SEMMELWEIS EGYETEM GYÓGYSZERTUDOMÁNYOK DOKTORI ISKOLA

TARTALOMJEGYZÉK

SEMMELWEIS EGYETEM GYÓGYSZERTUDOMÁNYOK DOKTORI ISKOLA

A bilirubin konjugációjának és a konjugátumok transzport folyamatainak tanulmányozása primer kollagén „szendvics” és hagyományos rigid májsejt kultúrában Doktori (Ph.D.) értekezés

Lengyel György Témavezetők: Dr. Vereczkey László D.Sc.; Jemnitz Katalin Ph.D. Szigorlati Bizottság Elnöke: prof. Dr. Magyar Kálmán, akadémikus Szigorlati Bizottság Tagjai: Dr. Bánhegyi Gábor D.Sc., Dr. Tihanyi Károly, a biológia tudományok kandidátusa Hivatalos Bírálók: Dr. Bánhegyi Gábor D.Sc., Dr. Tihanyi Károly, a biológia tudományok kandidátusa MAGYAR TUDOMÁNYOS AKADÉMIA KÉMIAI KUTATÓKÖZPONT, BIOMOLEKULÁRIS KÉMIAI INTÉZET FARMAKOBIOKÉMIAI OSZTÁLY

Budapest, 2006 -2-

TARTALOMJEGYZÉK

TARTALOMJEGYZÉK 1

RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ........................................................................................................- 5 -

2

BEVEZETÉS ...................................................................................................................................- 7 2.1

A máj szerepe a metabolizmusban, ....................................................................................................- 7 -

2.2

Drog transzport proteinek szerepe az endogén és exogén anyagok metabolizmusában ...................- 8 -

2.3

A bilirubin metabolizmusa ..............................................................................................................- 16 -

2.4

A kolesztázis ....................................................................................................................................- 20 -

2.5

Gyakran alkalmazott in vitro módszerek a transzport aktivitás meghatározására .........................- 25 -

3

CÉLKITŰZÉSEK .........................................................................................................................- 27 -

4

KÍSÉRLETI MÓDSZEREK........................................................................................................- 28 4.1

Vegyszerek.......................................................................................................................................- 28 -

4.2

Májsejt preparálás ..........................................................................................................................- 28 -

4.3

Mikroszóma preparálás...................................................................................................................- 31 -

4.4

UGT1A1 aktivitás meghatározása mikroszómában ........................................................................- 31 -

4.5

A BG meghatározása primer hepatocita rigid kultúrában ..............................................................- 32 -

4.6

Indukciós vizsgálatok primer hepatocita rigid kultúrában..............................................................- 32 -

4.7

Western immunoblot analízis ..........................................................................................................- 33 -

4.8

A BG és PNP-G mennyiségi meghatározása HPLC analízissel......................................................- 33 -

4.9

A BMG és BDG tömegspektrometriás azonosítása .........................................................................- 34 -

4.10

Primer hepatocita szendvics kultúra ...............................................................................................- 35 -

4.11

A BG és PNP-G szinuszoidális és kanalikuláris effluxának meghatározása primer hepatocita szendvics kultúrában .......................................................................................................................- 35 -

4.12

Indukciós vizsgálatok primer hepatocita szendvics kultúrában ......................................................- 36 -

4.13

MRP2 és MRP3 proteinek gátlásának vizsgálata hepatocita szendvics kultúrában .......................- 37 -

4.14

CDF-DA kanalikuláris felhalmozódásának vizsgálata konfokális pásztázó lézer mikroszkóp segítségével .....................................................................................................................................- 37 -

4.15

Vezikuláris transzport kísérletek .....................................................................................................- 38 -

4.16

Statisztika ........................................................................................................................................- 39 -

4.17

A vizsgalataink során alkalmazott modell vegyületek szerkezete ....................................................- 39 -

5

EREDMÉNYEK............................................................................................................................- 41 5.1

A bilirubin-glukuronidok HPLC analízise és azonosítása ..............................................................- 41 -

5.2

Bilirubin konjugáció primer patkány hepatocita kultúrában ..........................................................- 43 -

5.3

Enziminduktorok hatása a bilirubin konjugációjára primer patkány hepatocita kultúrában .........- 46 -

5.4

In vitro epevezető rendszer kialakulása és feltárása primer patkány hepatocita szendvics kultúrában.. .......................................................................................................................................................- 48 -

5.5

A BG és pNPG biliáris efflux indexének meghatározása patkány és humán hepatocita szendvics kultúrában .......................................................................................................................................- 49 -

-3-

TARTALOMJEGYZÉK 5.6

A szinuszoidális és a kanalikuláris membránon történő BG efflux BDG/BMG aránya 96 órás patkány és humán hepatocita szendvics kultúrában .....................................................................................- 50 -

5.7

A szinuszoidális BDG/BMG arány változása a humán és patkány májsejtkultúra korának függvényében...................................................................................................................................- 51 -

5.8

A BDG/BMG arány alakulása humán és patkány mikroszóma frakcióban.....................................- 52 -

5.9

Összehasonlító indukciós vizsgálat primer patkány hepatocita rigid és szendvics kultúrában.......- 53 -

5.10

Induktorok hatása a BG szinuszoidális és kanalikuláris effluxára patkány hepatocita szendvics kultúrában .......................................................................................................................................- 54 -

5.11

Gátlószerek hatása a BG kanalikuláris és szinuszoidális effluxára patkány hepatocita szendvics kultúrában .......................................................................................................................................- 55 -

5.12

Gátlószerek hatása az 5(6)-karboxi-2',7'-diklórfluoreszcein-diacetát (CDF-DA) kanalikuláris akkumulációjára..............................................................................................................................- 56 -

5.13

Gátlószerek hatása a 3H-estradiol-17β-D-glukuronid (3H-E217βG) MRP2,3 mediált transzportjára kifordított membrán vezikulákon .....................................................................................................- 57 -

5.14

Eredmények összefoglalása.............................................................................................................- 60 -

6

MEGBESZÉLÉS...........................................................................................................................- 63 -

7

ÖSSZEFOGLALÁS......................................................................................................................- 75 -

8

SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE ....................................................................................- 76 -

9

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS ......................................................................................................- 77 -

10

IRODALOMJEGYZÉK................................................................................................................... 78

-4-

RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE

1 3

RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE

H-E217βG

3

H-estradiol-17β-D-glukuronid

A

Apikális pólus

ABC

„ATP Binding Cassette”

AhR

Aromás szénhidrogén receptor

ASBT

Apikális epesó transzporter

BB

Benzbromaron

BCRP

Mellrák rezisztencia protein

BDG

Bilirubin-diglukuronid

BDL

Epevezető lekötés

BG

Bilirubin-glukuronid

BL

Bazolaterális pólus

BMG

Bilirubin-monoglukuronid

BRIC

„Benign Recurrent Intrahepatic Cholestasis”

BSEP

Epesó export pumpa

BSP

Brómszulfoftalein

CAR

Konstitutív androsztán receptor

CL

Klofibrát

cMOAT

Kanalikuláris multispecifikus organikus anion transzporter

CSA

Ciklosporin A

DEX

Dexametazon

DMSO

Dimetil-szulfoxid

EBSS

„Earle’s Balanced Salt Solution”

EGTA

Etilénglikol-bisz-(amino-etiléter)-tetraacetát

ER

Endoplazmatikus retikulum

FIC1

Familiáris intrahepatikus kolesztázis

FTF

Fetoprotein transzkripciós faktor

FXR

Farnezoid X receptor

GR

Glukokortikoid receptor

HBSS

„Hank’s Balanced Salt Solution”

HCC

Hepatocelluláris karcinóma

IM

Indometacin

LXR

„Liver X receptor”

-5-

RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE MC

Metilkolantrén

MDR

Multidrog rezisztencia protein

MOPS

3-(N-morfolinó)-propánszulfonsav

MRP

Multidrog rezisztencia kapcsolt protein

NSAID

Nem szteroid gyulladáscsökkentők

NTCP

Na+-taurokolát kotranszporter

OATP

Organikus anion transzport protein

OCT

Organikus kation transzporter

PB

Fenobarbitál

PBS

„Phosphate Balanced Salt Solution”

PFIC

Progresszív familiáris intrahepatikus kolesztázis

P-GP

P-glikoprotein

PNP-G

Para-nitrofenol-glukuronid

PPARα

Peroxiszóma proliferátor aktivált receptor α

PR

Probenecid

PSC

Primer szklerotizáló kolangitisz

PXR

Pregnán X receptor

Q-víz

„Millipore Ultra-Pure Water System Purification Pak” (MilliQ)

RARα

Retinolsav receptor

RIF

Rifampicin

rpm

fordulat/perc

SHP-1

Kis heterodimer partner

SLC

„Membrane Solute Carriers”

SPGP

Testvér p-glikoprotein

T3

Tiroxin

TRIS

Tri(hidroxi-metil)-metilamin

UDCA

Urszodeoxitaurokolsav

UGT

UDP-glukuronozil-transzferáz

VBDS

„Vanishing Bile Duct Syndrome”

XRE

„Xenobiotic Responsive Element”

-6-

BEVEZETÉS

2

BEVEZETÉS

2.1 A máj szerepe a metabolizmusban1,2 A máj központi szerepet játszik az endogén és exogén anyagok metabolizmusában. A szervezetbe került idegen anyagok és feleslegessé vált endogén molekulák a szisztémás vérkeringés útján többnyire albuminhoz kötve jutnak el a májhoz.

1. ábra 1 A májlebenyke szerkezete (A) pásztázó elektronmikroszkópos felvétel, periférián a szinuszoidok, középen a centrális véna látható; (B) fénymikroszkópos felvétel a szinuszoidok egy részletéről, középen egy az epitéllel érintkező vörös vértesttel; (C) a máj sematikus szerkezete.

A máj szerkezetére jellemző, hogy a vér az átlyuggatott felszínű endotél sejtekkel borított szinuszoidokban áramlik (1/A, 1/B ábra), ennek köszönhetően a molekulák könnyen diffundálnak a májsejtek felszínéhez. A hatszögletű májlebenyke a máj szerkezeti és funkcionális egysége, melyben a polarizált májsejtek úgy helyezkednek el, hogy bazolaterális (szinuszoidális) membránjuk a szinuszoidok felé, míg apikális (kanalikuláris) membránjuk az epevezető felé néz. A két membrán eltérő típusú transzporter rendszerrel rendelkezik, mely lehetővé teszi az epeszekréció megvalósulását (1/C ábra). A szinuszoidális membránban uptake proteinek foglalnak helyet, melyek feladata a metabolizálandó anyagok felvétele a májsejtekbe, majd a felvétel után a molekulák vagy változatlan formában ürülnek az epével, vagy pedig metabolizmus útján átalakulnak polárosabb, vízoldékonyabb anyagokká. A gyógyszerek biotranszformációjának leggyakoribb formája az oxidáció. A fázis I folyamatok közé tartozik például az endoplazmatikus retikulumban zajló mikroszómális oxidáció, melyet a citokróm P-450 enzimek katalizálnak. A mikroszómális monooxigenáz-rendszeren kívül az oxidatív fázis I folyamatokban részt vesznek más nem -7-

BEVEZETÉS mikroszómális enzimek, például az alkohol-dehidrogenáz vagy az aldehid-oxidáz. A fázis II folyamatok főként a fázis I során keletkezett kevésbé poláris metabolitok vízoldhatóságát fokozzák poláris kis molekulák (glukuronsav, szulfát csoport, glutation) konjugációjával. A fázis I és fázis II folyamatok lezajlása után a metabolitok molekulatömegtől függően vagy a szinuszoidális efflux transzportereken keresztül visszakerülnek a véráramba, majd vizelettel ürülnek, vagy pedig a kanalikuláris efflux transzporterek segítségével az epébe szekretálódnak. Emberben általában az 500, míg patkányban a 300 g/mol-nál nagyobb molekulatömegű metabolitok ürülnek epével. Újabban az uptake folyamatokat fázis 0-nak, míg az efflux folyamatokat fázis III-nak nevezi az irodalom. 2.2

Drog transzport proteinek szerepe az endogén és exogén anyagok metabolizmusában

2.2.1 Uptake proteinek, az SLC transzporter nagycsalád3,4 Az SLC transzporter nagycsalád tagjait a Na+ ion gradienstől való függésük szempontjából két csoportba lehet osztani: Na+ ion függő (Ntcp, Asbt), illetve független transzporterekre (OATP; OAT; OCT).

2. ábra Az Oatp1 szerkezete3 12 transzmembrán domént feltételező modell. A 3 potenciális extracelluláris N-glikozilációs helyet Y, a konzervatív aminosavakat fekete, míg a töltéssel rendelkező aminosavakat szürke pöttyök jelölik.

