

Behandeling

Er bestaat geen behandeling voor geiten besmet met CAEV. Dieren met milde symptomen van arthritis kunnen het comfortabeler gemaakt worden door een goede klauwverzorging en een zachte bedding. Eventueel kan er gebruik worden gemaakt van orale analgesie, zoals aspirine of fenylbutazone. Aspirine kan gegeven worden aan een dosis van 100 mg/kg elke 12 uur en fenylbutazone aan 10 mg/kg eenmaal daags. Bij gewichtsverlies moet er voeder worden voorzien van hogere kwaliteit en met een betere verteerbaarheid. Bij geiten met erge klinische symptomen is euthanasie de enige uitweg (Phelps & Smith, 1993). 9.

Economisch belang

Tot nu toe werd altijd aangenomen dat economische verliezen ten gevolge van infectie met CAEV significant waren. Er is echter weinig en vooral incomplete informatie over dit aspect van de ziekte. Dit is voornamelijk ten gevolge van de vele factoren die erbij komen kijken. De moeilijkheid om de economische verliezen in te schatten komt onder andere doordat enkel 30% van de geïnfecteerde dieren ziekteverschijnselen vertonen, ondanks een groot aantal 20

dragers. Hierdoor is het moeilijk de ziekte te eradiceren. Ziekteverschijnselen en economische verliezen zijn gerelateerd aan de seroprevalentie en deze worden in subklinisch besmette bedrijven niet gedetecteerd en dus niet ingecalculeerd. Het is wel gekend dat bepaalde uitbatingsomstandigheden, zoals intensieve geitenhouderij, resulteren in een grotere prevalentie van CAEV door het intensievere contact tussen de dieren. Ook de ziekteverschijnselen worden beïnvloed door de manier van huisvesting en de geografische ligging van bedrijven. Toch zijn er een aantal parameters waarop men zich kan baseren, namelijk de melkproductie en het geboortegewicht (Peterhans et al., 2004). 9.1

Melkproductie

De melkproductie kan ten gevolge van de induratieve mastitis dalen met 10%. Precieze data zijn niet gekend, omdat de melkproductiecijfers bij kleine herkauwers veel minder nauwkeurig worden bijgehouden dan bij melkkoeien (Krieg & Peterhans, 1990). Recentelijk werd onderzocht wat de mogelijke impact was van CAEV op de kwaliteit van de melk. Uit dit onderzoek bleek dat er bij CAEV positieve dieren niet meer bacterieel gecompliceerde mastitiden voorkwamen dan bij CAEV negatieve dieren. Het celgetal bleek niet beïnvloed te worden door CAEV besmetting (Leitner et al., 2009). 9.2

Geboortegewicht

Er is aangetoond dat met CAEV geïnfecteerde geiten jongen werpen met een lager geboortegewicht en dat deze jongen later zelf ook een lagere melkproductie hebben. Bovendien hebben besmette jongen een geringere gewichtstoename (Greenwood et al., 1995). 10.

Controle en Bestrijding

Voor een efficiënte preventie en controle is het belangrijk om een vroege diagnose te stellen. Diagnose kan beter niet gebaseerd zijn op klinische waarnemingen, aangezien symptomen pas laat verschijnen en er zoals eerder beschreven een groot aantal gelijkaardige aandoeningen zijn. Het is daarom beter om antistoffen en/of virus te detecteren. Met periodieke serologische testen kan men de prevalentie bekijken en kan men het bedrijf monitoren. Geiten worden het best elk half jaar getest. Testen aan het begin van het lammerenseizoen is handig met het oog op het management (Reina et al., 2008). Vaccineren tegen CAEV wordt momenteel niet gedaan. Een geattenueerd CAE virus werd reeds getest, maar dit had weinig succes (Pepin et al., 1998). Immunisatie met virale klonen, genetisch gemodificeerd virus of recombinante plasmiden zijn meer recente alternatieven

voor

klassieke

immunisatie.

Wanneer

men

geiten

immuniseert

met

recombinante plasmiden met env, tat, interferon (IFN)-γ, of interleukine (IL)-12 genen, 21

verkrijgt men een goede T-helpercel respons en bescherming tegen CAEV (Cheevers et al., 2001; Cheevers et al., 2003). Daarentegen resulteerde immunisatie met Gag-peptide (dat Tcel epitopen bevatte) in hogere provirus-spiegels na experimentele besmetting (Nenci et al., 2007). Immunisatie met genetisch gemodificeerd CAEV (modificatie en/of deletie in de vif, tat en dUTPase genen) zorgde voor een verlaging van de virustiter en verminderde het voorkomen van letsels. Infectie met virus of proviraal DNA met een tat-deletie zorgde voor een persisterende infectie, maar gaf wel bescherming na experimentele besmetting met pathogeen CAEV (Harmache et al., 1998). Tot dusver zijn immunsatiestrategieën niet erg succesvol gebleken, ondanks dat ze vaak wel voor behoorlijke bescherming zorgen. Ze vinden nog geen toepassing in de huidige geitenhouderij. Een mogelijke oorzaak hiervan zou de hoge kostprijs kunnen zijn. Totale eradicatie van CAEV zou een optie kunnen zijn in het controleren van CAEV. Voor het Maedi-Visna virus zijn er al een groot aantal Europese landen die een succesvol eradicatieprogramma hebben uitgevoerd (Reina et al., 2008). Voordeel van eradicatie is dat wanneer de prevalentie laag gehouden wordt, er minder klinische gevallen optreden en productieverlies dus voorkomen wordt. Bovendien verbetert hierdoor het dierenwelzijn en wordt er bespaard op dierenartskosten. In kleine bedrijven is het mogelijk om te saneren, wat wil zeggen dat men alle seropositieve dieren opruimt en vervangt door seronegatieve dieren. Ook wordt aangeraden dan het nageslacht van de seropositieve moederdieren op te ruimen, tenzij deze nog geen colostrum hebben opgenomen (Berriatua et al., 2003). Er kan ook voor worden gekozen om seropositieve en seronegatieve geiten apart op te stallen. Dit is echter bedrijfstechnisch niet altijd mogelijk (MacKenzie et al., 1987; Reina et al., 2008). Een aardig efficiënte en daarmee ook de meest gebruikte methode is de CAEV vrije opfok. Het doel is om blootstelling van de lammeren aan het virus te voorkomen. Dit kan worden gedaan door lammeren te scheiden van de moederdieren meteen na de geboorte, dus voor ze colostrum kunnen opnemen. Ze worden vervolgens totaal gescheiden en geïsoleerd van de moeder opgevoed. Ze moeten rundercolostrum of colostrum van nietgeïnfecteerde geiten krijgen (Reina et al., 2008).

