UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT DIERGENEESKUNDE
Academiejaar 2013-2014
6 CASE REPORTS: INZICHTEN IN DE PATHOGENESE VAN HAEMORRHAGIC BOWEL SYNDROME BIJ RUNDEREN
door
Yannik DE CLOEDT
Promotoren: Drs. Bonnie Valgaeren
Onderzoeksonderwerp in het kader van de Masterproef
Prof. Dr. K. Chiers ©2014
Yannik De Cloedt
Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de juistheid of volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de inhoud van deze masterproef geen inbreuk uitmaakt op of aanleiding kan geven tot inbreuken op de rechten van derden. Universiteit Gent, haar werknemers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of verantwoordelijkheid voor enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud van de masterproef, noch voor enig vertrouwen dat wordt gesteld in een advies of informatie vervat in de masterproef.
UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT DIERGENEESKUNDE
Academiejaar 2013-2014
6 CASE REPORTS: INZICHTEN IN DE PATHOGENESE VAN HAEMORRHAGIC BOWEL SYNDROME BIJ RUNDEREN
door
Yannik DE CLOEDT
Promotoren: Drs. Bonnie Valgaeren
Onderzoeksonderwerp in het kader van de Masterproef
Prof. Dr. K. Chiers ©2014
Yannik De Cloedt
VOORWOORD Vooraleer deze masterproef aan te vatten, had ik graag aan een aantal mensen mijn dank willen betuigen. Hun hulp was essentieel om deze opdracht te voltooien. Drs. Bonnie Valgaeren wil ik bedanken voor de vele tips, de nodige bijsturing en begeleiding van deze masterproef. Bonnie, ik kon steeds bij je terecht met mijn Post-it’je vol vragen. Bedankt om steeds de tijd te nemen om naar mijn uiteenzettingen en ideeën te luisteren. Zonder jou had ik dit werk nooit tot een goed einde kunnen brengen. Verder wil ik Evy Goossens bedanken voor het begeleiden van de onderzoekstechnieken. Ook bij u kon ik steeds terecht met al mijn bedenkingen en vragen. Bedankt! Professor K. Chiers wil ik bedanken om op de valreep nog immunohistochemische kleuringen te laten uitvoeren zodat de pathogenese van Haemorrhagic Bowel Syndrome nog meer uitgediept kon worden. Als laatste bedank ik nog mijn vriend Bart Gouwy voor het aanbrengen van verbeteringen en het optimaliseren van de lay-out.
INHOUDSOPGAVE
SAMENVATTING...................................................................................................................................... 1 INLEIDING ................................................................................................................................................ 2 CASUÏSTIEKEN ......................................................................................................................................... 3 1. CASE REPORT 1 ................................................................................................................................ 3 2. CASE REPORT 2 ................................................................................................................................ 6 3. CASE REPORT 3 ................................................................................................................................ 8 4. CASE REPORT 4 .............................................................................................................................. 10 5. CASE REPORT 5 .............................................................................................................................. 12 6. CASE REPORT 6 .............................................................................................................................. 15 LITERATUURSTUDIE .............................................................................................................................. 20 1. ETIOLOGIE EN PATHOGENESE ....................................................................................................... 20 1.1. Clostridium perfringens .......................................................................................................... 20 1.2. Aspergillus fumigatus ............................................................................................................. 22 1.3. Shigatoxine-producerende Escherichia coli’s (STEC’s) ........................................................... 22 2. RISICOFACTOREN........................................................................................................................... 23 3. KLINISCH BEELD ............................................................................................................................. 23 4. LABORATORISCHE BEVINDINGEN.................................................................................................. 24 5. ECHOGRAFISCHE BEVINDINGEN.................................................................................................... 25 6. AUTOPSIE....................................................................................................................................... 26 7. HISTOLOGIE ................................................................................................................................... 26 8. DIAGNOSE ...................................................................................................................................... 26 9. DIFFERENTIAALDIAGNOSE ............................................................................................................. 27 10. BEHANDELING EN PROGNOSE..................................................................................................... 27 11. PREVENTIE ................................................................................................................................... 28 ONDERZOEKSGEDEELTE ........................................................................................................................ 30 1. Materiaal en methoden................................................................................................................. 30 2. Resultaten case series ................................................................................................................... 30 3. Resultaten onderzoekstechnieken van case report 6 ................................................................... 32 BESPREKING .......................................................................................................................................... 35 CONCLUSIE ............................................................................................................................................ 37 LITERATUURLIJST .................................................................................................................................. 38
SAMENVATTING De klinische, haematologische en biochemische bevindingen, behandeling en afloop van zes runderen met Haemorrhagic Bowel Syndrome (HBS) worden besproken. Het gaat om vijf Holstein Friesian koeien en een stier van het Belgisch Wit Blauwe ras, welke aangeboden werden op de Faculteit Diergeneeskunde te Merelbeke. Anorexie, depressie, shock, abdominaal discomfort, opgezette dunne darmen en een verminderde of afwezige pens- en darmmotiliteit waren de meest voorkomende klinische bevindingen in deze studie. De belangrijkste echografische bevinding was de aanwezigheid van een vergrootte lebmaag en opgezette dunne darmen. De prognose van de aangetaste dieren was teleurstellend. Exploratieve laparotomie werd uitgevoerd bij vijf dieren, vier dieren werden geëuthanaseerd, één dier stierf enkele dagen na chirurgie, slechts één dier overleefde. Postmortaal onderzoek reveleerde een matig tot uitgesproken necro-haemorrhagische enteritis of jejunitis met intraluminale bloedingen of bloedklonters. Op basis van de klinische, intra-operatieve en/of postmortale bevindingen werd de diagnose van HBS gesteld. Clostridium perfringens type A (bèta2 toxine negatief) werd geïsoleerd uit de intestinale inhoud van het laatst aangeboden dier. ABSTRACT The clinical, haematological and biochemical findings, treatment and outcome of six cattle with Haemorrhagic Bowel Syndrome (HBS) are reviewed. Five Holstein Friesian cows and one bull of the Belgian Blue breed, which were referred to the Faculty of Veterinary Medicine in Merelbeke, were examined. Anorexia, depressed demeanor, shock, abdominal discomfort, distended loops of small intestine and decreased or absent rumen and intestinal motility were common clinical findings in our study. The most important ultrasonographic finding was distention of the abomasum and dilatation of the small intestine. The prognosis for the affected animals was very unfavorable. Explorative laparotomy was carried out in five animals, four cases were euthanized, one animal died several days postoperatively, only one cow survived. Necropsy revealed a moderate to severe necro-haemorrhagic enteritis or jejunitis with intraluminal haemorrhage or blood clots. Based on the clinical, intraoperative and/or postmortem findings, the cows were diagnosed with HBS. Clostridium perfringens type A (beta2 toxin negative) was isolated from the intestinal content of the most recent case. Key words:
Alpha toxin - Cattle - Clostridium perfringens type A - Haemorrhagic Bowel Syndrome - Haemorrhagic enteritis
1
INLEIDING Haemorrhagic Bowel Syndrome (HBS) is een acuut en sporadisch optredende aandoening van het jejunum bij volwassen runderen, die zich klinisch manifesteert als ileus en vaak een fatale afloop kent (Berghaus et al., 2005). Synoniemen voor deze aandoening zijn Jejunal Haemorrhage Syndrome of Bloody Gut Syndrome (Ewoldt en Anderson, 2005; Peek et al., 2009). Het syndroom komt voornamelijk voor bij hoogproductief melkvee, hoewel ook al gevallen beschreven zijn bij vleesvee (Abutarbush et al., 2004; Abutarbush en Radostits, 2005). In Noord-Amerika werd HBS voor het eerst beschreven begin de jaren negentig en sindsdien zijn steeds meer publicaties verschenen (Dennison et al., 2002; Abutarbush et al., 2004; Abutarbush en Radostits, 2005; Ceci et al., 2006; Muskens et al., 2007; Peek et al., 2009; Braun et al., 2010a; Savic et al., 2012). De aandoening vertoont een grote gelijkenis met enterotoxaemie. Ze wordt gekarakteriseerd door een acute, progressieve segmentale necro-haemorrhagische enteritis van de dunne darmen met aantasting van de mucosa en vorming van grote intraluminale bloedklonters. Deze leiden tot een mechanische obstructie over een variërende lengte van het jejunum (Abutarbush en Radostits, 2005; Dennison et al., 2005). Hoewel het syndroom voornamelijk het jejunum aantast, worden de meest uitgesproken letsels gezien ter hoogte van de dunne darmen (Ceci et al., 2006). Klinisch wordt voornamelijk depressie en een ileusbeeld waargenomen, waarbij abdominale distentie, melena en koliek karakteristiek zijn (Dennison et al., 2002; Abutarbush en Radostits, 2005; Ceci et al., 2006). Het symptomenbeeld kan bestaan uit acute anorexie, lethargie, dehydratatie, shock, verminderde melkproductie en bloederige feces of melena, maar regelmatig worden dieren ook plots dood aangetroffen zonder voorafgaande ziektetekenen (Dennison et al., 2002; Abutarbush en Radostits, 2005). Medicamenteuze en chirurgische behandeling zijn vaak niet succesvol (Dennison et al., 2002; Abutarbush en Radostits, 2005). HBS kent een mortaliteit die varieert tussen de 85 en 100% (Kirkpatrick et al., 2001; Braun et al., 2010a). De exacte oorzaak van HBS is nog steeds niet gekend. Zowel Clostridium perfringens type A, Aspergillus fumigatus en voedingsfactoren worden vooropgesteld een mogelijke rol te spelen, doch deze werden nog niet bewezen (Kirkpatrick et al., 2001; Abutarbush et al., 2004; Elhanafy et al., 2013). Recentelijk werd een associatie aangetoond tussen HBS, mycotoxines en Shigatoxineproducerende Escherichia coli’s (ETEC’s) (Baines et al., 2011). Het lijkt er op dat een combinatie van meerdere factoren bijdraagt tot de pathogenese van dit syndroom (Kirkpatrick et al., 2001; Dennison et al., 2002). Dit werk handelt over zes runderen met HBS die aangeboden werden op de faculteit diergeneeskunde te Merelbeke. Het objectief van deze studie was om een overzicht te geven van de meest voorkomende klinische, haematologische en pathologische bevindingen die optreden bij dit syndroom. Na beschrijving van deze casuïstieken zal verder ingegaan worden op de etiologie, pathogenese, risicofactoren, klinisch beeld, labo- en echografische bevindingen, autopsie, histologie, diagnose, differentiaaldiagnose, behandeling, prognose en preventie van dit syndroom. Omdat de recentste casus aangeboden werd tijdens het verloop van deze studie, en er mogelijkheid was om stalen te verzamelen, werd een onderzoeksgedeelte ingesloten om meer inzicht te verwerven in de pathogenese van HBS.
2
CASUÏSTIEKEN 1. CASE REPORT 1 1.1. Anamnese Eind juli 2008 werd een Holstein Friesian koe (5 jaar, 10 maanden oud) aangeboden met acute depressie en decubitus. Het dier werd ‘s middags liggend op de weide teruggevonden. Daags ervoor gaf deze koe nog 45 liter melk. De koe kreeg 6 kg krachtvoer in de stal en 3,5 kg krachtvoer in Total Mixed Ration (TMR) toegediend. Het dier had 5 maanden geleden gekalfd. Het dier werd thuis door de dierenarts behandeld met cortisone (Solu-delta-cortef®, Zoetis, Madison, New Jersey) en glucose (Glucose 30% kela, Eurovet Animal Health B.V., Bladel, Nederland). Daar geen verbetering optrad, werd het dier doorgestuurd naar de faculteit. 1.2. Klinisch onderzoek Bij aankomst maakte de koe een suffe indruk. De body condition score bedroeg 2,5. Het dier zwalpte en kon moeilijk blijven rechtstaan. Het had hypothermie (33,4°C), tachycardie (100 slagen/min) en een verhoogde ademhalingsfrequentie (44/min). De lymfeknopen waren niet opgezet. De mond- en oogmucosae waren zeer bleek en de huidturgor was vertraagd. De extremiteiten voelden koud aan en de halsvene zette moeilijk op. Er waren noch borborygmen, noch pensgeluiden hoorbaar. Klotsgeluiden waren afwezig. De mest had een normaal uitzicht. Bij rectaal onderzoek was een grote pens voelbaar. Op echografie was een vergrootte lebmaag te zien en aan de rechterzijde waren multiple opgezette dunne darmen met een echogene inhoud zichtbaar. Dit beeld was suggestief voor de aanwezigheid van bloedklonters. Het bloedonderzoek wordt weergegeven in tabel 1. De haematocriet was sterk gedaald, hoogstwaarschijnlijk door de haemorrhagische enteritis. Het dier was ook sterk verzuurd (B.E. -13,5 meq/L). De metabole acidose wordt veroorzaakt door de vorming van lactaat als gevolg van necrose die zich afspeelt ter hoogte van de darm. De prognose voor dit dier werd slecht ingeschat. Tabel 1. Bloedonderzoek case report 1 Parameter
Referentiewaarden
HTC (%)
16
25-35
pH (meq/L)
7,088
7,35-7,45
PCO2 (mmHg)
56,9
35,0-45,0
PO2v (mmHg)
28,3
80-100 art
B.E. (meq/L)
-13,5
-5 tot +5
HCO3-
13
20-25
(mmol/L)
3
Na (mmol/L)
131
132-152
K (mmol/L)
3,7
3,5-4
Ionair Ca (mmol/L)
1,52
1,2-1,6
B.E.: Base Excess HCO3-: Bicarbonaat
1.3. Behandeling Daar de algemene toestand zo slecht was, werd het dier onmiddellijk aangeboden voor chirurgie. Tijdens deze exploratieve laparotomie werd overgegaan tot euthanasie wegens de aanwezigheid van een uitgebreide haemorrhagische enteritis. 1.4. Autopsie Ter hoogte van het mid-jejunum was een submucosaal haematoom aanwezig over een lengte van 20 cm en 4 cm breedte. De dunne darmen waren gedilateerd over een variabele lengte. De bovenliggende mucosa was multifocaal gescheurd en bedekt met grote bloedklonters (figuur 1a,b). Distaal hiervan waren de darmen gevuld met zowel gestold als ongestold bloed. De eindmest was nog normaal.
