UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT DIERGENEESKUNDE
Academiejaar 2013 – 2014
LITERATUURSTUDIE: IS ER EEN INVLOED VAN INTEELT OP DE PREVALENTIE VAN MAMMATUMOREN BIJ DE HOND?
door
Roselinde MALCORPS
Promotoren:
dierenarts Kevin Caestecker Prof. dr. Herman Favoreel
Literatuurstudie in het kader van de Masterproef
© 2014 Roselinde Malcorps
Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de juistheid of volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de inhoud van deze masterproef geen inbreuk uitmaakt op of aanleiding kan geven tot inbreuken op de rechten van derden. Universiteit Gent, haar werknemers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of verantwoordelijkheid voor enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud van de masterproef, noch voor enig vertrouwen dat wordt gesteld in een advies of informatie vervat in de masterproef.
UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT DIERGENEESKUNDE
Academiejaar 2013 – 2014
LITERATUURSTUDIE: IS ER EEN INVLOED VAN INTEELT OP DE PREVALENTIE VAN MAMMATUMOREN BIJ DE HOND?
door
Roselinde MALCORPS
Promotoren:
dierenarts Kevin Caestecker Prof. dr. Herman Favoreel
Literatuurstudie in het kader van de Masterproef
© 2014 Roselinde Malcorps
VOORWOORD Genetica heeft steeds een grote plaats ingenomen in mijn interessegebied. Dit onderwerp sluit hier goed bij aan, maar heeft als extra voordeel dat het in een praktisch jasje gegoten is. Het schrijven van deze literatuurstudie heeft mij op verschillende vlakken meer academische en praktische kennis bijgebracht. Het is niet altijd eenvoudig om van de eerste keer onmiddellijk de juiste richting in te slaan bijvoorbeeld voor wat betreft het opzoekwerk van relevante literatuur. Mijn promotor, dierenarts Kevin Caestecker, heeft mij gestimuleerd nooit op te geven en verder te blijven zoeken
naar
die
artikels
en
boeken
die
wel
binnen
het
kader
vallen
van
mijn
literatuurstudieonderwerp. Het verwerken van de informatie is de volgende stap die eveneens niet vanzelfsprekend is. Tabellen op de juiste manier opstellen en cijfergegevens verwerken in juiste eenheden, anatomische figuren tekenen,… Eveneens dank aan mijn promotor en copromotor, Prof. dr. Herman Favoreel, voor de begeleiding, de instructies en verbeteringen die mij in staat hebben gesteld het werk nog beter te maken. Familie en vrienden mogen zeker ook niet ontbreken. Want ook zij hebben het mogelijk gemaakt mijn literatuurstudie te volbrengen door het nalezen van mijn werk en hun dagelijkse steun en vertrouwen in mijn kunnen.
INHOUDSOPGAVE VOORWOORD INHOUDSOPGAVE SAMENVATTING .....................................................................................................................................1 INLEIDING ................................................................................................................................................2 LITERATUURSTUDIE ..............................................................................................................................3 1. Deel 1: Mammatumoren .......................................................................................................................3 1.1. Prevalentie van mammatumoren bij de hond ....................................................................................3 1.2. Anatomische karakterisatie ...............................................................................................................5 1.3. Risicofactoren voor mammatumoren ................................................................................................8 1.3.1. Geslacht .........................................................................................................................................8 1.3.2. Leeftijd ............................................................................................................................................8 1.3.3. Hormonale beïnvloeding ................................................................................................................8 1.3.4. Ras en genetische factoren ............................................................................................................9 1.3.5. Voeding ..........................................................................................................................................9 2. Deel 2: Inteelt .................................................................................................................................... 10 2.1. Geschiedenis van het ontstaan van hondenrassen ....................................................................... 10 2.1.1. Gevolgen van de populatiestructuur ............................................................................................ 11 2.2. De invloed van fokpraktijken op de verspreiding van genetische afwijkingen ............................... 12 2.2.1. Stichterseffect .............................................................................................................................. 13 2.2.2. Inteelt ........................................................................................................................................... 13 2.2.3. Outbreeding en outcrossing ........................................................................................................ 14 2.3. Gepredisponeerde rassen .............................................................................................................. 14 3. Deel 3: Potentiële genetische risicofactoren voor de ontwikkeling van mammatumoren ................. 17 3.1. Vergelijkende oncologie ................................................................................................................. 17 3.2. Genen van belang bij mammatumoren .......................................................................................... 17 DISCUSSIE EN HYPOTHESEN ........................................................................................................... 20 Fokadvies .............................................................................................................................................. 20 REFERENTIELIJST .............................................................................................................................. 23
SAMENVATTING Een mammatumor is een frequent voorkomende caniene tumor. De gepubliceerde jaarlijkse incidentieratio’s verschillen door variatie in materiaal en methode van de studie en naargelang het geslacht, de leeftijd, het ras, de hormonale beïnvloeding en het dieet van de bestudeerde honden in de studiegroep. Hormonale beïnvloeding is wellicht de belangrijkste risicofactor. Ongeveer de helft van alle voorkomende tumoren bij intacte teven van middelbare leeftijd zijn namelijk mammatumoren. Daarnaast kan eveneens het ras een belangrijke risicofactor zijn. De gepredisponeerde rassen staan uitvoerig beschreven in de literatuur, zo wordt er herhaaldelijk een hoge prevalentie bij de Engelse springer spaniël teruggevonden. Mede omwille hiervan verwacht men een genetische factor in de pathogenese en speelt de unieke populatiestructuur van de hond een grote rol in de hedendaagse prevalentie van mammatumoren. Het ontstaansmechanisme van verschillende hondenrassen doorheen de geschiedenis en de wil van de mens in het onderhouden ervan veroorzaken een steeds lagere genetische heterogeniteit binnen de hondenrassen door de gebrekkige uitwisseling van nieuw genetisch materiaal tussen de individuele rassen. De toegepaste fokpraktijken beïnvloeden bovendien de expressie en verspreiding van genetische erfelijke aandoeningen en het voorkomen van inteeltdepressie. Het is dus meer dan ooit van belang voor dierenartsen om genetisch fokadvies te verschaffen aan fokkerijen om de negatieve gevolgen zoveel mogelijk te beperken. De meeste studies om genetische risicofactoren te achterhalen bij de hond richten zich specifiek op bepaalde receptoren of genen die gerelateerd zijn aan een verhoogd risico aan borstkanker bij de mens. Zo zijn er reeds enkele genen gevonden die een rol spelen in de etiologie van mammatumoren waarvoor men in de toekomst een diagnostische DNA-test zou kunnen ontwikkelen. Een werkelijk antwoord op de onderzoeksvraag kan nog niet gegeven worden. Hiervoor is nog meer onderzoek vereist. Trefwoorden: Genetische risicofactoren - Hond - Inteelt - Mammatumoren - Populatiestructuur
1
INLEIDING Mammatumoren komen bij de hond, en voornamelijk bij de teef van middelbare leeftijd, talrijk voor. Een van de meer recentere studies stelde een gemiddelde jaarlijkse incidentieratio van 191,8 op 100.000 honden vast (Merlo et al., 2008). Aangezien kankers en tumoren de voorbije decennia steeds frequenter in aantal voorkomen en steeds hogere belangstelling krijgen, ook in de humane geneeskunde, is men steeds meer geïnteresseerd in de onderliggende risicofactoren die van belang zijn in de pathogenese. Genetische oorzaken zijn reeds uitvoerig onderzocht bij de klassieke rodentia en de mens. Gezien de unieke populatiestructuur van de hond is men steeds meer geneigd onderzoek uit te voeren bij deze diersoort. Omwille van de gelijkenis met het ziektebeeld van borstkanker bij de mens, op tal van vlakken zoals het spontaan karakter van de ontwikkeling ervan en de vergelijkbare omgevingsinvloeden op de tumoren, kan men dus ook informatie inwinnen over de aandoening op humaan vlak. Er is reeds tal van literatuur beschikbaar die de prevalentie of incidentie van mammatumoren bij de hond in kaart brengt en mogelijke risicofactoren bespreekt. Het doel van deze literatuurstudie is om eerst en vooral mammatumoren kort te schetsen, de unieke populatiestructuur van de hond te bespreken en vervolgens een overzicht te geven van de verschillende belangrijke bevindingen van onderzoeken, voornamelijk voor wat betreft de risicofactoren. Om af te sluiten wordt er ook wat meer aandacht geschonken aan de mogelijke oplossingen van deze problematiek, namelijk het verschaffen van genetisch fokadvies aan verschillende van belang zijnde instellingen zoals fokkerijen.
