SEMMELWEIS EGYETEM DOKTORI ISKOLA

SEMMELWEIS EGYETEM DOKTORI ISKOLA MOLEKULÁRIS ORVOSTUDOMÁNYOK (MULTIDISZCIPLINÁRIS ORVOSTUDOMÁNYOK) TUDOMÁNYÁGI DOKTORI ISKOLA Vezeto: Dr. Mandl József egyetemi tanár

Ph.D. értekezés

CSIKÓS MÁRTA

A humán molekuláris genetika és géndiagnosztika alapjai címu program

Programvezeto: Dr. Falus András egyetemi tanár Témavezeto:

Dr. Kárpáti Sarolta egyetemi tanár

1

EPIDERMOLYTICUS GENODERMATOSISOK MOLEKULÁRIS GENETIKAI VIZSGÁLATA

Dr. Csikós Márta

Budapest, 2003.

Programvezeto:

Dr. Falus András egyetemi tanár

Témavezeto:

Dr. Kárpáti Sarolta egyetemi tanár

Opponensek:

Dr. Remenyik Éva egyetemi docens Dr. Darvas Zsuzsanna egyetemi docens

A bíráló bizottság elnöke:

Dr. Lapis Károly egyetemi tanár

A bíráló bizottság tagjai:

Dr. Marschalkó Márta egyetemi docens Dr. Bodó Imre foorvos

2

TARTALOMJEGYZÉK 1

BEVEZETÉS ..................................................................................................................................................................... 11 1.1 A GENODERMATOSISOK MOLEKULÁRIS GENETIKAI VIZSGÁLATAINAK HELYE A TUDOMÁNYÁG EGÉSZÉBEN..11 1.2 M OLEKULÁRIS GENETIKAI VIZSGÁLATOK HELYE ÉS JELENTOSÉGE A DERMATOLÓGIÁBAN ...............................11

2

SPECIÁLIS CÉLKITUZÉSEK.................................................................................................................................... 12

3

A KUTATÁS HÁTTERE............................................................................................................................................... 14 3.1 A KUTATÁS MOLEKULÁRIS BIOLÓGIAI HÁTTERE .......................................................................................................14 3.1.1

A keratinok molekuláris biológiája .................................................................................................................. 14

3.1.1.1

A keratinok funkciója ........................................................................................................................................14

3.1.1.2

A keratinok szerkezete......................................................................................................................................14

3.1.1.3

A terminális differenciáció, programozott keratinexpresszió...........................................................................17

3.1.1.4

A keratinok réteg- és régióspecifikus megoszlása.............................................................................................18

3.1.1.5

Kromoszomális organizáció, keratin gén struktúra...........................................................................................19

3.1.2

A bor bazálmembránzónájának molekuláris biológiája ............................................................................... 20

3.1.2.1

A dermo-epidermális junkció feladatai és szerkezete.......................................................................................20 3.1.2.1.1

Cytoskeletális intermedier filamentumok: keratin 5/14 –KRT5/14 gének .....................................24

3.1.2.1.2

Hemidesmosomák: plectin 1-PLEC1gén ........................................................................................24

3.1.2.1.3

Anchor filamentum: XVII. kollagén (BP180)– COL17A1 gén, laminin 5 – LAMA3, LAMB3,

LAMC2 gének; ? 6? 4 integrin-ITGA6/ITGB4 gének..................................................................................................24 3.1.2.1.4

Anchor fibrillum: VII. kollagén – COL7A1 gén.............................................................................25

3.2 A Z EPIDERMOLYTICUS GENODERMATOSISOK KLINIKAI MEGJELENÉSI FORMÁI ....................................................27 3.2.1

Keratin mutációk okozta örökletes borbetegségek ........................................................................................ 27

3.2.1.1

A stratum basale keratinjainak mutációi: epidermolysis bullosa simplex.........................................................29

3.2.1.2

A stratum spinosum keratinjainak mutációi: bullosus congenitalis ichthyosiform erythroderma /

epidermolyicus hyperkeratosis..........................................................................................................................................29 3.2.1.3

A BCIE/EH epidermalis naevoid formája.........................................................................................................30

3.2.1.4

A stratum spinosum és granulosum keratinjának mutációja: ichthyosis bullosa Siemens................................30

3.2.1.5

A tenyéri-talpi keratinok mutációi: palmoplantaris keratodermák....................................................................31 3.2.1.5.1

Nem-epidermolyticus palmoplantaris keratodermák......................................................................31

3.2.1.5.2

Epidermolyticus palmoplantaris keratoderma.................................................................................32

3.2.1.6

A köröm keratinok mutációi: pachyonychia congenita.....................................................................................32

3.2.1.7

A haj keratinok mutációi: monilethrix...............................................................................................................33

3.2.2

Epidermolysis bullosa csoport .......................................................................................................................... 33

3.2.2.1

Epidermolysis bullosa simplex..........................................................................................................................36

3.2.2.2

Hemidesmosomális (pseudojunkcionális) variánsok.........................................................................................38

3.2.2.3

Epidermolysis bullosa junctionalis ....................................................................................................................39

3.2.2.4

Epidermolysis bullosa dystrophica....................................................................................................................40

3.2.2.5

Az epidermolysis bullosa szövodményei..........................................................................................................42 3.2.2.5.1

Cutan komplikációk ........................................................................................................................42

3

3.2.2.5.2 3.2.2.6

3.2.3

4

Extracutan komplikációk, szisztémás tünetek ................................................................................42

Differenciáldiagnosztika: a DEJZ komponenseinek autoimmun betegségei ....................................................43

Egyéb epidermolyticus genodermatosisok ...................................................................................................... 45

3.2.3.1

Pemphigus familiaris benignus (Hailey-Hailey betegség) ................................................................................45

3.2.3.2

Dyskeratosis follicularis (Darier betegség) .......................................................................................................45

KLINIKAI ADATOK, ANYAG ÉS MÓDSZER..................................................................................................... 46 4.1 BETEGEK KLINIKAI ADATAI ..........................................................................................................................................46 4.1.1

Klinikai adatok, a kutatás etikai vonatkozásai............................................................................................... 46

4.1.2

Epidermolyticus palmoplantaris keratoderma ............................................................................................... 46

4.1.2.1

4.1.3

EPPK/1..............................................................................................................................................................46

Epidermolysis bullosa simplex.......................................................................................................................... 47

4.1.3.1

EBS-DM /1........................................................................................................................................................47

4.1.3.2

EBS-DM/2.........................................................................................................................................................48

4.1.3.3

EBS –WC/1 .......................................................................................................................................................48

4.1.4

Epidermolysis bullosa dystrophica................................................................................................................... 49

4.1.4.1

EBD/1................................................................................................................................................................49

4.1.4.2

EBD/2................................................................................................................................................................50

4.1.4.3

EBD/3................................................................................................................................................................50

4.1.4.4

EBD/4................................................................................................................................................................50

4.1.4.5

EBD/5................................................................................................................................................................50

4.1.4.6

EBD/6................................................................................................................................................................50

4.1.4.7

EBD/7................................................................................................................................................................51

4.1.5

Kontrollok ............................................................................................................................................................. 53

4.2 M ÓDSZEREK ....................................................................................................................................................................53 4.2.1

Családfa feltérképezése, öröklodésmenet vizsgálat ....................................................................................... 53

4.2.2

Klasszifikáció ....................................................................................................................................................... 54

4.2.3

Hisztopatológia .................................................................................................................................................... 54

4.2.4

Antigén mapping.................................................................................................................................................. 54

4.2.5

Ultrastrukturális elemzés.................................................................................................................................... 55

4.2.6

DNS-izolálás......................................................................................................................................................... 55

4.2.6.1

Salting out..........................................................................................................................................................55

4.2.6.2

DNS preparáló kit..............................................................................................................................................55

4.2.7

PCR amplifikáció................................................................................................................................................. 55

4.2.8

Heteroduplex analízis, konformációszenzitív gél-elektroforézis ................................................................. 56

4.2.9

Automata szekvencia analízis............................................................................................................................ 57

4.2.10 Mutációverifikálás restrikciós endonukleázok segítségével......................................................................... 58 5

EREDMÉNYEK................................................................................................................................................................ 59 5.1 EPIDEMIOLÓGIAI MEGFIGYELÉSEK...............................................................................................................................59 5.2 M ORFOLÓGIAI EREDMÉNYEK (HISZTOPATOLÓGIA, ANTIGÉN MAPPING, ULTRASTRUKTÚRA ).............................60 5.2.1

Szuprabazális epidermolysis: EPPK ................................................................................................................ 60

5.2.2

Bazális epidermolysis: EBS ............................................................................................................................... 61

4

5.2.3

Szubbazális epidermolysis (dermolysis): EBD................................................................................................ 62

5.2.4

Új komplikáció: pulmonális sekunder amyloidosis ....................................................................................... 64

5.3 M OLEKULÁRIS GENETIKAI EREDMÉNYEK ...................................................................................................................66 5.3.1

KRT9 mutáció....................................................................................................................................................... 66

5.3.1.1

5.3.2

KRT14 mutációk .................................................................................................................................................. 67

5.3.2.1

EBS-DM/1.........................................................................................................................................................67

5.3.2.2

EBS-DM/2.........................................................................................................................................................68

5.3.2.3

EBS-WC/1.........................................................................................................................................................70

5.3.3

6

EPPK/1..............................................................................................................................................................66

COL7A1 mutációk ............................................................................................................................................... 70

5.3.3.1

EBD/1................................................................................................................................................................70

5.3.3.2

EBD/2................................................................................................................................................................72

5.3.3.3

EBD/3................................................................................................................................................................73

5.3.3.4

EBD/4-5-6-7......................................................................................................................................................75

5.3.3.5

A 425A? G, K142R ismétlodo mutáció populációgenetikai vizsgálata...........................................................81

MEGBESZÉLÉS .............................................................................................................................................................. 82 6.1 M OLEKULÁRIS GENETIKAI VIZSGÁLATOK GENODERMATOSISOKBAN ....................................................................82 6.2 GENOTÍPUS-FENOTÍPUS KORRELÁCIÓ..........................................................................................................................82 6.2.1

KRT9 mutáció – epidermolyticus palmoplantaris keratoderma.................................................................. 83

6.2.2

KRT14 mutációk – epidermolysis bullosa simplex ........................................................................................ 85

6.2.3

COL7A1 mutációk – epidermolysis bullosa dystrophica.............................................................................. 87

6.3 ÚJ KOMPLIKÁCIÓ: PULMONÁLIS AMYLOIDOSIS..........................................................................................................92 7

A MUNKA JELENTOSÉGE ÉS AZ EREDMÉNYEK HASZNOSÍTÁSA..................................................... 93 7.1 A GENODERMATOSISOK MOLEKULÁRIS GENETIKAI VIZSGÁLATAINAK JELENTOSÉGE .........................................93 7.2 GENETIKAI TANÁCSADÁS ..............................................................................................................................................93 7.3 PREVENCIÓ. PRENATÁLIS DIAGNOSZTIKA ..................................................................................................................93 7.3.1

Fetoscopia, fetalis bor biopszia ........................................................................................................................ 94

7.3.2

Chorionboholy biopszián ill. genetikai amniocentézisen alapuló DNS diagnosztika.............................. 94

7.3.3

Preimplantációs diagnosztika........................................................................................................................... 94

7.4 SZOMATIKUS GÉNTERÁPIA ............................................................................................................................................94 7.5 A GENODERMATOSISOK MOLEKULÁRIS GENETIKAI VIZSGÁLATAINAK TOVÁBBI PERSPEKTÍVÁI .......................96 7.5.1

Új gének vizsgálatainak bevezetése.................................................................................................................. 96

7.5.2

Új technológiák bevezetése................................................................................................................................ 96

7.5.3

Egyéb kutatási területek ..................................................................................................................................... 96

8

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS ....................................................................................................................................... 98

9

IRODALOM....................................................................................................................................................................100

10

AZ ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁBAN MEGJELENT KÖZLEMÉNYEK.............................................................113 10.1 A Z ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁBAN MEGJELENT KÖZLEMÉNYEK.......................................................................................113

5

10.2 A Z ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁBAN MEGJELENT POSZTER ÉS ELOADÁSKIVONATOK ......................................................114 10.3 A Z ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁHOZ KÖZVETLENÜL NEM KAPCSOLÓDÓ KÖZLEMÉNYEK ................................................115 10.4 A Z ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁHOZ KÖZVETLENÜL NEM KAPCSOLÓDÓ MEGJELENT POSZTER ÉS ELOADÁSKIVONATOK 115

6

Összefoglalás

Epidermolyticus genodermatosisok molekuláris genetikai vizsgálata

Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Molekuláris Orvostudományok (Multidiszciplinális Orvostudományok) Tudományági Doktori Iskola Vezeto: Dr. Mandl József egyetemi tanár

Dr. Csikós Márta Programvezeto:

Dr. Falus András egyetemi tanár, Ph.D., D. Sc., MTA tag

Témavezeto:

Dr. Kárpáti Sarolta egyetemi tanár, Ph.D., D. Sc.

A humán molekuláris genetika és géndiagnosztika alapjai címu program Budapest, 2003.

Az értekezés témája az epidermolyticus genodermatosisok klinikai és molekuláris genetikai vizsgálata. Ezekben az örökletes borgyógyászati kórképekben a borön és a nyálkahártyákon mechanikai stresszt követoen vagy látszólag spontán hólyagok képzodnek. Egyes formáihoz elszarusodási zavar társul. Jelen disszertációban a cytokeratin 9 (KRT9), cytokeratin 5 és 14 (KRT5/14), valamint a VII. kollagén (COL7A1) gének mutációinak heteroduplex analízisen alapuló vizsgálatát foglalom össze. Fenotípusukat tekintve az epidermolyticus palmoplantaris keratoderma (EPPK) valamint az epidermolysis bullosa simplex (EBS) és epidermolysis bullosa dystrophica (EBD) domináns és recesszív kórformáival foglalkoztam. Egy EPPK által több generációjában érintett család esetében a tenyéri-talpi hám szuprabazális sejtjeiben expresszálódó keratin 9 génjében (KRT9) új 479A? T, N160I mutációt azonosítottam. Hazánkban

elsoként

végeztem

molekuláris

genetikai

vizsgálatokat

a

bazális

keratinocytákban kifejezodo KRT5 és KRT14 génekben. Két, az EBS legsúlyosabb formájában, a Dowling-Meara variánsban szenvedo betegben a keratin 14 konzervatív, aminoterminális végén (ún. helix iniciációs motívum) a 369T? A, N123K és a 373C? G, R125G új, missense 7

mutációkat azonosítottam. Az enyhébb, tenyéri-talpi tünetekkel járó Weber-Cockayne variánsban e régión kívül új, 397 G? T, V133L mutációt találtam. Az EBD különféle altípusaiban érintett családok eseteiben (n=43) számos új VII. kollagén gén (COL7A1) mutációt azonosítottam. Jelentos és a mutáció detekciós stratégiát befolyásoló megfigyelés a közép-európai EBD beteg populációban mintegy 12,8%-os gyakorisággal eloforduló rekurráló 425A? G, K142R splice site mutáció. Az epidermolyticus betegek gondozását végzo klinikusok számára jelentos az a megfigyelésünk, miszerint az állandó sebképzodéssel küszködo COL7A1 mutációt hordozó betegeknél számos cutan és extracutan komplikáció alakulhat ki, közöttük az elsoként általunk megfigyelt szekunder reaktív (AA típusú) pulmonaris amyloidosis.

8

Summary

Molecular genetic studies in epidermolytic genodermatoses Semmelweis University Ph.D. School Molecular Medicine Chairman: Prof. József Mandl MD., Ph.D., D.Sc.

Márta Csikós M.D. Leader of the program: Prof. Dr. András Falus Ph.D., D.Sc. Corresponding member of the Hungarian Academy of Sciences Tutor:

Prof. Dr. Sarolta Kárpáti M.D., Ph.D, D.Sc.

Basis of the Human Molecular Genetics and Gene Diagnostics Budapest, 2003.

Clinical and molecular genetical studies in different epidermolytic genodermatoses are presented. These inheritable skin diseases are characterized by blister formation of the skin and mucous membranes induced by mechanical stress. In some cases abnormal keratinisation is also present. This study presents several novel mutations in the KRT9, KRT5/14 and COL7A1 genes based on the strategy of heteroduplex analysis introduced as a novel method in our laboratory. In terms of phenotypes, clinical and ultrastructural features of epidermolytic palmoplantar keratoderma (EPPK), epidermolysis bullosa simplex (EBS) as well as dominant and recessive forms of dystrophic epidermolysis bullosa (EBD) are discussed. In one large family with EPPK the novel 479A? T, N160I mutation of the KRT9 gene was identified. The first molecular genetic studies from Hungary on the KRT5/14 genes are also presented. In two patients with the most severe form of EBS (Dowling-Meara) two novel missense mutations (369T? A, N123K and 373C? G, R125G) were detected in the evolutionary

9

conserved aminoterminal end of the KRT14 gene. In the milder Weber-Cockayne variant form of EBS the novel 397G? T, V133L mutation was found in KRT14. In families affected by different subtypes of EBD many novel mutations were identified in the large COL7A1 gene. One of them, the 425A? G, K142R splice site mutation, was present in 12,8% of the Central European EBD population. This observation may change the of COL7A1 mutation strategy screening in this geographical area. Various cutaneous and extracutaneous complications in patients carrying COL7A1 mutations, such as secondary reactive pulmonary amyloidosis, described by our group in EBD, are also included. These informations are of importance for clinicians taking care of EB patients.

10

1 Bevezetés

1.1 A genodermatosisok molekuláris genetikai vizsgálatainak helye a tudományág egészében Az öröklodo borgyógyászati megbetegedések, a genodermatosisok vizsgálata sajátos helyet foglal el a molekuláris genetikai kutatások körében. Az életminoséget nagymértékben befolyásoló, és gyakran magát az életet is veszélyezteto örökletes borbetegségek korán az érdeklodés középpontjába kerültek. Az elszarusodási zavarhoz és/vagy hólyagképzodéshez vezeto elváltozások célszerve, a bor valamint függelékei, könnyen hozzáférheto és tanulmányozható modellrendszer. Számos genodermatosist extracutan tünetek is kísérnek, összhangban azzal, hogy a humán bor strukturális felépítése és élettani folyamatai sok hasonlóságot mutatnak egyéb szervekével. Egy közös célmolekula hiánya, vagy kóros struktúrája több szerv és szövet kóros elváltozásának közös oka lehet. Különös jelentosége van ezért a bor bazális membránjának, a dermo-epidermális kohéziót biztosító, komplex és hierarhizált dermo-epidermális junkciónak, melynek borspecifikus molekulák mellett számos multiquiter

struktúrprotein

is

alkotója.

A

bazálmembránok

kóros

muködésének

tanulmányozásával általános érvényu új összefüggéseket tárhatunk fel. A bor elszarusodási folyamataiban dönto szerepet játszó cytoskeletális intermedier filamentum fehérjék expressziós mintázata az embriogenesis során megváltozik, valamint késobbi kifejezodése sajátos szerv, régió és rétegspecifikus eloszlást mutat. A sejtarchitektúra ezen meghatározó molekuláinak vizsgálata ezért szélesköru új ismeretekkel szolgálhat.

1.2 Molekuláris genetikai vizsgálatok helye és jelentosége a dermatológiában A csecsemo- és gyermek-borgyógyászati epidemiológiai adatokat figyelembe véve, néhány százra teheto Magyarországon azon családok száma, melynek tagjai örökletes epidermolyticus borgyógyászati megbetegedésben szenvednek. Joggal merült fel az igény az utóbbi években egyes mendeli módon öröklodo monogénes betegségek hátterében azonosított betegség gének hazai molekuláris genetikai vizsgálatára. Az eredmények bizonyos esetekben a klinikailag sejtheto diagnózis egzakt felállításához is hozzásegítenek, ezért a prognózis megítélésében a klinikus segítségére lehetnek, módot adhatnak a DNS alapú prenatális diagnózis révén a prevencióra, és alapul szolgálhatnak a napjainkban egyre elérhetobb közelségbe jutó szomatikus génterápiához is.

11

2 Speciális célkituzések

A genodermatosisok által érintett családok ill. betegek DNS és szövetmintáinak, vizsgálati eredményeinek összegyujtése, regiszterbe rendezése a részletes genetikai vizsgálatok alapfeltétele. A rendelkezésre álló nagyszámú adat epidemiológiai következtetések levonására alkalmas, és a világ más régióinak eredményeivel való összehasonlításra ad lehetoséget. A genodermatosisokban szenvedo betegek klasszifikációjához a részletes klinikai vizsgálaton és a fenotípus pontos rögzítésén kívül a pedigré analízise, részletes családi anamnézis, valamint borbiopsziás mintavétel (fénymikroszkópos hisztológiai, immunfluoreszcens antigén mapping és elektronmikroszkópos elemzések céljából) szükséges. A vizsgálatok együttes értékelése teszi lehetové a pontos klinikai besorolást. Az öröklodésmenet, a borpatológiai elemzések jelzik, hogy melyik fehérje hiányzik vagy károsodott. Mindezen eredmények együttes értékelése alapján kerülhet sor a károsodott molekula genetikai vizsgálatára. A munka elvégzéséhez szükséges technikai és technológiai háttér megteremtése is a feladatom volt. DNS bankunk állományát a korábban bevezetett módosított salting out módszer mellett a kis mennyiségu vér és szövetminták feldolgozását is lehetové tevo kitek alkalmazásával gazdagítottam. Feladatom volt laborunkban a PCR (polimeráz láncreakció) és RFLP (restrikciós fragmens hosszpolimorfizmus) technológia bevezetése, valamint németországi tanulmányutam alatt elsajátítani és Magyarországon adaptálni a mutációszurésnek a borgyógyászati genetikában sikerrel alkalmazott módszerét, a konformáció szenzitív gél-elektroforézissel (CSGE) végzett heteroduplex analízist. Munkám célja az epidermolyticus genodermatosisok klinikai és genetikai hátterének vizsgálata, mutációanalízis, DNS alapú prenatális diagnosztika elokészítése volt. Jelen disszertációban a cytokeratin 9 (KRT9), cytokeratin 5 és 14 (KRT5/14) valamint a VII. kollagén (COL7A1)

gének

mutációinak

analízisét

foglalom

össze.

Fenotípusukat

tekintve

az

epidermolyticus palmoplantaris keratoderma valamint az epidermolysis bullosa simplex és dystrophica domináns és recesszív kórformáival foglalkoztam. Az epidermolyticus palmoplantaris keratoderma (Vörner variáns) betegség génje a cytokeratin 9 (KRT9). Ezen fenotípus hátterében számos mutáció vált ismertté napjainkig, dominálóan a keratin fehérje aminosavszekvenciáját tekintve konzervatív, evolucionálisan állandó 1A domén aminoterminális részén. Célunk volt egy EPPK által több generációjában érintett család esetében a KRT9 gén mutációanalítikai szempontból kritikus, 1. exonának részletes analízise. 12

Hazánkban

elsoként

végeztem

molekuláris

genetikai

vizsgálatokat

a

herediter

epidermolysis bullosa csoport két altípusában: az epidermolysis bullosa simplex legsúlyosabb formájában, a Dowling-Meara variánsban és a lokalizált tünetekkel rendelkezo Weber-Cockayne variánsban a keratin 5 és 14 génjeinek, a KRT5 és KRT14-nek a genetikai eltéréseit azonosítottam. Az epidermolysis bullosa dystrophica betegség génje, a VII. kollagén gén (COL7A1), egyike a leghosszabb humán géneknek. Napjainkig több mint 200 mutációja vált ismertté, melyek legtöbbje individuális, családspecifikus. Rekurráló mutációira kevés adat van. Munkám célja az epidermolysis bullosa dystrophica különféle altípusaiban érintett családok eseteiben új mutációk azonosítása és további, összességében 43, magyar-német munkacsoportunk által vizsgált DEB beteg genotípusának analízise. Ezen munkám során sikerült egy, a közép-európai régióban nagy gyakorisággal eloforduló mutációt azonosítanom. Tekintettel a vizsgált gén nagyságára, megfigyelésünk Közép-Európában a késobbiekben a COL7A1 gén mutáció szurésének stratégiai változáshoz vezethet.

13

3 A kutatás háttere

3.1 A kutatás molekuláris biológiai háttere 3.1.1

A keratinok molekuláris biológiája

3.1.1.1 A keratinok funkciója Az epidermális eredetu szöveteknek, így a bornek és függelékeinek is a legfontosabb strukturális fehérjéi az intermedier filamentumok családjába tartozó keratinok, melyek a keratinocyták felépítésében a legnagyobb arányban vesznek részt. A keratinok alkotják ezen sejtek mechanikus védofunkcióját biztosító háromdimenziós intracytoplasmatikus hálózatot, a cytoskeletont. A keratin filamentumkötegek a sejtmagtól húzódnak a desmosomákig és a hemidesmosomákig, ezáltal behálózzák a sejtet, és stabilizálják az epidermis sejtközötti összeköttetéseit (1). Bizonyos fehérjéket, mint pl. a filagrint, trichohyalint, a glicin- és tirosingazdag proteint, a szulfátgazdag proteint, az okuribint (az I. típusú keratin filamentumok és a nucleáris envelop közötti kapcsolófehérjét) intermedier filamentum asszociált proteineknek (IFAP) nevezik. Biztosítják a keratin filamentumok desmosomákhoz és hemidesmosomákhoz való kapcsolódását, valamint a sejtarchitektúra kialakításában vesznek részt (2).

3.1.1.2 A keratinok szerkezete Az aminosavösszetétel, a kémiai reakciók és az oldhatóság alapján a keratinok a kollagénnel együtt a scleroproteinek osztályába tartoznak. Nagy mennyiségben tartalmaznak kéntartalmú

aminosavat,

ciszteint,

amely

diszulfidkötései

révén

a

polipeptidláncok

összetartásában szerepel. A kialakult diszulfidhidaknak tulajdonítható a keratin különbözo fizikai és kémiai behatásokkal szembeni nagyfokú ellenállása. A keratin ? és ? konformációja fehérje térszerkezet vizsgálatok modellje. (3) Több, mint 30 cytokeratint (softkeratint) és kemény vagy haj/köröm keratint (ún. trichocytokeratint) izoláltak mostanáig, és valószínu, hogy továbbiak elkülönítésére is sor kerül majd. A különbözo keratinokat betukkel és számokkal azonosítják, a cytokeratinok K-, a haj és körömkeratinok H-jelölést kaptak. A keratinok két nagy csoportba oszthatók. Az I. típusú keratinok (K9-K20 és Ha trichocytokeratin) savas vegyhatásúak (pKi 4-7) és kisebb molekulatömeguek (40-63 kDa). A II. típusú keratinok (K1-K8 és Hb trichocytokeratin) 14

bázikusak (pKi 7-9) és nagyobb molekulatömeguek (44-67 kDa). Egy keratin filamentumot mindig egy I. és egy II. típusú keratinpár épít fel, ún. heterodimereket alkotva. Ezért minden sejt legalább két különbözo keratint termel, melyek szövet-, réteg- és régióspecifikus módon, együttesen expresszálódnak (1, 4). Mint minden intermedier filamentum, így a keratinok is jellemzo molekulaszerkezetet mutatnak: fej (head) - bot (rod) - farok (tail) doménekbol állnak (1. ábra). Középso, ? -helikális struktúrájú elemüket, két, vele szomszédos globuláris N-terminális (fej) és C-terminális (farok) szakasz határolja. A keratin molekula centrális magját a bot domén alkotja, míg a sejtkomponensekkel a határoló domének tartanak kapcsolatot. A centrális ? -helikális domén 310-350 aminosavból áll, szerkezete 4 ? -helikális szegmensre tagozódik: 1A, 1B, 2A és 2B-re. Az ismétlodoen, minden 7. pozícióban hydrophob töltésu aminosavak beépülése és internalizációja miatt a keratin molekula felcsavarodik és speciális röntgendiffrakciós formát mutat. Az ismétlodo aminosav-heptád motívumok sajátságos töltéseloszlása révén alakul ki egy I. és egy II. típusú polipeptidláncból laterális asszociációval a ”csavart csavar” (coiled-coil) szerkezetu heterodimer szuperhélix molekula (5, 6). Könnyen elképzelheto, hogy ha egy kulcspozícióban levo aminosav génmutáció miatt eltéro töltésuvel helyettesítodik, vagy kiesik, megbomlik a helikális alakzat és a keratin filamentum struktúrája fellazul, szétesik. Az ún. helix iniciációs motívum, az 1A domén N-terminális végén figyelemreméltó evolúciós állandóságot mutat. A helix szegmentumokat nem helikális szerkezetu összeköto régiók szakítják meg, ezek adják az ? -helikális domén hajlékonyságát: L1, L12 és L2. A C-terminális és N-terminális domének részei a helix határoló peptidek: E1, V1, H1 és H2 (csak a II. típusú keratinban), továbbá V2 és E2. (1, 4, 7).

15

1. ábra. Az I. és II. típusú keratin intermedier filamentumok szerkezete. A helix iniciációs motívum az 1A domén aminoterminális végén (zöld).