A humán NTCP, és a patkány Ntcp működése a sejtbe irányuló nátrium gradiensen alapul (másodlagos aktív transzport). Kizárólag a májban expresszálódnak és az epesavak és származékaik felvételében játszanak szerepet. A patkány Ntcp szemben a humán NTCP-vel az epesavakon kívül az esztron- és dehidroepiandroszteron-szulfát, valamint a thyroid hormonok felvételében is szerepet játszik. A Na+ ion függő uptake transzporterek közé

-8-

BEVEZETÉS tartozik az ASBT. Elsősorban a kolangiociták és az enterociták apikális membránján lokalizálódik, főként az epesavak felvételében játszik szerepet. 1. táblázat Áttekintés a humán és patkány szervezetben előforduló uptake proteinek nevezéktanáról, membrán és szöveti 3 lokalizációjáról valamint főbb szubsztrátjairól . Név

Szisztematikus név

Polaritás

Szöveti lokalizáció

Főbb szubsztrátok

NTCP

SLC10A1

BL

hepatocita

epesavak, esztron-szulfát, BSP

hPGT

SLC21A2

BL

OATP-A

SLC21A3

BL

hepatocita, agy

OATP-C

SLC21A6

BL

hepatocita

OATP-8

SLC21A8

BL

hepatocita

epesavak, esztron-szulfát, E217βG, eikozanoidok, epesavak, rifampicin, eikozanoidok, BDG, BMG epesavak, digoxin, BMG

OATP-B

SLC21A9

BL

általános

esztron-szulfát, benzil-penicillin

OATP-D

SLC21A11

általános

prosztaglandin E2

OATP-E

SLC21A12

általános

taurokolát. T3,T4

OATP-F

SLC21A14

agy

E217βG, T3,T4, BSP

OCT1

SLC22A1

BL

Ntcp

Slc10a1

BL

hepatocita, vese

epesavak, esztron-szulfát, T3,T4

Oatp1

Slc21a1

BL

máj, vese

rPGT

Slc21a2

BL, A

általános

epesavak,szteroid hormonok, T3,T4 BDG, ochratoxin eikozanoidok

OAT-K1/2

Slc21a4

vese

epesavak, hormonok, eikozanoidok

Oatp2

Slc21a5

BL

epesavak, digoxin

Oatp3/Oat2

Slc21a7

BL, A

vese, máj, véragygát, retina jejunum, chorioid plexus

Oatp9

Slc21a9

Humán uptake proteinek eikozanoidok

kis organikus kationok

Patkány Uptake proteinek

Oatp4/Lst-1

Slc21a10

Oatp11

Slc21a11

Aptp12

Slc21a12

Oatp5

Slc21a13

Oatp14

Slc21a14

Oat1/Oct1

Slc22a1

epesavak, eikozanoidok epesavak, eikozanoidok, rokuronium

BL

máj, szem

epesavak, eikozanoidok, phalloidin

máj, tüdő, szív, agy, retina, vese vese

epesavak, T3

agy BL

hepatocita, vese

kis organikus kationok

Az OATP család tagjai széles és részben átfedő szubsztrát spektrummal jellemezhetőek (1. táblázat). A 2. ábrán látható a 12 transzmembrán szegmenset tartalmazó hipotetikus szerkezet. A család tagjainak közös jellemzője: az ötös számú nagy extracelluláris hurok, mely a 9.-10. transzmembrán régió között található, illetve az N-glikozilációs helyek a kettes, ötös extracelluláris hurkon. A legtöbb Oatp esetében a működésben szerepet játszó hajtóerő tisztázatlan. Az Oatp1, Oatp2 által mediált taurokolát transzport hátterében az intracelluláris glutation gradiens játszik szerepet. Mai ismereteink szerint nem írtak le olyan betegséget, mely az OATP deficiencia következménye lenne. Ezzel szemben több kolesztázis modellben – szepszis indukált, estradiol indukált, epevezető lekötés – megfigyelték, hogy a

-9-

BEVEZETÉS hepatocelluláris Oatp protein szintek csökkennek. Állatkísérletekkel igazolták, hogy primer szklerotizáló kolangitisz esetén az Oatp1,2 protein szint közel 80%-kal csökken.

2.2.2

Efflux proteinek, ABC transzport proteinek5,6

Az ABC efflux transzport proteinek családjába

olyan

membránproteinek

tartoznak, melyek szerkezetileg teljesen különböző

molekulákat

aktív

transzporttal a koncentráció gradiens ellenében

transzportálnak.

A

működésükhöz szükséges energiát az ATP

hidrolízise

topológia

fedezi.

alapján

Membránaz

ABC

transzportereket 4 osztályba sorolják (3. ábra). Az elsőként felfedezett csoport a p-glikoproteinek (P-gp) voltak. A P-gp (mdr, spgp) fehérjék két, egyenként 6 3. ábra

transzmembrán szegmenset tartalmazó 6

Az ABC proteinek általános szerkezete A feltételezett másodlagos szerkezet alapján az extraceluláris N glikozilezett helyek a P-gp esetén az 1., az MRP1,2,3 esetében az 1. és a 3., az MRP4,5 esetében a 2. transzmembrán doménen, míg a BCRP esetében a 3. transzmembrán hurkon helyezkednek el.

transzmembrán modulból épülnek fel, melyekhez 2 intracelluláris ATP-kötő domén

kapcsolódik.

Az

első

extracelluláris hurok a P-gp esetében nagymértékben N-glikozilezett. In vitro

kísérletek alapján feltételezik, hogy a glikoziláció megléte vagy hiánya kevéssé befolyásolja a transzport aktivitást, ezzel szemben nagy szerepet játszik a proteinek intracelluláris transzportjában és membrán lokalizációjában. A P-gp-hez hasonló szerkezetet mutat a második csoport, melybe az MRP4,5 proteinek tartoznak, azzal a különbséggel, hogy az Nglikoziláció a négyes extracelluláris hurkon történik. A harmadik csoportba tartozó MRP1,2,3 alapstruktúrája azonos az MRP4,5-el, azonban ezek tartalmaznak egy extra-transzmembrán domént, mely öt transzmembrán szegmensből épül fel. A negyedik csoportba az utolsóként felfedezett transzport proteinek tartoznak az úgynevezett fél-transzporterek, amely csoport legismertebb tagja a BCRP. A BCRP-t hat transzmembrán szegmens és egy N terminális ATP - 10 -

BEVEZETÉS kötő domén alkot. A funkcionális egység két fél egység összekapcsolódásával jön létre. Az alábbi táblázat áttekintést nyújt az emlős efflux transzporterek szöveti és membrán lokalizációjáról, valamint a főbb szubsztrátjairól. 2. táblázat Áttekintés az emlős szervezetben előforduló MRP proteinek nevezéktanáról, membrán és szöveti lokalizációjáról 5 valamint főbb szubsztrátjairól . MRP transzporterek

Szisztematikus név

Membrán

Szöveti lokalizáció

Főbb szubsztrátok

MRP1

ABCC1

BL

Általános

MRP2/CMOAT

ABCC2

A

hepatocita, vese

MRP3

ABCC3

BL

MRP4

ABCC4

A

hepatocita, kolangiocita, vese vese

glutation-konjugátumok, citosztatikumok konjugált anionok, citosztatikumok konjugált anionok, ciszplatin

MRP6

ABCC6

BL,A

általános

MDR1/PGY1

ABCB1

A

általános

BSEP/SPGP/PGY4

ABCB11

A

hepatocita

ciklosporin A, verapamil, epesavak, citosztatikumok Epesavak

MDR3/PGY3

ABCB4

esztradiol konjugátumok, methotrexat BQ123

A

hepatocita

digoxin, foszfatidil-kolin

ABCA1

A

hepatocita, monocita

foszfatidil-kolin

ABCG5/ABCG8

A

hepatocita

foszfatidil-szerin

2.2.3

Transzport proteinek élettani szerepe7

A sejtmembránban található transzporterek típusa és mennyisége függ a sejt, szövet vagy szerv fiziológiai szerepétől; polarizált sejtek esetén a membrán típusától. Orális úton a szervezetbe kerülő xenobiotikumok először a bélhám sejteken található transzport rendszerrel kerülnek kapcsolatba. A vékonybél villusaiban igen nagy számban található az MDR1, MRP2, BCRP melyek az enterociták apikális membránján lokalizálódnak és a xenobiotikumok felszívódása ellen hatnak. Ezek a transzporterek ugyan jelen vannak az egész bélcsatornában, de expressziójuk bélszakaszonként eltérő: a tápcsatorna kezdetén és végén a legkisebb, a duodénumban és a jejunumban főként MRP2, míg az ileumban és a colonban főként MDR1 és BCRP expresszálódik. A bélhám sejetek bazolaterális membrán doménjén főként MRP1,3 található, a működésük következtében az enterocitákba felvett epesavak a vérkeringésbe kerülnek. A fiziológiai szerep tisztázásához nagy segítséget jelentettek a knock-out egerek. Az Mdr1a knock-out egereken olyan bélgyulladást tapasztaltak, mely hasonlít néhány humán bélbetegséghez. Bár még nem igazolták, de feltehetőleg a jelenséget az okozza, hogy a bélbaktériumok által termelt toxinok a hiányzó mdr1a aktivitás miatt bejutnak a bélfalba és ott gyulladást indukálnak. Az epesavak homeosztázisában kritikus lépés az ASBT mediált intesztinális reabszorpció, mely működés - 11 -

BEVEZETÉS eredménye az epesavak enterohepatikus körforgása. Patkányokban a jejunum alsóbb szakaszán az Oatp3 is szerepet játszik az epesavak felszívódásában.

4. ábra

5

A transzporterek szerepe a gyógyszerek aktív transzportjában Az elsődleges epeszekrétum a májsejtek által határolt epecsatornákba választódik ki, az epesavak egy része a kolangiocitákkal határolt epegyűjtőcsatornákban visszaszívódik (kolehepatikus körforgás). A bélcsatornába került epesavak és a bilirubin egy része a bélhámsejtek transzportereinek közreműködésével visszakerülnek a központi keringésbe (enterohepatikus körforgás). Bal oldalon a humán, jobb oldalon a patkány sejtekre jellemző transzport proteinek találhatóak.

A felszívódás után a vérkeringésbe került molekulák a májba jutnak. A metabolizálandó endogén és exogén anyagok főként OATP, illetve NTCP mediált uptake útján kerülnek be a hepatocitákba. A fázis I és II folyamatok lezajlása után a metabolitok vagy a bazolaterális membránon lokalizálódó MRP1,3 transzporteren keresztül visszakerülnek a vérbe, majd vizelettel ürülnek; vagy pedig a hepatociták kanalikuláris membránján lokalizálódó transzporterek segítségével az epébe kerülnek. Az így keletkezett elsődleges szekrétum a kolangiocitákkal szegélyezett epevezetőkben áramlik. A kolangiocták apikális membránján lokalizálódó ASBT főként epesavakat abszorbeál az elsődleges szekrétumból, míg a kolangiociták bazolaterális membránján lokalizálódó MRP3 és tASBT („truncated” ASBT) a

- 12 -

BEVEZETÉS periduktuláris plexusba juttatja az epesavakat, így létrehozva azok intrahepatikus körforgását (kolehepatikus sönt). A transzporterek nagy szerepet töltenek be a különböző gátak (vér-agy gát, placenta barrier) funkciók létrehozásában. Az MDR1 alapvető szerepet játszik a vér-agy gát működésében, hiányukban a drogok agyi penetrációja 10-vagy akár 100-szorosára is emelkedhet, ami súlyos toxikológiai következményeket vonhat maga után. A placenta barrier létrehozásában fő szerepet játszanak a szincitiotrofoblasztok apikális membránján lokalizálódó P-gp, BCRP és feltehetőleg MRP2, melyek meggátolják a drogok és méreganyagok bejutását a magzati keringésbe. 2.2.4 Transzport proteinek farmakológiai szerepe6,8,9 A transzporterek alapvető szerepet játszanak a kemoterápiás rezisztencia kialakulásában, továbbá a gyógyszerek kiválasztásában és szöveti megoszlásában, azaz a gyógyszerek farmakokinetikai profiljának kialakításában. Komoly farmakológiai kutatások irányulnak P-gp inhibitorok keresésére, azt remélve, hogy így fokozható a citosztatikumok hatása. Azonban a szisztémás adagolás következtében a gátló hatás nem csak a tumoros sejteket érinti, hanem az egész szervezetre is hatással van. A bélben lokalizálódó P-gp proteinek direkt gátlása (PSC833, GF120918, ciklosporin A) drámaian megnövelte bizonyos P-gp szubsztrátok, például a paclitaxel biológiai hasznosíthatóságát mind egér, mind humán vizsgálatokban. Állatkísérletekben a HIV proteáz inhibitor saquinavir magzati penetrációja is fokozódott a PSC833, GF120918 P-gp gátlószerek hatására. Az MRP1 az epithelium sejtjeinek bazolaterális membránján lokalizálódik. Az mrp1 knockout egerekben fokozott toxicitás jelentkezett i.v. etopozid adagolás következtében az orofaringeális nyálkahártyán, illetve a tesztikuláris tubulusokban. A jelenség következtében felismerték, hogy az MRP1 nagy szerepet játszik ezeknek a szöveteknek a toxinokkal, xenobiotikumokkal szembeni védekezésében. Hasonlóan knock-out egereken végzett vizsgálatok mutattak rá, hogy az i.p. adagolt vinkrisztin fokozott toxicitást okozott a kontroll egerekhez képest, különösen a csontvelőben és a gasztrointesztinális nyálkahártyában. Normális körülmények között ezeknek a szöveteknek a védelmében kiterjedt szerepet játszanak a P-gp és MRP1 proteinek. Az endogén MRP1 expresszióval rendelkező sejtvonalak a vinka alkaloidokkal, antraciklinekkel és a topotekánnal történő kezeléssel szemben rezisztensek.

