Semmelweis Egyetem Molekuláris Orvostudományok Doktori Iskola Pathobiokémia Program
A tetrahidrobiopterin szerepe a humán placenta NOszintázának szabályozásában és kémiai stabilizálása aszkorbáttal
Ph.D. értekezés tézisei
Dr. VALENT SÁNDOR
Témaveze to: Prof. Dr. Tóth Miklós
Semmelweis Egyetem Orvosi Vegytani, Molekuláris Biológiai és Pathobiokémiai Intézet
Budapest, 2004
2
Bevezetés: Az
NO-szintáz
tetrahidrobiopterin
(BH4 )
enzim
muködése
jelenlétében
során
argininbol
és
molekuláris oxigénbol monooxigenáz I. és II. reakció során citrullint
és
elektrondonorként placentában
nitrogén- monoxidot pedig
domináló
muködéséhez ezen
NADPH-t endoteliális
kívül
(NO) használ.
A
NO-szintáz
Ca2+-kalmodulin
képez, humán izoforma
jelenléte
is
szükséges. Az elektronok a reduktáz domén elektrontranszport láncán át FAD, FMN és BH4 részvételével az oxigenáz domén hem csoportjához kötött O2 -re transzferálódnak. Az enzim homodimér formában aktív, alegységenként egy BH4 -et köt meg. Az elso, szorosan kötött BH4 az enzim alapaktivitásának biztosításában játszik szerepet és a második BH4 kötodésére homotróp antikooperatív hatást gyakorol. A második BH4 -gyel telítve az enzimet, az enzimaktivitás 2 - 2.5 szeresére fokozható. BH4 depléció esetén a reduktáz és az oxigenáz domén
muködése
szétkapcsolódik.
Az
elektrontranszfer
szétkapcsolt állapotban szuperoxid képzodését eredményezi, ami NO-val agresszíven oxidáló peroxinitritet képezhet. A
humán
placentában
innerváció
hiányában
a
vazoreguláció humorális tényezoi, így az NO szerepe alapveto fontosságú. Az NO-t termelo eNOS enzim a boholyerek 3
endotéliumában és a szincíciotrofoblasztban mutatható ki. Az oxidatív stressz hatására bekövetkezo anyai endotélium aktiválás
és
diszfunkció
magasvérnyomással
és
a
terhesség
proteinúriával
alatt
eloforduló,
járó
kórkép,
a
preeclampsia fontos patogenetikai tényezoje lehet. Úgy vélik, hogy az anyai endotélium oxidatív stressz kiváltotta aktiválása és diszfunkciója a preeclampsia fo patogén tényezoje lehet. A BH4 kémiai sajátsága, hogy gyorsan autooxidálódik, eközben H2 O2 képzodik. Mivel a de novo BH4 szintézis mértéke a placentában csekély és a BH4 oxidált származékai a sejtekbol kiürülhetnek, minden fiziológiás körülmény és tényezo, ami fenntartását,
elosegíti a szükséges BH4 fontos
lehet
a
kielégíto
koncentráció
NO
képzodés
szempontjából. Humán umbilikális és sertés aorta endotél sejtekben, valamint in vivo egér aortában is igazolták az aszkorbát hatására bekövetkezo BH4 koncentráció emelkedését és az NOszintáz aktivitás fokozódását. A BH4 -et az aszkorbát vizes oldatban stabilizálja. Ennek mechanizmusára eddig nem adtak magyarázatot.
4
Célkituzések: 1. Hogyan befolyásolja a BH4 koncentrációja a placentáris eNOS aktivitását? 2. Mi a BH4 koncentráció tartomány preeclampsiás terhesek placentájában és hogyan befolyásolja ugyanezen terhesek placentáris eNOS aktivitását a BH4 koncentráció változása? 3. Mi az aszkorbát BH4 koncentrációt stabilizáló hatásának kémiai mechanizmusa, hatékonyak-e az aszkorbát placentában eloforduló
fiziológiás koncentrációi,
milyen
tényezok befolyásolhatják az aszkorbát hatását? 4. Olyan módszer kidolgozása, amely lehetové teszi a BH4 oxidáció kinetikai vizsgálatát fiziológiás koncentrációjú aszkorbát jelenlétében. 5. Fokozhatja-e in vitro körülmények között az aszkorbát a placentáris eNOS aktivitását, s lehet-e ennek in vivo jelentosége?
Módszerek: Az eNOS enzimaktivitást radioaktívan jelölt arginin citrullinná alakulásának sebességével mértük.