2
LITERATUURSTUDIE 1. DEEL
1: MAMMATUMOREN
1.1. Prevalentie van mammatumoren bij de hond Om het belang van kanker en meer specifiek mammatumoren bij de hond aan te tonen worden enkele gegevens besproken in verband met het voorkomen en de incidentie bij verschillende hondenpopulaties in Europa en Amerika. Kanker bij de hond zorgt namelijk jaarlijks voor een hoog sterftepercentage. In een studie in de Verenigde Staten (V.S.) werd aangetoond dat ongeveer één vierde, meer specifiek 27%, van alle sterftes bij raszuivere honden hieraan te wijten is (Adams et al., 2010; Dobson, 2013). Er is een vrij uitgebreide literatuur beschikbaar over de incidentie van mammatumoren bij de hond in specifieke gebieden. Vergelijkende studies over verschillende regio’s heen zijn echter nog schaars. Gegevens over het voorkomen van melkkliertumoren worden in verschillende artikels anders uitgedrukt en weerspiegelen meestal ook de methode van de studie. Zo hebben sommige studies het doel voor ogen om de prevalentie van het totaal aantal tumoren op een gegeven ogenblik bij honden te bepalen en vervolgens het percentage mammatumoren te berekenen terwijl andere studies onmiddellijk in een specifieke hondenpopulatie de jaarlijkse incidentie ratio zullen berekenen. Dit bemoeilijkt vanzelfsprekend het maken van vergelijkingen. Aangezien de meeste artikels incidentieratio’s hanteren zal ook hier verder de focus op gelegd worden. In de onderstaande tabel is er een beknopt overzicht weergegeven van enkele incidentiegegevens van verschillende onderzoeken (Tabel 1). Hier wordt de incidentie uitgedrukt als het aantal honden op de 1000, 10.000 of 100.000 honden, die per jaar het risico hebben om mammatumoren te ontwikkelen (dogs a year at risk (DAYR)). Naargelang het onderzoek werd uitgevoerd op een volledige hondenpopulatie, zijnde reuen en teven samen, slechts op de vrouwelijke, al dan niet gesteriliseerde individuen, of enkel op bepaalde hondenrassen of leeftijdsgroepen is er een verschil in de uitkomst van de resultaten. Ook het land waar het onderzoek plaatsvond, heeft een invloed op de uitkomst. Deze factoren beïnvloeden de omschrijving van populatie “at risk” en gezien die term vervat zit in de berekening van de ziektefrequentiemaat bepalen deze bijgevolg de incidentieratio (Merlo et al., 2008). Zoals later in deze literatuurstudie zal besproken worden zijn er raspredilecties voor mammatumoren. Als er in een bepaalde hondenpopulatie in een specifiek land meer rassen voorkomen die gepredisponeerd zijn, zullen de cijfers aanzienlijk hoger liggen. Al deze gegevens zijn vaak niet volledig, waardoor de incidentiegegevens dus niet zomaar blindelings mogen vergeleken worden en men rekening dient te houden met de studieomstandigheden. In de onderstaande samenvattende tabel kunnen de exacte cijfers nagegaan worden zoals ze in de desbetreffende studie vermeld stonden.
3
Tabel 1: Vergelijkende tabel met incidentie ratio’s (DAYR) van mammatumoren bij de hond naar plaats en studiegroep. Plaats Californië (V.S.) Californië (V.S.) Noorwegen 1992-‘97
Incidentie ratio (DAYR)
Studiegroep
260/100.000
intacte teven
145/100.000
1
3,87 - 35,47/1000
teven
Auteur 1
teven (≠ rassen)
Dorn et al., 1968 Schneider, 1970 2
Moe, 2001 3
Verenigd Koninkrijk ‘97-‘98 205/100.000
omschreven populatie Dobson et al., 2002
Zweden ‘92-‘93
154/10.000
teven, 3-10 jaar
Zweden ‘95-2002
111/10.000 (5 -
teven (≠ rassen), 3-10 Egenvall et al., 2005
319/10.000)
jaar
191,8/100.000
teven
Genoa Italië ‘85–2002 1
4
Egenvall et al., 2005
4 1
Merlo et al., 2008
Studies waar geen specificatie staat betreffende het ras of leeftijd werden ‘at random’ uitgevoerd op een steekproef van
honden met alle mogelijke leeftijden. 2
Moe en collega’s berekenden de incidentieratio op basis van twee populatiegebaseerde studies in Noorwegen. De eerste
houdt geen rekening met de leeftijd of het ras van de onderzochte honden en de tweede onderzocht de risicoleeftijd voor het ontwikkelen van mammatumoren door middel van een censusstudie bij boxers, bichon frisé en berner sennenhonden. 3
Alle honden met een verzekering (UK pet insurance) van 1 juni 1997 tot 31 mei 1998. Het onderzoek maakt noch een
rasonderscheid, noch een leeftijdsonderscheid, dus bias invloeden werden vermoed. Op basis van dit vermoeden werd de incidentie bijgevolg gestandaardiseerd naar leeftijd. 4
Alle honden tussen drie en tien jaar met een levensverzekering bij een Zweeds verzekeringsbedrijf met onbekende
sterilisatiestatus. Er is een correctiefactor gebruikt om confounding omwille van geografische locatie te minimaliseren. Verder in de studie werden nog incidentie ratio’s specifiek per leeftijdsgroep weergegeven.
Studies in Californië omtrent 1968 en 1970 schatten een risico van respectievelijk 260 en 145 gevallen van mammatumoren op de 100.000 honden per jaar (Tabel 1) (Dorn et al., 1968; Schneider, 1970). e
Deze trend is ongeveer constant gebleven tot in de beginjaren van de 21 eeuw. Cijfers, gebaseerd op een studie in het Verenigd Koninkrijk van alle honden met een verzekering tussen 1997 en 1998, toonden aan dat de mammatumor één van de meest voorkomende soorten tumoren is bij de hond. Met een incidentie van ongeveer 205 gevallen op de 100.000 honden per jaar, is het de tweede meest voorkomende neoplasie, volgend op de tumoren van de weke delen en de huid (Tabel 1) (Dobson et al., 2002). Dit resultaat werd eveneens bekomen in een studie in Italië waar 34,8% van alle tumoren in het melkklierweefsel gesitueerd was en 40,8% in de huid en de weke delen (Tabel 2) (Vascellari et al., 2009). Een andere studie in Italië toonde een incidentie van 191,8 op 100.000 honden per jaar, wat eveneens vergelijkbaar is met de resultaten in het Verenigd Koninkrijk (Tabel 1) (Merlo et al., 2008). In Zweden werd een globale incidentie van 111 honden op de 10.000 honden per jaar gemeld (Egenvall et al., 2005). Dit is een opmerkelijk hogere incidentieratio in vergelijking met resultaten uit de V.S. en Italië. Verschillende mogelijke redenen met betrekking tot de variatie in studiegroepen zijn reeds in eerdere alinea’s besproken. Verschillen in de methode van registratie en diagnose van patiënten met mammatumoren en het gebruik van verschillende nomenclatuur en classificatieschema’s weerspiegelen eveneens de variatie in incidentieratio’s in diverse literatuur (Merlo et al., 2008).
4
Tabel 2: Het aandeel tumoren naar plaats van oorsprong op basis van gegevens uit Noord-Italië. Naar Richards et al., 2001 en Vascellari et al., 2009.
Huid en weke delen Melkklier
Teef
Reu
Totaal
30,8 % 56,4 %
56,1 % 1,9 %
40,8 % 34,8 %
Als men kijkt naar de incidentie van alle types tumoren werd er in het Noorden van Italië een incidentie van 282 honden op de 100.000 per jaar geschat. Het percentage mammatumoren was 34,8% (Tabel 2) (Vascellari et al., 2009). Hierbij moet men evenwel nog de opmerkelijke verschillen in incidentie tussen reuen en teven bemerken (Tabel 2) (Merlo et al., 2008). Een mammatumor kan geclassificeerd worden als een goedaardige of kwaadaardige tumor. Het percentage kwaadaardigheid van mammatumoren ligt ongeveer rond 50% (Rivera, 2010). Raszuivere honden zouden in vergelijking met gekruiste rassen een nog hoger risico hebben om kwaadaardige tumoren te ontwikkelen. Dit werd in de studie in het Noorden van Italië teruggevonden, zonder genoteerde verklaring (Vascellari et al., 2009). Uit de gegevens van tabel 1 valt niet op te maken of er een stijging in functie van de tijd heeft plaatsgevonden van de incidentie van mammatumoren bij de hond. Op basis van een studie in Polen werd de laatste jaren wel een significante stijging waargenomen van het aantal tumoren bij honden (Ciaputa et al., 2013). Dit wordt enerzijds verklaard door de verbeterde medische zorg, waardoor honden de kans krijgen om langer te leven en leeftijdsgerelateerde ziekten te ontwikkelen, waarvan kanker een belangrijk voorbeeld is (Rivera, 2010; Dobson, 2013). Anderzijds zijn er betere diagnostische methoden waardoor tumoren sneller ontdekt worden (Ciaputa et al., 2013; Dobson, 2013). Bij analyse en vergelijking van prevalentie- en incidentiegegevens van tumoren bij verschillende weefsels dienen echter bijkomende zaken in overweging genomen te worden. Een studie in de V.S., uitgevoerd op 21.371 weefselbiopten van honden, toonde aan dat meer dan de helft van deze biopten, die werden opgestuurd voor histopathologisch onderzoek, aanwijzingen gaven voor de aanwezigheid van een neoplasie. Meer dan 80% van de biopten was afkomstig van het melkklierweefsel of de huid maar dit verklaart niet zozeer de prevalentie van tumoren geassocieerd met dit weefsel, maar toont eerder het gemak aan waarmee deze weefsels kunnen geïnspecteerd en gebiopteerd worden. Deze cijfers zijn dus weinig informatief in verband met de proportionele verdeling van tumoren naar plaats van oorsprong (Richards et al., 2001). 1.2. Anatomische karakterisatie Een mammatumor is een type kanker dat voorkomt ter hoogte van de melkklieren. Melkklieren zijn speciale soorten apocriene, gemodificeerde zweetkliertjes die een secreet, namelijk melk, aanmaken voor de nakomelingen (Sleeckx et al., 2011). Ze zijn dus specifiek voor zoogdieren. Het geheel omvat verschillende melkkliercomplexen of -paren bilateraal verspreid over de ventrale regio van de thorax,
5
het abdomen en de inguinale regio. Naargelang de diersoort komt er een verschillend aantal paren voor (König en Liebich, 2009). Bij de hond zijn er 5 paren aanwezig waarvan 2 thoracaal gelegen zijn, 2 abdominaal en 1 inguinaal. Mammatumoren kunnen bij de hond voorkomen aan de 10 melkklierpakketten (Rivera, 2010).