22

DEEL 2: EIGEN ONDERZOEK 1.

Inleiding

Er is nog veel ruimte voor verbetering van de diagnostiek, preventie en behandeling van CAEV. Meer nog, prevalentiegegevens in onze regio’s ontbreken. Door het chronische karakter van deze ziekte heeft zij ernstige repercussies op de geitenhouderij. Om CAEV te isoleren kan men gebruik maken van synoviaal celculturen of foetale lam long celculturen. Hiervan is de eerste de meest courante. In dit onderzoek wordt er getracht een eigen capriene synoviaal celcultuur te bekomen voor diagnostische doeleinden. Bovendien is het wenselijk een cultuur voor handen te hebben waarmee verder onderzoek kan worden gedaan naar CAEV. Daarom is er in dit onderzoek geprobeerd een celcultuur te ontwikkelen van synoviaal cellen geëxtraheerd uit de carpus van net geslachte geiten. Het doel voor mij als student is het aanleren van een aantal laboratoriumtechnieken in het kader van de Masterproef, met als gewenst resultaat het succesvol opzetten van een synoviaal celcultuur. Voor CAEV (en MVV) zijn er primaire of secundaire celculturen nodig voor isolatie (Hotzel et al., 1993). De eerste isolatie van CAEV werd gedaan met behulp van een explant van een synoviaalmembraan van een geit met arthritis (Crawford et al., 1980). Het maken en onderhouden van primaire en secundaire celculturen is vaak moeilijk en arbeidsintensief en het aantal passages is beperkt (Costa et al., 2005). Het synoviaalmembraan is een complex gespecialiseerd weefsel bestaande uit een heterogene celpopulatie, acellulair stroma, zenuwen, lymfebanen en bloedvaten. Het aflijnende oppervlak is opgebouwd uit een mix van macrofagen en fibroblast-achtige synoviocyten (FAS) en is ongeveer vier cellagen dik. Onder deze aflijning bevindt zich een losmazig stroma. In vergelijking met andere aflijnende oppervlakten, zoals epitheel of endotheel, waar de integriteit wordt behouden door sterke juncties en interacties tussen de cellen, zijn er in het synoviaalmembraan eerder discrete en discontinue regio’s van contact, met grote intercellulaire ruimtes. Bovendien ontbreekt er een cellulaire basaalmembraan. Kort gezegd kan men stellen dat het synoviaalmembraan is opgebouwd uit dens opeengepakte cellen binnenin een netwerk van dense extracellulaire matrix. De FAS zijn de belangrijkste spelers bij het in stand houden van de synoviale extracellulaire matrix. Histochemische studies hebben uitgewezen dat de FAS matrixcomponenten produceren, zoals fibronectine, collageen, laminine, tenascine en proteoglycanen. Ook brengen de FAS een aantal integrinen aan hun oppervlakte tot expressie, zoals α5β1 en αVβ3. Daarenboven produceren de FAS ook proteasen, welke nodig zijn voor matrix-remodellering en cellulaire beweging; dit zijn onder andere cathepsines, serineproteasen en matrix metalloproteinases (MMPs). De FAS produceren ook het synoviaalvocht en het hierin aanwezige hyaluronzuur en lubricine. De

23

functie van de FAS is dus anders dan die van gewone fibroblasten (Barland et al., 1962; Kiener et al., 2010). In geval van ziekte kan het synoviaalmembraan enorm hyperplastisch worden en bot en kraakbeen invaderen. De FAS, maar ook macrofagen, zijn verantwoordelijk voor deze weefselhyperplasie. In geval van inflammatoire arthritis is nu bekend dat de FAS niet simpel passief reageren op inflammatie (aangetrokken door leukocyten), maar dat zij actief deelnemen aan de ontsteking (Kiener et al., 2010). In vivo heeft CAEV tropisme voor de cellen van het synoviaalmembraan, maar ook kan het worden gevonden in veel andere weefsels zoals hersenen, long, nier en milt (Adams et al., 1980b). Naast het opstellen van een FAS cultuur wordt er in dit onderzoek geprobeerd om een endotheel celcultuur op te zetten, aangezien Jan et al. (2000) zagen dat ook endotheelcellen van de aorta van een schaap succesvol te infecteren waren met CAEV. Endotheelcellen kunnen door veel verschillende soorten virussen geïnfecteerd worden, waardoor hun adhesieve eigenschappen aangetast kunnen worden. HIV-1 (Bagasra et al., 1996) en het cytomegalovirus (Sinzger et al., 1995) kunnen worden gevonden in de endotheelcellen van geïnfecteerde patiënten. SIV kan in vitro endotheelcellen van apen infecteren en is aanwezig in de endotheelcellen van besmette apen (Mankowski et al., 1994). Ruminante endotheelcellen zijn in vitro al succesvol geïnfecteerd met het Blauwtong virus (Russell et al., 1996) en de endotheel celculturen van schapen brengen reverse transcriptase tot expressie na infectie met het Maedi-Visna virus (Craig et al., 1997). Endotheelcellen worden door een infectie geactiveerd, wat zich uit door de verhoogde expressie van adhesiemoleculen en MHC klasse II antigenen. Dit is aangetoond door infectie van humane endotheelcellen met het West-Nijl virus. Bovendien zijn geactiveerde endotheelcellen in staat om verschillende cytokines en chemokines tot expressie te brengen, waaronder IL-1, IL-6 en IL-8, waarvan wordt vermoed dat ze het gedrag van leukocyten beïnvloeden (Chen & Manning, 1996). 2.