- 13 -

BEVEZETÉS Az MRP2 meghatározhatja az intesztinális abszorpció mértékét. Az enterociták apikális membránján lokalizálódva a lumenbe juttatja szubsztrátjait, így jelenléte a gasztrointesztinális rendszerben befolyásolhatja az orális gyógyszerek biológiai hasznosíthatóságát. Potenciális gyógyszer-interakciók forrása lehet az ún. stimulatív kotranszport, amelyet eddig az MDR1, MRP1 és MRP2 proteinekre írtak le. Az egyik elsőként dokumentált jelenség a redukált glutation hatása az MRP1 mediált etopozid és vinkrisztin transzportjára. Csökkentett glutation koncentráció mellett mindkét drog transzportja csökken. A legegyszerűbb magyarázat erre a jelenségre, hogy a két komponens egyszerre transzportálódik, így az egyik vagy a másik komponens hiányában a transzport kis kapacitással, vagy nem működik. Az MDR1 esetében szintén hasonló jelenséget írtak le két modell szubsztrát a Hoechst 33342 és a Rodamin 123 jelenlétében. A két szubsztrát transzportja eltérő típusú vegyületekkel stimulálható, így ezek alapján feltételezték, hogy ezeknek a fehérjéknek minimum két szubsztrát-kötő hellyel kell rendelkezniük. Az MRP2 szintén stimulálható, így pl. szulfinpirazon és vinkrisztin transzportja sztöchiometrikusan stimulálható glutationnal; a szulfinpirazon,

indometacin,

penicillin

G

transzportja

stimulálható

N-etilmaleimid-

glutationnal; az E217βG transzportja pedig szulfinpirazonnal. A kotranszport fokozódás mértéke néhány vizsgált esetben több mint négyszeres volt. A megnövekedett transzportaktivitás megváltoztathatja a gyógyszeres kezelés hatásfokát, mivel az intesztinális abszorpció csökkenhet. Az MRP4 főként az antivirális nukleozid analógok és egyéb nukleozid analóg citosztatikumok transzportjában vesz részt. Az antivirális rezisztencia kialakulásában nagy szerepet tulajdonítanak az MRP4-nek, különösen HIV fertőzöttek esetében. A BCRP-t, mely szintén nagy szerepet játszik a per os adagolt gyógyszerek biológiaihasznosíthatóságában, egy doxorubicin rezisztens mellrák eredetű sejtvonalon fedezték fel. A BCRP inhibitor GF120918 hatására az orálisan adagolt topotekán hatszoros szérumszint emelkedése következett be. 2.2.5 Uptake és efflux proteinek szintézisének és aktivitásának szabályozása10,11,12,13,14 Az uptake és efflux proteinek aktivitása −hasonlóképpen a metabolizmusban résztvevő fázis I és II enzimekéhez− elsősorban a szervezetet érintő kémiai terheléstől függ. Ha növekszik a szervezet kémiai terhelése (toxinok, gyógyszerelés), akkor ezzel egyensúlyt tartva növekedni fog a metabolizáló rendszerben résztvevő enzimek és transzport fehérjék mennyisége. A megváltozott kémiai környezethez való alkalmazkodás biokémiai adaptáció útján történik. A legtöbb szervezetbe kerülő xenobiotikum egyben transzkripciós faktor aktivátor vagy receptor

- 14 -

BEVEZETÉS ligand, így ezek a molekulák a transzkripció fokozódásával de novo fehérjeszintézist indukálnak. Ez a hosszú távú adaptáció lassan bekövetkező folyamat, mivel a fehérje szintézis időigényes, a bekövetkezett változás azonban tartós. Egy élőlény túlélése szempontjából előnyös az, ha minnél gyorsabban reagál környezetének változására. A metabolizmus folyamataiban szerepet játszó transzport proteinek aktivitása dinamikus poszttranszkripciós szabályozás (foszforiláció, membráninzerció) alatt áll, így az élőlények gyorsabban reagálhatnak a megváltozott kémiai terhelésre. A kanalikuláris transzport proteinekből (BSEP, MRP2) nagymennyiségű intracelluláris raktár található, ehhez képest a membránban aktuálisan lokalizálódó transzport fehérjék mennyisége elhanyagolható. 3. táblázat

Áttekintés a transzport proteinek indukálhatóságáról15 Nukleáris Receptor Pregnán X receptor

Konstitutív androsztán Recepetor

Farnezoid X receptor

Peroxiszóma proliferátor aktivált receptor α

Ligandok PXR

CAR

FXR

PPARα

rifampicin, szteroidok, phenobarbitál, sztatinok, epesavak és epesav prekurzorok

fenobarbitál

epesavak

Transzport proteinek ↑ MDR1

Funkcionális következmények

↑ OATP2

↑ hepatocelluláris uptake (pl. digoxin)

↑ MRP2

↑ efflux a hepatociták, enterociták felszínén

↑ MRP2

↑ efflux a hepatociták, enterociták felszínén

↑ MRP3

↑ efflux a hepatociták, kolangiociták, és enterocyták bazolaterális felszínén

↑ efflux a hepatociták, enterociták felszínén

↑ I-BABP

zsírsavak, klofibrát

↑ OATP8

↑ hepatocelluláris uptake

↑ BSEP

↑ epesav biliaris exkréció

↑ MRP2

↑ efflux a hepatociták, kolangiociták, és enterociták kanalikuláris felszínén

↑ mdr2

↑ kanalikuláris foszfolipid flippáz aktivitás

↑ ASBT

↑ Na ion függő epesav felvétel az ileumban

+

+

Glukukortikoid receptor

GR

glukokortikoidok

↑ ASBT

↑ Na ion függő epesav felvétel az ileumban

Retinol sav receptor

RARα

retinoidok

↑ NTCP

↑ Na ion függő epesav felvétel az ileumban

Kis heterodimer partner

SHP-1

aktiváció FXR által

↓ Ntcp

↓ Na ion függő epesav felvétel az ileumban

↓ OATP-C

↓ epesav felvétel a hepatocitákba

+

+

α1fetoprotein transzkripciós faktor

FTF

epesavak

↑ MRP3

↑ efflux a hepatociták, kolangiociták, és enterociták bazolaterális felszínén

"Liver" X receptor

LXRα/β

oxiszterolok

↑ ABCA1

↑ koleszterin efflux a makrofágokból, hepatocitákból és az enterocitákból ↑ koleszterin szekréció az epébe

↑ ABCG5/ABCG8

- 15 -

BEVEZETÉS Egyes tanulmányok megkülönböztetnek cAMP illetve taurokolát hatására mobilizálódó raktárakat. A foszfatidil-inozitol 3 kinázt gátló Wortmannin hatására a taurokolát indukált epesav szekréció 50%-al csökkent. Tehát a taurokolát hatására kialakuló vezikuláris forgalom az intracelluláris raktár és a kanalikuláris membrán között a foszfatidil-inozitol 3 kináz szabályozása alatt áll. A protein kináz C szerepe szintén fontos az intracelluláris membrán forgalomban. A protein kináz C aktivitás fokozódás kiváltható urszodeoxikolsav-val vagy forbolészter adásával, ami a kanalikuláris membrán növekvő MRP2 denzitásához vezet. Az urszodeoxikolsav indukált membrán inzercióban a protein kináz C mellett szerepet játszik a p38 mitogén aktivált protein kináz is. Az ozmotikus környezet is hatással van a transzport proteinek aktivitására. Hipozmótikus körülmények között az intracelluláris vezikulákban lokalizálódó BSEP proteinek kikerülnek a kanalikuláris membránra, ezzel szemben a hiperozmótikus környezet hatására a BSEP és MRP2 proteinek lefűződnek a membránról, így a sejt transzport aktivitása csökken. A protein kináz C aktiváció az Oatp1 mediált transzportot csökkenti. Az extracelluláris ATP hatására történő szerin foszforiláció következtében az Oatp1 és Oatp2 funkcionális downregulációja észlelhető. A foszforilált Oatp elveszti aktivitását anélkül, hogy elhagyná a sejtfelszínt, a membránasszociált proteinek foszforilációs helyei lehetőséget adnak a sejtnek, hogy viszonylag gyorsan reagálni tudjon a patológiás körülményekre. Fontos felismerés volt, hogy a protein kináz C aktivátorok csökkentik az Oatp1 mediált digoxin transzportot is. A transzport proteinek aktivitása az egyedfejlődés során is változik. A patkány májban az Ntcp és az Oatp1 epesav transzporterek már az embrió fejlődése alatt jelen vannak. Az Ntcp mRNS a vemhesség 18-21 napjában detektálható patkányban, a születés után kezd emelkedni és a felnőtt szintet egy héttel a születés után éri el. Az Oatp1 először a vemhesség 16. napján detektálható és az elválasztás időpontjától kezd emelkedni patkányokban. Az apikális epesav transzporter, a BSEP mRNS-e egerekben a vemhesség 15. napján már jelen van, emberben szintén kialakul az embrionális fejlődés során, de a patkány embriókból hiányzik. A máj és a vese MDR1 génexpressziója a vemhesség 11. hetében jelenik meg.

2.3

A bilirubin metabolizmusa16

Virchov már 1847-ben hematómákból izolált bilirubin kristályokat, így feltételezte, hogy azok a vérből származnak. 1937-ben Fisher és Orth meghatározta a bilirubin tetrapirrol szerkezetét, majd 1950-ben London és munkatársai sikerrel demonstrálták a bilirubin képződését

- 16 -

BEVEZETÉS hemoglobinból. A szérum bilirubin koncentráció fontos indikátora a kóros májműködésnek. 1916-ban Hymans van der Bergh módszert dolgozott ki, melynek segítségével két meghatározott bilirubin frakciót tudott megkülönböztetni: direkt és indirekt reagáló bilirubin. A normál szérum bilirubin koncentráció 5-17 μM és ennek kb. 4%-a a konjugált bilirubin. A szervezetben naponta kb. 6 g bilirubin képződik. 2.3.1 A bilirubin képződése17 A bilirubin a hem tartalmú fehérjék degradációját követően képződik. A szervezetben a hem 85-90%-a található hemoglobinban, kb. 10% mioglobinban és 1% egyéb fehérjékben (citokróm P-450 enzimek, peroxidáz, kataláz, oxigenáz). A degradáció első lépéseként az A és B pirrol gyűrűk közötti α metilén csoportot az α-metil oxigenáz kihasítja, így koleglobin keletkezik. A globinhoz kötött hem oxidációja következtében a porfirin gyűrű felbomlik. Ezt követi a globin lehasítása, majd a vastartalmú biliverdin IXα keletkezése. A hem oxigenáz katalitikus ciklusa a citokróm P-450 kevert funkciójú oxidázéra hasonlít. A bilirubin a citoszolban keletkezik, a tizedik szénatomon lévő központi metilén híd redukciójával, a folyamatot a NADPH-biliverdin reduktáz katalizálja. A kiszabaduló Fe2+ ion Fe3+ ionná oxidálódik, majd transzferrinhez kötődve eljut az újrafelhasználás helyéhez. A vasat a felhasználásig a lép ferritinben tárolja. A makrofág sejtekből kilépő bilirubin albuminhoz kapcsolódva komplexet alkot és így kerül be a központi keringésbe. A bilirubin kémiailag két aszimmetrikusan szubsztituált dipirrinon csoportból épül fel, melyek a központi metilén csoport körül szabadon rotációval elfordulhatnak, így a propionil oldallánc karbonil csoportja, a dipirrinon laktám amino csoportja és a pirrol gyűrű N atomja intramolekuláris hidrogénkötéseket hoznak létre, mely a molekula nagyfokú hidrofóbicitását okozza. A bilirubin hidrofób tulajdonsága miatt különösen nagy affinitással kötődik a központi idegrendszer szöveteihez. A bilirubin neurotoxicitása miatt a szervezetből történő eliminálása létfontosságú. A bilirubin erőssen kötődik az albuminhoz, ez a kötődés megakadályozza, hogy a szabad bilirubin kifejtse neurotoxikus hatását. 2.3.2 A bilirubin felvétele18 Az elimináció első lépése a bilirubin és konjugátumainak szelektív felvétele a vérből a hepatocitákba. Sokáig úgy képzelték, hogy a bilirubin spontán diffúzióval kerül be a májsejtekbe, de a gátlási vizsgálatok rávilágítottak, hogy ebben a folyamatban gyors és szelektív karrier mediált uptake játszik szerepet. A bilirubin ugyanis ugyanazt a karrier rendszert használja, mint amit más organikus anionok pl.: BSP, indocianin zöld. A BSP és bilirubin gátolják egymás felvételét a májsejtekbe. A humán bilirubin felvételben az OATP-C,

- 17 -

BEVEZETÉS OATP-8, OATP-B vesz részt. Megfigyelték, hogy a HIV proteáz inhibitor indinavirral kezelt betegekben

konjugálatlan

hiperbilirubinémia

fejlődik

ki

hasonlóképpen,

mint

az

immunszuppresszáns ciklosporin A és az antituberkulotikum hatású rifamicin esetében. Kísérletesen is alátámasztották, hogy ezek a gyógyszerek terápiás dózisban szerepet játszanak az OATP-B mediált bilirubin uptake gátlásában. A májsejtek által felvett bilirubin a ligandinhoz (glutation S transzferáz dimer) kötődik. Humán májsejtekben a BG felvételében az OATP-C és OATP-8 játszik szerepet. Mindkét protein nagy affinitást mutat a BMG-hez (Km: 0,1 μM, 0,5 μM). Az OATP-C a BDG transzportjára is képes (Km 0,28 μM). 2.3.3 A bilirubin konjugációja, az UGT enzimcsalád19 Az UDP-glukuronozil transzferázok (UGT) a metabolizmus második fázisában vesznek részt. A glukuronsavval történő konjugáció mennyiségét tekintve a legjelentősebb fázis II reakció, melynek eredményeként általában nem toxikus, poláros termékek keletkeznek. Az UGT-k népes családja lehetővé teszi, hogy számtalan szerkezetileg különböző molekula biotranszformációja valósuljon meg ezen az úton. A glukuronidáció főként alkoholos, fenolos hidroxil valamint karboxil csoporton megy végbe. Az UGT enzimek legnagyobb mennyiségben a májban expresszálódnak, de nem jelentéktelen hányaduk fordul elő

az enterális rendszerben, bőrben, vesében, szaglóhámban, ez

utóbbiaknak a szaglási ingert kiváltó mediátorok eliminálásában van szerepük. A folyamat kofaktora az UDP-glukuronsav, amely UDP-glukózból keletkezik UDP-glukóz-dehidrogenáz hatására. Az UGT-k az endoplazmatikus retikulum membránjában lokalizálódnak. A kompartmentalizációs elmélet szerint az enzimek aktív centruma a lumen felé néz, ezért a glukuronsavnak és a szubsztrátoknak transzporterek segítségével be kell kerülni az ER lumenébe. Aminosav szekvencia homológia alapján az UGT enzimeket két családba sorolják. Egy családon belül a homológia nagyobb 45%-nál, az alcsaládon belül, pedig nagyobb 60%-nál. Az UGT1 családba tartozó enzimek nagy része az UGT1A alcsaládba tartozik. Az UGT2 családba tartozó enzimeket három alcsaládba sorolják. Az UGT1A enzimcsaládot kódoló gén szerkezetére jellemző, hogy a gén 3’ végén található négy darab közös exon. Itt kódolódik az enzim C terminálisán elhelyezkedő glukuronsav kötő régió. A gén 5’ vége felőli oldalon helyet foglaló minden exon egy-egy izoenzim első exonját kódolja, melyek az enzimek N terminális részét a szubsztrát kötő régiót kódolják. Az mRNS transzkripció során az első exonok közül replikálódik egy és kapcsolódik a négy darab közös

- 18 -

BEVEZETÉS exonhoz. A közös exonokhoz legközelebb elhelyezkedő első exon az UGT1A1, a második az UGT1A2 és így tovább, az utolsó az UGT1A13 izoenzim kódjához tartozik. A fenti génstruktúrából egyenesen következik, hogy a közös exonokat érintő mutációk valamennyi izoenzim aktivitásában tükröződhetnek, míg az első exonok valamint a szabályzó szekvenciák mutációja eltérő mértékben érintheti az egyes izoenzimek aktivitását. Klinikai manifesztációt eddig csak az UGT1A1 enzim esetében tapasztaltak. Az UGT1A1 enzim végzi a bilirubin glukuronsav konjugációját, a folyamat során poláros, vízben jobban oldódó BMG és BDG keletkezik.