5
A szöveti BH4 koncentráció meghatározása Fukushima és Nixon módosított eljárása alapján HPLC analízist követo fluoreszcens spektrofotometriával történt. A placentában lévo teljes aszkorbát koncentrációt Denson
és
Bowers
dinitrofenil- hidrazin
konjugációs
módszerével, valamint a csak redukált formában lévo aszkorbátot Omaye és mtsai. dipiridiles módszerével mértük. A preeclampsiát Roberts és Redman kritériumai alapján definiáltuk. A BH4 (ODmax = 295 nm) és az aszkorbát (ODmax = 265 nm) oxidációját spektrofotometriás módszerrel mértük. Az eredmények statisztikai kiértékeléséhez Student és Wilcoxon t próbát, egyirányú variancia analízist (ANOVA) és Bonferroni post hoc tesztet használtunk.
Eredmények: Elso
trimeszterbol
származó
placenta
homogenizátumában az NO-szintáz enzimaktivitását a BH4 koncentráció 20 nmol/l - 1 ? mol/l között 2.5 szeresére fokozza. A BH4 koncentráció további növelésével már nem detektálható NO-szintáz
aktivitás
növekedés.
A
placenta
BH4
koncentrációja a terhesség folyamán csökken, az elso trimeszterben 189 ± 79 pmol/g szövet, a terhesség végén: 56 ± 6
23 pmol/g szövet (átlag ± SD). Munkacsoportunk korábbi, nagy mintaszámú mérései alapján a BH4 telítési görbe kettos reciprok ábrázolásával meghatározott EC50 érték 79 nmol/l. Ezekbol
az
adatokból
meghatározható,
hogy
elso
trimeszterben az NO-szintáz átlagosan a vmax 70%-ával, terminusban 41%-ával muködik. Normális szülésekbol (n=4) és a preeclampsiás terhesek „BH4 -reszponzív” csoportjából (n=3) származó placentákban az NO-szintáz relatív aktivitását a BH4 hozzáadása az elso trimeszter placentáiban találthoz hasonlóan fokozza. A „BH4 rezisztens”
csoportban
(n=7)
a
fenti
fiziológiás
koncentrációkban hozzáadott BH4 nem váltja ki az NO-szintáz enzimaktivitásának
fokozódását.
Farmakológiás
koncentrációban (50 ? mol/l) alkalmazva a BH4 -et, a „BH4 rezisztens” csoportban is az NO-szintáz aktivitás fokozódása észlelheto, de ennek mértéke elmarad a normális és a „BH4 reszponzív” csoportban megfigyelttol. A három csoportban a szöveti
BH4
koncentráció
értékei
szignifikánsan
nem
különböznek egymástól. Humán placenta mikroszómális frakciójában BH4 jelenléte nélkül az aszkorbát nem vált ki enzimaktivitás növekedést. Fiziológiás koncentrációjú (0.5 ? mol/l) BH4 jelenlétében azonban már 100 ? mol/l aszkorbát hozzáadása 7
szignifikánsan
fokozza
az
NO-szintáz
aktivitását.
Ez
érvényesülhet a placentában is mert elso trimeszterben 117.4 ± 12.5, terminusban pedig 254.5 ± 85.2 µmol/kg szövet (átlag ± SD) a normális placenta aszkorbát tartalma. Másik kísérletünk szerint
5
mmol/l
aszkorbát
jelenlétében
fiziológiás
koncentrációjú BH4 NO-szintáz aktivitást fokozó hatása szignifikánsan magasabb mint a kontrol érték, míg nagyobb farmakológiai BH4 koncentrációknál az effektus elmarad. Az
aszkorbát
hozzáadásakor
lassan
oxidációja
autooxidálódik,
jelentosen
de
felgyorsul.