Materiaal en methoden

2.1

Isolatie

Bereiding van het medium DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) (Invitrogen, Paisley, Verenigd Koninkrijk) gesupplementeerd met 10% foetaal kalfserum (FKS) (Greiner, AR Alphen aan den Rijn, Nederland), 1 µg/mL glutamine (VWR, AP Amsterdam, Nederland), 1 µg/mL gentamycine (Invitrogen), 1000 U/mL penicilline (Certa, Braine l’Alleud, België), 1 mg/L streptomycine (Continental Pharma, Puurs, België), 1 µg/mL niet-essentiele aminozuren (Invitrogen) en 1 µg/mL natriumpyruvaat (Invitrogen). 24

Synoviaal celcultuur creëren op basis van een gewrichtspoeling met collagenase Door het puncteren van het carpaalgewricht werd geprobeerd, met behulp van collagenase, de synoviaal cellen uit het gewricht te ‘spoelen’, om deze vervolgens in cultuur te brengen. De voorpoten van de pas geslachte geiten, afgezet net boven het carpaalgewricht, werden op ijs van het slachthuis naar het labo vervoerd. In het labo werd de poot gevild. De carpus werd gescrubd met Hibiscrub en nagespoeld met ethanol op de plaats waar de punctie werd uitgevoerd (Figuur 13a,b). Hierbij werd er veel aandacht besteed aan de steriliteit.

Figuur 13a: Punctieplaatsen

Figuur 13b: Gewrichtsblindzakken carpus.

carpaalgewrichten (Uit: Gheorghe, 2001).

4,5,6:

proximale,

mediale

en

distale

blindzak. 7,8: gewrichtskapsel (Uit: Nickel, 1984).

De proximale blindzak (Figuur 13a,b) werd gepuncteerd met een 18G naald en een kleine hoeveelheid synoviaalvocht werd gepreveleerd. Dit vocht werd al een keer onder de microscoop bekeken om te kijken wat er als ‘startpopulatie’ aan cellen aanwezig was. Via deze naald werd collagenase aan een concentratie van 0.1 g/ 50 ml ingespoten. Deze concentratie werd bekomen door het collagenase te verdunnen in DMEM. Dit collagenase heeft 10 minuten kunnen inwerken bij 37°C (waarbij ondertussen de poot werd gemanipuleerd, zodat de ingebrachte collagenase oplossing egaal in het gewricht verspreid werd). Na 10 minuten werd de proximale blindzak gepuncteerd en werd de collagenase daaruit geaspireerd en in een centrifugeerbuis overgebracht. Onmiddellijk werd via dezelfde naald opnieuw collagenase ingebracht in de proximale blindzak. De gehele procedure werd zo driemaal herhaald, zodat er drie stalen werden verkregen; 10 minuten, 20 minuten en 30 minuten. Ook werd er een staal gemaakt van alleen gewrichtsvocht, zonder dat daar 25

collagenase op ingewerkt had. Dit staal werd 0 minuten genoemd. Alle bekomen stalen werden 10 minuten gecentrifugeerd aan 1300 toeren per minuut (tpm). De bovenstaande vloeistof werd eraf gehaald en de pellet werd geresuspendeerd in 1 ml medium. Dit werd in een 5 ml celcultuur flesje geplant met nog 4 ml medium. De flesjes gingen in de broedstoof bij 37 °C, 5% CO2. Deze procedure werd uitgevoerd met twee voorpoten, zodat er meerdere culturen werden verkregen met verschillende inwerkingsduur van de collagenase. Endotheel celcultuur creëren vertrekkende van de a. mediana

De arterie (a.mediana) werd vrij geprepareerd uit de voorpoot van de geslachte geit. De arterie werd tweemaal grondig gespoeld met lichaamswarme witte PBS door met een 24G naald het lumen door te spoelen. Vervolgens werd de arterie in medium geplaatst en werd er collagenase (0,1 g/50 ml) met een 24G naald in het lumen van de arterie gebracht, todat het er aan de andere kant uitliep. De arterie werd dan distaal afgeklemd en opgevuld met collagenase en vervolgens ook proximaal afgeklemd. De klemmen bleven 5 minuten ter plaatse, terwijl de gehele arterie in medium werd gehouden in de flow. Vervolgens werden de klemmen verwijderd en werd de gehele arterie in een petrischaatje nog 5 minuten geïncubeerd bij 37 °C. Daarna werd het medium in het petrischaaltje verzameld en werd het lumen van de arterie nog tweemaal gespoeld met medium. Dit spoelvocht werd ook opgevangen. Het verzamelde vocht werd gecentrifugeerd aan 1300 tpm gedurende 10 minuten. De verkregen pellet werd geresuspendeerd in 1 ml medium. Dit ging in een kleine cultuurfles in de broedstoof bij 37 °C. Dezelfde arterie werd onmiddellijk nogmaals op dezelfde manier behandeld met collagenase en onderging nogmaals deze hele procedure zodat er twee stalen werden verkregen; bij de eerste heeft de collagenase 10 minuten kunnen inwerken, bij de tweede 20 minuten. Na één dag werden de celculturen van zowel de synoviaal cellen als de endotheelcellen gewassen met rode PBS en voorzien van nieuw medium, dit om resterende celdebris en loshangende cellen te verwijderen. Verder werd er onder de microscoop gekeken of er al enig teken van vastgehechte, delende cellen te zien was. Op dag 5 werden de celculturen opnieuw voorzien van nieuw medium. Splitsen FAS culturen Op dag 7 werd iedere FAS celcultuur gewassen met 3 ml lichaamswarme witte PBS. Na het wassen werd iedere celcultuur gesplitst met 1 % versene, 10% trypsine in witte PBS. Dit ging 5 minuten in de broedstoof bij 37 °C, 5% CO2. Regelmatig werd er zacht geschud en getikt tegen de flessen. De verkregen celsuspensie werd in een centrifugeerbuis met 2 ml foetaal kalfserum gebracht. Dit werd 10 minuten gecentrifugeerd aan 1300 tpm. Na het centrifugeren werd de bovenstaande vloeistof afgezogen en de pellet geresuspendeerd in 1 ml medium. Dit werd overgebracht in een cultuurfles van 25 ml en aangelengd met 24 ml medium. De flessen 26