2.3.4 A bilirubin konjugátumok effluxa16 Az ER lumenében keletkező BG az ER transzporterei segítségével ez idáig tisztázatlan mechanizmussal kerülnek a citoplazmába. Ezt követően fiziológiás körülmények között a BG a kanalikuláris membránon lokalizálódó MRP2 (humán rekombináns MRP2: KmBMG=0,7 μM KmBDG=0,9 μM) közreműködésével kerül az epecsatornákba. Normál körülmények között az MRP3 jelenléte a szinuszoidális membránon alacsony, így nem kerül BG a szinuszoidális membránon keresztül a véráramba. Ha az MRP2 funkcionálisan inaktív (kolesztázis), akkor szerepét a szinuszoidális membránon lokalizálódó megnövekedett mennyiségű MRP3 veszi át. Ez a kompenzációs mechanizmus megakadályozza a citotoxikus molekulák intracelluláris felhalmozódását. Így azok a metabolitok is a véráramba kerülnek, amelyek egyébként az epével ürülnének. A fokozódó renális kémiai terhelés hatására a vesében is lejátszódik a fenti folyamat, így a metabolitok eliminációjának sebessége fokozódik. 2.3.5

Örökletes bilirubin anyagcserezavarok és következményeik14,20

A biotranszformációban szerepet játszó fázis I-II enzimek és transzport proteinek működési zavara a metabolikus homeosztázis felborulásához vezet. A metabolizmus folyamatainak csökkenése vagy megszűnése a xenobiotikumok és a feleslegessé vált endogén anyagok (pl. bilirubin) felhalmozódásához vezethet. A legtöbb esetben - mivel ezen enzimek részben vagy teljes egészében átfedő szubsztrát specificitással rendelkeznek – klinikai manifesztáció nem történik.

Genetikai

okokra

visszavezethető

klinikailag

is

tapasztalható

bilirubin

anyagcserezavart az UGT1A1 és MRP2 proteinek esetében találtak. A Gillbert-kór a kaukázusi rasszba tartozó egyének 5-6%-át érintő megbetegedés. A kórkép kialakulásának hátterében genetikai mutáció áll, amely az UGT1A1 gén promoter régióját

- 19 -

BEVEZETÉS érinti. A betegség örökletes, krónikus, de gyakran tünetmentes. A mutáció következménye egy genetikai polimorfizmus, mely a TA bázisok ismétlődésében jelentkezik. A Crigler-Najjar szindrómának két típusa van. A CNSI szindrómát az UGT1A1 teljes hiánya jellemzi. Ennek következménye, hogy kritikus mértékben emelkedik a szérum bilirubin szint, ami kernicterus kialakulásához, majd halálhoz vezet. Ebben az esetben nem detektálható konjugátum az epében. A szérum bilirubin szint magas: 340-700 µM. A CNSII szindróma kialakulásáért az UGT1A1 csökkent működése felelős. A szérum bilirubin szint 50-500 µM között van. Az epében nagymértékben megnő a BMG aránya. A betegség molekuláris hátterében az áll, hogy az UGT1A1 mRNS transzkripció egy korai stop kodon miatt megáll, vagy egyéb mutáció miatt inaktív, illetve erősen csökkent aktivitású fehérje szintetizálódik. A Dubin-Johnson szindróma a kanalikuláris MRP2 hiánya következtében kialakuló konjugált hiperbilirubinémia. A Rotor szindrómára jellemző a krónikus, de ártalmatlan hiperbilirubinémia. A betegség autoszómális recesszív öröklődés menethez kötött. A bilirubin szérum szint 17 µM, egyéb májfunkciós paraméterek normálisak. A betegséget a hepatociták csökkent bilirubin raktározása okozza. 2.4 2.4.1

A kolesztázis A transzporterek kórélettani szerepe

A transzport folyamatokat érintő kórélettani változások létrejöhetnek genetikai defektus következtében vagy kialakulhatnak szerzett módon. Az örökletes májbetegségek egyik típusa a PFIC, mindhárom formája autoszómális recesszív öröklődést mutat. Három altípusa közül az egyik a Bayler-betegség (PFIC I), melyre sárgaság és súlyos pruritus jellemző az epesavak magas szérum koncentrációja miatt. A betegséget a FIC1 (ATP8B1) gén mutációja okozza. FIC1 gén által kódolt p típusú adenozin trifoszfatáz feltehetőleg szerepet játszik az epesavak és foszfolipidek transzportjában, bár ezt direkt úton még nem igazolták. Ennek ellenére az ATP8B1 diszfunkció következménye az epesav transzport zavara. Az ATP8B1 nem csak a májból, de a vékonybélből is hiányzik vagy mennyisége csökkent, aminek következménye a krónikus vizes hasmenés. A Bayler-szindróma (PFIC II) a BSEP (ABCB11) gén mutációja következtében jön létre. A betegségre jellemző az epesavak intracelluláris akkumulációja, melynek következtében hepatocelluláris károsodás alakul ki, ami nekrózist és/vagy apoptózist indukál.

- 20 -

BEVEZETÉS A PFIC III, MDR3 deficiencia következtében alakul ki. A PFIC I és II-vel szemben erre a kórképre jellemző a magas szérum γGT, a szövetekben a ductuláris proliferáció és a gyulladásos infiltráció. A kanalikuláris MDR3 defektus következtében az epéből hiányoznak a foszfolipidek. Mivel a foszfolipidek micellaképződéssel védik a biliáris epitélt az epesavak citotoxikus hatásától, így azok hiánya a biliáris epitél károsodásához vezet. BRIC a familiáris intrahepatikus kolesztázis benignus formája. Nem vezet progresszív májkárosodáshoz, de az epéből hiányzó epesavak gyakran intesztinális malabsorpcióhoz vezetnek az egyébként tünetmentes páciensekben. Dubin-Johnson-szindróma autoszómális receszív módon öröklődő betegség. Jellemző az emelkedett konjugált bilirubin szint, a magas vizelet koproporfirin I szint, illetve a megnövekedett brómszulfoftalein retenció. A PFIC-vel szemben megtartott májfunkció jellemző. A kórképet az apikális MRP2 deficiencia okozza. Az MRP2 delta mutáció az endoplazmatikus retikulum és a Golgi komplex közötti protein forgalom zavarát okozza, melynek következtében fokozódik az MRP2 endoplazmatikus retenciója, amit proteoszómális degradáció követ, ennek következtében az MRP2 teljesen hiányzik az apikális membránból. A hiányzó kanalikuláris MRP2 funkciót fokozott szinuszoidális MRP3 expresszió kompenzálja. Így a BG nem az epébe, hanem a vérkeringésbe kerül, majd renális úton ürül. Az emelkedett szérum BG szint következtében a tubulusok MRP3 expressziója is fokozódik, mely folyamat a konjugátumok ürülését gyorsítja. A transzport rendszer szerzett defektusai között említhető a gyógyszer, illetve szepszis indukált kolesztázis, valamint a terhesség alatt jelentkező intrahepatikus kolesztázis. A szerzett intrahepatikus kolesztázis típusait a következő fejezetben tárgyalom.

- 21 -

BEVEZETÉS 4. táblázat Áttekintés a transzport proteinek fiziológiás lokalizációjáról és a kórfolyamatokban bekövetkezett változásairól14. A változások alapesetben a proteinszintekre (p) vonatkozik. Faj

Transzport protein

Fiziológiai funkció

Kórkép, állapot

Változás

hepatocelluláris Na függő epesav felvétel

kolesztázis, állatmodell

↓

Terhesség

↓ p,mRNS

Kolesztázis

↓ p,mRNS

Hepatocelluláris karcinóma

↓

Bazolaterális transzport proteinek patkány

humán

patkány

Ntcp

NTCP

Oatp1

amfipatikus molekulák multispecifikus felvétele

BDL és estradiol indukált kolesztázis

↓

Oatp2

szívglikozidok

CCl4 okozta májkárosodás

↓ mRNS

estradiol indukált kolesztázis

↓ p,mRNS

BDL és szepszis

↓

gyulladásos kolesztázis

↓ mRNS

Hepatocelluláris karcinóma

↓

Oatp4

humán

hepatocelluláris Na függő epesav felvétel

OATP-C

OATP8 patkány/humán

MRP1

patkány/humán

MRP3

amfifil molekulák multispecifikus felvétele Epesavak és organikus anionok hepatocelluláris felvétele

xenobiotikumok, peptidek, organikus anionok hepatocelluláris felvétele citotoxikus kationok és nem epesavas anionok effluxa hepatoma sejtek, szepszis citosztatikumok konjugált anionok Eisai hiperbilirubinaemiás patkányok, BDL effluxa

↓ ↑ ↑

Dubin-Johnson syndroma

↑

primer biliáris cirrózis

↑

Apikális transzport proteinek egér/patkány

BSEP

epesavak effluxa

Génmutáció

humán

BSEP

epesavak effluxa

PFIC2

↓p ↓biliáris exkréció

intrahepatikus kolesztázis gyulladásos kolesztázis

↓ mRNS

ciszinhibició (CS A) transzinhibició (E17-βG) C57L/J epekőképződésre hajlamos egér ennek ellenére alacsony epesav szekréciós kapacitás

↑

egér

Mdr2

foszfolipid exkréció

portális gyulladás, epevezető proliferáció, fibrózis

humán

MDR3

PFIC3

Mutáció

patkány/humán

MRP2

foszfolipid exkréció organikus anion exkréció

epevezető lekötés, endotoxaemia

↓

humán

FIC1

aminofoszfolipid transzlokátor

- 22 -

kolesztázis

↓

direkt hiperbilirubinaemia, patkány

Mutáció

Dubin-Johnson syndroma

Mutáció

PBC, gyulladásos kolesztázis

↓

PSC

↓

Bayler betegség, BRIC

Mutáció

BEVEZETÉS

2.4.2

A szerzett kolesztázis

A kolesztázis vagy epepangás állapota a kóros epeszekréció következtében alakul ki, melynek extra vagy intrahepatikus okai lehetnek. Az extrahepatikus okok között említhető az obstrukciós kolesztázis, mely az epevezető elzáródása (epekő, tumor) következtében alakul ki. Az elzáródás következtében kialakuló intrakanalikuláris nyomásfokozódás a hepatociták membrán felszínén molekuláris szintű változásokat indukál. Megváltozik mind a bazolaterális, mind a szinuszoidális membrán proteinek mennyisége és eloszlása. A változásoknak köszönhetően a kanalikuláris efflux csökken, míg a szinuszoidális fokozódik. Az intrahepatikus kolesztázis lehet szepszis vagy gyógyszer indukált. A szepszis indukált kolesztázis mechanizmusára jellemző, hogy a baktériumokból felszabaduló endotoxinok a Kupffer sejtekből tumor nekrózis faktor α-t, interleukin 1 -és 6-ot szabadítanak fel. A felszabaduló citokinek hatására a kanalikuláris membránról a transzport proteineket (BSEP, MRP2) is tartalmazó membrán vezikulák fűződnek le, a folyamat hatására az epekomponensek nem tudnak az epébe szekretálódni. 2.4.3

A gyógyszer-indukált kolesztázis21

A gyógyszer indukált kolesztázisok spektruma az akut, enyhe kolesztázistól a krónikus „Vanishing Bile Duct Syndrome”-ig (VBDS) terjed. A gyógyszer okozta májkárosodások közel 17 %-a akut kolesztázis. 5. Táblázat A kolesztázis típusainak rövid áttekintése21 Típus Akut forma I. Kolesztázis hepatitis nélkül („bland” kolesztázis)

Ösztrogén, anabolikus szteroidok, Ciklosporin A Tamoxifen

II. Kolesztázisos hepatitis (hepatocanalicularis, exudative)

Klórpromazin, makrolid antibiotikumok, triciklusos antidepresszánsok, augmentin, NSAID Azatioprin

III. Kolangolítikus kolesztázis

Flucloxacillin, paraquat

(epevezető károsodás) Krónikus forma IV. Vanishing bile duct syndrome

Klórpromazin, oxopenicillin, cimetidin, barbiturát, haloperidol, karbamazepin

V. Primer szklerotizáló kolangitisz

Floxuridin

Ibuprofen, esztradiol

- 23 -

BEVEZETÉS Az I. típusra jellemző, hogy a kezdeti tünetek a gyógyszer terápia megkezdése után 2-3 hónappal jelentkeznek: hasmenés, anorexia, rossz közérzet, majd ezt követően súlyos viszketés alakul ki. A viszketést a szervezetben pangó epesavak idézik elő. Az első látható tünetek az icterus és horzsolások megjelenése a bőrön. Igen súlyos esetekben a bilirubin szint 200 µmol/l is lehet. Az ösztrogén indukált kolesztázis tipikus példa hepatitis mentes gyógyszer indukált kolesztázisra. A tünetek rendszerint 2-3 hónappal a kolesztázist okozó gyógyszerterápia indítása után kezdődnek. A terápia befejezése után, gyorsan és reverzibilisen megszűnnek. A hormonpótló kezelésként alkalmazott estradiol esetében nem alakul ki gyógyszer indukált kolesztázis sőt, még a kolesztatikus májbetegségben szenvedő nők esetében is biztonságosan alkalmazható. A II. típusra jellemző, hogy a kezdeti tünetek megjelenése a gyógyszerelés megkezdése után 1-6 hét között változik. Jellemző tünetei: fájdalom a jobb felső kvadránsban, hányás, anorexia. A szérum alkalikus foszfatáz szint kb. háromszorosa a normál szintnek. Pruritus a betegek 70%-ánál jelentkezik, de nem olyan súlyos mértékben, mint az előző típusnál. A gyógyszerelés befejezése után 3 hónapon belül megszűnnek a tünetek. Jellemző erre a típusra a klórpromazin indukált májkárosodás (a betegek 0,2-2%-a). A betegek 7%-ánál a VBDS alakulhat ki. Az amoxicillin-klavulánsav kombináció (Augmentin) szintén számos esetben okozott májkárosodást, elsősorban az augmentin klavulánsav tartalma miatt. A III. típusra jellemző a portális-lobuláris területek gyulladásos infiltrációja, valamint az interlobuláris epevezetők léziója. A klinikai tünetekre jellemző a magas láz, hepatomegália, sárgaság. Ezt a fajta toxikus májkárosodást elsősorban flukloxacillin, klorpromazin, karbamazepin idézheti elő. A IV. típusra az intrahepatikus epevezető rendszer kiterjedt és progresszív károsodása jellemző. A kezdeti tünetek májgyulladásra utalnak, majd ezt abnormális májfunkciós paraméterek és sárgaság követi. Perzisztáló anicterikus kolesztázis gyakran több mint egy éven át is jelen lehet. Májbiopszia során az intralobuláris epevezetők mennyiségének csökkenése figyelhető meg. A szindróma patogenezise ismeretlen, de az eozinofil infiltráció valószínűsíti az immunmediált epevezeték károsodást, valamint szerepet játszhat benne a pangó epesavak toxikus hatása is. Az V. típus (Primer szklerotizáló kolangitis) alakul ki pl. a metasztázisos kolorektális karcinoma kezelésekor alkalmazott intraarteriális fluxuridine infúzió alkalmazása után. - 24 -