Figuur 1: Een schematische voorstelling van de arteries en lymfeknopen die van belang zijn voor de bloedtoevoer en de lymfedrainage van de melkklieren. Naar Adams, 2001; Done et al., 2009 en König en Liebich, 2009.
Zoals elk weefsel anatomisch voorzien is van bloedtoevoer via arteries en bloedafvoer via venen om de normale fysiologische functie te kunnen uitvoeren, is dit ook bij de melkklieren het geval. Naargelang de lokalisatie krijgen de melkklieren arterieel bloed van verschillende oppervlakkig gelegen arteries geïllustreerd op bovenstaande (Figuur 1) en onderstaande afbeelding (Figuur 2). Zo krijgen de 2 voorste paren voornamelijk bloed van rami mammaria, kleine aftakkingen van rami perforantes die vervolgens weer kleine aftakkingen zijn van de a. thoracica interna. Op het verdere verloop van a. thoracica interna zal deze arterie opsplitsen in een diep deel en een oppervlakkig deel, namelijk a. epigastrica cranialis superficialis. Deze laatste bevloeit eveneens de voorste melkklierpakketten en het middelste melkklierpaar. De 2 achterste paren worden bevloeid door rami mammaria van de a. epigastrica caudalis superficialis, een aftakking van de a. pudenda externa. Het craniale abdominale pakket krijgt bloed van de anastomose tussen beide arteries. Verschillende aftakkingen van andere arteries zullen deze bloedvoorziening bijstaan, zoals bijvoorbeeld de ventrale intercostale takjes van de a. thoracica interna en takjes van de a. thoracica lateralis die specifiek zijn voor carnivoren (König en Liebich, 2009). De veneuze drainage gebeurt vergelijkbaar aan de arteriële bloedvoorziening door ermee parallel verlopende venen (Sleeckx et al., 2011).
6
Figuur 2: Een schematische voorstelling van de arteries (linkerzijde) en lymfeknopen (rechterzijde) die van belang zijn voor de bloedtoevoer en de lymfedrainage van de melkklieren. Naar Adams, 2001; Done et al., 2009 en König en Liebich, 2009.
De anatomie van het lymfevatstelsel is echter meer van belang bij het bestuderen van mammatumoren. Tumorcellen bij mammatumoren metastaseren frequent via het lymfevatstelsel naar andere organen. Om dit te verhinderen is het dus van belang het drainagepatroon nauwkeurig te schetsen om zo de bijhorende lymfeknopen, tijdens het wegnemen van de aangetaste melkklier, mee te kunnen verwijderen. Ondanks dat er talrijke variaties voorkomen voor wat betreft de drainage, zijn er toch enkele steeds terugkomende patronen die op de bovenstaande figuren afgebeeld staan (Figuur 1 en 2). Beide thoracale melkklierparen draineren vooral via de axillaire lymfeknopen en de craniale thoracale mammae draineren eveneens frequent via de sternale lymfeknopen en de superficiale cervicale lymfeknopen. De caudale abdominale en inguinale melkklierpakketten draineren via de superficiale inguinale lymfeknopen en de craniale abdominale via zowel de axillaire als de superficiale inguinale lymfeknopen. Lymfe van de caudale abdominale melkklier kan eveneens via de mediale iliacale lymfeknoop afgevoerd worden. Elke melkklier draineert meestal via de ipsilaterale lymfeknopen, maar anastomose tussen ipsilaterale en contralaterale lymfevaten is mogelijk (König en Liebich, 2009; Sleeckx et al., 2011). Naargelang het type van de mammatumoren kan er ook metastasering gebeuren via venen en capillairen (Sorenmo et al., 2011).
7
1.3. Risicofactoren voor mammatumoren Er zijn verschillende factoren die mogelijk een invloed hebben op de prevalentie van mammatumoren. Zo zal de prevalentie variëren naargelang het geslacht, de leeftijd, het ras, de hormonale beïnvloeding en het dieet van de hond. De etiologie van mammatumoren is bijgevolg multifactorieel met zowel genetische factoren als invloeden van buitenaf (Rivera, 2010). 1.3.1. Geslacht Mammatumoren komen vooral, maar niet uitsluitend, voor bij vrouwelijke individuen. Reuen kunnen dus ook mammatumoren ontwikkelen, weliswaar met een lage incidentie (Perez Alenza et al., 2000). De proportie van mammatumoren ten opzichte van andere tumoren bij de reu werd in een studie in het Noorden van Italië op 1,9% geschat terwijl die bij de teef 56,4% bedroeg (Tabel 2) (Vascellari et al., 2009). 1.3.2. Leeftijd De neoplasie ontwikkelt zicht het vaakst bij teven van gemiddelde tot oude leeftijd. De gemiddelde leeftijd van aanvang is ongeveer 9 jaar maar reeds vanaf 6 jaar werd er een verhoogde incidentie waargenomen (Perez Alenza et al., 2000). Naargelang de tumor goedaardig of kwaadaardig was werden er ook verschillen bemerkt in een Noorse studie, door Sorenmo en collega’s, in de leeftijd van aanvang. Honden met goedaardige mammatumoren waren gemiddeld 1 jaar jonger dan deze met kwaadaardige tumoren (Sorenmo et al., 2009; Sleeckx et al., 2011; Dobson, 2013). 1.3.3. Hormonale beïnvloeding Hormonale beïnvloeding is wellicht de belangrijkste risicofactor. Mammatumoren worden het vaakst gezien bij intacte teven van middelbare leeftijd en dit aan een percentage van 50-70% van alle voorkomende tumoren bij deze doelgroep (Merlo et al., 2008; Vascellari et al., 2009; Sleeckx et al., 2011). Melkklierweefsel bij intacte teven staat onder invloed van steroïdale geslachtshormonen. Deze hormonen, zoals oestrogenen en progesteron, interageren met specifieke receptoren, oestrogen- en progesteronreceptoren (ER en PR, respectievelijk), ter hoogte van het melkklierweefsel en oefenen hier een prolifererend effect op uit. Dit gebeurt zowel onder normale fysiologische als onder pathologische omstandigheden. Elke ovariële cyclus verhoogt dus bijgevolg in principe de kans dat het weefsel zich neoplastisch omvormt door de opeenvolgende proliferatie en involutie (König en Liebich, 2009; Sleeckx et al., 2011). Dit verklaart waarom mammatumoren bij intacte teven aan een hoger percentage voorkomen dan bij gesteriliseerde teven. Ovariëctomie of ovariohysterectomie wordt om die reden frequent ter preventie uitgevoerd. Hierbij is de periode van sterilisatie echter van belang. In een studie werden 3 verschillende leeftijdsgroepen van sterilisatie onderzocht, namelijk honden gesteriliseerd voor de eerste oestrus, voor de tweede oestrus of na de tweede oestrus voor de leeftijd van 2,5 jaar. Het risico om mammatumoren te ontwikkelen was respectievelijk 0,5%, 8% en 26% (Sleeckx et al., 2011). Ovariëctomie had echter geen invloed op de incidentie wanneer uitgevoerd na de leeftijd van 2,5 jaar
8
en kwam de prognose niet ten goede na het ontstaan van een mammatumor. De gevonden onderliggende reden is dat steroïdale hormonen enkel een functie uitoefenen in het beginstadium van de pathogenese omwille van de aanwezige receptoren in het melkklierweefsel. In latere fases van de kanker hebben deze vrouwelijke hormonen geen negatief effect meer op de metastases aangezien er over het algemeen op die locaties geen ER en PR aanwezig zijn (Perez Alenza et al., 2000; Richards et al., 2001). Andere hormonale invloeden zoals oestrusonregelmatigheden, schijnzwangerschap en gewone zwangerschap werden niet significant gerelateerd aan een verhoogd risico op mammatumoren (Perez Alenza et al., 2000; Sorenmo et al., 2011). Dit bevestigde een eerdere studie uit 1966 door Brodey en collega's (Brodey et al., 1966). 1.3.4. Ras en genetische factoren Het is ondertussen duidelijk dat er verschillende raspredilecties zijn voor het ontwikkelen van mammatumoren, wat duidt op genetische invloeden. Welke rassen gepredisponeerd zijn verschilt naargelang het onderzoek en de geografische regio waar het onderzoek plaatsvond (Dobson, 2013). In de literatuur zijn dus verschillende gegevens te vinden, waaronder zelfs enkele tegenstrijdigheden (Sleeckx et al., 2011). Naast raspredilecties over het algemeen kunnen binnen een bepaald ras bepaalde lijnen van families een verhoogd risico vertonen (Sorenmo et al., 2011). Het thema raspredilecties zal verder uitgediept worden in de volgende hoofdstukken. Genetische factoren worden alom bestudeerd om mogelijke invloeden te ontdekken op het ontstaan van mammatumoren. Bij de mens is het algemeen gekend dat mutaties in de breast cancer genen 1 en 2 (respectievelijk BRCA 1 en BRCA 2) leiden tot een verhoogde kans van 56-84% om familiale borstkanker te ontwikkelen tegen de leeftijd van 70 jaar (Rivera, 2010). Deze mutaties zouden wel slechts 10% van het totale overerfbare effect voor hun rekening nemen, waardoor tal van andere genen, zoals fibroblast growth factor receptor 2 (FGFR2), lymphocyte-specific protein 1 (LSP1), mitogen-activated protein kinase kinase kinase 1 (MAP3K1) en TOX high mobility group box family member 3 (TOX3), eveneens een rol spelen bij het ontstaan van borstkanker (Dobson, 2013). Hierop zal eveneens dieper worden ingegaan in verdere hoofdstukken. 1.3.5. Voeding Bij de mens zijn verschillende studies uitgevoerd waaruit is gebleken dat zwaarlijvigheid op jonge leeftijd en voeding met een hoog percentage aan vet gepaard zou gaan met een hogere incidentie aan borstkanker (Perez Alenza et al., 2000; Rivera, 2010). Ook op honden werden er vergelijkbare studies uitgevoerd waarbij sommige tot gelijkaardige conclusies komen (Rivera, 2010), maar andere geen significantie konden aantonen. Zo werd er een gevallen-controle studie uitgevoerd waarbij geen verhoogd risico werd gevonden voor mammatumoren bij een vetrijk dieet of zwaarlijvigheid 1 jaar voorafgaande aan de diagnose. De studie suggereerde wel het etiologisch belang van voeding, tijdens het vroege leven van de hond, op het ontwikkelen van mammatumoren (Sonnenschein et al., 1991).
