UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE. Academiejaar

UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE

Academiejaar 2012 – 2013

IN VITRO PRODUCTIE MET SLACHTHUISOVARIA ALS VOORBEELD TOT OPTIMALISATIE VAN HET OVUM PICK-UP IN VITRO PRODUCTIEPROCES.

door

Maaike CATTEEUW

Promotor: Dr. Eline Wydooghe Medepromotor: Prof. Dr. Ann Van Soom

Literatuurstudie in het kader van de Masterproef

VRIJWARINGSCLAUSULE Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de juistheid of volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de inhoud van deze masterproef geen inbreuk uitmaakt op of aanleiding kan geven tot inbreuken op de rechten van derden. Universiteit Gent, haar werknemers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of verantwoordelijkheid voor enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud van de masterproef, noch voor enig vertrouwen dat wordt gesteld in een advies of informatie vervat in de masterproef.

UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE

Academiejaar 2012 – 2013

IN VITRO PRODUCTIE MET SLACHTHUISOVARIA ALS VOORBEELD TOT OPTIMALISATIE VAN HET OVUM PICK-UP IN VITRO PRODUCTIEPROCES.

door

Maaike CATTEEUW

Promotor: Dr. Eline Wydooghe Medepromotor: Prof. Dr. Ann Van Soom

Literatuurstudie in het kader van de Masterproef

VOORWOORD Bij de aanvang van deze masterproef wil ik tal van mensen bedanken die bijgedragen hebben tot het realiseren van dit werk. In de eerste plaats gaat speciale dank uit naar Dr. Eline Wydooghe voor het spenderen van haar kostbare tijd aan deze masterproef, voor de professionele inkijk en het kritisch vragenstellen, maar ook voor haar optimisme en motivatie. Daarnaast wil ik Prof. Dr. Ann Van Soom bedanken voor de mogelijkheid die ik heb gekregen om samen te werken met het CRV, en voor de input tijdens de bijeenkomsten. Maar ook Petra Vandamme en Isabelle Lemahieu wil ik bedanken voor hun ten allen tijde beschikbaarheid in het laboratorium en hun vakkundige hulp bij het uitvoeren van de experimenten. Ik dank ook het CRV, Dr. Erik Mullaart, Dr. Hiemke Knijn, Sanne Meijer en Femmie Dotinga voor het geven van hun commercieel-wetenschappelijke visie op deze masterproef en het ter beschikking stellen van hun producten.

Ik kan verder niet beschrijven hoe dankbaar ik mijn ouders ben, zonder hen zou ik nu niet zo ver in het leven staan. Ze staan dan ook dag en nacht paraat met steun en advies. Als laatste wil ik nog Nils Van Butsel bedanken voor het uittekenen van de meest onmogelijke figuren, het rangschikken van de foto’s en gewoon omdat hij er altijd voor mij is, Maïté Depreeuw voor haar interesse en raad, en mijn familie en vrienden die steeds opgewonden naar de evolutie van deze masterproef vroegen.

INHOUDSOPGAVE VOORWOORD INHOUDSOPGAVE SAMENVATTING EN TREFWOORDEN ............................................................................................. 1 INLEIDING.......................................................................................................................................... 2 LITERATUURSTUDIE ........................................................................................................................ 4 1.

2.

Eicelcollectie ...............................................................................................................................4 1.1

Ovum Pick Up......................................................................................................................4

1.2

Slachthuisovaria ..................................................................................................................6

1.2.1

Follikelaspiratie ............................................................................................................6

1.2.2

Follikeldissectie ............................................................................................................6

In vitro productie..........................................................................................................................7 2.1

In vitro maturatie ..................................................................................................................8

2.1.1

Selectie........................................................................................................................9

2.1.2

Medium en supplementen .......................................................................................... 10

2.2

In vitro fertilisatie................................................................................................................ 12

2.2.1

Stiereffect .................................................................................................................. 12

2.2.2

Densiteitsgradiënt ...................................................................................................... 13

2.2.3

Medium en supplementen .......................................................................................... 13

2.3

In vitro cultuur .................................................................................................................... 15

2.3.1

Medium en supplementen .......................................................................................... 15

2.3.2

Embryodensiteit ......................................................................................................... 17

MATERIAAL EN METHODEN........................................................................................................... 18 1.

Media ........................................................................................................................................ 18

2.

In vitro embryo productie ........................................................................................................... 18 2.1

Standaardprotocol UGent .................................................................................................. 18

2.1.1

Verzamelen van ovaria en eicelcollectie ..................................................................... 18

2.1.2

In vitro maturatie ........................................................................................................ 19

2.1.3

In vitro fertilisatie ........................................................................................................ 19

2.1.4

In vitro cultuur ............................................................................................................ 20

2.2

Standaardprotocol CRV ..................................................................................................... 20

2.2.1

Verzamelen van ovaria en eicelcollectie ..................................................................... 20

2.2.2

In vitro maturatie ........................................................................................................ 21

2.2.3

In vitro fertilisatie ........................................................................................................ 21

2.2.4

In vitro cultuur ............................................................................................................ 22

3.

Experimentele proefopzet .......................................................................................................... 22 3.1

Experiment 1: protocolvergelijkende proef .......................................................................... 22

3.2

Experiment 2: individuele koemodel ................................................................................... 23

4.

Evaluatie van de proeven .......................................................................................................... 25

5.

Statistische analyse................................................................................................................... 27

RESULTATEN .................................................................................................................................. 28 1.

Experiment 1: protocolvergelijkende proef ................................................................................. 28

2.

Experiment 2: individuele koemodel .......................................................................................... 29

DISCUSSIE ...................................................................................................................................... 32 REFERENTIELIJST .......................................................................................................................... 38

SAMENVATTING EN TREFWOORDEN Enerzijds worden runderembryo’s in vitro geproduceerd in het kader van wetenschappelijk onderzoek, zoals aan UGent, en anderzijds voor commerciële doeleinden zoals het CRV. Een eerste verschilpunt tussen beide standaardprocedures is de bron van eicellen: bij UGent wordt er gestart vanuit postmortem eierstokken, terwijl bij het CRV de eicellen verzameld worden door middel van Ovum-pick up (OPU). Bijkomend zijn er ook verschillen wat betreft de samenstelling en volume van de gebruikte media, het aantal eicellen per groep en het al dan niet overplaatsen van meercellige embryo’s op dag 4 pi (post inseminatie) naar vers medium. Eerst werden de twee standaardprocedures met elkaar vergeleken vertrekkend van slachthuiseicellen en er werd voor beide procedures twee subgroepen onderworpen aan de transfer van de meercellige embryo’s op dag 4 pi. De blastocystratio werd geëvalueerd op dag 8 pi; UGent zonder transfer (37.6±3.97%) en met transfer (42.0±4.03%) en CRV zonder transfer (24.4±3.24%) en met transfer (36.6±3.64%).Gezien de resultaten na OPU standaard lager liggen dan de resultaten met slachthuiseicellen werd in een tweede experiment nagegaan of deze resultaten verbeteren door gebruik te maken van de Corral dish, waarbij tijdens de cultivatie de embryo’s van één koe per kwadrant worden gecultiveerd. De blastocystratio op dag 8 pi in de Corral dish (26.9±3.00%), in druppels medium met één groep embryo’s van één koe (24.8±2.82%), in druppels medium met een gerandomiseerde kleine groep embryo’s (32.0±2.92%) waren allen lager dan na standaard groepscultuur (40.8±3.47%). Een hogere groepsgrootte of een lager volume kan aldus bijdragen tot een hogere embryonale ontwikkeling tot blastocyst. Trefwoorden: autocriene factoren, Corral dish, embryocultuur, in vitro productie, ovum pick-up

INLEIDING De geboorte van de eerste proefbuisbaby, Louise Brown (1978), is een mijlpaal in de geschiedenis van artificiële reproductieve technieken. In amper drie decennia zijn wereldwijd meer dan 3 miljoen baby’s geboren na in vitro fertilisatie (IVF) of intracytoplasmatische sperma injectie (ICSI). Omwille van ethische beperkingen is het echter niet mogelijk om met humane embryo’s de in vitro productie (IVP) te onderzoeken en optimaliseren. Vandaar zijn diermodellen de uitgelezen methode om meer informatie te verschaffen. Vroeger werden muizenmodellen op grote schaal aangewend, maar experimenten met boviene embryo’s kennen tegenwoordig de voorkeur (Van Soom et al., 2011). Het rundermodel is namelijk een uitstekend model om meer inzicht te krijgen in de ontwikkeling van humane pre-implantatieembryo’s, vooral op het gebied van microtubuli vorming tijdens de fertilisatie, het tijdstip van genoomactivatie, het metabolisme en de interactie met het cultuurmedium (Navara et al., 1995; Anderiesz et al., 2000; Ménézo et al., 2000;Neuber en Powers, 2000; Niemann en Wrenzycki, 2000). Verder heeft de koe ook een drachtduur van negen maanden, en heeft ze slechts uitzonderlijk meer dan één nakomeling per dracht. Daarenboven kunnen runderembryo’s ook vergeleken worden met embryo’s van andere species, en kan deze dus als het ware als een ‘gouden standaard’ beschouwd worden (Wrenzycki et al., 2004).

Er zijn twee mogelijke manieren om boviene oöcyten te collecteren. Een eerste methode is het aspireren van follikels op verzamelde ovaria in het slachthuis (post mortem). Embryo’s op deze manier gecollecteerd dienen voornamelijk voor wetenschappelijke doeleinden. Hier is het ultieme doel volledige kennis te verwerven over de embryonale fysiologie en ontwikkeling, de wisselwerking tussen het embryo en de cultuurmedia, de ideale omgevingscondities… Een tweede methode om oöcyten te verzamelen kan via transvaginale echogeleide follikelaspiratie (ovum pick-up – OPU) op het levende dier. OPU werd afgeleid van de humane manier van collecteren en werd aangepast aan zijn specifiek gebruik bij dieren (Boni, 2012). Verder kent OPU omwille van de kostprijs een meer commerciële toepassing. Sinds de kunstmatige inseminatie op grootschalige wijze wordt uitgevoerd, kan een stier ontelbaar veel nakomelingen produceren per jaar. Een koe daarentegen kan slechts 1 kalf per jaar baren, haar genetische impact op de populatie is daardoor sterk beperkt in vergelijking met deze van stieren. Dankzij OPU/IVP kan het genetisch aandeel van een koe toch verhoogd worden. OPU kan namelijk tweemaal per week gedurende enkele maanden uitgevoerd worden op eenzelfde individu. Tijdens het gehele OPU/IVP programma worden de eicellen en later de embryo’s steeds per koe in medium geplaatst, traceerbaarheid is hier immers van groot belang. Vaak worden slechts een achttal eicellen per ovarium verkregen, waardoor er slechts in kleine groepen kan worden gecultiveerd. De IVP in deze kleine groepen heeft vaak een minder grote opbrengst in blastocysten dan wanneer grote groepen (25 embryo’s) worden aangewend, dit wordt standaard in wetenschappelijke experimenten gedaan. Van welk individu een embryo afkomstig is, speelt hier immers geen rol. Het positieve effect van groepscultuur zou te wijten zijn aan de embryonale productie van autocriene factoren, deze ondersteunen niet alleen de verdere ontwikkeling van zichzelf maar ook van de omliggende embryo’s. 2

Wanneer tijdens de in vitro cultuur een hogere embryodensiteit (embryo/medium ratio) wordt aangehaald, door grote groepen embryo’s te cultiveren of door het mediumvolume te verlagen, wordt de concentratie van deze autocriene factoren opgedreven (Gardner et al., 1994; Ferry et al., 1994; O’Doherty et al., 1997).

In deze masterproef werd in de eerste plaats nagegaan of de media die gebruikt worden voor experimentele of commerciële doeleinden van elkaar verschilden wat betreft de blastocystratio op dag 8 na fertilisatie, hiervoor werden respectievelijk de media gebruikt van aan de Universiteit Gent, faculteit diergeneeskunde en die van aan het CRV, coöperatie voor rundveeverbetering. In een tweede experiment werd vervolgens nagegaan of de blastocystopbrengst bij het cultiveren van embryo’s per koe kan verhoogd worden wanneer meerdere groepen samen gecultiveerd worden. Dit in de speciaal ontworpen Corral dish; twee centrale welletjes zijn in kwadranten opgedeeld door een semipermeabele wand waarbij medium zich over het volledige welletje kon verspreiden maar waarbij het groepje embryo’s steeds in hun kwadrant achterbleven. Via deze Corral dish konden de geproduceerde autocriene factoren zich over het gehele welletje verspreiden en hierdoor meerdere ontwikkelende embryo’s gaan beïnvloeden.

3

LITERATUURSTUDIE 1. Eicelcollectie 1.1

Ovum Pick Up

Een kwarteeuw geleden heeft een Nederlands onderzoeksteam voor het eerst Ovum Pick Up (OPU) op de koe uitgevoerd (Pieters et al., 1988). Tijdens deze techniek worden in vivo oöcyten gecollecteerd door middel van transvaginale echogeleide follikelaspiratie. Na het toedienen van een epidurale anesthesie, wordt hierbij rectaal het ovarium tegen de vaginale wand gedrukt. Dankzij de vaginaal ingebrachte echografische sonde is het mogelijk het ovarium met de follikels in beeld te brengen. Via een naaldgeleider aan de sonde kan een ingebrachte naald (foto 1) de follikels aspireren en wordt het follikelvocht met de aanwezige COC’s opgevangen in een daarvoor voorziene proefbuis. Herhaaldelijke eicelcollectie op deze manier bleek zonder risico voor zowel de algemene gezondheid als voor de reproductiviteit van het dier. OPU werd hierdoor bevonden als een uitstekend alternatief voor superovulatie als basis voor het in vitro productieproces. Daarnaast is OPU ook succesvol bij drachtige of acyclische dieren, bij koeien met een eileiderpathologie of -infectie en bij koeien die ongevoelig bleken voor superovulatietherapie. Op maandelijkse basis kunnen ook meer embryo’s per donorkoe teruggeplaatst worden in vergelijking met superovulatie (Boni, 2012).

Foto 1 Echografische sonde met ingebrachte aspiratienaald. (Uit: Fotoboek Gamete Research Center, Universiteit Antwerpen)

De optimalisatie van deze techniek is een voortdurend proces. De naald en het gecreëerde vacuüm zijn van cruciaal belang voor de kwantiteit en kwaliteit van de cumulus-oöcytcomplexen (COC’s). Beide parameters werden aan nauwkeurige proeven onderworpen. Bols et al. (1996, 1997) beschreven dat de meeste eicellen bekomen werden met het gebruik van een 18 gauge naald, onafhankelijk van het gebruikte vacuüm. Daarnaast bleek ook de lengte, de scherpte en de opening van de naald een rol te spelen. Ander onderzoek stelde vast dat meer oöcyten werden verzameld 4

wanneer een hoger vacuüm werd gecreëerd. Toch is dit niet zonder risico: hoe hoger het gebruikte aspiratievacuüm, hoe meer de COC’s aan de destructieve krachten van het vacuüm onderworpen worden. Hierdoor moet een gulden middenweg gezocht worden tussen het enerzijds collecteren van voldoende COC’s en tussen het anderzijds schadelijke effect van het vacuüm.