BEVEZETÉS Az epeszekréció gátlásának molekuláris hátterében szerepet játszhat: 1) A transzport protein direkt gátlása (benzbromaron, probenecid, indometacin, glibenclamid, rifampicin). 2) A mikortubulusok depolimerizációját okozó kolhicin, mely gátolja a transzport proteinek kihelyeződését a sejtmembránra; a ciklosporin A pedig a perikanalikuláris F-actin károsításával gátolja a transzport protein-plazmamembrán transzportot. 3) A transzport proteinek poszttranszkripciós szintézisének gátlása, pl. etenil-estradiol. Kolesztatikus mellékhatásokat jelentettek a következő kiterjedten alkalmazott gyógyszerekről: sztatinok, tillopidin, ACE gátlók, ATII antagonisták, fluoroquinolon származékok, loracerbef, NSAID, terbinafin, tiopronin, glicirhizin. 2.5

Gyakran alkalmazott in vitro módszerek a transzport aktivitás meghatározására

A gyógyszerjelölt molekulák transzporterekre gyakorolt hatásának in vitro preklinikai vizsgálata során leggyakrabban akkumuláció/efflux, transzport/permeábilitás és ATP-áz esszéket alkalmaznak. Az akkumuláció/efflux teszteket máj sejtszuszpenzióban, monolayeren vagy membrán vezikulákon végzik fluoreszcens (rhodamin 123) vagy radioaktiv ligand alkalmazása mellett22,23. A módszer jól használható a potenciális gyógyszer-interakciók, abszorpció és elimináció mértékének becsléséhez. Előnye, hogy könnyű és gyors technika, jól alkalmazható nagy áteresztő képességű (HTP) vizsgálatoknál. Hátránya, hogy nem lehet meghatározni az akkumuláció/effluxban érintett transzport proteinek lokalizációját, és alulbecsli a transzport aktivitást a kis permeabilitású szubsztrátok esetében. A transzport/permeabilitás esszék célja az akkumuláció/efflux esszékhez hasonlóan a potenciális transzport szubsztrátok meghatározása főként transzport fehérjéket expresszáló Caco-2 sejtek alkalmazása mellett. A módszer jól használható a transzporterek celluláris lokalizációjának meghatározására. Definitív módszer az efflux transzporterek drog permeábilitásra gyakorolt hatásának vizsgálatára. Hátránya, hogy konfluens monolayer-t követel meg, alulbecsli a transzport aktivitást a nagy permeabilitású szubsztrátok esetében24,25. Az ATP-áz esszék az ATP hidrolízis során keletkező inorganikus foszfát detektálásán alapulnak. Ezeket kiterjedten alkalmazzák a P-gp aktivitás meghatározására. Az ATP-áz aktivitás

meghatározása

történhet

membrán

vezikulákban

vagy

monolayeren.

A

gyógyszer/transzporter interakciók felderítéséhez a módszer könnyen adaptálható nagy - 25 -

BEVEZETÉS áteresztő képességű vizsgálatokhoz. Hátránya, hogy nagy a mérések közötti variabilitás, és kis permabilitású szubsztrátok vizsgálata esetén alulbecsüli a transzport aktivitást26,27. A fenti technikák kivitelezése során általában genetikailag módosított sejtvonalakat alkalmaznak.

Ezek

az

immortalizált

sejtek

egy

vagy

több

transzport

fehérjét

overexpresszálnak. Szemben a primer sejtekkel ezek mind funkcionális, mind morfológiai szempontból távol állnak a fiziológiás állapottól.

- 26 -

CÉLKITŰZÉS

3

CÉLKITŰZÉSEK

Doktori munkám alapját a bilirubin metabolizmusában kulcsszerepet játszó UDPglukuronozil transzferáz (UGT1A1) és bilirubin-glukuronid efflux transzporterek (MRP2, MRP3) vizsgálata képezte. Munkám egyik célkitűzése az volt, hogy megvizsgáljam primer hepatocita kultúrában a bilirubin metabolizmusát érintő indukciós típusú gyógyszer interakciókat, különböző indukciós hatásmechanizmussal működő molekulák esetében (dexametazon, klofibrát, metilkolantrén, rifampicin). Vizsgálni kívántuk a fenti induktorok hatását az UGT1A1, a kanalikuláris MRP2 és a szinuszoidális MRP3 aktivitására primer hepatocita rigid és kollagén szendvics kultúrában. Munkám további célkitűzése volt a gyógyszerindukált kolesztázis in vitro modellezése. Ennek megvalósítása érdekében vizsgáltuk a már ismert kolesztázist okozó és transzport gátló vegyületek hatását a bilirubin-glukuronid szinuszoidális és kanalikuláris effluxára primer hepatocita szendvics kultúrában.

- 27 -

KÍSÉRLETI MÓDSZEREK

4

KÍSÉRLETI MÓDSZEREK

4.1

Vegyszerek

Sigma Chemie GmbH (Deisenhofen, Németország): DEX, MC, albumin, Williams` medium E, nutrient mixture F-12 (Ham), inzulin, bilirubin, PB, CL, rifampicin. Amersham Pharmacia Biotech (Buckinghamshire, Anglia): ECL Western blot detektáló reagens, Hyperfilm TMECLTM . Reanal Magyarország kft.: PNP. A dolgozatban szereplő, de ebben a fejezetben külön fel nem sorolt vegyszereket a Merck Kft. közreműködésével szereztük be. 4.2

Májsejt preparálás

Állatkísérletek: A kísérleteket 150-250 g súlyú Wistar hím patkányokon (Toxicoop Safty Toxicological Study Center, Budapest) végeztük, az állatokat standard körülmények között tartottuk (20 0C, 12 órás nappal/éjszaka ciklus). Az állatkísérleteket a hatályos állatvédelmi törvény (2002. évi LXVII. törvénnyel módosított 1998. évi XXVIII. törvény 31.§; 103/2002 (V.10.) számú kormányrendelettel módosított 243/1998 (XII.31.) kormányrendelet 7.§) betartása mellett, a Munkahelyi Állatvédelmi Bizottság engedélyével végeztük. 4.2.1

Altatás

A műtétet megelőzően az állatot dietil-éterrel elaltattuk és rögzítettük a műtőasztalhoz. Mivel a cél életképes májsejtek izolálása volt, ezért az altatás során nem használhattunk hatékonyabb, ám májkárosító altatószereket, mint pl. halotán, kloroform, továbbá nem használhattunk indukciós hatású szereket sem (barbiturátok). Az altatás során az állat légterébe juttattuk az éter gőzöket. 4.2.2

A műtéti metodika

A has és a mellkas tájékról a bőrszövetet téglalap formájában eltávolítottuk. Az os pubis-tól kb. 2 cm-re bemetszettük a peritoneumot és a línea alba mentén a thoraxig felvágtuk vigyázva, hogy ne vágjunk bele a diaphragmába és a peritoneumra felfekvő májlebenybe. Középtájon a diaphragmától kb. 1 cm-re mindkét oldal irányában elvágtuk a peritoneumot és

- 28 -

KÍSÉRLETI MÓDSZEREK pean segítségével rögzítettük. Két érbe, a véna cava superior-ba és a véna portae hepatis-ba a következő módon vezettünk kanült: a peritoneum megnyitása után a v. portae-t és a v. cava inferior-t kipreparáltuk és ligatúrát helyeztünk a vénák köré. Először a v. cava inf.-ra helyeztünk lazán egy ligatúrát a veseleágazás felett. A második ligatúra a v. portae-ra került a májba történő beszájadzás és a portális érről leágazó pankreatikus-duodenális ér közé. A laza ligatúrák felhelyezése után a ligatúra alatt kb. 45 fokos szögben bevágtuk a v. portea-t és behelyeztük a kanült, amelyhez előzőleg csatlakoztattuk a perisztaltikus pumpa nyomó ágát. A kanült ligatúra segítségével rögzítettük az érben. A nyomó ág bekötésével a keringési rendszerben a folyadékmennyiség növekedése nyomásfokozódást okozott, ezért átvágtuk a v. cava inf.-t a ráhelyezett ligatúra alatt, hogy a nyomás csökkenjen. A rekeszizom bevágásával légmell alakul ki, ennek következtében az állat elpusztul. A mellkas feltárásával hozzáférünk a szívhez és a v. cava superiorhoz. Ligatúrát helyeztünk fel a jobb pitvartól kb. egy cm-re a v. cava superior-ra. A szívet csipesz segítségével óvatosan kiemeltük, majd ollóval bemetszettük a jobb pitvar felől, és a kanült felcsúsztattuk a ligatúráig, majd rögzítettük. Ezután a v. cava inf.-on lévő ligatúrával az eret elkötöttük, ezzel zárt rendszert hoztunk létre, megakadályozva a perfúziós folyadék további elszivárgását. 4.2.3

Humán májsejt preparálás

Vizsgálatainkat a Regionális Tudományos és Kutatásetikai Bizottság, valamint a Helyi Etikai Bizottság engedélyével (Semmelweis Egyetem) végeztük. A humán, donációra nem alkalmas máj eltávolítása a Semmelweis Egyetem Sebészeti és Transzplantációs Klinikáján történt. A májszegmensen a vizsgálatokhoz szükséges májsejt mennyiségnek megfelelően választottuk ki azt az eret, amelybe a kanült vezettük, majd a továbbiakban részletesen ismertetett perfúziós módszert alkalmaztuk. Mivel a humán máj jóval nagyobb, mint a patkányé, ennek megfelelően a perfúzió során alkalmazott perfúziós folyadékok térfogata, valamint a kollagenáz mennyisége is nagyobb, a perfúzió ideje pedig hosszabb volt, mint a patkány esetében. A patkány májsejt preparálásától eltérő mennyiségi, térfogati és idő értékeket a módszer ismertetésekor a humán máj esetére vonatkoztatva zárójelben tüntettük fel.

- 29 -

KÍSÉRLETI MÓDSZEREK

4.2.4

A májperfúziós rendszer

A májperfúzió során két oldatot használtunk, amelyeket termosztátban 41

0

C-ra

melegítettünk. Az oldatok a vékony csövekben áramlova éppen 37 0C-ra hűltek le, mire eljutottak a májhoz. A perfúziós oldatokba karbogén gázt (95% O2, 5% CO2) vezettünk, így beállítva az optimális oxigén koncentrációt és pH-t. A perisztaltikus pumpa szívó ága az első oldatba merült, nyomó ága pedig egy buborékfogóban végződött, ahonnan műanyag csövön keresztül jutott a folyadék a kanülbe. Az oldatot a perfúzió megkezdéséig az első tárolóedénybe recirkuláltattuk. A perfúzió megkezdése előtt, a fenti elrendezésben 20 percen keresztül működtettük a rendszert, hogy a kívánt paraméterek beálljanak. A perfúziós folyadék áramlási sebessége a második kanül bekötéséig 10 ml/perc volt, a v. cava. inf. elkötése után ezt 40 ml/percre növeltük. A perfúzió célja a hepatociták közötti sejtkapcsoló struktúrák megszüntetése, hogy végül májsejt szuszpenzióhoz jussunk. Az első fázis a máj kelátképzővel történő átmosása volt. Az EBSS oldatból, amely 0,5 mM EGTA-t tartalmazott, 300 ml-t (1500 ml) folyattunk át a májon. Az EGTA komplexbe viszi a kalcium ionokat, így a kalcium-függő sejtkapcsoló struktúrák megszűnnek. A második fázis a kelátképző kimosása volt. 350 ml EBSS oldatból (1500 ml) kb. 220 ml (1100 ml) mosta át a májat. A harmadik fázisban a maradék 130 ml-t (400 ml) visszaforgattuk a tárolóedénybe. A recirkuláló rendszerhez 1,3 ml (4 ml) 0,25 M-os CaCl2-oldatot és 25 mg (75 mg) EBSS oldatban oldott kollagenáz enzimet adtunk. 5 percig (kb. 30 perc) tartottuk fenn az áramlást, ezalatt a kollagenáz feloldotta a sejtek közötti mátrixot, így a sejtek elváltak egymástól. A májat kívülről borító tok kevéssé emésztődik, így a képlékeny máj viszonylag könnyen kiemelhető28.

4.2.5

Májsejtek kinyerése, tisztítása

A májat borító tokot szuszpendáló oldatban (0,238% HEPES; 0,83% NaCl; 0,053% KCl) szétszakítottuk, majd a sejtszuszpenziót négyrétegű steril gézen szűrtük, végül 900 rpm fordulatszám mellett egy percig centrifugáltuk. Az eljárást még kétszer ismételtük, az utolsó centrifugálás előtt kiegészített William’s E tápoldatban (2,5 μg/ml amfotericin B, 0.1 mg/ml gentamicin, 30 nM Na2SeO3, 1,2 mg/ml glükóz, 0,4 M piruvát) szuszpendáltuk a sejteket. Ezt követően tripán-kék kizárásos módszerrel határoztuk meg a sejtek életképességét. A módszer - 30 -

KÍSÉRLETI MÓDSZEREK elve az, hogy a sérült sejtek membránja áteresztővé válik és a festékanyag bejut a citoplazmába és azt kékre színezi. Végül a sejtszámot Bürker kamra segítségével határoztuk meg29. 4.3 4.3.1

Mikroszóma preparálás Mikroszóma preparálás májból

A májat NaCl oldattal (0,9%) mostuk, majd ollóval összevágtuk. Ezután jégfürdőben 4-szeres térfogatú Tris-HCl homogenizáló pufferben (7,4 pH, 0,1 M Tris, 0,15 M KCl) homogenizáltuk Potter-Elvehjem homogenizátorral. A homogenizátumot 30 percig, 4 0C-on centrifugáltuk (10000 g). A mikroszóma frakciót a felülúszóból preparáltuk (100000 g, 1 óra, 4 0C) ultracentrifugával (Janetzky WAC 602). A kiülepedett mikroszómát a homogenizáló pufferben szuszpendáltuk, majd újra centrifugáltuk (100000 g, 1 óra, 4

o

C), ezután

felhasználásig kb. 10 mg/ml koncentrációban −80 0C-on tároltuk (Kelvinator Series 500 Manitowoc, WIC., U.S.A.)30. A fehérje koncentrációt Lowry és munkatársai módszere alapján mértük31, standardként borjú szérum albumint alkalmaztunk. 4.3.2

Mikroszóma preparálás sejtekből

Nem csak májból, hanem sejtkultúrából is történt mikroszóma preparálás. A petricsészében kollagénmátrixhoz tapadt sejteket speciális kaparó segítségével lekapartuk és PBS oldattal szuszpendáltuk. A sejteket jéghűtés mellett ultrahang segítségével tártuk fel, majd a fent már leírt

módon

mikroszómát

preparáltunk

a

homogenizátumból.