Figuur 1: Submucosaal haematoom ter hoogte van het mid-jejunum. De mucosae vertoonden multifocale scheuren en waren bedekt met grote bloedklonters (a,b). (Prof. Dr. K. Chiers, persoonlijke mededeling)
4
1.5. Histologie Histologie toonde de aanwezigheid van een submucosaal haematoom aan ter hoogte van het aangetaste darmsegment (mid-jejunum) (figuur 2a,b).
Figuur 2: Haematoxyline-eosine kleuring van een submucosaal haematoom ter hoogte van het mid-jejunum zowel globaal (a) als meer in detail (b) weergegeven.
5
2. CASE REPORT 2 2.1. Anamnese Een stier van het Belgisch Wit Blauwe ras (2 jaar, 1 maand en 4 dagen oud) werd begin augustus 2010 op de faculteit aangeboden. Het dier was sedert twee dagen wat stiller, at en dronk niet meer, maakte weinig mest en vertoonde melena. Het had net twee dagen op de weide gestaan en werd erna op stal gezet. Tien dagen voor het aanbieden werd het rund behandeld met doramectine (Dectomax®, Zoetis, Madison, New Jersey). De dierenarts had reeds twee dagen behandeld met amoxicillineclavulaanzuur (Noroclav®, Norbrook, Newry, Noord-Ierland). Het dier werd aangeboden met een vermoeden van een traumatische reticulo-peritonitis (TRP) of van een perforatieve lebmaagulcus. 2.2. Klinisch onderzoek Het dier stond opgetrokken en had een gedaalde lichaamstemperatuur (37,5°C), een normale polsfrequentie (72 slagen/min) en een normale ademhalingsfrequentie (32/min). De mond- en oogmucosae waren roze en de huidturgor was normaal. Urineren verliep vlot. De lendenreflex was negatief. De halsvene zette niet goed op en de capillaire vullingstijd bedroeg meer dan 2 seconden. Darmgeluiden waren afwezig. Bij rectaal onderzoek was zwarte, plakkerige mest te zien. De mest was gemengd met bloed en wat mucus. Op echografie waren enkele contractiele dunne darmen zichtbaar. Een aantal waren ook opgezet. In de rest van darmen was een vloeibare inhoud aanwezig. Het bloedonderzoek wordt weergegeven in tabel 2. De haematocriet was wat aan de hoge kant. Dit werd vermoedelijk veroorzaakt door dehydratatie. De B.E. was sterk verhoogd (B.E. 29,7 meq/L). Deze toestand van metabole alkalose wordt vaak gezien bij obstructieve processen die zich situeren in het proximale deel van de dunne darm. De functionele of mechanische obstructie, veroorzaakt door bloedklonters in de darm, geven aanleiding tot sekwestratie van lebmaagsecreties. Het bloed wordt daardoor meer alkalisch, met een uitwisseling tussen protonen en kalium tot gevolg. Hypokaliëmie wordt daarom gezien in combinatie met metabole alkalose. Verder was ook het calciumgehalte verlaagd. Deze hypocalcemie is allicht toe te schrijven aan een verminderde opname van calcium uit de darm door de aanwezige ileus. Deze zou mogelijks ook veroorzaakt kunnen worden door integratie van calcium in proteasen, geproduceerd tijdens de vermeerdering van C. perfringens type A. Tabel 2. Bloedonderzoek case report 2 Parameter
Referentiewaarden
HTC (%)
40
25-35
pH (meq/L)
7,580
7,35-7,45
PCO2 (mmHg)
62,3
35,0-45,0
PO2v (mmHg)
42,5
80-100 art
B.E. (meq/L)
29,7
-5 tot +5
HCO3- (mmol/L)
55,9
20-25
Na (mmol/L)
137
132-152
6
K (mmol/L)
2,3
3,5-4
Ionair Ca (mmol/L)
0,69
1,2-1,6
2.3. Behandeling Omdat de algemene toestand van hier dier dermate slecht was, werd besloten om een exploratieve laparotomie uit te voeren. Bloedklonters waren aanwezig in het proximale deel van de dunne darm, en dit over een lengte van 75 tot 100 cm. Deze konden doorgemasseerd worden. Een resectie was technisch onmogelijk omdat de kwaliteit van het dunne darm segment onvoldoende was. Het dier werd enkele dagen nabehandeld met penicilline (Duphapen®, Zoetis, Madison, New Jersey), erythromycine (Erythrocine 200®, CEVA Santé animale, Libourne, Frankrijk), flunixine meglumine (Emdofluxin 50®, Emdoka BVBA, Hoogstraten, België) en ketoprofen (Ketofen®, Merial B.V., Velserbroek, Nederland), aangevuld met intraveneuze vochttherapie met glucose (Glucose 30% kela, Eurovet Animal Health B.V., Bladel, Nederland). Er trad echter geen beterschap op en het dier werd vervolgens geëuthanaseerd. 2.4. Autopsie Op autopsie werd een haemorrhagische (entero) colitis en een fibrineuze peritonitis vastgesteld. Verder zijn geen gedetailleerde gegevens over deze lijkschouwing bekend. Over de betrokkenheid van het jejunum kunnen we hier dus geen uitspraak doen.
7
3. CASE REPORT 3 3.1. Anamnese Begin augustus 2011 werd een Holstein Friesian koe (2 jaar, 10 maanden en 2 dagen oud) aangeboden met de klacht dat het dier niet meer wilde eten. Het dier had twee dagen geleden gekalfd met een beetje hulp en de secundinae waren vlot afgekomen. Bij de eerste melking gaf deze koe 8 tot 9 liter melk. Er werd reeds drie dagen behandeld met ceftiofur (Excenel®, Zoetis, Madison, New Jersey) en die ochtend met dexamethasone (Rapidexon®, Eurovet Animal Health B.V., Bladel, Nederland). 3.2. Klinisch onderzoek Het dier vertoonde een algemeen suffe indruk en stond er ongemakkelijk bij. Het rund had een vette conditie. Het had een licht verhoogde lichaamstemperatuur (39,1°C), een zeer hoge polsfrequentie (124 slagen/min) en een normale ademhalingsfrequentie (80/min). De mucosae waren gestuwd. De huidturgor was nog normaal. Het dier kreunde continu. Op echografie werd vocht in het pericard vermoed, het hart zelf was normaal. Aan de linker zijde was buikvocht of fibrine aanwezig in de ruimte tussen de pens en buikwand. Tevens werd een verdachte zone rond netmaag waargenomen. Op het bloedonderzoek, die weergegeven wordt in tabel 3, is een milde dehydratatie en metabole alkalose te zien. Tabel 3. Bloedonderzoek case report 3 Parameter
Referentiewaarden
HTC (%)
36
25-35
pH (meq/L)
7,509
7,35-7,45
PCO2 (mmHg)
37,8
35,0-45,0
PO2v (mmHg)
38,8
80-100 art
B.E. (meq/L)
6,2
-5 tot +5
HCO3- (mmol/L)
55,9
20-25
3.3. Behandeling Het dier werd geëuthanaseerd. 3.4. Autopsie De conchae waren gestuwd, spumeus vocht was aanwezig in de trachea en enkele submucosale puntbloedingen waren zichtbaar. De longen waren algemeen oedemateus en vertoonden multifocale subpleurale bloedingen. Dit is een typisch beeld dat gezien wordt na agonie. De lever had een algemeen bleek aspect en was vergroot. Wat op echografie aanzien werd als vocht en fibrine rond de netmaag en pericard, bleken vetmassa’s met een afwijkende consistentie te zijn. De darmen waren
8
algemeen gestuwd en vertoonden serosale vaatinjecties. Een deel van het jejunum bevatte een haemorrhagische inhoud. Een haematoom was aanwezig tussen de bladen van het mesocolon. Samengevat vertoonde het dier een haemorrhagische enteritis, longoedeem en een lichte ketonemie. 3.5. Histologie Een histologisch onderzoek werd uitgevoerd. Door de postmortale autolyse was de beoordeling van deze preparaten sterk bemoeilijkt. Ter hoogte van de darm waren kolonies staafvormige bacillen aanwezig in de darmmucosa (figuur 3a,b). In de submucosa van de darm was er diffuus een eosinofielen infiltratie zichtbaar. Clostridium enterotoxaemie werd gesteld als diagnose.
Figuur 3: Haematoxyline-eosine kleuring van de darm. In de darmmucosa waren basofiele kolonies van staafvormige bacillen aanwezig met een morfologische gelijkenis met C. perfringens (a,b).
3.6. Bacteriologie Er werd een swab genomen ter hoogte van het jejunum. Grote hoeveelheden Clostridium perfringens konden aangetoond worden.
9
4. CASE REPORT 4 4.1. Anamnese Begin mei 2012 werd een Holstein Friesian vaars (1 jaar, 6 maanden en 20 dagen oud) aangeboden die niet meer wilde eten. Er was geen koorts aanwezig. Het dier had wel wat diarree. Aan de rechterzijde waren pinggeluiden hoorbaar. De algemene toestand was normaal. 4.2. Klinisch onderzoek Bij aankomst maakte het dier een alerte indruk. Het had een licht verhoogde lichaamstemperatuur (39,1°C), een verhoogde polsfrequentie (96 slagen/min) en een normale ademhalingsfrequentie (16/min). De oog- en mondmucosae waren roze en de huidturgor was vertraagd. De penswerking was verminderd. De lenden- en schoftreflex waren positief. Het dier had slijmerige mest. Op echografie was een vergrootte lebmaag, wat vrij buikvocht en een stuk darm met een waterige inhoud tussen lever en buikwand te zien. De rest van de dunnen darmen was matig contractiel en hadden een verdikte wand. Het bloedonderzoek wordt weergegeven in tabel 4. De haematocriet was sterk gestegen, wat samengaat met dehydratatie. Verder was een duidelijke metabole alkalose aanwezig (B.E. 24,2 meq/L). Biochemisch bloedonderzoek reveleerde een hyponatriëmie, hypokaliëmie en hypocalcemie. De hypokaliëmie en hypocalcemie werd eerder al verklaard. De hyponatriëmie kan mogelijks een gevolg zijn van een slechte nierfunctie. Tabel 4. Bloedonderzoek case report 4 Parameter
Referentiewaarden
HTC (%)
44
25-35
pH (meq/L)
7,56
7,35-7,45
PCO2 (mmHg)
57,7
35,0-45,0
PO2v (mmHg)
32,7
80-100 art
B.E. (meq/L)
24,2
-5 tot +5
HCO3- (mmol/L)
50,6
20-25
Na (mmol/L)
126
132-152
K (mmol/L)
2,79
3,5-4
Ionair Ca (mmol/L)
0,91
1,2-1,6
4.3. Parasitologie Een meststaal werd ingestuurd voor parasitologisch onderzoek. Dit reveleerde de aanwezigheid van 600 oöcysten per gram feces (OPG), maar het ging om niet pathogene Eimeria species.