Naast de technische kant van OPU bepaalt ook de frequentie van collectie de kwantiteit en kwaliteit van de eicellen. Zo leverde de collectie een maal per week onvoldoende waardevolle oöcyten op. Meerdere studies toonden aan dat het aantal verkregen eicellen significant toenam wanneer OPU twee maal per week werd uitgevoerd (van der Schans et al., 1991; Boni et al., 1992). Hierbij wordt ook een meer homogene groep van COC’s verkregen, welke minder tekenen van atresie vertoonden (Merton et al., 2012). Deze frequentie resulteert in een toegenomen folliculaire golffrequentie en een pauze in zowel de oestruscylclus, als in de follikelmaturatie en bijgevolg vindt geen ovulatie meer plaats. Met als gevolg dat er zich geen corpus luteum vormt, waardoor er geen productie van progesteron is die zal interfereren met de follikelgroei. Men zag dat dieren die aan deze collectiefrequentie werden onderworpen, zich in een parafysiologische status gingen bevinden. Hierdoor worden de folliculaire golven losgekoppeld van de oestruscyclus (Kruip et al., 1994). Toch vindt er opnieuw een ovulatie plaats wanneer de OPU stopgezet wordt, en dit binnen de 6 dagen (Boni et al., 1993). Bij het echter nog verder opdrijven van de collectiefrequentie, daalde het aantal gepuncteerde follikels (Boni et al., 1997) en het aantal verkregen oöcyten (Boni et al., 1995). Niettegenstaande er wel eicellen van betere kwaliteit werden verzameld (Simon et al., 1993).

Niet alleen onderzoek naar de kwaliteit van de oöcyten, maar ook de impact op de koe is van belang. Kruip et al. (1994) hielden nauwlettend de gezondheid van de koe in de gaten, maar speciale aandacht ging ook naar de genitale tractus, de fertiliteit en de cycli. In deze studie zag men geen neveneffecten van OPU welke minstens vijf opeenvolgende maanden werd uitgevoerd op eenzelfde dier. OPU is daarenboven de enige manier om eicellen te verzamelen bij drachtige koeien, dit gedurende het eerste trimester bij vaarzen en gedurende de eerste helft van de dracht bij koeien (Eikelmann et al., 2000). Bij prepuberale dieren kan de transvaginale wijze van collectie niet toegepast worden. Bij deze dieren kan enkel via laparotomie of laparoscopie oöcyten worden verzameld. Door kalveren als eiceldonor te gaan benuttigen, is men in staat het interval tussen twee generaties sterk te gaan inkorten. Wat sterk ten gunste is van de genetische vooruitgang (Majerus et al., 1998).

Een variant op OPU werd ontwikkeld door Reichenbach et al. (1994), via laparoscopie werd de eicelcollectie uitgevoerd (L-OPU). Onderzoek toonde enkele voordelen van L-OPU; het aspireren van primaire, oppervlakkige follikels, de directe visualisatie van het ovarium tijdens het verzamelen en hierdoor minder schade aan het ovarium. Toch wordt de voorkeur nog steeds aan OPU gegeven. Dankzij OPU kunnen namelijk significant meer graad 1 eicellen, welke van uitstekende kwaliteit zijn, gecollecteerd worden. Hierdoor stijgt als logisch gevolg van de hoge kwaliteit van de gecollecteerde oöcyten ook het aandeel gedeelde embryo’s en blastocysten (Becker et al., 1996; Santl et al., 1998).

5

1.2

Slachthuisovaria

1.2.1

Follikelaspiratie

Aspiratie van antrale follikels door middel van een naald en een spuit (foto 2) of een aspiratienaald onder vacuüm is een van de meest gebruikte technieken om eicellen te collecteren. Follikels met een diameter van 2 tot 8 mm worden hierbij aangeprikt. Verder werd reeds tal van onderzoek gedaan naar de invloed van de naald (gauge) en het gecreëerde vacuüm. Zo rapporteerden Fry et al. (1997) het gebruik van een 17 gauge naald met een vacuüm van 55 mmHg als meest succesvol om primaire oöcyten te gaan collecteren. Wanneer men echter de vacuümdruk liet toenemen, werden er minder leefbare eicellen bekomen. Er werd namelijk een opmerkelijke stijging van naakte eicellen waargenomen. Mogelijks zorgt het hogere vacuüm ervoor dat cumuluscellen reeds voortijdig van de eicel worden gestript. Een groot nadeel aan follikelaspiratie blijft weliswaar de lage eicelopbrengst. De gepuncteerde follikels brengen vaak slechts 30-60% oöcyten op.

Foto 2 Aspiratie van follikels met een diameter tussen 2 en 8 mm wordt uitgevoerd met een 10 ml spuit en een 18 gauge naald. (Uit: Fotoboek Universiteit Gent, faculteit diergeneeskunde, voortplanting en verloskunde)

1.2.2

Follikeldissectie

Dankzij follikeldissectie kan tot 100% oöcyten bekomen worden. Follikeldissectie werd initieel toegepast door Lu in 1990. Tijdens het uitvoeren van deze techniek worden de follikels los geprepareerd van het omliggende ovariële weefsel. Alle follikels worden hierbij verzameld en worden in een dissectiemedium open geprikt. Hierdoor begeven de eicellen zich in het medium. Cumulusoöcytcomplexen worden hierbij uiterst weinig beschadigd (foto 3). Men doet er echter drie maal langer

6

over dan wanneer men de follikels aspireert. Vandaar dat deze techniek weinig succes kent in de onderzoekswereld (Gordon, 2003a).

Foto 3 Oöcytcollectie aan de hand van follikeldissectie. Vervolgens worden de intacte follikels opengemaakt waardoor de COC’s in het medium vrijkomen. (Uit: Gorden, 2003a)

2. In vitro productie Na de collectie ondergaan de oöcyten drie stappen, namelijk in vitro maturatie (IVM), in vitro fertilisatie (IVF) en in vitro cultuur (IVC), die als einddoel hebben blastocysten af te leveren. Verder wordt hier dieper ingegaan op deze drie fases van de in vitro productie (IVP) door gebruik te maken van de wetenschappelijke en commerciële kant van de IVP. Overal ter wereld verdiepen onderzoekers zich in het in vitro embryoproductieproces, met als ultieme doel embryo’s te produceren met eenzelfde of zelfs betere kwaliteit dan de in vivo geproduceerde embryo’s. Door kennis te hebben van activatieprocessen, moleculen die inwerken op het embryo, veranderingen die ontstaan in media en omgeving… kunnen onderzoekers het in vivo proces nabootsen en later zelfs dit in vitro proces perfectioneren om nog betere resultaten te bekomen, namelijk het afleveren van levend en gezonde nakomelingen. Tot op heden is echter de volledige kennis omtrent het embryonale ontwikkelingsproces nog niet verworven. Daarom moet intens onderzoek hierin verandering brengen. Aan de universiteit van Gent (UGent) vinden experimentele studies plaats die inzicht moeten brengen in zowel het humane als het dierlijke in vitro embryoproductieproces.

Naast de wetenschappelijke IVP, is er ook de IVP met commerciële doeleinden. Een voorbeeld hiervan is een overkoepelende organisatie in Nederland en België die een groot marktaandeel heeft op het gebied van boviene reproductiviteit, namelijk het CRV welke een samensmelting is van de

7

Koninklijke coöperatie rundveeverbetering delta (CR delta) en de Vlaamse rundveeteelt vereniging (VRV). Het CRV bezit stierstations zodat menig veehouder sperma kan aankopen, bestemd voor kunstmatige inseminatie. Naast de commercialisatie van diepgevroren spermarietjes, promoten ze ook de mogelijkheid van embryosamenstelling. Zo kan elke geïnteresseerde veehouder een embryo laten samenstellen volgens zijn specifieke keuze, met oog op prominente genetische factoren zoals melkproductie. De geselecteerde koe ondergaat OPU en de gecollecteerde eicellen worden bevrucht met het uitgekozen sperma. Dit alles gebeurt volledig in vitro. Wanneer de acceptorkoeien via hormonale therapie klaar gestoomd worden voor ontvangst, kunnen de meest kwalitatieve en bijgevolg meest leefbare embryo’s ingeplant worden. Een embryo wordt steeds onder het ontwikkelingsstadium van blastocyst ingeplant in een receptorkoe, dit gebeurt na zeven dagen cultivatie. De aankoop van zo’n embryo is echter niet goedkoop, maar daartegenover staat wel de productie van dieren met een hoge genetische waarde. Theoretisch gezien is men in staat om 50 tot 100 kalveren per koe per jaar te gaan produceren (van Wagtendonk-de Leeuw, 2006). Men is dus via OPU/IVP in staat de selectie-intensiteit te verhogen en het generatie-interval in te korten.

2.1

In vitro maturatie

Bij de aspiratie van follikels worden zowel bij slachthuisovaria als bij levende donorkoeien onrijpe cumulus-oöcytcomplexen (COC’s) gecollecteerd. Wanneer COC’s een rijpingsfase ondergaan tijdens de IVP (foto 4), hervat de meiose zich tot aan de metafase II (Masui, 1990). Gedurende deze transformatie ondergaat de eicel verdere nucleaire en cytoplasmatische hervormingen, waaronder biochemische en structurele veranderingen (Watson, 2007; Eppig, 1996). Na het voltooien van dit rijpingsproces worden de oöcyten bevruchtingskrachtig. Wanneer in een volgende stap sperma wordt toegevoegd, resulteert de fusie tussen een oöcyt en een spermacel in de voltooiing van de meiose (Sirard, 2001). De in vitro maturatie (IVM) vindt plaats bij een temperatuur van 38-39°C, onder een gasfase van 5% koolstofdioxide (CO2) en 20% zuurstof (O2) (Pinyopummintr en Bavister, 1994) en dit gedurende 2224h. Deze tijdsspanne is belangrijk aangezien de COC’s gecollecteerd worden uit slachthuisovaria. Door depost-mortem veranderingen in deze COC’s is de rijping reeds van start gegaan, nog voor de COC’s werden verzameld. Hierdoor is de tijdsduur van maturatie meer strikt aangezien mogelijks een verstoring plaatsvond in het evenwicht tussen het rijpingsproces van de nucleus en het cytoplasma. De periode van maturatie speelt echter een minder belangrijke rol wanneer de IVP gebruik maakt van COC’sdie via OPU verkregen werden. Een studie door Merton et al. (2012) toonde aan dat OPU verkregen COC’s kwalitatief gelijkaardig ontwikkelden wanneer ze gedurende 16-28h werden gematureerd. Aan het CRV en de UGent worden beide maturatiemedia verschillend gesupplementeerd.

8

A

B

Foto 4 Boviene oöcyten voor en na in vitro maturatie (IVM). (A) Voorafgaand aan IVM, compacte cumuluslagen omgeven oöcyten. (B) Na IVM, geëxpandeerde cumuluscellen. (Uit: Fotoboek Universiteit Gent, faculteit diergeneeskunde, voortplanting en verloskunde)

2.1.1

Selectie

De verkregen boviene oöcyten ontwikkelen echter niet allemaal tot het blastocyststadium. Dankzij voorafgaande selectie van de oöcyten is men er in geslaagd om een blastocystpercentage op het einde van het in vitro embryoproductieproces te verkrijgen van 30-40% (Gordon, 2003b). Deze selectie baseert zich op de morfologische kenmerken van de COC’s, namelijk de compactheid en het aantal lagen cumuluscellen rondom de eicel. Op basis hiervan werden vier kwalitatieve categorieën opgesteld (I: excellent; II: goede kwaliteit; III: ondermaats; IV: slechte kwaliteit) (foto 5).

Foto 5 COC categorieën: (A) categorie I, compactheid en meer dan drie lagen cumuluscellen rondom de eicel. (B) categorie II, compactheid en slechts een drietal lagen cumuluscellen. (C) categorie III, cumuluscellen omgeven niet gehele eicel. (D) categorie IV, naakte eicel. (Uit: Alvarez et al., 2009)

Onderzoek toonde reeds aan dat het aantal COC’s van een goede kwaliteit die uitgroeien tot blastocyst hoger is dan wanneer COC’s met een slechte kwaliteit worden benuttigd in de IVP (Khurana en Niemann, 2000) (tabel 1). Daarenboven is er echter geen significant verschil in ontwikkelingsvermogen tussen de oöcyten van categorie I en II (Eckert en Niemann, 1995). Experimentele studies maken vaak alleen gebruik van de COC’s van een uitstekende of goede kwaliteit, om zo een hoger blastocystratio te bekomen. Het grote minpunt aan deze strenge selectie is dat de proportie aan COC’s van categorie I en II vaak laag is (Madison et al., 1992) waardoor het 9

puncteren en aspireren van het aantal follikels verhoogd moet worden en dus het aantal slachthuisovaria opgedreven moet worden. Tabel 1 Het effect van immature oöcyt kwaliteit op de ratio’s maturatie, fertilisatie, deling en morulae/blastocystvorming. (percentage ± SD) (Uit:Khurana en Niemann, 2000) COC categorie

fertilisatie

maturatie

I II III IV

84,5±4,5 85,0±2,4 71,0±4,5 32,7±2,2

normaal 67,1±6,5 63,7±7,1 44,6±3,9 16,3±2,9

abnormaal 11,1±1,1 11,3±3,8 17,9±2,9 12,2±2,1

deling

morulae/blastocysts

61,4±4,7 52,0±3,1 26,0±5,0 12,1±2,8

33,9±3,1 13,1±1,8 0 0

Wanneer OPU wordt toegepast als collectiemethode kan er echter niet zo streng geselecteerd worden. De mogelijkheid tot het puncteren en aspireren van follikels per koe is echter eindig per OPUsessie. Vandaar dat het CRV de IVP aangaat met COC’s behorende tot alle categorieën uitgezonderd de naakte eicellen. Het meenemen van COC’s van mindere kwalitatieve morfologie wordt niet aanzien als een beperking. De kans dat deze toch verder zouden ontwikkelen tot het stage van blastocyst kan alleen maar een meerwaarde geven aan het commerciële programma.

2.1.2 a.

Medium en supplementen CRV

In de commerciële sector van de IVP wordt het maturatiemedium, ook wel CH medium genoemd, met als basis TCM-199 gesupplementeerd met penicilline/streptomycine (9.9 µl/ml), foetaal kalf serum (fetal calf serum - FCS) (99 µl/ml), cysteamine (1 µl/ml), luteïniserend hormoon (LH) en follikel stimulerend hormoon (FSH) (10 µl/ml).

TCM-199 bestaat uit tal van componenten waaronder aminozuren (o.a. L-glutamine), vitamines, natriumbicarbonaat, dextrose en fenolrood. Dit gedefinieerde medium staat in voor de aanbreng van voedingsstoffen voor de rijpende eicellen.De toevoeging van penicilline/streptomycine heeft als doel mogelijke bacteriële contaminatie in het medium te voorkomen, zodat een betere ontwikkeling gegarandeerd kan worden. Tal van onderzoeken hebben reeds aangetoond dat FCS een positief effect heeft op de eicelmaturatie en dus ook op embryonale ontwikkeling. Serum is samengesteld uit een brede waaier componenten, namelijk hormonen, groeifactoren, aminozuren, cytokines en vitamines (Gordon, 2003b). De exacte samenstelling van serum is ondefinieerbaar, en daarenboven kan serum gecontamineerd zijn met prionen en/of virussen. Serum kan hierdoor mogelijks morfologische, metabole, genetische en structurele veranderingen veroorzaken in het ontwikkelende embryo (Dorland et al., 1994). Alsook zou het geassocieerd zijn met het large offspring syndrome bij schapen (McEvoy et al., 1997).