A

mikroszómák

fehérjetartalmának meghatározását Lowry módszere szerint végeztük31. 4.4

UGT1A1 aktivitás meghatározása mikroszómában

A mikroszómális UDP-glukuronozil transzferáz aktivitást B. Burchell módszere szerint határoztuk meg32. A reakció során bilirubint használtuk szubsztrátként. A reakciót 400 µ1 végtérfogatban (0,4 mg mikroszóma fehérje, 0,4 mM bilirubin, 4 mM UDP-glukuronsav) 37 0

C-on 5 perc előinkubálás után a glukuronsav hozzáadásával indítottuk. A 10 perc reakcióidő

letelte után 1 ml jég-hideg sósav-glicin pufferrel (0,8 M glicin, pH=2,7) állítottuk le a reakciót. A reakció elegyhez 500 µl diazoreagenst (15 ml 0,15 M HCl, 150 µl etil-2 aminobenzoát, 450 µl 0,07 M NaNO2, 150 µl 88 mM ammónium-amidoszulfonát) adtunk szobahőmérsékleten. A diazoreakciót 250 µl 10%-os aszkorbinsav-oldattal állítottuk le. A diazotált terméket 3 m1 metil-propil-keton:butil-acetát, 17:3 arányú elegyével extraháltuk,

- 31 -

KÍSÉRLETI MÓDSZEREK majd 4000 rpm fordulatszám mellett centrifugáltuk 10 percig. A szerves fázis abszorbanciáját spektrofotométerrel mértük 530 nm-nél. Az extinkciós együttható értéke diazotált BG származékra:

1cm

E530 = 44,4×103 M-1. A specifikus enzimaktivitás értékét nmol/mg

protein/perc-ben adtuk meg. 4.5

A BG meghatározása primer hepatocita rigid kultúrában

A sejtkultúrában végzett inkubációkat 37 0C-on, 100%-os páratartalom mellett, 5%:95% CO2: levegő atmoszférában végeztük. A 30 mm-es, I. típusú patkányfarok-kollagénnel (0,15 ml; 1,6 mg/ml) bevont petricsészékre helyeztük a patkány májsejt szuszpenziót úgy, hogy a sejtsűrűség 1,3×106 sejt/petricsésze legyen. A kiegészített William’s medium E tápoldatot (10 % FCS, 100 nM inzulin, 2.5 μg/ml amfotericin B, 0,1 mg/ml gentamicin, 0,4 M piruvát, 30 nM Na2SeO3) a lerakástól számított 4 óra múlva és 24 óránként frissen adtuk a sejtekhez. A 10% FCS és az amfotericin B csak az első 24 órában volt jelen. Munkánk során az UGT1A1 aktivitást határoztuk meg spektrális diazoreakciós detektálással B. Burchell (4.4. fejezet) módszere szerint, kis módosítással, primer hepatocita monolayeren végzett inkubáció után. Mivel a bilirubin apoláros molekula, emiatt vízoldékonysága alacsony. A kísérletek során 60 mM-os bilirubin törzsoldatot (oldószer: DMSO/1M NaOH, 88/12) használtunk. A további hígítás során a pH csökkenés miatt a bilirubin kicsapódna az oldatból, továbbá a májsejtek csak a bilirubin-albumin komplexet képesek felvenni, ezért a szükséges 20x-os hígítást 20 mg/ml koncentrációjú albumin oldattal végeztük. Az albumin-bilirubin oldatot további 120xra hígítottuk az alkalmazott médiummal (kiegészített William’s Medium E tápoldat) mielőtt a sejtekhez adtuk. A sejteket 1 ml 0,025 mM-os bilirubin-albumin oldattal inkubáltuk 60 percig. Az inkubálási idő leteltével 400 µl mintát vettünk. Ebben a mintában határoztuk meg a konjugált bilirubin koncentrációját, melyből kiszámoltuk a specifikus enzimaktivitásokat. 4.6

Indukciós vizsgálatok primer hepatocita rigid kultúrában

A hepatociták induktorokkal történő kezelését a lerakástól számított negyedik órában kezdtük és minden nap frissen a tápoldattal együtt adtuk a sejtekhez. Az indukciót 96 órán keresztül folytattuk, és hatását 24 óránként mértük. A kontroll sejtkultúra csak kiegészített William’s Medium E tápoldatot kapott, amely 0,1% DMSO-t tartalmazott. Az induktorokból 1000x

- 32 -

KÍSÉRLETI MÓDSZEREK tömény törzsoldatot készítünk DMSO-val, majd a tápoldathoz adtuk. A végkoncentrációk: 3,7 µM MC, 100 µM CL; 50 µM RIF; 0,1; 1; 10 µM DEX; 100 µM CL és 10 µM DEX kombináció. Az indukciós periódus végén meghatároztuk a BG képződés sebességét a 4.4. fejezetben leírt módon. 4.7

Western immunoblot analízis

Sejtszuszpenzióból, 96 órás MC, DEX, CL, RIF, és DEX+CL indukált, valamint a kontroll sejtkultúrákból mikroszómát preparáltunk (4.3.2 fejezet szerint), majd Western immunoblot analízissel meghatároztuk az UGT1A1 mennyiségét33. A mikroszómákat Laemmli-oldattal (1,45% TRIS-HCl (pH 6.8), 4% SDS, 10% merkaptoetanol, 23% glicerin, 0,002% mg brómfenolkék) 0,5 μg/μl koncentrációra hígítottuk, majd 7.5 %-os akrilamid gélre helyeztünk (15 μl/zseb). Futtatás után a (koncentráló gélben 40 mA, szeparáló gélben 100 mA, készülék: LKB) a gélen szeparált fehérjéket blottoló cella alkalmazásával (X Cell II, Novel Experimental Technology) nitrocellulóz membránra vittük át (270 mA). A nitrocellulóz membránt 24 óráig 3%-os BSA (0,1% Tween20) oldattal inkubáltuk, majd pufferrel mostuk (kétszer PBS-Tween oldattal, majd egyszer PBS-el)34. A poliklonális elsődleges ellenanyagot (patkány UGT1A antitest, 1:3000 arányú hígítás, 46,5 mg/ml protein) B. Burchell laboratóriuma az UGT1A alcsaládra fejlesztette ki. Az ellenanyagot ajándékként Burchell Professzor Úrtól kaptuk. Az elsődleges ellenanyaggal egy órán át inkubáltuk a membránt. Az inkubáció után az elsődleges ellenanyagot lemostuk a membránról, majd szintén egy óráig inkubáltuk a másodlagos ellenanyaggal (tormaperoxidázzal konjugált juh anti IgG (Calbiochem, San Diego, CA; 1:30000 hígítás)). A másodlagos antitest feleslegét mosással eltávolítottuk (PBS-Tween oldat, PBS oldat). A torma peroxidáz enzim szubsztrátjának hozzáadása után a fotonemissziót hyperfilm segítségével (ECL Hyperfilm, Amersham International, Arlington Heights, IL) detektáltuk35. A filmnegatívot denzitometriás módszerrel értékeltük (UN-SCAN-IT Digitizing Software (Silk Scientific, Orem, USA)).

4.8

A BG és PNP-G mennyiségi meghatározása HPLC analízissel

A BG és a PNP-G mennyiségét is HPLC (Merck-Hitachi HPLC system, L-6200 A pumpa, L4250 UV detektor, D-6000 A interfész, 100×4,6 mm Chromolith Performance RP18 oszlop,

- 33 -

KÍSÉRLETI MÓDSZEREK Merck, Németország) analízissel detektáltuk. A minta-előkészítés során a mintákat filteren (pórusátmérő: 0,45 µm) szűrtük. A BG elválasztáshoz gradiens elúciót alkalmaztunk: Injektálási térfogat: 100 µl „A” eluens: 75% 0,01 M nátrium-foszfát puffer pH=3,2; 25% acetonitril; 150 µl/l trietil-amin „B” eluens: acetonitril Áramlási sebesség a szeparálás alatt: 2,5 ml/perc Detektálási hullámhossz: 450 nm Pumpa program: „A”

„B”

Áramlási sebesség

0-1 perc

100%

0%

2,5 ml/perc

1-6 perc

90%

10%

2,5 ml/perc

6-8 perc

0%

100%

3 ml/perc

8-12 perc

100%

0%

3 ml/perc

A 6 perces szeparációs idő alatt a BG csúcsok szétválnak és meghatározható a BMG és BDG mennyisége. A Merck újfejlesztésű szilikagél oszlopa lehetőséget nyújt arra, hogy a szeparációs fázis után nagy koncentrációjú szerves fázissal a lipofil molekulákat rövid idő alatt eltávolítsuk az oszlopról, majd ezt követően visszaállítva az eredeti eluens koncentrációt gyorsan ekvilibrálható az oszlop a következő minta injektálásához. A PNP-G mennyiségét izokratikus elúcióval detektáltuk: Injektálási térfogat: 100 µl Eluens: 93% 0,01 mM nátrium-foszfát puffer pH=3,2; 7% acetonitril Áramlási sebesség: 2 ml/perc Detektálási hullámhossz: 305 nm A BG és PNPG mennyiségét kalibrációs görbe segítségével határoztuk meg. A PNP-G standard a rendelkezésünkre állt, míg a BG mennyiségi meghatározása során a bilirubint használtunk standardként, mert a B és a BG elnyelési maximuma és extinkciós koefficiense majdnem azonos.

4.9

A BMG és BDG tömegspektrometriás azonosítása

A tömegspektrometriás analízishez a BG-ot mikroszómális reakcióval állítottuk elő. A 4.4. fejezetben leírtakhoz képest a reakciót azonos térfogatú jég-hideg metanollal állítottuk le. A mintákat HPLC készülékbe injektáltuk és a glukuronid csúcsokat frakcionálva kigyűjtöttük. A - 34 -

KÍSÉRLETI MÓDSZEREK mintákat szilárd fázisú extrakcióval dúsítottuk, ezt követően a mintákból felvettük a tömegspektrumot turboionspray módban (Applied Biosystem/MDS Sciex API-2000 tandem mass spectrometer, Perkin Elmer Series 200 HPLC pumpa,). A mintákat acetonitril:víz 1:1 arányú elegyével injektáltuk. Tömegspektrometriás mérési paraméterek: Áramlási sebesség: 0,2 ml/perc Q1 szken tömeg spektrum: 500-1000; idő: 1 sec MRM szken átmenet: 937-475; 761-475; idő: 150 msec Ütközési energia: 30 eV

4.10 Primer hepatocita szendvics kultúra A 30 mm-es I. típusú patkányfarok-kollagénnel (0,15 ml; 1,6 mg/ml) bevont petricsészékre helyeztük a patkány májsejt szuszpenziót úgy, hogy a sejtsűrűség 1,3 × 106 sejt/petricsésze legyen. A májsejteket kiegészített William’s Medium E (5% FCS; 100 nM inzulin; 2,5 µg/ml amfotericin B; 0,1 mg/ml gentamicin; 30 nM Na2SeO3, 0,1 µM DEX) oldatban szuszpendáltuk. A sejtek 4 órával a letapadás után és minden nap friss tápoldatot kaptak. Az FCS és az amfotericin B csak az első 24 órában volt jelen a tápoldatban. A letapadástól számított 24 óra múlva a tápoldatot eltávolítottuk, majd 200 µl, NaOH-oldattal neutralizált kollagén-oldatot (pH=7,4; 1,5 mg/ml) helyeztünk a sejtekre. 45 perc alatt a kollagén oldatból gél képződött, így létrejött az úgynevezett szendvics kultúra, ezt követően 1,5 ml meleg tápoldatot tettünk a sejtekre36.

4.11 A BG és PNP-G szinuszoidális és kanalikuláris effluxának meghatározása primer hepatocita szendvics kultúrában A 24, 72 és 96 órás kollagén szendvics konfigurációban tartott patkány és 96 órás humán májsejteket 0,025 mM-os bilirubin-albuminoldattal inkubáltuk 60 percig (37 0C, 5% CO2 : 95% levegő). Az inkubációs idő letelte után a szubsztrát tartalmú médiumot eltávolítottuk és a sejteket 3x1 ml standard HBSS-oldattal mostuk. A szubsztrát eltávolítása után Ca2+/Mg2+ ionok jelenlétében és hiányában a sejteket 20 percig 0,5 ml HBSS oldattal szobahőmérsékleten inkubáltuk. Az inkubációs médiumban és az efflux médiumokban a BMG és a BDG mennyiségét HPLC analízissel határoztuk meg.