gingen weer in de broedstoof bij 37 °C, 5% CO2. Deze culturen werden weer bekeken onder de microscoop op dag 9. 2.2

Karakterisatie

Merkers FAS Karakterisatie van de FAS gebeurt meestal door een morfologische karakterisatie (Hotzel, 1993). Om deze cellen verder te karakteriseren werd er gebruik gemaakt van merkers. Zoals eerder vermeld zijn er twee celtypen van belang in het synoviale membraan; FAS en macrofagen. Verder moet er rekening worden gehouden dat er mogelijks door de punctie doorheen de huid en bindweefsel er enkele epitheliale cellen in het aspirant terecht zijn gekomen. Een eerste merker die gebruikt werd om onderscheid te maken tussen cellen van epitheliale oorsprong en mesenchymale oorsprong is vimentine. Het monoklonaal muis anti-vimentine antilichaam lokaliseert vimentine in cellen van mesenchymale oorsprong, bijvoorbeeld fibroblasten en endotheelcellen. Vimentine is een 57 kDa intermediair filamenteiwit (IF); deze eiwitten vormen een deel van het cytoskelet van cellen van vertebraten. Er zijn vijf klassen van IFs die negen groepen omvatten; vimentine behoort tot klasse III en vertoont een hoge mate van specificiteit voor cellen van mesenchymale oorsprong. Van de celtypespecificiteit die elk subtype van de IFs vertoont werd oorspronkelijk gedacht dat deze behouden bleef in maligne cellen; daardoor waren IFs belangrijk als diagnostische markers in de histogenese. Er is echter gebleken dat er sprake is van coëxpressie van intermediaire filamenten, met name vimentine en cytokeratine, in diverse normale cellen en weefsels. Via immunocytochemie werd aangetoond dat het antilichaam een kruisreactie vertoont met de vimentine-equivalente eiwitten van onder andere mensen, koeien, honden, hamsters en paarden (Bohn et al., 1992; Osborn et al., 1984). Een tweede merker, DH59B, werd gebruikt om cellen van de macrofaag/monocyt cellijn uit te sluiten. Deze monoklonale antistof is gericht tegen CD172a, aanwezig op onder andere macrofagen en monocyten. Voor de kleuring werden de cellen uit de stikstof gehaald en weer in cultuur gebracht in een 5 ml fles. Nadat er zich een monolaag had gevormd werden de cellen gesplitst en geplant op inserts in een 24-well plaat. De cellen werden één dag geïncubeerd bij 37 °C, waarna ze 10 minuten werden gefixeerd met paraformaldehyde 4%. Om de celmembranen permeabel te maken werden de cellen gedurende 2 minuten behandeld met Triton X (Sigma). Voor de vimentine kleuring werd een 1/100 verdunning gemaakt van monoklonaal antivimentine antilichaam (geproduceerd in muizen) (Sigma Aldrich, St. Louis, USA), die gedurende één uur op de cellen werd gebracht. Na één uur werden de cellen gewassen met lichaamswarme witte PBS en werd er secundair gekleurd met goat-α-mouse FITC (groen) (verdunning 1/100) (VMRD, Pullmann, USA). Voor de macrofaag kleuring werd er een 1/10 27

verdunning gemaakt van monoklonaal antilichaam DH59B (geproduceerd in muizen) (VMRD). Dit werd ook gedurende één uur op de cellen gebracht, waarna er werd gewassen met lichaamswarme witte PBS en secundair gekleurd met goat-α-mouse TR (rood) (verdunning 1/50) (Invitrogen). Verder werd er een isotype controle meegenomen met inserts met daarop de FAS, die primair werden behandeld met een irrelevante antistof, namelijk mouse-α-collageen VII (Abcam, Cambridge, UK). Deze werden dan secundair weer gekleurd met de beide secundaire antistoffen (FITC en TR). Ook werden alle inserts gekleurd met Hoechst (blauw) (verdunning 1/100) (Invitrogen) om de nuclei zichtbaar te maken. Als positieve controle voor de vimentine kleuring werd een coupe van de trachea van een rund gekleurd met vimentine. Er werd ook één insert met macrofagen gebruikt om een positieve controle te doen voor de DH59B kleuring. Endotheel Om specifiek endotheel te kleuren kan er gebruik gemaakt worden van de Von Willebrand factor merker. Aangezien er enkel werd verder gewerkt met FAS (zie resultaten), zal hier niet verder op worden ingegaan. 3.

Resultaten

3.1

Isolatie

FLS Na één dag in de broedstoof bij 37 °C, 5% CO2 werd er gekeken naar de verkregen celpopulatie. Bij alle stalen waren langgerekte cellen te zien en hier en daar was er duidelijk sprake van mitose (celeilanden te zien). Er werd al vrij snel een vrij homogene celpopulatie bekomen. Er werd geen duidelijk verschil waargenomen tussen de verschillende inwerkingstijden van de collagenase (Figuur 14 ). Ter controle werd er een staal genomen van het gewrichtsvocht, zonder collagenase. Na zeven dagen werd er, voordat de cellen werden gesplitst, gekeken onder de microscoop. De celpopulatie was talrijker en homogener geworden en had een monolaag gevormd. De morfologie van de cellen lijkt erg op die van fibroblasten (Figuur 15). In totaal zijn er negen passages gemaakt, waarna de cellen in vloeibare stikstof werden ingevroren.