Cysteamine is een eenvoudig en stabiel aminothiol, welk vrijkomt bij de afbraak van cysteïne. Het toevoegen van cysteamine aan het maturatiemedium stimuleert de glutathion synthese en ondersteunt de verdere embryonale ontwikkeling (de Matos et al., 2002). Daarbij komt glutathion zo

10

goed als in alle lichaamscellen aan een hoge concentratie voor en speelt hierbij een belangrijke rol in de bescherming van de cellen tegen oxidatieve schade. LH en FSH zijn gonadotropines die in vivo gesecreteerd worden door de hypofyse, deze hormonen staan respectievelijk in voor de ovulatie en de voorafgaande follikelrijping. Onderzoek naar het effect van gonadotropines tijdens de IVM is vaak tegenstrijdig. Danfour et al. (1999) experimenteerden met preovulatoire gehaltes LH en FSH, hierbij konden de verkregen maturatieratio’s positief in verband gebracht worden met de toevoeging van LH en FSH. Toch is er sprake van dat LH, toegevoegd tijdens de IVM, geen positieve effect (Ali en Sirard, 2002), maar zelfs een inhibitorisch effect heeft op de embryonale ontwikkeling (Duszewska en Pienkowski, 1998). Door de onderlinge variatie in eicelproductie tussen koeien, verschilt het aantal COC’s per koe dat op medium geplaatst kan worden. Deze COC’s worden hierbij per koe in een welletje met 500 µl medium geïncubeerd, en later ook in dezelfde groep en hetzelfde volume tijdens de fertilisatiefase. Hierdoor blijft de oorsprong van de eicellen steeds bewaard en kunnen de eicellen per koe steeds opgevolgd worden. b.

UGent

Aan de UGent wordt enkel gentamicine (50 µg/ml) en epidermale groeifactor (EGF) (20 µl/ml) aan het TCM-199 maturatiemedium toegevoegd. Gentamicine is een antibioticum behorend tot de aminoglycosiden en heeft een breedspectrum werking maar voornamelijk een Gram-negatieve werking. Een antibioticum is ook hier van noodzaak om het algemeen risico op bacteriële contaminatie van het medium te voorkomen.

EGF is een groeifactor die de celgroei, proliferatie en differentiatie stimuleert door te gaan binden op zijn receptor. Downs et al. (1988) rapporteerden dat EGF de productie van cAMP stimuleert alsook de afbraak van de germinale vesikel bevordert bij muizen. Daarenboven achten onderzoekers het mogelijk dat EGF via hetzelfde proces inwerkt op boviene COC’s (Kobayashi et al., 1994). EGF draagt bij tot meiotische maturatie (Anas en Terada, 1999). Cumuluscellen ondergaan daarbij expansie welke positief gerelateerd is met de fertilisatieratio en het verdere ontwikkelingsvermogen (Schroeder en Eppig, 1984; Vanderhyden en Armstrong, 1989; Chen et al., 1993). Aan de UGent is het steeds mogelijk om gelijke aantallen COC’s te incuberen. Hier worden 60 COC’s, afkomstig van verscheidene koeien, in een welletje met 500 µl maturatiemedium geplaatst. De koe van oorsprong speelt hier immers geen verdere rol in de IVP. Dezelfde aantallen worden ook aangehouden tijdens de in vitro fertilisatie.

11

2.2

In vitro fertilisatie

De gematureerde eicellen kunnen bevrucht worden met zowel vers als diepgevroren sperma, en dit na een grondige selectie en aan een concentratie van 1 miljoen zaadcellen/ml. Bij de transfer van het maturatiemedium naar het fertilisatiemedium worden de COC’s intact gelaten. Onderzoek toonde aan dat cumuluscellen bevorderlijk zijn voor de fertilisatie (Tanghe et al., 2002), ze zouden namelijk in staat zijn een selectie uit te voeren op het sperma. Het betreft zowel een negatieve als positieve selectie van spermacellen; niet-gecapaciteerde spermazoa worden weerhouden en hyperactieve zaadcellen worden vastgegrepen en dichterbij het eiceloppervlak gebracht. Bijgevolg dragen cumuluscellen bij tot een vluggere penetratie van de eicel door de zaadcel.

2.2.1

Stiereffect

Stieren hebben een variabele bevruchtingscapaciteit, ingedeeld in lage of hoge fertiliteit welke in vivo geëvalueerd wordt door de non-return rate. Dit houdt het aantal succesvolle concepties in 56 dagen na inseminatie. De morfologie en kwaliteit van het sperma hebben een grote invloed op deze nonreturn rate (Söderquistet al., 1991), ook kan de invloed van de koe en de omgeving, zoals management en seizoen, een rol spelen (den Daas, 1992). Maar de prestaties van een stier in vivo zijn moeilijk te extrapoleren naar het in vitro succes. Toch wordt de in vitro fertiliteit van een stier vaak geëvalueerd aan de hand van het delingspercentage, de blastocystratio en de blastocyst kwaliteit (Larsson en Rodríguez-Martinez, 2000). De variabiliteit tussen stieren kan verklaard worden door twee mogelijkheden. Een eerste mogelijkheid is de onderlinge variatie in seminale plasma proteïnen, welke een rol spelen in de fertiliteitsbeoordeling van het geëjaculeerde sperma (Henault en Killian, 1995). Zo toonden Katska et al. (1994) aan dat de afwezigheid van de seminale plasma proteïnen het bevruchtingsvermogen van stieren met een lage fertiliteit verhoogde. Een tweede mogelijkheid is dat embryo’s bevrucht door stieren met een hoge fertiliteit vlugger beginnen te delen. Zo gaat de S-fase van de eerste mitose eerder door, wat dus resulteert in een hoger delingspercentage in vitro alsook in een hogere vorming van blastocysten (Eid et al., 1994; Comizzoliet al., 2000).

Waar vroeger de spermakwaliteit voornamelijk subjectief geëvalueerd werd, bestaan op dit ogenblik een gamma aan wetenschappelijk ondersteunde testen. Dankzij de ontwikkeling van de computerassisted semen analysers (CASA), kan de spermamotiliteit en aldus de fertiliteit uitermate objectief en precies geëvalueerd worden (Verstegen et al., 2002). Daarnaast kunnen ook subtiele veranderingen in de spermamotiliteit gevisualiseerd worden, en dit in een fractie van een seconde.

De wetenschappelijke IVP maakt slechts gebruik van één stier, zodat de stier en de spermakwaliteit geen verdere invloed hebben in de onderlinge variatie tussen experimenten. Deze ene stier werd vooraf aan strenge controles onderworpen zodat enkel de stier met een sterk bevruchtingsvermogen in vitro voldoet voor IVP. Dit staat in scherp contrast met het CRV en andere commerciële OPU/IVP sectoren waar stierstations uitgebaat worden. Deze stieren werden geselecteerd op basis van waardevolle, genetische factoren, zoals fertiliteit, stamboom, verworven prestaties, en ook die van zijn

12

nakomelingen. Sperma van deze stieren wordt veelal diepgevroren in rietjes, welke dan verhandeld worden voor kunstmatige inseminatie of in OPU/IVP laboratoria worden benuttigd.

2.2.2

Densiteitsgradiënt

Om de meest beweeglijke en dus de kans op bevruchting te verhogen, kan het sperma onderworpen worden aan een densiteitsgradiënt. Dit houdt in dat enkel de beste spermacellen zich doorheen deze gradiënt kunnen voortbewegen onder inwerking van centrifugale krachten (figuur 1). Op deze manier kunnen de spermacellen doeltreffend geselecteerd en geïsoleerd worden. Daarbij worden somatische cellen, dode en morfologisch abnormale spermacellen eenvoudig afgevoerd. Aan de UGent wordt de Percoll gradiënt gebruikt, dit is een colloïdale suspensie van silica partikels gecoat met polyvinyl pyrrolidone (PVP). De voordelen van deze gradiënt zijn dat het geen osmotisch effect heeft op het sperma en dat het een lage viscositeit heeft waardoor de sedimentatie van spermacellen niet vertraagd wordt (Mortimer, 2000). Het CRV maakt gebruik van Redigrad, welke sterk gelijkaardig is aan de Percoll gradiënt.

Figuur 1 Selectie van bevruchtingskrachtige spermatozoa aan de hand van een 45 en 90% Percoll gradiënt. (Uit: Parrish et al., 1995).

2.2.3 c.

Medium en supplementen CRV

Aan het CRV wordt het fertilisatiemedium gesupplementeerd met heparine (4.08%) als bevorderaar van de capacitatie van het sperma, BSA als proteïnebron en daarnaast wordt nog penicillamine, hypotaurine en epinephrine (PHE) (4.08%) aan het medium toegevoegd.

13

Heparine zorgt voor de capacitatie van de spermatozoa, waardoor deze een oöcyt kunnen bevruchten. Capacitatie vindt in vivo na de ejaculatie plaats in de vrouwelijke geslachtstractus. In vitro kan dit gebeuren door het sperma enkele uren te incuberen in een medium verrijkt met heparine. Er treedt een influx van Ca

2+

op waardoor het intracellulair cAMP stijgt met als gevolg een toename in

motiliteit. Markkula et al. (1999) rapporteerden dat de toevoeging van heparine aan het fertilisatiemedium ervoor zorgt dat de IVP met een hogere doeltreffendheid plaatsvindt. Een studie door Susko-Parrish et al. (1990) ging na wat het effect van penicillamine, hypotaurine en epinephrine is op de boviene penetratieratio. Wanneer PHE gesupplementeerd werd, werd een hogere ratio geëvalueerd dan wanneer slechts één van deze substanties werd toegevoegd (tabel 2). Talrijke studies werden reeds uitgevoerd bij de hamster om de werking achter PHE te achterhalen. Onderzoekers toonden aan dat door het toevoegen van penicillamine het aandeel spermatozoa waarvan de acrosomale reactie doorging toenam (Meizel et al.,1980). Hypotaurine zorgde voor een toename in de motiliteit van de spermacellen alsook voor een stijging in de eicelpenetratie (Leibfrieb en Bavister, 1981). Ook epinephrine stimuleerde de motiliteit van spermacellen (Bavister et al., 1979; Leibfried en Bavister, 1982) maar induceerde daarenboven de acrosomale reactie (Meizel et al., 1980), en bevorderde ook de eicelpenetratie (Leibfried en Bavister, 1982). Bij het rund werd aangetoond dat wanneer PHE aan het fertilisatiemedium werd toegevoegd, de tijd daalde die nodig was om de oöcyten te bevruchten (Susko-Parrish et al., 1990). Ook het tijdstip van toevoegen is van belang. Merton et al. (2000) toonde aan dat embryonale opbrengst significant daalde wanneer PHE 6h voor de inseminatie werd toegevoegd, in plaats van op het ogenblik van inseminatie zelf. Tabel 2 Het effect van de toevoeging van heparine, penicillamine (P), hypotaurine (H) en epinephrine (E) aan het fertilisatiemedium op de penetratie 9h na inseminatie. (uit: Susko-Parrish et al., 1990)

heparine heparine + P heparine + H heparine + E heparine + PHE

pen/totaal 24/66 34/66 33/64 39/68 46/67

% penetratie 35 52 52 57 69

b. UGent Net als aan het CRV wordt ook aan de UGent gebruik gemaakt van heparine (1.00%) als bevorderaar van de capacitatie van het sperma. Het basismedium is TALP, wat bestaat uit tyrode, albumine, lactaat en natrium pyruvaat. Daarnaast wordt het fertilisatiemedium verder gesupplementeerd met bovien serum albumine (BSA) (0.006g/ml). Als proteïnebron wordt hier ook BSA aangehaald, dit zou echter enkel van groot belang zijn wanneer de eicellen niet meer omgeven zijn door cumulus (Saeki et al., 1994), wat dus hier het geval niet is.

14

2.3

In vitro cultuur

Na 21h incubatie op het fertilisatiemedium, moet de embryonale ontwikkeling ten volste ondersteund worden. Dit gebeurt door de zygoten op een cultuurmedium te plaatsen (in vitro cultuur – IVC). Omdat de cumuluscellen hierbij de verdere ontwikkeling kunnen inperken, worden deze verwijderd door de COC’s gedurende drie minuten te vortexen. Tijdens deze cultuurfase vindt een eerste belangrijke verandering plaats, namelijk de omschakeling van maternaal naar zygotisch RNA (Schultz, 2002). Dankzij deze overgang, ook wel embryonale genoomactivatie genoemd, is de zygote in staat om verder te delen. Het exacte tijdstip van genoomactivatie is species afhankelijk: bij de muis op het tweecellig stadium, bij rundvee, schaap en mens op het vier- tot achtcellig stadium (Schultz, 1993 en Telford et al., 1990).

De condities waaronder deze cultuurfase plaatsvindt, zijn erg specifiek. De incubator staat in voor de waarborg van de gasfase en de temperatuur, grote fluctuaties hierin worden als erg nadelig gezien (Gardner, 2008). Zo bedraagt de gasconcentratie 5% zuurstofgas, 5% koolstofdioxide en 90% stikstofgas. De verlaging van de atmosferische zuurstofspanning (20%) naar 5% brengt een onderdrukking van de zuurstofradicaalvorming teweeg (Pool, 2002). Hierdoor wordt een significant hogere blastocystratio bekomen op dag 5 tot 6 na fertilisatie (Dumoulin et al., 1999). Thompson en Peterson (2000) rapporteerden dat de verdere daling van het zuurstofgehalte tot 2% een stijging van het aantal blastocysten gaf, maar dat er weliswaar meer afwijkende ontwikkelingen werden waargenomen na transfer van deze embryo’s. Daarnaast worden de beste resultaten gezien bij een temperatuur van 38,5°C, wanneer de temperatuur echter verder wordt opgedreven, is er sprake van ‘heat stress’. Dit leidt tot meer zuurstofradicaalvorming (Sugiyama et al., 2007) en vroegere embryonale sterfte (Hirao en Yanagimachi, 1978).

Naast de omgevingsfactoren waarin de IVC doorgaat, wordt ook specifieke aandacht gegeven aan de pH van het medium. Media worden naargelang de hoeveelheid CO 2 en bicarbonaat vervaardigd met een pH tussen 7,3 en 7,4 (Gardner, 2008). Toch hebben onderzoekers reeds aangetoond dat grote fluctuaties in de pH kunnen verdragen worden door de muriene embryo’s (Edwards et al., 1998). Maar de levensvatbaarheid van deze embryo’s na transfer was echter gedaald wanneer extreme pHwaarden werden aangehouden tijdens de cultivatie (Gardner, 2008). Naast de pH is er ook de osmolariteit van het medium, daar ontbreken echter nog duidelijke waarden voor. De waarden worden nu gebruikelijk binnen de grenzen van 275 en 295 mOsmol gehouden (Gardner, 2008).

2.3.1 a.