10
4.4. Behandeling Er werd een exploratieve laparotomie uitgevoerd. Een deel van de dunne darmen, vooral het ileum, was sterk opgezet. Bij het openen van de darm was duidelijk een erge haemorrhagische enteritis en een ileïtis van onbekende oorsprong aanwezig. De buik werd gespoeld en intraperitoneaal werd penicilline-neomycine (Neopen®, Intervet Nederland B.V., Boxmeer, Nederland) toegediend. Postoperatief werd behandeld met penicilline-neomycine (Neopen®, Intervet Nederland B.V., Boxmeer, Nederland), flunixine meglumine (Emdofluxin 50®, Emdoka BVBA, Hoogstraten, België) als pijnstiller en ontstekingsremmer, en erythromycine (Erythrocine 200®, CEVA Santé animale, Libourne, Frankrijk) als prokineticum; dit aangevuld met intraveneuze vochttherapie met glucose (Glucose 30% kela, Eurovet Animal Health B.V., Bladel, Nederland). Na twee dagen begon het dier terug normale mest te maken en te herkauwen. Het dier keerde in een goede gezondheidstoestand terug naar het bedrijf.
11
5. CASE REPORT 5 5.1. Anamnese Begin september 2013 werd een Holstein Friesian koe (4 jaar, 2 maanden en 21 dagen oud) binnengebracht op de faculteit. Het dier bevond zich 90 dagen in lactatie en gaf bijna 40 liter melk per dag. Ze kreeg 4 tot 5 kg krachtvoeder toegediend. Overdag stond het dier op de weide en ’s nachts op stal. Het dier was plots uit de melk gevallen en had geen eetlust meer. De plaatselijke dierenarts had reeds behandeld met dexamethasone (Rapidexon®, Eurovet, Madison, New Jersey) en butafosfancyanocobalamine (Catosal®, Bayer B.V., Mijdrecht, Nederland). De volgende dag werd melena opgemerkt. De koe vertoonde een versnelde ademhaling. Koorts en pinggeluiden waren afwezig. Er werd een magneet opgeschoten en een buikinfuus gegeven met dexamethasone (Rapidexon®, Eurovet Animal Health B.V., Bladel, Nederland), aminophylline en ammonium chloride (Pentallin®, Swiss Pharma, Zürich, Zwitserland) spectinomycine en lincomycine (Linco-spectin®, Zoetis, Madison, New Jersey). Tevens werd vitamine K (Konakion®, Roche Nederland B.V., Woerden, Nederland) en tolfenamzuur (Tolfine® 4%, Vétoquinol, Aartselaar, België) toegediend. De derde dag had het dier nog steeds geen eetlust. De koe werd doorgestuurd naar de faculteit met vermoeden van een darmbloeding ten gevolge van een invaginatie. 5.2. Klinisch onderzoek De koe had een normale lichaamstemperatuur (38,3°C), een normale polsfrequentie (66 slagen/min) en een normale ademhalingsfrequentie (30/min). De oog- en mondmucosae waren bleek. De huidturgor was verminderd en het dier had diepliggende ogen. De extremiteiten voelden koud aan. De buikspanning was verhoogd. Er waren geen pens, noch darmgeluiden hoorbaar. Op rectaal onderzoek waren opgezette dunne darmen voelbaar. De pens lag niet ver caudaal. Op echografie waren opgezette dunne darmen te zien met een vloeibare inhoud. De darmen zelf vertoonden weinig contractiliteit. Tabel 5 toont de resultaten van het bloedonderzoek. De koe was klinisch uitgedroogd en toch had ze een lage haematocriet. Deze bevinding is te verklaren door bloedverlies via een haemorrhagische enteritis. Verder toonde dit bloedonderzoek aan dat het dier zich in een metabole alkalose bevond die gepaard ging met een hyponatriëmie, hypokaliëmie, hypocalcemie en hypochloremie. Tabel 5. Bloedonderzoek case report 5 Referentiewaarden
Parameter HTC (%)
23
25-35
pH (meq/L)
7,530
7,35-7,45
PCO2 (mmHg)
50,0
35,0-45,0
PO2v (mmHg)
24,8
80-100 art
B.E. (meq/L)
16,5
-5 tot +5
HCO3- (mmol/L)
40,8
20-25
12
Na (mmol/L)
131,8
132-152
K (mmol/L)
2,44
3,5-4
Ionair Ca (mmol/L)
0,90
1,2-1,6
Cl (mmol/L)
71
90-110
5.3. Behandeling Er werd een exploratieve laparotomie uitgevoerd. Een groot stuk van het jejunum was erg bloederig en sterk opgezet, met een harde inhoud. De kwaliteit van de darm was dermate slecht dat geen resectie kon uitgevoerd worden. Er werd beslist het dier te euthanaseren. 5.4. Autopsie Autopsie reveleerde een uitgesproken necro-haemorrhagische enteritis (figuur 4a-f). De dunne darmen waren diffuus gedilateerd en het aangetaste darmsegment vertoonde een donkerrode tot paarse kleur over een lengte van 80 cm (figuur 4c). De serosale zijden vertoonden multipele bloedingen (figuur 4a,b). Het jejunum was over een grote lengte gevuld met zowel gestold als ongestold bloed (figuur 4d-f). Ook in het ileum en caecum was een haemorrhagische inhoud met bloedstolsels aanwezig. De dunne darmen waren diffuus gedilateerd. Verder waren ter hoogte van de serosale zijde van het aangetaste segment kleine fibrinestrengen zichtbaar (figuur 4a).
13
Figuur 4: Macroscopische bevindingen na autopsie. Er was een uitgesproken necro-haemorrhagische enteritis (af) aanwezig over een lengte van 80 cm (c). Het jejunum was gevuld met zowel gestold als ongestold bloed (d-f). Het aangetaste darmsegment vertoonde serosale bloedingen (a,b) en op de serosale zijde was eveneens een fibrine beleg te zien (a).
14
6. CASE REPORT 6 6.1. Anamnese Eind januari 2014 werd een Holstein Friesian koe (2 jaar, 2 maanden en 20 dagen oud) met spoed binnengebracht op de faculteit. De koe was die ochtend plots uit de melk gevallen. Het dier was hypothermisch en vertoonde abdominale distentie. Het had in november afgekalfd met behulp van een keizersnede. Het dier werd door de behandelende dierenarts onmiddellijk doorgestuurd. 6.2. Klinisch onderzoek Bij aankomst maakte het dier een suffe indruk en vertoonde het een wankelende, atactische gang. Het had een normale lichaamstemperatuur (38,3°C), een iets verlaagde polsfrequentie (56 slagen/min) en een normale ademhalingsfrequentie (20/min). Het dier had een goede conditie. De mucosae waren sterk gestuwd. De huidturgor was vertraagd en de extremiteiten voelden koud aan. De halsvene zette goed op en de capillaire vullingstijd was normaal. Op longauscultatie werden geen afwijkingen vastgesteld. Ter hoogte van de rechter flank waren hoogtonige geluiden hoorbaar. Pensbewegingen, klotsgeluiden en borborygmen waren afwezig. Op rectaal onderzoek waren een ingedroogde pens en enkele opgezette dunne darmen voelbaar. De mest was normaal. Echografie reveleerde een grote lebmaag in de mediaanlijn, die zowel links als rechts tot ver caudaal in de flank reikte. Naast de aanwezigheid van normale, niet opgezette contractiele dunne darmen, konden enkele niet contractiele, sterk opgezette dunne darmen gezien worden. Verder was vrij buikvocht aanwezig. De resultaten van het bloedonderzoek worden weergegeven in tabel 6. De voornaamste bevindingen waren: gestegen haematocriet, hypochloremische metabole alkalose, hypokaliëmie, hyponatriëmie, hypocalcemie en een hyperglycemie. Hyperglycemie is een veel voorkomende bevinding bij koeien met HBS. Dit is hoogstwaarschijnlijk het gevolg van een stress-afhankelijke respons waarbij adrenaline wordt vrijgesteld. Tabel 6. Bloedonderzoek case report 6 Referentiewaarden
Parameter HTC (%)
40
25-35
pH (meq/L)
7,563
7,35-7,45
PCO2 (mmHg)
40,0
35,0-45,0
PO2v (mmHg)
123,5
80-100 art
B.E. (meq/L)
12,0
-5 tot +5
HCO3- (mmol/L)
35,3
20-25
Na (mmol/L)
127,2
132-152
K (mmol/L)
2,50
3,5-4
Ionair Ca (mmol/L)
0,51
1,2-1,6
Cl (mmol/L)
↓↓ (onmeetbaar)
90-110
Glucose (mg/dl)
353
40-60
15
6.3. Behandeling Er werd onmiddellijk beslist om een exploratieve laparotomie uit te voeren. Om te verzekeren dat het dier gedurende de chirurgische interventie bleef rechtstaan, werd eerst het calciumgehalte genormaliseerd door het toedienen van een calciuminfuus (Calcii borogluconas®, Eurovet N.V. Heusden-Zolder, België). Hierdoor steeg het calcium- en chloorgehalte naar respectievelijk 2,23 en 65 mmol/L. Exploratieve laparotomie reveleerde een sterk opgezet en haemorrhagisch proximaal jejunum en duodenum (figuur 5a) met grote intraluminale bloedklonters (figuur 5c,d). Verder werden voornamelijk lege darmen en een sterk vergrootte lebmaag waargenomen. De darmwanden waren daarenboven sterk verdikt. Na verdoving van het mesenterium (figuur 5b) met procaïne zonder adrenaline (Procaïne hydrochloride 4%, V.M.D. N.V., Arendonk, België) werd een zo groot mogelijk stuk gereseceerd van het haemorrhagische jejunum (figuur 5c). Het gereseceerde darmsegment was volledig geobstrueerd door intraluminale bloedklonters (figuur 5d). Het was technisch onmogelijk het ganse darmsegment te verwijderen. Intra-abdominaal werd penicilline (Peni-kel®, Kela laboratoria N.V., Hoogstraten, België) toegediend.
Figuur 5: Exploratieve laparotomie van een Holstein Friesian koe (2 jaar, 2 maanden en 2 dagen) met HBS. Na opening van het abdomen werd een sterk opgezet en haemorrhagisch proximaal jejunum en duodenum waargenomen (a). Het mesenterium werd verdoofd (b) en vervolgens werd het haemorrhagisch darmsegment gereseceerd (c). Het aangetaste darmsegment was volledig geobstrueerd door intraluminale bloedklonters (d).
16
Postoperatief werd het dier behandeld met penicilline-neomycine (Neopen®, Intervet Nederland B.V., Boxmeer, Nederland), penicilline (Duphapen®, Zoetis, Madison, New Jersey), flunixine meglumine (Emdofluxin 50®, Emdoka BVBA, Hoogstraten, België), erythromycine (Erythrocine 200®, CEVA Santé animale, Libourne, Frankrijk) en intraveneuze vochttherapie met glucose (Glucose 30% kela, Eurovet Animal Health B.V., Bladel, Nederland) en lidocaïne (Lidocaïne HCl 2% in 0,9% NaCl, magistrale bereiding) (figuur 6a). Er kwam wat bloederige mest en bloed af (figuur 6b). Daags na de chirurgische interventie werd het dier ook gedrencht. Dit gebeurde slechts één maal, daar het dier de volgende dag kreunend werd teruggevonden met een sterk opgezet abdomen. De volgende ochtend werd de koe dood aangetroffen.
Figuur 6: Postoperatief beeld na exploratieve laparotomie. Het dier werd behandeld met intraveneuze vochttherapie (a). Na de chirurgische interventie kwam wat bloederige mest af (b).
6.4. Autopsie Postmortaal onderzoek werd uitgevoerd, dit met een post-mortem interval van twee dagen. Ter hoogte van het hart waren petechiën, ecchymosen en multifocaal bleke zones op te merken. De conchae, larynx en trachea waren gestuwd, en deze laatsten hadden bijkomend een haemorrhagisch uitzicht. De longen waren oedemateus en gestuwd. De typische kenmerken van een shocklong waren aanwezig. De lever was bleek, vertoonde afgeronde randen en ter hoogte van het kapsel waren fibrineafzettingen te zien. De bleke lever kan verklaard worden door de toxemie. De milt was klein, gecontraheerd en vertoonde fibrineafzettingen op het kapsel. Ter hoogte van de staart was melena zichtbaar. Het volledige magencomplex, de lebmaag in het bijzonder, was sterk gedilateerd. De darmen waren diffuus gedilateerd en segmenteel cyanotisch. Verder was een afzetting van fibrine zichtbaar aan de serosale zijde van de darmen en ter hoogte van het mesenterium. Deze laatste vertoonde multipele bloedingen aan de ophangband met veel oedeem. De mesenteriale lymfeknopen waren opgezet. Het jejunum was over een grote afstand erg bloederig en cyanotisch, met veel afzetting van fibrine op de serosa. Ter hoogte van de resectieplaats van het jejunum waren meerdere hechtingen aanwezig die een goede wondappositie vertoonden. Toch was er een kleine lekkage van bloed zichtbaar. De dunne darmen waren oedemateus en vertoonden intraluminaal een bloederige inhoud. Er was een duidelijke demarcatie zichtbaar tussen het
17
aangetaste en niet aangetaste darmsegment (figuur 7a,b). Het peritoneum bevatte ongeveer 60 liter buikvocht die een vezelige maagdarminhoud bevatte. Tevens waren er veel fibrine afzettingen en adhesies te zien. De uitgesproken peritonitis kan verklaard worden door de darmruptuur. De exacte plaats van die ruptuur kon niet meer achterhaald worden, daar het moeilijk was om premortale scheuren
van
postmortale
te
onderscheiden.