BH4 Olyan
koncentrációjú kataláz hozzáadásakor, ami az autooxidációs folyamatok
során keletkezo
hidrogénperoxidot
biztosan
eltávolítja az oldatból, a BH4 jelenlétében mért aszkorbát oxidáció
kezdeti
sebessége
jelentosen
lecsökken,
de
szignifikánsan, mintegy kétszer magasabb marad, mint a BH4 hozzáadása nélkül, de kataláz jelenlétében mért érték, ami az aszkorbát közvetlen BH4 stabilizáló hatására utal. A 36 ? mol/l BH4 -et 25, 50 és 100 ? mol/l aszkorbát jelenlétében inkubálva, az a BH4 oxidációjának kezdeti sebességét koncentrációfüggo módon csökkenti. Katalázt és aszkorbátot tartalmazó oldatban a BH4 oxidáció kezdeti sebessége tovább lassul. Kataláz nélkül a regenerálódó BH4 moláris aránya az oxidálódó aszkorbáthoz képest 0.5, míg 8
kataláz jelenlétében 1.0, azaz ilyenkor a védohatás a BH4 és aszkorbát koncentrációkra nézve ekvimoláris. Kataláz nélkül mérve a BH4 oxidáció látszólagos másodrendu reakciósebességi konstansát (k) 100 µmol/l aszkorbát 22-37
o
C homérsékleti tartományban minden
homérsékleten azonos mértékben csökkenti (az eredeti érték átlagosan 64 ± 0.77 %-ára, átlag ± SEM, n=12), míg kataláz jelenlétében az egyetlen változás az, hogy a csökkenés mértéke nagyobb (az eredeti érték 51 ± 0.67 %-a, átlag ± SEM, n=12). Az aszkorbát nélkül, illetve aszkorbát jelenlétében mért k értékeket Arrhenius szerint ábrázolva akkor is párhuzamos egyeneseket kapunk ha van kataláz az elegyben és akkor is ha nincs. Az így kapott egyenesek meredekségébol Arrhenius egyenlete alapján meghatároztuk a látszólagos aktiválási energiákat. Akár kataláz jelenlétében, akár anélkül végezzük a meghatározásokat, az aszkorbát az aktiválási energia értékét nem befolyásolja szignifikánsan. Az aktiválási energiák kataláz nélkül: 57.02 ± 0.09 kJ/mol (-aszkorbát) és 56.77 ± 2.21 kJ/mol (+aszkorbát), míg kataláz jelenlétében: 62.72 ± 1.37 kJ/mol (-aszkorbát) és 59.93 ± 2.84 kJ/mol (+aszkorbát, átlag ± SEM, n=3).
9
Megbeszélés: Fiziológiás koncentráció tartományban a BH4 az NOszintáz aktivitást koncentrációfüggo módon fokozza. A terhesség folyamán a placenta BH4 koncentrációja az elso trimeszterben mért érték 30%-ára csökken és terminusban a csökkent BH4 koncentráció hozzájárulhat az ilyenkor található alacsonyabb placenták
NO-szintáz igen
eltéro
aktivitáshoz. BH4
Az
individuális
koncentrációja
abban
a
tartományban változik, ami az enzimaktivitást jelentosen befolyásolni képes. Ebbol következik, hogy a BH4 a placentáris NO szintáz aktivitás fontos szabályozó tényezoje lehet. A „BH4 -rezisztens” preeclampsiás lepényekben az NOszintáz lehetséges szerkezeti változására visszavezetheto megváltozott BH4 iránti affinitása állhat a BH4 koncentráció emelés hatására elmaradó enzimaktivitás növekedés mögött. Elképzelésünk szerint az enzimaktivitás BH4 rezisztenciája, valamint
az
oxigén
redukció
és
az
arginin
oxidáció
következményes szétkapcsolódása sokkal fontosabb szerepet játszhat a preeclampsia etiológiájában és patogenezisében, mint az NO-szintáz aktivitás abszolút értéke. A placenta NO-szintáz aktivitása preeclampsiában gyakran a normálisnál magasabb. Ez a magasabb NO-szintáz aktivitás a BH4 rezisztenciával és a valószinu szétkapcsolódással társulva fokozott szuperoxid és 10
peroxinitrit
termelésen
keresztül
oxidatív
stresszt
eredményezhet. Abból, hogy a BH4 hatására fokozódó aszkorbát oxidációnak egy részét a kataláz nagy koncentrációi is csak részben képesek kivédeni, arra következtethetünk, hogy az aszkorbátot a BH4 elsodleges oxidációs terméke, a kinoidális BH2 (qBH2 ) közvetlenül (azaz közbülso termék nélkül) oxidálni képes, miközben saját maga BH4 -gyé redukálódik vissza. Ez azért is valószínu mert irodalmi adatok szerint a BH2 -t az aszkorbát nem képes redukálni és ezért kísérleti körülményeink között az aszkorbát számára a kinoidális BH2 lehet az egyetlen potenciális redox reakció partner . Azokból az eredményeinkbol, melyek szerint az Arrhenius féle aktiválási energiák közel azonosak akár aszkorbát
jelenlétében,
akár
anélkül
történik
a
BH4
autooxidációjának mérése, arra következtetünk, hogy a BH4 autooxidációja egy kisebb sebességi konstanssal jellemezheto, lassúbb reakció,
mint
a
BH4
képzodés qBH2 -bol és
aszkorbátból. Ebbol következik, hogy a BH4 autooxidációja a ciklikus redox reakció leglassúbb, sebesség- meghatározó lépésének tekintheto. Kataláz azért képes az aszkorbát hatás potenciálására, mert a hidrogénperoxid gyors eltávolításával védi az aszkorbátot az oxidációtól és kedvez a magasabb 11
aszkorbát szint fenntartásának. Az aktiválási energiák, az hogy az aszkorbát alacsony koncentrációban is hatékony, valamint az elso és a harmadik trimeszterbol nyert placenták viszonylag magas aszkorbát koncentrációi arra utalnak, hogy az aszkorbát normális placentában eloforduló koncentrációi képesek a BH4 autooxidáció gyors ellensúlyozására.