Medium en supplementen CRV

Aan het CRV wordt een synthetic oviductal fluid (SOF) cultuurmedium gesupplementeerd met bovien serum albumine (BSA) (0.4%). Dit SOF medium, gebaseerd op de biochemische samenstelling van de vloeistof aanwezig in schapenoviducten, werd in de jaren ’70 vervaardigd door Tervit et al. SOF is een eerder simpel en relatief goed gedefinieerd medium, in tegenstelling tot het voorheen complex en ongedefinieerd gebruikte TCM-199. Doorheen de jaren werd het SOF medium door allerlei 15

onderzoekers verder geoptimaliseerd (Rorie et al., 1994). Studies rapporteerden dat embryo’s gecultiveerd in SOF medium meer leken op hun in vivo tegenhangers dan wanneer ze gecultiveerd werden in TCM-199, voornamelijk op gebied van genexpressie (Wrenzychi et al., 2001; Yaseen et al., 2001). Daarenboven wordt een lagere zuurstofspanning gehanteerd in een SOF medium, welke meer in de lijn ligt van de in vivo omstandigheden in de eileider. Deze verlaagde spanning brengt ook een daling van de schadelijke zuurstofradicalen met zich mee. Albumine komt overvloedig voor in de vrouwelijke geslachtstractus, in tegenstelling tot het voorheen gesupplementeerde serum. Toevoeging van BSA aan het medium voorkomt daarbij dat embryo’s met hun oppervlakte aan het omgevende plastiek blijven kleven. Hierdoor zijn de embryo’s eenvoudiger te manipuleren en ondervinden ze minder schade. BSA ondersteunt ook de embryonale ontwikkeling door als belangrijke voedingsstof op te treden. Verder zou albumine een positieve invloed hebben op de toxische stoffen in het medium en een belangrijke rol spelen in de colloïd osmotische druk (Palasz et al., 2000). Toch is albumine niet compleet veilig, BSA bevat vaak vetzuren en andere kleine moleculen(Hanson en Ballard, 1968). Men moet er zich dus steeds van bewust zijn dat ook BSA een mogelijke bron van biologische contaminatie kan zijn (Gardner, 2008). Aan het CRV worden tijdens de IVC de embryo’s van elke koe apart geïncubeerd in 500 µl SOF medium. Omwille van de grote hoeveelheid medium wordt er geen beschermende laag minerale olie over het welletje gegoten. Wel worden de gedeelde embryo’s vier dagen na de fertilisatie overgezet naar een nieuw welletje waarin vers medium werd ingebracht. b.

UGent

Ook aan de UGent wordt een SOF cultuurmedium gesupplementeerd met BSA (0.4%). Maar daarbovenop wordt ook 5µg/ml insuline, 5µg/ml transferrine en 5 ng/ml selenium (ITS) toegevoegd aan het medium.

Insuline, een hormonaal polypeptide, promoot de opname van aminozuren en glucose door de blastocyst (Spicer en Achternkamp, 1995), waardoor de embryonale ontwikkeling gestimuleerd wordt. De vorming van de blastocyst wordt hierdoor verder ondersteund, alsook zou insuline de mitogenese ter hoogte van de inner cell mass bevorderen. Dankzij insuline wordt ook een betere foetale groei gezien na het terugplaatsen van een blastocyst. Ijzer is een essentiële component in de cultivatie, zonder deze kunnen embryonale cellen moeilijk groeien. Omdat vrij ijzer kan deelnemen aan redox reacties die oxidatieve stress veroorzaken, is het nodig dat de opslag, transport en levering ervan onder goed gecontroleerde omstandigheden plaatsvindt. Transferrine speelt aldus een centrale rol in dit extracellulair ijzer management (Penhallow et al., 1986). Selenium kan beschouwd worden als een essentieel element voor de groei en ontwikkeling, zowel in vivo als in vitro. Als antioxidant beschermt selenium de embryo’s door peroxiden, organische hydroperoxiden en peroxynitrieten onschadelijk te maken (McKeehan et al., 1976). Shamsuddin et al. (1994) onderzochten het effect van ITS

16

toegevoegd aan BSA-gesupplementeerd medium op de blastocystratio, daaruit bleek ITS voor een significante toename van blastocysten te zorgen (tabel 3). Tabel 3 Deling- en blastocystratio zonder en met toevoeging van insuline, transferrine en selenium (ITS) aan een BSA-gesupplementeerd medium. (uit Shamsuddin et al., 1994)

Zygoten

Delingsratio

225 242

74,7±2,8 78,8±3,5

BSA BSA + ITS

Blastocystratio Dag 7 Dag 8 2,8±1,2 7,7±1,1 12,6±3,4 25,6±4,7

Omdat de UGent 25 embryo’s in 50 µl druppels medium cultiveert, wordt een beschermende toplaag minerale olie gehanteerd. Deze olie is een destillaat van aardolie en is een heldere, kleurloze vloeistof die chemisch inert is. De evaporatie, temperatuurschommelingen en microbiologische contaminatie van het medium worden gereduceerd door de toplaag olie (Raty et al., 2004). De mogelijke invloed van de minerale olie op de embryo’s en hun ontwikkeling werd verder onderzocht door Ferruzzi et al. (2000). Het belang van het gebruik werd hier bevestigd, maar de olie had verder geen negatieve gevolgen voor de blastocystontwikkeling.

2.3.2

Embryodensiteit

Tal van onderzoeken toonden reeds aan dat de grootte van de embryogroep en de hoeveelheid medium een rol speelt in de verdere ontwikkeling tot blastocyst. Zo cultiveerden Blondin en Sirard (1994) boviene embryo’s zowel individueel (1 per 10 µl druppel, embryodensiteit 1:10) als in groep (10 per 50 µl druppel, embryodensiteit 1:5). Ze rapporteerden significant meer morulae in de groepscultuur ten opzichte van de individuele cultuur, respectievelijk 45,9% en 28,0%. Ook andere onderzoekers toonden een positief effect aan wanneer de embryodensiteit toenam, dit door het volume medium te verminderen of het aantal embryo’s gecultiveerd per eenheid te laten toenemen (Donnay et al., 1997; Yuan et al., 2000) (tabel 4). Ook hebben zygoten van een mindere kwaliteit baat bij groepscultuur, dit werd onderzocht door Khurana en Niemann (2000). In 500 µl media werden zowel 20 als 40 zygoten van verschillende kwaliteit gecultiveerd, in deze laatste groep werden meer morulae en blastocysten waargenomen. Tabel 4 Embryoproductie afhankelijk van de groepsgrootte. 50 µl druppels medium bevatten 1, 5 en 25 embryo’s (S1, S5, S25), geëvalueerd door deling- en blastocystratio’s. (gemid ± SD) (uit Yuan et al., 2000)

Groep S1 S5 S25

Aantal embryo's 457 549 535

Delingsratio 56,5±7,2 67,5±7,1 71,5±4,3

Blastocystratio 3,4±2,5 14,5±1,8 17,8±2,6

Hatched blastocystratio 0,3±0,3 6,0±1,9 15,9±3,3

Het gebruik van groepen met een hoge embryodensiteit kan zonder probleem benuttigd worden in IVP op grote schaal. Aan de UGent wordt tijdens de IVC gewerkt met een embryodensiteit van 1:2 (25 embryo’s in 50 µl medium). Maar in de commerciële praktijk is dit vaak niet mogelijk, omdat hier onvermijdelijk met kleine aantallen oöcyten en embryo’s wordt gewerkt. Hier is het dus noodzakelijk om boviene embryo’s individueel of in kleine groepen te gaan cultiveren, en doordat de cultivatie plaatsvindt in 500 µl daalt de embryodensiteit opmerkelijk. 17

MATERIAAL EN METHODEN 1. Media Alle producten werden aangekocht bij Sigma-Aldrich (Bornem, Belgïe), met uitzondering van TCM-199 en penicilline/streptomycine (GIBCO-BRL Life Technologies, Merelbeke, België), Percoll gradiënt en Redigrad gradiënt (GE Healthcare, Leuven, België), LH/FSH (Sioux Biochemical, Nederland), PHE en opvangmedium B (aanmaak door het CRV). Voor de compositie van de media wordt verwezen naar de reeds beschreven hoofdstukken (2.1.2; 2.2.3; 2.3.1)

2. In vitro embryoproductie 2.1

Standaardprotocol UGent

2.1.1

Verzamelen van ovaria en eicelcollectie

De ovaria werden gecollecteerd in een nabijgelegen slachthuis in een isolerende container, dit om afkoeling tegen te gaan. Ze werden binnen de drie uur na de dood van de dieren getransporteerd naar het laboratorium, waar het omgevende weefsel (mesovarium en vet) van de ovaria werd geknipt. Vervolgens werden deze gespoeld in 300 ml warme (39°C), fysiologische zoutoplossing gesupplementeerd met 0.5% kanamycine. Nadien werden de ovaria afgedept met een in ethanol gedrenkte handdoek, waarna ze nog tweemaal gewassen werden in een propere, kanamycinebevattende, fysiologische zoutoplossing. Het reservoir met de gewassen ovaria in de oplossing werd op een warmtematje (37°C) geplaatst, dit om ervoor te zorgen dat de nog niet gepuncteerde ovaria niet te snel afkoelden.

Follikels met een grootte tussen 2 en 8 mm werden aangeprikt met behulp van een 18 gauge naald en een 10 ml spuit. Hiermee werd het follikelvocht, inclusief de aanwezige COC, geaspireerd. Het follikelvocht werd verzameld in 15 ml falcon proefbuizen, waarin zich reeds 2.5 ml HEPES-TALP bevond. TALP werd bereid door het samenvoegen van 114 mM NaCl, 3.1 mM KCl, 0.3 NaH2PO4, 2.1 mM CaCl2.2H2O, 0.4mM MgCl2.6H2O, fenolrood (0.2%), 2 mM bicarbonaat, 1 mM natriumpyruvaat, 36 mM natriumlactaat en 10 mg/ml gentamycine. HEPES-TALP werd vervaardigd door 8.5 ml HEPES en 0.34 g BSA aan 850 ml TALP toe te voegen. De falcon buizen werden op het warmtematje geplaatst om de COC’s in het medium van een ideale temperatuur te voorzien. Na het puncteren werden de buizen in de incubator geplaatst, zodat de COC’s in een warme omgeving de tijd hadden om te bezinken. Vervolgens werd met naald en spuit het supernatans verwijderd. Het bezinksel werd uitgegoten in een 94/16 mm petrischaal, de falcon buizen werden meerdere keren gespoeld met HEPES-TALP om het achterblijven van COC’s in de buis te vermijden. Onder de stereomicroscoop en met behulp van een unopette werden de COC’s in de petrischaal opgezocht en overgebracht in een 35/10 mm petrischaal gevuld met 2.5 ml HEPES-TALP. Enkel de COC’s van goede en uitstekende kwaliteit werden hier geselecteerd. Deze COC’s werden nogmaals gewassen in het deksel van deze

18

petrischaal, waarvan de bodem opnieuw gevuld werd met HEPES-TALP. Hierin werden de COC’s reeds gegroepeerd per 60. 2.1.2

In vitro maturatie

De reeds opgezochte COC’s werden per 60 gewassen in 500 µl maturatiemedium in een linker welletje van de vierwellplaat waarna ze werden overgeplaatst naar het rechter welletje en daar werden ze gedurende 22h geïncubeerd in 500 µl maturatiemedium bij 38.5°C en 5% CO2. 2.1.3

In vitro fertilisatie

Om de eicellen te bevruchten werd diepgevroren sperma gebruikt. Voor beide experimenten werd het sperma van eenzelfde stier gebruikt, die reeds eerder zijn bevruchtingsvermogen in vitro had bewezen. Het diepgevroren sperma werd bewaard in een container met vloeibare stikstof N2 (-196°C). De rietjes sperma werden eerst 5 seconden in de open lucht ontdooid, en vervolgens in een warm waterbad (37°C) gehouden gedurende 1 minuut. Na het openknippen en opvangen van het sperma in een eppendorf, werden de beste spermacellen geselecteerd aan de hand van een densiteitsgradiënt. De percoll 90% fractie werd in een 15 ml falcon proefbuis gepipetteerd, waarna de 45% fractie er zorgvuldig bovenop werd gepipetteerd. Bovenop dit alles werd het sperma toegevoegd met behulp van naald en spuit (foto 6). De spuit bevatte geen rubberen stamper, want rubber is namelijk toxisch voor sperma.

A B C

Foto 6 Een Percoll gradiënt bestaat uit een 90% fractie (C) en 45% fractie (B), waarop sperma (A) wordt toegevoegd. (Uit: Fotoboek Universiteit Gent, faculteit diergeneeskunde, voortplanting en verloskunde)

Vervolgens werden de proefbuizen gecentrifugeerd: Een eerste keer gedurende 30 minuten bij 900g waardoor de levende spermacellen zich onderaan de 90% fractie bevonden. Na het afnemen van het supernatans werd hier Sperma-TALP met BSA bijgevoegd. Vervolgens werd dit opnieuw gecentrifugeerd, 10 minuten bij 125g, waarna het supernatans opnieuw met naald en spuit verwijderd werd. Met behulp van een Bürkerse telkamer (foto 7) werd de concentratie van deze verkregen

19

spermafractie bepaald om een verdunning van 2 miljoen spermacellen per ml fertilisatiemedium te maken. Ondertussen werden de COC’s na een wasstap overgeplaatst vanuit het maturatiemedium naar 250 µl fertilisatiemedium, waaraan per welletje nog 250 µl spermaverdunning werd toegevoegd. Op die manier bedroeg de totale inhoud per welletje 500 µl fertilisatiemedium en is de uiteindelijke spermaconcentratie een miljoen spermacellen per milliliter. De motiliteit van het sperma werd nadien gecontroleerd onder de stereomicroscoop, waarna de plaatjes gedurende 21h werden geïncubeerd bij 38.5°C en 5% CO2.

Foto 7 In een Bürkerse telkamer wordt de concentratie van het sperma bepaald.

2.1.4

In vitro cultuur

Bevruchte eicellen werden ontdaan van de omgevende cumuluscellen en spermacellen door deze in een 15 ml falcon proefbuis gevuld met 2.5 ml HEPES-TALP gedurende drie minuten te vortexen. Nadien werd de proefbuis geledigd en nagespoeld met HEPES-TALP in een 35/10 mm petrischaal, waarna de eicellen werden opgezocht onder de stereomicroscoop en overgeplaatst in het deksel van deze petrischaal, gevuld met HEPES-TALP. Vervolgens werden deze gewassen in een 35/10 mm petrischaal met SOF-medium. Er werd een selectie gemaakt waardoor enkel de eicellen met een intacte zona pellucida en homogeen cytoplasma werden gecultiveerd. Per groep van 60 gematureerde en bevruchte eicellen werden twee groepen van 25 gevormd die elk in een druppel van 50 µl BSA/ITS-gesupplementeerd SOF-medium gecultiveerd werden waarover zich een beschermende toplaag minerale olie bevond. De cultivatie vond plaats gedurende 7 dagen bij 38.5°C en in een gasmengsel van 5% CO2, 5% O2 en 90% N2.

2.2

Standaardprotocol CRV

Naast de commerciële activiteit van het CRV waar de traceerbaarheid van de koe belangrijk is, worden ook experimentele studies uitgevoerd aan het CRV. Tijdens deze experimentele studies wordt steeds gebruik gemaakt van oöcyten afkomstig van slachthuisovaria, dit protocol wordt hier vervolgens beschreven.

2.2.1

Verzamelen van ovaria en eicelcollectie

Ook hier werden de ovaria gecollecteerd in een nabijgelegen slachthuis in een isolerende container en werden ze binnen de drie uur na de dood van de dieren getransporteerd naar het laboratorium. Het omgevende weefsel werd van de ovaria geknipt. Vervolgens werden deze driemaal gespoeld in een 20

300 ml warme (39°C), fysiologische zoutoplossing gesupplementeerd met penicilline/streptomycine. Het reservoir met de gewassen ovaria in de oplossing werd ook hier op een warmtematje (37°C) geplaatst.