A keratin szerkezetének kétdimenziós modellje után a háromdimenziós modell is megszületett (2. ábra). A dimer láncok antiparalel lefutással, axiális, end-to-end módon kapcsolódva 45-50 nm hosszú, pálca alakú tetramert alkotnak, végül ezek az egységek szupramolekuláris komplexekbe szervezodnek. Elektronmikroszkópos kvantitatív mérések azt mutatták, hogy az intakt keratin intermedier filamentumok polimorfok, keresztmetszetükben leggyakrabban 16 szálat tartalmaznak, de 12 és 24 szál között bármilyen variáció elofordulhat. Ezeket a szálakat protofilamentumoknak nevezik (2-3 nm), melyek összessége 3-4 szálból (4-5 nm) álló protofibrillumokat hoz létre. Ez alkotja a 10 nm szélességu keratin intermedier filamentumot. A háromdimenziós szerkezetet meghatározott helyeken kialakult ionos-, hidrogénhíd- és diszulfidkötések stabilizálják (3, 7).

16

2. ábra. A 10 nm átméroju keratin intermedier filamentum háromdimenziós szerkezete

3.1.1.3 A terminális differenciáció, programozott keratinexpresszió A hámsejtek terminális differenciációja az epidermis bazális rétegében kezdodik, majd a bor felszíne felé történo vándorlásuk idején játszódik le. Eközben számos morfológiai és biokémiai változáson mennek keresztül, majd elhalnak, magjukat vesztik és lesodródnak a felszínrol. A bazális sejtek tonofilamentum hálózatát II. típusú K5 és I. típusú K14 alkotja. Ezen keratinok a bazális sejtek fehérjetartalmának 15-25%-át teszik ki. A bazális sejtek differenciálódása során a K5 és K14 termelése abbamarad, ún. down-regulációt szenved, miközben új, a differenciációra specifikus keratinok termelodnek. Szuprabazálisan II. típusú K1, valamint I. típusú K10 expresszálódik. A stratum spinosum alsó szintjén a keratinok még vegyesen vannak jelen: a maradék K5 és K14 és az újonnan szintetizálódott, differenciációra specifikus keratinok a K1 és K10. A stratum spinosum sejtjei a felszín felé tartó útjuk során fehérjeszintetizáló apparátusuk kapacitásának mind nagyobb részét fordítják a keratin szintézisére. A keratinok a fehérjék mind nagyobb hányadát teszik ki, végül a teljesen differenciált, desquamálódó részben a K1 és K10>85%-os arányban vannak jelen a proteinek között. A tenyér és talp borének szuprabazális rétegében egy járulékos keratin, az I. típusú K9 is megtalálható.

17

A stratum spinosum sejtjeiben egyéb aktív fehérjeszintézis is történik. Egy hisztidingazdag bázikus protein a profilagrin szintetizálódik, melynek proteolítikus származéka a filagrin, a stratum granulosumban a tonofibrillumok összecsapódásában, a keratohyalin granulumok képzésében dönto jelentoségu. Számos egyéb változás is végbemegy a differenciáció késoi fázisában. Lipid tartalmú vesiculák, keratinosomák fuzionálnak a plasmamembránnal és kibocsátják tartalmukat a stratum granulosum és corneum sejtjei közötti résekbe. Ugyanakkor glutamin- és lizingazdag proteinek (envelop-fehérjék) halmozódnak fel a plasmamembránok belso felszínein. Közülük az involucrin már korán (stratum spinosum) megjelenik a differenciáció során, míg a loricrin késobb (stratum granulosum) szintetizálódik. Ma úgy gondoljuk, hogy az elszarusodás folyamata a programozott sejthalál, az apoptózis speciális formája. Ebben számos enzim, pl. a más sejtek apoptózisában is szerepet játszó transzglutaminázok (TG) játszanak szerepet. Ilyenkor a destruktív fázisba kerülo sejtbe áramló Ca2+ aktiválja a hámsejtek transzglutamináz enzimeit (TGk-keratinocyta TG, TGcszöveti TG, TGe-epidermális TG), melyek az ?-(?-glutamil) lizin izopeptidkötések létrehozásával összecsapják, tömörítik a fehérjéket. Így kerülnek az envelop-fehérjékkel keresztkötésekbe, pl. a keratohyalin makrofibrillumok is. A folyamatot további litikus enzimek felszabadulása követi, majd a metabolikus aktivitás eltunik. A végso, lelapult squamák csupán sejtvázak, melyeket strukturális makrofibrillumok ékelnek, támasztanak ki. A stratum corneum a lipid és sejtváz alkotórészeivel együtt barriert képez, mely meggátolja a mikroorganizmusok és a testnedvek átjutását (2, 8).

3.1.1.4 A keratinok réteg- és régióspecifikus megoszlása A keratinok jellegzetes réteg- és régióspecifikus megoszlást mutatnak. A több mint 30féle keratin közti különbségekért elsosorban a globuláris domének sokfélesége felelos. Miért van ilyen sok szövetspecifikus keratin? Valószínu, hogy a különbözo hámokban a sejtek cytoskeletonjának különleges követelményeknek kell megfeleljen: a még azonosítatlan feladatú keratin domének ezideig ismeretlen szövetspecifikus funkciót hordozhatnak. Az egyedfejlodés során a keratinok expressziós mintázata változik. A K8 és a K18 az elsoként expresszált keratinok, amik az embrionális, egyrétegu ectodermában megtalálhatóak. Ezek a molekulák a felnott szervezet egyrétegu hámjaiban fellelhetoek, de nem jellemzoek a többrétegu

elszarusodó

hámra.

A

K5

és

K14

molekulák

termelodnek

azokban

a

keratinocytákban, amelyek a mesenchymális sejtekkel állnak kapcsolatban. A felnott szervezetben K5 és K14 molekulák jelenléte elsosorban a proliferáló, bazális sejtekre jellemzo. 18

Egy járulékos, I. típusú keratin, a K15 is expresszálódhat a bazális keratinocytákban. A terminális differenciáció folyamatában a K5, K14 és K15 expressziója down-regulációt szenved és helyettük differenciáció specifikus keratinok termelodnek. Általánosan K1 és K10 van jelen szuprabazálisan, egy járulékos keratin, a K11 mellett. A K2e is szuprabazálisan termelodo keratin, bár expressziója késik K1 és K10-hoz képest, ezért csak a bor legfelso rétegeiben mutatható ki. K9 speciálisan a tenyéri-talpi szuprabazális rétegekre jellemzo molekula. K6 és K16 retinoid kezelést követoen, vagy hyperproliferatív folyamatokban, valamint epidermális eredetu tumorokban jelenik meg (2, 8). A szortüszok keratinmintázata komplexebb, mint az epidermiszé. A külso gyökérhüvely mitotikusan aktív sejtjei K5-öt és K14-et termelnek. A differenciálódó sejtekben, melyek belülre kerülnek, a K6 és K16 expressziója indukálódik, amely az epidermis hyperproliferatív elváltozásaiban is jelenlévo atípusos pár. A belso gyökérhüvelyben K1 és K10 van jelen. A matrix sejtek intermedier filamentum hálózatát kezdetben K9 és K14, majd a differenciáció során megjeleno hajspecifikus Ha és Hb keratinok alkotják. A Ha és Hb keratinokhoz IFAP-ek társulnak, melyek szerepe az intermedier filamentumok makrofibrilláris struktúrába rendezése (1, 2). A keratinok testtájak szerinti megoszlását és a mutációk által okozott genodermatosisokat a 2. táblázat tünteti fel Attól függoen, hogy milyen mértéku a keratin strukturális zavara és hogy melyik keratin károsodott, különbözo örökletes kórképek jönnek létre (4).

3.1.1.5 Kromoszomális organizáció, keratin gén struktúra A keratinok különbözo proteineket magába foglaló heterogén csoportját több, mint 30 különbözo gén kódolja, melyek közül mintegy 18 expresszálódik a borben, ezek kromoszomális lokalizációja ma már ismeretes. A humán keratinokat kódoló gének két zárt, a géneket nagy suruségben tartalmazó csoportban (cluster) helyezkednek el a 12-es és a 17-es kromoszómán. Az I. típusú keratinok génjeit a 17., a II. típusú keratinok és a K18 génjeit a 12. kromoszóma hosszú karján (12q, 17q) lokalizálták. A keratin párok együtt expresszálódnak. A nagy jelentoségu epidermális keratinok közül a K14 és a K10 génjei a 17q12? q21-en helyezkednek el, hasonlóképpen, mint a bor más I. típusú keratinjai. A II. típusú keratinok közül a K5 és a K1 a 12q11? q14 locuson foglalnak helyet (8). Ezen génekben számos mutáció és polimorfizmus vált ismertté napjainkig (1, 4, 7). A feltérképezett mutációk aránytalanul oszlanak meg a fehérjelánc mentén, nagy részük a molekula 19

egyes kitüntetett területén halmozódik. (4). Ismert néhány olyan genetikai hiba is, amit egymástól független populációkban való igen nagyszámú ismétlodése miatt „forró pontnak” (hot-spot) is neveznek. Úgy tunik, hogy a mutációk által gyakrabban érintett régiók aminosavszekvenciája igen fontos, állandó része a keratin fehérjeláncoknak. Egyetlen aminosav szubsztitúciója a funkciójában fontos protein szakaszon belül a keratin struktúra széteséséhez vezet, amely a borben jellegzetes eltéréseket okoz (1, 2, 4). A keratin gének polimorfizmusai a mutációkkal ellentétben klinikai tüneteket nem eredményezo aminosav cserén alapulnak, melyek az egészséges populációban is kimutatható normál variánsoknak tekinthetok.

3.1.2

A bor bazálmembránzónájának molekuláris biológiája

3.1.2.1 A dermo-epidermális junkció feladatai és szerkezete Az epidermális bazálmembránzóna feladata a bazális hámsejteken keresztül az epidermisnek a dermis extracelluláris matrixához való rögzítése, lehorgonyzása, ezáltal a bor integritásának, mechanikai ellenállóképességének biztosítása. A dermo-epidermális junkciós zóna (DEJZ) szupramolekuláris komplexumában számos multiquiter bazálmembrán molekula mellett, sajátosan, csak a humán borre jellemzo komponens is megtalálható. A bor DEJZ-ját a bazális hámsejtek dermális oldalán lévo hemidesmosomák és a bennük rögzülo cytoskeletális intermedier keratin filamentumok, a bazálmembrán lamina lucidáját átívelo anchor filamentumok, a lamina lucida és densa összetevoi valamint a bazálmembrán alatti anchor fibrillumok együttese alkotja (9). Hasonló struktúra építi fel a szájnyálkahártya, a szem, a gasztrointesztinális és a respiratórikus traktus, valamint a placenta bazálmembránjait (10, 11).

20

3. ábra. A dermo-epidermális junkció

A bazálmembránban ultrastrukturálisan elektronátereszto lamina lucida és elektrondenz lamina

densa

különül

el.

A

hemidesmosomák

a

bazális

keratinocyták

dermális

plazmamembránján, mint kis méretu elektrondenz képletek tunnek fel, és befogadják a bazális keratin filamentumokat. A hemidesmosomák bazális felszínérol induló fonalszeru anchoring filamentumok szelik át a lamina lucidát, kapcsolatot teremtve a hemidesmosomák és a lamina densa között. A bazálmembrán dermális felszínén egymással keresztkötésben lévo, a lamina densából kiinduló anchor fibrillumok töltik ki a lamina densa és a papilláris kötoszövet közötti teret. Az anchor komplexum a hemidesmosómákat, anchor filamentumokat és az anchor fibrillumokat foglalja magába. Az anchor komplexum ultrastrukturális egysége a borre egyedülálló módon specifikus aggregátum. Az különálló molekulák termelését, majd makromolekulákká történo hierarchikus összeépülését az epitheliális és mesenchymális sejtek ill. a szintézist reguláló egyéb sejtekbol és az extracelluláris matrixból származó paracrin szignálok irányítják (3. ábra) (9-11).

21

Számos genetikai és szerzett, autoimmun borbetegség célpontjai a dermo-epidermális adhéziós molekulák. Ilyen a herediter epidermolysis bullosa csoport és a különféle a DEJZ komponensei ellen irányuló autoantitestekkel jellemezheto akvirált hólyagos borbetegségek.

22

1. táblázat. A DEJZ molekuláris komponensei. (K: keratinocyta, F: fibroblaszt)

Molekula

Szintézis

Speciális jellemzo

Intermedier filamentum komponens Keratin 5

K

dimer? intermedier filamentum

Keratin 14

K

dimer? intermedier filamentum

Hemidesmosmális plakk komponens BP230

K

Cytoskeleton kapcsoló, izoformák

Plectin

K

Cytoskeleton kapcsoló, izoformák

? 6? 4 integrin

K

? alegység proteolitikus érés/aktiválás

XVII. kollagén (BP180)

K

Ectodomén proteolitikusan elvész

? 3? 1 integrin

K

In vitro fokális adhéziók

XIII. kollagén

K

In vitro fokális adhéziók

Syndecan 1, 4

K

Ectodomén proteolitikusan elvész

Laminin5

K

Proteolítikus érés

Laminin6

K

Laminin 5 interakció

Laminin10

K

Szerep a BM kifejlodésében?

Laminin2

K/F

Szerepe a DEJZ-ban nem ismert

IV. kollagén

F

Univerzális bazálmembrán komponens

Nidogén

F

Többszörös ligandok, hálózati összeköto

BM-40/SPARC

F

Kalciumkötés

Perlecan

F

Heparán szulfát proteoglikán

VII. kollagén

K/(F)

Proteolitikus érés? fibrillum

GDA-J/F3 antigén

K

VII. kollagén interakció

Transzmembrán komponensek

Lamina lucida komponensek

Lamina densa komponensek

Anchor fibrillum komponensek

23

3.1.2.1.1 Cytoskeletális intermedier filamentumok: keratin 5/14 –KRT5/14 gének Részletesen lásd a 3.1.1.5 fejezetben.

3.1.2.1.2 Hemidesmosomák: plectin 1-PLEC1gén Az ún. plakk protein plectin 1 egyike a legnagyobb ismert polypeptideknek, fo komponense a sejtkultúrákból izolálható intermedier filamentumot köto komplexumnak. Az 500kDa-os intermedier filamentum köto protein génje a PLEC1 a 8q24 lókuszon foglal helyet, 32 kb terjedelmu és 32 exonból áll. C- és N-terminális globuláris doménjei egy centrális a-helikális domént fognak közre. A plectin gén mutációi állnak az epidermolysis bullosa simplex muscularis dystrophiával társult fenotípusának hátterében, a gén lókuszát korábban az epidermolysis bullosa simplex ún. Ogna variánsával is összefüggésbe hozták (12-13).

3.1.2.1.3 Anchor filamentum: XVII. kollagén (BP180)– COL17A1 gén, laminin 5 – LAMA3, LAMB3, LAMC2 gének; ? 6? 4 integrin-ITGA6/ITGB4 gének A XVII. kollagén (korábban BP180, BPAG2) egy transzmembrán protein, mely a hemidesmosomák struktúrprotein komplexumának és a lamina lucidának egyaránt alkotója. A XVII. kollagént kódoló gén a 10q24.3 kromoszomális lókuszon helyezkedik el, 52 kb terjedelmu és 56 exonra tagolódik. E transzmembrán hemidesmosomális kollagént kódoló gén elsodleges terméke az a1 (XVII) lánc, mely egy intracelluláris globuláris doménbol, egy transzmembrán szegmensbol valamint egy extracelluláris doménbol áll. Ez utóbbi 15 szeparált kollagénszeru azaz a triplahelikális struktúra létrejöttét eredményezo Gly-X-Y repetitív aminosavszekvenciájú részletet is tartalmaz, a juxtamembranózus NC-16a (nem kollagénszeru) domén mellett. A XVII. kollagénnek két formában van jelen az epitheliális sejtekben: az elso, a három 180-kDa a1 (XVII) láncból szövodött, teljes hosszúságú XVII. kollagén homotrimer transzmembrán molekula, a második egy szolubilis forma, mely a XVII. kollagén extracelluláris, ectodomén részletének megfelelo, három 120-kD-os polipeptidbol felépülo N-glikozilált molekula (15). Midkét forma a COL17A1 gén terméke, ám a szolubilis forma poszttranszlációs módosulással jött létre. Az ADAMs metalloproteinázok közé tartozó enzimek az NC-16a domén területén hasítják le a molekula extracelluláris részletét (16). A COL17A1 gén mutációit az epidermolysis bullosa junctionalis nem lethális, azaz non-Herlitz variáns (nonH-EBJ) formáiban mutatták ki (14). Speciális, alopeciával és generalizált bor atrophiával jellemzett fenotípusát korábban generalizált atrophiás benignus epidermolysis bullosa (GABEB) néven tartották számon. A laminin 5 molekula (epiligrin/nicein/kalinin) a lamina lucidának és a lamina densának a jellegzetes struktúrproteine. Kapcsolatban van az ? 6/? 4 integrin molekulákkal, a VII. kollagén 24

nem kollagén természetu, amino-terminális (NC1) doménjével is, így fontos szerepet játszik a keratinocyta-matrix adhézióban. Három polipeptidbol felépülo komplex glikoprotein (alpha3, beta3 és gamma2), melyek diszulfid hidakkal rögzülnek egymáshoz, és együttesen jellegzetes, egy hosszú és három rövid karból felépülo molekula alakzatot hoznak létre. Bár a LAMA3 (18q11.2), LAMB3 (1q32), LAMC2 (1q25-q31) gének mutációi egyaránt okozói lehetnek az epidermolysis bullosa junctionalis lethalis (Herlitz variáns) és nem lethalis formáiért, a feldolgozott esetek mintegy 80%-ában a LAMB3 gén eltérései tehetoek felelossé a kóros fenotípusért (17). A laminin 5 beta3 lánca öt doménbol áll ?VI (laminin interakciók), V/III és II, alpha (helikális struktúra) és I (alpha3 és gamma2 interakció)?. Az ? 6/? 4 integrin heterodimer molekulát elsosorban az epitheliális sejtek expresszálják. Funkciójukat tekintve laminin receptorok, a laminin molekulák hosszú karját kötik. A humán genomban génjeiket a 17q25, 2q24-q31 kromoszomális lókuszokra térképezték. Az ITGA6 és ITGB4 mutációit a pylorus atresiával és oesophagus stenosissal szövodött junctionalis epidermolysis bullosában mutatták ki (Pa-JEB) (18).

3.1.2.1.4 Anchor fibrillum: VII. kollagén – COL7A1 gén Az anchor fibrillumok az epidermális bazál membrán lamina densa komponense és a dermális kötoszövet között feszülnek. Hosszuk hozzávetolegesen 800 nm, centroszimmetrikusan keresztkötések stabilizálják, láncai szabadon végzodnek. Egyes irodalmi adatok szerint 90%-uk indul és végzodik a lamina densában, ún. loop back formációt alkotva, 10%-uk a felso dermis anchoring plaque nevu képletében végzodik. Az anchor fibrillumok szálait dermális kollagén molekulák szövik át (11). Az anchor fibrillumok legfontosabb alkotója a VII. kollagén, melyet a COL7A1 gén a 3p21 kromoszomális régióban kódol. A gén 32kb nagyságú és 118 exonból áll – az eddig megismert legnagyobb gének egyike. Az mRNS transzkriptuma 8,9kb nagyságú, és a 2944 aminosavból álló pro-? 1 (VII) polipeptiddé transzlálódik. A prokollagén VII, 3 pro-? 1 (VII) láncból létrejött homotrimer. Egy nagy 145 kDa centrális tripla-helikális kollagénszerkezetu doménhez kapcsolódik egy amino-terminális 145 kDa-os NC-1 és egy carboxi-terminális 30 kDa-os NC-2 nem kollagén, globuláris domén. A kollagénszerkezetu doménben megtalálható a kollagének jellemzo repetitív szekvenciája: minden harmadik aminosav glicin (-Gly-X-Y-). Ezen aminosav repetitív ismétlodése alapfeltétele a helikális struktúra létrejöttének. A helixet 19 alkalommal töri meg rövid, nem kollagénszeru szekvencia, melyek közül egy középen elhelyezkedo 39 aminosav hosszúságú részlet ún. csukló régió biztosítja a molekula flexibilitását (4. ábra) (9-11). 25

4. ábra. A VII. kollagén domén szerkezete a cDNA szekvencia adatok alapján.

Az anchor fibrillumok alkotóeleme a GDA-J/F3 antigén is. Az 50 kDa nem kollagén természetu fehérje az anchor fibrillumoknak a lamina densához történo kapcsolódási pontján helyezkedik el. Funkciója még nem tisztázott. Hiányzó vagy mutált VII. kollagén esetén nem volt kimutatható a borben (10-11). A VII. kollagén prokollagén prekurzorként szintetizálódik és szekretálódik túlnyomórészt a keratinocytákból az extracelluláris matrixba. Fibrillogenezis során a monomerek diszulfid hidak segítségével és a carboxiterminális végek átfedésével antiparalel dimereket képeznek, majd laterálisan aggregálódnak. A tripla-helikális és NC-2 domén in vitro szubsztrátja a TGc enzimnek, így valószínusíthetoen az általa létrehozott izopeptidkötések stabilizálják a laterális aggregációt. (10) Mindezen folyamatok elofeltétele a prokollagén VII. poszttranszlációs módosulása, az NC-2 domén proteolítikus hasítása a 2814-2843 aminosavszekvencia területén és az ún. Kunitznodulus lehasadása. Ezen 29 aminosavból álló részlet a prokollagén C-proteináz vagy BMP-1 enzim (bone morphogenic protein 1) konszenzus szekvenciája, mely a prokollagének processzálásában játszik szerepet. Figyelemreméltó, hogy a BMP-1 – mely a laminin 5 ?2 láncát is hasítja – foként a fibroblasztokban termelodik, ám a laminin 5 és a VII. kollagén döntoen epitheliális termék. Mindez azt sugallja, hogy az epitheliális-mesenchimális interakciók fontos szabályozó szerepet töltenek be e folyamatokban. (5. ábra) (11).

26

5. ábra. A VII. kollagén szupramolekuláris aggregációja

3.2 Az epidermolyticus genodermatosisok klinikai megjelenési formái 3.2.1

Keratin mutációk okozta örökletes borbetegségek A keratinok (K) mutációi klinikailag a bor és függelékeinek olyan különbözo

genodermatosisaihoz vezetnek, mint az epidermolysis bullosa simplex, a bullosus congenitalis ichthyosiform

erythroderma,

epidermolyticus

és

nem

epidermolyticus

palmoplantaris

keratoderma, ichthyosis bullosa Siemens, pachyonychia congenita és a monilethrix. Az extracutan keratinok hibáit néhány nem borgyógyászati betegséggel hozzák kapcsolatba, mint a száj nyálkahártyáját érinto Canon-féle naevus spongiosus albus, a szaruhártya betegsége, a Meesmann-féle juvenilis epitheliális corneális dystrophia valamint a máj cryptogén cirrhosisa (6. ábra).

27

2. táblázat. A keratinok expressziós mintázata és a mutációik által okozott genodermatosisok

Keratin

Expressziós mintázat

Genodermatosis

K1, K10

Többrétegu elszarusodó laphám szuprabazális sejtjei

BCIE/EH, DNEPPK

K2e

Többrétegu elszarusodó laphám felso szuprabazális sejtjei

IBS

K2p

Kemény szájpad

?

K3, K12

Cornea

?

K4, K13

Mucosa, többrétegu el nem szarusodó laphám

NSA

K5, K14

Többrétegu hámok bazális sejtjei

EBS

K6, K16

Palmoplantaris hám, mucosa, borfüggelékek, sebgyógyulás

PC-1, FNEPPK

K7

Myoepitheliális sejtek, egyrétegu hám

?

K8, K18

Egyrétegu hám

?

K9

Palmoplantaris hám szuprabazális sejtjei

EPPK

K15

Bazális keratinocyták

?

K17

Borfüggelékek

PC-2

K19

Egyrétegu hám, borfüggelékek

?

K20

Gasztrointesztinális traktus hámja

?

hHb1, hHb6

Hajspecifikus keratinok

M

BCIE/EH (bullosus congenitalis ichthyosiform erythroderma/epidermolyicus hyperkeratosis), DNEPPK (diffúz nem-epidermolyticus palmoplantaris keratoderma), IBS (ichthyosis bullosa Siemens), NSA (naevus spongiosus albus), EBS (epidermolysis bullosa simplex), PC-1 (pachyonychia congenita-1), FNEPPK (focalis nem epidermolyticus palmoplantaris keratoderma), EPPK (epidermolyticus palmoplantaris keratoderma), PC-2 (pachyonychia congenita-2), M (monilethrix).

28

6. ábra. Epidermolysist okozó keratinmutáció hátteru genodermatosisok EBS (epidermolysis bullosa simplex), BCIE/EH (bullosus congenitalis ichthyosiform erythroderma/epidermolyicus hyperkeratosis), IBS (ichthyosis bullosa Siemens), EPPK (epidermolyticus palmoplantaris keratoderma)

3.2.1.1

A stratum basale keratinjainak mutációi: epidermolysis bullosa simplex Az epidermolysis bullosa simplex (EBS) az egyik legjobban tanulmányozott

genodermatosis. Az EBS kutatása történeti jelentoségu, mert a keratin rendellenességek genetikai alapjainak feltárása során ezek voltak az elso ismertté vált keratin mutációk. EBS-ben a K5 és a K14 - azaz rétegspecifikusan csak a bazális keratinocytákban jelenlévo - keratinok mutációit azonosították (22, 23). Részletesen lásd az 3.2.2.1 alfejezetben.

3.2.1.2 A stratum spinosum keratinjainak mutációi: bullosus congenitalis ichthyosiform erythroderma / epidermolyicus hyperkeratosis A

bullosus

congenitalis

ichthyosiform

erythroderma

(BCIE)-melyet

gyakran

epidermolyticus hyperkeratosisnak (EH) is neveznek-volt az EBS után a következo borbetegség, amelynek hátterében a keratin gének mutációját azonosították (OMIM 113800) (27). Az EBS tükörképi párjának is tekintheto, mivel a bor bazális sejtjei normálisnak tunnek, a patológiás eltérések a szuprabazális rétegekben láthatók. Születés után fellépo erythroderma és shubokban progrediáló hólyagképzodés jellemzi, mely csecsemokortól kezdodoen helyt ad a hajlatokat is érinto barázdált hyperkeratosisnak. A tenyér és talp szintén hyperkeratotikus. Jellegzetes 29

fénymikroszkópos

eltérés

a

szuprabazális

sejtek

vacuolás

degenerációja,

cytolízise

(epidermolysis), a stratum granulosum kiszélesedése és a stratum corneum kifejezett megvastagodása (hyperkeratosis). Ultrastrukturális vizsgálattal filamentum aggragátumok detektálhatók a szuprabazális sejtek cytoplasmájában. A szuprabazális réteg domináló struktúrfehérjéi a K1 és K10 molekulák, melyeket az ultrastrukturális vizsgálattal észlelt filamentum aggregátumok komponenseiként azonosítottak (28, 29) A KRT1 és KRT10 génekben szekvenciaanalízissel olyan pontmutációkat találtak, melyek a nagymértékben konzervatív 1A domén helix-szegélyezo régióiban csoportosulnak (27, 28, 30, 31). A betegség jelzi, hogy a tonofilamentum aggregációban az 1A doménnek a filamentum összerendezésben jelentos szerepe van. A szuprabazális keratinok a szaruréteg fo komponensei, ezért a kóros fehérje jelenléte nem csak a stratum spinosum hólyagképzodéséhez vezet, de elszarusodási zavart is okoz.

3.2.1.3 A BCIE/EH epidermalis naevoid formája A BCIE/EH gyakran körülírtan jelentkezik, a bortünetek a Blaschko-vonalak mentén csíkszeruen helyezkednek el (OMIM 600648). A betegség által érintett és nem érintett bortünetek ilyen jellegu eloszlási mintázata nem véletlenszeru. A mozaicizmus jelenségének magyarázata az, hogy az érintett epidermális keratin génben posztzigotikus szomatikus mutáció történik az egyedfejlodés korai szakaszában. A klasszikus BCIE/EH esetekhez hasonló heterozigóta KRT1/10 pontmutációkat detektáltak a naevoid tünetek keratinocytáiban, de ez a mutáció hiányzott a tünetmentes bor hámsejtjeibol. Ezzel szemben a dermális fibroblasztokban a K10 mutációi az egész testfelszínen mindenütt kimutathatóak voltak. Ez egybevág azzal a ténnyel, hogy a keratinocyták és a fibroblasztok eloalakjai egymástól függetlenül vándorolnak az embriogenezis során (1, 4). Az elváltozás a BCIE/EH csoportba tartozik, amit az is alátámaszt, hogy az epidermális naevusszal rendelkezo betegek gonadális mozaicizmusa esetén a leszármazottaknál

gyakran

generalizált BCIE/EH jelenik meg (1).

3.2.1.4 A stratum spinosum és granulosum keratinjának mutációja: ichthyosis bullosa Siemens A Siemens-féle ichthyosis bullosa (IBS) egy enyhébb formájú, autoszomális domináns módon öröklodo epidermolytikus ichthyosis, amely elsosorban a törzsön jelentkezik (OMIM 146800). Többnyire mechanikus trauma után fellépo, igen felületes, az EBS-re emlékezteto hólyagok, sokszor csak finom hámlás jellemzi. A laesiók heg nélkül gyógyulnak. A borön

30

körülírt, szürkésbarna, lichenifikált, hyperkeratotikus plakkok jelennek meg, elsosorban a karon és a lábon. Ultrastrukturálisan a tonofilamentumok aggregációja és a cytolisis a szuprabazális rétegekben a stratum spinosum felso rétegeire és a stratum granulosumra korlátozódik. Ezen rétegekben speciálisan a K2e is expresszálódik, ezért csak ido kérdése volt ezen keratin mutációinak azonosítása az IBS által érintett családokban (32, 33, 34, 35).