9
2. DEEL
2: INTEELT
2.1. Geschiedenis van het ontstaan van hondenrassen
Figuur 3: Een vereenvoudigde schematische samenvatting van de evolutie van de hond naar Dobson, 2013, naar het werk van Gray et al., 2009.
Honden stammen af van de grijze wolf, dit staat vast. Details over dit domesticatieproces zijn niet eenduidig. Op basis van onderzoek op mitochondriaal DNA (mtDNA) zijn er toch enkele hypothesen en theorieën tot stand gekomen. Mitochondriaal DNA wordt voornamelijk overgeërfd langs maternale zijde. Verschillende honderden mitochondriale sequenties kunnen in één individu voorkomen en blijven detecteerbaar na jarenlange afstamming (Webb en Allard, 2010; Wade, 2011). Om die reden wordt dit DNA gebruikt voor onderzoeken naar afstamming. Enkele mtDNA studies toonden aan dat dit domesticatieproces gebeurde uit verschillende honderden wolven en suggereerden tijdsbestekken die variëren van 5.400 tot 100.000 jaar geleden (Pang, 2009; Wade, 2011). Daarnaast is ook de plaats van domesticatie onduidelijk. Sommige studies vermelden het Oosten van Azië, andere het Oosten van Europa, maar de meeste onderzoekers vermoedden tot voor kort een meervoudige locatie omwille van de verschillende data die voorhanden zijn (Shearman en Wilton, 2011; Wade, 2011). Dit strookt wel niet met de meer recente bevindingen van het mtDNA. Deze studie suggereert een domesticatie op 1 plaats, namelijk in Zuid-Oost Azië ten Oosten van de Yangtze rivier, omwille van de gemeenschappelijke genenpool van mtDNA bij honden van deze regio. Haplotypes van de drie belangrijkste fylogenetische ‘clades’ en meer specifieke ‘subclades’ die geassocieerd worden met de wolf als gemeenschappelijke voorouder, werden onderzocht in verschillende geografische regio’s. De hoogste frequentie werd bekomen rond de eerder genoemde rivier. Vanuit
10
deze regio neemt de mtDNA diversiteit steeds af tot een minimum in Europa. Dit duidt op een gradiënt van Oost naar West (Pang et al., 2009). Deze eerste bottleneck van wilde wolven naar inheemse hondenpopulaties (Figuur 3) zou gepaard zijn gegaan met 5% verlies van nucleotide diversiteit (Dobson, 2013). Vanaf de plaats van oorsprong is er namelijk een afnemende haplotype diversiteit (Wade, 2011). Na de domesticatie verspreidden honden zich geleidelijk aan ‘at random’ vanaf de plaats van oorsprong, over de hele wereld waardoor vele jaren later verschillende groepen van honden voorkwamen. In deze periode kon er enige heropbouw van genetische diversiteit gebeuren. De eerste rassen ontstonden duizenden jaren geleden, maar de laatste 200 jaar ontwikkelden zich de meer moderne hondenrassen door artificiële selectie door de mens (Shearman en Wilton, 2011). Dit wordt gezien als de tweede bottleneck in de geschiedenis (Figuur 3), waarmee 35% verlies van nucleotide diversiteit gepaard ging (Dobson, 2013). In vergelijking met de eerste bottleneck, namelijk de domesticatie van wilde wolven naar inheemse hondenpopulaties, heeft de tweede bottleneck voor een veel groter aandeel een rol gespeeld in het verlies van genetische diversiteit. De laatste 200 jaar werd er namelijk door de mens kunstmatig geselecteerd op verschillende uiterlijke kenmerken van honden. De populatie van honden werd onderverdeeld in meer dan 300 verschillende hondenrassen, elk met hun typische uiterlijk en karaktertrekken. De rassen worden onderhouden door het gebruik van een beperkt aantal stichters, herhaaldelijke paringen binnenin het bepaalde ras en inteelt (Derrien et al., 2012). Meerdere genmutaties zijn verantwoordelijk voor de gegeerde raskenmerken. Deze mutaties zijn de dag van vandaag nog steeds aanwezig in die bepaalde rassen. Echter omwille van deze sterke onnatuurlijke selectie werd er onbewust ook geselecteerd voor ziekte allelen (Dobson, 2013). 2.1.1. Gevolgen van de populatiestructuur Door de manier van het ontstaan van verschillende hondenrassen doorheen de geschiedenis, het onderhouden van de hondenrassen en de nu nog steeds strikte vereisten voor stamboekregistraties, kan elk ras gezien worden als een geïsoleerde, gesloten populatie met praktisch geen onderlinge beweging van genen. Er is bijgevolg weinig genetische heterogeniteit binnenin de rassen en veel genetische diversiteit tussen de rassen (Dobson, 2013). Naast het effect van de stichters op het verlies van diversiteit is ook de genetische drift ten gevolge van een verminderde populatiegrootte één van de oorzaken hiervan (Lewis et al., 2010; Wade, 2011). Inteeltpraktijken hebben niet zozeer een impact op de verandering van diversiteit op populatieniveau, maar eerder individueel gezien. Anders verwoord: de genenfrequenties blijven binnen een populatie stabiel, terwijl de organisatie ervan in genotypen wel wijzigt zoals in de alinea hieronder verduidelijkt wordt. Inteelt verhoogt ook de incidentie van afwijkingen maar heeft geen directe invloed op de verspreiding ervan (Leroy, 2011). Recessieve ziekte allelen komen fenotypisch tot uiting wanneer ze homozygoot voorkomen. Inteelt laat de fractie heterozygoten systematisch afnemen waardoor bijgevolg de fractie homozygoten toeneemt. Mede door inteelt hebben raszuivere honden steeds meer kans om homozygotie voor allelen te ontwikkelen, aangezien binnen familiale lijnen bepaalde ziekteallelen meer kans hebben om
11
reeds heterozygoot voor te komen. Wanneer twee heterozygote ouders gepaard worden, hebben de nakomelingen 1 kans op 4 om homozygoot voor het recessieve gen te zijn (Rashonden – Geen hond gezond. Brandpunt, 2012). Sinds er meer en meer genetische testen op de markt zijn om homozygote wildtypes te identificeren en te onderscheiden van heterozygote dragers van ziekteallelen, gebruiken fokkers deze steeds meer om zo geschikte ouders te selecteren. Recessieve ziektes kunnen op die manier niet tot expressie komen bij de nakomelingen. Het voordeel van deze genetische testen is dat ouderparen zo worden uitgekozen dat inteelt minder waarschijnlijk is. Het nadeel is dat de selectiedruk stijgt en andere genetische afwijkingen, waar nog geen genetische tests voor beschikbaar zijn, ongemerkt in de populatie kunnen verspreiden (Wade, 2011). 2.2. De invloed van fokpraktijken op de verspreiding van genetische afwijkingen Er zijn verschillende fokpraktijken gangbaar (Tabel 3). Daarvan worden er drie vaak toegepast door fokkers en die krijgen in de literatuur veel aandacht bij onderzoek naar de invloed ervan op de verspreiding van genetische afwijkingen. Het stichterseffect is waarschijnlijk de belangrijkste fokpraktijk geweest doorheen de geschiedenis samen met lijnenteelt, paringen tussen individuen met een gemeenschappelijke voorouder, ook wel collaterale verwantschap genoemd, en inteelt met nog nauwer verwante individuen die een gemeenschappelijk bloedaandeel bezitten (Leroy en Baumung, 2010). Outbreeding (uitteelt) is het paren van individuen die minder verwant zijn dan onder normale random omstandigheden en outcrossing is het combineren van 2 verschillende rassen. Deze 2 methodes worden toegepast in sommige lijnen van honden om terug meer genetische diversiteit te creëren bijvoorbeeld bij geografisch geïsoleerde subpopulaties van honden (Leroy, 2011; Van Zeveren, 2013). Wanneer deze fokpraktijken gecombineerd worden met selectie voor specifieke gegeerde kenmerken, kunnen binnen het ras delen van het genoom naar homozygote toestand evolueren (Rooney en Sargan, 2009). Tabel 3: De theoretische invloed van verschillende fokpraktijken op de genetische diversiteit, expressie en verspreiding van genetische erfelijke aandoeningen, inteeltdepressie en inteeltzuivering. Naar Leroy, 2011.