De
vermoedelijke
scheur
vertoonde
geen
haemorrhagische rand, wat je zou verwachten bij een premortale scheur. Het dier vertoonde een algemeen shockbeeld.
Figuur 7: Demarcatie tussen het aangetaste en niet aangetaste darmsegment (a,b).
6.5. Histologisch onderzoek Ter hoogte van de lamina propria was een lymfoplasmocytair infiltraat aanwezig (figuur 8a,b) en enkele met haemosiderine beladen macrofagen (figuur 8b) konden opgemerkt worden. De darmvilli waren verkort en de centrale lymfevaten gedilateerd (figuur 8c). Dit is een beeld van een chronisch lymfoplasmocytaire enteritis met atrofie van de villi. Waarschijnlijk was dit de uitlokkende factor voor de explosieve vermeerdering van C. perfringens met productie van grote hoeveelheden toxines. In de lamina propria waren ook bloedingen en neutrofielen aanwezig, wat eerder wijst op een acuut proces (figuur 8d,e). Multifocaal waren necrotische villustoppen te zien (figuur 8d,e). In de lamina propria waren bloedingen zichtbaar (figuur 8b,d,e). Opvallend was de aanwezigheid van uitgesproken intraluminale en submucosale bloedingen (figuur 8d,f).
18
Figuur 8: Haematoxyline-eosinekleuring van het jejunum. Globaal overzicht (a) van de chronische lymfoplasmocytair enteritis: lymfoplasmocytair infiltraat in de lamina propria. Detail (b) van het lymfoplasmocytair infiltraat met enkele met haemosiderine beladen macrofagen (pijl) in de lamina propria. Gedilateerde lymfevaten (c). Necrose van de villustoppen en bloedingen in de lamina propria met massieve intraluminale bloedingen (d,e). Detail van een necrotische villustop en bloedingen in de lamina propria (e). Submucosale bloeding (f).
19
LITERATUURSTUDIE 1. ETIOLOGIE EN PATHOGENESE 1.1. Clostridium perfringens Ondanks de beschrijving van de klinische en pathologische bevindingen, is nog weinig gekend over de etiologie, de pathogenese en de rol van predisponerende factoren in het ontstaan van HBS (Ceci et al., 2006). Verschillende studies suggereren dat Clostridium perfringens type A, of type A met bèta2 gen, een belangrijke rol speelt in de pathogenese van dit syndroom (Dennison et al., 2002; Abutarbush et al., 2004; Abutarbush en Radostits, 2005; Dennison et al., 2005; Ceci et al., 2006; Savic et al., 2012). Clostridium perfringens is een anaerobe, Gram-positieve sporenvormende bacterie, dat ubiquitair voorkomt in de
Tabel 7. Clostridium perfringens toxinotypes Type
α
omgeving en deel uitmaakt van de normale intestinale flora
A
X
bij zoogdieren (Denisson et al., 2005). Onder invloed van
B
X
X
verschillende predisponerende factoren kan deze kiem
C
X
X
exponentieel vermeerderen en ziekte veroorzaken (Ceci et
D
X
al., 2006). De pathogeniciteit van deze bacterie is
E
X
gerelateerd aan de grote hoeveelheiden toxines die
β
ε
ɩ
Enterotoxine
β2
(x)
(x)
X
(x) (x)
X
(x) X
(x)
(x)
X klassiek (x) potentieel
geproduceerd worden tijdens de exponentiële groeifase (Ceci et al., 2006). Classificatie van C. perfringens stammen in toxinotypes (A tot E) is gebaseerd op de productie van vier major letale toxines (alpha, bèta, iota en epsilon). Naast deze major letale toxines kunnen ook andere toxines gesecreteerd worden zoals het enterotoxine en bèta2 toxine (Niilo, 1980; Lebrun et al., 2010) (tabel 7). Er zijn twee hypotheses die veronderstellen dat HBS wordt veroorzaakt door Clostridium spp. Een eerste hypothese suggereert dat de pathogenese van HBS zou overeenstemmen met deze van haemorrhagische enteritis (enterotoxaemie) bij snel groeiende zuigende kalveren veroorzaakt door C. perfringens. Onder condities waarbij een grote beschikbaarheid is aan proteïnen en snel fermenteerbare koolhydraten kan deze kiem zeer snel vermeerderen en toxines produceren. Dit scenario zou kunnen optreden bij volwassen melkkoeien in associatie met risicofactoren gelijkaardig aan deze die aanleiding geven tot pensacidose, namelijk wanneer grote hoeveelheden snel fermenteerbare koolhydraten en een beperkte hoeveelheid vezels in het voeder aanwezig zijn (Abutarbush en Radostits, 2005). Enterotoxaemie en HBS hebben volgende karakteristieken gemeenschappelijk: intensieve voederstrategieën, acuut verloop van de ziekte, haemorrhagische enteritis (jejunitis), isolatie van grote hoeveelheden C. perfringens uit de dunne darmen, identieke C. perfringens toxinotypes (hoofdzakelijk type A) en de stressvolle omstandigheden waarin de dieren gehouden worden (Lebrun et al., 2010). Een tweede hypothese gaat uit van een slechte fermentatie van kuilvoeder, wat zorgt voor accumulatie van schimmels, bacteriën en toxines, welke opgenomen worden door de dieren (Abutarbush en Radostits, 2005).
20
Clostridium perfringens type A (alpha toxine of alpha toxine met bèta2 toxine) werd reeds frequent geïsoleerd uit laesies, meststalen en intestinale inhoud van klinische gevallen van volwassen melk- en vleesvee, en recentelijk ook uit laesies bij vier Simmental kalveren van negen maanden oud (Dennison et al., 2002; Abutarbush et al., 2004; Abutarbush en Radostits, 2005; Dennison et al., 2005; Ceci et al., 2006; Savic et al., 2012). Een overzicht van deze publicaties wordt weergegeven in tabel 8. Een studie toonde aan dat een significant grotere hoeveelheid C. perfringens type A, in het bijzonder het alpha toxine (of alpha toxine in combinatie met het bèta2 toxine), kon geïsoleerd worden uit multipele plaatsen van het gastro-intestinaal stelsel van koeien met HBS in vergelijking met kuddegenoten met een lebmaagverplaatsing naar links. Daarenboven werd intraluminale productie van toxines vastgesteld op meerdere plaatsen in het gastro-intestinaal stelsel bij koeien met HBS, maar niet bij controledieren van dezelfde kudde met een lebmaagverplaatsing naar links (Dennison et al., 2005). Hoewel de bevindingen van deze klinische studies sterk doen vermoeden dat C. perfringens type A een bijzondere rol speelt in de pathogenese, kon het syndroom nog niet gereproduceerd worden. Experimentele inoculatie van C. perfringens type A, geïsoleerd uit klinische gevallen, in het proximale jejunum van 12 volwassen niet-lacterende melkkoeien, leidde niet tot klinische symptomen (Ivany et al., 2005). Zoals reeds eerder vermeld, maakt C. perfringens (vooral type A), deel uit de normale intestinale flora bij gezonde dieren (Songer, 1999; Niilo, 1980; Lebrun et al., 2010). Echter, wanneer de omstandigheden in de darm gewijzigd worden door bijvoorbeeld snelle voedingsveranderingen en/of stress, kan deze bacterie explosief vermeerderen en grote hoeveelheden toxines produceren. Aangezien dit na de dood ook het geval is, is een juiste interpretatie bij het isoleren van C. perfringens uit de darm bij postmortaal onderzoek moeilijk. Vermoedelijk maakt de premortale enterische proliferatie van C. perfringens type A, die gepaard gaat met intraluminale toxineproductie, deel uit van een multifactorieel proces dat optreedt secundair aan andere uitlokkende factoren (Elhanafy et al., 2013).
Tabel 8: Casusmeldingen van Haemorrhagic Bowel Syndroom sinds 2002
Jaar 2002
Auteurs Dennison et al.
Toxinotype A
2004
Abutarbush et al.
2005
2006 2012
β2* Ja
Dieren Melkvee
Land V.S.
A
Vleesvee
Canada
Abutarbush en Radostits Dennison et al.
A
Melk- en vleesvee
Canada
A
Ja
Melkvee
V.S.
Ceci et al. Savic et al.
A A
Ja Ja
Melkvee Kalveren van 9 maanden
Italië Servië
* In sommige studies werden β2-positieve stammen geïsoleerd
21
Alle stammen van C. perfringens, dus ook C. perfringens type A, bevatten het gen dat codeert voor de productie van alpha toxine. Het C. perfringens type A alpha toxine is een zink-bevattend metalloproteïne met een fosfolipase C activiteit. Clostridium perfringens type A kan alpha toxines produceren wanneer deze groeit in een medium dat zink bevat. In een medium met calcium produceert C. perfringens type A op z’n minst drie proteasen. Enkel in een zink-bevattend medium is het alpha toxine grotendeels resistent tegen deze proteasen. Biobeschikbaarheid van zink in de darmtractus, in het bijzonder in de dunne darm, ondersteunt de vermeerdering van C. perfringens type A en zorgt daarenboven voor de stabiliteit en destructieve eigenschappen van het alpha toxine. Deze hypothese zou duidelijkheid kunnen scheppen in de nog ongekende pathogenese van HBS. Het alpha toxine leidt tot splitsing van celmembraanfosfolipiden en van fosfatidylcholine en sphingomyeline. Wanneer dit toxine inwerkt op cellen, wordt een cascade in gang gezet met vorming van arachidonzuur, die op zijn beurt aanleiding geeft tot productie van thromboxanen, leukotriënen en prostaglandines. Vermoedelijk initieert deze cascade een lokale inflammatoire reactie die de integriteit van de intestinale microvasculatuur verstoort, wat resulteert in een uitgesproken bloeding in het intestinale lumen. Door aantasting van de integriteit ter hoogte van de dunne darmwand kunnen lipopolysachariden van Gram-negatieve bacteriën en het alpha toxine de bloedbaan bereiken, wat aanleiding geeft tot toxaemie. Dit hele proces wordt verder in de hand gewerkt door de functionele en mechanische obstructie ter hoogte van de dunne darm (Elhanafy et al., 2013). 1.2. Aspergillus fumigatus Andere auteurs spreken eerder over een associatie tussen HBS en een infectie met Aspergillus fumigatus (Forsberg, 2003; Sockett, 2004). Aspergillus fumigatus is een ubiquitair voorkomende schimmel en kan in grote hoeveelheden aanwezig zijn in beschimmeld kuilvoeder. De veronderstelling dat deze schimmel zou tussenkomen in de pathogenese van HBS is gebaseerd op 2 theorieën. Het beeld dat gezien wordt bij koeien met HBS stemt overeen met deze bij immunosuppressieve mensen met een haemorrhagische darmaandoening veroorzaakt door A. fumigatus (Forsberg et al., 2003). Een andere studie in 2004 onderzocht de rol van deze schimmel bij 25 koeien die gestorven waren aan variabele gastro-intestinale aandoeningen, waaronder HBS. DNA van A. fumigatus werd enkel teruggevonden in intestinale inhoud en bloedstalen van koeien met HBS, maar niet in stalen van koeien zonder HBS (Sockett, 2004). Verder onderzoek is nodig om uit te maken of deze schimmel tussenkomt als primaire oorzaak, of eerder secundair door de inwerking van schimmeltoxines op het immuunsysteem van de dieren (Elhanafy et al., 2013). 1.3. Shigatoxine-producerende Escherichia coli’s (STEC’s) Naast de vele veronderstellingen dat C. perfringens type A en A. fumigatus zouden tussenkomen in de pathogenese van HBS, werd meer recentelijk onderzoek verricht naar de rol van mycotoxines en STEC’s. Een studie bij aangetaste melkkoeien toonde aan dat mycotoxines en STEC’s bijdragen in het ziektecomplex. Deze rol werd nadien ook bevestigd bij vleesvee (Baines et al., 2011).