28

Figuur 14: Dag 1

Figuur 15: Dag 7 Endotheelcellen Bij de endotheelcellen was het moeilijker om cellen op te sporen in de fles. Daar waar er al een vrij groot aantal cellen te vinden was bij de synoviaal celcultuur, waren er vrij weinig endotheelcellen te vinden (Figuur 16). De cellen die er gevonden zijn leken zich te elongeren. Omdat er na een week geen groei meer te zien was in de endotheel celcultuur werd deze niet verder gesplitst. Er werd besloten om enkel verder te werken met de FAS.

Figuur 16: Dag 1, endotheelcellen

29

3.2

Karakterisatie

VIMENTINE

DH59B

Fig.17: Positieve controle vimentine.

Fig. 18: Positieve controle macrofagen DH59B

Trachea van een rund.

kleuring

Fig.19: FLS gekleurd met vimentine.

Fig. 20: FLS gekleurd met DH59B.

Fig. 21: Isotype controle vimentine.

Fig. 22: Isotype controle DH59B.

Uit de kleuring blijkt dat de FAS positief kleuren voor vimentine (Figuur 19). De DH59B kleuring mocht niet positief zijn, aangezien dat zou betekenen dat de celcultuur bestond uit macrofagen in plaats van cellen van fibroblast-achtige synoviocyten (FAS). Deze kleurde 30

negatief (Figuur 20). Beide positieve controles, zowel voor de vimentine als de DH59B zijn positief (Figuur 17, 18). De isotype controles kleurden niet, wat bevestigt dat de kleuring specifiek is (Figuur 21, 22). 4.

Besluit

In dit onderzoek blijkt dat het mogelijk is om een celcultuur van fibroblast-achtige synoviocyten (FAS) op te stellen. De morfologische eigenschappen van de cellen en de kleuringen bevestigen dat het gaat om cellen van mesenchymale oorsprong en meer nog dat het geen cellen van de monocyt/macrofaaglijn betreffen. Wat nog niet onderzocht is, is de gevoeligheid van de celcultuur voor het CAE virus. Het zou interessant zijn om in een verder onderzoek te kijken of de celcultuur ook daadwerkelijk geïnfecteerd kan worden met het virus. Mocht dit een succes zijn dan beschikken we over een diagnostisch middel voor de toekomst.

31

5.

Referenties

Adams, D. S., Crawford, T. B., Banks, K. L., McGuire, T. C. & Perryman, L. E. (1980a). Immune responses of goats persistently infected with caprine arthritis-encephalitis virus. Infection and immunity 28, 421-427. Adams, D. S., Crawford, T. B. & Klevjer-Anderson, P. (1980b). A pathogenetic study of the early connective tissue lesions of viral caprine arthritis-encephalitis. The American journal of pathology 99, 257-278. Adams, D. S. & Gorham, J. R. (1986). The gp135 of caprine arthritis encephalitis virus affords greater sensitivity than the p28 in immunodiffusion serology. Research in veterinary science 40, 157-160. Bagasra, O., Lavi, E., Bobroski, L., Khalili, K., Pestaner, J. P., Tawadros, R. & Pomerantz, R. J. (1996). Cellular reservoirs of HIV-1 in the central nervous system of infected individuals: identification by the combination of in situ polymerase chain reaction and immunohistochemistry. AIDS (London, England) 10, 573-585. Barland, P., Novikoff, A. B. & Hamerman, D. (1962). Electron microscopy of the human synovial membrane. The Journal of cell biology 14, 207-220. Belanger, D. & Leboeuf, A. (1993). CAE virus seroprevalence in a mixed goat herd. The Veterinary record 133, 328. Berriatua, E., Alvarez, V., Extramiana, B., Gonzalez, L., Daltabuit, M. & Juste, R. (2003). Transmission and control implications of seroconversion to Maedi-Visna virus in Basque dairy-sheep flocks. Preventive veterinary medicine 60, 265-279. Bohn, W., Wiegers, W., Beuttenmuller, M. & Traub, P. (1992). Species-specific recognition patterns of monoclonal antibodies directed against vimentin. Experimental cell research 201, 1-7. Brodie, S. J., de la Concha-Bermejillo, A., Koenig, G., Snowder, G. D. & DeMartini, J. C. (1994). Maternal factors associated with prenatal transmission of ovine lentivirus. The Journal of infectious diseases 169, 653-657. Brown, C. C., Olander, H. J., Biberstein, E. L. & Moreno, D. (1985). Serologic response and

lesions

in

goats

experimentally

infected

with

Corynebacterium

pseudotuberculosis of caprine and equine origins. American journal of veterinary research 46, 2322-2326. Campbell, R. S. & Robinson, W. F. (1998). The comparative pathology of the lentiviruses. Journal of comparative pathology 119, 333-395. Chebloune, Y. K., B.M. ; Karr, B.M. ; Singh, D.K. ; Narayan, O. (1999). Persistant Viral Infections. John Wiley & Sons Ltd., New York. Chapter 15, 347-362. Cheevers, W. P., Beyer, J. C. & Hotzel, I. (2001). Plasmid DNA encoding caprine interferon gamma inhibits antibody response to caprine arthritis-encephalitis virus (CAEV) surface protein encoded by a co-administered plasmid expressing CAEV env and tat genes. Vaccine 19, 3209-3215. 32