Genetische diversiteit
Populatieniveau Individueel niveau
Erfelijke aandoeningen
Inteeltdepressie Inteeltzuivering
Verspreidingsrisico Expressie individueel niveau
Stichters effect
Nauwe inteelt
Lijnenteelt
Outbreeding
Outcrossing
↓ ↓
− ↓
− ↓
− ↑
↑ ↑
↑
↓
↓
↑
↑
↑ ↑ ↑
↑ ↑ ↑
↑ ↑ ↑
↓ ↓ ↓
↓ ↓ ↓
12
2.2.1. Stichterseffect Zoals reeds vermeld werd, hebben er door de geschiedenis heen talrijke kunstmatige selecties plaatsgevonden. Na het ontstaan van de hedendaagse rassen, moest er een manier gevonden worden om deze rassen te behouden, al dan niet te verbeteren. Dit werd gerealiseerd door gebruik te maken van een beperkt aantal stichters bij paringen. Honden die gunstige uiterlijke kenmerken bezaten (vb. showkampioenen) werden vaker ingeschakeld in de fok om zo deze kenmerken te verspreiden naar de volgende generaties (Rooney en Sargan, 2009). Veel auteurs zijn het eens over de invloed van stichters op de verspreiding van genetische ziektes (Tabel 3). Dit is logisch te verklaren aangezien bepaalde stichters die toevallig drager zijn van een recessief ziekteallel hun genen zullen doorgeven aan vele nakomelingen. Een studie in Frankrijk toonde dit nogmaals aan (Leroy en Baumung, 2010). Het stichterseffect doet eveneens de genetische diversiteit dalen zowel op niveau van de populatie als individueel (Tabel 3). Er wordt op die manier slechts een klein deel van de grote genenpool verder doorgegeven aan nakomelingen waardoor andere genen relatief aan belang verliezen (Calboli, 2008; Leroy, 2011). 2.2.2. Inteelt Het paren van verwante individuen heeft vergelijkbare effecten - op de parameters vermeld in de tabel - als het gebruik van stichters. Bij een toename van de inteeltgraad werd er een progressieve afname van de algemene fitness van een populatie waargenomen, wat aangeduid wordt met de term inteeltdepressie. Inteeltdepressie is een algemeen verschijnsel dat zich vooral uit in een verlaagde vruchtbaarheid, verlaagde vitaliteit en levensverwachting, verlaagde immuniteit, verhoogde frequentie van kankers en verhoogde frequentie van auto-immuunziekten (Peelman, 2014). Het voorkomen van genetische afwijkingen neemt op deze manier toe maar de verspreiding ervan wordt daarentegen niet beïnvloed of zelfs verminderd (Tabel 3) (Leroy, 2011). Er zijn veel gegevens beschikbaar over inteelt en genetische diversiteit in hondenpopulaties in verschillende landen in Europa. In België zijn onderzoeken echter schaars. Midden 2012 werd er daarom op basis van informatie uit stambomen een nieuwe studie gedaan door Wijnrocx en collega’s. Ze publiceerden inteeltgegevens van verschillende Belgische hondenrassen (Wijnrocx et al., 2012). Zoals in bovenstaand hoofdstuk reeds werd aangehaald gaat inteelt gepaard met een relatief verlies van heterozygotie. Gebreken komen meer tot uiting waardoor er een daling is van vitaliteit in de populatie (Scholten, 2004; Wijnrocx et al., 2012). De inteeltcoëfficiënt drukt in percentage de mate van inteelt uit. Het toont de kans dat 2 allelen in een locus, overgeërfd van beide ouders, van dezelfde voorouder binnen de stamboom komen (Calboli et al., 2008). Indien dit het geval is noemt men het dier fokzuiver of homozygoot. Gunstige genen zullen fixeren binnen de stamboom en dit is ook de reden dat fokkers inteelt uitvoeren binnen hun fokbeleid aangezien gewenste eigenschappen bewaard blijven. Echter zullen ook ongunstige genen in relatieve frequentie toenemen en fixeren. De inteeltgraad wordt echter wel onderschat indien de stamboom onvolledig is (Wijnrocx et al., 2012).
13
Aangezien hondenrassen een gesloten populatie vormen met weinig genetische diversiteit kan men aannemen dat inteelt onvermijdelijk zal optreden. Praktijkpopulaties zijn numeriek begrensd. De omvang ervan wordt binnen bepaalde perioden min of meer constant gehouden waardoor alle dieren theoretisch gezien dus verwant zijn. Op basis van genetische testen en het berekenen van inteeltcoëfficiënten kan men wel geschikte ouderparen vormen om inteelt zo min mogelijk te laten gelden, maar dit zal nooit voor 100% het probleem oplossen. Meer van belang is bijgevolg de toename van de gemiddelde inteelt over de generaties heen. Dit is gerelateerd aan de effectieve populatiegrootte, het aantal individuen dat in een at random parende populatie aanleiding zou geven tot een bepaalde inteeltgraad. Volgens een studiegroep binnen Livestock Genetics aan de Katholieke Universiteit te Leuven wordt een veilige bovengrens van 0,5% gehanteerd. Een intermediaire zone is gesitueerd tussen 0,5% en 1%. De effectieve populatiegrootte ligt best boven de 100 (Gandini et al., 2004; Wijnrocx et al., 2012). Dit is belangrijk daar er bij een intensere selectie mogelijk nieuwe erfelijke aandoeningen kunnen ontwikkelen door de dalende genetische diversiteit (en dus stijgende inteeltgraad) (Lewis et al., 2010). Om dit te verduidelijken kan men vergelijkbaar bij een stijging van 10%, een inteeltdepressie verwachten van 2 tot 10%. Inteeltdepressie is zowel voor de hond als voor de fokker een negatief gevolg waardoor genetisch fokadvies een belangrijke rol zal spelen in de fokpraktijken (Van Zeveren, 2013). Dit zal verder behandeld worden in de bespreking van deze scriptie. 2.2.3. Outbreeding en outcrossing Outbreeding en outcrossing hebben tegengestelde effecten in vergelijking met beide vormen van inteelt (Tabel 3). Positief is dat ze de genetische diversiteit op vlak van het individu zowel als op vlak van de populatie doen toenemen waardoor de populatie meer polymorf wordt. Deze fokpraktijk heeft echter wel als nadeel dat genetische afwijkingen sneller verspreid raken aangezien heterozygote dragers moeilijker op te sporen zijn en dus moeilijker uit te sluiten zijn uit de fok (Leroy, 2011). 2.3. Gepredisponeerde rassen Elk hondenras kampt met specifieke erfelijke gebreken die reeds uitgebreid beschreven staan in de literatuur. Deze gebreken worden generatie na generatie doorgegeven aan nakomelingen ten gevolge van het fokbeleid. Fokkers willen de rasstandaarden namelijk zo goed mogelijk evenaren en dit doen ze door de meest geschikte raszuivere honden meerdere malen te paren. De genetische pool wordt echter steeds kleiner en genetische gebreken blijven dus bewaard (Rashonden – Geen hond gezond. Brandpunt, 2012). In verschillende onderzoeken vond men een oververtegenwoordiging van de neoplasie bij zowel grote rassen, namelijk Engelse springer spaniël, Brittany spaniël, cocker spaniël, Engelse setter, pointer, Duitse herder en Afghaanse windhond, als bij verschillende kleine rassen: poedel, chihuahua, Malteser, Yorkshire terriër, West Highland white terriër, beagle, teckel en bichon frisé (Tabel 4) (Sorenmo et al., 2011). Enkele tegenstrijdige gegevens werden ook teruggevonden. Zo bestaat er bijvoorbeeld discussie over het al dan niet verhoogde risico bij de boxer en de berner sennenhond (Sleeckx et all., 2011).