22
2. RISICOFACTOREN Hoewel HBS voornamelijk voorkomt bij melkvee, zijn ook al gevallen beschreven bij vleesvee (Abutarbush et al., 2004; Abutarbush en Radostits, 2005). Peek et al. (2009) toonden aan dat HBS met een significant hogere frequentie voorkomt bij Brown Swiss in vergelijking met andere rassen. Meerdere risicofactoren worden geassocieerd met het voorkomen van HBS bij melkkoeien. Een hogere prevalentie wordt waargenomen in de herfst en winter en HBS komt het meest frequent voor bij oudere melkkoeien die zich in de tweede of een hogere lactatie bevinden (Berghaus et al., 2005; Godden et al., 2001). De aandoening wordt het vaakst gezien op grote melkveebedrijven (≥100 dieren), en dan vooral op bedrijven die Total Mixed Ration (TMR) voederen. Het productieniveau van de koeien blijkt een zeer belangrijke factor te zijn. De gemiddelde melkproductie per koe is gedurende de laatste twee decennia spectaculair gestegen. Meer gevallen van HBS worden beschreven naarmate de gemiddelde melkproducties op melkveebedrijven toenemen, en dit vooral in vroege lactatie, wanneer hoog-energetische en eiwitrijke rantsoenen toegediend worden met een lage structuurwaarde. Het gebruik van dergelijke rantsoenen die nodig zijn om hoge melkproducties te realiseren, blijkt net een risicofactor te zijn voor het ontstaan van HBS (Godden et al., 2001; Berghaus et al., 2005; Ceci et al., 2006; Elhanafy et al., 2013). Een aantal van deze risicofactoren vereisen naar de toekomst toe verder onderzoek, omdat sommige associaties de resultante kunnen zijn van artefacten. De associatie tussen bedrijfsgrootte en het voorkomen van HBS zou bijvoorbeeld kunnen voortvloeien uit de grotere waarschijnlijkheid dat autopsie zal uitgevoerd worden wanneer een dier plots sterft, of gewoon door het groter aantal dieren die at risk zijn op grote melkveebedrijven (Godden et al., 2001; Berghaus et al., 2005). 3. KLINISCH BEELD De klinische symptomen bij aangetaste dieren treden zeer acuut op en zijn snel progressief, waardoor dieren vaak dood aangetroffen worden zonder voorafgaande ziektesymptomen (Elhanafy et al., 2013). Soms is het verloop iets langzamer en treedt sterfte na enkele dagen op. Mogelijk wordt de darmwand hier geleidelijk aangetast waardoor darminhoud en bacteriën lekken naar de buikholte, met peritonitis tot gevolg (Muskens et al., 2007). De symptomen zijn verklaarbaar door het gecombineerd effect van pathologische veranderingen ter hoogte van de darm, waarbij massieve bloedingen en een uitgesproken toxaemie optreden. Aangetaste dieren kunnen zich presenteren met de volgende klinische bevindingen: acute anorexie, decubitus, depressie, verminderde melkproductie, dehydratatie, bleke mucosae, koude extremiteiten, shock, abdominale distentie, abdominale pijn, verminderde mestproductie en mest met vers bloed, bloedklonters of melena (Dennison et al., 2002; Elhanafy et al., 2013). Vaak zijn pinggeluiden hoorbaar aan de rechterzijde, en dit voornamelijk in de hongergroeve (Dennison et al., 2002). De temperatuur varieert van normaal, verlaagd tot licht verhoogd (Abutarbush en Radostits, 2005; Radostits et al., 2007). Hypothermie kan te wijten zijn aan dehydratatie, hypovolemie en haemorrhagische anemie. De hartfrequentie is normaal tot verhoogd. Deze verhoging kan optreden door pijn, dehydratatie, bloeding en anemie. De ademhalingsfrequentie kan normaal, verhoogd of verlaagd zijn. Een verlaagde ademhalingsfrequentie kan mogelijks voortvloeien uit de hypothermie en dehydratatie (Abutarbush en Radostits, 2005). In vergevorderde gevallen kan
23
intestinale necrose optreden met peritonitis en finaal toxische shock en sterfte tot gevolg (Elhanafy et al., 2013). Bij rectaal onderzoek kunnen opgezette dunne darmen, een grote pens en een gedilateerd colon gevoeld worden. Niettegenstaande opgezette dunne darmen bijna steeds aanwezig zijn, worden ze bij rectaal onderzoek vaak niet opgemerkt door uitzakken van de met-bloed-gevulde darmsegmenten naar meer ventraal in het abdomen (Elhanafy et al., 2013). Over het algemeen kunnen bloedklonters, ongestold bloed of melena in de feces worden teruggevonden (Dennison et al., 2002; Abutarbush et al., 2004). 4. LABORATORISCHE BEVINDINGEN De meeste haematologische en biochemische abnormaliteiten zijn veelal een weerspiegeling van de gastro-intestinale stase en het acute optreden van dit syndroom. Neutrofilie, die gepaard gaat met een stijging van gesegmenteerde neutrofielen (linksverschuiving), kan optreden door vrijstelling van neutrofielen uit het beenmerg als reactie op inflammatoire cytokines (Dennison et al., 2002; Elhanafy et al., 2013). De haematocriet is meestal normaal tot verhoogd door dehydratatie. Echter, door bloedverlies via de haemorrhagische enteritis wordt eerder een verlaagde haematocriet verwacht. Wanneer de functionele of mechanische obstructie in het meer proximale deel van de dunne darm optreedt, kan dit aanleiding geven tot sekwestratie van lebmaagsecreties. Dit leidt tot een hypochloremische metabole alkalose die gepaard met een hypokaliëmie (Dennison et al., 2002; Braun et al., 2010b). HBS gaat bijna steeds gepaard met een hyperglycemie, die hoogstwaarschijnlijk veroorzaakt wordt door stress met vrijstelling van adrenaline. Hypocalcemie, hypermagnesiëmie en hyperfosfatemie zijn vaak voorkomende bevindingen. De hypocalcemie wordt mogelijks veroorzaakt door integratie van calcium in proteasen geproduceerd tijdens de vermeerdering van C. perfringens type A (Elhanafy et al., 2013). Een verminderde resorptie van calcium als gevolg van de ileus zou ook deze hypocalcemie kunnen verklaren (Braun et al., 2010b). Hyperfosfatemie kan voortvloeien uit dehydratatie en een verminderde renale doorbloeding (Elhanafy et al., 2013). Een verminderde glomerulaire filtratie kan aanleiding geven tot een prerenale azotemie. Hyponatriëmie kan een resultante zijn van dysfunctie van proximale tubuli (Braun et al., 2010b). Een verhoogd ureumgehalte, zonder een gelijktijdige stijging van serum creatinine wordt frequent vastgesteld bij melkkoeien met HBS. Dit verhoogd ureumgehalte kan een indicatie geven van ruminale stase en gastro-intestinale bloedingen. Herkauwers kunnen dankzij hun pensflora ureum omzetten naar aminozuren. In het geval van ruminale stase gebeurt deze omzetting veel minder, zodat het ureumgehalte toeneemt. Bijkomend zorgen microbiële en enzymatische degradatieprocessen van haemorrhagische inhoud in de darm voor een extra stijging van ammoniak. Deze ammoniak wordt in de lever namelijk omgezet naar ureum, die bijdraagt tot een verdere stijging van ureum (Elhanafy et al., 2013). Stijging van enzymes zoals aspartaat aminotransferase, sorbitol dehydrogenase, y-glutamyl transferase
en
lactaat
dehydrogenase
worden
regelmatig
vastgesteld.
Deze
toegenomen
enzymatische activiteit is vermoedelijk toe te schrijven aan acute leverschade die optreedt na
24
absorptie van bacteriën en toxines door de stase of proximale obstructie ter hoogte van de dunne darm. Een stijging van creatinine kan het gevolg zijn van musculoskeletale schade. Dit kan een gevolg zijn van de toxaemie of van ischemie door langdurige decubitus (Dennison et al., 2002). Glucosurie, een frequent voorkomende bevinding bij koeien met HBS, is waarschijnlijk toe te schrijven aan hyperglycemie dat veroorzaakt wordt door stress of door de intraveneuze toediening van glucose. Een verlaagde urine pH kan een gevolg zijn van de abomasale sekwestratie, die leidt tot zogenaamde ‘paradoxale acidurie’. Een lage urine pH kan mede veroorzaakt worden door het katabolisme die optreedt bij anorexie (Braun et al., 2010b). 5. ECHOGRAFISCHE BEVINDINGEN Transabdominale echografie reveleert de aanwezigheid van opgezette dunne darmen (figuur 9a,b) met een verminderde tot afwezige motiliteit. In de overgrote meerderheid van de gevallen kan vloeistof tussen de darmlussen waargenomen worden. Soms kan fibrine teruggevonden worden als resultante van peritonitis of transsudatie door aantasting van de darmwand. Accumulatie van pens- en lebmaaginhoud komt voor bij 22,2% van de aangetaste dieren. Deze laatste bevindingen zijn indicatief voor ileus (Braun et al., 2010a). Bij 19 tot 25% van de koeien kan echogeen materiaal, die overeenkomt met intraluminale bloedklonters, gevisualiseerd worden (figuur 9b) (Dennison et al., 2002; Braun et al., 2010a).
Figuur 9: (a) Opgezette dunne darmen met aanwezigheid van echogeen materiaal in een koe met HBS. 1 Abdominale wand, 2 Opgezette dunne darmen, 3 Vrij buikvocht tussen de intestinale lussen. Ds=dorsaal, Vt=ventraal. (b) Opgezette dunne darmen met hypo-echogeen materiaal (bloedklonter) in een koe met HBS. 1 Abdominale wand, 2 Dwarse doorsnede doorheen de dunne darmen, 3 Longitudinale doorsnede van de dunne darmen, 4 Hypo-echogene intestinale inhoud, 5 Echogene bloedklonter. (Uit Braun et al., 2010a)
25
6. AUTOPSIE Op autopsie valt op het eerste zicht een matige distentie op van het abdomen als gevolg van de opgezette dunne darmen (Radostits et al., 2007). Vaak is devitalisatie van het proximaal deel van de dunne darm te zien. De serosae ter hoogte van de aangetaste darmen zijn vaak bedekt met een laagje fibrine. Uitgesproken laesies ter hoogte van het jejunum met intraluminale bloedstolsels of ongestold bloed zijn karakteristiek. Het gaat in het bijzonder om een necro-haemorrhagische enteritis of jejunitis. Naast gestold en/of ongestold bloed, kunnen in de aangetaste darmsegmenten vaak stukken losgelaten mucosae teruggevonden worden (Elhanafy et al., 2013). 7. HISTOLOGIE Op histologisch onderzoek zijn multifocale submucosale bloedingen (haematomen) en oedeem zichtbaar ter hoogte van aangetaste dunne darmsegmenten. Deze histopathologische bevinding wordt voornamelijk gezien ter hoogte van het jejunum. Dit gaat vaak samen met segmentele necrose en ulceratie. Frequent treedt een complete loslating op van het epitheel met infiltratie van voornamelijk neutrofielen. In zeer erge gevallen treedt totale destructie op van de mucosa met uitgesproken bloedingen en haematomen in de submucosa, tunica muscularis en serosa (Abutarbush en Radostits, 2005; Radostits et al., 2007; Elhanafy et al., 2013). 8. DIAGNOSE Op basis van de anamnese en klinische bevindingen kan meestal een vermoedelijke diagnose gesteld worden. Een peracuut optreden van anorexie, verminderde melkproductie, abdominale distentie, verminderde melkproductie, melena of feces met vers of gestold bloed zijn karakteristiek. De aanwezigheid van opgezette dunne darmen, vastgesteld op basis van rectaal onderzoek of echografie, aangevuld met een bloedbeeld van hypochloremie, hypokaliëmie en metabole alkalose versterken het vermoeden van HBS. Veelal kan een definitieve diagnose enkel gesteld worden na een exploratieve laparotomie of bij autopsie (Abutarbush, 2002). De volgende bevindingen worden het meest geobserveerd bij exploratieve laparotomie: dilatatie van de lebmaag, opgezette dunne darmen, haemorrhagische enteritis, ongestold bloed en/of intraluminale bloedklonters adhesief aan de mucosa, intra-intestinale loslating van mucosa, devitalisatie of ischemie van meer proximaal gelegen dunne darmen en een donkerrode verkleuring van de serosa. Vaak is er op de serosa van de aangetaste dunne darmen een fibrine beleg terug te vinden. Manipulatie van het aangetaste stuk darm kan leiden tot ruptuur door de dunne en fragiele darmwand ingevolge ischemie en devitalisatie. Het deel van de dunne darm proximaal van het aangetaste segment is meestal gedilateerd en gevuld met vloeistof en gas, terwijl de meer distaal gelegen darmen eerder leeg zijn (Dennison et al., 2002; Ceci et al., 2006; Radostits et al., 2007). PCR kan gebruikt worden om het genotype van C. perfringens isolaten te achterhalen. Hiervoor worden C. perfringens kolonies geselecteerd op basis van de kolonie morfologie en de aanwezigheid van een dubbele hemolytische zone op bloedagar platen (Denisson et al., 2002).