3.2.1.5 A tenyéri-talpi keratinok mutációi: palmoplantaris keratodermák A palmoplantaris keratodermák heterogén csoportját számos klinikai (diffúz, fokális, punktált) és hisztológiai (epidermolyticus és nem epidermolyticus) kritérium alapján lehet felosztani (36). Újabban az egyes altípusok hátterében megismert gének új osztályozás lehetoségét vetik fel: a leggyakoribb, keratin mutációk okozta formákon kívül számos egyéb fehérje (pl. envelop fehérje loricrin, lysosomális proteáz cathepsin C, gap junction fehérje connexin 26, továbbá a desmosoma komponense, a desmoplakin) defektusával is kapcsolatba hozták (38, 39, 40, 41) .

3.2.1.5.1 Nem-epidermolyticus palmoplantaris keratodermák A sokszor már az elso életévekben manifesztálódó laesiók szimmetrikusak, felületesek, sárgásbarnásak ill. viaszszeruek, a tenyereket és talpakat gyakran teljesen befedik (OMIM 6000962). A borrajzolat kifejezettebbé válik, fájdalmas fissurák, rhagasok tördelik. Hólyagképzodés nem kíséri, hisztológiailag epidermolyticus aktivitás nincs. A korábbi besorolás

alapját képezo Unna és Thost által a múlt században leírt

családokon napjainkban ismételten elvégzett hisztológiai és ultrastrukturális vizsgálata során az Unna által leírt család nem mutatott epidermolysist, Thost betegei viszont igen, és így az utóbbi az epidermolyticus palmoplantaris keratodermák (Vörner típus) csoportjába sorolhatók, míg az elobbiek nem (37). Mindez mutatja, hogy milyen nehéz klinikailag a hólyagos és nem hólyagos típust egymástól elkülöníteni. Az új nomenklatúra a különbözo kórképeket összefoglaló UnnaThost elnevezést elveti. Diffúz

nem-epidermolyticus

palmoplantaris

keratoderma

(DNEPPKD)

családok

betegeiben pontmutációt találtak a K1 fej doménjében. Ez a mutáció egy 22 aminosavat tartalmazó részletet, ún. boxot érint, amelyet a szekvencia egyik részlete után ISIS-boxnak neveztek el. A mutációt egy lizin aminosav szenvedi el, ami a transzglutaminázok által kialakított keresztkötések képzésében vesz részt a terminális differenciáció, az elszarusodás során (42). 31

Az ISIS-boxról az is kiderült, hogy a K1-nek a desmosomákhoz kapcsolódásában is részt vesz, így mutáns formája megzavarja a filamentum más molekulákkal való kölcsönhatását. Ezek a megfigyelések is alátámasztják, hogy a fej és farok domének eloboltosulnak a molekula felszínén és így az intermedier filamentumok és asszociált proteinjeik közötti interakcióban vesznek részt (42). A K16 a palmoplantaris bor és a borfüggelékek mellett az epidermis hyperproliferatív elváltozásaiban

jelenlévo

minor

variáns.

Fokális

nem-epidermolyticus

palmoplantaris

keratodermákban (FNEPPKD) a K16 génjének mutációit figyelték meg. Ezen esetekben a fokális palmoplantaris keratoderma pachyonychia congenitával társulhat ( 49).

3.2.1.5.2 Epidermolyticus palmoplantaris keratoderma Az

epidermolyticus

palmoplantaris

keratoderma

(EPPKD,

Vörner

típus)

egy

autoszomális dominánsan öröklodo borbetegség, amelyet erythemás szélu, a tenyér és talp teljes felületén jelentkezo, diffúz szaru megvastagodás jellemez (OMIM 144200). Néha már klinikailag is sejtheto hólyagképzodés a tünetek szélén. A K9 specifikusan a palmoplantaris epidermis szuprabazális sejtsoraiban termelodik. Az EPPKD kialakulásáért a K9 gén (KRT9) pontmutációi felelosek, melyek túlnyomórészt az 1A domént érintik (43, 44, 45). Az 1A domén a

keratin

filamentumok

dimerképzésében

és

késobbi

magasabbrendu

struktúrájának

kialakításában tölt be fontos szerepet, így ez lehet a mutációja nyomán létrejövo elszarusodási zavar oka.

3.2.1.6 A köröm keratinok mutációi: pachyonychia congenita A pachyonychia congenita (PC) a herediter ectodermális dysplasiák csoportjába tartozik Hypertrophiás körömdystrophia, melyhez a bor, a nyálkahártya és a szaruhártya egyéb rendellenességei társulhatnak. A PC-nek két nagy alcsoportja van. A Jadassohn-Lewandowsky (PC-1, OMIM 167200) variáns a következo elváltozásokat foglalja magába: pachyonychia és NEPPKD együttese, orális leukokeratosis, gége (rekedtség) és dobhártya (süketség) érintettség, hyperhidrosis, néha hólyagképzodés és follikuláris keratosis. Steatocystoma multiplex jelenléte és az orális laesiók hiánya jellemzi a Jackson-Lawler variánst (PC-2, OMIM 167210). A pachyonychia congenita-1 (PC-1) esetében K16 és K6a, a pachyonychia congenita-2 (PC-2) esetében pedig K17 mutációkat találtak (46, 47, 48, 49).

32

3.2.1.7 A haj keratinok mutációi: monilethrix A monilethrixre jellemzo (OMIM 158000), hogy a hajszálat helyenként depigmentált és elvékonyodó részek, máshol erosen pigmentált, orsószeru megvastagodások tördelik. Monilethrixben a hajszálak törékenységét, a hajszálkortex defektusát a keratinmatrix fehérjéinek hibás szintézise, összeszerelése és stabilizációja okozza. Autoszomális domináns módon öröklodo formáit már régen kapcsolatba hozták a keratin génekkel. Pontmutációkat elsoként a hHb6, majd újabban a hHb1 hajcortex keratin génjeiben találtak. A legújabb adatok a monilethrix kialakulásában további gének szerepét is felvetik: a hHa4 keratinét, a keratin intermedier filamentum asszociált proteinek (IFAP) közül az erosen szulfátgazdag proteinekét, a trichohyalinét, az involucrinét (50, 51, 52).

3.2.2

Epidermolysis bullosa csoport A herediter epidermolysis bullosa (EB) betegségcsoportra a hám fokozott sérülékenysége

jellemzo: a borön és a nyálkahártyákon a traumára vagy látszólag spontán fellépo hólyagképzodés zajlik, mely a dermo-epidermális határzónában történik. Klasszikus klinikai felosztása a hólyagképzodés szintjét is figyelembevevo módon történt: epidermolysis bullosa simplex (bazális keratinocyták), epidermolysis bullosa junctionalis (lamina lucida), epidermolysis bullosa dystrophica (sublamina densa, anchor-rostok). Az elmúlt évtizedben a genodermatosisok kutatása világszerte felgyorsult. A bevezetett új technikák segítségével a klinikailag, hisztológiailag és prognosztikailag is jelentosen különbözo epidermolysis bullosa alcsoportok hátterében sikerült az érintett molekulák és betegség gének azonosítása. A génmutációk kimutatása és az etiológia pontosabb ismerete a korábbi klasszikus klinikai felosztás mellett újabb alcsoportok létrejöttét eredményezte (pl. hemidesmosomalis variánsok). Emellett nemzetközi konszenzus konferenciák nem tartották indokoltnak a következo klinikai kategóriák további használatát: EB lethalis, EB atrophicans, GABEB (generalizált atrophiás benignus epidermolysis bullosa), cicatrizáló JEB, DDEB albopapuloidea (Pasini variáns), DDEB hyperplasticus (Cockayne-Touraine variáns), Bart szindróma, EBS Ogna variáns, EBS Kallin szindróma, EBS Mendes da Costa variáns, valamint a gravis, mitis, progressziva jelzoket (127).

33

3. táblázat. A bor herediter hólyagos betegségeiben azonosított humán gének

Protein

Gén

Kromoszomális

Humán betegség Állat modell

lokalizáció Keratin 5

KRT5

12q11-q12

EBS

Egér

Keratin 14

KRT14

17q12-q21

EBS

Egér

BP230

BPAG1

6p11-p12

?

Egér

Plectin

PLEC1

8q24

EBS-MD

? 6 integrin

ITGA6

17q25

EBJ-PA

Egér

? 4 integrin

ITGB6

2q24-q31

EBJ-PA

Egér

? 3 integrin

ITGA3

?

Egér

XVII. kollagén

COL17A1

10q24.3

EBJ nem-Herlitz

Laminin5

LAMA3

18q11.2

EBJ Herlitz

LAMB3

1q32

EBJ nem-Herlitz

LAMC2

1q25-q31

COL7A1

3p21.1

VII. kollagén

DDEB

Kutya

Juh

RDEB TBDN EBS epidermolysis bullosa simplex, MD musculáris dystrophia, JEB junctionalis epidermolysis bullosa, PA pylorus atresia, DDEB domináns epidermolysis bullosa dystrophica, RDEB recesszív epidermolysis bullosa dystrophica, TBDN „transient bullous dermolysis of the newborn”

34

4. táblázat A herediter EB revideált, a klinikai fenotípuson és a genotípuson alapuló klasszifikációja EB típus

EB szubtípus

Érintett protein/gén rendszer

EBS („epidermolyticus”)

EBS-WC

Keratin5, Keratin14

EBS-K

Keratin5, Keratin14

EBS-DM

Keratin5, Keratin14

EBS-MD

Plectin

JEB-H

Laminin5

JEB-nH

Laminin5, XVII. kollagén

JEB-PA

? 6? 4 integrin

DDEB

VII. kollagén

RDEB-HS

VII. kollagén

RDEB-nHS

VII. kollagén

JEB („junctionalis”)

DEB („dermolyticus”)

EBS epidermolysis bullosa simplex, WC Weber-Cockayne, K Köbner, DM Dowling-Meara, MD musculáris dystrophia, EBJ junctionalis epidermolysis bullosa, H Herlitz, nH nem Herlitz, PA pylorus atresia, DDEB domináns epidermolysis bullosa dystrophica, RDEB recesszív epidermolysis bullosa dystrophica, HS Hallopeau-Siemens, nHS nem Hallopeau-Siemens

5. táblázat. Az EB egyéb ritka fenotípusai ill. szubtípusai EB típus

EB szubtípus

Érintett protein/gén rendszer

EBS („epidermolyticus”)

EBS-MP

Keratin5

EBS-AR

Keratin14

EBSS

Ismeretlen

JEB-I

Laminin5

JEB-Lo

Ismeretlen

DDEB-Pt

VII. kollagén

DEB-TBDN

VII. kollagén

DDEB-Pr

VII. kollagén

RDEB-I

VII. kollagén

RDEB-Ce

Ismeretlen

DEB, autoszomális domináns

VII. kollagén

JEB

DEB („dermolyticus”)

/autoszomális recesszív MP mottled pigmentation, AR autoszomális recesszív, S superficialis, I inversa, Lo late onset, Pt pretibiális, Ce centripetalis

35

6. táblázat A herediter EB öröklodésmenete. EB típus

Az átörökítés gyakori módja

Az átörökítés ritka módja

EBS†

autoszomális domináns

autoszomális recesszív

JEB


-

DEB

autoszomális domináns

autoszomális domináns/ és


autoszomális recesszív compound heterozigóta

??Beleértve a de novo mutációkat is, melyek gyakoriak a herediter EB legtöbb formájában † Az X-hez kötött recesszív Mendes da Costa variáns jelenleg nem tartozik az EBS altípusai közé

3.2.2.1 Epidermolysis bullosa simplex Az EB csoport leggyakoribb és egyben legenyhébb formája az EBS. Dönto többségében autoszomális domináns, igen ritkán autoszomális recesszív öröklodésmenetu betegség. EBS esetén a dermo-epidermális szeparáció a bazálmembrán felett, a bazális sejtrétegben van. Esetenként a keratinocytákban degeneratív elváltozások, összecsapzódott keratin rögök, ún. keratin clumps jelenség figyelheto meg. Rövid idovel a születés után, a mechanikai traumának kitett területeken többnyire serosus hólyagok keletkeznek, melyek hamar megnyílnak, gyorsan hámosodó erosiókat hagyva maguk után. Hegképzodés nincs, de miliumképzodés elofordulhat. A szájnyálkahártya, a haj, a körmök és a fogazat érintettsége – alcsoporttól függoen – ritkább (7. táblázat). A meleg évszakokban, a hyperhidrosis miatt gyakran romlik a betegek állapota, de az élet elorehaladtával a hólyagképzodés aktivitása általában csökken. Az EBS egyik speciális formája, az EB herpetiformis (Dowling-Meara) (OMIM 131760) esetében hólyagok a születés után képzodnek a törzsön, tenyéren, talpon. A törzs gruppírozott, herpetiform hólyagjai pigmetációt hátrahagyva gyógyulnak. A hólyagképzodés a korral mérséklodik, azonban tenyéri és talpi hyperkeratosis alakulhat ki (60). Ultrastrukturálisan a bazális hámsejtekben durva keratin-tonofilamentum aggregáció, clumps-képzodés detektálható. A K5 és K14 molekulák mutációi a nagyfokú evolúciós állandóságot mutató szekvenciákat érintik (pl. helix iniciációs motívum) (24,25). Ezen szakaszok kóros eltérései akadályozzák a keratin fehérjék magasabbrendu, filamentáris struktúrákba történo szervezodését és a keratin filamentumok összecsapzódásához vezetnek. Az enyhébb fenotípusú lokalizált, döntoen tenyéri-talpi tünetekkel jellemezheto (WeberCockayne) (OMIM 131800) és generalizált (Köbner) EBS (OMIM 131900) formákban hólyagok általában a mechanikai traumának leginkább kitett helyeken keletkeznek (láb, kéz, sarok, térd, 36

könyök) és súlyosabb következmény nélkül gyógyulnak. Mutációkat ugyancsak a K5 és K14 génekben, enyhébb fenotípusban a tonofilamentum aggregációt okozó kritikus régión kívül találtak (22, 23, 24,26). A keratin-clumping nem jellemzoje az ultrastrukturális képnek. Az irodalom említ néhány az EBS fenotípusba illesztheto és hisztológiailag bazális epidermolysist mutató, lethális kimenetelu esetet is (41).

7. táblázat. Az EB simplex fobb altípusai.

EBS Weber-Cockayne

EBS Köbner

EBS Dowling-Meara

Öröklodésmenet:

AD/(AR)

AD

AD

A betegség kezdete:

Újszülöttkor vagy kora

Születéskor

Születéskor

Generalizált (a tenyerek-

Generalizált

gyermekkor Predomináns borterületek:

Tenyerek-talpak

talpak gyakran megkíméltek) Botünetek:* Bulla

7

7

7

Milium

2

4

4

Atrophias heg

4

6

5

Dystrophiás vagy hiányzó

4

6

7

Granulációs szövet

1

2

Hiányzik

Hajas fejbor abnormalitás

1

3

2

Keratoderma (tenyér-talp)

Fokális

Fokális

Gyakran konfluáló

Egyéb

-

-

Herpetiform-gruppírozott

köröm

hólyagok A hólyagok

Változó

Általános

Általános

Anaemia

2

4

3

Növekedési retardáció

1

2

4

Nyálkahártya abnormalitás 5

6

5

Zománc hypoplasia

4

4

4

Caries

Normál frekvencia

Normál frekvencia

Normál frekvencia

Gasztrointesztinális traktus 2

4

4

Genitourinális traktus

1

2

2

Szem

1

2

3

provokálhatósága: Extracutan érintettség:

37

EBS Weber-Cockayne

EBS Köbner

EBS Dowling-Meara

Pseudosyndactylia

Hiányzik

Hiányzik

2

Légzoszervek

1

2

3

Carcinoma spinocellulare

Nincs adat

Nincs adat

Nincs adat

Melanoma malignum

Nincs adat

Nincs adat

Nincs adat

Carcinoma basocellulare

Nincs adat

Nincs adat

Nincs adat

Exitus

0,6%

0,6%

1,4%

Kumulatív rizikó 30-éves korig:

AD autoszomális domináns, AR autoszomális recesszív, *a a statisztikai adatok az USA NEBR (National EB Registry) megfigyeléseit tükrözik: 1=? 1,0%, 2=1,0-5,0%, 3=5,1-10,0%, 4=10,1-25,0%, 5=25,1-50,0%, 6=50,175,0%, 7=75,1-100,0%

3.2.2.2 Hemidesmosomális (pseudojunkcionális) variánsok A bazális keratinocyták hemidesmosómáiban elhelyezkedo kohéziós fehérjék (plectin 1, XVII. kollagén intracelluláris része, BP230 antigén) betegségei didaktikailag hemidesosomális variánsok néven korábban külön alcsoportban voltak összefoglalhatóak. Ultrastrukturálisan a diagnózis EBS, mivel a hemidesmosómák dezorganizációja és következményes bazális epidermolysis figyelheto meg. A plectin 1 gén mutációi állnak az epidermolysis bullosa simplex muscularis dystrophiával (EBS-MD) társult fenotípusának hátterében. Korábban a gén lókuszát az epidermolysis bullosa simplex az ujjbegy suffusióival és körömdystrophiával jellemzett ún. Ogna variánsával is összefüggésbe hozták. Bár a betegek klinikai fenotípusa leginkább a JEB-nH altípusának megfelelo, az ultrastrukturális diagnózist követo klinikai besorolás az EBS egy ritka altípusaként tartja számon (12, 13). Az anchor filamentumok közé tartozó XVII. kollagén fehérjét intracelluláris, transzmembrán és egy extracelluláris kollagénszeru részleteket tartalmazó domének hármasa építi fel. Az intracelluláris részlet missense mutációi EBS közeli fenotípust okozhatnak, ezzel szemben a lamina lucidát átívelo extracelluláris rész mutációi az EBJ-nH, lokalizált tünetekkel járó egyes formáiért felelosek (14-16). A BP230 antigén génjének knock out állatmodelljei EBS fenotípust mutattak, ám a humán gén mutációit még nem azonosították EBS betegekben.

38

3.2.2.3 Epidermolysis bullosa junctionalis Gyakran a születéskor is észlelheto, autoszomális recesszív öröklodésmenetu, ritka betegségek (OMIM 226700). A hólyagképzodés során a bazálmembrán rétegei távolodnak el egymástól. A generalizált tünetekkel jellemzheto fatális kimenetelu, laminin 5 molekula defektusra ill. hiányra visszavezetheto Herlitz variáns esetén a fej, az arc, a száj körül, valamint a nyomásnak kitett területeken nagy, haemorrhagiás bennéku bullák, vérzo, pörkkel fedett erosiók jelentkeznek. Akrálisan sok hólyag keletkezik, és a felso gasztrointesztinális és genitourinális traktus is érintett lehet. A lokalizált tünetekkel, lassú sebgyógyulással, heges alopeciával társult non-Herlitz kórformái esetén (korábbi GABEB) többnyire a XVII. kollagén génjének és ritkábban a laminin 5 heterotrimer valamelyik láncát kódoló gén mutációit találjuk (19). Pylorus atresiával társult (JEB-Pa) formákban az ? 3? 4 integrin mutációi állnak (18) (8. táblázat). 8. táblázat. Az EB junctionalis fobb altípusai. JEB Herlitz

JEB nem-Herlitz

Öröklodésmenet:

AR

AR


Születéskor

Születéskor/late onset

Predomináns borterületek:

Generalizált

Generalizált/lokalizált

Bulla

7

7

Milium

3

3

Atrophias heg

6

6

Dystrophiás vagy hiányzó köröm

7

7


6

4


4

5


Hiányzik

Hiányzik

Egyéb

-

-

A hólyagok provokálhatósága:

Gyakori

Gyakori

Anaemia

6

3


5

4

Nyálkahártya abnormalitás

6

7

Zománc hypoplasia

7

7

Caries

Kifejezett

Kifejezett

Gasztrointesztinális traktus

5

4


3

3

Botünetek:

Extracutan érintettség:

39

JEB Herlitz

JEB nem-Herlitz

Szem

5

5

Pseudosyndactylia

3

Hiányzik

Légzoszervek

5

4


Nincs adat

Ritka

Melanoma malignum

Nincs adat

Nincs adat


Nincs adat

Nincs adat

Exitus

42,2%

38,2%


AR autoszomális recesszív, *a a statisztikai adatok az USA NEBR (National EB Registry) megfigyeléseit tükrözik: 1=?1,0%, 2=1,0-5,0%, 3=5,1-10,0%, 4=10,1-25,0%, 5=25,1-50,0%, 6=50,1-75,0%, 7=75,1-100,0%

3.2.2.4 Epidermolysis bullosa dystrophica A DEB a mechanobullosus genodermatosisok gyakori elofordulású csoportja, mely enyhe fenotípussal járó autoszomális domináns és súlyosabb tünetekkel jellemezheto autoszomális recesszív módon egyaránt öröklodik. A hólyagképzodés dermolyticus, ezért a bortünetek hegképzodéssel

gyógyulnak.

Valamennyi

kórforma

hátterében

az

anchor

fibrillumok

legfontosabb építokövének a VII. kollagén génjének (COL7A1) mutációi állnak (128). Domináns formáiban (OMIM 131750) a trauma hatására keletkezo hólyagok a predilekciós területeken, a mechanikai sérülésnek leginkább kitett régiókban, a könyök, kézfej, térd, lábfej területén keletkeznek. A hegekben nagyszámú milium található. Az általános állapotot nem befolyásolja, és a gyermekkori aktív hólyagosodás az életkor elorehaladtával mérséklodik. A betegek genotípusában gyakran glicin szubsztitúciós mutációkat találunk (129). Ritkábban találkozunk a recesszív formájával a drámai fenotípusú Hallopeau-Siemens variánssal (RDEB-HS) (OMIM 226600), melyet pseudosyndactylia és mutiláció jellemez. Az anchorrostok mennyisége erosen redukált vagy teljesen hiányzik a borbol. A bortüneteket számos cutan és extracutan komplikáció kísérheti: spinocelluláris carcinoma, szekunder reaktív amyloidosis (nephrosis szindróma), oesophagus strictura. Egyéb RDEB-nHS formáiban az ujjak csonkolódása és összenövése nem jön létre, és egyéb szövodmények is ritkábban fordulnak elo, ám a betegek életminoségét ez a variáns is nagymértékben rontja. A betegek tüneteit az anchorrostok mérsékelt redukciója magyarázza (130-135).

40

9. táblázat. Az EB dystrophica fobb altípusai. DDEB

RDEB,

RDEB, nem-

Hallopeau-Siemens

Hallopeau-Siemens

Öröklodésmenet:

AD

AR

AR



Születéskor


Predomináns borterületek:

Lokalizált

Generalizált

Generalizált/lokalizált

Bulla

7

7

7

Milium

6

7

7

Atrophias heg

7

7

7

Dystrophiás vagy hiányzó

7

7

7


Hiányzik

4

4


4

5

4


Nincs

Nincs

Nincs

Egyéb

-

-

-

A hólyagok

Változó

Kifejezett

Kifejezett

Anaemia

4

7

5


2

7

4

Nyálkahártya abnormalitás 6

7

7

Zománc hypoplasia

4

4

5

Caries

Normál frekvencia

Kifejezett

Normál frekvencia

Gasztrointesztinális traktus 4

7

5


2

2

2

Szem

Nincs adat

6

4

Pseudosyndactylia

Nincs adat

7

5

Légzoszervek

Nincs adat

2

2


Nincs adat

39,6%

14,3%

Melanoma malignum

0,8%

2,5%

0,7%


0,9%

Nincs adat

Nincs adat

Exitus

Nincs adat

38,7%

10,0%

Botünetek:

köröm

provokálhatósága: Extracutan érintettség:


AD autoszomális domináns, AR autoszomális recesszív, *a a statisztikai adatok az USA NEBR (National EB Registry) megfigyeléseit tükrözik: 1=? 1,0%, 2=1,0-5,0%, 3=5,1-10,0%, 4=10,1-25,0%, 5=25,1-50,0%, 6=50,175,0%, 7=75,1-100,0%

41

3.2.2.5 Az epidermolysis bullosa szövodményei Az alapbetegség bortünetei mellett számos cutan és extracutan komplikáció rontja a betegek életminoségét ill. fatális kimenetelhez is vezethet.

3.2.2.5.1 Cutan komplikációk Gyakori szekunder infekciók, pyodermák mellett, a generalizált tünetekkel rendelkezo recesszív öröklodésmenetu DEB-ben szenvedo betegeknél, az ujjak synechiája alakulhat ki, pseudosyndactyliát eredményezve. A tenyéri hólyagosodást követo sebgyógyulás flexiós kontraktúrát eredményezhet. A recesszív DEB legsúlyosabb fenotípusát, az ún. HalloeauSiemens szindrómát a kéz és lábujjak végperceinek elvesztése, mutilációja kíséri. Enyhébb, domináns DEB, EBS-DM fenotípusban gyakori a körömdystrophia, súlyosabb formákban a periungualis hólyagosodást teljes körömvesztés követheti. A betegek onkodermatológiai ellenorzése fontos feladat, hiszen az EB legsúlyosabb, fatális komplikációja a korai életkorban jelentkezo, gyakran multiplex fellépésu spinocellularis carcinoma, mely a bazálmembrán barrierfunkciójának elégtelensége miatt korán infiltrálja a mélyebb rétegeket és áttétet ad.

3.2.2.5.2 Extracutan komplikációk, szisztémás tünetek Az EB extracutan tünetei ectodermalis, endodermalis és mezodermalis eredetu szöveteket egyaránt érinthetnek. A szájnyálkahártya érintettsége esetén fájdalmas eróziók jelentkeznek a szájban, mely microstomiához, frenulum fibrózishoz vezethet. A száj és garat érintettsége mellett nem ritka a dysphagiával járó oesophagus strictura és motilitás zavar. A gége érintettségét rekedtség jelzi, súlyos JEB-ben stridoros légzéssel kísért gégeszukület alakulhat ki. Nagy odafigyelést igényel az EB betegek táplálása, az anaemia és a fehérjehiány gyakori, makacs szövodménye a betegségnek (krónikus vérvesztés, táplálkozási nehézségek valamint elégtelen felszívódás következményei). Fogászati problémák az EB valamennyi altípusában jelen lehetnek (caries, szekunder dystrophia). A conjunctiván, corneán fájdalmas eróziók, fekélyek alakulhatnak ki, synblepharon jöhet létre. Anus strictura, krónikus obstipatio súlyos, recesszív EBD-ben gyakori. Nephrosis syndroma hátterében leggyakrabban szekunder, reaktív amyloidosis, míg nephritis syndroma esetében a superinfectiokat követo poststreptococcalis glomerulonephritis állhat. Gyakori az ureterek és az urethra szukülete, a genitális epithelium is érintett lehet. Pszichés és szociális problémák a betegek egész életét végigkísérik, a pályaválasztás, párválasztás nehézségekbe ütközik.

42

3.2.2.6 Differenciáldiagnosztika: a DEJZ komponenseinek autoimmun betegségei A DEJZ számos komponense ellen irányuló autoantitestek mutathatóak ki különbözo hólyagos autoimmun betegségben. A tünetek sokszor hasonlóak a herediter bullosus betegségekben megszokottakéhoz. Az anamnézis, a kórlefolyás, a bor hisztológiai, valamint direkt és indirekt immunfluoreszcens vizsgálatai segítik a differenciáldiagnózist. Egyes autoimmun betegek magas titeru, a bazálmembránzóna komponensei ellen irányuló antitestei a herediter bullosus borbetegségek klasszifikációját segíto immunfluoreszcens antigén mapping vizsgálatokhoz felhasználhatóak. (A zavaró nomenklatúra miatt részletesen csak az epidermolysis bullosa acquisitát tárgyalom.)