Cheevers, W. P., Snekvik, K. R., Trujillo, J. D., Kumpula-McWhirter, N. M., Pretty On Top, K. J. & Knowles, D. P. (2003). Prime-boost vaccination with plasmid DNA encoding caprine-arthritis encephalitis lentivirus env and viral SU suppresses challenge virus and development of arthritis. Virology 306, 116-125. Chen, C. C. & Manning, A. M. (1996). TGF-beta 1, IL-10 and IL-4 differentially modulate the cytokine-induced expression of IL-6 and IL-8 in human endothelial cells. Cytokine 8, 58-65. Contreras, A., Corrales, J. C., Sanchez, A., Aduriz, J. J., Gonzalez, L. & Marco, J. (1998). Caprine arthritis-encephalitis in an indigenous Spanish breed of dairy goat. The Veterinary record 142, 140-142. Costa, U. M., Reischak, D., da Silva, J. & Ravazzolo, A. P. (2005). Establishment and partial characterization of an ovine synovial membrane cell line obtained by transformation with Simian Virus 40 T antigen. Journal of virological methods 128, 7278. Craig, L. E., Nealen, M. L., Strandberg, J. D. & Zink, M. C. (1997). Differential replication of ovine lentivirus in endothelial cells cultured from different tissues. Virology 238, 316326. Crawford, T. B., Adams, D. S., Cheevers, W. P. & Cork, L. C. (1980). Chronic arthritis in goats caused by a retrovirus. Science 207, 997-999. Cutlip, R. C., Lehmkuhl, H. D., Sacks, J. M. & Weaver, A. L. (1992). Prevalence of antibody to caprine arthritis-encephalitis virus in goats in the United States. Journal of the American Veterinary Medical Association 200, 802-805. Daltabuit Test, M., de la Concha-Bermejillo, A., Espinosa, L. E., Loza Rubio, E. & Aguilar Setien, A. (1999). Isolation of caprine arthritis encephalitis virus from goats in Mexico. Canadian journal of veterinary research = Revue canadienne de recherche veterinaire 63, 212-215. DaMassa, A. J., Wakenell, P. S. & Brooks, D. L. (1992). Mycoplasmas of goats and sheep. Journal of Veterinary Diagnostic Investigations 4, 101-113. de Andres, D., Klein, D., Watt, N. J., Berriatua, E., Torsteinsdottir, S., Blacklaws, B. A. & Harkiss, G. D. (2005). Diagnostic tests for small ruminant lentiviruses. Veterinary microbiology 107, 49-62. East, N. E., Rowe, J. D. , Dahlberg, J.E. , Theilen, G.H. , Pedersen, N.C. (1993). Modes of transmission of caprine arthritis-encephalitis virus infection. Small Ruminant Research 10, 251-262. Ellis, T. M., Robinson, W. F. & Wilcox, G. E. (1988). The pathology and aetiology of lung lesions in goats infected with caprine arthritis-encephalitis virus. Australian veterinary journal 65, 69-73. Gheorghe, M. C. (2001). Guide to regional ruminant anatomy based on the dissection of the goat. Iowa State University Press.Chapter 8, p182.

33

Greenwood, P. L., North, R. N. & Kirkland, P. D. (1995). Prevalence, spread and control of caprine arthritis-encephalitis virus in dairy goat herds in New South Wales. Australian veterinary journal 72, 341-345. Grego, E., Lacerenza, D., Arias, R. R., Profiti, M. & Rosati, S. (2009). Serological characterization of the new genotype E of small ruminant lentivirus in Roccaverano goat flocks. Veterinary research communications 33 Suppl 1, 137-140. Gufler, H., Zambotto, P. & Baumgartner, W. (2007). Goat population and riskfactors associated with caprine arthritis encephalitis virus infection in South-Tyrol, Italy. Veterinary Medicine Austria 94, 48-52. Harmache, A., Vitu, C., Guiguen, F., Russo, P., Bertoni, G., Pepin, M., Vigne, R. & Suzan, M. (1998). Priming with tat-deleted caprine arthritis encephalitis virus (CAEV) proviral DNA or live virus protects goats from challenge with pathogenic CAEV. Journal of virology 72, 6796-6804. Horzinek, M. C. (1990a). Virus Infections of Ruminants. Elsevier Science & Technology. Chapter 41, p441-452. Horzinek, M. C. (1990b). Virus Infections of Ruminants. Elsevier Science & Technology. Chapter 41, p441-442. Hotzel, I., Bastos Ede, S., Ravazzolo, A. P. & Moojen, V. (1993). Caprine arthritisencephalitis virus: isolation and identification in Rio Grande do Sul, Brazil. Brazilian journal of medical and biological research = Revista brasileira de pesquisas medicas e biologicas / Sociedade Brasileira de Biofisica [et al 26, 1175-1179. Jan, C. L., Greenland, T., Gounel, F., Balleydier, S. & Mornex, J. F. (2000). Activation of small ruminant aortic endothelial cells after in vitro infection by caprine arthritis encephalitis virus. Research in veterinary science 69, 225-231. Kiener, H. P., Watts, G. F., Cui, Y., Wright, J., Thornhill, T. S., Skold, M., Behar, S. M., Niederreiter, B., Lu, J., Cernadas, M., Coyle, A. J., Sims, G. P., Smolen, J., Warman, M. L., Brenner, M. B. & Lee, D. M. (2010). Synovial fibroblasts self-direct multicellular lining architecture and synthetic function in three-dimensional organ culture. Arthritis and rheumatism 62, 742-752. Knowles, D., Jr., Cheevers, W., McGuire, T., Stem, T. & Gorham, J. (1990). Severity of arthritis is predicted by antibody response to gp135 in chronic infection with caprine arthritis-encephalitis virus. Journal of virology 64, 2396-2398. Knowles, D. P., Jr. (1997). Laboratory diagnostic tests for retrovirus infections of small ruminants. The Veterinary clinics of North America 13, 1-11. Konishi, M., Tsuduku, S., Haritani, M., Murakami, K., Tsuboi, T., Kobayashi, C., Yoshikawa, K., Kimura, K. M. & Sentsui, H. (2004). An epidemic of caprine arthritis encephalitis in Japan: isolation of the virus. The Journal of veterinary medical science / the Japanese Society of Veterinary Science 66, 911-917. Krieg, A. &

Peterhans, E. (1990).