26
9. DIFFERENTIAALDIAGNOSE Differentiaaldiagnostisch moet gedacht worden aan salmonellose, coccidiose, winter dysenterie, perforerende lebmaagulcera, Bovine Virale Diarree Virus infectie (BVDV), coagulopathieën, lebmaagverplaatsing naar rechts, intestinale volvulus, intussusceptie en acute peritonitis (Kirkpatrick et al., 2001; Dennison et al., 2002; Braun et al., 2010b; Savic et al., 2012). Bij een perforerende, bloedende lebmaagulcus is melena aanwezig, maar de mestproductie zal zelden in hoeveelheid afnemen. De haematocriet is vaak gedaald, dit in tegenstelling met HBS. Bepaling van de haematocriet kan dus nuttig zijn (Braun et al., 2010b). Een bloedende lebmaagulcus gaat daarenboven niet gepaard met een uitgesproken hypochloremie, metabole alkalose of opgezette dunne darmen (Abutarbush, 2002). In geval van een lebmaagverplaatsing naar rechts, kan naast het horen van pinggeluiden, rectaal vaak een gedilateerde lebmaag gevoeld worden, welke ook door middel van echografie kan gevisualiseerd worden. Bovendien treden niet zo snel systemische abnormaliteiten of opzetting van de dunne darmen op (Abutarbush, 2002; Braun et al., 2010b). Een invaginatie ter hoogte van de dunne darmen geeft dezelfde klinische bevindingen als HBS en op basis van echografie kan niet steeds een differentiatie gemaakt worden omdat beide aandoeningen geassocieerd zijn met gedilateerde, niet motiele dunne darmen. Visualisatie van de karakteristieke ‘doughnut’ bij een darminvaginatie of van bloedklonters die typisch bij HBS voorkomen, gebeurt slechts sporadisch. Daarom is in veel gevallen een exploratieve laparotomie of autopsie noodzakelijk om HBS van een invaginatie te kunnen differentiëren (Braun et al., 2010b). Salmonella spp., BVDV en coccidia kunnen ook intraluminale bloedingen teweegbrengen, maar de letsels die ze veroorzaken lijken niet op deze die gezien worden bij HBS. Acute salmonellose en peritonitis gaan meestal gepaard met koorts en worden overigens niet geassocieerd met een erge hypochloremische metabole alkalose (Abutarbush, 2002). Bij een acute Salmonella-infectie wordt ook diarree verwacht. De laesies die bij coccidiose gezien worden, blijven beperkt tot het ileum en een BVDV-infectie wordt niet geassocieerd met een verminderde mestproductie (Savic et al., 2012). Winter dysenterie is eerder een bedrijfsprobleem en gaat niet gepaard met opzetting van dunne darmen (Abutarbush, 2002). 10. BEHANDELING EN PROGNOSE De behandeling van dieren met HBS is zelden succesvol en de prognose is teleurstellend. Daarom is een vroege diagnose en snelle interventie van groot belang. Een exact protocol voor de behandeling van HBS bestaat niet. Verschillende combinaties van geneesmiddelen werden uitgetest met variabele resultaten (Kirkpatrick et al., 2001; Dennison et al., 2002; Braun et al., 2010b). Een medicamenteuze behandeling kan bestaan uit het toedienen van analgetica, anti-inflammatoire geneesmiddelen, antibiotica en intraveneuze vochttherapie. Over het algemeen wordt procaïne benzylpenicilline (22.000 IU/kg IM) toegediend als antibioticum (Dennison et al., 2002; Elhanafy et al., 2013). Flunixine meglumine kan gebruikt worden als anti-inflammatoir analgeticum (Dennison et al., 2002). Additioneel kan een antitoxine, gericht tegen C. perfringens types C en D, worden aangewend. Voorlopig bestaat geen specifiek antitoxine gericht tegen alpha toxine. Door gebruik te maken van het huidig antitoxine, wordt gehoopt op een zekere kruisreactiviteit met
27
alpha toxine (Elhanafy et al., 2013). In een studie met 22 aangetaste melkkoeien, stierven zeven van de acht dieren na administratie van een combinatie van verschillende geneesmiddelen (Dennison et al., 2002). Chirurgie, door middel van een exploratieve laparotomie, blijkt het meest effectief te zijn wanneer deze wordt uitgevoerd in een vroeg stadium (Elhanafy et al., 2013). Deze kan bestaan uit resectie van het aangetaste stuk darm gevolgd door het uitvoeren van een anastomose. Vaak wordt gewoon een enterotomie uitgevoerd met verwijderen van de aanwezige bloedklonters. Een andere mogelijkheid bestaat uit het doormasseren van bloedklonters die zich in de aangetaste darmsegmenten bevinden. Tijdens de chirurgische interventie kan gemakkelijk een darm geperforeerd worden, wat aanleiding geeft tot septische peritonitis. Daarom worden dieren vaak intra-operatief geëuthanaseerd (Elahanafy et al., 2013). Negen van de 13 koeien die chirurgie ondergingen in diezelfde studie van Dennison et al. (2002) stierven of werden alsnog geëuthanaseerd. Een chirurgische interventie bleek iets succesvoller te zijn dan de medicamenteuze behandeling. Naast de studie van Denisson et al. (2002), blijkt ook uit andere studies dat zowel medicamenteuze als
chirurgische
behandeling
vaak
niet
succesvol
zijn.
De
overlevingskansen,
hetzij
na
medicamenteuze, hetzij na chirurgische behandeling, worden zeer laag ingeschat (Dennison et al., 2002; Abutarbush en Radostits, 2005; Braun et al., 2010b). Algemeen kent HBS een mortaliteit die varieert tussen de 85 en 100% (Kirkpatrick et al., 2001; Braun et al., 2010a). Manuele massage van de darmen, om de grootte van bloedklonters te reduceren, blijkt iets succesvoller te zijn dan intestinale resectie of enterotomie met verwijderen van bloedklonters (Peek et al., 2009). 11. PREVENTIE Omdat behandeling vaak niet succesvol is, zijn preventie- en managementstrategieën de beste manier om deze aandoening aan te pakken. Geschikte preventiestrategieën zijn moeilijk te definiëren, daar de exacte etiologie van HBS nog niet werd achterhaald. Praktiserende dierenartsen raden tegenwoordig
het
gebruik
aan
van
vaccins
en
voederadditieven
om
de
incidentie
op
probleembedrijven te doen afnemen. Echter, de vaccins die nu voorhanden zijn tegenover C. perfringens verhinderen het voorkomen van HBS niet, hoewel infecties met C. perfringens type A sterk worden gesuggereerd als potentiële oorzaak van HBS. Dit vindt een verklaring in het feit dat de (bacterin-toxoïd) vaccins die nu beschikbaar zijn enkel gericht zijn tegen C. perfringens types C en D (Songer, 1999). Tegenwoordig gaat een bijzondere interesse uit naar de ontwikkeling van autologe (bacterin-toxoïd) vaccins gericht tegen C. perfringens type A isolaten van aangetaste bedrijven (Elhanafy et al., 2013). Desalniettemin blijken deze vaccins, die onder andere het alpha toxine bevatten, ook niet effectief te zijn. Het toxine wordt namelijk met formol geïnactiveerd, waardoor de tertiaire structuur van het eiwit wordt aangetast. Hierdoor worden niet alleen minder antistoffen geproduceerd, maar de gevormde antistoffen blijken bovendien niet neutraliserend te werken op het natieve alpha toxine. Mogelijks spelen andere toxines zoals het bèta2 toxine en perfringolysine een rol (Metz et al., 2006; Evy Goossens, ongepubliceerde data).
28
Verder zou er moeten ingespeeld worden op het gebruik van hoog geconcentreerde rantsoenen die aangewend worden om hoge melkproducties te garanderen op hoogproductieve melkveebedrijven. Er blijkt namelijk een associatie te bestaan tussen het voorkomen van subacute pensacidose en HBS. Een uitgebalanceerd rantsoen met voldoende vezels is belangrijk voor een goede penswerking. Op bedrijven die in het verleden reeds geconfronteerd werden met gevallen van HBS, zou de aanwezigheid van subacute pensacidose gemonitord moeten worden. Een laag vetgehalte kan een verklikker zijn voor pensacidose. Ook een wisselende mestconsistentie en de aanwezigheid van veel onverteerde delen kan wijzen op pensacidose. Een goede analyse van de melkcontrolegegevens kan daarom zinvol zijn (Muskens et al., 2007; Elhanafy et al., 2013). Op probleembedrijven is een inspectie van het kuilvoeder aangewezen. Indien de kwaliteit ondermaats is, kunnen volgende parameters worden onderzocht: pH, temperatuur en vochtigheid. Recent stelt zich ook de mogelijkheid om schimmelinhibitoren aan het voeder toe te voegen, wat mogelijks de incidentie van HBS op bedrijven zal doen dalen. Consumptie van deze inhibitoren heeft een betere werking van leukocyten aangetoond bij immunosuppressieve schapen (Elhanafy et al., 2013).
29
ONDERZOEKSGEDEELTE 1. Materiaal en methoden Runderen De medische dossiers van runderen aangeboden op de Faculteit Diergeneeskunde te Merelbeke tussen 1 januari 2008 en 1 mei 2014 werden onderzocht. In deze periode werden zes dieren gediagnosticeerd met HBS. De runderen opgenomen in deze studie werden geselecteerd op basis van de aanwezigheid van een haemorrhagische enteritis of jejunitis vastgesteld tijdens exploratieve laparotomie en/of autopsie en de afwezigheid van andere oorzaken die een intestinale obstructie (intestinale volvulus, invaginatie, etc.) of melena kunnen teweegbrengen. Analysemethoden Signalement, anamnese, klinische symptomen, laboratorische en echografische bevindingen, behandeling, afloop, postmortaal en histologisch onderzoek werden beschreven. Bij het laatst aangeboden dier werd bijkomend bacteriologisch, moleculair en histologisch onderzoek uitgevoerd. Bacteriologische kwantificatie van C. perfringens in intestinale inhoud werd uitgevoerd zoals beschreven door Valgaeren et al. (2013). Op basis van de typische kolonie karakteristieken werden een aantal C. perfringens kolonies geselecteerd. Er werden 9 stammen geïsoleerd. Het toxinotype van de C. perfringens isolaten werd bepaald door een multiplex PCR, zoals beschreven door Yoo et al. (1997), terwijl de aanwezigheid van
het
bèta2 toxine
gen
gedetecteerd
werd
via
het
PCR
protocol beschreven door
Gholamiandekhordi et al. (2006). Een Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) PCR werd uitgevoerd om na te gaan of de C. perfringens isolaten al dan niet klonaal waren. Deze PCR werd uitgevoerd volgens het protocol van Leflon-Guibout et al. (1997). In het kader van het histologisch onderzoek werden verschillende immunohistochemische kleuringen uitgevoerd: CD3 (T-lymfocyten), CD20 (B-lymfocyten), CD31 (endoheelcellen) en Von Willebrand-factor (endotheelcellen en bloedplaatjes). 2. Resultaten case series Zes runderen voldeden aan de criteria om opgenomen te worden in deze studie. Het ging om vijf Holstein Friesian koeien en één stier van het Belgisch Wit Blauwe ras. De leeftijd van deze dieren varieerde van 1,5 tot ongeveer 6 jaar (gemiddeld 3,1 jaar; mediaan 2,5 jaar). Alle runderen vertoonden symptomen van koliek. De voornaamste klachten en klinische bevindingen waren anorexie (n=8), dehydratatie (n=5), een verminderde of afwezige pens- en darmmotiliteit (n=4), hypothermie (n=2), milk drop (n=3) en melena (n=2). De rectale temperatuur varieerde van 33,4 tot 39,1°C (gemiddeld 37,6°C; mediaan 38,3°C). De hartfrequentie varieerde van 56 tot 124 slagen/minuut (gemiddeld 86 slagen/minuut; mediaan 84 slagen/minuut). Drie dieren (50%) vertoonden tachycardie. De ademhalingsfrequentie varieerde van 16 tot 80 ademhalingen per minuut (gemiddeld 37; mediaan 31).