7. ábra. A dermo-epidermális junkció herediter és szerzett betegségei

43

10. táblázat. A DEJZ komponensei ellen irányuló autoimmunitás. Protein

Betegség

Immunodominans epitop tartalmú domének

BP230

Bullosus pemphigoid

variábilis

Plectin

Bullosus pemphigoid

variábilis

XVII. kollagén

Bullosus pemphigoid

NC-16a

Pemphigoid gestationes

NC-16a

Pemphigoid cicatrisans

C-terminus

Linearis IgA dermatosis

NC-16a, solubilis ectodomén

Laminin 5/6

Pemphigoid cicatrisans

Laminin ? 3 vagy ? 3 lánc

VII. kollagén

EB acquisita

NC-1 domén Tripla-helix

Bullosus SLE

NC-1 domén

Inflammatorikus bélbetegség

NC-1 domén

Az epidermolysis bullosa acquisita (EBA) ritka, krónikus, általában az élet késobbi szakaszában manifesztálódó, autoimmun mechanizmusú, a bullosus pemphigoid csoportba tartozó hólyagos borbetegség. Poliklonális, a VII. kollagén különbözo doménei ellen irányuló autoantitestek jelenléte okozza. A bor fokozott sérülékenysége, traumának kitett helyeken hólyagképzodés, erosiók, atrófiás hegek, miliumok és körömdystrophia jellemzi. Ritkán gyermekkorban, típusosan felnottkorban manifesztálódik, a családi anamnézisben herediter bullosus betegség nincs, és egyéb hólyagos betegség (bullosus pemphigoid, porphiria cutanea tarda, juvenilis SLE) kizárható. Szövettanilag szubepidermális hólyagképzodés, direkt immunfluoreszcens vizsgálattal lineáris IgG lerakódás a bazálmembrán mentén, indirekt immunfluoreszcens vizsgálatokkal keringo antitestek mutathatóak ki. Salt split skin indirekt immunfluoreszcens vizsgálattal a VII. kollagén ellen irányuló autoantitestek a bazálmembrán alatt dermális kötodést mutatnak. Az EBA betegek szérumát a herediter bullosus borbetegségek klasszifikációját segíto immunfluoreszcens antigén mapping vizsgálatokhoz rutinszeruen alkalmazzuk. Az autoimmun hólyagos borbetegségek mellett a herediter epidermolysis bullosa legfontosabb differenciáldiagnosztikai tényezoi: mechanikus traumát követo hólyagok, herpes vírus infekció, bullosus impetigo, staphylogen toxikus epidermalis necrolysis, vesiculopustulosus candidosis, porphyria cutanea tarda, bullosus ichthyosisok, incontinentia pigmenti, morbus Kindler. 44

3.2.3

Egyéb epidermolyticus genodermatosisok

3.2.3.1 Pemphigus familiaris benignus (Hailey-Hailey betegség) Autoszomális domináns módon öröklodo ritka hólyagos borbetegség (OMIM 169600). A pubertás környékén kezdodik, shubokban zajlik, az egész életen át fennáll. Elsosorban a dörzsölésnek kitett területeken (hónaljban, lágyékhajlatban, mellek alatt) gyulladt alapon ülo igen laza falú hólyagok keletkeznek. A folyamat a szélén hólyagkoszorúval terjed, miközben a közepe gyógyul. Hideg idoben spontán javulást mutat. Szövettanára a szuprabazális epidermis kifejezett acatholysise, hólyaguri acantholyticus sejtek jelenléte jellemzo. Hátterében egy kalcium-pumpa fehérje gén, az endoplazmatikus retikulumok (Golgi-apparátus) membránjában helyet foglaló ATP2C1 mutációi állnak (újabb elnevezése: PMR1/SPCA Ca2+/Mn2+-transport ATPase). Valószínuleg, egyes desmosomális fehérjekomponensek szintézisét/transzportját károsítja hibás muködése.

3.2.3.2 Dyskeratosis follicularis (Darier betegség) A dyskeratosis follicularis vagy Darier betegség (OMIM 124200) autoszomális domináns módon öröklodo genodermatosis. Gyakorisága 1:30.000-50.000. A pubertás után, elsosorban a seborrheas borterületeken sárgásbarna színu, helyenként konfluáló, plakkokat képzo keratotikus papulák jelennek meg. Jellegzetes körömelváltozások és szájnyálkahártyatünetek kísérhetik, ill. neuropszichiátriai eltérések (pl. bipoláris betegség, epilepszia) gyakori társulását is megfigyelték. Hisztológiailag dyskeratosis és acantholysis kíséri. Ultrastrukturálisan a desmosomális struktúra felbomlása, a keratinfilamnetumok perinukleáris aggregációja és cytoplasmatikus vacuolisatio, lysis jellemzi. A jellegzetes fenotípus hátterében a 12q23-24.1 kromoszomális elhelyezkedésu sarco/endoplasmatikus retikulum kálcium ATP-áz (SERCA2) nevu fehérjét kódoló ATP2A2 gén mutációi állnak. Feltételezheto, hogy az ATP2A2 gén mutációi ún. haplo-insufficiencia révén vezetnek

a

keratinocyták

kalcium

homeosztázisának

intracelluláris hyperkalcémián keresztül a kóros fenotípushoz.

45

megzavarásán,

következményes

4 Klinikai adatok, anyag és módszer 4.1 Betegek klinikai adatai 4.1.1

Klinikai adatok, a kutatás etikai vonatkozásai A dolgozatban szereplo betegek a Semmelweis Egyetem Bor- és Nemikórtani Klinikáján,

a Heim Pál Gyermekkórház Borgyógyászati osztályán és a münsteri Westfälische Wilhelms Egyetem Borgyógyászati Klinikáján muködo gyermek-borgyógyászati és bullosis ambulancia, valamint az intézetünkben muködo Epidermolysis Bullosa Centrum gondozása alatt állnak. Doktori munkám részét képezte a betegek adatainak, vizsgálati eredményeinek komplettálása, regiszetbe rendezése. Munkacsoportunk rendelkezik a Tudományos Kutatásetikai Bizottság engedélyeivel, melyek mintavételekhez, ezek feldolgozásához, az eredmények közléséhez, genetikai tanácsadáshoz és prenatális diagnózis felállításához szükségesek.

4.1.2

Epidermolyticus palmoplantaris keratoderma

4.1.2.1 EPPK/1 Zavartalan terhességbol, terminusra született, vérrokonságban nem álló szüloktol származó, jelenleg 22 éves nobeteg. Bortünetei 2-3 hónappal a születése után jelentkeztek kezdetben a thenár és a sarok területén valamint az ujjbegyeken, melyek a késobbiekben konfluáltak, lassú progressziót mutattak. Az index személy klinikai vizsgálata során diffúz, szimmetrikus, pathognomikus erythemas szegéllyel övezett tenyéri-talpi hyperkeratosist észleltünk, hólyagképzodés nélkül. Elmondása szerint szezonális jelleggel, tavasszal és osszel hólyagok és lemezes hámlás jelentkezik az érintett területeken. A bor a test egyéb régióiban, a száj nyálkahártya, a fogak, a haj és a köröm eltérés nélküli. A család számos generációjában nagy számú, hasonló tünetekkel rendelkezo személy fordul elo. Az index személy fenotípusa EPPK (Vörner) (8. ábra).

46

8. ábra. a: Erythemas szegéllyel övezett tenyéri hyperkeratosis. b: Erythemas szegéllyel határolt talpi hyperkeratosis. c: A család azonos klinikai tünetekkel rendelkezo tagjai

4.1.3

Epidermolysis bullosa simplex

4.1.3.1 EBS-DM /1 7 éves, kedvezotlen szociális körülmények között élo roma fiúgyermek. Szülei és két idosebb fiútestvére egészségesek, a családban egyéb öröklodo betegség és borbetegég nem fordult elo. Terminusra született, az elso hólyagok a végtagokon, törzsön és periorálisan a szülésekor jelentkeztek. A bortünetek nemcsak mechanikai stresszt követoen, hanem spontán is keletkeznek. Klinikai vizsgálatakor szimmetrikus, diffúz tenyéri-talpi hyperkeratosis mellett kiterjedt körömdystrophiát észleltünk. Herpetiform megjelenésu vesiculáris laesiók testszerte megfigyelhetoek voltak. Hólyagosodást követo erosiok képzodtek a hyperkeratotikus tenyereken és talpakon, valamint serosangvinosus bullák a mindkétoldali könyök, térd és boka felett. A szájnyálkahártya tünetmentes volt. Az erosen viszketo hólyagos bortünetek hegképzodés nélkül, hyper-és depigmentációval gyógyulnak, a hólyagképzodés dinamikájára szezonális variabilitás nem jellemzo. A gyermek fenotípusa jelenleg súlyos, aktív hólyagképzodéssel zajló EBS-DMnak megfelelo. (9. ábra ).

47

4.1.3.2 EBS-DM/2 A 26 éves EBS-DM diagnózisú nobeteg egészséges, vérrokonságban nem álló szüloktol származik, és két egészséges, bortünetekkel nem rendelkezo leánygyermek édesanyja. Születését követo 3. naptól fogva és gyermekkorát végigkisérve a törzsét és végtagjait hólyagok

borították,

bore

igen

sérülékeny

volt,

a

legkisebb

mechanikai

traumára

hólyagképzodéssel reagált. Az exponált borterületeket (kéz, könyök, láb, térd) folyamatosan hólyagok és erosiók borították. A hólyagok heg és miliumképzodés nélkül gyógyultak. Szezonális variabilitás, „nyári hólyagosodás” a betegség lefolyását nem jellemezte. Bortünetei az életkor elorehaladtával regrediáltak. Jelenleg csupán minden körömre kiterjedo körömdystrophia és diffúz, szimmetrikus, tenyéri-talpi hyperkeratosis figyelheto meg, aktív hólyagosodás nélkül. Az index személy fenotípusa enyhe EBS-DM (9. ábra ).

4.1.3.3 EBS –WC/1 A 6 éves epidermolysis bullosa Weber-Cockeyne (EBS-WC) diagnózisú leánygyermeken a születését követo 3.nap óta feszes falú, sero-sanguinosus bennéku, hegek és miliumok nélkül gyógyuló hólyagok és erosiók folyamatosan megfigyelhetoek a tenyereken és talpakon.

A

hólyagképzodés intenzitása szezonális variabilitást mutat, a nyári hónapokban nagyobb számban keletkeznek bullák. Jelenleg a tenyéri-talpi területek kezdodo focalis hyperkeratosisa is megfigyelheto. A nyálkahártyák nem érintettek. A gyermek szülei nem vérrokonok. Édesapja és krónikus pyelonephritisben szenvedo idosebb fiútestvére hasonló bortünetekkel rendelkezik. Mindkét gyermek mérsékelt mentális retardáció miatt áll pszichológiai gondozás alatt. (9. ábra ).

48

9. ábra. a-b: Herpetiform megoszlású serosanguinosus hólyagok (EBS-DM/1). c: Diffúz, szimmetrikus palmoplantaris keratoderma (EBS-DM/2). d-e: Tenyéri-talpi hólyagok (EBSWC/1)

4.1.4

Epidermolysis bullosa dystrophica

4.1.4.1 EBD/1 A domináns EBD fenotípusú index személy, a 17 éves fiú és a 45 éves pater családjában három egymást követo generációban jelentkeztek típusos bortünetek. Minden érintett személy esetében az enyhe hólyagképzodés a születés után korán jelentkezett, a gyermekkort végigkísérte, majd kora felnottkorban intenzitása mérséklodött. Bortüneteik elsosorban a mechanikai stressznek kitett területeken, a kéz és lábfejen, a könyökön, a térden voltak és hegek, miliumok hátrahagyásával gyógyultak. Körömdystrophia és másodlagos anonychia csupán a lábujjak körmein volt megfigyelheto. Albopapuloid tünetek (Pasini papulák) nem jelentkeztek (10. ábra).

49

4.1.4.2 EBD/2 A 25 éves fiatal férfibeteg diagnózisa enyhe, nem-Hallopeau-Siemens típusú EBD. Hólyagok születése óta észlelhetoek a kéz és lábfejeken, valamint a térdek és könyökök felett. A család többi tagja tünetmentes. A klasszikus dystrophiás formát mutató hólyagosodás, milium és hegképzodés mellett, 23 éves kora óta viszketo, pruriginosus albopapuloid tünetek jelentkeztek a mindkétoldali pretibiális régióban. Enyhe körömdystrophia egészíti ki a klinikai képet (11. ábra).

4.1.4.3 EBD/3 A 6 éves nem-Hallopeau-Siemens típusú EBD diagnózisú fiúgyermek kiterjedt hólyagképzodése 9 hónapos korától zajlik. Miliumokkal, hegekkel gyógyuló nagyméretu, feszes, gyakran haemorrhagiás bennéku bullák és kíséro erosiók állandóan jelen vannak a kéz és lábfejeken, könyökökön, térdeken és a pretibialis régióban. A lumbosacralis terület hólyagosodása szintén gyakori. Kiterjedt körömdystrophia észlelheto, syndactylia és synechia képzodése nélkül. A nyálkahártyák nem érintettek. Szülei és idosebb fiútestvére tünetmentesek (11. ábra).

4.1.4.4 EBD/4 Az 5 éves ukrán származású fiúgyermek klinikai képe a Hallopeau-Siemens EBD gyorsan progrediáló, legsúlyosabb formájának megfelelo. Kiterjedt bor- és nyálkahártya tünetek észlelhetoek, melyek hegképzodéssel gyógyulnak, körömhiány, a kéz és lábujjak synechiái és mutiláció javalamint növekedési retardáció figyelheto meg. A klinikailag egészséges szülok nem vérrokonok (12. ábra).

4.1.4.5 EBD/5 A 6 éves Hallopeau-Siemens EBD-ben szenvedo lányon születése óta észlelheto generalizált

hólyagképzodés,

következményes

mely

impetiginizációval,

hegek

és

miliumok

körömvesztéssel,

hátrahagyásával acralis

gyógyul,

mutilációval

és

pseudosyndactyliával. A kézujjak synechiáit több alkalommal sebészileg korrigálták. Családi anamnézise negatív, a család egyedüli érintett tagja (12. ábra).

4.1.4.6 EBD/6 A 25 éves Hallopeau-Siemens szindrómás nobeteg egészséges, vérrokonságban nem álló szüloktol származik. Négy élo, egészséges testvére mellett a család 6 hónapos korában pontosan 50

nem identifikált hólyagos borbetegség által érintett leánygyermeket veszített el. Betegünk cachecticus, infantilis habitusú, amenorrheás nobeteg volt. Súlyos, kiterjedt spontán hólyagképzodése volt, mely hegekkel gyógyult, ami a kéz és lábujjak következményes fúziójához és mutilációjához vezetett. Szájnyálkahártya erosiói microstomiához, súlyos carieshez hiányos fogazathoz vezettek, a nyelv mozgása a frenulum fibrosisa miatt nehezített volt. További komplikációt az oesophagusstenosis, a súlyos nephrosis szindrómában megnyilvánuló sekunder reaktív amyloidosis és az e kórképben gyakori, rapidan progrediáló, szokatlan lokalizációjú, hamar áttétet adó cutan laphámrák jelentett. Az EBD-ben szokatlan, ismétlodo bronchitis, pneumonia és pulmonális abscessus miatt két alkalommal pulmonológiai intezív ellátást igényelt. Tünetei hátterében a szekunder amyloidosis pulmonális manifesztációját sejtettük. (12. ábra)

4.1.4.7 EBD/7 6 éves német leánygyermek diagnózisa epidermolysis bullosa dystrophica generalisata. Bortünetei születése óta fennállnak. Bár a folyamatos hólyagképzodés hegképzodéssel és számos miliummal gyógyul, pseudosyndacylia és mutiláció nem észlelheto.

10. ábra. A domináns epidermolysis bullosa dystrophica diagnózisú pater (a, c) és az index személy (b, d) klinikai tünetei (EBD/1 család). A mechanikai traumának kitett területeken (kéz és lábfejek) a dermális hólyagok nyomán kialakult hegek és miliumok. A lábujjakon körömdystrophia. 51

11. ábra. Recesszív, nem Hallopeau-Siemens variáns fenotípusú betegek bortünetei. a-b: A kézujjakon és a térdeken véres bennéku dermális hólyagok, hegek (EBD/3). c-d: A mechanikai traumának leginkább kitett területeke, a könyökön és térden erosiók, a hólyagképzodést követo hegek (EBD/2).

12. ábra. Recesszív Hallopeau-Siemens variáns fenotípusú betegek bortünetei. a: Súlyos, generalizált hólyagosodás nyomán kialakult atrophiás hegek, körömvesztés, az ujjak fúziója (pseudosyndactyia) (EBD/4). b: Véres bennéku hólyagok, erosiók, kiterjedt hegképzodés. A kézujjak körmeinek elvesztése és kezdodo fúziója (EBD/5). c: Elorehaladott fúzió 52

(pseudosyndactylia), flexiós kontraktúra, a végpercek elvesztése (mutiláció), kiterjedt hegesedés, erosiók (EBD/6). d: Az EBD fatális szövodménye, a szokatlan lokalizációjú, a nyak dorzális felszínén, a vertebra prominens felett elhelyezkedo 4x6 cm nagyságú exulcerált spinocellularis carcinoma (EBD/6).

4.1.5

Kontrollok Munkánk során minden ismétlodo és új mutáció esetében 50 egészséges, bortünetekkel

nem rendelkezo, negatív családi anamnézisu személytol származó 100 normál allélt vizsgáltunk, mint kontrollt. Kizártuk annak lehetoségét, hogy az általunk talált genetikai defektus az adott gén fenotípusbeli változást nem okozó neutrális polimorfizmusa lenne. Ismétlodo mutáció esetén meghatároztuk annak a normál populációban kimutatható elofordulási gyakoriságát.

4.2 Módszerek 4.2.1

Családfa feltérképezése, öröklodésmenet vizsgálat A genodermatosisok vizsgálatának elso lépése a részletes családi anamnézisen alapuló

pedigré analízis. Az általunk vizsgált betegség gén csoport az autoszómákon öröklodik. Autoszomális domináns öröklodésmenetu formák esetében nagy családfákon az egészséges és beteg személyek aránya közel megegyezo, az index személy valamelyik szüloje szintén beteg, leszármazottai között pedig 50%-os eséllyel nemüktol függetlenül betegek. A családtagokat reprezentáló családfán a betegség szegregációja vertikális. Recesszív kórformákban az indexszemély szülei klinikailag egészségesek, és a családfán az esetek halmozódása vízszintes elrendezésu. A pedigré analízise önmagában nem elegendo az öröklodésmenet tisztázásához. Számos autoszomális domináns öröklodésmenetu eset (pl. EBS-DM, DDEB) kapcsán tapasztaltuk, hogy az indexszemély szülei klinikailag tünetmentesek voltak, és a késobbi genetikai vizsgálat sem találta meg a perifériás vérbol izolált genomiális DNS mintáikban a proband esetében azonosított mutációt. Ezekben az esetekben a családfa mutatóitól eltéroen autoszomális domináns öröklodésmenetu formákról van szó, és felmerül a mutációgenezis de novo, ill. az átörökítésnek a szülok gonadális mozaicizmusán alapuló formája.

53

4.2.2

Klasszifikáció Az EB betegek klinikai klasszifikálása az alábbi ajánlás figyelembevételével történt:

Fine JD, Eady RAJ, Bauer EA et al. Revised classification system for inherited epidermolysis bullosa: Report of the Second International Consensus Meeting on diagnosis and classification of epidermolysis bullosa. J Am Acad Dermatol 2000; 42:1051-1066.

4.2.3

Hisztopatológia Szövettani mintavétel lokális lidocain anesztéziát követo atraumatikus, az ép-kóros

részlet határáról történo sebészi kimetszéssel, ritkábban punch-biopsziás mintavételi eszközzel történt. A szöveti minták feldolgozása során, amennyiben annak nagysága lehetové tette, a hagyományos hisztopatológiai, immunfluoreszcens antigén mapping valamint ultrastrukturális elemzések együttes elvégzésére törekedtünk. A betegek bormintáinak hisztopatológiai vizsgálata formalinban fixált, majd paraffinba ágyazott blokkok metszését követo haematoxylin-eosin festéssel történt.

4.2.4

Antigén mapping Az antigén mapping, a bazálmembrán proteinek expressziójának immunhisztokémiai

módszerekkel történo meghatározása és a hólyagalaphoz ill. hólyagfedélhez viszonyított festodésük vizsgálatára szolgáló módszer. Egyszeru, gyors vizsgálat a hólyagképzodés szintjének megállapítására. Friss hólyag esetében, az ép és kóros borterület határáról vett borbiopsziás mintát számos bazálmembránkomponens ellen irányuló antitesttel egyesével, kontroll borminta jelenlétében festjük, és a hólyagfedélhez vagy a hólyagalaphoz való viszonyuk, mintázatuk alapján következtetünk a lysis szintjére. A 6? m vastagságú cryostattal metszett borbiopsziás mintákat indirekt immunfluoreszcens vizsgálatnak vetjük alá. A következo monoclonális antitesteket használtuk: 161-6 és fúziós protein NC2-7 (anti-kollagén VII) (63), mAb-1D1 (anti-BPAG2) (64), BM-2 (anti-laminin 5 ? 3) (65), 6F12 (anti-laminin 5 ? 3) (66), GB3 (anti-laminin 5 ? 3 és ?2) (67) és GoH3 (anti-integrin ? 6) (68), anti-cytokeratin 14. Továbbá egyéb autoimmun betegségben szenvedo betegek policlonális IgG frakcióba tartozó antitestjeit tartalmazó savókat (epidermolysis bullosa acquisita – anti VII. kollagén, Good-Pasture szindróma – anti IV. kollagén, bullosus pemphigoid - anti BP180). Második antitestként FITC-el konjugált kecske anti-egér (Jackson, USA) és nyúl antihumán (DAKO, Danemark) IgG –t használtunk.

54

4.2.5

Ultrastrukturális elemzés A borbiopsziás minták elektronmikroszkópos vizsgálatához 4% paraformaldehid és 1%

glutáraldehid tartalmú fixálást alkalmaztunk, majd Poly/Bed 812 Embedding Media (Polysciences, Inc.) –gyantába ágyaztuk. A minták analízise Philips CT 10 mikroszkóppal történt.

4.2.6

DNS-izolálás

4.2.6.1 Salting out Genomiális DNS szeparálása 18 ml EDTA-val alvadásgátolt periferiás vérbol történt. A perifériás vér lymphocytáiból módosított Miller módszere szerint „salting out” technikával nyertünk DNS-t, melyet génbankunkban -80ºC-on tárolunk (102).

4.2.6.2 DNS preparáló kit Genomiális DNS-t mindösszesen 180? l-nyi EDTA-val alvadásában gátolt vérbol standard kit technológiával is nyerünk (SIGMA GenTM Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit). Elonye a salting out technikához képest a kis mintaszükséglet, ami kisgyermek és csecsemokorú betegeink esetében igen fontos szempont, továbbá a nyert minta nagyfokú tisztasága az elvégzésére fordított ido rövidsége. A módszer hátránya, hogy nem jutunk nagy mennyiségu DNS-hez.

4.2.7

PCR amplifikáció A adott gének DNS-szekvenciájának és exon-intron szerkezetének ismeretében a PCR

amplifikációhoz olyan oligonukleotid primereket használtunk, amelyek az exonokat övezo intronikus szekvenciákkal komplementerek voltak. Így a PCR reakciók termékei mind az egyes exonokat, mind az mRNS érése során az exonok helyes kivágódását biztosító junkció (donor és acceptor splice site) szekvenciákat tartalmazták. PCR termékeink nagysága általában 190-600 bp közé esett. Az általunk használt primerek nagyobbrészt az irodalomból ismertté vált ún. konszenzus primerek voltak, kisebb részt saját tervezésu oligonukleotidok. A standard amplifikációs feltételek a következok voltak: 95?C - 5 min, majd 95?C - 45 s, 54-64?C annelációs homérséklet 30 s, 72?C - 4 min, x 40 ciklus a Perkin-Elmer 9600, valamint TouchGene (Techne Cambridge Ltd UK) thermo-cyclerekkel. Az amplifikációs reakcó össztérfogata 50µl volt, komponensei: 50 ng templát DNS, 10xPCR puffer MgCl2 –dal (GIBCO/BRL), 2 U Taq polymerase (GIBCO/BRL), 10 mM minden egyes nukleotidból (Perkin55

Elmer GeneAmp dNTPs), és 25 pM primerekbol állt, az össztérfogat 50? l volt. 5? l aliquotokat 2% agaróz gél-elektroforézis során ethydium bromide-dal tettük láthatóvá.

4.2.8

Heteroduplex analízis, konformációszenzitív gél-elektroforézis A mutáns exonok kimutatására és kiválogatására szuro módszerként a mismatch

hibridizáció elvén alapuló heteroduplx analízist végeztünk (104). A módszer elve az, hogy ha a vizsgálandó, mutációt hordozó PCR terméket egy vad típusú standard aplifikátummal keverjük össze, majd az elegyüket denaturáljuk, egyszálú DNS láncok halmazát kapjuk. Ha a következo lépésben a mintánkat lehutjük, az egyszálú DNS láncok ismét összekapcsolódnak, renaturálódnak. Ez után azonban már nem csak a kiinduláskor jelenlévo mutáns és vad típusú exon amplifikátumok homoduplexei vannak jelen, hanem kétféle, egymásnak komplementer vad és mutáns szekvencia összekapcsolódásából létrejött heteroduplexek is. A heteroduplexek megjelenése utal a vad típusú szekvenciától eltéro nukleotid sorrendre vagy számra. A heteroduplexek kimutatása nagy felbontású, denaturálószert tartalmazó polyacrilamid gélen történo elválasztáson alapul. Az egymástól akár csak egy nukleotidban (pontmutáció), vagy akár többletben (insertio) vagy hiányban (deletio) különbözo heteroduplex szálai között az adott nem komplementer részletben gyengül a kohézió. A gélben való futtatás során közölt ho és egyéb kémiai denaturáló szerek (formamid és ethylen glicol) hatására a mismatch hibridizált nukleotidok bázisai közötti kötések felbomlanak, majd a bázisok kifele rotálnak a DNS molekula tengelyébol. A DNS molekula ezen a ponton megtörik. A megváltozott konformációjú heteroduplexek vándorlási sebessége az általában komigráló homoduplex DNS-szekvenciákhoz képest csökken. Az ilyen módon létrejövo vándorlási mintázatot shift-nek nevezik, jelenléte heteroduplex képzodésre utal. Konformáció-szenzitív gél-elektroforézis (CSGE)–ben végzett heteroduplex analízishez az 1-8 µl térfogatú PCR termékeket 5 min ideig 98?C–on denaturáltuk, majd további 55 min ideig inkubáltuk ill. renaturáltuk 68?C-on a futtatás elott. A vertikális, 8%-os polyacrilamid gél 10% ethylen glycolt és 15% formamidot tartalmazott. A heteroduplexeket SYBR Green I (FMC BioProducts) festéssel tettük láthatóvá. Az index személy DNS mintája mellett normál kontroll DNS-t, továbbá a két DNS minta megfelelo arányú keverékét szimultán vizsgáljuk. Heterozigóta módon hordozott eltérés esetén shiftet detektálhatunk az index személy mintája mellett annak vad típusú kontroll mintával való elegyében is. Homozigóta pontmutációk/polimorfizmusok vizsgálatakor shift nem jelentkezik az index személy mintájának futtatásakor, csupán a kontroll amplifikátummal készített elegyben képzodhetnek heteroduplexek. Deléciók vizsgálatakor a 56

deléciót szenvedett DNS szálakból képzett homoduplexek vándorlási sebessége megno, ezért a normál kontroll homoduplexektol disztálisan detektálhatóak. Az insertált homoduplexek ezzel szemben a futtatás során „lemaradnak”, proximálisan helyezkednek el a vad típusú homoduplexekhez

viszonyítva.

A

DNS

szálaik

között

számbeli

eltérést

tartalmazó

heteroduplexek instabilak, kis mennyiségben képzodnek ill. maradnak egyben az elektroforézis során. A hurokképzodés miatt, konformációjuk jelentosen eltér a homoduplexekétol, ezért jelentosen csökken a migrációs sebességük, pl. nagy deléciók esetében a homoduplexektol jelentos távolságban, proximálisan detektálhatóak. A heterozigóta státusban deléciót hordozó DNS szálakból felépült homoduplexek a polyacrilamid gélbol visszanyerhetoek. 4°C-on desztillált vízben 24 órás inkubáció során a deletált homoduplexeket tartalmazó szeparált gélbol a DNS fragmensek a vizes fázisba diffundálnak, ahonnan az eredeti reakció során is alkalmazott PCR primerek alkalmazásával reamplifikálhatók. Az így nyert PCR termék tisztán tartalmazza a deléciót hordozó szekvenciát a normál szekvenciától mentesen, ezért a szekvenciaanalízis során frame-shift nélküli, értékelheto szekvenciaadatokhoz juthatunk. A konformációszenzitív gélben végzett heteroduplex analízist hazánkban elsoként alkalmaztuk. A Conradi-Hünermann-Happle szindróma hátterében álló emopamil binding protein

(3? -hydroxysteroid-? 8-? 7-isomerase)

génhiba

esetében

heteroduplex

analízis

segítségével azonosítottuk a mutációt hordozó exont (105).

4.2.9

Automata szekvencia analízis A heteroduplex analízis során shift pozitívnak bizonyult PCR mintákat direkt automata

szekvenciaanalízisnek vetettük alá (ABI Prism 310 automated sequencing system - Applied Biosystem). A szevenciaanalízist a Genome Express (Grenoble, France), a H-MED Diagnosztikum Kft. (Budapest, Magyarország) valamint a GENODIA Kft. (Budapest, Magyarország) munkatársai végezték. Eredményeink értékelése során a nukleotidok és codonok számozását minden esetben az adott gén kódoló szekvenciájának kezdetétol indítottuk (1. metionin aminosav, ill. A az ATG=1), a GenBank adott Homo sapiens mRNA szekvenciaadatainak megfeleloen ((keratin 9 - hivatkozási szám: NM 000226; keratin 14 hivatkozási szám: NM 000526; kollagén VII. – hivatkozási szám: L02870).