14
Volgens een andere studie vond men de collie, sheltie en Berner sennenhond als rassen met een lagere risicofactor voor mammatumoren (Borge et al., 2011). Hieruit blijkt al een verschil tussen verscheidene studies naargelang de geografische regio waar het onderzoek plaatsvond. Desondanks is het duidelijk dat sommige hondenrassen frequenter mammatumoren ontwikkelen dan andere. Maar zelfs binnen bepaalde rassen zouden er onderlinge verschillen zijn in incidentie naargelang de familielijn. Dit werd in een beagle familie teruggevonden. Bepaalde lijnen zouden resistenter zijn tegen het ontwikkelen van mammatumoren aangezien ze in de studie op latere leeftijd vatbaar werden dan de controlegroep (Schafer et al., 1998; Sleeckx et all., 2011). Het belang van dit alles is dat dit een genetische en dus overerfbare component in de pathogenese van mammatumoren suggereert. Deze componenten zullen meer in detail uitgewerkt worden in deel 3 van deze scriptie. Tabel 4: Incidentiegegevens (Dogs a year at risk (DAYR)) van mammatumoren bij teven van verschillende rassen, van de leeftijd van 3 tot 10 jaar samen met de gemiddelde leeftijd op moment van diagnose. Naar Egenvall et al., 2005. Ras
Gemiddelde leeftijd bij diagnose
Incidentie /10.000 DAYR
HOGE RISICOFACTOR RASSEN Engelse springer spaniël
6,9
319
Doberman Pinscher
6,7
297
Boxer
6,4
256
Ierse softcoated wheaten terriër
6,8
199
Amerikaanse cocker spaniël
7,7
192
Yorkshire Terriër
8,1
188
Bichon Frisé
7,3
172
Duitse Herder
7,1
170
Berner Sennenhond
7,6
54
Newfoundlander
6,3
21
Finse Brak
6,8
17
Ruwharige collie
7,9
5
Gemiddeld
7,3
111
LAGE RISICOFACTOR RASSEN
De incidentie ratio’s bij verschillende hondenrassen in Zweden variëren tussen de 5 gevallen van mammatumoren per 10.000 honden per jaar, bij de ruwharige collie en 319, bij de Engelse springer spaniël (Tabel 4). Egenvall en collega’s kwamen tot deze resultaten door het analyseren van de gegevens van honden van 3 tot 10 jaar met een verzekering bij Agria in Zweden, gedurende de periode van 1995 en 2002. Het was aangetoond dat deze database (Zweedse Kennel Club) representatief was voor Zweedse honden in het algemeen. Op basis van postcode gegevens van de eigenaars kon men de groepen honden indelen naargelang de geografische regio, namelijk het Zuiden, het Centrum en het Noorden van Zweden. Mammatumoren werden echter niet histologisch
15
gedifferentieerd naar type of kwaadaardigheid waardoor de tumoren niet geclassificeerd werden. Met behulp van statistische testen kon men vervolgens de incidentie ratio’s berekenen. (Egenvall et al., 2005). Een andere manier om incidentieverschillen tussen rassen te schatten is het bekijken van de mortaliteit. Het gemiddelde sterftepercentage van honden aan kanker is 27%. Men kan dus stellen dat hondenrassen die een significant hoger sterftepercentage hebben, gevoeliger zijn voor kanker dan andere. Dit zegt echter niks over de proportie van de verschillende types van kanker bij dit ras (Dobson, 2013). De reden voor de verschillende raspredilecties is mede te vinden in de totstandkoming van de populatiestructuur bij honden. De verschillende fokpraktijken hebben namelijk geleid tot variatie in allel frequenties van genen, onder andere deze genen die een invloed hebben op mammatumoren, waardoor er nu opmerkelijke verschillen zijn in genetische risicofactoren tussen de verschillende rassen (Borge et al., 2011). Een voorbeeld van genen die bij defectieve werking een invloed op de mammatumor ontwikkeling hebben, zijn de celcyclus regulerende genen. Deze genen spelen een kritische rol in de ontwikkeling van elk type tumor. Wanneer de celcyclus onvoldoende of defectief gereguleerd wordt kunnen cellen zich ontwikkelen tot ongecontroleerd delende cellen met al dan niet een invasief karakter, namelijk tumorcellen (Evan en Vousden, 2001). Om kandidaatgenen op te sporen zou een studie idealiter gebaseerd moeten zijn op honden van verschillende rassen, met een vergelijkbare veruiterlijking van een ziekte, maar aan een verschillende incidentie (Borge et al., 2011).
16
3. DEEL
3: POTENTIËLE GENETISCHE RISICOFACTOREN VOOR DE
ONTWIKKELING VAN MAMMATUMOREN Aangezien de mens relatief dicht bij de hond staat in de context van mammatumoren, is het onvermijdelijk en ook zinvol om het ziektebeeld, en de genetische kennis hierover, van bij de mens te gaan vergelijken met deze bij de hond. 3.1. Vergelijkende oncologie Bij de mens is borstkanker, zoals bij de hond, een veelvoorkomende, complexe, multifactoriële ziekte en dus een belangrijk onderzoeksonderwerp. Verschillende studies toonden aan dat mammatumoren bij de hond veel overeenkomsten vertonen met borstkanker bij de mens (Sorenmo et al., 2000; Richards, 2001). De kanker ontstaat namelijk spontaan en aan een min of meer vergelijkbare frequentie als deze bij de mens (Dobson, 2013). Bovendien leven honden in zeer nauwe associatie met de mens, waardoor ze aan vergelijkbare omgevingsinvloeden onderhevig zijn (Starkey et al., 2005). Het genoom van honden bevat eveneens een grote overeenkomst met dit van de mens waardoor studies bij honden, mede door de langere generatietijd in vergelijking met andere proefdieren, bijgevolg interessant zijn voor vergelijkende studies (Calboli et al, 2008). Om deze reden worden honden gebruikt als een goed model om de genetische invloeden op kanker te onderzoeken (Starkey et al., 2005). Een andere reden om de hond als model voor de mens te gebruiken bij kankeronderzoek is de unieke populatiestructuur zoals eerder reeds uitvoerig besproken werd. Elk ras stamt af van een beperkt aantal stichters. Elk ras bezit een beperkte hoeveelheid genetische variatie omdat stamboeken strikte vereisten
hebben
qua
rasstandaarden
(Dobson,
2013).
Sommige
rassen
vertonen
een
oververtegenwoordiging van bepaalde ziektes en men denkt dat daarom de oorzakelijke varianten gemakkelijker te detecteren zijn bij honden dan bij de mens (Calboli et al, 2008). Linkage-analyse, een methode om familiegerelateerde ziektes te onderzoeken, wordt op deze manier eenvoudiger, evenals genetische associatiestudies die de omgevingsfactoren en interactie tussen verschillende genen mee in beschouwing nemen (Houwing-Duistermaat, 2005; Dobson, 2013). Bij de mens is bewezen dat er familiale borstkanker voorkomt die dus overerfbaar is. Dit is echter nog niet ontegensprekelijk bewezen bij de hond. Wel weet men ondertussen, zoals ook aangegeven in de voorgaande delen van deze scriptie, dat er verschillende raspredilecties voorkomen (Sleeckx et al., 2011). 3.2. Genen van belang bij mammatumoren Om te weten of inteelt een invloed heeft op mammatumoren, is het van belang eerst na te gaan welke genetische systemen precies inwerken op de overerving van mammatumoren. Aangezien inteelt een invloed heeft op de genetica van honden zou er op die manier een indirect verband kunnen aangetoond worden.
17
Borstkanker bij de mens kan men indelen in de familiale en sporadische borstkanker. Zoals reeds vermeld bij de risicofactoren voor mammatumoren, spelen mutaties in de BRCA 1 en 2 genen een rol in het overerfbaar effect van de familiale vorm en slechts zelden in de sporadische vorm. Andere genen en oncogenen spelen eveneens een rol. Zo zijn er verschillende genen die bij aanwezigheid van mutaties een verhoogd risico inhouden, namelijk BRCA1, BRCA2, Tumor Protein 53 (TP53), Phosphatase and tensin homolog (PTEN), Checkpoint homolog (CHEK2) en Aataxia Telangiectasia Mutated (ATM). Deze genen coderen voor proteïnen die een rol spelen in de DNA schade herkennings- en herstellingsmechanismen. Mutaties in deze genen verhogen het risico op kanker en verhogen eveneens het overerfbaar effect ervan (Borge et al., 2011). Ook bij de hond zouden de genen BRCA1, BRCA2, TP53 en PTEN een rol spelen in de etiologie van mammatumoren (Borge et al., 2011). De meeste studies uitgevoerd bij honden zijn niet zozeer genexpressie studies maar studies waar men zich specifiek concentreert op bepaalde receptoren of genen die meestal gerelateerd zijn aan een verhoogd risico bij de mens. Zo werd gemeld dat mammatumoren soms gepaard gaan met mutaties in TP53 (Dobson, 2013). Een Noorse studie onderzocht de genetische variatie van 11 kandidaatgenen, uitgekozen op basis van de huidige kennis, om de eventuele invloed van mutaties op kanker te voorspellen. Men extraheerde genomisch DNA uit bloedstalen van 4 hoogrisico en 4 laagrisico hondenrassen voor mammatumoren en sequeneerde vervolgens de genenregio’s. Single nucleotide polymorphisms (SNP’s) werden geïdentificeerd en gecontroleerd op aminozuursubstituties. Van de 64 gevonden SNP’s waren er 3 met een aminozuursubstitutie die een gewijzigde R-groep bezaten en dus mogelijk een schadelijke wijziging aanbrachten in hun proteïne waardoor de individuen een verhoogde kans op kanker zouden vertonen. Een significant verband kon echter niet aangetoond worden, mede doordat de studiegroep te beperkt was, namelijk 32 honden (Borge et al., 2011). Een studie in Zweden onderzocht op een vergelijkbare manier 10 kandidaatgenen bij Engelse springer spaniël honden, bij een controlegroep en een groep met mammatumoren (cases). Vervolgens onderzocht men of SNP’s aan een significant hogere frequentie voorkwamen bij de cases in vergelijking met de controlegroep. Bij twee genen, BRCA 1 en BRCA 2, werden dergelijke SNP’s gevonden waarvan enkele SNP’s op geconserveerde regio’s lagen en andere niet (Rivera et al., 2009). Een genetische variant gelokaliseerd op een sterk geconserveerde regio van het gen heeft meer kans om ziektegerelateerd te zijn (Borge et al., 2011). Vanzelfsprekend zijn er verdere studies nodig om werkelijk het verband aan te tonen tussen de betrokken genen en hun invloed op de pathogenese van mammatumoren (Rivera et al., 2009). Niet alleen het ontstaan van mammatumoren wordt genetisch beïnvloed maar eveneens de kwaadaardigheid ervan. De mate van expressie van het enzyme cyclooxygenase-2 (COX-2) zou hier bijvoorbeeld een invloed op hebben (Rivera, 2010). COX-2 is een belangrijke speler in de angiogenese, de vorming van nieuwe bloedvaten, en bijgevolg in de tumorgroei. Dit effect wordt voornamelijk bewerkstelligd via thromboxaan A2 (TXA2), prostaglandine E2 (PGE2) en prostaglandine I2 (PGI2), 3 intermediaire producten van het arachidonzuur metabolisme dat gemedieerd wordt door
18
COX-2 enzymen (Gately en Li, 2004). Bij de mens werd een verhoging van expressie van dit enzym reeds bij verschillende types kanker aangetoond. In Canada werd dit bevestigd voor mammatumoren bij de hond. In normaal melkklierweefsel was er geen expressie van COX-2 te zien. Bij de goedaardige melkkliertumoren had 24% een verhoogde expressie en bij de kwaadaardige was dit 56%. Dit verschil was significant, waaruit kon afgeleid worden dat COX-2 expressie verhoogd is bij kwaadaardige mammatumoren (Dore et al., 2003).