30
Twee dieren vertoonden bleke mucosae en twee dieren gestuwde mucosae. Bij twee dieren voelden de extremiteiten koud aan en bij één dier waren pinggeluiden hoorbaar aan de rechter zijde. Rectaal onderzoek werd uitgevoerd bij vier dieren. Bij twee dieren konden opgezette dunne darmen gepalpeerd worden. Verder kon een grote (n=1) en ingedroogde (n=1) pens gevoeld worden. Bij één dier werd de aanwezigheid van melena en bloederige mest opgemerkt. Alle dieren werden onderworpen aan een transabdominale echografie. De voornaamste echografische bevindingen waren een vergrootte lebmaag (n=3), opgezette dunne darmen (n=4), dunne darmen met een echogene inhoud (n=1) en vrij buikvocht (n=2). Bij één dier kon geen differentiatie gemaakt worden tussen vrij buikvocht en fibrine, doch dit bleek bij autopsie gewoon om vetmassa’s te gaan met een afwijkende consistentie. Haematologisch onderzoek werd bij alle dieren uitgevoerd. Vier dieren vertoonden een gestegen haematocriet en bij twee dieren was deze verlaagd. Vijf dieren bevonden zich in een metabole alkalose; het andere dier had een metabole acidose. Resultaten van het biochemisch onderzoek zijn bekend voor vijf dieren. Hypokaliëmie, hypocalcemie en hyponatriëmie werd vastgesteld bij vier dieren; een hypochloremie bij twee dieren. Parasitologisch onderzoek werd verricht bij één dier. Deze werd uitgevoerd om andere oorzaken van bloederige mest of melena te kunnen uitsluiten. Bij dit dier werden niet pathogene Eimeria species teruggevonden. Eén koe werd onmiddellijk na het klinisch onderzoek geëuthanaseerd wegens een slechte prognose. De andere dieren ondergingen een exploratieve laparotomie. Deze werd uitgevoerd via de rechter flank. Twee dieren werden intra-operatief geëuthanaseerd omwille van vergevorderde intestinale letsels. Doormasseren van bloedklonters werd uitgevoerd bij één dier. Enkele dagen na de chirurgische interventie werd het dier alsnog geëuthanaseerd wegens verslechtering van de algemene toestand. Bij één dier werd een enterotomie uitgevoerd. Dit dier overleefde de chirurgie en werd gezond verklaard bij het verlaten van de kliniek. Bij het laatst aangeboden dier werd het aangetaste darmsegment gereseceerd; doch het dier werd twee dagen later alsnog dood aangetroffen. De postoperatieve behandeling bestond voornamelijk uit het toedienen van penicilline (Duphapen ®, Zoetis, Madison, New Jersey; Neopen®, Intervet Nederland B.V., Boxmeer, Nederland), erythromycine (Erythrocine 200®, CEVA Santé animale, Libourne, Frankrijk) en flunixine meglumine (Emdofluxin 50®, Emdoka BVBA, Hoogstraten, België) aangevuld met intraveneuze vochttherapie met glucose (Glucose 30% kela, Eurovet Animal Health B.V., Bladel, Nederland). Vijf dieren werden aangeboden ter autopsie. Deze reveleerde de aanwezigheid van een (necro) haemorrhagische enteritis (n=3) en/of jejunitis (n=2), gestold en ongestold bloed (n=2), opgezette dunne darmen (n=2), een submucosaal haematoom (n=1) en fibrine ter hoogte van de serosale zijde van het aangetaste darmsegment (n=2).
31
Bij drie van de zes dieren werden stalen ingestuurd voor histologisch onderzoek. Bij het eerste dier werd een submucosaal haematoom teruggevonden. Een ander dier vertoonde staafvormige bacillen op de darmmucosa, indicatief voor de aanwezigheid van C. perfringens. Een lymfoplasmocytair infiltraat, intraluminale en submucosale bloedingen, villustopnecrose en bloedingen in de lamina propria werden teruggevonden bij de recentste casus. 3. Resultaten onderzoekstechnieken van case report 6 Intestinale inhoud werd verzameld ter hoogte van het aangetaste darmsegment en vervolgens werd deze gecultiveerd op bloedplaten. Op basis van de kolonie karakteristieken, namelijk de kolonie morfologie en de dubbele hemolytische zone, werd C. perfringens geïdentificeerd. Daarna werd een bacteriologische kwantificatie van C. perfringens uitgevoerd. Deze test wordt frequent gebruikt om C. perfringens enterotoxaemie te diagnosticeren (Valgaeren et al., 2013). Bij zoogkalveren bedraagt de cut-off waarde tussen 106 en 107 colony forming units (CFU) per ml intestinale inhoud (Popoff, 1989; Manteca et al., 2001; Philippeau et al., 2003). Bij dit dier werden na drie verdunningsreeksen 1,42 x 105 CFU per ml intestinale inhoud vastgesteld. Dit impliceert dat de intestinale inhoud, genomen ter hoogte van de intestinale laesies, sterk positief was voor C. perfringens. Genotypering door middel van een multiplex Polymerase Chain Reaction assay (PCR) werd uitgevoerd (figuur 10). Bij het aflezen van de gelelektroforese kon geen verschil gezien worden tussen C. perfringens type A of D. Het bandje dat staat voor de aanwezigheid van het epsilon toxine kleurde niet aan bij de positieve controle stam type D. Mogelijks werkte de epsilon primer hier niet. Hierdoor kon dus niet met zekerheid uitgemaakt worden of we met C. perfringens type A of type D te maken hadden. Omdat C. perfringens type D weinig waarschijnlijk is, zal het hier vermoedelijk om type A gaan. Deze PCR zou herhaald moeten worden om dit vermoeden te bevestigen.
Figuur 10: Het toxinotype van 9 C. perfringens isolaten werd bepaald door een multiplex Polymerase Chain Reaction (PCR), zoals beschreven door Yoo et al. (1997). Er werd 1 negatieve controle (NC) stam gebruikt. De geteste stammen (HBS 1-9) werden vergeleken met de referentiestammen (toxinotype A-E). Er kon geen verschil gezien worden tussen het toxinotype A en D. We konden dus niet met zekerheid uitmaken of we hier met C. perfringens type A of D te maken hadden. Doch, omdat isolatie van C. perfringens type D weinig waarschijnlijk is, zal het hier vermoedelijk om C. perfringens type A gaan. .
32
Ook de betrokkenheid van het bèta2 toxine gen werd nagegaan door het uitvoeren van een PCR (figuur 11). Geen enkel staal was positief voor het bèta2 toxine gen.
Figuur 11: De aanwezigheid van het bèta2 toxine gen in 9 C. perfringens isolaten werd nagegaan via het PCR protocol beschreven door Gholamiandekhordi et al. (2006). PC staat voor de positieve controle stam en NC voor de negatieve controle stam. Omdat geen enkel bandje oplichtte, kon besloten worden dat geen enkel isolaat positief was voor het bèta2 toxine gen.
Een Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) PCR werd uitgevoerd om na te gaan of de C. perfringens isolaten al dan niet klonaal waren (figuur 12). Aanwezigheid van een klonale stam zou kunnen wijzen op een explosieve overgroei van één pathogene stam (Van Immerseel et al., 2010). Het bandenpatroon was verschillend, wat impliceert dat de C. perfingens stammen niet klonaal waren.
Figuur 12: Een Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) werd uitgevoerd om te verifiëren of de C. perfringens isolaten al dan niet klonaal waren. Deze PCR werd uitgevoerd volgens het protocol van Leflon-Guibout et al. (1997). De 9 C. perfringens isolaten vertoonden allen een ander bandenpatroon, waardoor besloten kan worden dat het hier niet om een klonale stam ging.
33
Bijkomende histologische kleuringen werden uitgevoerd. Het gaat om immunohistochemische kleuringen voor CD3 (T-lymfocyten), CD20 (B-lymfocyten), CD31 (endotheelcellen) en Von Willebrand-factor (endotheelcellen en bloedplaatjes). Op de kleuring gebaseerd op CD3 antistoffen waren veel T-lymfocyten te zien in de lamina propria dicht tegen het epitheel en ook intra-epitheliaal waren T-lymfocyten aanwezig (figuur 13a). Op de CD20 kleuring waren de B-lymfocyten vooral basaal gelokaliseerd (figuur 13b). De CD31 IHC werkte niet. De kleuring voor Von Willebrand-factor (figuur 13c,d) werd uitgevoerd om de integriteit van het endotheel ter hoogte van het aangetaste darmsegment te beoordelen. Het endotheel kleurde niet overal even sterk aan. Op plaatsen waar darmvilli en endotheel aangetast waren, kwam een compacte massa Von Willebrand-factor voor. Op die manier konden de bloedingen aanwezig in de lamina propria en in het lumen aangetoond worden. De bloedingen in de lamina propria werden meer uitgesproken naar apicaal toe en gaven aanleiding tot het optreden van excessieve intraluminale bloedingen.
Figuur 13: Immunohistochemische kleuringen van het jejunum. Door middel van een CD3 kleuring werden de Tlymfocyten aangekleurd. Globaal beeld (a) van het verspreidingspatroon van de T-lymfocyten in de lamina propria: de T-lymfocyten bevonden zich voornamelijk dicht tegen het epitheel. Ook intra-epitheliaal werden enkele T-lymfocyten gezien. De CD20 kleuring (b) toonde aan dat de B-lymfocyten vooral basaal gelokaliseerd waren. Een kleuring voor Von Willebrand-factor (c,d) werd uitgevoerd om de integriteit van het endotheel in beeld te brengen. Op plaatsten waar darmvilli en endotheel aangetast was, kon een compacte massa Von Willebrandfactor gezien worden. De bloedingen in de lamina propria werden meer uitgesproken naar apicaal toe en gaven aanleiding tot excessieve intraluminale bloedingen. Deze kleuring toonde duidelijk aan dat de massieve intraluminale bloedingen een resultante waren van de endotheliale schade in de lamina propria.