57

4.2.10 Mutációverifikálás restrikciós endonukleázok segítségével Az vizsgált betegek családtagjainak szurovizsgálatára, a mutáns allélek szegregációjának nyomon követésére 5-17? l PCR terméket emésztettünk restrikciós endonukleázok segítségével. (Aci I, Tsp509 I, Sty I, BstN1, Hph I, Nci I, Xho I, MspI, BsiEI, BsphI, New England BioLabs Inc. USA). Az emésztés termékeit 2-4% agaróz gél-elektroforézissel vagy 6-12%-os polyacrylamid gél-elektroforézissel, ethydium bromide vagy SYBR Green I festéssel tettük láthatóvá.

58

5 Eredmények 5.1 Epidemiológiai megfigyelések A herediter epidermolysis bullosa valamennyi kontinensen és rasszban elofordul. Incidenciája Európában és az USA-ban 1:50.000-100.000 körüli, mely az EB összgyakoriságát tükrözi, természetesen altípusonként és egyes populációnként ettol eltérés észlelheto (10). Az 1995-ben alapított Országos Epidermolysis Bullosa Centrum, mely DEBRA (Dystrophic Epidermolysis Bullosa Research Association) Hungary néven a DEBRA Europe-ba integrálódott, 54 epidermolysis bullosa betegség által érintett családot és 112 beteget gondoz, így megállapítható, hogy hazánkban a nemzetközi tapasztalatokkal megegyezo arányban fordul elo e ritka borbetegség. A betegek közel 51% simplex típusú eltéréssel rendelkezik, junctionalis EB által érintett beteget ritkán diagnosztizálunk (3%). A domináns EBD gyakorisága 33%, recesszív, nemHallopeau-Siemens típusú EBD betegek 6%-os, valamint a súlyos, mutilációval járó HalloeauSiemens szindrómás betgek 7%-os arányban fordulnak elo az EB altípusai között (13. ábra).

13. ábra. Az epidermolysis bullosa altípusainak megoszlása hazánkban

Az epidermolyticus palmoplantaris keratoderma irodalmi incidenciája 1:25.000, világszerte összességében csupán 28 család körében végeztek molekuláris genetikai vizsgálatot a

59

kórkép hátterében (82-90). Hazánkból csupán négy EPPK által érintett családról közöltek adatokat, s ezek közül háromban vált ismertté kóroki KRT9 mutáció (44).

5.2 Morfológiai

eredmények

(hisztopatológia,

antigén

mapping,

ultrastruktúra) 5.2.1

Szuprabazális epidermolysis: EPPK Az EPPK/1 beteg bormintájának rutin hisztológiai vizsgálata során a stratum spinosum és

stratum granulosum felso rétegeiben epidermolysis, valamint a stratum corneum vaskos hyperkeratosisa volt észlelheto (14. ábra). Ultrastrukturálisan karakterisztikus tonofilamentum clump-képzodés és cytolysis látható a felso szuprabazális keratinocytákban (15. ábra).

14. ábra Bor hisztológia: epidermolysis a stratum spinosum és granulosum rétegeiben, a startum corneum kiszélesedése mellett (Haematoxylin-eosin festés, x40)

60

15. ábra. Bor elektronmikroszkópia: tonofilament clumping (kc) és cytolysis (ly) a stratum spinosumban és granulosumban. Egység: 5 ? m.

5.2.2

Bazális epidermolysis: EBS Az EBS-DM/1-2 és EBS-WC/1 betegek friss, hólyagos tüneteibol vett borbiopsziás

mintáiban az EBS típusos tünete, a bazális keratinocyták lysise volt kimutatható. Immunfluoreszcens antigén mapping vizsgálat során a bazálmembránprotein komponensek ellen irányuló antitesteket jelzo fluoreszcencia a hólyagalapon volt észlelheto (szuprabazális lysis) (16. ábra). Monoklonális anti-cytokeratin 14 antitesttel végzett immunhisztokémiai vizsgálat, a bazálspecifikus

cytokeratin

14-et

expresszáló

bazális

keratinocyták

szintjén

zajló

hólyagképzodést mutatott (17. ábra). Az EBS-DM/1-2 betegek esetében a szubnucleáris cytolysis mellett, a Dowling-Meara altípus speciális differenciáldiagnosztikai jellegzetessége, a keratin clumps-képzodést is kimutattuk (18. ábra).

16. ábra Immunfluoreszcens antigén mapping. 6F12 (anti-laminin 5 ? 3-lánc) monoklonális antitesttel végzett festés. a: A bazálmembrán lineáris festodése felett, a bazális keratinocyták szintjén húzódó résképzodés epidermolysis bullosa simplexben (EBS-WC/1) (x40). b: normál kontroll bor (x40). 61

17. ábra. Immunhisztokémiai vizsgálat monoklonális, bazálspecifikus anti-cytoketain 14 ellenes antitestekkel. a: Cytokeratin 14-pozitív bazális keratinocytákon keresztül húzódó epidermolysis (EBS-DM/1). b: normál kontroll borminta.

18 ábra. Ultrastrukturális vizsgálat. a: Az epidermis ultrastrukturális képe a bazális keratinocyták szintjén zajló hólyagképzodéssel (EBD-DM/1). Egység: 0,1 ? m. b: Keratin tonofilamentum kötegek és tonofilamentum clumping (EBD-DM/2). Egység: 0,1 ? m. Kf: keratin filamentum, Kc: keratin clumps, Ly: lysis, Bm: bazálmembrán.

5.2.3

Szubbazális epidermolysis (dermolysis): EBD Az EBD betegek esetében a bazálmembrán alatt, az anchorrostok mentén alakul ki lysis.

Immunfluoreszcens antigén mapping vizsgálat során, a VII. kollagén és a bazálmembránprotein komponensek ellen irányuló antitestek egyaránt a hólyagfedélen detektálhatóak. A súlyos klinikai tünetekkel rendelkezo, recesszív öröklodésmenetu betegek esetében a VII. kollagén 62

festodés súlyos redukciója, vagy teljes hiánya észlelheto. Domináns öröklodésmenetu, enyhe klinikai tünetekkel járó altípusok esetén a hólyagfedélen a VII. kollagén festodés megtartott vagy minimálisan redukált (19. ábra). A súlyos klinikai tünetekkel rendelkezo, recesszív öröklodésmenetu

betegek

esetében

ultrastrukturálisan

a

VII.

kollagénbol

felépülo

anchorfibrillumok súlyos redukciója, vagy teljes hiánya észlelheto. Domináns öröklodésmenetu, enyhe klinikai tünetekkel járó altípusok esetén az anchorfibrillumok kóros morfológiája, kisfokú redukciója detektálható (20. ábra).

19. ábra. Immunfluoreszcens antigén mapping. a: Enyhe klinikai tünetekkel rendelkezo domináns EBD/1 beteg immunfluoreszcens mapping vizsgálata. A dermális oldalon, a bazálmembrán alatt húzódó lysis. 161-6 (VII. kollagén NC-1 domén) megtartott festodése a hólyagfedélen. (x40). b: Recesszív, nem Hallopeau-Siemens szindrómás beteg esetében megtartott, kismértékben redukált 161-6 (VII. kollagén NC-1 domén) festodés a hólyagfedélen, dermális, szubbazalis hólyagképzodés (x40). c: Mérsékelten súlyos klinikai tünetekkel rendelkezo recesszív, nem Halloeau-Siemens szindrómás beteg bormintájában a VII. kollagén lineáris, redukált festodése (161-6, VII. kollagén NC-1 domén) a hólyagfedélen látható (x120). d: normál kontroll borminta (x120).

63

20. ábra. a: Domináns EBD beteg ultrastrukturális képe (EBD/1). A bazálmemebrán alatti résképzodés megtartott anchorfibrillumokkal (VII. kollagén). Egység: 0,05 ? m b: Súlyos, mutiláló recesszív EBD beteg ultrastrukturális képe (EBD/6). A bazálmembrán alatti résképzodés hiányzó anchorfibrillumokkal (VII. kollagén). Egység: 0,1 ? m.

Kf: keratin

filamentum, Ll: lamina lucida, Ld: lamina densa, Hd: hemidesmosoma, Af: anchor fibrillum (VII. kollagén), * hiányzó anchor fibrillumok (VII. kollagén).

5.2.4

Új komplikáció: pulmonális sekunder amyloidosis EBD/6 betegünk pulmonológiai intenzív ellátás ellenére rapidan progrediáló bilaterális

pneumonia talaján kialakult cardiorespiratorikus insufficiencia következtében veszítettük el. A máj, lép és vese autopsziás mintáiban kiterjedt amyloidósist találtunk. A mellékpajzsmirigy eltérés nélküli volt. Haematoxylin-eosin festéssel a vese glomerulusaiban amorf,

homogén

eosinophil

anyagot,

valamint

ultrastrukturálisan

a

glomerulusok

mesangiumában finom, fibrilláris struktúrát észleltünk, melyek amyloid specifikus thioflavine T és amyloid AA specifikus immunhisztokémiai festéssel pozitívak voltak. A rekurráló légúti infekciók hátterében sejtett amyloidosis kimutatására törekedtünk a tüdo autopsziás minták esetében is. Thioflavine T és AA amyloid pozitivitást észleltünk a bronchiális epithelium bazálmembránja mentén, valamint a kis vénák és arteriolák falában (21. ábra).

64

21. ábra. Az epidermolysis bullosa dystrophica Hallopeau-Siemens variánsában szenvedo beteg autopsziás szövettani mintái. a: Szubepidermális, bazálmembrán alatti lysis a borben, (haematoxylin-eosin, x25). b: Magasan differenciált spinocelluláris carcinoma, dermális invázió, mérsékelt atypia, helyenként szarugyöngy képzodés (haematoxylin-eosin, x25) c: Amyloid depozitumok a vese glomerulusaiban és a kiserek falában (Thioflavin T festés, x40). d: AAtípusú amyloid depozitumok a vese glomerulusaiban és a kiserek falában (anti-amyloid AA festés, x40). e: Amyloid depozitumok a bronchusok bazálmembránja mentén (Thioflavin T festés, x120). f: AA-típusú amyloid depozitumok a bronchusok bazálmembránja mentén (antiamyloid AA festés, x40).

65

5.3 Molekuláris genetikai eredmények 5.3.1

KRT9 mutáció

5.3.1.1 EPPK/1 A KRT9 gén 1. exonát tartalmazó PCR fragmentum direkt szekvenciaanalízise során heterozigóta módon hordozott új, az irodalomban és a genetikai adatbázisokban nem szereplo A? T transzverziót találtunk a 479. nucleotid pozícióban, mely aszparagin (AAT) ? isoleucin (ATT) cserét eredményezett a keratin 9 protein 160. aminosavpozíciójában (codonában) (22. ábra). Mivel a 479A? T mutáció megszünteti a Tsp509 I restrikciós endonukleáz hasítási helyét, ezért a mutáció az enzim használatával verifikálható. A 429 bp PCR termék a Tsp509 I emésztése után két fragmentumra bomlik (275 bp, 154 bp) a vad típusú allélek esetében, a mutáns allél esetében viszont a hasítási hely eliminációja miatt a 429 bp termék változatlanul egyben marad (23. ábra). A mutáns allél szegregációja ezen módszerrel nyomonkövetheto az érintett családtagok körében. Annak kizárására, hogy 479A? T neutrális polimorfizmus lenne, a KRT9 1. exon részletét 50 normál kontroll személy esetében 100 egészséges allélon vizsgáltuk Tsp509 I restrikciós endonukleáz emésztés segítségével. Nem találtunk eltérést a 100 normál allél vizsgálata során.

22. ábra. Az epidermolyticus palmoplantaris keratodermában szenvedo index személy KRT9 génjének szekvencia analízise. 479A? T nukleotid csere eredményeként, a keratin 9 160. aminosav pozíciójában (codonában) aszparagin (AAT)? isoleucin (ATT) cserét eredményezett. 66

a: A keratin 9 aminosav szekvenciája, N160I szubsztitúció. b: A KRT9 gén up-stream szekvenciája, 479A? T szubsztitúció. c: Az index személy down-stream KRT9 szekvenciája, automata szekvencia analízis. A lefelé mutató nyíl a 479A? T, heterozigóta módon hordozott szubsztitúcióra irányul. d: Normál kontroll személy down-stream KRT9 szekvenciája.

23. ábra. a: Öt generációjában érintett epidermolyticus palmoplantaris keratodermában szenvedo család pedigréje. A nyíl az index személyre mutat. b: 479A? T mutáció megszünteti a Tsp509 I restrikciós endonukleáz hasítási helyét. A 429 bp PCR termék a Tsp509 I emésztése után két fragmentumra bomlik (275 bp, 154 bp) a vad típusú allélek esetében, a mutáns allél esetében (IV/5, IV/2, V/1) a hasítási hely eliminációja miatt a 429 bp termék változatlanul egyben marad. U: emésztetlen minta. C: normál kontroll minta.

5.3.2

KRT14 mutációk

5.3.2.1 EBS-DM/1 A KRT14

gén

1.

exonát

tartalmazó

shift-pozitív

PCR

fragmentum

direkt

szekvenciaanalízise során heterozigóta módon hordozott új T? A transzverziót találtunk a 369. nucleotid pozícióban, mely

aszparagin (N) ?

lizin (K) cserét eredményezett 123.

aminosavpozícióban a keratin 14 proteinben (24. ábra). A mutáció nem generál és nem eliminál

67

restrikciós enzimhasítási helyet, ezért a mutáns allél szegregációja CSGE és szekvenálás segítségével követheto nyomon.

24. ábra. a: EBS-DM/1 beteg családfája. A nyíl az index személyre mutat. b: N123K aminosavcsere a keratin 14 fehérje szekvenciájában. c: Heterozigóta módon hordozott új 369T? A nukleotid csere a KRT14 génben. Az ugyanebben a pozícióban lévo 369T? C szubsztitúció aminosavcserét nem eredményezo neutrális polimorfizmus. Up-stream szekvencia. d: Normál kontroll személy KRT14 szekvenciája.

5.3.2.2 EBS-DM/2 Az új, 373C? G transzverzió a KRT14 1. exonában

arginin (R) ?

glicin (G)

szubsztitúciót eredményezett a 125. aminosav pozícióban. Mivel a 373C? G megszünteti az Aci I restrikciós endonukleáz hasítási helyét, ezért a mutáció az enzim használatával verifikálható. A 353 bp nagyságú PCR termék Aci I enzimmel emésztve három kis hosszúságú fragmentumra esik szét (162 bp, 90 bp, 101 bp) a vad típusú allél esetében, míg két, 252 bp és 101 bp hosszúságú fragmentumra a mutáns allél esetében (25. ábra).

68

25. ábra. a: EBS-DM/2 beteg családfája. A nyíl az index személyre mutat. b: N123N aminosavcserét nem eredményezo neutrális polimorfizmus és R125G aminosavcsere a keratin 14 fehérje szekvenciájában. c: Heterozigóta módon hordozott 369T? C neutrális polimorfizmus, és új 373C? G nukleotid csere a KRT14 génben. Up-stream szekvencia. d: Normál kontroll személy KRT14 szekvenciája. e: A 373C? G mutáció megszünteti az Aci I restrikciós endonukleáz egyik hasítási helyét, ezért a mutáció az enzim használatával verifikálható. A 353 bp nagyságú PCR termék Aci I enzimmel emésztve három kis hosszúságú fragmentumra esik szét (162 bp, 90 bp, 101 bp) a vad típusú allél esetében, míg két, 252 bp és 101 bp hosszúságú fragmentumra a mutáns allél esetében (II/1). (A 90bp és 101bp hosszúságú termék nem látható.) M. marker, U: emésztetlen minta, C: normál kontroll minta.

EBS-DM/ 1 és EBS-DM/2 betegek esetében további T? C szubsztitúciót találtunk a 369. nukleotid pozícióban, a 123. codonban. A szubsztitúció nem változtatja meg az asparagin (N) aminosavat kódoló codon információtartalmát. Ezt a neutrális, fenotípusbeli változást nem okozó polimorfizmust korábban többen leírták (61, 62). 50 normál kontroll 100 egészséges allélének szurovizsgálata során a gyakori polimorfizmust 37 allélen találtuk meg (37%).

69

5.3.2.3 EBS-WC/1 Betegünk a KRT14 génben új G? T transzverziót hordoz a 397. nukleotid pozícióban, mely valin (V) ? leucin (L) aminosav cserét okoz a 133. codonban (26. ábra). A mutáció nem generál és nem eliminál restrikciós enzimhasítási helyet, verifikálása CSGE-vel és szekvenálással van mód. Az indexszeméllyel azonos klinikai tünetekkel rendelkezo családtagok valamennyien hordozzák a V133L szubsztitúciót. A család valamennyi vizsgált tagja hordozza a KRT5 gén 4. intronában a 927+15T? C, a fenotípusra hatást nem gyakorló, neutrális polimorfizmust (nem ábrázolva).

26. ábra. a: EBS-WC/1 beteg családfája. A nyíl az index személyre mutat. b: V133L aminosavcsere a keratin 14 fehérje szekvenciájában. c: Heterozigóta módon hordozott új 397 G? T transzverziót a KRT14 génben. Up-stream szekvencia. d: Normál kontroll személy KRT14 szekvenciája.

Az elobb ismertetett új KRT14 mutációkat (N123K, R125G, V133L) 50 normál kontroll 100 egészséges allélének vizsgálata során nem detektáltuk.

5.3.3

COL7A1 mutációk

5.3.3.1 EBD/1 Az elso domináns EBD diagnózisú család érintett tagjai (apa és fia) heterozigóta hordozói a COL7A1 gén 73. exonának 6100G? A, G2034R missense, glicin szubsztitúciós mutációjának. Ezt a tranzíciót elozoleg már több ízben detektálták (136, 137, 129). A 6100. pozícióban történt 70

G? A változás a 2034. glicin (G) aminosav argininre (R) való cseréjét eredményezte, mely a domináns negatív effektus révén akadályozza a VII. kollagén molekulák anchor fibrillumokká való összerendezodését (27. ábra).

27. ábra. a: Domináns epidermolysis bullosa dystrophica fenotípusú beteg családfája. Három egymást követo generációban követheto nyomon a jellegzetes bortünet. A nyíl az index személyre mutat (EBD/1 beteg). b: Heteroduplex analízis. Heterozigóta módon hordozott szubsztitúciós mutációra utaló shift a beteg és hasonló klinikai tünetekkel rendelkezo pater mintájában (COL7A1, 73. exon). c: A 73. exon szekvencia analízise. 6100 G? A, G2034R mutáció az index személy mintájában d: Nci I restrikciós endonukleázzal végzett emésztés. A 6100G? A mutáció az Nci I enzim egyik hasítási helyét eliminálja. A vad típusú 286 bp hosszúságú allél 148bp, 18 bp, 26 bp és 94 bp hosszú fragmentumokra esik szét. A mutáns allél három, egy 148bp, egy 44 bp és egy 94bp fragmensekre esik. A 44 bp hosszú diagnosztikus csík megjelenése az EBD fenotípusú apánál (II/2) és az index személynél (III/1) a mutáció jelenlétére utal. A tünetmentes anya (II/3) és a testvér (III/2) nem hordozó. U: emésztetlen minta, C: kontroll. (A 18 bp és 26 bp hosszú fragmentumok nem láthatóak a képen.).

71

5.3.3.2 EBD/2 Albopapuloid tünetekkel rendelkezo, recesszív, nem-Hallopeau-Siemens EBD diagnózisú EBD/2 betegünk genotípusa compound heterozigótának bizonyult, a proband a két szüloi allélen egymástól eltéro COL7A1 defektust hordoz. Az egyik allélen az 5. intron 682+1G? A ismert splice site szubsztitúcióját (138), mely frame shift révén a mutációtól forward irányban PTC-t generál, a tünetmentes anyánál is detektáltuk. A másik allélen elsoként írtuk le a tünetmentes apa és a proband mintájában egyaránt fellelheto 7984-7delT deléciót a 107. intronban. Mivel további eltéréseket a vizsgált gén teljes terjedelmében nem tudtunk feltárni, a 107. intron deléciójának fenotípusban megnyilvánuló hatást tulajdonítunk, bár 50 egészséges kontroll személy vizsgálata során 3 allélen detektáltuk a deléciót (3%) (28. ábra).

28. ábra. a: Recesszív epidermolysis bullosa dystrophica fenotípusú beteg családfája. A nyíl az index személyre mutat (EBD/2 beteg). b: Heteroduplex analízis. Heterozigóta módon hordozott szubsztitúciós mutációra utaló shift a beteg és a tünetmentes mater mintájában (COL7A1, 5. exon/intron). c: Heteroduplex analízis. Heterozigóta módon hordozott mutációra utaló shift a beteg és a tünetmentes pater mintájában (COL7A1, 107. exon/intron). d: Az 5. exon szekvencia analízise. 682+1G? A splice site mutáció az index személy mintájában. e: A 107. exon-intron

72

szekvencia analízise. 7984-7delT frame shiftet okozó deléció az index személy mintájában f: Bsph I restrikciós endonukleázzal végzett emésztés. A 682+G? A mutáció a Bsph I enzim számára új hasítási helyét generál. A vad típusú allél egyben marad (337 bp), a mutáns allél egy 243 bp és egy 94 bp nagyságú fragmentumra esik szét. A tünetmentes anya (I/2) és a férfibeteg (II/1) heterozigóta hordozói az adott mutációnak, a tünetmentes apa nem hordozó (I/1). U: emésztetlen minta, C: kontroll. (A 94 bp hosszú fragment nem látható a képen.).

5.3.3.3 EBD/3 A recesszív, nem-Hallopeau-Siemens EBD diagnózisú probandunkban az irodalomban már ismert, az anyai allél 95. exonának 7344. pozíciójában levo G? A splice site mutációja mellett (139) elsoként írunk le egy 20 bp terjedelmu deléciót. Az intron 114 és exon 115 közötti junkciót magábanfoglaló és ezzel a splice site-ot elimináló 8441-15del20 deléciónak a proband és a tünetmentes apa egyaránt heterozigóta hordozója. Ez az új mutáció terjedelmében és pozíciójában is hasonló, a korábban leírt 8441-14del21 delécióhoz (140). Dunnil és mtsai szerint a 8441-14del21 deléció a splice site eliminációja miatt a leolvasáskor frame shifthez vezetett, ami a továbbiakban PTC-t generált (29. ábra).

73

29. ábra. a: Recesszív epidermolysis bullosa dystrophica fenotípusú beteg családfája. A nyíl az index személyre mutat (EBD/3 beteg). b: Heteroduplex analízis. Heterozigóta módon hordozott szubsztitúciós mutációra utaló shift a beteg és a tünetmentes mater mintájában (COL7A1, 94-95. exon). c: A COL7A1 gén 94-95. exonának szekvencia analízise. A 95. exon 7344G? A splice site mutációja az index személy mintájában. d: Hph I restrikciós endonukleázzal végzett hasítás. A 7344G? A mutáció az enzim egyik hasítási helyét eliminálja. A vad típusú allél 183 bp, 32 bp, 15 bp, 176 bp, 51 bp hosszú fragmentumokra esik. A mutáns allél 183 bp, 32 bp, 15 bp és 227 bp 74

hosszú fragmentumokra bomlik. A tünetmentes anya (I/2) és a beteg fiúgyermek (II/1) heterozigóta hordozói az adott mutációnak, melyre a 227 bp hosszú diagnosztikus csík megjelenése utal. U: emésztetlen minta (457 bp), C: kontroll. (A 32 bp, 15bp és 51 bp hosszú fragment nem látható a képen). e: Heteroduplex analízis, a COL7A1 gén 114-115. exonait tartalmazó minták. A homoduplexeket (HD) reprezentáló csík elott elhelyezkedo (gyorsabb migrációra utaló) csík (HD-d) nagy kiterjedésu delécióra utal (I/1, II/2). A két komplementer heteroduplex a homoduplexektol messze lemaradva detektálható a gélben (hd). f: Automata szekvencia analízis, COL7A1 114-115. exon. Delécióra utaló frame shift az index személy mintájában (felso szekvencia). A HD-d minta extrakciója és reamplifikációja után ismételt szekvencia analízis a 8441-15del20 deléciót igazolta az index személy mintájában (középso szekvencia). A normál kontroll minta szekvencia analízise (alsó szekvencia). g: A sematikus ábra az acceptor splice site mutáció teoretikus eredményét mutatja. A vörös színnel jelölt szakasz a deléciót reprezentálja. Új, korábban csendes acceptor splice site aktiválódhat a 115. exonban.

5.3.3.4 EBD/4-5-6-7 Három Hallopeau-Siemens DEBD beteg (EBD/4-5-6) és egy generalizált tünetekkel rendelkezo, nem-Hallopeau-Siemens DEB páciens (EBD/7) esetében is detektáltuk a 425A? G, K142R mutációt. Ez a 3. exon splice site-ját érinto mutáció a leolvasás során PTC-t generál (128, 132, 137, 139, 143, 142). Ezen négy beteg esetében szokatlan gyakorisággal, összességében 5 allélon fordult elo a 425A? G báziscsere. Az EBD/4 beteg homozigóta módon, mindkét szüloi allélen hordozza a 425A? G, K142R mutációt (30. ábra). Az EBD/5 és EBD/6 betegek compound heterozigótáknak bizonyultak: EBD/5 esetében a 13. exon ismert 1732C? T, R578X mutációjával (31. ábra) (133, 140, 138), míg EBD/6 beteg genotípusában a 70. exon 5797C? T, R1933X új, korábban nem ismert PTC-jével társult a 425A? G, K142R splice site mutáció (32. ábra). Az R1933X új PTC-t a vizsgálatainkkal párhuzamosan, a magyar mellett a német EBD populációban is megtalálták (Mecklenbeck és mtsai, nem publikált adat).

75

30. ábra. a: Recesszív epidermolysis bullosa dystrophica (Hallopeau-Siemens variáns) fenotípusú beteg családfája. A nyíl az index személyre mutat (EBD/4 beteg). b: Heteroduplex analízis. Heteroduplexek megjelenése a tünetmentes szülok (I/1 és I/2) valamint a beteg normál kontroll mintával való elegyében (II/1+C) (COL7A1, 3. exon). c: A COL7A1 gén 3. exonának szekvencia analízise. A 3. exon 425A? G splice site homozigóta mutációja az index személy mintájában. d: Sty I restrikciós endonukleázzal végzett hasítás. A 425A? G mutáció az enzim hasítási helyét eliminálja. A vad típusú 422 bp nagyságú allél 208 bp és 214 bp hosszú fragmentumokra esik. A mutáns allél egyben marad. A tünetmentes pater (I/1) és mater (I/2) heterozigóta hordozói az adott mutációnak, melyre a 422 bp hosszú diagnosztikus csík utal. Az index személy homozigóta hordozója az adott mutációnak. U: emésztetlen minta C: normál kontroll minta.

76

31. ábra. a: Recesszív epidermolysis bullosa dystrophica (Hallopeau-Siemens variáns) fenotípusú beteg családfája. A nyíl az index személyre mutat (EBD/5 beteg). b: Heteroduplex analízis. Heteroduplex megjelenése az index személy mintájában (II/1, COL7A1, 3. exon). c: 77

Heteroduplex analízis. Heteroduplex megjelenése az index személy mintájában (II/1, COL7A1, 13. exon). d: A COL7A1 gén 3. exonának szekvencia analízise. A 3. exon 425A? G splice site heterozigóta mutációja az index személy mintájában. e: A COL7A1 gén 13. exonának szekvencia analízise. A 13. exon 1732C? T, R578X heterozigóta PTC mutációja az index személy mintájában. f: Sty I restrikciós endonukleázzal végzett hasítás. A 425A? G mutáció az enzim hasítási helyét eliminálja. A vad típusú 422 bp nagyságú allél 208 bp és 214 bp hosszú fragmentumokra esik. A mutáns allél egyben marad. A tünetmentes mater (I/2) és az index személy (II/1) heterozigóta hordozói az adott mutációnak, melyre a 422 bp hosszú diagnosztikus csík utal. U: emésztetlen minta C: normál kontroll minta. g: Xho I restrikciós endonukleázzal végzett hasítás. A 1732C? T mutáció az enzim hasítási helyét eliminálja. A vad típusú 295 bp nagyságú allél 187 bp és 108 bp hosszú fragmentumokra esik. A mutáns allél egyben marad. A index személy (II/1) heterozigóta hordozói az adott mutációnak, melyre a 295 bp hosszú diagnosztikus csík utal. U: emésztetlen minta C: normál kontroll minta.

78

32. ábra. a: Recesszív epidermolysis bullosa dystrophica (Hallopeau-Siemens variáns) fenotípusú beteg családfája. A nyíl az index személyre mutat (EBD/6 beteg). b: Heteroduplex analízis. Heteroduplex megjelenése az index személy mintájában (II/6, COL7A1, 3. exon). c: Heteroduplex analízis. Heteroduplex megjelenése az index személy mintájában (II/6, COL7A1, 70. exon). d: A COL7A1 gén 3. exonának szekvencia analízise. A 3. exon 425A? G splice site heterozigóta mutációja az index személy mintájában. e: A COL7A1 gén 70. exonának szekvencia analízise. A 70. exon 5797C? T, R1933X heterozigóta PTC mutációja az index személy mintájában. f: Sty I restrikciós endonukleázzal végzett hasítás. A 425A? G mutáció az enzim hasítási helyét eliminálja. A vad típusú 422 bp nagyságú allél 208 bp és 214 bp hosszú 79

fragmentumokra esik. A mutáns allél egyben marad. A tünetmentes testvérek (II/2, II/4, II/5) és az index személy (II/6) heterozigóta hordozói az adott mutációnak, melyre a 422 bp hosszú diagnosztikus csík utal. U: emésztetlen minta C: normál kontroll minta.