[Caprine

arthritis-encephalitis

in

Switzerland:

epidemiologic and clinical studies]. Schweizer Archiv fur Tierheilkunde 132, 345-352. 34

Lamara, A., Fieni, F., Mselli-Lakhal, L., Tainturier, D. & Chebloune, Y. (2001). Efficient replication of caprine arthritis-encephalitis virus in goat granulosa cells. Virus research 79, 165-172. Leitner, G., Krifucks, O., Weisblit, L., Lavi, Y., Bernstein, S. & Merin, U. (2009). The effect of caprine arthritis encephalitis virus infection on production in goats. Veterinary Journal. Lloyd, S. & Soulsby, E. J. (1978). Survey of parasites in dairy goats. American journal of veterinary research 39, 1057-1059. MacKenzie, R. W., Oliver, R. E., Rooney, J. P. & Kagei, H. (1987). A successful attempt to raise goat kids free of infection with caprine arthritis encephalitis virus in an endemically infected goat herd. New Zealand Veterinary Journal 35, 184-186. Mankowski, J. L., Spelman, J. P., Ressetar, H. G., Strandberg, J. D., Laterra, J., Carter, D. L., Clements, J. E. & Zink, M. C. (1994). Neurovirulent simian immunodeficiency virus replicates productively in endothelial cells of the central nervous system in vivo and in vitro. Journal of virology 68, 8202-8208. Matthews, J. (2009a). Diseases of the goat. Blackwell Publishing Ltd. Chapter 7. 105-111. Matthews, J. (2009b). Diseases of the goat. Blackwell Publishing Ltd. Chapter 17. 302-312. Matthews, J. (2009c). Diseases of the goat. Blackwell Publishing Ltd. Chapter 9,17. 130-149, 298. McGuire, T. C., O'Rourke, K. I., Knowles, D. P. & Cheevers, W. P. (1990). Caprine arthritis encephalitis lentivirus transmission and disease. Current topics in microbiology and immunology 160, 61-75. Midwinter, A. C., Clarke, J. K. & Alley, M. R. (1986). Pasteurella haemolytica serotypes from pneumonic goat lungs. New Zealand veterinary journal 34, 35-36. Morin, T., Grezel, D. , Bouzar, B. , Villet, S. , Greenland, T. , Guiguen, F. , Fornazero, C. , Mornex, J-F. , Chebloune, Y. (2003). Experimental model for lentivirus reactivation for virological and immunological studies in caprine arthritis-encephalitis virus (CAEV) infected goats. The Bulletin of the Veterinary Institute in Pulawy 47, 275-286. Narayan, O., Clements, J. E., Strandberg, J. D., Cork, L. C. & Griffin, D. E. (1980). Biological characterization of the virus causing leukoencephalitis and arthritis in goats. The Journal of general virology 50, 69-79. Narayan, O. Z., M.C. ; Gorrell, M. ; Crane, S. (1993). The Retroviridae. Plenum Press, new York. Chapter 2, p229-255. Nickel, R. ; Frewein, J. ; Schummer, A. ; Seiferle, E. (1984). Lehrbuch der Anatomie der Haustiere 1: Bewegungsapparat. Parey, Berlijn. p238-239. Nenci, C., Zahno, M. L., Vogt, H. R., Obexer-Ruff, G., Doherr, M. G., Zanoni, R., Peterhans, E. & Bertoni, G. (2007). Vaccination with a T-cell-priming Gag peptide of caprine arthritis encephalitis virus enhances virus replication transiently in vivo. The Journal of general virology 88, 1589-1593.

35

Nord, K. (1997). CAEV infection does not affect prevalence of bacterial mastitis in goats. Acta veterinaria Scandinavica 38, 197-199. Osborn, M., Debus, E. & Weber, K. (1984). Monoclonal antibodies specific for vimentin. European journal of cell biology 34, 137-143. Pepin, M., Vitu, C., Russo, P., Mornex, J. F. & Peterhans, E. (1998). Maedi-visna virus infection in sheep: a review. Veterinary research 29, 341-367. Peterhans, E., Greenland, T., Badiola, J., Harkiss, G., Bertoni, G., Amorena, B., Eliaszewicz, M., Juste, R. A., Krassnig, R., Lafont, J. P., Lenihan, P., Petursson, G., Pritchard, G., Thorley, J., Vitu, C., Mornex, J. F. & Pepin, M. (2004). Routes of transmission and consequences of small ruminant lentiviruses (SRLVs) infection and eradication schemes. Veterinary research 35, 257-274. Peterhans, E., Zanoni, R. & Bertoni, G. (1999). How to succeed as a virus: strategies for dealing with the immune system. Veterinary immunology and immunopathology 72, 111-117. Phelps, S. L. & Smith, M. C. (1993). Caprine arthritis-encephalitis virus infection. Journal of the American Veterinary Medical Association 203, 1663-1666. Platt-Samoraj, A., Michalski, M. M., Sobiech, P. & Mikulska-Skupień, E. (2003). A case of caprine arthritis-encephalitis virus infection of goats in one of the herds in the Warmia and Mazury voivodship. Medycyna Wet 59, 802-807. Ramirez, H., Roman, B. S., Glaria, I., Reina, R., Hernandez, M. M., de Andres, X., Crespo, H., Hichou, B., Cianca, S., Goni, C., Grandas, A., Garcia-Pastor, L., Vijil, L. E., Quintin, F., Grillo, M. J., de Andres, D. & Amorena, B. (2009). Antibody-based diagnosis of small ruminant lentivirus infection in seminal fluid. Theriogenology 72, 1085-1096. Reddy, P. G., Sapp, W. J. & Heneine, W. (1993). Detection of caprine arthritis-encephalitis virus by polymerase chain reaction. Journal of clinical microbiology 31, 3042-3043. Reina, R., Berriatua, E., Lujan, L., Juste, R., Sanchez, A., de Andres, D. & Amorena, B. (2008). Prevention strategies against small ruminant lentiviruses: An update. Veterinary Journal. Reina, R., Grego, E., Bertolotti, L., De Meneghi, D. & Rosati, S. (2009). Genome analysis of small-ruminant lentivirus genotype E: a caprine lentivirus with natural deletions of the dUTPase subunit, vpr-like accessory gene, and 70-base-pair repeat of the U3 region. Journal of virology 83, 1152-1155. Rimstad, E., East, N. E., Torten, M., Higgins, J., DeRock, E. & Pedersen, N. C. (1993). Delayed seroconversion following naturally acquired caprine arthritis-encephalitis virus infection in goats. American journal of veterinary research 54, 1858-1862. Rowe, J. D., East, N. E., Thurmond, M. C., Franti, C. E. & Pedersen, N. C. (1992). Cohort study of natural transmission and two methods for control of caprine arthritisencephalitis virus infection in goats on a California dairy. American journal of veterinary research 53, 2386-2395. 36