- 35 -

KÍSÉRLETI MÓDSZEREK A 60 perces inkubációs idő alatt a termelődött glukuronidok egy része a szinuszoidális transzportereken keresztül az inkubációs médiumba, a másik része pedig a kanalikuláris transzportereken keresztül az in vitro epevezető rendszerbe került. Az inkubációs médium BG mennyisége a szinuszoidális transzport aktivitással arányos. Az in vitro epevezető BG tartalmát úgy határoztuk meg, hogy szobahőmérsékleten megvontuk a Ca2+/Mg2+ ionokat az efflux médiumból, ennek hatására a Ca2+/Mg2+ ion függő sejtkapcsoló struktúrák megszűnnek, a csatorna „felnyílik” és az előzőleg termelődött és kiválasztott BG tartalma az efflux médiumba kerül. A szinuszoidális transzport aktivitás szobahőn nem szűnik meg teljesen, ennek mértékére a Ca2+/Mg2+ ionokat tartalmazó efflux médium BG tartalma utal. Így valós kanalikuláris BG mennyiség csak Ca2+/Mg2+ ionok hiányában és jelenlétében mért BG tartalom különbségeként számítható. A csatornák BG mennyisége a kanalikuláris transzport aktivitással arányos. Szinuszoidális efflux:

BGInkubációs médium

Kanalikuláris efflux:

BGCa 2+ / Mg 2+ − mentes HBSS − BGCa 2+ / Mg 2+ HBSS

A PNP-G exkréció meghatározásához a PNP-t (0,1 mM) William’s medium E tápoldatban oldva adtuk a sejtekhez, az inkubációs idő 20 perc volt. A szubsztrát tartalmú médiumot eltávolítottuk. A sejteket Ca2+/Mg2+ ionok jelenlétében és hiányában 0,5 ml HBSS-oldattal inkubáltuk 20 percig szobahőmérsékleten. Az inkubációs médiumban és az efflux médiumokban HPLC analízissel meghatároztuk a PNP-G mennyiségét. A PNP-G szinuszoidális és kanalikuláris effluxát a BG esetében leírt módon számítottuk. Meghatároztuk a Biliáris Efflux Index értékeket (BEI), amely érték minél nagyobb, annál inkább a kanalikuláris transzportereken keresztül ürül az adott metabolit.

BEI =

BGCa 2+ , Mg 2+ − mentes HBSS − BGCa 2+ , Mg 2+ HBSS BGCa 2+ , Mg 2+ − mentes HBSS

× 100

4.12 Indukciós vizsgálatok primer hepatocita szendvics kultúrában

Az indukciós kezelést a letapadástól számított 4. órában kezdtük (10 µM DEX, 100 µM CL, 250 µM PB, 50 µM RIF). A kezeletlen sejtek 0,1% DMSO tartalmú tápoldatot kaptak. Az induktorokat is tartalmazó táploldatot minden nap frissen adtuk a sejtekhez. Az indukciós periódus végén meghatároztuk a BG kanalikuláris és szinuszoidális effluxát.

- 36 -

KÍSÉRLETI MÓDSZEREK

Az indukciós vizsgálatokhoz kis mértékben módosítottuk az 4.11. fejezetben leírt módszert. A 96 órás szendvics kultúrában tartott májsejteket 15 percig 0,025 mM bilirubin-albumin oldattal inkubáltuk (37 0C). A szubsztrát tartalmú médium eltávolítása után a sejteket 3x1 ml HBSS-oldattal mostuk. A sejteket Ca2+/Mg2+ ionok jelenlétében és hiányában 0,5 ml HBSSoldattal inkubáltuk (37 0C), majd HPLC analízissel meghatároztuk az efflux médiumok BG tartalmát. A módosított módszer szerint: BG kanalikuláris efflux:

BGCa 2+ / Mg 2+ − mentes HBSS − BGCa 2+ / Mg 2+ HBSS

BG szinuszoidális efflux:

BGCa 2+ / Mg 2+ HBSS

4.13 MRP2 és MRP3 proteinek gátlásának vizsgálata hepatocita szendvics kultúrában

A 96 órás szendvics kultúrában tartott májsejteket gátlószerek jelenlétében (50 µM RIF, 100 µM CL, 100 µM PR, 400 µM IM) és hiányában (DMSO 0,1%) 0,025 mM bilirubin-albumin oldattal inkubáltuk 15 percig. A szubsztrát tartalmú oldatot eltávolítottuk. A sejteket Ca2+/Mg2+ ionok jelenlétében és hiányában 0,5 ml HBSS-oldattal inkubáltuk (37 0C). Majd a szinuszoidális és a kanalikuláris efflux mértékét az 5.10. és az 5.11. fejezetben leírt módon határoztuk meg.

4.14 CDF-DA kanalikuláris felhalmozódásának vizsgálata konfokális pásztázó lézer mikroszkóp segítségével

Megvizsgáltuk a BG efflux gátlása során alkalmazott gátlószerek transzportgátló hátását fluoreszcens CDF szubsztrát esetében. A módszer elve az, hogy az inkubáció során a fluoreszcenciával nem rendelkező CDF-DA (5(6)-karboxi-2',7'-diklorofluoreszcein-diacetát) bejut a májsejtekbe és az észterázok lehasítják a molekuláról az acetil csoportokat, az így létrejött vegyület (CDF) fluoreszkál és szubsztrátja a transzport proteineknek, elsősorban az MRP2-nek. A kanalikuláris MRP2 a csatornába pumpálja a festéket, így a lézer gerjesztés hatására a csatornák alakja zöld fénnyel kirajzolódik. A fluoreszcencia intenzitása függ a csatornába található festék mennyiségétől. A csatornában található fluoreszcens festék mennyiségét a transzport gátlószerek csökkentik, így a fluoreszcencia intenzitása is csökken. A 96 órás kollagén szendvics konfigurációban tartott sejteket a gátlószerek jelenlétében (IM: 400 µM; RIF: 50 µM; BB: 100 µM; CL: 100 µM) és hiányában (kontroll: 0,1% DMSO) 10

- 37 -

KÍSÉRLETI MÓDSZEREK

µM CDF-DA-val inkubáltuk 10 percig. Az inkubáció után a szubsztrát tartalmú oldatot eltávolítottuk, majd 3x2 ml hideg HBSS-oldattal mostuk a sejteket és végül felvételt készítettünk a hidegen tartott sejtekről konfokális pásztázó lézer mikroszkóppal. A kanalikuláris rendszerben a fluoreszcens festék jelenlétét Noran OZ konfokális pásztázó lézer mikroszkóp [Prairie Technologies, Middleton, WI, USA; argon-kripton multiline lézer (Omnichrom 643; Mells Griot, Bensheim, Németország); 20-szoros víz-immerziós objektív (résarány: 0,9)] segítségével detektáltuk. A zöld fluoreszcenciát (excitáció: 488 nm, emisszió: 515 nm) a fluoreszcein csatornán keresztül rögzítettük (515-nm „long-pass barrier filter”). 4.15 Vezikuláris transzport kísérletek

A vezikuláris transzport kísérletek során alkalmazott kifordított (inside-out) membrán vezikulákat expressszált (bakulovírus expressziós rendszer)37,38 humán MRP2 és MRP3 transzportereket tartalmazó SF9 (Spodoptera frugiperda) sejtekből izolálták39,40. A módszer elve: az MRP2, illetve MRP3 transzportereket tartalmazó kifordított vezikulákat 3

H-E217βG-al inkubáltuk. A transzporterek ebben a rendszerben a szubsztrátot a vezikula

belsejébe pumpálták. Az inkubáció leállítása után a vezikulákat szűrő „plate”-en kötöttük meg. A szubsztrát felesleg eltávolítása után meghatároztuk a vezikulákban található szubsztrát mennyiségét, folyadék szcintilláción alapuló radioaktivitás méréssel. Az MRP2 esetében 50 µM míg az MRP3 esetében 2 µM E217βG végkoncentrációt alkalmaztunk. Az inkubációt 96 lukú tálcán végeztük. A gátlószereket a következő koncentrációban tartalmazta az inkubációs elegy: BB

6,25; 12,5; 25; 50; 100* µM

RIF

12,5; 25; 50; 100; 200; 400* µM

IM

4,94; 14,81; 44; 133; 400 µM;

CL

12,5*; 25; 50; 100; 200 µM

PR

6,25; 12,5; 25; 50; 100; 200 µM

12,5*; 25*; 50*; 100*; 200* µM

* csak az MRP3 esetében alkalmazott gátlószer koncentrációk

50 µl reagens elegyet (39µl reagens mix (0,046 M MOPS-TRIS, 0,301 M KCl, 0,007 M MgCl2); 0,5 µl glutation; 0,1µl 3H-E217βG (1 mCi/ml); 0,5 µl E217βG; 10 µl membrán preparátum) 10 percig előinkubáltuk rázó termosztátban (500 rpm, 37 0C). Az előinkubálás után 25 µl ATP-oldattal (12 mM) indítottuk a reakciót (500 rpm, 37 0C). A 8 perces reakció idő végén 200 µl jég-hideg mosó oldattal állítottuk le a transzportot. A mintákat 96 lukú filterplate-re (Millpre multiscreen HTS 96 well filterplates) helyeztük és leszűrtük, majd - 38 -

KÍSÉRLETI MÓDSZEREK

5x200 µl mosó pufferrel (0,04 M MOPS-TRIS, 0,07 M KCl) mostuk. A megszárított szűrőre 50 µl szcintillációs koktélt (OptiPhase „supermix”) tettünk és a beütésszámot Perkin Elmer készülékkel határoztuk meg. Radioaktivitás alapján meghatároztuk a transzport aktivitást (pmol/mg membrán protein/perc): transzport aktivitás = •

transzport aktivitás (cpm) c[E 217 βG(nM)] × térfogat (ml ) × * totál aktivitás (cpm) membrán protein(mg ) × idő ( perc)

totál aktivitás: a kiindulási reakcióelegy összaktivitása

4.16 Statisztika

A sejtkultúrás kísérleteket minden esetben három független sejtpreparátummal végeztük és a vizsgálatok során 3 párhuzamos mérést végeztünk. Minden kísérlethez saját kontrollt alkalmaztunk. Az adatok átlag±S.D. formában vannak kifejezve. A statisztikailag szignifikáns különbségeket párosított Student’s t teszttel vizsgáltuk. A szignifikancia minden esetben: p<0,05. 4.17 A vizsgalataink során alkalmazott modell vegyületek szerkezete

Probenecid

Indometacin

Benzbromaron

- 39 -

KÍSÉRLETI MÓDSZEREK

Klofibrát

Rifampicin

Fenobarbitál

Metilkolantrén

Dexametazon

- 40 -

EREDMÉNYEK

5

EREDMÉNYEK

5.1

A bilirubin-glukuronidok HPLC analízise és azonosítása

A BG mennyiségét egyrészt diazoreakción alapuló módszerrel, másrészt HPLC analízissel határoztuk meg. A HPLC analízis bevezetésére szükség volt mert: 1. a diazotáláson alapuló reakció nem bizonyult elég érzékenynek, 2. a diazoreakciót számos vegyület zavarja (triton X-100, szaponin), 3. a diazoreakcós detektálással nem lehet meghatározni a BMG és a BDG mennyiségét. A bilirubinnak a vinil csoportok „endo”, illetve „exo” helyzetétől függően három izomerje van: bilirubin-IXα, XIIIα, IIIα (5. ábra). A három izomer négyféle BMG, illetve háromféle BDG izomer képződéséhez vezet. HPLC analízisen alapuló elválasztást dolgoztunk ki a BMG és BDG konjugátumok mennyiségének meghatározására (6. ábra). A konjugátumok

jelenlétét

β-glukuronidáz

hidrolízissel igazoltuk. A konjugátumokat az enzimmel elhidrolizáltuk, ezt követően a BG csúcsok a kromatogramról eltűntek és ezzel egyidőben a bilirubin csúcs megnövekedett. 5. ábra

A glukuronidok hidrolízise D-szacharinsav41

A bilirubin szerkezeti izomerjei

1,4 laktonnal gátolható volt, ebben az esetben

a BG csúcsok nem változtak. A BMG és BDG csúcsokat tömegspektrometriás analízissel azonosítottuk. Az m/z arány BMG-ra 761,2 és BDG-ra 936,9 volt (7.ábra). A HPLC analízis kalibrációja bilirubin oldattal történt, mert a bilirubin, a BMG és a BDG abszorpciós spektruma gyakorlatilag azonos41.

- 41 -

EREDMÉNYEK

A BG HPLC elúciós profilja 6. ábra A bilirubin és a BG elúciós profilja HPLC analízis során. (B:bilirubin, BMG: bilirubin-monoglukuronid, BDG bilirubin-diglukuronid)

+ P r e c ( 4 7 5 , 0 0 ) : 6 1 M C A s c a n s f r o m S a m p le 1 9 ( P r e c 4 7 5 ) o f L e n g y e lG y u r i. w if f ( T u r b o S p r a y ) 7 6 1 ,2

Intenzitás (mV)

2 ,8 e 5 2 ,6 e 5 2 ,4 e 5

M a x . 2 ,8 e 5 c p s .

BMG

2 ,2 e 5 2 ,0 e 5 1 ,8 e 5 1 ,6 e 5 1 ,4 e 5 1 ,2 e 5 1 ,0 e 5 8 ,0 e 4

BDG

6 ,0 e 4 7 7 8 ,3 4 ,0 e 4

9 3 6 ,9

2 ,0 e 4 500

7 6 3 ,4

6 6 2 ,2 520

540

560

580

600

620

640

660

680

700

720 740 m /z , a m u

m/z arány 7. ábra A BMG és a BDG tömegspektruma.

- 42 -

760

780

800

820

840

860

880

900

920

940

EREDMÉNYEK

5.2

Bilirubin konjugáció primer patkány hepatocita kultúrában

60

6

(nmol/10 sejt/perc)

Bilirubin-glukuronid

50 40 *

30 *

20 *

10 0 0

4

24 48 Idõ (óra)

72

96

8. ábra Az UGT1A1 aktivitás változása a sejtkultúra korának függvényében (átlag±S.D.;*p<0,05; n=3)

Az indukció időtartama legalább három nap, aminek oka az, hogy az indukció során időigényes de novo enzim szintézis történik, ezért megvizsgáltuk, hogy hogyan változik a kezeletlen sejtek UGT1A1 aktivitása a sejtkultúra korának függvényében. Meghatároztuk a BG képződésének sebességét a preparálást követően májsejt szuszpenzióban, a leültetéstől számított 4, 24, 48, 72, és 96 órában. A májsejt szuszpenziót 10 ml térfogatban (sejtszám: 1,3x106 sejt/ml), folyamatos keverés közben 0,025 mM bilirubin-albumin oldattal inkubáltuk 60 percig, csakúgy mint a májsejt kultúrát. Végül meghatároztuk a képződött BG mennyiségét a 4.4. és 4.5. fejezetben leírt módon. A konjugátumok mennyisége a felülúszóban a sejtek leültetése után 4 órával a szuszpenzióban mért 10%-ára csökkent (8. ábra). 24 óra múlva kezdett emelkedni (20%), végül 72 óra múlva közelítette meg (87%) a szuszpenzióban detektálható értéket. 96 órában mért kontroll enzimaktivitás (42±11 nmol/106 sejt/perc), közel azonos volt a szuszpenzióban mérhető értékkel (47±12 nmol/106 sejt/perc). A csökkent BG szekréciónak több oka is lehetett, így a citoplazmatikus UDP-glukuronsav mennyiségének, illetve az UGT1A1 aktivitás csökkenése, valamint a transzport proteinek inaktiválódása.