Az EBD/7 beteg esetében a 425A? G, K142R rekurráló mutáció mellet, a COL7A1 gén szisztematikus vizsgálata ellenére a 2. recesszív mechanizmusú mutációt nem azonosítottuk (33. ábra). Mivel a beteg fenotípusa nem-Hallopeau-Siemens EBD, valamint az antigén mapping során a VII. kollagén, bár redukált mennyiségben, de a bazálmembrán mentén lineárisan kimutatható volt, ezért második PTC vagy egyéb, frame shift révén a fehérje korai terminációját eredményezo mutáció jelenléte nem valószínu. A beteg genotípusa vélhetoen compound heterozigóta, a 425A? G, K142R mellett második mutációként missense defektus sejtheto.

33. ábra. a: Recesszív epidermolysis bullosa dystrophica (Hallopeau-Siemens variáns) fenotípusú beteg családfája. A nyíl az index személyre mutat (EBD/7 beteg). b: Heteroduplex analízis. Heteroduplex megjelenése a tünetmentes pater (I/2) és az index személy (II/1) mintájában (COL7A1, 3. exon). c: A COL7A1 gén 3. exonának szekvencia analízise. A 3. exon 425A? G splice site heterozigóta mutációja az index személy mintájában.

80

5.3.3.5 A 425A? G, K142R ismétlodo mutáció populációgenetikai vizsgálata Vizsgálatokat végeztünk annak kiderítésére, hogy a közép-európai egészséges, nem-EB populáció milyen arányban hordozza e gyakori, rekurráló mutációt. A 425A? G, K142R mutációt Sty I restrikciós endonukleázzal végzett emésztéssel 50 egyén esetében összességében 100 allélon kíséreltük meg kimutatni. Egy esetben, egy egészséges személy heterozigóta hordozónak bizonyult. Ebbol arra következtethetünk, hogy az általunk vizsgált csoport 1%-os gyakorisággal heterozigóta hordozója lehet a 425A? G, K142R recesszív módon kifejezodo mutációnak. A heterozigóta gyakoriság (H) és a betegség incidenciája (i) közötti összefüggést a következo egyenlet fejezi ki: i=H2 /4. Két heterozigóta egyén házasságkötésének esélye a populációban 1/100 x 1/100= 1/10.000 és mivel gyermekeik ¼-e lehet homozigóta beteg, a recesszív EBD születési prevalenciája 1/10.000 x ¼= 1/40.000 lenne. Közép-Európában a recesszív EBD születési prevalenciája ismereteink szerint 1/100.000 körül van. Ezért arra következtetünk, hogy talán nem minden EB beteget észlelünk, valamint nagy valószínuséggel egy nagyobb esetszámú kontroll csoport vizsgálatakor kisebb heterozigóta gyakoriságot észlelnénk.

81

6 Megbeszélés 6.1 Molekuláris genetikai vizsgálatok genodermatosisokban Hazánkban egyedülálló és egyben hiánypótló módon egy centrumban elérhetové vált számos genodermatosis molekuláris genetikai vizsgálata. Mindez a betegek bizalmának növekedéséhez, a klinikai vizsgálatok pontosabbá válásához, új diagnosztikus lehetoségek eléréséhez (genotípus-fenotípus korreláció ismeretében pontosabb prognózis adható), új prevenciós eszközökhöz (DNS alapú prenatális vagy preimplantációs diagnosztika), és a késobbiekben új szomatikus génterápiás beavatkozások megteremtéséhez vezethet.

6.2 Genotípus-fenotípus korreláció A

struktúrmolekulák

defektusain

alapuló

genodermatosisok

genotípus-fenotípus

korrelációja relatíve szoros, azaz az egyes kórformák klinikai képe és súlyossága (fenotípus) és a hátterében kimutatható mutációk típusa (genotípus) között összefüggés figyelheto meg (20). Általánosságban igaz, hogy a genodermatosisok egyes autoszomális recesszív öröklodésmenetu, súlyosabb fenotípusú formái hátterében a mindkét szüloi allélon elhelyezkedo korai terminációs, ún. premature termination codon (PTC) áll, vagy olyan splice site szubsztitúció, deléció, inszerció, ami frame shift révén a leolvasás során PTC-t generál (26). A PTC eredményeként a fehérjeszintézis megszakad, az adott célmolekula szintézise meghiúsul. Mivel a klinikailag egészséges szülok is hordoznak egy hibás allélt, az adott molekula mintegy 50%-kal kisebb mennyiségben található a borükben, ennek ellenére klinikai tünetek nem alakulnak ki. Mindennek magyarázatául az szolgálhat, hogy a struktúrmolekulák a kello funkció ellátásához szükséges elégséges szinthez képest igen jelentos rezerv mennyiségben vannak jelen. A domináns öröklodésmenetu, általában enyhe fenotípusú formák esetében – ide tartozik pl. a legtöbb keratin mutáció okozta genodermatosis - csak az egyik allélon detektálható nem PTC-típusú, általában egy aminosav cseréjét eredményezo pontmutáció. A keratinmolekulák mintegy 50%-a az egészséges allél termékeként szabályos morfológiát mutat, míg a kóros allélnek megfeleloen a keratinmolekulák másik fele kóros felépítésu. A kóros morfológiájú molekulák ún. domináns negatív effektus révén az egészséges allél termékeinek funkcióját is megzavarják. Ennek eredményeként az intakt, funkcióját maradéktalanul ellátni képes keratinok aránya messze 50% alatt marad (21) és a struktúrproteinek magasabbrendu, általában filamentáris struktúrájának felépülése károsodik. Ez a hatás magyarázza azt a tényt, hogy míg a keratinok 50%-ának hiánya nem feltétlenül okoz klinikai tüneteket, addig ugyanennek a 82

hányadnak hibás morfológiája tüneteket vált ki. Súlyos, recesszív öröklodésmenetu formák esetében, az adott struktúrprotein hiánya miatt gyakori a spontán hólyagképzodés. Kevésbé súlyos, domináns öröklodésmenetu betegek bortünetei provokáló faktorok hatására, pl. mechanikai traumát követoen jelentkeznek (34. ábra).

34. ábra. Keratin gén mutációk (KRT5/14) hatása. Mindkét allélon PTC típusú mutációk következtében elmaradó keratinszintézis és súlyos klinikai tünetekben megnyilvánuló epidermolysis. Az aminosav szubsztitúciók domináns negatív effektus révén a kóros morfológiájú keratinok összecsapzódását okozzák, ezért a cytoskeleton vulnerábilitása fokozódik.

6.2.1

KRT9 mutáció – epidermolyticus palmoplantaris keratoderma A humán I. típusú keratin 9 (KRT9) gén az I. típusú keratin gén csoportban helyezkedik el

a 17q12-21 kromoszomális régióban (81, 82). 1994-óta számos mutációt azonosítottak az EPPK által érintett családokban (68, 82-90). Az I. típusú intermedier filamentum protein keratin 9 kizárólag a terminálisan differenciált tenyéri-talpi epidermisben expresszálódik, a szuprabazális epidermális rétegek jellemzo cytoskeleton fehérjéi, az I. típusú keratin 10 és II. típusú keratin 1 mellett (91). A „rod” domén evolúcionárisan állandó, konzervatív N-terminális vége meghatározója az intermedier filamentumok helyes összeépülésének (92, 93, 94). A missense mutációk e régióban keratin filamentum aggregációt okoznak és az EPPK-hoz hasonló domináns bor fragilitási szindrómákhoz vezetnek (95, 96). 83

Esetünk megfelel az EPPK klinikai, hisztopatológiai és ultrstrukturális kritériumainak. Az új, domináns módon öröklodo missense mutáció (479A? T, N160I) a KRT9 gén 1. exonában EPPK fenotípust eredményezett. Az irodalmi adatok elemzése szerint (11. táblázat), a legtöbb mutáció az 1A doménben, a 156-171 codonokban halmozódik, és csak egy inszerciót találtak a 2B doménben. A mutációk többsége missense szubsztitúciós mutáció, és csupán egy gén defektus eredményezett PTC-t (nonsense mutáció). A mutációk családspecifikusak, és csupán három rekurráló mutációt azonosítottak. Az ismertté vált keratin 9 mutációk közül az R162W szubsztitúció gyakorisága 35,71% (10/28 eset), sugallva, hogy e fo hot-spot mutáció a leggyakoribb az EPPK betegek körében. A 160. codon mutációi – beleértve az általunk feltárt új aminosavcserét is – több mint 14,28%-át teszik ki az EPPK-ban azonosított mutációknak. Számos pedigré genetikai vizsgálata igazolta, hogy új, de novo mutációk ritkán állnak a kórkép hátterében, ellentétben egyéb keratin mutáció hátteru genodermatosisokkal (pl. EBS) (87). Az általunk elsoként azonosított missense mutáció is a keratin 9 rod doménének Nterminális részén e régió épségének fontosságát hangsúlyozza. Vizsgálatunk egy magyar EPPK pedigré genetikai hátterét vizsgálta, és újabb ismerettel járult hozzá az EPPK genotípus-fenotípus korrelációjának megértéséhez.

84

11. táblázat. EPPK betegek KRT9 mutációi Keratin 9

Codon

domén

Nukleotid

Aminosav

csere

csere

Mutáció típus

Referencia

1A

156

ATG-ACG

Met-Thr

missense

Covello 1998 1x

1A

156

ATG-GTG

Met-Val

missense

Hennies 1994 2x, Covello 1998 2x

1A

159

CTC-GTC

Leu-Val

missense

Endo 1997 1x

1A

160

AAT-AAA

Asn-Lys

missense

Reis 1994 1x

1A

160

AAT-AGT

Asn-Ser

missense

Bonifas 1994 1x

1A

160

AAT-TAT

Asn-Tyr

missense

Tochard 1994 1x

1A

160

AAT-ATT

Asn-Ile

missense

Csikós 2003 1x

1A

162

CGG-CAG

Arg-Gln

missense

Reis 1994 1x, Yang 1998 1x, Covello 1998 1x, Szalai 1999 1x

1A

162

CGG-TGG

Arg-Trp

missense

Reis 1994 4x, Bonifas 1994 1x, Navsaria 1995 2x, Rothnagel 1995 1x, Yang 1998 1x, Mayuzumi 1999 1x

1A

167

TTG-TCG

Leu-Ser

missense

Rothnagel 1995 1x

1A

169

AAG-TAG

Lys-X

nonsense

Szalai 1999 1x

1A

171

CAG-CCG

Gln-Pro

missense

Hennies 1994 1x

2B

454

1362ins3

Histidin inszerció

Kis inszerció

Coleman 1999 1x

6.2.2

KRT14 mutációk – epidermolysis bullosa simplex A keratin 5 és keratin 14 pár, az elszarusodó többrétegu hám elsodleges bazális

cytokeratinja (91). A keratinok I. és II. típusú intermedier filamentum proteinekbol 10 nm–es filamentumokká kaszkádszeruen összeépülo obligát heteropolimerek (107, 108). Az ? -helikális domén evolúcionárisan állandó, konzervatív N-terminális vége (ún. helix iniciációs motívum, 117-129. codon) meghatározó tényezoje az intermedier filamentumok helyes összeépülésében a cytokeratin 14 esetében is (92, 93, 94, 60, 106, 112-125). E régió missense mutációi filamentum aggregációt okoznak, melyek a legsúlyosabb EBS fenotípushoz, DM-EBS szindrómához vezetnek. A három általunk vizsgált eset megfelelt az EBS klinikai és ultrastrukturális kritériumainak. A felnott DM-EBS fenotípusú nobeteg enyhébb tüneteket mutatott, aktív hólyagképzodés nélkül, a fiatalabb DM- EBS és WC-EBS beteg súlyosabb bortünetekkel rendelkezett. Három új, domináns öröklodésmenetu missense mutációt azonosítottunk a keratin 14 gén 1. exonában (N123K, R125G és V133L) (12. táblázat). Az általunk elsoként feltárt új mutációk közül ketto, melyek DM-EBS fenotípust eredényeznek, az N123K és R125G a helix

85

iniciációs motívumban található, míg a V133L WC-EBS fenotípust okozva ezen kritikus régión kívül található. A KRT14 125. codona hordozza a DM-EBS fenotípussal járó mutációk több mint 50%-át (113-124). Többségük arginin? cistein cserét eredményezo hot-spot, de két egyéb rekurráló mutáció is ismert ebben a pozícióban: arginin? histidin és arginin? serin szubsztitúció. Az EBSDM/2 betegben a 125. codonban azonosított arginin? glicin szubsztitúciót elsoként ismertettük. Az EBS pedigrék genetikai analízise azt mutatja, hogy gyakran állnak de novo mutációk e borbetegség hátterében. A WC-EBS beteg családfáján, a klasszikus autoszomális domináns öröklodésmenet nyomonkövetheto. Az EBS-DM/1-2 betegek esetében csak az index személy volt érintett, ami de novo mutációra ill. a szülok gonadalis mozaicizmusára is utalhat. Elsoként vizsgáltuk és közöltünk adatokat közép-kelet-európai EBS betegek KRT14 mutációiról. Eredményeink újabb információval szolgálnak az EBS genotípus-fenotípus korrelációjának megértéséhez.

12. táblázat. Az általunk vizsgált EBS betegek KRT5/KRT14 mutációi és polimorfizmusai Család

Gén

Nukleotid csere

Aminosav csere

Konzekvencia

Verifikáció

EBS-DM/1

KRT14

369T? A

N123K

missense mutáció

szekvenálás

KRT14

369T? C

N123N

neutrális polimorfizmus

szekvenálás

KRT14

373C? G

R125G

missense mutáció

Aci I

KRT14

369T? C

N123N


szekvenálás

KRT14

397G? T

V133L

missense mutáció

szekvenálás

KRT5

927+15T? C

-


szekvenálás

EBS-DM/2

EBS-WC/1

86

35. ábra. Aminosav szubsztitúciót okozó KRT14 mutációk EBS-ben. Súlyos, generalizált tünetekkel járó EBS-Dowling-Meara variáns hátterében (EBS-DM/1-2) a konzervatív, Nterminális, helix iniciációs motívumban (117-129. aminosav) észleltük az N123K és R125G mutációkat. Az enyhébb klinikai tünetekkel járó EBS-Weber-Cockeyne variáns fenotípusával jellemezheto beteg (EBS-WC/1) esetében a V133L szubsztitúciót a kritikus régión kívül találtuk.

6.2.3

COL7A1 mutációk – epidermolysis bullosa dystrophica

13. táblázat. EBD betegek rekurráló, új és ismert COL7A1 mutációi Beteg

Diagnózis

Mutáció

Verifikáció

Referenciák

EBD/1

EBDD

6100G? A, G2034R

BstN1/NciI

Kon 1997 Hammami-Hauasli 1998 Mecklenbeck 1999

EBD/2

REBD-nHS

682+1G? A/ 7984-7delT

BsphI szekvenálás, CSGE

Hovnanian 1997 Csikós 2003

EBD/3

REBD-nHS

7344G? A, V2448V/ 8441-15del20

HphI szekvenálás, CSGE

Gardella 1996 Csikós 2003

EBD/4

REBD-HS

425A? G, K142R/ 425A? G, K142R

StyI StyI

Christiano 1994 Gardella 1996, 1999 Hammami-Hauasli 1997 Cserhalmi-Friedmann 1997

87

Beteg

Diagnózis

Mutáció

Verifikáció

Referenciák

EBD/5

REBD-HS

425A? G, K142R /

StyI

Lásd EBD/4

1732C? T, R578X

XhoI

Mellerio 1997, Dunnill 1994, 1996 Hovnanian 1997

425A? G, K142R /

StyI

Lásd EBD/4

5797C? T, R1933X

szekvenálás

Csikós 2003

425A? G, K142R /

StyI

Lásd EBD/4

EBD/6

EBD/7

REBD-HS

REBD-nHS

ismeretlen EBDD domináns epidermolysis bullosa dystrophica, REBD recesszív epidermolysis bullosa dystrophica; HS Hallopeau-Siemens; nHS nem Hallopeau-Siemens

36. ábra. A VII. kollagén (COL7A1 gén) mutációi. Az irodalomban korábban leírt mutációk (fekete nyíl), az általunk észlelt mutációk (vörös nyíl), új, korábban nem publikált mutációk (vörös keret), a doktori munkában részletesen ismertetett esetek (*).

A COL7A1 gén mutációi az EBD valamennyi klinikai altípusában kimutathatóak. Enyhe fenotípussal járó domináns öröklodésmenetu formákat általában glicin szubsztitúciós mutációk okoznak. A hibás allél termékei domináns negatív effektus révén megzavarják az ép allél termékének funkcióját is. A kollagén VII. molekulák, bár kóros morfológiával, de kifejezodnek a 88

keratinocytákban. Ezzel összhangban, az EBD domináns betegek borének immunfluoreszcens antigén mapping vizsgálata során a protein lineáris megoszlásban detektálható a bazálmembrán alatt. Súlyos fenotípussal járnak a recesszív öröklodésmenetu formák, kiemelten a synechyát és mutilációt okozó Hallopeau-Siemens szindróma. Az antigén mapping vizsgálattal általában nem találunk VII. kollagént a felso dermisben. A protein hiányát a betegek genotípusában a mindkét szüloi allélen elhelyezkedo, korai terminációt eredményezo PTC mutációk, vagy egyéb, pl. frame shift révén PTC-t generáló splice-site mutációk magyarázzák (128). Az általunk vizsgált EBD betegek fenotípusa széles skálán mozgott, az igen súlyos Hallopeau-Siemens szindrómás recesszív EBD-tol az enyhe bortünetekkel jellemezheto domináns EBD formákig. Az EBD domináns öröklodésmenetet mutató, gyakran kevésbé súlyos klinikai tünetekkel jellemzett formáiban gyakoriak a COL7A1 gén 73. exonának mutációi. E kritikus szakasz a VII. kollagén, triplahelikális, Gly-X-Y repetitív szekvenciával jellemezheto centrális doménében helyezkedik el. A kollagénszeru helikális struktúra létrejöttének alapfeltétele a glicin aminosavak szigorú, repetitív ismétlodése. A COL7A1 gén mutációi halmozottan észlelhetok a 73. exonban. E kitüntetett régiót néhány rekurráló glicin szubsztitúciós mutáció érinti (2008., 2034., és 2043. aminosav). Ezen dominánsan öröklodo glicin szubsztitúciós mutációk azonosíthatók a leggyakrabban a domináns EBD hátterében (129). Domináns EBD betegünk (EBD/1) és a vele megegyezo klinikai tünetekkel rendelkezo pater a 6100G? A, G2034R glicin-szubsztitúciós mutációt hordozza. A Közép-Európai DEB betegek COL7A1 gén mutációanalízise számos új mutáció feltárásához vezetett. Az EBD/2 beteg, akinek a fenotípusát az enyhe, nem-Hallopeau-Siemens recesszív DEB és albopapuloid bortünetei dominálták, compound heterozigóta hordozója a korábban már ismertté vált 682+1G? A szubsztitúciónak az 5. intronban (138), mely frame shift révén PTC-t generál. E mutáció kombinálódott a 107. intron 7984-7delT új deléciójával. Bár ezen deléciót 50 egészséges kontroll személy 100 allélének szurovizsgálata során 3 allélen megtaláltuk (3%), nem zártuk ki annak további valószínuségét, hogy a fenotípusban is megnyilvánul, mivel a COL7A1 gén szisztematikus ismételt vizsgálata során egyéb eltérést nem sikerült feltárni az elso allél recesszív módon megnyilvánuló mutációja mellett. Az EBD/3 beteg fenotípusa súlyos, nem-Hallopeau-Siemens recesszív DEB volt. Az ismert 7344G? A splice site mutáció, mely a 95. exonban található, és a tünetmentes anyában is igazolható volt, egy 20 bp terjedelmu delécióval kombinálódott, melyet elsoként írtunk le. A beteg és a tünetmentes apa heterozigóta hordozója a 8441-15del20 deléciónak, mely a 114. intron és 115. exon közötti junkciót foglalja magában, ezáltal eliminálva a splice site-ot. Ezen új 89

deléció kiterjedésében és pozíciójában is kissé eltér a korábban az olasz EBD betegek körében leírt 8441-14del21 deléciótól (140), mely ismert frame shift mechanizmussal aktivál az eliminált eredeti splice site-tól up-streame irányban egy új splice site-ot. Mindkét mutáció a VII. kollagén molekula centrális kollagénszeru triplahelikális doménét követo nem kollagénszeru globuláris NC-2 domént érinti. A COL7A1 gén terméke a pro-? 1 fehérjelánc extracellulárisan proteolítikus hasítás révén lehasad a prokollagén láncról. Az N-terminális globuláris NC-2 domén terminális részlete, az ún. Kunitz-nodulus, a pro-? 1 kollagén VII.? kollagén VII. molekulák extracelluláris poszttranszlációs konverziójakor hasad le. Immunohisztokémiai tanulmányok szerint a normál kontroll bor bazálmembránzónája az NC-2 domén N-terminális részlete ellen irányuló antitestekkel nem festodik, jelezve, hogy ezen domén hiányzik a normál borbol (144). A Bruckner-Tuderman és mtsai (144) által korábban leírt és tanulmányunkban is szereplo (Csikós és mtsai 2003) egyik beteg ismert 14 bp hosszú 8523del14 deléciója az 115. exon és 115. intron (62) közötti junkciót, az exon 115 donor splice site-ját foglalja magában. Ezzel szemben, a dolgozatban szereplo EBD/3 beteg új 8441-15del20 deléciója az acceptor splice site-ot eliminálja a 114. intron és 115. exon határon. A 8523del14 deléció a 115. exon kivágódásához vezet, ami eliminálja a putatív prokollagén C-proteináz hasítási helyét, ami a prokollagén processzálás elmaradását okozza, így a deléciót hordozó beteg borében az NC-2 domén retineálódásához vezet. Ennek bizonyítékaként a 8523del14 mutációt homozigóta módon hordozó DEB beteg dermo-epidermális bazálmembránja mentén a retineált NC-2 domén lineáris pozitív fluoreszcenciát mutat a normál bor negatív reakciójával szemben. Az általunk vizsgált a 844115del20 deléciót heterozigóta módon hordozó beteg (EBD/3) a normál kontroll borrel azonos módon negatív reakciót adott az NC-2 ellenanyaggal (nem illusztrált adat). Ezért úgy gondoljuk, hogy 8441-15del20 deléció nem befolyásolja a prokollagén-kollagén konverziót. A recesszív EBD betegek genotípusában csupán kis számú rekurráló mutáció vált ismertté napjainkig, melyek bizonyos földrajzi megoszlást mutatnak: Olaszországban (497insA, 8441-14del21), Nagy-Britanniában (R2814X, R578X, 7786delG), Mexikóban (2470insG) és Japánban (5818delC, E2857X, 6573+1G? C) (130-135). Tanulmányunkban 43, különféle EBD fenotípusú, a DEBRA Hungary és DEBRA Germany által gondozott és nyilvántartott beteget vizsgáltunk új vagy rekurráló mutációk igazolása céljából. A közép-európai régióban az érintett allélon PTC-t generáló 425A? G, K142R splice site mutáció elofordulását kiemelkedoen magas gyakoriságúnak találtuk. A korábban már ismert 425A? G tranzíciót a COL7A1 gén 3. exonának –2 donor splice site-ján 10 EBD által érintett családban (23%), összességében 11 allélon azonosítottuk (kilenc proband heterozigóta és egy homozigóta módon hordozta a mutációt). A 425A? G mutáció allél 90

elofordulási gyakorisága 12,8% volt az általunk vizsgált betegcsoportban, és ez azt sugallta, hogy a közép-európai EBD betegek csoportjának domináló gyakoriságú mutációját azonosítottuk. A 425A? G, K142R mutációnak 50 egészséges kontroll személy 100 allélének vizsgálata során azt 1%-os gyakoriságúnak találtuk, mivel egy egészséges kontroll személy tünetmentes heterozigóta carriernek bizonyult. A 425A? G szusztitúciót elsoként Christiano és mtsai írták le, akik neutrális intragenikus Lys/Arg polimorfizmusnak vélték (141). Késobb Gardella (139) és Hammami-Hauasli (142) is megtalálták ezt az eltérést olasz és német EBD betegek genotípusában és a splice-site mutáció kóroki szerepét is bizonyították. A 3. exon 425A? G splice site mutációja kóros splicinghez vezet, és eredményeként kóros, rövid transzkriptum is azonosítható volt, mely a COL7A1 génben frame shift révén generált PTC révén keletkezik. A 425A? G mutáció recesszív módon nyilvánul meg, így hordozójának fenotípusát a második mutáció határozza meg. Tanulmányunkban négy, Hallopaeu-Siemens szindrómás, az EBD legsúlyosabb, számos cutan és extracutan manifesztációval és komplikációval társult formájában szenvedo beteget vizsgáltunk, akik a 425A? G, K142R mutáció hordozójának bizonyultak. Ezen esetekben a 425A? G a második allélon önmagával, vagy további PTC-vel, vagy PTC-t generáló splice site mutációkkal társult, a gén funkcionális knock out-ját eredményezve, mely az anchoring fibrilllumok teljes hiányához vezetett és ezért súlyos, mutiláló fenotípust okozott. Az EBD/4 beteg homozigóta státuszban hordozta K142R mutációt mindkét szüloi allélen. EBD/5 betegünk esetében a 13. exon 1732C? T, R578X PTC mutációjával társult, mely igen gyakori eltérés a brit EBD populációban (133, 140, 138). A EBD/6 DEB-HallopeauSiemens beteg esetében a 425A? G, K142R mellett a 70. exon új, elsoként általunk azonosított 5797C? T, R1933X PTC mutációját észleltük. Egy német Hallopeau-Siemens típusú EBD betegnél a 4929delT új deléciót találtuk, mely frame shift révén PTC-t okoz az 52. exonban a 425A? G, K142R splice site mutáció mellett. 425A? G-t további hat, nem mutiláló, nem Hallopeau-Siemens recesszív DEB beteg genotípusában is azonosítottuk. Ezen esetekben a második allélon vagy deléciót, (2638del25, 8523del14), vagy glicin szubsztitúciót (G2775S) és egyéb missense mutációt (R2008C), új splice site mutációt (976-3C? A) azonosítottunk. Egy esetben a második COL7A1 allél mutációja ismeretlen maradt (EBD/7). A 425A? G, K142R mutációt a magyar populációban korábban már Cserhalmi és mtsai is detektálták, egy recesszív, enyhe klinikai tüneteket mutató, nemHallopeau-Siemens EBD diagnózisú beteg esetében, ahol a K142R splice site, PTC-t generáló mutáció egy glicin szubsztitúcióval társult, ami együttesen enyhe fenotípust eredményezett 91

(143). Mindezen adatok összessége felhívja a figyelmet arra a genotípus-fenotípus korrelációs megfigyelésre, hogy a 425A? G, K142R mutációt hordozó betegek klinikai tüneteinek spektruma rendkívül széles lehet annak függvényében, hogy a genotípusukban a második allélen milyen típusú mutációt hordoznak. A 425A? G, K142R mutáció kiemelkedoen magas elofordulási gyakoriságával a középeurópai EBD betegek jellegzetes, rekurráló mutációját képviseli. Megfigyelésünk nagy gyakorlati jelentoséggel bír, és meghatározója lehet a COL7A1 gén mutációanalitikai startégiájának. Adataink szerint, a szisztematikus COL7A1 mutációszurés elott, prioritást élvez a recesszív öröklodésmenetu EBD betegeink esetében a 3. exon vizsgálata, a domináns EBD betegek körében korábban már általánossá vált 73. exon vizsgálatának analógiájára. Továbbá új mutációink új információkat szolgáltatnak az EBD különféle altípusaiban a genotípus-fenotípus korreláció jobb megértéséhez.

6.3 Új komplikáció: pulmonális amyloidosis Bár a szekunder, reaktív, szisztémás amyloidosis (AA típusú amyloid depozíció) ismert komplikációja lehet az extenzív dermatosisoknak, recesszív EBD-ben ritka komplikáció (158). AA típusú amyloidosis gyakran krónikus, inflammatórikus betegségeket kísér. Az finom, fibrilláris struktúrájú AA protein a keringésbe került szérum amyloid A (SAA) akut fázis proteinbol képzodik (161). A másodlagos amyloidosis gyakran érinti a veséket, AA amyloid depozíció jelenik meg a glomerulusokban és a kis erek falában. Mindez a recesszív EBD fatális komplikációja lehet, mivel a vesekárosodás súlyos, rapid progressziót mutató, hemodialízissel nehezen befolyásolható krónikus veseelégtelenséghez vezeto nephrosis szindrómát okoz (159160). A respiratórikus traktus amyloidosisa ritka (162). Krónikus bronchitisben, súlyos, rekurráló pneumóniában, pleuritisben és pulmonális abscessusban szenvedo betegünk (EBD/6) esetében a tüdo autopsziás mintában AA amyloid depozíciót találtunk. Ismereteink szerint, ez az elso ismert recesszív EBD eset, ahol spinocellularis carcinoma és nephrosis szindrómában megnyilvánuló szekunder amyloidosis együttesen fordult elo, valamint pulmonális amyloidosisról beszámoló elso közlés e kórképben.