19
DISCUSSIE EN HYPOTHESEN Alvorens in te gaan op de incidentieratio’s is het uit bovenstaande duidelijk dat de literatuur vrij divers is in de methode van onderzoek. Dit verhoogt de complexiteit aanzienlijk aangezien er geen gestandaardiseerde methodes bestaan om incidentieratio’s in studiegroepen te bepalen. Deze problematiek kwam reeds eerder in de scriptie aan bod omdat dit het mede moeilijk maakt om vergelijkingen te maken tussen de verschillende studies. Elke studie kiest een bepaalde studiegroep waardoor de resultaten vaak niet extrapoleerbaar zijn naar andere studiegroepen, hetzij in dezelfde geografische regio, hetzij in andere regio’s. Een suggestie voor het verder in kaart brengen van mammatumoren bij de hond met eventueel doel tot verder onderzoek van risicofactoren is het noteren van zoveel mogelijk randinformatie zoals het ras, het geslacht en het al dan niet intact zijn van de geslachtsorganen, de leeftijd en andere. Dit zal de verwerking van resultaten nadien vereenvoudigen waardoor er eveneens juistere conclusies kunnen getrokken worden. Wat betreft het achterhalen van genetische risicofactoren heeft men de laatste jaren reeds veel vooruitgang geboekt. Vooral in de humane geneeskunde zijn reeds tal van SNP’s gevonden die werkelijk een verhoogd risico op kanker geven. Wanneer iemand meer van deze SNP’s tegelijkertijd in het genoom draagt verhoogt het risico nog meer. Genoomprojecten van de hond zijn nog niet volledig waardoor genetische studies bij de hond vaak beperkingen kennen. In de toekomst zullen er dus meer gerichte linkage-analyses en genetische associatiestudies kunnen gebeuren (Derrien T. et al., 2012). Het doel van dit alles bij de mens is dat men streeft naar een preventieve screening van risicopersonen naar deze SNP’s om op die manier de kanker vroeger te kunnen opsporen en behandelen. Bij de hond zullen DNA-testen belangrijker zijn op vlak van de fok. Indien men preventief de honden met een verhoogde aanwezigheid van SNP’s geassocieerd met kanker of eender welke andere erfelijke aandoeningen kan detecteren en weren uit de fok zullen de ziektes progressief afnemen in aantal. Als men hierop verder redeneert zal de genetische diversiteit binnen de rassen een heropleving kennen indien stamboekregistraties minder strikt zouden zijn en paringen buiten het ras zouden toelaten. Het fokadvies is dan ook een belangrijk onderdeel van de bespreking van deze scriptie en zal hieronder verder behandeld worden.
FOKADVIES Om gegrond fokadvies te kunnen geven zijn er enkele aspecten waarmee men rekening dient te houden. Er moet bepaald worden of (een substantieel aandeel van) mammatumoren werkelijk overerfbaar zijn en de wijze waarop dit gebeurt. Hier is nog geen eenduidig bewijs voor maar men gaat
uit
van
een
complexe
multifactoriële
overerving.
Daarnaast
dient
eveneens
een
frequentiebepaling van mammatumoren in de populatie en een stamboomanalyse te gebeuren (Peelman, 2014). Onder optimale omstandigheden is men het erover eens dat er drie verschillende basisprincipes bestaan om de frequentie van erfelijke aandoeningen te doen afnemen in een populatie. Deze optimale omstandigheden houden in dat de exacte wijze van overerving gekend is en er genetische
20
testen bestaan om dragers te kunnen identificeren (Peelman, 2014). Indien hieraan voldaan is kan men selecteren naar individuen die de aandoening niet bezitten. Hiervoor zal uiteraard een DNA-test moeten gebeuren. Een tweede mogelijkheid is het binnenbrengen van nieuw genetisch materiaal waarna men vervolgens hiernaar selecteert om de frequentie van deze genen te doen toenemen. Een laatste mogelijkheid is de gezondheid van de populatie op lange termijn te verzekeren door genetische drift en inteelt te minimaliseren (Lewis et al., 2010). DNA-testen zijn ontegensprekelijk waardevol in genetisch fokadvies maar men moet de nadelen ervan niet negeren. De ontwikkeling en het gebruik ervan is namelijk complex en duur en gelimiteerd tot een kleine groep van erfelijke aandoeningen en moet daarom slechts als onderdeel van een volledige strategie dienen, waarbij fokmaatregelen zelf zeker even belangrijk zijn (Rooney en Sargan, 2009). Volgens 94% van de respondenten van een panelonderzoek door Rooney en Sargan zijn er 4 essentiële actiepunten in de welzijnsproblematiek van de stamboekhonden. Ten eerste moet er een systematische verzameling van morbiditeits- en mortaliteitsgegevens plaatsvinden. Hierdoor kan men de ernst van de verschillende aandoeningen inschatten en prioriteiten stellen. Er moet een herziening komen betreffende de criteria voor registratie bij stamboekhouders om op die manier inteelt te verminderen. Ook zouden de stamboeken meer uitteelt moeten toelaten om zo nieuw genetisch materiaal binnen te brengen in probleemrassen waardoor de genetische diversiteit zou verhogen. Door vervolgens meervoudig terug te kruisen met het oorspronkelijke ras, kunnen de gegeerde kenmerken toch nog steeds behouden worden (Peelman, 2014). Bovendien zou er volgens hen een overkoepelende organisatie moeten worden opgericht die de efficiëntie van de gewijzigde fokmethodes kan monitoren en zo nodig bijsturen. Daarnaast zijn er nog tal van andere aanbevelingen in de aanpakmethode die eveneens door de grote meerderheid op het panelonderzoek verkozen werden (Rooney en Sargan, 2009). Praktisch gezien is een eerste aandachtspunt in de methode van fokken, het beperken van het gebruik van stichters. Men zou het aantal nesten per stichter kunnen beperken om zo negatieve effecten van het stichterseffect, zijnde verspreiding van genetische afwijkingen, te minimaliseren. Dit wordt reeds toegepast in sommige hondenclubs maar om een voldoende groot en blijvend effect voorop te stellen zouden alle fokkers deze methode moeten toepassen. Er is dus nood aan meer communicatie tussen fokkers en meer uniformiteit in de fokmethode. De reeds eerder aangeraden oprichting van een overkoepelende organisatie zou ook hier nuttig zijn (Leroy en Baumung, 2010; Leroy, 2011). Er zijn verschillende studies die positieve resultaten bekwamen bij gewijzigde foktechnieken bij monogenetische recessieve afwijkingen, waaruit bleek dat er een vermindering van verspreiding was (Leroy en Baumung, 2010). Aangezien de erfelijkheidsgraad en de wijze van overerving bij mammatumoren nog niet gekend is kan men hier geen uitspraken over doen. Inteelt kan genetische afwijkingen tot expressie laten komen. Door op basis van inteeltcoëfficiëntberekeningen ouders uit te kiezen die minder ingeteeld zijn en deze te laten paren, kan dit effect verminderd worden. Inteelt komt zoals reeds vermeld werd onvermijdelijk voor binnen rassen. Men
21
moet dus de inteelt over generaties heen beperken door gebruik te maken van een maximale toegelaten inteeltgraad. Hier zouden stamboekregistraties mee een rol in kunnen spelen door honden met een inteeltgraad boven de toegelaten grens niet meer te registreren (Wijnrocx et al., 2012). Paringen over de grenzen heen zou een positief effect hebben op de genetische diversiteit. Daarom opteert men voor versoepeling van de rasstandaarden om zo paringen tussen fokzuivere en fokonzuivere honden toe te laten zowel via outbreeding als outcrossing (Wijnrocx et al., 2012). Men moet echter wel rekening houden met het feit dat genetische afwijkingen beter kunnen gedetecteerd en dus aangepakt worden bij homozygoten, zijnde raszuivere honden, in vergelijking met heterozygote dragers. Outcrossing en outbreeding hebben daarenboven als potentieel risico dat er een verspreiding van genetische aandoeningen kan plaatsvinden (Leroy, 2011).