Follikels met een grootte tussen 2 en 8 mm werden ook hier op dezelfde wijze aangeprikt. Het follikelvocht werd verzameld in 15 ml falcon buizen waarin zich reeds 2.5 ml opvangmedium B bevond. Opvangmedium B werd vervaardigd door het samenvoegen van TCM-199, HEPES , NaHCO3 en 10 µl/ml penicilline/streptomycine. Dit medium werd gesupplementeerd met 9.9% fetal calf serum (FSC). De falcon buizen werden op het warmtematje geplaatst. Na het bezinken van de COC’s werd het supernatans verwijderd en werden de buizen leeggegoten in een 94/16 mm petrischaal en nagespoeld. Met behulp van een unopette werden de COC’s overgebracht in een 35/10 mm petrischaal gevuld met 2.5 ml opvangmedium B. Alle COC’s werden overgeplaatst naar het deksel van deze petrischaal, welke ook gevuld was met opvangmedium B. De op het zicht beschadigde eicellen en de naakte oöcyten werden niet mee overgeplaatst. 2.2.2

In vitro maturatie

De opgezochte COC’s werden gewassen in het midden van de vierwellplaat in het FCS-bevattende CH-medium en werden vervolgens in een welletje met 500 µl medium geïncubeerd. De maturatie vond plaats in groepen van 35. De plaatjes werden gedurende 22h geïncubeerd bij 38.5°C en 5% CO2. 2.2.3

In vitro fertilisatie

Na de maturatie werden de COC’s gefertiliseerd. Diepgevroren sperma, afkomstig van eenzelfde stier, werd op eenzelfde manier ontdooid in een warmwaterbad (37°C) en onderworpen aan een densiteitsgradiënt. De redigrad gradiënt onderging slechts één centrifugesessie, dit gedurende 30 minuten aan 700g. Na het centrifugeren werd het supernatans van de gradiënt verwijderd, waardoor enkel de geselecteerde spermacellen achterbleven in 100 µl medium per gebruikt rietje. Aan de redigrad pellet werd vervolgens 50 µl opzwemmedium toegevoegd. De spermaconcentratie werd bepaald via de Bürkerse telkamer, waarna de gepaste verdunning werd aangemaakt. De gematureerde COC’s werden vanuit het maturatiemedium overgeplaatst in het fertilisatiemedium, tussenin werden de COC’s opnieuw gewassen in het midden van de vierwellplaat. Aan het medium met de COC’s werd vervolgens het sperma toegevoegd. Ook hier werd bevrucht met een miljoen spermacellen per milliliter. Net voor het toevoegen van de spermasuspensie werd 20 µl penicillamine, hypotaurine en epinephrine (PHE) en 20 µl heparine aan 430 µl fertilisatiemedium toegevoegd. Vervolgens werd hieraan 20 µl sperma toegevoegd. De motiliteit van het sperma werd nadien gecontroleerd onder de stereomicroscoop, waarna de plaatjes gedurende 21h werden geïncubeerd bij 38.5°C en 5% CO2.

21

2.2.4

In vitro cultuur

De eicellen werden na de incubatie ontdaan van de cumuluscellen door deze in een 15 ml falcon proefbuis met 2.5 ml wasmedium gedurende drie minuten te vortexen. Vervolgens werd de buis geledigd en nagespoeld in een 35/10 mm petrischaal. Alle eicellen werden opgezocht onder de stereomicroscoop en overgeplaatst in het deksel van deze petrischaal, gevuld met wasmedium. Vervolgens werden deze in 35/10 mm petrischaal met SOF-medium en een toplaag minerale olie gewassen. Vervolgens werden de eicellen in groepen van 35 geïncubeerd in 500 µl BSAgesupplementeerd SOF-medium. Op dag vier na de fertilisatie werden de gedeelde embryo’s overgeplaatst naar 500 µl vers medium. De cultuur vond plaats bij 38.5°C en een gasmengsel van 5% CO2, 5% O2 en 90% N2.

3. Experimentele proefopzet 3.1

Experiment 1: protocolvergelijkende proef

In dit eerste experiment werd het protocol dat gebruikt wordt aan de faculteit diergeneeskunde en dat aan het CRV vergeleken met elkaar. De verschillende media die gebruikt werden (tabel 5), vormden de basis van deze proefopzet. Ook de hoeveelheid media en het aantal geïncubeerde eicellen/embryo’s verschilden. De embryodensiteit speelde dus ook een belangrijke rol in deze proef. Aan het CRV worden standaard op dag 4 na fertilisatie de meercellige embryo’s overgezet op vers medium. Dit werd tijdens de proef ook uitgevoerd voor beide protocols. Tabel 5 Een overzicht van de media en supplementen volgens het protocol, UGent of CRV, met aanduiding van de specifieke embryodensiteit volgens de fase van de IVP.

UGent

CRV

EICELCOLLECTIE IVM

kanamycine pen/strep Maturatie medium CH medium EGF FCS gentamicine pen/strep LH/FSH cysteamine embryodensiteit 1:8,3 1:14,3 IVF FERT medium E medium heparine heparine BSA BSA penicillamine hypotaurine epinephrine embryodensiteit 1:8,3 1:14,3 SPERMAGRADIENT percoll redigrad IVC SOF medium SOF medium BSA BSA insuline transferrine selenium olie toplaag embryodensiteit 1:2 1:14,3

22

Proefopstelling: Bij elk replicaat (n=3) werden de helft van de eicellen (n=120) onderworpen aan het standaard protocol van de UGent en de andere helft (n=140) aan het standaardprotocol van het CRV, zoals hiervoor beschreven werd. Op dag 4 na de bevruchting werden beide groepen nogmaals opgesplitst (figuur 2) om het effect na te gaan van overzetten van meercellige embryo’s naar vers medium. Van de embryo’s onderworpen aan het standaard protocol van de UGent bleef de helft van de embryo’s (n=50) in dezelfde druppel medium, terwijl van de andere helft (n=50) de meercellige embryo’s overgeplaatst werden naar een verse druppel medium. Hetzelfde werd gedaan met de embryo’s onderworpen aan het standaardprotocol van het CRV teneinde 4 groepen te bekomen: 1) UGent zonder vers medium, 2) UGent overgezet in vers medium 3) CRV zonder vers medium en 4) CRV overgezet in vers medium.

Figuur 2 Een schematisch voorstelling van de groepsgrootte, de hoeveelheid medium en de handeling op dag 4 na de fertilisatie gedurende de IVP.

3.2

Experiment 2: individuele koemodel

Een veehandelaar kan een embryo laten samenstellen aan het CRV. Vandaar dat hier eicellen/embryo’s steeds per koe worden gecultiveerd. Naast de onderlinge variatie in opbrengst tussen koeien, is er ook sprake van een variatie in eicelkwaliteit. In deze proef werd het gebruik van de Corral dish (foto 8) voorgesteld, hierdoor kunnen embryo’s afkomstig van een koe samen met nog drie andere groepen embryo’s afkomstig van verschillende koeien gecultiveerd worden. Omwille van de specifieke opbouw waarvan de 2 centrale welletjes zijn opgedeeld in kwadranten gescheiden door een semipermeabele wand, kan het medium zich over de kwadranten gaan verspreiden maar bleven de eicellen ter plaatse. Dankzij de stevige wand waaruit de kwadranten zijn opgebouwd, bleef de traceerbaarheid van de embryo’s gegarandeerd. In deze proef werd nagegaan of embryo’s beter ontwikkelden in de Corral dish in vergelijking met de cultuur in kleine groepen per koe. De media en supplementen die hier benuttigd werden, waren deze volgens het standaardprotocol aan de UGent. 23

Foto 8 Corral dish waarbij de twee centrale welletjes in kwadranten zijn opgedeeld door een semipermeabele wand. (Uit: Fotoboek Universiteit Gent, faculteit diergeneeskunde, voortplanting en verloskunde)

Proefopstelling Per replicaat (n=4) werden in het slachthuis, naast de standaardprocedure, de ovaria van 16 koeien apart bijgehouden. Per koe werd er vervolgens notitie gemaakt van de grootte van de twee ovaria, het aantal follikels per ovarium en de aan- of afwezigheid van een corpus luteum. Het follikelvocht van de twee gepuncteerde ovaria werd per koe apart verzameld in 5 ml proefbuisjes, die vooraf met 1 ml HEPES-TALP gevuld werden. Alvorens de ovaria van een volgende koe te puncteren, werd de naald en spuit gespoeld met HEPES-TALP zodat eventuele overblijvende COC’s toch in de juiste proefbuis verzameld werden. Deze buisjes werden vervolgens in steeds een nieuw steriele 94/16 mm petrischaal uitgegoten en gespoeld, waarna de opgezochte COC’s in een aparte 35/10 mm petrischaal, gevuld met HEPES-TALP, werden overgebracht. Enkel de zichtbaar beschadigde en naakte eicellen werden niet overgeplaatst. Per koe werden tien oöcyten in 500 µl maturatiemedium geplaatst en vervolgens werden deze per koe gefertiliseerd in opnieuw 500 µl fertilisatiemedium. Na het bevruchten werden 2 groepen gevormd: van de eerste groep werden per koe acht bevruchte eicellen gecultiveerd in microdruppels van 30 µl medium in een petrischaal, overgoten met een laag minerale olie. Van de tweede groep werden acht bevruchte eicellen in de Corral dish geplaatst, 1 koe per kwadrant. De Corral dish welletjes bevatten elk 120 µl SOF-medium, en over de gehele Corral dish werd een beschermend laagje minerale olie gegoten. Met de ovaria die de standaardprocedure ondergingen en waarbij dus de COC’s allen in eenzelfde falcon buis werden verzameld, werden nog twee andere groepen gevormd. De ene groep bestond uit kleine aantallen: gedurende IVM en IVF werden 80 eicellen in groepjes van 10 geïncubeerd in 500 µl medium. Tijdens de IVC werden er 8 groepjes met telkens 8 eicellen ontdaan van hun cumulus op 30 µl SOF-medium gecultiveerd, overgoten met een laagje minerale olie. De andere groep, hier de controlegroep, volgde het standaardprotocol van UGent. Hierbij vond de IVM en IVF in een groep van 60 plaats en de ging de IVC door in twee groepen met elk 25 geselecteerde eicellen. 24

Met andere woorden, tijdens de IVC werden er vier groepen gevormd (figuur 3): 1) individuele koe in druppels, 2) individuele koeien in de Corral dish, 3) kleine groepen met gerandomiseerde embryo’s, 4) standaard groepscultuur.

Figuur 3Een schematische weergave van de groepsgrootte en kwantiteit medium tijdens IVM/IVF/IVC met bijhorende grafische weergave van de vier groepen tijdens IVC.

4. Evaluatie van de proeven De twee experimenten werden elk geëvalueerd aan de hand van volgende parameters: het delingspercentage 45h na de fertilisatie (45hpi), de blastocystontwikkeling op dag 7 en dag 8 na de fertilisatie. Daarnaast werd bij het eerste experiment (protocolvergelijking UGent – CRV) ook het delingspercentage op dag 4 na de fertilisatie geëvalueerd. Bij het beoordelen van de deling werden de zygoten opgedeeld in 6 verschillende groepen (foto 9): niet gedeeld, 2 cellen, 3-4 cellen, 5-7 cellen, 8 cellen en >8 cellen. De som van alle gedeelde zygoten werd gedeeld door het totaal aantal gecultiveerde zygoten in de groep en dit resultaat is het delingspercentage. De blastocysten op dag 7 en dag 8 na fertilisatie werden opgedeeld in volgende groepen (foto 10): jonge blastocyst, normale blastocyst, geëxpandeerde blastocyst, hatching blastocyst en hatched blastocyst. Vervolgens werd respectievelijk voor dag 7 en dag 8 de som van alle blastocysten gedeeld door het totaal aantal gecultiveerde zygoten in de groep. Dit resultaat is de blastocystratio op respectievelijk dag 7 en dag 8. Verder werd nog de hatching rate geëvalueerd, hierbij behoren de hatching en hatched blastocyst op dag 8 na fertilisatie, dit aantal werd gedeeld door het totaal aantal blastocysten in de groep.

25

A

B

C

D

E

F

Foto 9Weergave van een niet-gedeeld embryo (A), een embryo met 2 cellen (B), 3 cellen (C), 5 cellen (D), 8 cellen (E) en meer dan 8 cellen (F). (Uit: Asgari et al., 2012)

A

B

C

D

E

Foto 10 Weergave van een jonge blastocyst (A), normale blastocyst (B), geëxpandeerde blastocyst (C), hatching blastocyst (D) en een hatched blastocyst (E). (Uit: Fotoboek Universiteit Gent, faculteit diergeneeskunde, voortplanting en verloskunde)

Om de kwaliteit van de gevormde blastocysten na te gaan werden de blastocysten op dag 8 gefixeerd in een 2% paraformaldehyde oplossing en later gemerkt met een Hoechst fluorescente kleuring (foto 11). Hoechst is een fluorochroom dat bindt aan DNA. Dankzij een UV-laser (350 nm) zal het fluorochroom gaan exciteren en bij terugval naar het oorspronkelijk energieniveau emissielicht uitstralen met een frequentie van 461 nm (grafiek 1). Hoechst bindt aan alle nucleïnezuren, maar heeft een grotere affiniteit voor sequenties rijk aan adenine-thymine verbindingen. Dankzij Hoechst werd hier het DNA van de blastomeren gekleurd, waardoor het totaal cel aantal bepaald kon worden.

Grafiek 1 Het spectrum waarbij een met Hoechst gekleurde cel licht absorbeert en emissielicht uitstraalt.

26

A

B

Foto 11 Dankzij Hoechst fluorescente kleuring lichten de kernen van de blastomeren afzonderlijk op onder een fluorescentiemicroscoop. (A) blastocyst, (B) hatching blastocyst (schaal: 50 µm) (Uit: Fotoboek Universiteit Gent, faculteit diergeneeskunde, voortplanting en verloskunde)

5. Statistische analyse De resultaten van beide experimenten werden statistisch geanalyseerd door gebruik te maken van een binair logistisch regressie model van IBM SPSS Statistics 20, met replicaat en groep als fixed factors. Het delingspercentage 45hpi en op dag 4 in het eerste experiment en de blastocystratio op dag 7 en op dag 8 na fertilisatie werden berekend. Er werd voor beide experimenten de controlegroep waar het standaardprotocol UGent werd uitgevoerd gekozen. Zodoende werden de andere groepen binnenin een experiment vergeleken met deze controlegroep. P-waarden kleiner dan 0.05 werden als significant beschouwd. Het totaal cel aantal werd via lineaire regressie geanalyseerd. Ook hier werd de controlegroep (standaardprotocol UGent) vergeleken met de uitkomst van de andere groepen binnenin hetzelfde experiment. Opnieuw werden P-waarden kleiner dan 0.05 beschouwd als significant.