Russell, H., O'Toole, D. T., Bardsley, K., Davis, W. C. & Ellis, J. A. (1996). Comparative effects of bluetongue virus infection of ovine and bovine endothelial cells. Veterinary pathology 33, 319-331. Saltarelli, M., Querat, G., Konings, D. A., Vigne, R. & Clements, J. E. (1990). Nucleotide sequence and transcriptional analysis of molecular clones of CAEV which generate infectious virus. Virology 179, 347-364. Saman, E., Van Eynde, G., Lujan, L., Extramiana, B., Harkiss, G., Tolari, F., Gonzalez, L., Amorena, B., Watt, N. & Badiola, J. (1999). A new sensitive serological assay for detection of lentivirus infections in small ruminants. Clinical and diagnostic laboratory immunology 6, 734-740. Saunders, M. (1998). Arthrite encéphalite caprine á virus : aspects épidémiologiques et importance en production caprine. Le Point vet 29, 67-75. Schoborg, R. V., Saltarelli, M. J. & Clements, J. E. (1994). A Rev protein is expressed in caprine arthritis encephalitis virus (CAEV)-infected cells and is required for efficient viral replication. Virology 202, 1-15. Schöpf, K. & Schönbauer, M. (1990). Serologische Erhebungsuntersuchung über die Verbreitung der Caprinen Arthritis-Enzephalitis (CAE) in Tirol. Wiener Tierärztliche Monatsschrift 77, 249-252. Sinzger, C., Grefte, A., Plachter, B., Gouw, A. S., The, T. H. & Jahn, G. (1995). Fibroblasts, epithelial cells, endothelial cells and smooth muscle cells are major targets of human cytomegalovirus infection in lung and gastrointestinal tissues. The Journal of general virology 76 ( Pt 4), 741-750. Smith, M. C. & Cutlip, R. (1988). Effects of infection with caprine arthritis-encephalitis virus on milk production in goats. Journal of the American Veterinary Medical Association 193, 63-67. Smith, M. C. S., D. M. (2007a). Goat Medicine. Blackwell Publishing. Chapter 4. 73-79. Smith, M. C. S., D. M. (2007b). Goat Medicine. Blackwell Publishing. Chapter 14. p. 474-475. Smith, M. C. S., D. M. (2007c). Goat Medicine. Blackwell Publishing. Chapter 9. p. 254-263. Smith, M. C. S., D. M. (2007d). Goat Medicine. Blackwell Publishing. Chapter 5. p. 135-138. Smith, M. C. S., D. M. (2007e). Goat Medicine. Blackwell Publishing. Chapter 15. p.498. Sonigo, P., Alizon, M., Staskus, K., Klatzmann, D., Cole, S., Danos, O., Retzel, E., Tiollais, P., Haase, A. & Wain-Hobson, S. (1985). Nucleotide sequence of the visna lentivirus: relationship to the AIDS virus. Cell 42, 369-382. Straub, O. C. (1983). Vorkommen der virusbedingten Ziegen (Caprinen) Arthritis-Enzephalitis (CAE) in der Bundesrepublik Deutschland. Tierärztliche Umschau 38, 882-895. Straub, O. C. (2008). Arthritis-Enzephalitis (CAE): Erfahrungen und neuere Erkenntnisse. Tierarztliche Umschau 63, 265-271. Truyen, U., Kaske, M., Ganter, M. & Kaaden, O.-R. (1991). Serologische Untersuchung zum Vorkommen der Caprinen Arthritis-Enzephalitis (CAE). . Praktische Tierarzt 72, 426430. 37

von Bodungen, U., Lechner, F., Pfister, H., Vogt, H. R., Cheevers, W. P., Bertoni, G., Jungi, T. W. & Peterhans, E. (1998). Immunohistology of the early course of lentivirus-induced arthritis. Clinical and experimental immunology 111, 384-390. Werling, D. L., W. (2004). Infectios Diseases of Livestock. OUP Southern Africa; 2 edition, p741-746. Wilkerson, M. J., Davis, W. C., Baszler, T. V. & Cheevers, W. P. (1995). Immunopathology of chronic lentivirus-induced arthritis. The American journal of pathology 146, 14331443. Zanoni, R., Pauli, U. & Peterhans, E. (1990). Detection of caprine arthritis-encephalitis- and maedi-visna viruses using the polymerase chain reaction. Experientia 46, 316-319. Zanoni, R. G., Nauta, I. M., Kuhnert, P., Pauli, U., Pohl, B. & Peterhans, E. (1992). Genomic heterogeneity of small ruminant lentiviruses detected by PCR. Veterinary microbiology 33, 341-351. Zink, M. C., Yager, J. A. & Myers, J. D. (1990). Pathogenesis of caprine arthritis encephalitis virus. Cellular localization of viral transcripts in tissues of infected goats. The American journal of pathology 136, 843-854.

38

39