22
REFERENTIELIJST Artikels: Adams D.R. (2001). Canine Anatomy: A Systemic Study. 3
th
edition. Iowa State Press, Blackwell,
p.308-310, 319. Adams V.J., Evans K.M., Sampson J., Wood J.L.N. (2010). Methods and mortality results of a health survey of purebred dogs in the UK. Journal of Small Animal Practice 51 (10), 512–524. Borge K.S., Børresen-Dale A.L., Lingaas F. (2011). Identification of genetic variation in 11 candidate genes of canine mammary tumour. Veterinary and Comparative Oncology 9 (4), 241–250. Bowen T.J., Yakushiji H., Montagna C., Jain S., Ried T., Wynshaw-Boris A. (2005). Atm heterozygosity cooperates with loss of Brca1 to increase the severity of mammary gland cancer and reduce ductal branching. Cancer Research 65 (19), 8736-8746. Bragulla H., Budras K.-D., Červeny C., Forstenpointner G., König H. E., Liebich H.-G., Maierl J., Mülling C., Probst A., Reese S., Ruberte J., Sótonyi P., Weissengruber G. (2009). In: König H. E., th
Liebich H.-G. (Editors) Veterinary Anatomy of Domestic Mammals. 4 edition. Schattauer, Stuttgart, New York, p.481, 619-624 en 693. Brodey R.S., Fidler I.J., Howson A.E. (1966). The relationship of estrus cycle irregularity, pseudopregnancy, and pregnancy to the development of canine mammary neoplasms. Journal of the American Animal Hospital Association 149,1047–1049. Calboli F.C.F., Sampson J., Fretwell N., Balding D.J. (2008). Population structure and inbreeding from pedigree analysis of purebred dogs. Genetics 179 (1), 593–601. Ciaputa R., Kandefer-Gola M., Nowak M., Madej J.A. (2013): Prevalence of tumours in domestic animals in the lower Silesia (Poland) in 2009-2011. Bulletin of the Veterinary Institute in Pulawy 57 (1), 53-59. Derrien T., Vaysse A., Andre C., Hitte C. (2012). Annonation of the domestic dog genome sequence: finding the missing genes. Mammalian Genome 23 (1-2), 124-131. Dobson J.M. (2013). Breed-predisposition to cancer in pedigree dogs. ISRN Veterinary Science 2013 Dobson J.M., Samuel S., Milstein H., Rogers K., Wood J.L.N. (2002). Canine neoplasia in the UK: estimates of incidence rates from a population of insured dogs. Journal of Small Animal Practice 43 (6), 240–246. Done S.H., Goody P.C., Evans S.A., Stickland N.C. (2009). Color Atlas of Veterinary Anatomy. th
Volume 3. The Dog and Cat. 2 edition. Elsevier Health Sciences, Mosby, p.5.42, 6.42-6.43, 7.10 en 8.27-8.28.
23
Dore M., Lanthier I., Sirois J. (2003). Cyclooxygenase-2 expression in canine mammary tumors. Veterinary Pathology Online 40 (2), 207-212. Dorn C.R., Taylor D.O.N., Frye F.L., Hibbard H.H. (1968). Survey of animal neoplasms in Alameda and Contra Costa counties, California. I. Methodology and description of cases. Journal of the National Cancer Institute 40 (2), 295-305. Egenvall A., Bonnett B.N, Öhagen P., Olson P., Hedhammar Å., von Euler H. (2005). Incidence of and survival after mammary tumors in a population of over 80,000 insured female dogs in Sweden from 1995 to 2002. Preventive Veterinary Medicine 69 (1), 109-127. Evan G.I., Vousden K.H. (2001). Proliferation, cell cycle and apoptosis in cancer. Nature 411 (6835), 342-348. Gately S., Li W.W. (2004). Multiple roles of COX-2 in tumor angiogenesis: a target for antiangiogenic therapy. Seminars in oncology 31, 2-11. Gray M.M., Granka J.M., Bustamante C.D., Sutter N.B., Boyko A.R., Zhu L., Ostrander E.A., Wayne R.K. (2009). Linkage disequilibrium and demographic history of wild and domestic canids. Genetics 181 (4), 1493-1505. Houwing-Duistermaat
J.
(2005).
Genoom-statistiek.
Internetreferentie:
http://www.kennislink.nl/publicaties/genoom-statistiek (geconsulteerd op 30 juli 2013). Leroy G. (2011). Genetic diversity, inbreeding and breeding practices in dogs: Results from pedigree analyses. The Veterinary Journal 189 (2), 177-182. Leroy G., Baumung R. (2010). Mating practices and the dissemination of genetic disorders in domestic animals, based on the example of dog breeding. Animal Genetics 42 (1), 66-74. Lewis T.W., Woolliams J.A., Blott S.C. (2010). Optimisation of breeding strategies to reduce the prevalence of inherited disease in pedigree dogs. Animal Welfare 19 (1), 93-98. MacArthur D.G., Tyler-Smith C. (2010). Loss-of-function variants in the genomes of healthy humans. Human Molecular Genetics 19 (2), 125-130. Merlo D.F., Rossi L., Pellegrino C., Ceppi M., Cardellino U., Capurro C., Ratto A., Sambucco P.L., Sestito V., Tanara G., and Bocchini V. (2008). Cancer incidence in pet dogs: Findings of the animal tumor registry of Genoa, Italy. Journal of Veterinary Internal Medicine 22 (4), 976–984. Moe L. (2001). Population-based incidence of mammary tumours in some dog breeds. Journal of Reproduction and Fertility. Supplement 57, 439-443. Mousavi S.M., Montazeri A., Mohagheghi M.A., Jarrahi A.M., Harirchi I., Najafi M., Ebrahimi M. (2007). Breast cancer in Iran: an epidemiological review. The Breast Journal 13 (4), 383–391.
24
Ostrander E.A., Galibert F., Patterson D.F. (2000). Canine genetics comes of age. Trends In Genetics 16 (3), 117-124. Pang J.F., Kluetsch C., Zou X.J., Zhang A.B., Luo L.Y., Angleby H., Ardalan A., Ekstrom C., Skollermo A., Lundeberg J., Matsumura S., Leitner T., Zhang Y.P., Savolainen P. (2009). mtDNA data indicate a single origin for dogs south of Yangtze River, less than 16,300 years ago, from numerous wolves. Molecular Biology and Evolution 26 (12), 2849-2864. Parker H.G., Sutter N.B., Ostrander E.A. (2005). In: O. Giger and K. Lindbland-Toh (Editors) Understanding genetic relationships among purebred dogs: the PhyDo project. a Dog and Its Genome, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA, chapter 9, p.141-157. Peelman L. (2014). Genetische fokadvies. Cursus Faculteit Diergeneeskunde, Gent, p.13, 58, 84. Perez Alenza M.D., Peña L., del Castillo N., Nieto A.I. (2000). Factors influencing the incidence and prognosis of canine mammary tumours. Journal of Small Animal Practice 41 (7), 287-291. Richards H.G., McNeil P.E., Thompson H., Reid S.W.J. (2001) An epidemiological analysis of a canine-biopsies database compiled by a diagnostic histopathology service. Preventive Veterinary Medicine 51 (1), 125-136. Rivera P. (2010). Biochemical markers and genetic risk factors in canine tumors. Doctoral Thesis Swedish University of Agricultural Sciences, Uppsala 34. Rooney N. en Sargan D. (2009). Pedigree dog breeding in the UK: a major welfare concern? Royal Society for the Prevention of Cruelty to Animals. 75 pagina’s. Schafer K.A., Kelly G., Schrader R., Griffith W.C., Muggenburg B.A., Tierney L.A., Lechner J.F., Janovitz E.B., Hahn F.F. (1998). A canine model of familial mammary gland neoplasia. Veterinary Pathology Online 35 (3), 168-177. Schneider R. (1970). Comparison of age, sex and incidence rations in human and canine breast cancer. Cancer 26, 419–4126. Scholten J. (2004). Inteelt en inteeltcoëfficiënt. Labrador Post 40 (3). Shearman J.R., Wilton A.N. (2011). Origins of the domestic dog and the rich potential for gene mapping. Genetics Research International 2011, 6 pagina’s. Sleeckx N., de Rooster H., Veldhuis Kroeze E.J.B., Van Ginneken C., Van Brantegem L. (2011). Canine mammary tumours, an overview. Reproduction in Domestic Animals 46 (6), 1112–1131. Sonnenschein E.G., Glickman L.T., Goldschmidt M.H., McKee L.J. (1991). Body conformation, diet, and risk of breast cancer in pet dogs: a case-control study. American Journal of Epidemiology 133 (7), 694–703.
25
Sorenmo K.U., Kristiansen V.M., Cofone M.A., Shofer F.S., Breen A.-M., Langeland M., Mongil C.M., Grondahl A.M., Teige J., Goldschmidt M.H. (2009). Canine mammary gland tumors; a histological continuum from benign to malignant; clinical and histopathological evidence. Veterinary and Comparative Oncology 7 (3), 162–172. Sorenmo K.U., Rasotto R., Zappulli V., Goldschmidt M.H. (2011). Development, anatomy, histology, lymphatic drainage, clinical features and cell differentiation markers of canine mammary gland neoplasms. Veterinary Pathology Online 48 (1), 85-97. Starkey M.P., Scase T.J., Mellersh C.S., Murphy S. (2005). Dogs really are man’s best friend - Canine genomics has applications in veterinary and human medicine. Briefings in Functional Genomics & Proteomics 4 (2), 112–128. Van Zeveren A. (2013). Deel 1: Begrippen van algemene veeteelt. Cursus Faculteit Diergeneeskunde, Gent, H2 p.1-12. Vascellari M., Baioni E., Ru G., Carminato A., Mutinelli F. (2009). Animal tumour registry of two provinces in northern Italy: incidence of spontaneous tumours in dogs and cats. BMC Veterinary Research 5 (1), 39. Wijnrocx K., Janssens S., Buys N. (2012). Rapport: Inteelt en genetische diversiteit van 23 populaties van honden in België op basis van afstammingsgegevens van de KMSH. K.U. Leuven, Livestock
Genetics. Wade C.M. (2011). Inbreeding and genetic diversity in dogs: Results from DNA analysis. The Veterinary Journal 189 (2), 183–188.
Filmfragment: Inteelt met honden veroorzaakt veel aandoeningen. Het journaal 7, tv-programma, één, 30 augustus 2012, geraadpleegd op 19/08/13: http://www.deredactie.be/cm/vrtnieuws/videozone/archief/programmas/journaal/2.23980/2.23981/1.14 16007 Rashonden – Geen hond gezond. Brandpunt, tv-programma, KRO, 04 maart 2012, geraadpleegd op 19/08/13: http://brandpunt.incontxt.nl/seizoenen/seizoen_2012/afleveringen/04-03-2012
26