27

RESULTATEN 1. Experiment 1: protocolvergelijkende proef Bij het evalueren van het delingspercentage op 45hpi werden geen significante verschillen waargenomen tussen beide groepen (UGent-CRV), delingspercentage op dag 4 na fertilisatie vertoonde echter wel een verschil. Hierbij werden in de groep CRV significant meer gedeelde embryo’s ten opzichte van de UGent groep bemerkt (P=0.042) (tabel 6). Wat betreft de sneldelende embryo’s, dit zijn embryo’s met meer dan 5 cellen op 45phi en meer dan 8 cellen op dag 4, werden er geen significante verschillen geobserveerd tussen beide groepen op 45 hpi maar wel op dag 4 (grafiek 2). Op dag 4 na fertilisatie deelden de embryo’s zich significant sneller in de CRV groep dan in die van de UGent (P=0.014) . Nadat van elk protocol twee groepen overgeplaatst werden op vers medium op dag 4 na de fertilisatie, werden de blastocystratio’s per groep bekeken. Op dag 7 werd waargenomen dat de groep ‘UGent zonder transfer naar vers medium’ significant meer blastocysten ontwikkelde dan de groep ‘CRV zonder transfer naar vers medium’ (P= 0.019). Deze vaststelling werd ook gezien op dag 8, met een hogere significantie (P=0.008). Op dag 8 werd naast de blastocystratio ook de hatching rate geëvalueerd. Daar werd een sterke tendens waargenomen, de groep ‘UGent zonder transfer naar vers medium’ ontwikkelde meer blastocysten die hatchen (P=0.057) dan de andere drie groepen. Deze resultaten werden weergegeven in tabel 7. Tabel 6 Weergave van het delingsratio op 45 hpi en op dag 4 na fertilisatie. (Data worden weergegeven als Gemid ± SD) (P<0.05: *; P<0.01: **; P<0.001: ***)

Delingsratio (%) 45 hpi 70,2 ± 2,65 69,5 ± 2,46

Dag 4 pi 73,9 ± 2,54 80,6 ± 2,11*

Sneldelende embryo's 60

*

50 Percentage

UGent CRV

Aantal oöcyten 299 351

40 30

Snel 45 hpi

20

Snel dag 4 pi

10 0 UGent

CRV

Grafiek 2 Het aantal sneldelende embryo’s op 45hpi (>5 cellen) en op dag 4 na fertilisatie (>8 cellen). (P<0.05: *; P<0.01: **; P<0.001: ***)

28

Tabel 7 Weergave van de blastocystratio op dag 7 en dag 8 na fertilisatie en de hatching rate (Gemid ± SD). (P<0.05: *; P<0.01: **; P<0.001: ***)

Blastocystratio (%)

UGent zndr vers medium UGent vers medium d4 CRV zndr vers medium CRV vers medium d4

Aantal oöcyten 149 150 176 175

Dag 7 23,5 ± 3,47 26,0 ± 3,58 15,3 ± 2,71* 20,6 ± 3,06

Dag 8 37,6 ± 3,97 42,0 ± 4,03 24,4 ± 3,24** 36,6 ± 3,64

Hatching 21,4 ± 5,48 7,9 ± 3,40 7,0 ± 3,89 7,8 ± 3,35

Het totaal cel aantal van de blastocysten uit de vier groepen werd met behulp van een fluorescentiemicroscoop geëvalueerd. De resultaten (grafiek 3) toonden een significant hoger aantal cellen in de controlegroep ‘UGent zonder transfer naar vers medium’ dan die van ‘UGent met vers medium op dag 4’ (P=0.03), ‘CRV zonder transfer naar vers medium’ (P<0.001) en ‘CRV met vers medium op dag 4’ (P=0.003).

Totaal cel aantal 350 300

Cellen

250

**

200

***

**

150 100 50 0 UGent zndr vers medium

UGent vers medium d4

CRV zndr vers medium

CRV vers medium d4

Grafiek 3 Het totaal cel aantal via Hoechst kleuring.(P<0.05: *; P<0.01: **; P<0.001: ***)

2. Experiment 2: individuele koemodel Wanneer het delingspercentage van de vier groepen werden geëvalueerd, werden geen significante verschillen waargenomen. Ook was er geen opmerkelijk verschil in sneldelende embryo’s (5-8 cellen) op 45hpi tussen de groepscultuur en de andere drie groepen (resultaten niet weergegeven). Wat betreft de blastocystratio op dag 7 na de fertilisatie werd gezien dat de groepscultuur significant meer blastocysten ontwikkelde ten opzichte van de gemixte groep, van het individuele koemodel en van de Corral dish (tabel 8). Ook op dag 8 ontwikkelde de groepscultuur significant meer blastocysten dan het individuele koemodel (P<0.001) en de Corral dish (P=0.003). Daarnaast kon er gesproken worden van een duidelijk sterke tendens dat de groepscultuur ook ten opzichte van de gemixte groep meer blastocysten ontwikkelde (P=0.053). Verder werden er geen significante verschillen bemerkt in de hatching rate tussen de groepscultuur en de andere drie groepen. Ook wat betreft het totaal cel aantal 29

werden er geen significante verschillen geëvalueerd tussen de groepscultuur en de andere drie groepen (grafiek 4). Tabel 8 De blastocystratio’s op dag 7 en dag 8 na fertilisatie en de hatching rate. (Gemid ± SD) (P<0.05: *; P<0.01: **; P<0.001: ***; a: P=0.053)

Blastocystratio (%)

Groepscultuur Mixed model Individuele koemodel Corral dish

Aantal oöcyten 201 256 234 219

Dag 7 33,3 ± 2,35 19,5 ± 2,48*** 16,2 ± 2,41*** 18,7 ± 2,63***

Dag 8 40,8 ± 3,47 32,0 ± 2,92a 24,8 ± 2,82*** 26,9 ± 3,00**

Hatching 20,7 ± 4,47 17,1 ± 4,16 17,2 ± 4,96 22,0 ± 5,39

Totaal cel aantal 350 300

Cellen

250 200 150 100 50 0 Groepscultuur

Mixed model

Individuele koecultuur

Corral dish

Grafiek 4 Het totaal cel aantal via Hoechst kleuring.

Verder werd geëvalueerd dat de embryo’s die ontwikkelden tot blastocyst op dag 8 afkomstig waren van ovaria met significant meer follikels in vergelijking met embryo’s die niet tot blastocyst uitgroeiden (43.6 ±1.50 vs 39.0 ± 0.91 ; P=0.013) (grafiek 5). Ook wat betreft de blastocysten op dag 7 is er sprake van een sterke tendens dat ook deze afkomstig waren van ovaria met beduidend meer follikels (P=0.064). De grootte van de ovaria en de aan- of afwezigheid van een corpus luteum had geen invloed op de embryonale ontwikkeling (resultaten niet weergegeven).

30

Ovaria 70

a

60

*

Follikels

50 40 30 20 10 0

D7 geen blastocyst

D7 blastocyst

D8 geen blastocyst

D8 blastocyst

Grafiek 5 Het aantal geaspireerde follikels per koe (twee ovaria) waarvan de COC’s die al dan niet ontwikkelden tot blastocysten op dag 7 en dag 8 afkomstig zijn. (Gemid ± SD) (P<0.05: *; P<0.01: **; P<0.001: ***; a: P=0.064)

31

DISCUSSIE De resultaten van het eerste experiment tonen aan dat de deling op 45hpi in de UGent groep sterk gelijkend is aan die van de CRV groep. Wanneer echter op een volgend tijdstip, namelijk op dag 4 na de fertilisatie, de deling geëvalueerd wordt, wordt een significante stijging gezien in het aantal meercellige embryo’s aan de CRV groep. Ook het aandeel sneldelende embryo’s op dit tijdstip, zijnde embryo’s die reeds meer dan acht cellen bezitten, is significant hoger in de CRV groep. Als mogelijke oorzaak hiervoor kunnen in de eerste plaats de mediaverschillen aangehaald worden: aan het maturatiemedium bij CRV wordt FCS, LH/FSH en cysteamine toegevoegd terwijl bij UGent enkel EGF gesupplementeerd wordt. Zo beschreven Choi et al. (1987) en Vanderhyden en Armstrong (1989) de positieve effecten van serumsupplementatie tijdens IVM op de verdere fertilisatie en embryonale ontwikkeling bij respectievelijk muizen en ratten. Verder rapporteerden Leibfried-Rutledge et al. (1987) dat er zich een betere maturatie van de boviene oöcyten voordeed wanneer serum aan het medium werd toegevoegd. Nochtans toonde een studie uitgevoerd door Lonergan et al. (1996) aan dat de toevoeging van EGF aan het maturatiemedium significant meer gedeelde en sneldelende embryo’s opleverde dan wanneer FCS werd gesupplementeerd. Maar een studie waar het effect van supplementatie van FCS en gonadotrope hormonen aan het maturatiemedium werd onderzocht, toonde aan dat er significant meer embryo’s deelden wanneer zowel FCS als hormonen werden toegevoegd (Saeki et al., 1991). Aangezien in de CRV groep beide werden toegevoegd, is het mogelijk dat door de synergistische werking van FCS en LH/FSH een hoger delingspercentage werd bekomen in vergelijking met de EGF-supplementatie aan de UGent groep. In de tweede plaatst kan de stijging in deling in de CRV groep ook te wijten zijn aan het feit dat er meer voedingsstoffen beschikbaar zijn voor de ontwikkelende embryo’s: de embryo’s in de CRV groep bevinden zich namelijk in 500 µl cultuurmedium, terwijl de embryo’s in de UGent groep slechts in 50 µl medium gecultiveerd worden. Nadat op dag 4 van één subgroep van beide groepen de meercellige embryo’s overgeplaatst werden op vers medium, werden de blastocystratio’s op dag 7 en dag 8 na fertilisatie geëvalueerd. Zowel op dag 7 als op dag 8 ontwikkelde de groep ‘CRV zonder transfer op vers medium’ significant minder blastocysten dan de controlegroep ‘UGent zonder transfer’. Omdat aan het CRV de embryo’s in 500 µl medium worden gecultiveerd, wordt geen beschermende laag minerale olie over het medium gebracht. Hierdoor kunnen de fysische karakteristieken van het cultuurmedium, waaronder de osmolariteit, beïnvloed worden door de verschillende omgevingscondities tijdens de uitgevoerde handelingen. Zo werd op dag 8 na fertilisatie vastgesteld dat de osmolariteit van het originele cultuurmedium ‘CRV zonder transfer’ met 100 eenheden toegenomen was, dit van 280 naar 380 mOsmol. Wat de exacte invloed van de osmolariteit van het medium is op de embryonale ontwikkeling is nog niet duidelijk geweten. Bij muizen werd reeds beschreven dat blastocysten zich kunnen ontwikkelen in een medium met een osmolariteitsomvang van 200 mOsmol tot 354 mOsmol, met een piek in de ontwikkeling bij 276 mOsmol (Brinster, 1965). Gebruikelijk wordt de osmolariteit van cultuurmedia binnen de grenzen van 275 en 295 mOsmol gehouden (Gardner, 2008). De stijging in 32

osmolariteit kan aldus bijdragen aan het feit dat er minder embryo’s tot blastocyst ontwikkelen wanneer er geen transfer op dag 4 gebeurt in het medium van het CRV. Verder kan er ook gedacht worden aan het feit dat de voedingsstoffen in het medium na een week cultuur opgebruikt werden, alsook dat toxische stoffen, zoals ammonium, zich sterk opstapelden. Aminozuren vervallen namelijk naar verloop van tijd. Ammonium is een eindproduct uit deze gedegenereerde aminozuren, en dit wordt in associatie gebracht met een vertraagde ontwikkeling van muizen- en humane embryo’s, alsook met een foetale retardatie en neurale defecten in muizen (Virant-Klun et al., 2006). Verder zou er ook een samenhang bestaan tussen het ammoniumgehalte in het cultuurmedium en het voorkomen van het large offspring syndrome bij schapen (Sinclair et al., 1998). Hammon et al. (2000) beschreven dat er door de aanwezigheid van ammonium in het cultuurmedium minder runderembryo’s ontwikkelen tot blastocyst. De ammoniumproductie werd geanalyseerd door Orsi en Leese (2004) en bedroeg 4.281 (±0.362) pmol/embryo/h tijdens de expansie en hatching periode van de blastocyst. Verder werd ook aangetoond door Lane et al. (2002) dat ammonium de embryonale groei vertraagt door het verstoren van de intracellulaire pH. Daarenboven heeft ammonium ook een nefast gevolg op de ontwikkeling van de inner cell mass in de blastocysten.

Als verder de blastocystopbrengst op dag 8 na fertilisatie wordt vergeleken tussen de standaard procedure aan de UGent en dat aan het CRV, wordt geen opmerkelijk verschil waargenomen. Met als gevolg kan er besloten worden dat beide standaardprotocols gelijkwaardig zijn wat betreft de aflevering van blastocysten op dag 8 na fertilisatie. Verder beschreven Vajta et al. (2010) de voordelen van het niet hernieuwen van de media: minder manipulatie van de embryo’s, endogene groeifactors accumuleren, de lage relatieve omgevingsstress, de lagere werklast en kost en minder kwaliteitscontrole. Maar zoals reeds eerder aangehaald, zijn hier ook twee nadelen aan verbonden: essentiële nutriënten worden niet vervangen en toxines kunnen zich opstapelen. Na talrijke studies wordt ook in bepaalde humane fertiliteitscentra gebruik gemaakt van een single medium waarbij de embryo’s niet meer overgeplaats worden op een vers medium. Deze methode kent een hogere aflevering volwaardige embryo’s op dag 5 dan wanneer gebruik gemaakt wordt van een sequentieel medium. Hierbij worden de embryo’s op dag 3 overgeplaatst naar een medium die inhoudelijk verschilt van het voorgaande (Reed et al., 2009).

Hoewel er geen verschil is in blastocystontwikkeling tussen de 2 standaardprotocols, werd er wel een een significant verschil vastgesteld wat betreft de hatching rate. Zo worden duidelijk meer hatching en hatched blastocysten gevormd bij uitvoering van het standaardprotocol aan de UGent. Er kan gesteld worden dat de ontwikkeling aan de UGent sterker gepromoot wordt. Als mogelijke oorzaak hiervan kan er gedacht worden aan de specifieke samenstelling van het cultuurmedium. De supplementatie van insuline, transferrine en selenium (ITS) werd reeds door talrijke onderzoekers (Bowles en Lishman, 1998) positief aangehaald. Insuline als zijnde een stimulator voor de energieopname door het embryo in de vorm van glucose, ondersteunt de blastocystontwikkeling en bevordert de mitogenese ter hoogte van de inner cell mass (Spicer en Achternkamp, 1995). Transferrine en selenium, beide antioxidantia, beperken de schade die vrijgestelde radicalen aanbrengen tijdens de

33

IVC. Doordat ITS niet toegevoegd wordt aan het cultuurmedium aan het CRV, is een mogelijke hypothese dat hier meer radicaalvorming en oxidatieve stress plaats vindt waardoor minder blastocysten gaan hatchen. Bijkomend werd ook een verschil gezien tussen de standaardprocedure aan de UGent waar de embryo’s de hele IVC in hetzelfde medium blijven en de groep waar de meercellige embryo’s overgeplaatst worden op vers medium op dag 4 na de fertilisatie. Deze beide groepen worden echter in dezelfde mediumsamenstelling gecultiveerd. Een mogelijke verklaring kan gevonden worden bij de door embryo’s geproduceerde autocriene factoren. Embryo’s produceren namelijk tijdens hun ontwikkeling autocriene factoren, voornamelijk onder de vorm van groeifactoren, en deze hebben een positieve invloed zowel op zichzelf als op de omgevende embryo’s (O’Neill, 2008) (figuur 2). Studies toonden reeds aan dat embryo’s gecultiveerd in groepen of in een klein volume een hogere deling en leefbaarheid vertonen (Gandolfi, 1994). In de groep ‘UGent zonder transfer’ kunnen de autocriene factoren zich meer opstapelen in het medium doordat het een week aangehouden wordt, en als gevolg kan de ontwikkeling van deze gecultiveerde embryo’s sterker geboost worden en kan er dus meer hatching voorkomen. Doordat in de groep ‘UGent zonder transfer’ de meeste blastocysten hatchen, is het totaal cel aantal in deze groep ook significant hoger. Naarmate de blastocyst zich verder ontwikkelt, groeit namelijk ook het totaal aantal cellen waaruit de blastocyst is opgebouwd.