92

7 A munka jelentosége és az eredmények hasznosítása 7.1 A genodermatosisok molekuláris genetikai vizsgálatainak jelentosége Munkacsoportunk megteremtette hazánkban bizonyos örökletes borgyógyászati kórképek rutinszeru genetikai vizsgálatainak alapjait. A bor adhéziós és elszarusodási zavaraiban, összességében 9 gén mutációinak azonosítása zajlik, közöttük az EB és EPPK hátterében meghúzódó legfontosabb géneké (COL7A1, KRT5, KRT14, KRT9, LAMB3, TGM1, EBP, SPINK5, ATP2A2, ATP2C1). Centrumunk jelenleg a régióban egyedülálló módon aktuálisan a 9 gén hozzávetolegesen 250 exonának részletes vizsgálatát végzi. Populációgenetikai, epidemiológiai megfigyeléseink a mutáció detekciós stratégia változását eredményezhetik Közép-Európában. A COL7A1 gén 425A? G, K142R mutációja kiemelkedoen magas elofordulási gyakoriságával a közép-európai recesszív EBD betegpopuláció jellegzetes, rekurráló mutációját képviseli. Számos új KRT9, KRT14 és COL7A1 mutáció azonosításával gazdagítottuk az EPPK, EBS, EBD betegek genotípus-fenotípus korrelációjáról kialakított képet.

7.2 Genetikai tanácsadás A reproduktív korban levo, genodermatosisban szenvedo gyermeket nevelo szülopár szempontjából az ismétlodés kockázatának ismerete jelentos. Autoszomális domináns örörklodésmenetu, többnyire enyhe klinikai tünetekkel járó, az életminoséget változó fokban rontó öröklodo borbetegségek esetében az ismétlodés valószínusége 50%. Autoszomális recesszív öröklodésu, általában súlyos, olykor lethalis kimenetelu formák esetében az ismétlodés kockázata 25% A klinikailag tünetmentes hordozó gyermek 50%-os, valamint a fenotípusa és genotípusa tekintetében egyaránt negatív utód 25%-os valószínuséggel jöhet világra. A reproduktív korba jutó autoszomális domináns öröklodésmenetu formákban szenvedo betegek gyermekei 50%-os valószínuséggel öröklik a beteg szülo fenotípusát. Recesszív öröklodésu genodermatosisban szenvedo szülo gyermeke nagy valószínuséggel tünetmentes hordozó lesz.

7.3 Prevenció. Prenatális diagnosztika A prenatális diagnosztika egyik legjelentosebb területét képviselik a molekuláris genetikai vizsgálatok, amelynek során a vizsgálatok közvetlenül az embrió/magzat genetikai információját hordozó sejtekbol végezheto el.

93

7.3.1

Fetoscopia, fetalis bor biopszia A DNS alapú genetikai vizsgálatok fejlodésével a magzat megtekintése ill. egyes

szerveibol a terhesség relatíve késobbi szakaszában történo biopsziás mintavétel jelentosége csökkent. Indikációja csak speciális esetekben maradt meg, pl. olyan súlyos fenotípusú, ill. lethalis genodermatosisok esetében, ahol a molekuláris genetikai vizsgálat nem, vagy csupán korlátozott módon kivitelezheto (az elvégzett vizsgálat nem elég informatív, vagy nem ismert a betegség gén).

7.3.2

Chorionboholy biopszián ill. genetikai amniocentézisen alapuló DNS diagnosztika A chorionboholy mintavétel (chorionic villus sampling) a prenatális diagnosztika

legfontosabb eszköze. A beavatkozás korán, a terhesség 9-11. hete között végezheto. PCR amplifikáción alapuló DNS vizsgálatokhoz már kb. 1mg chorionszövet is elegendo, de a sejtek mitotikus osztódásának köszönhetoen tovább tenyészthetoek. A chorionboholysejtek az embrióval azonos genetikai információt hordoznak. A minták kariotípusának ellenorzése mellett, mikrosatellita markerek alkalmazásával zárható ki az anyai DNS-sel történt kontamináció. Genetikai amniocentézis a terhesség 12-16. hetében történhet, melynek során mintavételkor a magzatvíz 5-10%-át távolítják el. A magzatvíz sejtjeiben vizsgálható a magzati DNS.

7.3.3

Preimplantációs diagnosztika Az in vitro fertilizációs technikák bevezetése tette lehetové a preimplantációs

diagnosztika megvalósítását. Az preembrió 6-8 sejtes stádiumában eltávolított 1-2 totipotens blastomerasejt a tapasztalatok szerint nem befolyásolja a magzat késobbi fejlodését, DNS-sébol pedig genotípusa megismerheto. Mivel az egészséges allélekkel rendelkezo embriók kerülnek beültetésre, a módszer alkalmazásával elkerülhetoek a terhesség alatt a késobbiekben végzett genetikai vizsgálatok során pozitívnak bizonyuló magzatok fejlodésének megszakítása. Hazánkban már megtörtént az elso, nemhezkötött öröklodo megbetegedés esetében nemmeghatározáson alapuló preimplantációs vizsgálat. A késobbiekben talán elérhetové válik a direkt, molekuláris genetikai vizsgálatokkal igazolható genodermatosisok számára is.

7.4 Szomatikus génterápia A genodermatosisok génterápiája napjainkra egyre közelebb kerül a realitáshoz. Az öröklodo borbetegségek különbözo formáiért felelos gének azonosítása, és molekuláris genetikai elemzése után joggal merült fel a génterápia igénye. 94

A génterápia a betegséget a genetikai defektus korrigálásával gyógyítja. Leggyakrabban ez a normál génnek a sejtbe irányuló transzportját jelenti, ritkábban a kóros gén kifejezodésének a visszaszorítását. In vivo: a génderivátum direkt módon borbe juttatását, ex vivo: a páciensbol biopsziával nyert mintából létrehozott, majd genetikailag módosított keratinocytakultúra graftként történo visszaadását. A genodermatosiok egyes domináns öröklodésmenetu formái (pl. EPPK – KRT9, EBS KRT5/KRT14, EBD domináns – COL7A1) esetében a génterápia egyedi módon tervezheto. A mutációt hordozó allél terméke domináns negatív effektus által lerontja az egészséges allél termékének funkcióját is. A sikeres genetikai korrekciót ezért a kóros génkópia kizárólag individuálisan tervezheto kikapcsolása jelentheti. Egyelore a DNS-RNS hybrid rendszereket csak egérmodellben alkalmazták sikeresen (164). A recesszív módon öröklodo EBJ esetében mindkét szüloi allél kóros, ezért a terápia szempontjából alapveto fontosságú a gén hibátlan kópiájának a hámsejtekbe juttatása (163). Mivel egyes altípusainak hátterében meghúzódó gének (LAMB3, COL17A1, ? 6? 4 integrin gének) kis méretuek, ezért a transzporterként szolgáló virális vektorokban illesztésük viszonylag problémamentes. Az EB legsúlyosabb, recesszíven öröklodo dystrophias formájának esetében a génterápiás próbálkozásokat nagyban megnehezíti az a tény, hogy a kollagén VII. génje, a COL7A1 egyike az eddig megismert leghosszabb géneknek, ezért mérete a legtöbb klasszikus retrovirális vektor befogadó kapacitását kimeríti. Így számos alternatív áthidaló megoldás született: eloállították a gén rövidített változatát, mely „minigén” termék formájában és funkciójában nagymértékben emlékeztet az anchor fibrillumokra. Más kutatócsoportok a gén komplett verziójának non-virális módszerekkel (liposzomák, integrin targeting peptidek, mikroinjekció) történo sejtbe juttatásával értek el biztató eredményeket (165). A próbálkozásokat megnehezíti, hogy az „új” protein megjelenése kiváltja az ellen irányuló immunválaszt, amit immunszuppresszív terápiával kell visszaszorítani. Továbbá mennyiségi korlátok szukítik le a graftok alkalmazási körét egyelore a lokalizált tünetek orvoslására. A terminális differenciáció, az elszarusodás folyamata miatt a genetikailag módosított keratinocyták lehámlanak, így a beavatkozás idoszakos ismétlése válhat szükségessé. Mindezen nehézségek ellenére, a fenti biztató eredmények ismeretében talán optimisták lehetünk, és reális közelségben tudhatjuk az epidermolyticus genodermatosisoknak, ezen az életminoséget nagymértékben rontó és gyakran magát az életet is veszélyezteto betegség csoportok a végleges, definitív megoldását jelento szomatikus génterápiáját.

95

7.5 A genodermatosisok molekuláris genetikai vizsgálatainak további perspektívái 7.5.1

Új gének vizsgálatainak bevezetése Bullosus congenitalis ichthyosiform erythrodermában (epidermolyticus hyperkeratosis) a

KRT1/10, az EBS muscularis dystrophiával társult formáiban a PLEC1, junctionális EB-ben a COL17A, LAMA3, LAMC2, pylorus atresiával társult eseteiben az INTGA6 és INTGB6 gének vizsgálata válhat szükségessé a közeljövoben. A mutáció analízis stratégiai változásához vezethet az elszigetelten muködo, azonos vizsgálatokat egymással párhuzamosan végzo genetikai centrumok munkájának összehangolása. A specializáció, egyes gének, génszegmensek kiemelt vizsgálata nagyobb esetszám hatékony feldolgozását tenné lehetové.

7.5.2

Új technológiák bevezetése A mutációanalízis hatékonyságát és biztonságát a genetikai szuromódszerek számának

növelésével javíthatjuk. Közel 100%-os eredményességrol számolnak be a CSGE/HD analízis és pl. DGGE (denaturáló gradiens gél-elektroforézis) és/vagy SSCP (single stand conformation polymorphysm) párhuzamos alkalmazásakor. Bevezetésüket korlátozza, hogy a PCR amplifikációhoz felhasználandó primerek felépítése, tulajdonságai különbözoek, így a vizsgálatok költségeit együttes alkalmazásuk jelentosen növelné. Borbiopsziás mintákból történo RNS preparálás, majd szekvenciaspecifikus primerek segítségével végzett cDNS amplifikáció és szekvenálás az analízis definitív megoldását és kiváltását jelenthetné, hasonlóképpen DNS chipek jövobeni alkalmazásához.

7.5.3

Egyéb kutatási területek Bár az epidermis fo cytokeratin génjeinek mutációja számos genodermatosis hátterében

oki tényezoként kimutatható, de a kutatás ebben az irányban még nem zárult le. Ismert, hogy a keratin mutációknak elgondolkodtató intra- és interfamiliáris variációi vannak – ugyanaz a mutáció enyhe és súlyos fenotípust eredményezhet – ezért a mutációk hatásmechanizmusának további analízise szükséges ahhoz, hogy megértsük, miért okozhatja ugyanazon eltérés olykor akár fenotípusok egész spektrumát. Számos eset molekuláris biológiai feldolgozása után, a genotípus-fenotípus korreláció pontosabb ismerete, önmagukban fenotípusos változást nem eredményezo polimorfizmusok szegregációjának nyomon követése és exogén faktorok figyelembevétele vihet közelebb a megértéshez (57, 58). 96

A kutatások egy további érdekes iránya lehet az általunk vizsgált struktúrproteinek filogenetikai, még magzati életben majd az azt követo csecsemo- és gyermekkorban zajló változó kifejezodésének nyomon követése. Az epidermolyticus genodermatosiok struktúrprotein és bazálmembrán rendellenességei onkodermatológiai tárgyú megfigyelések modelljeiként szolgálhatnak. Az epidermális eredetu tumorok inváziójakor, a bazálmembrán struktúrproteinjei sajátos sorrendben tunnek el. E szabályszeruség nyomon követése esetlegesen a prognózisalkotást és a terápiás tervet is befolyásolhatja.

97

8 Köszönetnyilvánítás Köszönetet mondok Prof. Dr. Horváth Attila egyetemi tanárnak, a Semmelweis Egyetem Bor- és Nemikórtani Klinika igazgatójának, hogy szakmai felkészülésemben és fejlodésemben támogatott és lehetoséget adott doktori munkám elkészítésére. Köszönettel

tartozom

gyermekborgyógyászat

és

Prof.

Dr.

Kárpáti

Sarolta

borgyógyászati

genetika

kérdéseibe

egyetemi

tanárnak

a

való

bevezetésemért.

Témavezetoként fáradhatatlanul irányította és segítette tudományos munkámat és a dolgozat elkészítését. Hálával és köszönettel tartozom Prof. Dr. Leena Bruckner-Tuderman egyetemi tanárnak, aki korábban a münsteri Westfälische Wilhelms Egyetem Borgyógyászati Klinkájának professzora volt, jelenleg pedig Freiburg egyetemének Borgyógyászati Klinikáját vezeti. Tanulmányutam alatt témavezetoként bevezetett a molekuláris genetika gyakorlati kérdéseibe, és jelenleg is önzetlenül és fáradhatatlanul segíti tudományos munkámat. Prof. Dr. Falus András egyetemi tanár és Prof. Dr. Mandl József egyetemi tanár programvezetoként lehetové tették kutatómunkámat és értekezésem megalkotását. Köszönöm Prof. Dr. Török Éva professzor asszony, Prof. Dr. Schneider Imre egyetemi tanár, Dr. Szalai Zsuzsa foorvos asszony és Dr. Sebok Béla a betegek ellátásában és követésében nyújtott szakmai segítségét. Hálával tartozom Dr. Becker Krisztina adjunktus asszonynak, munkám alapjait képezo színvonalas ultrastrukturális vizsgálatok elvégzéséért és értékeléséért, valamint többéves önzetlen munkatársi és baráti segítségéért. Köszönöm Dr. Hársing Judit adjunktus asszonynak a hisztológiai vizsgálatok elvégzését, és Dr. Bottlik Gyulának a sebészi biopsziás mintavételek kivitelezését. Köszönöm Dr. Hajnal Irén Szocs munkáját, aki az Országos Epidermolysis Bullosa Centrum alapító tagjaként az elsok között rendszerezte a betegek adatait, és munkatársként részt vett a hazai genetikai vizsgálatok adaptálásában is. Köszönöm Dr. Burcsi Natália adatgyujto és rendszerezo munkáját. Dr. Sabine Mecklenbeck, Dr. Hauke Schumann,

Michaela Daamen, Margit

Schubert és Henrike Pentrup németországi munkámat segítették, bevezettek egyes molekuláris biológiai technikákba. Köszönöm Dr. Nagy Károly, Kemény Béla technológiai tanácsait és Dr. Harmos Ferenc informatikai kérdésekben nyújtott segítségét.

98

Hálásan köszönöm Dr. Rácz Emoke, Benko Réka és Bóna Annamária önzetlen, precíz molekuláris biológiai és informatikai munkáját, Dr. Sárdy Miklós segítségét az egyes automata szekvenálási munkák elérhetovétételéért és elorevivo, motiváló kritikáiért, Dr. Lászik Andrásnak és Dr. Szakács Orsolyának a haplotípusanalízis kivitelezését. Hálával tartozom Menyhárt Ferencnének az immunfluoreszcens és DNS szeparáláshoz nyújtott asszisztenciájáért, Tamási Annának az immunhisztokémiai vizsgálatok magas színvonalú

elvégzéséért,

értékeléséért, Dián

Klárának

a

rutin

hisztológiai

minták

feldolgozásáért és Dr. Plavecz Tibornénak a borminták elektronmikroszkópos feldolgozásához nyújtott technikai segítségéért. Külön köszönöm Szaák Tamás kiváló minoségu, muvészi színvonalú klinikai képeit, Nyírfalvi Károly irodalmi adatgyujto munkáját és Medvecz Péter a dolgozat és az eloadás informatikai munkálataiban nyújtott segítségét. Végül de nem utolsósorban köszönöm a Semmelweis Egyetem Bor-és Nemikórtani Klinika valamint a münsteri Westfalische Wilhelms Egyetem Borklinikája valamennyi munkám elvégzését támogató munkatársának segítségét és türelmét. A munka az OTKA T022291, T032139 számú pályázat, az Epidermolysis Bullosa Alapítvány, a Kaposi Mór Alapítvány, és a Soros Alapítvány támogatásával készült.

99

9 Irodalom 1. Fuchs E.: Genetic disorders of keratins and their associated proteins. Dermatol Science 1996; 13: 181-192. 2. Fuchs E.: Keratins and the skin. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol (1995) 11, 123-153.Fuchs E., Clevelad D.W.: A structural scaffolding of intermediate filaments in health and disease. Science 1998; 279: (23) 514-519. 3. Alberts B. és mtsai (eds.): Molekular biology of the cell. Gerland Publishing, Inc., New York, London (1989) pp. 762-766, 796-798, 966-973. 4. Corden D., McLean W.H.I.: Human keratin diseases: Hereditary fragility of specific epithelial tissues. Exp. Dermatol. 1996; 5: 297-307. 5. Miller K, Khuon S, Goldman RD.: Dynamics of keratin assembly: exogenous type I keratin rapidly associated with type II keratin in vivo. Cell Biol 1993; 122: 123-135. 6. Wilson AK, Coulombe PA, Fuchs E.: The roles of K5 and K14 head, tail and R/KLLEGE domains in keratin filament assembly in vitro. Cell Biol 1992; 119: 401-414. 7. Steinert M., Bale S. J.: Genetic Skin diseases caused by mutation in keratin intermediate filaments. Trend in Genetics 1993; 9: 280-284. 8. Scriver C. R. és mtsai (eds): The Metabolic and Molekular Bases of Inheredited Disease I.: Fuchs E.: Genetic Skin Disorders of Keratin. McGraw-Hill, Inc. Health Professions Division, New York (1995) pp. 4421-4433. 9. Bruckner-Tuderman L. Blistering skin diseases:models for studies on epidermal-dermal adhesion. Biochem Cell Biol 1996;74: 729-736. 10. Bruckner-Tuderman L. Hereditary skin diseases of anchoring fibrils. J Dermatol Science 1999; 20:122-133. 11. Bruckner-Tuderman L., Höpfner B., Hammami-Hauasli N. Biology of anchoring fibrils: lessons from dystrophic epidermolysis bullosa. 1999; 18: 43-54. 12. Liu CG.,Maercker C., Castanon MJ. és mtsai. Human plectin: organization of the gene, sequence analysis and chromosome localization (8q24). Proc Nat Acad Sci 1996; 93 : 42784283. 13. Smith FJD., Eady RAJ., Leigh IM és mtsai. Plectin deficiency results in muscular dystrophy with epidermolysis bullosa. Nature Genet 1996; 13:450-457. 14. Schumann H, Hammami-Hauasli N, Pulkinnen és mtsai. Three novel homozygous point mutations and a new poymorphism in the COL17A1 gene: relation to biological and clinical phenotypes of junctional epidermolysis bullosa. Am J Hum Genet 1997; 60: 1344-1353. 100

15. Schacke H, Schumann H, Hammami-hauasli N és mtsai. Two forms of collagen XVII in keratinocytes. A full-length transmembrane protein and a soluble ectodomain. J Biol Chem 1998; 273: 25937-25943. 16. Franzke CW, Tasanen K, Schacke H és mtsai. Transmembrane collagen XVII, an epithelial adhesion protein, is shed from the cell surface by ADAMs. EMBO J 2002;21: 5026-5035. 17. Nakano A, Pfendner E, Pulkinnen L és mtsai. Herlitz junctional epidermolysis bullosa: novel and recurrent mutations in the LAMB3 gene and the population carrier frequency. J Invest Dermatol 2000; 115: 493-498. 18. Ruzzi L, Gagnoux-Palacios L, Pinola M és mtsai. A homozygous mutation in the integrin alpha-6 gene in junctional epidermolysis bullosa with pyloric atresia. J Clin Invest 1997; 99: 2826-2831. 19. McGrath JA, Gatalica B, Christiano AM és mtsai. Mutations in the 180-kD bullous pemphigoid antigen (BPAG2) a hemidesmosomal transmembrane collagen (COL17A1) in generalized atrophic benign epidermolysis bullosa. Nature Genet 1995; 11: 83-86. 20. Irvine A.D., McLean W.H.I.: Human keratin diseases: the increasing spectrum of diesase and subtlety of the phenotype-genotype correlation. Br. J. Dermatol. 1999; 140, 815-828. 21. Herskowitz I.: Functional inactivation of genes by dominant negative mutations. Nature 1987; 329(17): 219-222. 22. Bonifas J. M., Rothman A., K., Epstein E. H.: Epidermolysis bullosa simplex: evidence in two families for keratin gene abnormalities. Science (1991) Vol. 254. 22 November, 12021204. 23. Coulombe P.A.és mtsai.: Point mutations in human keratin 14 genes of epidermolysis bullosa simplex patients: genetic and functional analyses. Cell (1991) Vol. 66, Sept 20, 1301-1311. 24. Chen H. és mtsai.: Keratin 14 gene mutations in patients with epidermolysis bullosa simplex. J Invest Dermatol 1995; 105: 629-632. 25. Irvine A.D. és mtsai.: A novel mutation on the helix termination peptide of keratin 5 causing epidermolysis bullosa simplex Dowling-Meara. J Invest Dermatol 1997; 109: 815-816. 26. Corden L. D. és mtsai.: Homozygous nonsense mutation in helix 2 of K14 causes severe recessive epidermolysis bullosa simplex. Human Mutation 1998; 11: 279-285. 27. Cheng J. és mtsai.: The genetic basis of epidermolytic hyperkeratosis: a disorder of differentiation-specific epidermal keratin genes. Cell 1992; 70: 811-819. 28. Ishida-Yamamoto J és mtsai.: Selective involment of keratins K1 and K10 in the cytosceletal abnormality

of

epidermolytic

hyperkeratosis

erythroderma) J Invest Dermatol 1992; 99(1):19-26. 101

(bullosus

congenital

ichthyosiform

29. Huber M és mtsai.: Abnormal keratin 1 and 10 cytoskeleton in cultured keratinocytes from epidermolytic hyperkeratosis caused by keratin 10 mutations. J Invest Dermatol 1994; 102(5): 691-4. 30. McLean H és mtsai.: Mutation in the rod 1A domain of keratins 1 and 10 in bullosus congenital ichthyosiform erythroderma (BCIE). J Invest Dermatol 1994; 102 (1): 24-30. 31. Syder AJ és mtsai.: Genetic mutations in the K1 and K10 genes of patients with epidermolytic hyperkeratosis. Correlation between location and disease severity. J Clin Invest 1994; 93 (4): 1533-42. 32. Kremer P. és mtsai.: Ichtyosis bullosa of Siemens is caused by mutations in the keratin 2e gene. J Invest Dermatol 1994; 103(3):286-289. 33. Basarab T és mtsai.: Ichthyosis bullosa of Siemens: report of a family with evidence of a keratin 2e mutation, and a review of the literature. Br J Dermatol 1999; 140 (5): 689-95. 34. Suga Y és mtsai.: Hot spot mutations in keratin 2e suggest a correlation between genotype and phenotype in patients with ichthyosis bullosa of Siemens. Exp Dermatol 2000;9(1): 11-5. 35. Irvine AD és mtsai.: A novel mutation in the 2B domain of keratin 2e causing ichthyosis bullosa of Siemens. Clin Exp Dermatol 2000; 25 (8): 648-51. 36. Ratnavel R.C., Griffiths W. A.: The inherited palmoplantar keratodermas. Br J Dermatol 1997; 137(4):485-90. 37. Kuster W., Becker A.: Indication for the identity of palmoplantar keratoderma type UnnaThost with type Vorner. Thost’s family revisited 110 years later. Acta Derm Venereol, 1992; 72 (2): 120-2. 38. Hart T. C és mtsai.: Mutations of the cathepsin C gene are responsible for Papillon Lefevre syndrome. Journal of Medical Genetics 1999; 36(12): 881-7. 39. Heathcote K és mtsai.: A connexin 26 mutation causes a syndrome of sensorineural hearing loss and palmoplantaris hyperkeratosis. Journal of Medical Genetics 2000; 37(1):50-1. 40. McKoy G. és mtsai.: Identification of a deletion in plakoglobin in arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy with palmoplantar keratoderma and woolly hair (Naxos disease). Lancet 2000; 17(355) (9221):2119-24. 41. Krous HF. Lethal Dowling-Meara-type epidermolysis bullosa simplex in a young infant. Pediatr Pathol Lab Med 1995;15:191-200. 42. Kimonis V és mtsai.: A mutation in the V1 end domain of keratin 1 in non-epidermolytic palmar-plantar keratoderma. J Invest Dermatol 1994 ;103 (6): 764-9. 43. Reis A és mtsai.: Keratin 9 gene mutations in epidermolytic palmoplantar keratoderma (EPPK) Nat Genet 1994;6(2): 174-9. 102

44. Szalai Zs., Szalai Cs., Becker K., Török É.: Keratin 9 mutations in coil 1A region in epidermolytic palmoplantar keratoderma. Ped Dermatol 1999; 16(6): 430-435. 45. Mayuzumi N és mtsai.: R162W mutation of keratin 9 in a family with autosomal dominant palmoplantar keratoderma with unique histologic features. J Invest Dermatol 1999; 4 (2):150-152. 46. Swensson O.: Pachyonychia congenita. Keratin gene mutations with pleiotropic effect. Hautartzt 1999; 50(7):483-90. 47. Lin MT és mtsai.: Identification of sporadic mutations in the helix initaiation motif of keratin 6 in two pachyonychia congenita patients: further evidence for a mutational hot spot. Exp Dermatol 1999; 8 (2): 115-9. 48. Celebi JT és mtsai.: Mutation report: identification of a germline mutation in keratin 17 in a family with pachyonychia congenita type 2. J Invest Dermatol 1999; 113 (5): 848-50. 49. Smith FJ és mtsai.: Novel keratin 16 mutations and protein expression studies in pachypnychia congenita type 1 and focal palmoplantar keratoderma. Exp Dermatol 2000; 9 (3):170-7. 50. Richard G és mtsai.: Evidence for genetic Heterogeneity in monilethrix. J Invest Dermatol 1996; 107: 812-814. 51. Korge BP és mtsai.: Identification of novel mutations in basic hair keratins hHb1 and hHb2 in monilethrix: implications for protein structure and clinical phenotype. J Invest Dermatol 1999; 113 (4): 607-12. 52. Horev L és mtsai.: Monilethrix: mutational hotspot in the helix termination motif of the human hair basic keratin 6. Hum Hered 2000; 50 (5): 325-30. 53. Rugg EL és mtsai.: A mutation in the mucosal keratin K4 is associated with oral white sponge nevus. Nat Genet 1995; 11: 450-2 54. Richard G és mtsai.: Keratin 13 point mutation underlies the hereditary mucosal epithelial disorder white sponge nevus. Nat Genet 1995; 11: 453-5. 55. Irvine AD és mtsai.: Mutations in cornea-specific keratins K3 or K12 cause Meesmann’s corneal dystrophy. Nat Genet 1997; 16: 184-7. 56. Ku NO és mtsai.: Mutation of human keratin 18 in association with cryptogenic cirrosis. J Clin Invest 1997; 99: 19-23. 57. Kvarai P.: Gene therapy for genetic skin disease. J Invest Dermatol 1998; 111: 462-467. 58. Vogel JC.: A direct in vivo approach for skin gene therapy. Proc Assoc Am Physicians 1999; 111: 190-197.

103

59. Csikós M. és mtsai: A keratinok szerkezete és funkciója. Borgyógyászati és Venerológiai Szemle 1999; 75. évf.2. 53-57 60. Szalai Zs., Csikós M., Kárpáti S.: Epidermolysis bullosa herpetiformis Dowling-Meara típusa, két eset ismertetése és az irodalom áttekintése. Borgyógyászati és Venerológiai Szemle 2000; 76. évf.6. 247-250 61. Coulombe PA, Hutton ME, Letai A, Hebert A, Paller AS, Fuchs E. Point mutations in human keratin 14 genes of epidermolysis bullosa simplex patients: genetic and functional analyses. Cell. 1991; 20;66(6):1301-11. 62. Hovnanian A, Pollack E, Hilal L et al. A missense mutation in the rod domain of keratin-14 associated with recessive epidermolysis bullosa simplex. Nature Genet 1993;3: 327-332. 63. Bruckner-Tuderman L, Nilssen O, Zimmermann D R et al. Immunohistochemical and mutation analyses demonstrate that procollagen VII is processed to collagen VII through removal of the NC-2 domain. J Cell Biol 1995; 131: 551-559. 64. Nishizawa Y, Uematsu J, Owaribe K. HD4, a 180 kDa bullous pemphigoid antigen, is a major transmembrane glycoprotein of the hemidesmosome. J Biochem 1993; 113: 493-497. 65. Roussele P et al. Kalinin: an epithelium-specific basement membrane adhesion molecule that is a component of anchoring filaments. J Cell Biol 1991; 114: 567-576. 66. Marinkovich MP, Lunstrum GP, Burgeson RE. The anchoring filament protein kalinin is synthetized and secreted as a high molecular weight precursor. J Biol Chem1992; 267: 17901796. 67. Verrando P et al. Monoclonal antibody GB3, a new probe for the study of human basement membranes and hemidesmosomes. Exp Cell Res 1987; 170: 116-128. 68. Sonnenberg A et al. Integrin ? 6/? 4 complex is located in hemidesmosomes, suggesting a major role in epidermal cell basement membrane adhesion. J Cell Biol 1991; 113: 907-911. 69. Covello SP, Irvine AD, McKenna KE et al. Mutations in keratin K9 in kindreds with epidermolytic palmoplantar keratoderma and epidemiology in Northern Ireland. J Invest Dermatol 1998; 111: 1207-1209. 70. Vörner H. Zur Kenntnis des Keratoma hereditarium palmare et plantare. Arch Derm Syph 1901; 56: 3-31. 71. Alsaleh QA, Teebi AS. Autosomal recessive epidermolytic palmoplantar keratoderma. J Med Genet 1990; 27: 519-522. 72. Mascaro JM, Torras H, Mascaro JM. A child with unusual palms and soles. Epidermolytic palmoplantar keratoderma (PPK) of Vorner. Arch Dermatol 1996; 132:1509-1512.