Következtetések: 1. Összehasonlítottuk a normális elso trimeszterbeli és a terminus
körüli
placentából
származó
eNOS
enzim
aktiválásához szükséges BH4 koncentrációkat a BH4 szöveti koncentrációjával és megállapítottuk, hogy a terhesség során a BH4 koncentráció csökkenése valamint egyéni variációja jelentos különbségeket okozhat az eNOS aktivitásában. 2.
Tíz
preeclampsiás
terhességbol
származó
terminuskörüli placentában is megvizsgáltuk a BH4 szintet, és az eNOS aktivitás BH4 koncentráció függését. A tízbol hét esetben az eNOS enzim csökkent aktiválhatóságát találtuk, amit a BH4 koncentráció különbségével nem lehet magyarázni. Felteheto, hogy a preeclampsiák egy részében az eNOS BH4 kötésének defektusa hozzájárul a szuperoxid, hidrogénperoxid és peroxinitrit fokozott képzodéséhez és az oxidatív stressz kialakulásához. 12
3. Mivel az eNOS enzim aktivitását a placenta BH4 koncentrációja jelentosen befolyásolja, minden olyan kémiai folyamat, ami a BH4 szintet stabilizálja, fontos lehet a fetoplacentáris és maternoplacentáris perfúzió fenntartásában. Ilyen
stabilizáló
faktor
az
aszkorbát,
ami
in
vitro,
fiziológiáshoz közel álló körülmények között növeli az eNOS aktivitását. 4.
Fiziológiás
koncentrációjú
aszkorbát
BH4
stabilizálására kifejtett hatásának mechanizmusát, egy általunk kidolgozott spektrofotometriás módszerrel lehet vizsgálni. 5. Megállapítottuk, hogy az aszkorbát elsosorban a kinoidális
BH2
(qBH2 )
közvetlenül
BH4 -gyé
történo
redukálásával stabilizálja a BH4 koncentrációt, de ehhez hozzájárul a BH4 autooxidációja során képzodo H2 O2 eltávolítása is. 6.
Megállapítottuk,
hogy
kataláz
potenciálja
az
aszkorbát BH4 koncentrációt stabilizáló hatását, mert a BH4 autooxidációja során képzodo H2 O2 lebontásával kivédi az aszkorbát oxidációját és hozzájárul a hatékony aszkorbát szint fenntartásához.
13
Az értekezés témájával összefüggo publikációk:
Cikkek: 1.
Valent S., M. Tóth. Spectrophotometric analysis of the
protective effect of ascorbate against spontaneous oxidation of tetrahydrobiopterin in aqueous solution: kinetic characteristics and potentiation by catalase of ascorbate action. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 36(7):1266-80, 2004. IF: 3,044 (2002-ben) 2.
Tóth M., Z. Kukor, S. Valent. Chemical stabilization of
tetrahydrobiopterin
by
L-ascorbic acid: contribution to
placental nitric oxide synthase III activity. Molecular Human Reproduction. 8(3):271-80, 2002. IF: 2,968 3.
Kukor Z., S. Valent, M. Tóth. Regulation of nitric oxide
synthase activity by tetrahydrobiopterin in human placentae from
normal
and
preeclamptic
21(8):763-72, 2000. IF: 2,587
Idézheto absztraktok:
4.
Eloadások és poszterek:
9.
14
pregnancies.
Placenta.
A disszertáció témájával nem összefüggo publikációk:
Cikkek: 1.
Tóth P., H. Lukács, G. Gimes, A. Sebestyén, S. Valent,
N. Pásztor, A. Pajor, Ch.V. Rao, F. Paulin. The role of LH/hCG receptors in premature delivery. Magyar Noorvosok Lapja. 66(2):95-9, 2003. 2.
Regéczy N., S. Valent, L, Kormos, M. Hajdu, L.
Gopcsa, K. Pálóczi. Telomere length analysis on cord blood cells by the flow-FISH method. Haematologia. 32(3):265-9, 2002. IF: 0,293 3.
Gimes G., S. Valent. Clinical experiences with a
gestodene containing oral contraceptive. Acta Pharmaceutica Hungarica. 68(5):289-93, 1998.
Könyvrészlet: Valent S. Veszélyeztetett terhesség Rh isoimmunisatio miatt. In Betegségenciklopédia, Ed: Kornya L. Springer Tudományos Kiadó Kft. Budapest, Vol. 2: 1151-2, 2002.
Idézheto absztraktok:
13.
Eloadások és poszterek:
48. 15
16