Figuur 4 Embryo’s produceren autocriene factoren die de verdere ontwikkeling van zichzelf als van de omgevende embryo’s ondersteunen. (Naar O’Neil, 2008)

Bij commerciële activiteiten aan het CRV moeten de embryo’s steeds per koe traceerbaar zijn. Vandaar dat de eicellen en later de embryo’s steeds per koe worden geplaatst in één welletje. Afhankelijk van het stadium van de IVP bevinden deze zich in een welletje met maturatie-, fertilisatieof cultuurmedium. Doordat er een grote variatie is tussen koeien wat betreft het aantal puncteerbare oöcyten en de kwaliteit van deze eicellen, kunnen vaak slechts kleine groepen worden gevormd. Zoals reeds aangehaald, sprak Gandolfi (1994) over het positieve effect wanneer embryo’s in grote groepen of in een klein volume worden gecultiveerd. Daar dit dus vaak niet mogelijk is door het kleine aantal

34

embryo’s per koe, werd het gebruik van de Corral dish aangehaald. Het gebruik van de Corral dish werd voor het eerst beschreven door Ebner et al. (2010) om de voordelen van individuele opvolging van humane embryo’s en groepscultuur te combineren. In deze masterproef werd de opzet aangepast in die zin dat de embryo’s van één koe in één kwadrant van de Corral dish werden geplaatst. Zo konden de embryo’s van vier koeien volledig traceerbaar blijven gedurende de IVC, maar kon het medium en de gesecreteerde autocriene factoren zich over de 4 kwadranten verspreiden. Toch wordt bij de evaluatie van de resultaten, geen opmerkelijke stijging waargenomen in het aantal blastocysten op dag 8 in de Corral dish, en evenaart deze aldus niet het resultaat van de klassieke groepscultuur. Omdat in de groepscultuur een hogere embryodensiteit werd aangewend, kan de hogere concentratie aan autocriene factoren mogelijks een belangrijke rol spelen in de hogere blastocystontwikkeling. Door het hoger aantal blastocysten in de mixed model groep en in de groepscultuur ten opzichte van de twee groepen met de embryo’s gecultiveerd per koe, kan er gesuggereerd worden dat de afkomst van de koe mogelijks een invloed heeft op de verdere ontwikkeling van haar embryo’s. De variatie in de opbrengst tussen de koeien was in dit experiment immers groot, 0-100%. Het is mogelijk dat koeien met een matige blastocystopbrengst minder autocriene factoren produceren. Wanneer de embryo’s echter in de Corral dish worden gecultiveerd, kunnen de autocriene factoren, gesecreteerd door prominent ontwikkelende embryo’s, ook de embryo’s welke slechts een matige ontwikkeling kennen positief gaan beïnvloeden. Omwille van de sterk gelijkaardige blastocystratio’s op dag 8 tussen de Corral dish en de individuele koedruppels, kan dit effect in deze proefopzet als miniem worden beschouwd. Verder werd door Gopichandran en Leese (2006) beschreven dat de ideale afstand tussen embryo’s 165 µm is, dit zou de gemiddelde afstand zijn waarop embryo’s door elkaar dwarrelen. In de Corral dish bevinden de vier groepen zich echter op 4 mm van elkaar (figuur 5).

In dit experiment werd ook notitie gemaakt van de ovariële morfologie. Zo werd geëvalueerd dat de embryo’s die ontwikkelden tot blastocyst op dag 8 afkomstig waren van ovaria met significant meer follikels. Een studie door Gandolfi et al. (1997) toonde aan dat COC’s afkomstig van ovaria met minder dan 10 follikels van 2-5 mm significant minder matureerden en uitgroeiden tot blastocyst in vergelijking met deze afkomstig van ovaria met meer dan 10 follikels. Wanneer echter toch blastocystvorming optrad, telden deze blastocysten beduidend minder cellen. De onderliggende reden van deze verminderde embryonale ontwikkeling bij COC’s afkomstig van ovaria met weinig follikels is nog niet volledig achterhaald. In de studie van Gandolfi et al.(1997) werd bij 70% van de koeien met een ovarium met minder dan 10 follikels als tweede ovarium één met meer dan 10 follikels teruggevonden. De invloed van omgevingsfactoren zoals management, dieet, leeftijd… zijn dus wellicht niet aan de orde.

35

Figuur 5 Bovenaanzicht van een centraal welletje in de Corral dish met een doorsnede doorheen het diepste punt van een kwadrant. De diepste punten in de kwadranten bevinden zich 4 mm van elkaar.

Naast het effect van deze autocriene factoren, kan ook de groepsgrootte tijdens de IVM en IVF een gevolg hebben op de verdere embryonale ontwikkeling. Er werd aangetoond dat COC’s in staat zijn om extracellulaire substanties, waaronder hyaluronzuur (hyaluronic acid – HA), te produceren die de rijping sterk promoten. Een studie door de Vries et al. (2000) rapporteerde dat wanneer COC’s in kleine aantallen werden gematureerd, de concentratie HA laag is door ofwel lage productie ofwel door sterke verdunning. Hierdoor werden minder goede resultaten verkregen dan wanneer de IVM plaatsvond in grote groepen of wanneer exogeen HA werd gesupplementeerd. Doordat in de proefopzet van deze masterproef enkel de groepscultuur in een grote groep werd gematureerd en gefertiliseerd, kan dit mogelijks bijdragen tot de significant hogere blastocystratio.

36

Verder kan er besloten worden dat de groepsgrootte en de hoeveelheid medium gebruikt gedurende de IVP een belangrijke rol spelen in de embryonale ontwikkeling. Omdat traceerbaarheid van de embryo’s een belangrijke rol speelt in de commerciële activiteiten van het CRV, is het nodig dat er een model ontwikkeld wordt waardoor meerdere groepen samen gecultiveerd kunnen worden zonder verlies van de embryonale identiteit. Hierdoor kan geprofiteerd worden van een hogere embryodensiteit, met als gevolg ook een hogere concentratie aan autocriene factoren.

37

REFERENTIES Ali A., Sirard M.A. (2002). The effects of 17-beta-estradiol and protein supplement on the response to purified and recombinant follicle stimulating hormone in bovine oocytes. Zygote, 10, 65-71. Alvarez G.M., Dalvit G.C., Achi M.V., Miguez M.S., Cetica P.D. (2009). Immature oocyte quality and maturational competence of porcine cumulus-oocyte complexes subpopulations. Biocell, 33, 3. Anas M.K.I., Terada T. (1999). In vitro nuclear maturation and developmental potential of bovine oocytes cultured with EGF and wortmannin. Biology of Reproduction, 60, 179. Anderiesz C., Ferraretti A., Magli C., Fiorentino A., Fortini D., Gianaroli L., Jones G.M., Trounson A.O. (2000). Effect of recombinant human gonadotrophins on human, bovine and murine oocyte meiosis, fertilization and embryonic development in vitro. Human Reproduction, 15, 1140-1148. Asgari V., Hosseini S.M., Forouzanfar M., Hajian M., Nasr-Esfahani M.H. (2012). Vitrification of in vitro produced bovine embryos: Effect of embryonic block and developmental kinetics. Cryobiology, 65, 278-283. Bavister B.D., Chen A.F., Fu P.C. (1979). Catecholamine requirement for hamster sperm motility in vitro. Journal of Reproduction and Fertility, 56, 507-513. Becker F., Kanitz W., Nurnberg G., Kurth J., Spitschak M. (1996). Comparison of repeated transvaginal ovum pick up in heifers by ultrasonographic and endoscopic instruments. Theriogenology, 46, 999-1007. Blondin P., Sirard M.A. (1994). The influence of the number of cumulus oocyte complexes cultured in vitro on the developmental competence of bovine embryos. Biology of Reproduction, 50, 146. Bols P.E., Van Soom A., Ysebaert M.T., Vandenheede J.M., de Kruif A. (1996). Effects of aspiration vacuum and needle diameter on cumulus oocyte complex morphology and developmental capacity of bovine oocytes. Theriogenology, 45, 1001-1014. Bols P.E., Ysebaert M.T., Van Soom A., de Kruif A. (1997). Effects of needle tip bevel and aspiration procedure on the morphology and developmental capacity of bovine compact cumulus oocyte complexes. Theriogenology, 47, 1221-1236. Boni R., Roelofsen M.W.M., Pieterse M.C., Wurth Y.A., Kruip T.A.M. (1992). Ovum Pick-Up and embryo-production in vitro: an established procedure in cattle. In: Proceedings of the VIII Congress. European Embryo Transfer Association, 1992, Lyon, France. Lyon: AETE. pp. 128. Boni R., Campanile G., Zicarelli L., Taccone W., Kruip T.A.M. (1993). Health and some blood parameters in cows punctured twice weekly during three months to collect immature oocytes. In: Proceedings of the IX Congress. European Embryo Transfer Association, 1993, Lyon, France. Lyon: AETE. pp. 160. (abstract). Boni R., Zicarelli L., Kruip T.A.M. (1995). Impact of Ovum Pick-Up (OPU) technique for research and animal breeding. In: Enne G., Greppi G.F., Lauria A. (Ed.). Reproduction and animal breeding: advances and strategy. Amsterdam: Elsevier. pp. 211-221. Boni R., Roelofsen M.W.M, Pieterse M.C., Kogut I., Kruip T.A.M. (1997). Follicular dynamics, repeatability and predictability of follicular recruitment in cows submitted to repeated follicular puncture. Theriogenology, 48, 277-289. Boni R. (2012). Ovum pick-up in cattle: a 25 yr retrospective analysis. Animal Reproduction, 9, 362369. Bowles C.M., Lishman A.W. (1998). Attempts to improve the yield of bovine blastocysts by incorporating insulin, selenium and transferring in the in vitro system. South African Journal of Animal Science, 28, 30-37. Brinster R.L. (1965). Studies on the development of mouse embryos in vitro: The effect of osmolarity and hydrogen ion concentration. Journal of Experimental Zoology, 158, 49-57. Chen L., Russell P.T., Larsen W.J. (1993). Functional significance of cumulus expansion in the mouse: roles for the preovulatory synthesis of hyaluronic acid within the cumulus mass. Molecular Reproduction and Development, 34, 87-93. 38

Choi T.S., Mori M., Kohmoto K., Shoda Y. (1987). Beneficial effect of serum on the fertilizability of mouse oocytes matured in vitro. Journal of Reproduction and Fertility, 79, 565-568. Comizzoli P., Marquant-Le-Guienne B., Heyman Y., Renard J.P. (2000). Onset of the first S-phase is determined by a paternal effect during the G1-phase in bovine zygotes. Biology of Reproduction, 62, 1677-1684. Danfour M.A., Picton H.M., Gosden R.G. (1999). Impact of culture and cellular environment on the maturation potential of bovine oocytes in vitro. Journal of Reproduction and Fertility, 24, 20. de Matos D.G., Herrera C., Cortvrindt R., Smitz J., Van Soom A., Nogueira D., Pasqualini R.S. (2002). Cysteamine supplementation during in vitro maturation and embryo culture: a useful tool for increasing the efficiency of bovine in vitro embryo production. Molecular Reproduction and development, 62, 203209. De Vries W., Larsson B., Rodriguez-Martinez H. (2000). Hyaluronan improves in vitro maturation when bovine oocytes are cultured singly or in small groups. Theriogenology, 53, 451. den Daas N. (1992). Laboratory assessment of semen characteristics. Animal Reproduction Science, 28, 87-94. Donnay I., VanLangendonckt A., Auquier P., Grisart B., Vansteenbrugge A., Massip A., Dessy F. (1997). Effects of co-culture and embryo number on the in vitro development of bovine embryos. Theriogenology, 47, 1549-1561. Dorland M., Gardner D.K., Trounson A. (1994). Serum in synthetic oviduct fluid causes mitochondrial degeneration in ovine embryos. Journal of Reproduction and Fertility, 13, 70. Downs S.M., Daniel A.J., Eppig J.J. (1988). Induction of maturation in cumulus cell enclosed mouse oocytes by follicle-stimulating hormone and epidermal growth factor: evidence for a positive stimulus of somatic cell origin. Journal of Experimental Zoology, 245, 86-96. Dumoulin J.C.M., Meijers C.J.J., Bras M., Coonen E., Geraedts J.P.M., Evers J.L.H. (1999). Effect of oxygen concentration on human in-vitro fertilization and embryo culture. Human Reproduction, 14, 465-469. Duszewska A.M., Pienkowski M. (1998). Effects of LH on the development of in vitro produced bovine embryos. In: Proceedings 14th Meeting EuropeanEmbryo Transfer Association, Venice, p. 150. Ebner T., Shebl O., Moser M., Mayer R.B., Arzt W., Tews G. (2010). Group culture in human is superior to individual culture in terms of blastulation and implantation. Reproductive Biomedicine Online, 21, 762-768. Eckert J., Niemann H. (1995). In vitro maturation, fertilization and culture to blastocysts of bovine oocytes in protein-free media. Theriogenology, 43, 1211-1225. Edwards L.J., Williams D.A., Gardner D.K. (1998). Intracellular pH of the mouse preimplantation embryo: amino acids act as buffers of intracellular pH. Human Reproduction, 13, 3441-3448. Eid L.N., Lorton S.P., Parish J.J. (1994). Paternal influence on S-phase in the first cleavage postinsemination affects cryosurvival of in vitro-produced bovine blastocysts. Biology of Reproduction, 51, 1232-1237. Eikelmann E., Frank K.U., Schindler L., Niemann H. (2000). Repeated ultrasound-guided follicular aspiration in pregnant heifers and cows. Theriogenology,53, 351. Eppig J.J. (1996). Coordination of nuclear and cytoplasmic oocyte maturation in eutherian mammals. Reproduction, Fertility and Development, 8, 485-489. Ferruzzi P., Bernardi M.L., Mezzalira A., Vinocur M.E., Barbieri D.P., Fava R.C., Silva C.A.M., Rubin M.I.B. (2000). Culture of in vitro-produced bovine embryos under mineral or silicone oil. Arquivos da Faculdade de Veterinaria,UFRGS, 28, 20-31. Ferry L., Mermillod P., Massip A., Dessy F. (1994). Bovine embryos cultured in serum-poor oviductconditioned medium need cooperation to reach the blastocyst stage. Theriogenology 42 (3), 445-453. Fry R.C., Niall E.M., Simpson T.L., Squires T.J., Reynolds J. (1997). The collection of oocytes from bovine ovaries. Theriogenology,47, 977–987.