104

73. Kuster W, Becker A. Indication for the identity of palmoplantar keratoderma type UnnaThost with type Vorner. Thost's family revisited 110 years later. Acta Derm Venereol 1992; 72:120-122. 74. Requena L, Schoendorff C, Sanchez Yus E. Hereditary epidermolytic palmo-plantar keratoderma (Vorner type)--report of a family and review of the literature. Clin Exp Dermatol 1991;16: 383-388. 75. Moriwaki S, Tanaka T, Horiguchi Y et al. Epidermolytic hereditary palmoplantar keratoderma. Histologic, ultrastructural, protein-chemical, and DNA analyses in two patients. Arch Dermatol 1988; 124: 555-559. 76. Hamm H, Happle R, Butterfass T et al. Epidermolytic palmoplantar keratoderma of Vorner: is it the most frequent type of hereditary palmoplantar keratoderma? Dermatologica 1988; 177: 138-145. 77. Camisa C, Williams H. Epidermolytic variant of hereditary palmoplantar keratoderma. Br J Dermatol 1985; 112: 221-225. 78. Urmacher C, Shiu MH. Malignant melanoma in association with keratosis palmaris et plantaris (epidermolytic hyperkeratosis variant). Am J Dermatopathol 1985; 7: Suppl:187190. 79. Thomas JR 3rd, Greene SL, Su WP. Epidermolytic palmo-plantar keratoderma. Int J Dermatol 1984; 23: 652-655. 80. Blasik LG, Dimond RL, Baughman RD. Hereditary epidermolytic palmoplantar keratoderma. Arch Dermatol. 1981;117: 229-231. 81. Reis A, Kuster W, Eckardt R et al. Mapping of a gene for epidermolytic palmoplantar keratoderma to the region of the acidic keratin gene cluster at 17q12-21. Hum Genet 1992; 90: 113-116. 82. Reis A, Hennies HC, Langbein L et al. Keratin 9 gene mutations in epidermolytic palmoplantar keratoderma (EPPK). Nat Genet 1994; 6: 174-179. 83. Mayuzumi N, Shigihara T, Ikeda S et al. R162W mutation of keratin 9 in a family with autosomal dominant palmoplantar keratoderma with unique histologic features. J Investig Dermatol Symp Proc 1999; 4: 150-152. 84. Coleman CM, Munro CS, Smith FJ et al. Epidermolytic palmoplantar keratoderma due to a novel type of keratin mutation, a 3-bp insertion in the keratin 9 helix termination motif. Br J Dermatol 1999; 140: 486-490. 85. Yang JM, Lee S, Kang HJ et al. Mutations in the 1A rod domain segment of the keratin 9 gene in epidermolytic palmoplantar keratoderma. Acta Derm Venereol 1998; 78: 412-416. 105

86. Endo H, Hatamochi A, Shinkai H. A novel mutation of a leucine residue in coil 1A of keratin 9 in epidermolytic palmoplantar keratoderma. J Invest Dermatol 1997; 109: 113-115. 87. Kuster W, Zehender D, Mensing H et al. Vorner keratosis palmoplantaris diffusa. Clinical, formal genetic and molecular biology studies of 22 families Hautarzt. 1995; 46: 705-710. 88. Rothnagel JA, Wojcik S, Liefer KM et al. Mutations in the 1A domain of keratin 9 in patients with epidermolytic palmoplantar keratoderma. J Invest Dermatol 1995; 104: 430433. 89. Navsaria HA, Swensson O, Ratnavel RC et al. Ultrastructural changes resulting from keratin9 gene mutations in two families with epidermolytic palmoplantar keratoderma. J Invest Dermatol 1995; 104: 425-429. 90. Bonifas JM, Matsumura K, Chen MA et al. Mutations of keratin 9 in two families with palmoplantar epidermolytic hyperkeratosis. J Invest Dermatol 1994; 103: 474-477. 91. Fuchs E, Green H. Changes in keratin gene expression during terminal differentiation of the keratinocyte. Cell 1980;19: 1033-1042. 92. Alberts K, Fuchs E. Expression of mutant keratin cDNA s in epithelial cells reveals possible mechanisms for initiation and assembly of intermediate filaments. J Cell Biol 1989; 108: 1477-1493. 93. Hatzfeld M, Weber K. Modulation of keratin intermediate filament assembly by single amino acid exchanges in the consensus sequence at the C-terminal end of the rod domain. J Cell Sci 1991; 99: 351-362. 94. Letai A, Coulombe PA, Fuchs E. Do the ends justify the means? Proline mutations at the ends of the keratin coiled-coil rod segment are more disruptive than internal mutations. J Cell Biol 1992; 116: 1181-1195. 95. Corden LD, McLean WH. Human keratin diseases: hereditary fragility of specific epithelial tissues. Exp Dermatol 1996; 5: 297-307. 96. Fuchs E. JSID Tanioku Memorial Lecture 1996. Genetic disorders of keratins and their

associated proteins. J Dermatol Sci 1996;13: 181-192. 97. Anton-Lamprecht I. Keratin clumping in epidermolysis bullosa, Dowling-Meara type. Br J Dermatol 1996; 134: 184-185. 98. Dowling GB, Meara RH. Epidermolysis bullosa dermatitis herpetiformis. Br J Dermatol 1954; 66: 139-143. 99. Fine JD, Eady RAJ, Bauer EA et al. Revised classification system for inherited epidermolysis bullosa: Report of the Second International Consensus Meeting on diagnosis and classification of epidermolysis bullosa. J Am Acad Dermatol 2000; 42: 1051-1066. 106

100.

Horn HM, Tidman MJ. The clinical spectrum of epidermolysis bullosa simplex. Br J

Dermatol 2000; 142: 468-472. 101.

Fuchs E, Green H. Changes in keratin gene expression during terminal differentiation of

the keratinocyte. Cell 1980; 19: 1033-1042. 102.

Miller SA, Dykes DD, Polesky HF. A simple salting out procedure for extracting DNA

from human nucleated cells. Nucl Acid Res 1988; 16: 1215. 103.

Coulombe PA, Hutton ME, Letai A, Hebert A, Paller AS, Fuchs E. Point mutations in

human keratin 14 genes of epidermolysis bullosa simplex patients: genetic and functional analyses. Cell 1991; 66: 1301-1311. 104.

Ganguly A, Rock JM, Prockop DJ. Conformation–sensitive gel electrophoresis for rapid

detection of single-base differences in double-standed PCR products and DNA fragments: evidence for solvent induced bands in DNA heteroduplexes. Proc Natl Acad Sci USA 1993; 90: 10325-10329. 105.

Becker K, Csikós M, Hováth A, Kárpáti S. Identification of a novel mutation in 3beta-

hydroxysteroid-Delta8-Delta7-isomerase in a case of Conradi-Hünermann-Happle syndrome. Exp Dermatol 2001; 4: 286-289. 106.

Hovnanian A, Pollack E, Hilal L et al. A missense mutation in the rod domain of

keratin-14 associated with recessive epidermolysis bullosa simplex. Nature Genet 1993; 3: 327-332. 107.

Fuchs E, Weber K. Intermediate filaments: structure, dynamics, function, and disease.

Annu Rev Biochem 1994; 63: 345-382. 108.

Steinert PM. The two-chain coiled-coil molecule of native epidermal keratin intedmediate

filaments is a type I-type II heterodimer. J Biol Chem 1990; 265: 8766-8774. 109.

Alberts K, Fuchs E. Expression of mutant keratin cDNA s in epithelial cells reveals

possible mechanisms for initiation and assembly of intermediate filaments. J Cell Biol 1989; 108: 1477-1493. 110.

Hatzfeld M, Weber K. Modulation of keratin intermediate filament assembly by single

amino acid exchanges in the consensus sequence at the C-terminal end of the rod domain. J Cell Sci 1991; 99: 351-362. 111.

Letai A, Coulombe PA, Fuchs E. Do the ends justify the means? Proline mutations at the

ends of the keratin coiled-coil rod segment are more disruptive than internal mutations. J Cell Biol 1992; 116: 1181-1195.

107

112.

Shemanko CS, Horn HM, Keohane SG et al. Laryngeal involvement in the Dowling-

Meara variant of epidermolysis bullosa simplex with keratin mutations of severely disruptive potential. Br J Dermatol 2000; 142: 315-320. 113.

Coulombe PA, Hutton ME, Vassar R, Fuchs E. A function for keratins and a common

thread among different types of epidermolysis bullosa simplex diseases. J Cell Biol 1991; 115: 1661-1674. 114.

Sasaki Y, Shimizu H, Akiyama M et al. A recurrent keratin 14 mutation in Dowling-

Meara epidermolysis bullosa simplex. Br J Dermatol 1999; 141: 747-748. 115.

Sorensen CB, Ladekjaer-Mikkelsen AS, Andresen BS et al. Identification of novel and

known mutations in the genes for keratin 5 and 14 in Danish patients with epidermolysis bullosa simplex: correlation between genotype and phenotype. J Invest Dermatol 1999; 112: 184-190. 116.

Shemanko CS, Mellerio JE, Tidman MJ, Lane EB, Eady RA. Severe palmo-plantar

hyperkeratosis in Dowling-Meara epidermolysis bullosa simplex caused by a mutation in the keratin 14 gene (KRT14). J Invest Dermatol 1998; 111: 893-895. 117.

Chan YM, Cheng J, Gedde-Dahl T Jr, Niemi KM, Fuchs E. Genetic analysis of a

severe case of Dowling-Meara epidermolysis bullosa simplex. J Invest Dermatol 1996; 106: 327-334. 118.

Swensson O, Eady RA, Umeki K, Nomura K, Harada K, Hashimoto I. A keratin K14

gene mutation in a Japanese patient with the Dowling-Meara type of epidermolysis bullosa simplex. J Dermatol Sci 1996; 11: 64-69. 119.

Krous HF. Lethal Dowling-Meara-type epidermolysis bullosa simplex in a young

infant. Pediatr Pathol Lab Med 1995; 15: 191-200. 120.

Hachisuka H, Morita M, Karashima T, Sasai Y. Keratin 14 gene point mutation in the

Kobner and Dowling-Meara types of epidermolysis bullosa simplex as detected by the PASA method. Arch Dermatol Res 1995; 287: 142-145. 121.

Sybert VP, Stephens K. A keratin 14 mutational hot spot for epidermolysis bullosa

simplex, Dowling-Meara: implications for diagnosis. J Invest Dermatol 1994; 102: 822. 122.

Stephens K, Sybert VP, Wijsman EM, Ehrlich P, Spencer A. A keratin 14 mutational

hot spot for epidermolysis bullosa simplex, Dowling-Meara: implications for diagnosis. J Invest Dermatol 1993; 101: 240-243. 123.

Ishida-Yamamoto A, McGrath JA, Chapman SJ, Leigh IM, Lane EB, Eady RA.

Epidermolysis bullosa simplex (Dowling-Meara type) is a genetic disease characterized by

108

an abnormal keratin-filament network involving keratins K5 and K14. J Invest Dermatol 1991; 97: 959-968. 124.

Umeki K, Nomura K, Harada K, Hashimoto I. A keratin K14 gene mutation in a Japanese

patient with the Dowling-Meara type of epidermolysis bullosa simplex. J Dermatol Sci 1996; 11: 64-69. 125.

Cummins RE, Klingberg S, Wesley J, Rogers M, Zhao Y, Murrell DF. Keratin 14 point

mutations at codon 119 of helix 1A resulting in different epidermolysis bullosa simplex phenotypes. J Invest Dermatol 2001; 117: 1103-1107. 126.

Whittock NV, Ashon HS, Mohammedi R et al. Comparative Mutation Detection

Screening of the Type VII Collagen Gene (COL7A1) Using the protein Truncation Test, Fluorscent

Chemical

Cleavage

of

Mismatch,

and

Conformation

Sensitive

Gel

Electrophoresis. J Invest Dermatol 1999; 113: 673-686 127.

Fine JD, Eady RAJ, Bauer EA et al. Revised classification system for inherited

epidermolysis bullosa: Report of the Second International Consensus Meeting on diagnosis and classification of epidermolysis bullosa. J Am Acad Dermatol 2000; 42: 1051-1066. 128.

Christiano AM, Hoffman GG, Zhang X et al.: A strategy for identification of sequence

variants in COL7A1, and a novel 2 bp deletion mutation in recessive dystrophic epidermolysis bullosa. Hum Mutat 1997; 10: 408-414. 129.

Mecklenbeck S, Hammami-Hauasli N, Höpfner B et al. Clustering of COL7A1 Mutations

in Exon 73: Implications for Mutation Analysis in Dystrophic Epidermolysis Bullosa. J Invest Dermatol 1999; 112:398-400 130.

Christiano AM, D’AlessioM, Paradisi M et al. A common insertion mutation in COL7A1

in two Italian families with recessive dystrophic epidermolysis bullosa. J Invest Dermatol 1996; 106:679-684. 131.

Ashton GHS, Mellerio JE, Dunnill MGS et al. Recurrent molecular abnormalities in type

VII collagen in southern Italian patients with recessive dystrophic epidermolysis bullosa. Clin Exp Dermatol 1999; 24: 232-235. 132.

Gardella R, Zoppi N, Ferraboli S et al. Three homozygous PTC mutations in the collagen

VII gene of patients affected by recessive dystrophic epidermolysis bullosa: analysis of transcript levels in dermal fibroblasts. Human Mutation 1999; 13: 439-452. 133.

Mellerio JE, Dunnill MGS, Allison W et al. Recurrent mutations in the type VII collagen

gene (COL7A1) in patients with recessive dystrophic epidermolysis bullosa. J Invest Dermatol 1997; 109: 246-249.

109

134.

Salas-Alains J C, Amaya-Guerra M, McGrath J. The molecular basis of dystrophic

epidermolysis bullosa in mexico. International Journal of Dermatology 2000; 39:439-442. 135.

Tamai K, Murai T, Mayama M et al. Recurrent COL7A1 mutations in Japanese patients

with dystrophic epidermolysis bullosa: positional effects of premature termination codon mutations on clinical severity. J Invest Dermatol 1999; 112:991-993. 136.

Kon A, Nomura K, Pulkinnen L et al. Novel glycine substitution mutations in COL7A1

reveal that the Pasini and Cockavne-Touraine variants of dominant dystrophic epidermolysis bullosa are allelic. J Invest Dermatol 1997; 109: 684-687. 137.

Hammami-Hauasli N, Schumann H, Raghunath M et al. Some, but not all, glycine

substitution mutations in COL7A1 result in intracellular accumulation of collagen VII, loss of anchoring fibrils, and skin blistering. J Biol Chem 1998; 272: 19228-19234. 138.

Hovnanian A, Rochat A, Bodemer C et al. Characterization of 18 new mutations in

COL7A1 in recessive dystrophic epidermolysis bullosa provides evidence for distinct molecular mechanisms underlying defective anchoring fibril formation. Am J Hum Genet 1997; 61: 599-610. 139.

Gardella R, Belletti L, Zoppi N et al. Identification of two splicing mutations in the

collagen type VII gene (COL7A1) of a patient affected by the localisata variant of recessive dystrophic epidermolysis bullosa. Am J Hum Genet 1996; 59: 292-300. 140.

Dunnill MGS, McGrath JA, Richards AJ et al. Clinicopathological correlations of

compound heterozygous COL7A1 mutations in recessive dystrophic epidermolysis bullosa. J Invest Dermatol 1996; 107: 171-177. 141.

Christiano AM, Greenspan DS, Lee S et al. Cloning of human type VII collagen:

complete primary sequence of the ? 1(VII) chain and identification of intragenic polymorphisms. J Biol Chem 1994; 269: 20256-20262. 142.

Hammami-Hauasli N, Kalinke UD, Schumann H et al. A combination of a common

splice site mutation and a frameshift mutation in the COL7A1 gene: absence of functional collagen VII in keratinocytes and skin. J Invest Dermatol 1997; 109:384-389. 143.

Cserhalmi-Friedman PB, Karpati S, Horvath A et al. Identification of a glycine

substitution and a splice site mutation site in the type VII collagen gene in a proband with mitis recessive dystrophic epidermolysis bullosa. Arch Dermatol Res 1997; 289: 640-645. 144.

Bruckner-Tuderman L, Nilssen O, Zimmermann D R et al. Immunohistochemical and

mutation analyses demonstrate that procollagen VII is processed to collagen VII through removal of the NC-2 domain. J Cell Biol 1995; 131: 551-559.

110

145.

Miller SA, Dykes DD, Polesky HF. A simple salting out procedure for extracting DNA

from human nucleated cells. Nucl Acid Res 1988; 16:1215. 146.

Ganguly A, Rock JM, Prockop DJ. Conformation–sensitive gel electrophoresis for rapid

detection of single-base differences in double-standed PCR products and DNA fragments: evidence for solvent induced bands in DNA heteroduplexes. Proc Natl Acad Sci USA 1993; 90: 10325-10329. 147.

Kon A, Pulkkinen L, Ishida-Yamamoto A, Hashimoto I, Uitto J. Novel COL7A1

mutations in dystrophic forms of epidermolysis bullosa. J Invest Dermatol 1998; 111: 534537. 148.

Zimmer KP, Schumann H, Mecklenbeck S et al. Esophageal stenosis in childhood:

dystrophic epidermolysis bullosa without skin blistering due to collagen VII mutations. Gastroenterology 2002; 122: 220-225. 149.

Csikós M, Orosz Z, Bottlik G et al. Dystrophic epidermolysis bullosa complicated by

cutaneous squamous cell carcinoma and pulmonary and renal amyloidosis. Clin Exp Dermatol 2003; 28; 163-166. 150.

Nishizawa Y, Uematsu J, Owaribe K. HD4, a 180 kDa bullous pemphigoid antigen, is a

major transmembrane glycoprotein of the hemidesmosome. J Biochem 1993; 113: 493-497. 151.

Roussele P et al. Kalinin: an epithelium-specific basement membrane adhesion molecule

that is a component of anchoring filaments. J Cell Biol 1991; 114: 567-576. 152.

Marinkovich MP, Lunstrum GP, Burgeson RE. The anchoring filament protein kalinin is

synthetized and secreted as a high molecular weight precursor. J Biol Chem 1992; 267: 17901796. 153.

Verrando P et al. Monoclonal antibody GB3, a new probe for the study of human

basement membranes and hemidesmosomes. Exp Cell Res 1987; 170: 116-128. 154.

Sonnenberg A et al. Integrin ? 6/? 4 complex is located in hemidesmosomes, suggesting a

major role in epidermal cell basement membrane adhesion. J Cell Biol 1991; 113: 907-911. 155.

Bosch R J, Gallardo MA, Ruiz del Portal G et al. Squamous cell carcinoma secondary to

recessive dystrophic epidermolysis bullosa: report of eight tumours in four patients. J Eur Acad Dermatol Venereol 1999; 13: 198-204. 156.

McGrath JA, Schofield OMV, Mayou BJ et al. Epidermolysis bullosa complicated by

squamous cell carcinoma: report of 10 cases. J Cutan Pathol 1992; 19: 116-123. 157.

Newman C, Wagner RF, Tyring SK et al. Squamous cell carcinoma secondary to

recessive dystrophic epidermolysis bullosa. A report of 4 patients with 17 primary cutaneous malignancies. J Dermatol Surg Oncol 1992; 18: 301-5. 111

158.

Browstein MH, Helwing EB. Systemic amyloidosis complicating dermatoses. Arch

Dermatol 1970; 102: 1-2. 159.

Kaneko K, Kakuta M, Ohtomo Y et al. Renal amyloidosis in recessive dystrophic

epidermolysis bullosa. Dermatology 2000; 200: 209-12. 160.

Gündüz K, Vatansever S, Türel A. Recessive dystrophic epidermolysis bullosa

complicated with nephrotic syndrome due to secondary amyloidosis. Int J Dermatol 2000; 39: 151-153. 161.

Stone MJ. Amyloidosis: a final common pathway for protein deposition in tissues. Blood

1990; 75: 531-545. 162.

Planes C, Kleinknecht D, Brauner M et al. Diffuse interstitial lung disease due to AA

amyloidosis. Thorax 1992; 47: 323-4. 163.

Vailly J, Gagnoux-Palacios L, Dell Ambra E és mtsai. Corrective gene transfer of

keratinocytes from patients with junctional epidermolysis bullosa restores assembly of hemidesmosomes in reconstructed epithelia. Gene Therapy 1998; 5: 1322-1332. 164.

Alama A, Barbieri F, Cagnoli M és mtsai. Antisense oligonucleotides as therapeutic

agents. Pharmacol Res 1997; 36(3): 171-8. 165.

Mecklenbeck S, Compton SH, Mejia JE és mtsai. A microinjected COL7A1-PAC vector

restores synthesis of intact procollagen VII in a dystrophic epidermolysis bullosa keratinocyta cell line. Hum Gene Ther. 2002; 1:13(13) 1655-62.

112

10 Az értekezés témájában megjelent közlemények

10.1 Az értekezés témájában megjelent közlemények Csikós M, Becker K, Kárpáti S, Horváth A: A keratinok szerkezete és funkciói (Structure and function of keratins) Borgyógyászati és Venerológiai Szemle 1999; 75. Évf. (2) 53-57. A Szemle 1999-es évi legjobb tudományos összefoglaló cikkéért járó nívódíj

Csikós M, Kárpáti S: A génterápia küszöbén-Beszámoló a DEBRA (Dystrophic Epidermolysis Bullosa Research Association) Marseille-ben rendezett világkongresszusáról. Borgyógyászati és Venerológiai Szemle 2000; 76. Évf. (5) 233.

Szalai Zs, Csikós M, Kárpáti S: Epidermolysis Bullosa Herpetiformis Dowling-Meara típusa-két eset ismertetése és az irodalom áttekintése. (Epidermolysis Bullosa Herpetiformis DowlingMeara type- two cases and rewiev of literature) Borgyógyászati és Venerológiai Szemle 2000; 76. Évf. (6) 247-250. A Szemle 2000-es évi legjobb kazuisztikájáért járó nívódíj

Kárpáti S, Csikós M, Cserhalmi-Friedman P. és mtsai.: Az Országos Epidermolysis Bullosa Centrum megalakulása és öt éves muködése. Borgyógyászati és Venerológiai Szemle 2000; 76. Évf. (6) 283-285.

Csikós M, Becker K, Kárpáti S, Horváth A: Keratin mutációk okozta örökletes borbetegségek. (Keratin mutations associated genodermatoses). Borgyógyászati és Venerológiai Szemle 2001; 77. Évf. (4) 149-155.

Becker K, Csikós M, Horváth A, Kárpáti S.: Identification of a novel mutation in 3? hydroxysteroid-? 8-? 7-isomerase in a case of Conradi- Hünermann- Happle syndrome. Exp Dermatol 2001; 10: (4):286-9. IF 2,234

M Csikós , Zs Orosz, Gy Bottlik, H Szocs, Zs Szalai, Zs Rozgonyi, J Hársing, É Török, L Bruckner-Tuderman, A Horváth, S Kárpáti: Dystrophic epidermolysis bullosa complicated by cutaneous squamous cell carcinoma and pulmonary and renal amyloidosis Clin Exp Dermatol 2003; (28); 163-166. IF 0,787 (2001)

113

M. Csikós , P. Holló, K. Becker, E. Rácz, A. Horváth, S. Kárpáti : Novel N160I mutation of keratin 9 in a large pedigree from Hungary with epidermolytic palmoplantar keratoderma Acta Derm Venereol 2003;83:(4):303-305. IF 1,477 (2001)

M Csikós , Zs Szalai, K Becker, B Sebok, I Schneider, A Horváth, S Kárpáti: Novel Keratin 14 Gene Mutations in Hungarian Patients with Epidermolysis Bullosa Simplex Exp Dermatol 2003 (közlés alatt) IF 2,234 (2001)

M Csikós , H I Szocs, A Lászik, S Mecklenbeck, A Horváth, S Kárpáti, L Bruckner-Tuderman High Frequency of the 425A? G Splice Site Mutation and Novel Mutations of COL7A1 Gene in Central-Europe: Significance for Future Mutation-Detection Strategies in Dystrophic Epidermolysis Bullosa Br J Dermatol 2003 (közlés alatt) IF 2,45 (2001)

10.2 Az értekezés témájában megjelent poszter és eloadáskivonatok M. Csikós , H. Szocs, S. Mecklenbeck, L. Bruckner-Tuderman, S. Kárpáti, A. Horváth.: Recurrent Mutation in Exon 3 of type VII Collagen Gene (COL7A1) in Mutilating Dystrophic Epidermolysis Bullosa in Hungarian Pedigrees. J Invest Dermatol 2000; Vol 115: (3): 574. IF: 4,822

H. Szocs, M. Csikós, S. Mecklenbeck, L. Bruckner-Tuderman, S. Kárpáti, A. Horváth.: Unusual Epidermolysis Bullosa Dystrophica Albopapuloidea with Late Onset in two Patients. J Invest Dermatol 2000; Vol 115: (3): 575. IF: 4,822

M. Csikós , Zs. Szalai, K. Becker, É. Török, A. Horváth and S. Kárpáti: Three Novel Keratin 14 Gene Mutations in Dowling-Meara Type Epidermolysis Bullosa Simplex J Invest Dermatol 2001; Vol. 117: (3): 797. IF: 4,539

M. Csikós , P. Holló, K. Becker, E. Rácz, A. Horváth, S. Kárpáti: Novel mutation of keratin 9 in a Hungarian pedigree with epidermolytic palmoplantar keratoderma J Invest Dermatol 2002; Vol. 119: (3): 720. IF 4,539

114

10.3 Az értekezés témájához közvetlenül nem kapcsolódó közlemények Becker K, Csikós M, Sárdy M, Szalai Zs, Horváth A, Kárpáti S.: Identification of two novel nonsense mutations in the transglutaminase 1 gene in a Hungarian patient with congenital ichthyosiform erythroderma. Exp Dermatol 2003; Jun;12(3):324-329. IF 2,234 (2001)

Rácz E, Csikós M, Kornsee Z, Kárpáti S.: Identification of mutations of the ATP2A2 gene in Hungarian patients with Darier’s disease. Exp Dermatol 2003. (közlés alatt) IF 2,234 (2001)

10.4 Az értekezés témájához közvetlenül nem kapcsolódó megjelent poszter és eloadáskivonatok Csikós M, Kohalmi B, Hargitai B, Kárpáti S, Horváth A: Severely, damaged amorphous components of skin elastic tissue in a congenital recessive cutis laxa. J Invest Dermatol 1999; Vol 113: (3): 452. IF: 4, 822

K Becker, Zs. Pálfi, M. Csikós, S. Kárpáti, A. Horváth: Lack of suspected A142R, A141R TGk mutations in Hungarian patients with autosomal recessive ichthyosis. J Invest Dermatol 1999; Vol 113: (3): 498. IF: 4, 822

Csikós M , Kohalmi B, Hargitai B, Kárpáti S, Horváth A.: Angeborene, rezessive vererbte Cutis laxa mit ungewöhnlicher, schwerer Myopathie. Zeitschrift für Hautkrankheiten H+G 2000; 1 (75) 59. K Becker, M Csikós, S Kárpáti, A Horváth: 3? - Hydroxysteroid- ? 8-? 7- Isomerase Mutation is a case of Conradi-Hünermann-Happle Syndrome. J Invest Dermatol 2000; Vol 115: (3): 574. IF: 4,822

Sárdy M, Csikós M, Geisen C, Preisz K, Tomsits E, Töx U, Wieslander J, Kárpáti S, Paulsson M, Smyth N: Tissue transglutaminase (TGc) is a minor antigen in autoimmune disease independent of gluten sensitive enteropathy. J Invest Dermatol 2001; Vol. 117: (3): 779. IF 4,539

K Becker, M Csikós, Z Szalai, S Kárpáti, A Horváth: TGk mutations in a Hungarian patient with lamellar ichthyosis J Invest Dermatol 2001; Vol. 117: (3): 797. IF 4,539 115

E. Rácz, M Csikós, Z Kornsée, A Horváth, S Kárpáti: Mutation analysis of the ATP2A2 Gene in five Hungarian petients with Darier’s disease. J Invest Dermatol 2002; Vol. 119:(3): 720. IF 4,539

K Becker, M Csikós, M Sárdy, Zs Szalai, S Kárpáti: Ultrastructural and genetic studies in patients with autosomal recessive congenital ichthyoses. J Invest Dermatol 2003; Vol. 119: (3): 768. IF 4,539

116

SEMMELWEIS EGYETEM DOKTORI ISKOLA

Recommend Documents