34
BESPREKING De resultaten van deze casuïstieken bevestigen voorgaande studies dat HBS bij zowel melk- als vleesvee een acuut optredende aandoening betreft, dat gekarakteriseerd wordt door intraluminale bloedingen met obstructie van de dunne darmen, en dit voornamelijk in het jejunum (Dennison et al., 2002; Abutarbush en Radostits, 2005; Ceci et al., 2006; Braun et al., 2010b). De klinische, haematologische en pathologische bevindingen ondersteunen de diagnose van HBS bij deze zes runderen. Deze bevindingen waren grotendeels het gevolg van het acute optreden van een intestinale obstructie door de intraluminale bloedingen en bloedklonters met secundair het optreden van gastroinstestinale stase. De meest voorkomende klinische bevindingen waren anorexie, verminderde melkproductie, dehydratatie, hypothermie, bleke mucosae, tachycardie, abdominaal discomfort, opgezette dunne darmen en een verminderde of afwezige pens- en darmmotiliteit. Dehydratatie, hypothermie, bleke mucosae en tachycardie zijn indicaties voor shock. Metabole alkalose met een compensatoire hypokaliëmie werd gezien bij vijf dieren en kan verklaard worden door de abomasale sekwestratie die optreedt ten gevolge van de intestinale obstructie en ileus. De belangrijkste echografische bevinding in deze studie was de aanwezigheid van een vergrootte lebmaag en opgezette dunne darmen. Deze bevinding stemt grotendeels overeen met een studie uitgevoerd bij 63 runderen, waar dilatatie van de dunne darmen met een verminderde tot afwezige intestinale motiliteit bij alle dieren werd vastgesteld (Braun et al., 2010a). In diezelfde studie werd vrij buikvocht tussen de dunne darmlussen bij 61,9% van de dieren geobserveerd, waar dat in onze studie slechts bij 33,3% van de dieren werd gezien. Onafhankelijk van de behandeling was de prognose van de aangetaste dieren teleurstellend: 83% van de dieren stierf. Eén koe werd onmiddellijk na het klinisch onderzoek geëuthanaseerd wegens een slechte prognose. Vijf dieren ondergingen een exploratieve laparotomie, waarvan twee dieren tijdens de operatie werden geëuthanaseerd omwille van vergevorderde intestinale letsels; één dier werd twee dagen later dood aangetroffen en het andere dier werd enkele dagen na chirurgische interventie alsnog geëuthanaseerd wegens verslechtering van de algemene toestand. Slechts één koe overleefde de chirurgie en werd gezond verklaard bij het verlaten van de kliniek. Zoals beschreven in vorige publicaties, is de morbiditeit van HBS laag, maar de mortaliteit hoog. Dit impliceert het belang van een vroege diagnose opdat chirurgische interventie effectief zou zijn. De meest opvallende pathologische bevinding was de aanwezigheid van gestold en/of ongestold bloed over een variabele lengte van de dunne darmen. Soms waren bloedingen aanwezig ter hoogte van de serosale zijde van de dunne darmen. Bij enkele dieren werden aan de serosale zijde van het aangetaste dunne darm segment ook fibrinestrengen waargenomen, wat wijst op aantasting van de darmwand met transsudatie en peritonitis tot gevolg. De belangrijkste morfologische diagnose bij postmortaal onderzoek was de uitgesproken necro-haemorrhagische enteritis of jejunitis met intraluminale bloedingen of bloedklonters. De histologische bevindingen in deze studie waren identiek aan deze gerapporteerd in vorige publicaties (Dennison et al., 2002; Abutarbush en Radostits, 2005). De uitgesproken intestinale
35
necrose, de bloedingen in de lamina propria en de excessieve intraluminale bloedingen werden bij het laatst aangeboden dier in beeld gebracht. Door het uitvoeren van een immunohistochemische kleuring voor Von Willebrand-factor kon de endotheliale schade ter hoogte van de aangetaste villi vastgesteld worden. De bloedingen in de lamina propria van de necrotische villi werden meer uitgesproken naar apicaal toe en gaven aanleiding tot massieve intraluminale bloedingen. Deze bevinding ondersteunt de hypothese dat door de inwerking van het alpha toxine op de darmwand een lokale ontstekingsreactie in gang gezet wordt met aantasting van de intestinale microvasculatuur en met uitgesproken intraluminale bloedingen tot gevolg (Elhanafy et al., 2013). Opmerkelijk is dat de microscopische letsels bij runderen met HBS sterk overeenkomen met deze van enterotoxaemie bij kalveren (Lebrun et al., 2010; Verherstraeten et al., 2013). Risicofactoren voor HBS werden in deze studie niet onderzocht en dus niet geïdentificeerd. Echter, vijf van de zes dieren in deze studie waren hoogproductieve Holstein Friesian koeien. Stress geassocieerd met de hoge melkproducties en hoge energie- en verlaagde vezelgehaltes in het rantsoen worden vooropgesteld als mogelijke risicofactor in het ontstaan van HBS (Berghaus et al., 2005; Elhanafy et al., 2013). Hoewel de exacte oorzaak van HBS bij runderen nog niet achterhaald werd, benadrukken verschillende publicaties de rol van C. perfringens type A (alpha toxine of alpha toxine met bèta2 toxine) (Dennison et al., 2002; Abutarbush et al., 2004; Abutarbush en Radostits, 2005; Dennison et al., 2005; Ceci et al., 2006; Savic et al., 2012). Doch deze rol moet genuanceerd worden, daar C. perfringens deel uitmaakt van de normale intestinale flora bij zoogdieren (Denisson et al., 2005). In deze studie werd bij het laatst aangeboden dier C. perfringens type A (bèta2 toxine negatief) geïsoleerd uit intestinale inhoud die verzameld werd op de plaats van de intestinale laesies. Hieruit kunnen we besluiten dat HBS kan optreden in afwezigheid van het bèta2 toxine. Verder kon bij een ander dier de intraluminale groei van basofiele, staafvormige bacteriën histologisch worden aangetoond. Samengevat kunnen we stellen dat de bevindingen in onze studie overeenkomen met de hypothese dat C. perfringens type A een mogelijke rol kan spelen in het ontstaan van de letsels. De vraag blijft of C. perfringens type A in staat is om op zichzelf ziekte te veroorzaken of eerder deel uitmaakt van een multifactorieel proces. Tot op heden kon het syndroom kon nog niet gereproduceerd worden.
36
CONCLUSIE Haemorrhagic Bowel Syndrome (HBS) is een acuut optredende intestinale aandoening bij volwassen runderen, die een sterke verwantschap vertoont met enterotoxaemie bij kalveren en vaak een fatale afloop kent. De aandoening wordt op melkveebedrijven met een toenemende frequentie gerapporteerd. De gemiddelde melkproductie per koe is de laatste twee decennia spectaculair gestegen. De managementstrategieën en het gebruik van hoog energetische rantsoenen om dergelijke hoge melkproducties te realiseren, zorgt niet alleen voor een hogere incidentie van metabole stoornissen, maar blijkt ook een belangrijke risicofactor te zijn in het ontstaan van HBS. De aandoening heeft een slechte prognose en gaat gepaard met verlies van waardevolle, hoogproductieve dieren in het begin van de lactatieperiode, wat leidt tot belangrijke economische verliezen. Daarom is verder onderzoek noodzakelijk om inzicht te verkrijgen in de pathogenese van dit syndroom zodat preventie- en managementstrategieën opgesteld kunnen worden om HBS te voorkomen.
37
LITERATUURLIJST Abutarbush S.M. (2002). Jejunal Hemorrhage Syndrome in cattle: a newly emerging disease. Large Animal Veterinary Rounds 2, issue 10. Abutarbush S.M., Carmalt J.L., Wilson D.G., O’Connor B.P., Clark E.G., Naylor J.M. (2004). Jejunal Hemorrhage Syndrome in 2 Canadian beef cows. Canadian Veterinary Journal 45, 48-50. Abutarbush S.M., Radostits O.M. (2005). Jejunal Hemorrhage Syndrome in dairy and beef cattle: 11 cases (2001 to 2003). Canadian Veterinary Journal 46, 711-715. Baines D., Erb S., Turkington K., Kuldau G., Juba J., Masson L., Mazza A., Robers R. (2011). Mouldy feed, mycotoxins and Shiga toxin-producing Escherichia coli colonization associated with Jejunal Hemorrhage Syndrome in beef cattle. BMC Veterinary Research 7:24. Berghaus R.D., McCluskey B.J., Callan, R.J. (2005). Risk factors associated with Hemorrhagic Bowel Syndrome in dairy cattle. Journal of the American Veterinary Medical Association 226, 1700-1706. Braun U., Forster E., Steininger K., Irmer M., Gautschi A., Previtali M., Gerspach C., Nuss K. (2010a). Ultrasonographic findings in 63 cows with Haemorrhagic Bowel Syndrome. Veterinary Record 166, 79-81. Braun U., Schmid T., Muggli E., Steininger K., Previtali M., Gerspach C., Pospischil A., Nuss. K. (2010b). Clinical findings and treatment in 63 cows with Haemorrhagic Bowel Syndrome. Schweizer Archiv für Tierheilkunde 152, 525,522. Ceci L., Paradies P., Sasanelli M., De Caprariis D., Guarda F., Capucchio M. T., Carelli G. (2006). Haemorrhagic Bowel Syndrome in dairy cattle: possible role of Clostridium perfringens type A in the disease complex. Journal of Veterinary Medicine Series A. 53, 518-523. Dennison A.C., Van Metre D.C., Callan R.J., Dinsmore P., Mason G.L., Ellis R.P. (2002). Hemorrhagic Bowel Syndrome in dairy cattle: 22 cases (1997-2000). Journal of the American Veterinary Medical Association 221, 686-689. Dennison A.C., Van Metre D.C., Morley P.S., Callan R.J., Plampin E.C., Ellis R.P. (2005). Comparison of the odds of isolation, genotypes, and in vivo production of major toxins by Clostridium perfringens obtained from the gastrointestinal tract of dairy cows with Hemorrhagic Bowel Syndrome or left-displaced abomasum. Journal of the American Veterinary Medical Association 227, 132-138. Elhanafy M.M., French D.D., Braun U. (2013). Understanding Jejunal Hemorrhage Syndrome. Journal of the American Veterinary Medical Association 243, 352-358.
38
Ewoldt J.M., Anderson D.E. (2005). Determination of the effect of single abomasal or jejunal inoculation of Clostridium perfringens type A in dairy cows. Canadian Veterinary Journal 46, 821824. Forsberg N. (2003). New findings on Jejunal Hemorrhagic Syndrome. Hoard’s Dairyman 148, 311. Gholamiandekhordi A.R., Ducatelle R., Heyndrickx M., Haesebrouck F., Van Immerseel F. (2006). Molecular and phenotypical characterization of Clostridium perfringens isolates from poultry flocks with different disease status. Veterinary Microbiology 113, 143-152. Godden, S., Frank R., Ames T. (2001). Survey of Minnesota dairy veterinarians on the occurrence of and potential risk factors for Jejunal Hemorrhage Syndrome in adult dairy cows. The Bovine Practitioner 35, 97-103. Ivany J., Anderson D.E., Miesner M.D. (2005). Determination of the role of Clostridium perfringens type A in intraluminal Intestinal Hemorrhage Syndrome in dairy cows. Canadian Veterinary Journal 46, 821-824. Kirkpatrick M.A., Timms L.L., Kersting K.W., Kinyon J.M. (2001). Jejunal Hemorrhage Syndrome of dairy cattle. Bovine Practitioner 35,104-116. Lebrun M., Mainil J.G., Linden A. (2010). Cattle enterotoxaemia and Clostridium perfringens: description, diagnosis and prophylaxis. Veterinary Record 167, 13-22. Leflon-Guibout V., Pons J.L., Heym B., Nicolas-Chanoine M.H. (1997). Typing of Clostridium perfringens strains by use of Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) system in comparison with zymotyping. Anaerobe 3, 245-250. Manteca C., Daube G., Pirson V., Limbourg B., Kaeckenbeeck A., Mainil J.G. (2001). Bacterial intestinal flora associated with enterotoxaemia in Belgian Blue calves. Veterinary Microbiology 81, 21-32. Metz B., Kersten G.F. Baart G.J., De Jong A., Meiring H., Ten Hove J., Van Steenbergen M.J., Hennink W.E., Crommelin D.J., Jiskoot W. (2006). Identification of formaldehyde-induced modifications in proteins: reactions with insulin. Bioconjugate Chemistry 17, 815-822. Muskens J., Veldhorst G.J., Snoep J.J., Vos J. (2007). Hoge mortaliteit in melkveekoppel met beelden van Jejunal Hemorrhage Syndrome. Tijdschrift voor Diergeneeskunde 132, 116-119. Niilo L. (1980). Clostridium perfringens in animal disease: A review of current knowledge. The Canadian Veterinary Journal 21, 141-148.
39
Peek S.F., Santschi E.M., Livesey M.A., Prichard M.A., McGuirk S.M., Brounts S.H., Edwards III R.B. (2009). Surgical findings and outcome for dairy cattle with Jejunal Hemorrhage Syndrome. Journal of the American Veterinary Medical Association 234, 1308-1312. Philippeau C., Goncalves S., Julliand V. (2003). Sudden death syndrome in cattle: bacteriological diagnosis of enterotoxemia. Point Vétérinaire 34, 12-13. Popoff M.R. (1989) Enterotoxaemia. Revue de Médecine Vétérinaire 140, 479-491. Radostits O.M, Gay C.C., Hinchcliff K.W., Constable P.D. (2007). Veterinary Medicine. 10 th edition. W.B. Saunders, London, 380-382. Savic B., Prodanovic R., Ivetic V., Radanovic O., Bojkovski J. (2012). Enteritis associated with Clostridium perfringens type A in 9-month-old calves. Canadian Veterinary Journal 53, 174-176. Sockett D.C. (2004). Hemorrhagic Bowel Syndrome. Proceedings of the 2 nd Mid-Atlantic Nutrition Conference, Timonium, USA, 139-145. Songer J.G. (1999). Clostridium perfringens type A infection in cattle. In Proceedings. 32th Annual Conference of the American Association of Bovine Practitioners, 40-44. Valgaeren B.R., Pardon B., Verherstraeten S., Goossens E., Timbermont L., Haesebrouck F., Ducatelle R., Deprez P.R., Van Immerseel F. (2013). Intestinal clostridial counts have no diagnostic value in the diagnosis of enterotoxaemia in veal calves. Veterinary Record 172: 237. Van Immerseel F., Pardon B., Maes S., Heyndrickx M., Timbermont L., Boyen F., Haesebrouck F., Ducatelle R., Deprez P. (2010). Isolation of a clonal population of Clostridium perfringens type A from a Belgian Blue calf with abomasal ulceration. Journal of Comparative Pathology 143, 289-293. Verherstraeten S., Goossens E., Valgaeren B., Pardon B., Timbermont L., Vermeulen K., Schauvliege S., Haesebrouck F., Ducatelle R., Deprez P., Van Immerseel F. (2013). The synergistic necrohemorrhagic action of Clostridium perfringens perfringolysin and alpha toxin in the bovine intestine and against bovine endothelial cells. Veterinary Research 44:45. Yoo H.S., Lee S.U., Park K.Y., Park Y.H. (1997). Molecular typing and epidemiological survey of prevalence of Clostridium perfringens types by multiplex PCR. Journal of Clinical Microbiology 35, 228-232.
40