39

Gandolfi F. (1994). Autocrine, paracrine and environmental factors influencing embryonic development from zygote to blastocyst. Theriogenology, 41, 95-100. Gandolfi F, Luciano A.M., Modina S., Ponzini A., Pocar P., Armstrong D.T., Lauria A. (1997). The in vitro developmental competence of bovine oocytes can be related to the morphology of the ovary. Theriogenology, 48, 1153-1160. Gardner D.K., Lane M., Spitzer A., Batt P.A. (1994). Enhanced rates of cleavage and development for sheep zygotes cultured to the blastocyst stage in vitro in the absence of serum and somatic cells: amino acids, vitamins, and culturing embryos in groups stimulate development. Biology of Reproduction,50, 390-400. Gardner D.K. (2008). Dissection of culture media for embryos: the most important and less important components and characteristics. Reproduction, Fertility and Development, 20, 9-18. Gopichandran N., Leese H.J. (2006). The effect of paracrine/autocrine interactions on the in vitro culture of bovine preimplantation embryos. Reproduction, 131, 269-277. Gordon I. (2003a). Laboratory production of cattle embryos. 2nd edition. In: Recovering the bovine oocyte. CABI publishing, Cambridge, USA, p. 79-112. Gordon I. (2003b). Laboratory production of cattle embryos. 2nd edition. In: Maturating the bovine oocyte. CABI publishing, Cambridge, USA, p. 112-158. Hammon D.S., Wang S., Holyoak G.R. (2000). Effects of ammonia during different stages of culture on development of in vitro produced bovine embryos. Animal Reproduction Science, 59, 23-30. Hanson R.W., Ballard F.J. (1968). Citrate, pyruvate, and lactate contaminants of commercial serum albumin. Journal of Lipid Research, 9, 667-668. Henault M.A., Killian G.J. (1995). Effects of sperm preparation and bull fertility on in vitro penetration of zona-free bovine oocytes. Theriogenology, 43, 739-749. Hirao Y., Yanagimachi R. (1978). Temperature-dependence of sperm-egg fusion and post-fusion events in hamster fertilization. Journal of Experimental Zoology, 205, 43-438. Katska L., Rynska B., Smorag Z. (1994). In vitro fertilizability of frozen bull semen deprived ofseminalplasma. In: Proceedings 10th Meeting European Embryo Transfer Association, Lyon, p. 190. Khurana N.K., Niemann H. (2000). Effects of oocyte quality, oxygen tension, embryo density, cumulus cells and energy substrates on cleavage and morula/blastocyst formation of bovine embryos. Theriogenology, 54, 741-765. Kobayashi K., Yamashita S., Hoshi H. (1994). Influence of epidermal growth factor and transforming growth factor-α on in vitro maturation of cumulus cell-enclosed bovine oocytes in a defined medium. Journal of Reproduction and Fertility, 100, 439-446. Kruip T.A.M;, Boni R., Wurth Y.A., Roelofsen M.W.M., Pieterse M.C. (1994). Potential use of ovum pick-up for embryo production and breeding in cattle. Theriogenology, 42, 675-684. Lane M., Maybach J.F., Gardner D.K. (2002). Ammonium affects ICM development, metabolism, intracellular pH and fetal growth rates. Biology of Reproduction, 66, 104. Larsson B., Rodríguez-Martinez H. (2000). Can we use in vitro fertilization tests to predict semen fertility? Animal Reproduction Science, 60-61, 327-336. Leibfried M.L., Bavister B.D. (1981). The effects of taurine and hypotaurine on in vitro fertilization in the golden hamster. Gamete Research, 4, 57-63. Leibfried M.L., Bavister B.D. (1982). Effects of epinephrine and hypotaurine on in vitro fertilization in the golden hamster. Journal of Reproduction and Fertility, 66, 87-93. Leibfried-Rutledge M.L., Critser E.S., Eyestone W.H., Northey D.L., First N.L. (1987). Development potential of bovine oocytes matured in vitro or in vivo. Biology of Reproduction, 36, 376-383. Lonergan P., Carolan C., Van Langendonckt A., Donnay I., Khatir H., Mermillod P. (1996). Role of epidermal growth factor in bovine oocyte maturation and preimplantation embryo development in vitro. Biology of Reproduction, 54, 1420-1429.

40

Madison V., Avery B., Greve T. (1992). Selection of immature bovine oocytes for developmental potential in vitro. Animal Reproduction Science, 27, 1-11. Majerus V., De Roover R., Etienne D., Donnay I., Massip A., Dessy F. (1998). Production of blastocysts from prepubertal calves oocytes recovered by ovum pick-up. Theriogenology,49, 291. Markkula M., Peippo J., Tanskanen K., Seppa M., Jokinen J., Myllymaki H. (1999). In vitro fertility of Finnish Ayrshire bulls is improved by optimization of the heparin concentration but is not predictable by their in vivo fertility. In: Proceedings15th Meeting European Embryo Transfer Association, Lyon, p. 206. Masui Y. (1990). The cytostatic factor (CSF) that causes metaphase arrest in amphibian eggs. In 'Mechanism of Fertilization', 45, 35-44. McEvoy T.G., Robinson J.J., Aitken R.P., Findlay P.A., Robertson I.S. (1997). Dietary excesses of urea influence the viability and metabolism of preimplantation sheep embryos and may affect fetal growth among survivors. Animal Reproduction Science, 47, 71-90. McKeehan W.L., Hamilton W.G., Ham R.G. (1976). Selenium is an essential trace element for the growth of WI-38 diploid human fibroblasts. Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 73, 2023-2037. Meizel S., Working P.K. (1980). Further evidence suggesting the hormonal stimulation of hamster sperm acrosome reactions by catecholamines in vitro. Biology of Reproduction, 22, 211-216. Ménézo Y.J.R., Veiga A., Dale B. (2000). Assisted reproductive technology (ART) in humans: facts and uncertainties. Theriogenology, 53, 599-610. Merton J.S., de Roos A.P.W., Koenen E.P.C., Roelen B.A.J., Vos P.L.A.M., Mullaart E., Knijn H.M. (2012). Bovine OPU-derived oocytes can be matured in vitro for 16-28 h with similar development capacity. Reproduction in Domestic Animals, 47, 1037-1042. Merton J.S., Oei C., Huis in het Veld U., Poelarends J., Mullaart E. (2000). Effect of semen preparation on in vitro bovine embryo production. Theriogenology, 53, 427. Mortimer D. (2000). Sperm preparation methods. Journal of Andrology, 21, 3. Navara C.S., Simerly C., Schatten G. (1995). Imaging motility during fertilization. Theriogenology,44, 1099-1114. Neuber E., Powers R.D.(2000). Is the mouse a clinically relevant model for human fertilization failures? Human Reproduction, 15, 171-174. Niemann H., Wrenzycki C.(2000). Alterations of expression of developmentally important genes inpreimplantation bovine embryos by in vitro culture conditions: implications for subsequent development. Theriogenology, 53, 21-34. O’Doherty E.M., Wade M.G., Hill J.L., Boland M.P. (1997). Effects of culturing bovine oocytes either singly or in groups on development to blastocysts. Theriogenology, 48, 161-169. O'Neil C. (2008). The potential roles of embryotrophic ligands in preimplantation embryo development. Human Reproduction Update, 14, 275-288. Orsi N.M., Leese H.J. (2004). Ammonium exposure and pyruvate affect the amino acid metabolism of bovine blastocysts in vitro. Reproduction, 127, 131-140. Palasz A.T., Thundathil J., Verall R.E., Mapletoft R.J. (2000). The effect of macromolecular supplementation on the surface tension of TCM-199 and the utilization of growth factors by bovine oocytes and embryos in culture. Animal Reproduction Science, 58, 229-240. Parrish J.J., Krogenaes A., Susko-Parrish J.L. (1995). Effect of bovine sperm separation by either swim-up or Percoll method on success of in vitro fertilization and early embryonic development. Theriogenology, 44, 859-869. Penhallow R.C., Brown-Mason A., Woodworth R.C. (1986). Comparative studies of the binding and growth-supportive ability of mammalian transferrins in human cells. Journal of Cellular Physiology, 128, 251-260. Pieterse M.C., Kappen K.A., Kruip T.A., Taverne M.A. (1988). Aspriration of bovine oocytes during transvaginal ultrasound scanning of the ovaries. Theriogenology, 30, 751-762. 41

Pinyopummintr T., Bavister B.D. (1994). Effect of gaseous atmosphere on in vitro maturation and in vitro fertilization of bovine oocytes. Theriogenology, 41, 276. Pool T.B. (2002). Recent advances in the production of viable human embryos in vitro. Reproductive Biomedicine Online, 4, 294-302. Raty S., Walters E.M., Davis J., Zeringue H., Beebe D.J., Rodriguez-Zas S.L., Wheeler M.B. (2004). Embryonic development in the mouse is enhanced via microchannel culture. Lab Chip, 4, 186-190. Reed M.L., Hamic A., Thompson D.J., Caperton C.L. (2009). Continuous uninterrupted single medium culture without medium renewal versus sequential media culture: a sibling embryo study. Fertility and Sterility, 9, 1783-1786. Reichenbach H.D., Wiebke N.H., Modl J., Zhu J., Brem G. (1994). Laparoscopy through the vaginal fornix of cows for the repeated aspiration of follicular oocytes. Veterinary Record, 135, 353-356. Rorie R.W., Lester T.D., Miller G.F., Gliedt D.W., McNew R.W. (1994). Effects of protein source and co-culture on bovine embryo development in synthetic oviductal fluid medium. Theriogenology, 42, 385-395. Saeki K., Hoshi M., Leibfried-Rutledge M.L., First N.L. (1991). In vitro fertilization and development of bovine oocytes matured in serum-free medium. Biology of Reproduction, 44, 256-260. Saeki K., Nagao Y., Hoshi M., Kainuma H. (1994). Effects of cumulus cells on sperm penetration of bovine oocytes in protein-free medium. Theriogenology, 42, 1115-1123. Santl B., Wenigerkind H., Schernthaner W., Mödl J., Stojkovic M., Prelle K., Holtz W., Brem G., Wolf E. (1998). Comparison of ultrasound-guided vs laparoscopic transvaginal ovum pick-up (OPU) in simmental heifers. Theriogenology, 50, 89-100. Schroeder A.C., Eppig J.J. (1984). The developmental capacity of mouse oocytes that matured in vitro is normal. Developmental Biology, 102, 493-498. Schultz R.M. (1993). Regulation of zygotic gene activation in the mouse. BioEssays, 15, 531-538. Schultz R.M. (2002). The molecular foundations of the maternal to zygotic transition in the preimplantation embryo. Human Reproduction Update, 8, 323-331. Shamsuddin M., Larsson B., Gustafsson H., Rodriguez-Martinez H. (1994). A serum-free, cell-free culture system for development of bovine one-cell embryos up to blastocyst stage with improved viability. Theriogenology, 41, 1033-1043. Simon L., Burgartz L., Rath D., Niemann H. (1993). Repeated bovine oocyte collection by means of a permanently rinsed ultrasound guided aspiration unit. Theriogenology, 39, 312. Sinclair K.D., McEvoy T.G., Carol C., Maxfield E.K., Maltin C.A., Young L.E., Wilmut I., Robinson J.J., Broadbent P.J. (1998). Conceptus growth and development following in vitro culture of ovine embryos in media supplemented with sera. Theriogenology, 49, 218. Sirard M.A. (2001). Resumption of meiosis: Mechanism involved in meiotic progression and its relation with developmental competence. Theriogenology, 55, 1241-1254. Söderquist L., Janson K., Larsson K., Einarsson S. (1991). Sperm morphology and fertility in AI bulls. Journal of Veterinary Medicine, 38, 534-543. Spicer L.J., Echternkamp S.E. (1995). The ovarian insulin and insulin-like growth factor system with an emphasis on domestic animals. Domestic Animal Endocrinology, 12, 223-245. Sugiyama S., McGowan M., Phillips N., Kafi M., Young M. (2007). Effects of increased of ambient temperature during IVM and/or IVF on the in vitro development of bovine zygotes. Reproduction in Domestic Animals, 42, 271-274. Susko-Parrish J.L., Wheeler M.B., Ax R.L., First N.L., Parrish J.J. (1990). The effect of penicillamine, hypotaurine, epinephrine and sodium metabisulfite on bovine in vitro fertilization. Theriogenology, 33, 333. Tanghe S., Van Soom A., Nauwynck H., Coryn M., De Kruif A. (2002). Minireview: Functions of the cumulus oophorus during oocyte maturation, ovulation and fertilization. Molecular Reproduction and Development, 61, 414-424.

42

Telford N.A., Watson A.J., Schultz G.A. (1990). Transition from maternal to embryonic control in early mammalian development: a comparison of several species. Molecular Reproduction and Development, 26, 90-100. Tervit H.R., Whittingham D.G., Rowson L.E.A. (1972). Successful culture in vitro of sheep and cattle ova. Journal of Reproduction and Fertility, 30, 487-493. Thompson J.G., Peterson A.J. (2000). Bovine embryo culture in vitro: new developments and posttransfer consequences. Human Reproduction, 15, 59-67. Vajta G., Rienzi L., Cobo A., Yovich J. (2010). Embryo culture: can we perform better than nature. Reproductive Biomedicine Online, 20, 453-469. Van der Schans A., Van der Westerlaken L.A.J., De Wit A.A.C., Eyestone W.H., De Boer H.A. (1991). Ultrasound-guided transvaginal collection of oocytes in the cow. Theriogenology, 35, 288. Van Soom A., Wydooghe E., Heras S., Vandaele L. (2011). Alternative models for the study of embryo-maternal cross-talk and signaling molecules from fertilization to implantation. Reproduction, Fertility and Development,23, III–V. Van Wagtendonk-de Leeuw A.M. (2006). Ovum pick up and in vitro production in the bovine after use in several generations: a 2005 status. Theriogenology, 65, 914-925. Vanderhyden B.C., Armstrong D.T. (1989). Role of cumulus cells and serum on the in vitro maturation, fertilization and subsequent development of rat oocytes. Biology of Reproduction, 40, 720-728. Verstegen J., Iguer-Ouada M., Onclin K. (2002). Computer assisted semen analysers in andrology research and veterinary practice. Theriogenology, 57, 149-179. Virant-Klun I., Tomazevic T., Vrtacnik-Bokal E., Vogler A., Krsnik M., Meden-Vrtovec H. (2006). Increased ammonium in culture medium reduces the development of human embryos to the blastocyst stage. Fertility and Sterility, 85, 526-528. Watson A.J. (2007). Oocyte cytoplasmic maturation: a key mediator of oocyte and embryo developmental competence. Journal American Society of Animal Science, 85, 1-3. Wrenzycki C., Herrmann D., Keskintepe L., Martins A. Jr, Sirisathien S., Brackett B.G., Niemann H. (2001). Effects of culture system and protein supplementation on mRNA expression in preimplantation bovine embryos. HumanReproduction, 16, 893-901. Wrenzycki C., Herrmann D., Lucas-Hahn A., Lemme E., Korsawe K., Niemann H. (2004). Gene expression patterns in in vitro-produced and somatic nuclear transfer-derived preimplantation bovine embryos: relationship to the large offspring syndrome? Animal Reproduction Science, 82-83, 593-603. Yaseen M.A., Wrenzycki C., Herrmann D., Carnwath J.W., Niemann H. (2001). Changes in the relative abundance of mRNA transcripts for insulin-like growth factor (IGF-I and IGF-II) ligands and their receptors (IGF-IR/IGF-IIR) in preimplantation bovine embryos derived from different in vitro systems. Reproduction, 122, 601-610. Yuan Y.Q., Van Soom A., Laevens H., Coopman F., Peelman L., de Kruif A. (2000). Single embryo culture affects hatching rate in bovine in vitro produced embryos. Theriogenology, 53, 307.

43