- 43 -

EREDMÉNYEK

Az UDP-glukuronsav depléciós hipotézis igazolására az ültetéstől számított 4. órában a májsejteket 0,005%-os szaponin kezeléssel, illetve ciklikus fagyasztással-olvasztással permeabilizáltuk (9. ábra). A permeabilizálást célzó kezelések eredményességét tripán kék kizárásos módszerrel ellenőriztük. Ezt követően a májsejteket 4 mM UDP-glukuronsav jelenlétében

0,025

mM

bilirubin-albumin

oldattal

inkubáltuk,

végül

diazotálással

meghatároztuk a BG mennyiségét. A fagyasztás nem szignifikáns mértékben növelte, míg a szaponin kezelés csökkentette a konjugátumok mennyiségét a felülúszóban (9. ábra).

9. ábra

90

A fagyasztás és a szaponin kezelés hatása a BG képződésére primer hepatocita kultúrában (átlag±S.D.; n=3)

80

Bilirubinglukuronid 6 nmol/10 sejt.perc

70 60 50 40 30 20 10 0

Intakt sejt

Fagyasztott

Szaponin

120

120

A

*

100

80

80

* 60

%

%

B

100

40

60

*

40

* 20

20

0

Szuszpenzió

4 óra

0

96 óra

Szuszpenzió

4 óra

96 óra

10. ábra A BG extracelluláris (A) és intracelluláris (B) megoszlása szuszpenzióban, 4 és 96 órás primer rigid májsejt kultúrában 100% (BG) = a szuszpenzióban mérhető extracelluláris BG + intracelluláris BG összmennyisége (átlag±S.D.;*p<0,05; n=3)

Az

esetleges

transzport

protein

aktivitás

csökkenését

úgy

vizsgáltuk,

hogy

a

májsejtszuszpenziót, valamint a 4 és a 96 órás májsejtkultúrát 0,025 mM-os bilirubinalbumin-oldattal inkubáltuk, majd a szubsztrát tartalmú médiumot eltávolítottuk és a sejteket 0,05%-os Triton X100-PBS-oldattal feltártuk. HPLC analízissel meghatároztuk a médiumok és a Triton X100 tartalmú oldatok BG tartalmát.

- 44 -

EREDMÉNYEK

A diazoreakcióhoz képest pontosabb mennyiségi meghatározást lehetővé tevő HPLC analízisnél azt tapasztaltuk, hogy a médiumban a lerakástól számított 4 óra múlva kb. 20%-ra csökkent a kiválasztott BG mennyisége a szuszpenzió médiumában mérthez képest, és 96 órában sem éri el a szuszpenzióban mért értéket (10/A ábra). Szuszpenzióban tartott sejtekben az akkumulálódott BG mennyisége a detektálási határon van (1-2%), míg 4 órában a konjugátumok jelentős része (83%), 96 órában pedig kb. 40%-a akkumulálódott (10/B ábra). A bilirubin konjugáció sebessége függ az UGT1A1 enzim mennyiségétől. Különböző időpontokig (szuszpenzió, 4h, 24h, 96h) tartott sejtkultúrákból Western-blot technika segítségével meghatároztuk az UGT1A1 enzim mennyiségét. A Western-blot analízis denzitogrammja látható a 11. ábrán. Az enzim mennyisége 4 óra múlva nem változik, majd 24 órára lecsökken (45%), amit 96 órában overexpresszió követ (220%). A Western-blot analízissel azt igazoltuk, hogy négy órában változatlan mennyiségben van jelen az UGT1A1 enzim.

2,2 2,0 1,8

UGT1A1 szint Relatív denzitás

1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 S zu szp en zió

4 ó ra

24 ó ra

96 ó ra

11.ábra Az UGT1A1 fehérje szint változása a sejtkultúra korának függvényében (Western-blot denzitogramm) Az ábrán egy jellemző denzitogramm látható

- 45 -

EREDMÉNYEK

5.3

Enziminduktorok hatása a bilirubin konjugációjára primer patkány hepatocita kultúrában

K o n tro ll D E X 0,1 μ M D EX 1μM D E X 10 μ M Cl R IF C l+ D E X 10 μ M

6

(nmol/10 sejt/perc)

Bilirubin-glukuronid

100 80 60

* *

* *

*

40 20 0

24

48

72

96

Id õ (ó ra )

12. ábra Induktorok hatása az UGT1A1 aktivitására az indukció időtartamának függvényében (átlag±S.D.;*p<0,05; n=3)

Megvizsgáltunk néhány az irodalomból jól ismert citokróm P-450 enzim induktor (0,1 μM, 1 μM, 10 μM DEX, 100 μM CL, 3,7 μM MC , 50 μM RIF, 10 μM DEX + 100 μM CL kombináció) hatását a bilirubin UDP-glukuronsavval történő konjugációjára (12. ábra). Az indukciós kezelést a májsejtek ültetésétől számított 4. órában kezdtük és 96 órán keresztül folytattuk. A sejtek minden nap frissen kapták az induktorokat is tartalmazó médiumot. A kontroll médium 0,1% DMSO-t tartalmazott. Az UGT1A1 aktivitást naponta meghatároztuk a 4.6. fejezetben leírt módon. MC kivételével (a 12. ábrán nincs feltűntetve) mindegyik induktor fokozta a BG képződést már 48 órában, de szignifikáns indukciós hatás csak 96 órában volt tapasztalható. A 96 órás májsejt kultúrában a DEX koncentrációfüggő indukciós hatást mutatott (133%, 150%, 178%). A legnagyobb mértékű indukciót a 10 μM DEX+CL kombináció esetében tapasztaltuk (210%). A CL és a RIF közel egyenlő mértékben fokozták a BG mennyiségét a médiumban (176%, 168%). - 46 -

EREDMÉNYEK

3 ,5

UGT1A1 protein szint Relatív denzitás

3 ,0 2 ,5 2 ,0 1 ,5 1 ,0 0 ,5 0 ,0

K o n tro ll

R IF

D E X 10 µ M

MC

CL

K ez elés

13. ábra Az UGT1A1 enzim mennyiségének változása induktorok hatására Western-blot denzitogramm Az ábrán egy jellemző denzitogramm látható

Abból a célból, hogy igazoljuk a valódi enzimindukciót, azaz a de novo enzimszintézist, Western-blot analízissel meghatároztuk az UGT1A1 protein mennyiségét a 96 órás kultúrában. A CL, RIF, DEX kezelés megnövelte az UGT1A1 enzim mennyiségét: 328, 250, 362%-ra, míg a MC nem volt szignifikáns hatással az UGT1A1 enzim mennyiségére (13. ábra).

- 47 -

EREDMÉNYEK

5.4

In vitro epevezető rendszer kialakulása és feltárása primer patkány hepatocita szendvics kultúrában

Ahhoz, hogy izoláltan tudjuk vizsgálni a szinuszoidális és a kanalikuláris transzport aktivitást, olyan rendszerre volt szükségünk, melyben a májsejtek megtartják a polarizált membrán struktúrát a rájuk specifikusan jellemző transzport proteinekkel együtt. A megoldás kulcsát a primer hepatocita kollagén szendvics kultúra jelentette. A hepatocitákat kollagénezett petricsészékre helyeztük. 24 órával később nátrium-hidroxiddal neutralizált felső kollagén réteget helyeztünk a sejtekre, így létrehozva a kollagén szendvics konfigurációt. A felső kollagén réteg hatására a májsejtekben visszaalakult a preparálás során elvesztett polarizált membrán struktúra. Az így regenerálódott polarizált membrán felszínen elkülönül a kanalikuláris és szinuszoidális membrán. A májsejtek között 96 órára kiterjedt és összefüggő, kollaterálisokban gazdag kanalikuláris rendszer jött létre (14/A ábra). A sejtkapcsoló struktúrák valamint a csatornarendszer morfológiájának megtartásához a Ca2+/Mg2+ ionok jelenléte szükséges. Ha megvontuk ezeket a kétértékű ionokat a májsejtektől, továbbá kelátképzővel (EDTA) egészítettük ki a médiumot, akkor a Ca2+/Mg2+ ion függő sejtkapcsoló struktúrák megszűntek, és a sejtek lekerekedtek (14/B ábra). Ca2+/Mg2+ ionok jelenlétében csak a szinuszoidális membrán, míg hiányukban mind a kanalikuláris, mind pedig a szinuszoidális membrán érintkezett a médiummal. Így Ca2+/Mg2+ ionok

jelenlétében

a

szinuszoidális,

míg

hiányukban

a

kumulatív

(szinuszoidális+kanalikuláris) transzport aktivitás határozható meg a felülúszóban.

14/A. abra

14/B. ábra

Kollagén szendvics konfigurációban tartott májsejtek Ca2+/Mg2+ ionok jelenlétében.

Kollagén szendvics konfigurációban tartott májsejtek Ca2+/Mg2+ ionok hiányában.

- 48 -

EREDMÉNYEK

5.5

A BG és pNPG biliáris efflux indexének meghatározása patkány és humán hepatocita szendvics kultúrában

BEI: 62.5

**

BEI:80.6

BEI:5.2

**

*

BG és pNPG összkonjugátum%

100 BG a standard mediumban 2+ BG a Ca mentes mediumban pNPG a standard mediumban 2+ pNPG a Ca mentes mediumban

80 60 40 20 0

Humán

Patkány

15. ábra A BG és pNP-G effluxa kálcium jelenlétében és hiányában. A csatornák BG tartalmát a piros és zöld oszlopok közötti különbség reprezentálja. (átlag±S.D.; *p<0,05; **p<0,01; n=3)

A négy napig szendvics konfigurációban tartott patkány és humán májsejteket bilirubin oldattal inkubáltuk. 60 perc után ezt a szubsztrát tartalmú médiumot eltávolítottuk és standard (Ca2+/Mg2+ ion tartalmú) illetve Ca2+/Mg2+ ion mentes HBSS-re cseréltük, mely a szubsztrátot már nem tartalmazta. A szubsztrát tartalmú médiumban, a Ca2+/Mg2+ ion mentes és a standard HBSS-ben meghatároztuk a bilirubin konjugátumok mennyiséget HPLC módszerrel. Szignifikánsan több BG volt detektálható a Ca2+/Mg2+ ion mentes médiumban, mint a standard efflux médiumban mind a humán (270%), mind pedig a patkány májsejtek esetében (500%). A BG megoszlása a két médium között azt mutatja, hogy a BG főként a kanalikuláris membránon keresztül szekretálódik (15. ábra). A biliáris efflux index (BEI) BG-ra nézve humán hepatocitákban 62,5, míg patkány hepatocitákban 80,6 volt. A p-nitro-fenol-glukuronid (pNPG) effluxának vizsgálatával igazoltuk azt, hogy primer hepatocita szendvics kultúrában a szinuszoidális transzport szubsztrátok gyakorlatilag nem szekretálódnak a kanalikuláris térbe. Empirikus tapasztalat szerint patkányban a 300 g/mol molsúlynál kisebb metabolitok (pNPG) a szinuszoidális transzportereken keresztül ürülnek. A májsejteket 0,1 mM pNP-oldattal inkubáltuk, majd ezt a szubsztrát tartalmú médiumot

- 49 -

EREDMÉNYEK

Ca2+/Mg2+ ion mentes és standard HBSS oldatra cseréltük. A pNPG mennyiségét HPLC-s módszerrel detektáltuk. A pNPG mennyisége ugyan szignifikánsan több volt a Ca2+/Mg2+ ion mentes médiumban, mint a standard médiumban (84,6 ± 1,1; 80,2 ± 1,1), de a szinuszoidális és kanalikuláris efflux közötti különbség sokkal kisebb volt, mint a BG esetében (5,2%).

5.6

A szinuszoidális és a kanalikuláris membránon történő BG efflux BDG/BMG aránya 96 órás patkány és humán hepatocita szendvics kultúrában

BMG és BDG megoszlás (össz BG%)

100

BMG BDG

80

60

40

20

in Sz

0

us

z

o id

s á li

e ff

lu x

Ka

na

l

lá ik u

e ff r is

lu x Sz

é ru

m

Ep

e

16. ábra A BDG/BMG arány alakulása in vitro szendvics kultúrában, valamint in vivo szérumban és epében42. (átlag±S.D.; n=3)

A 16. ábrán összehasonlítottuk a 96 órás májsejt kultúrákban a szinuszoidálisan és kanalikulárisan ürülő konjugátumok BDG/BMG megoszlását. A szinuszoidális effluxot a szubsztrát tartalmú médiumban mértük. A csatornák BG tartalmát a Ca2+/Mg2+ ion mentes és standard efflux médiumban detektálható BG mennyiség különbségeként kaptuk meg. A BDG és BMG megoszlása a szubsztrát tartalmú médiumban: 35,5 ± 3% és 64,5 ± 3%, míg a kanalikuláris hálózatban a BDG 59,7 ± 2%, a BMG pedig 40,3 ± 3%. A médiumban több volt a BMG, mint a csatornákban. A kapott adatokat összehasonlítottuk a Mesa és munkatársai által kapott in vivo eredményekkel42. A patkány szérumban 38 ± 30% BDG-t és 62 ± 10% BMG-t mértek, míg a patkány epében 60 ± 4% BDG-t és 38 ± 4% BMG-t mértek. A szendvics kultúrában a szubsztrát tartalmú médium és a szérum BDG/BMG aránya majdnem

- 50 -

EREDMÉNYEK

azonos 0,55 és 0,6; szendvicskultúra csatornáiban található szekrétum és az epe BDG/BMG aránya szintén majdnem azonos 1,48 és 1,5 volt. Tehát az eltérő membránokon lokalizálódó transzporterek aktivitását tükröző in vivo fordított BDG/BMG arány az in vitro rendszerben is megmaradt.

A szinuszoidális BDG/BMG arány változása a humán és patkány májsejtkultúra korának függvényében

BMG és BDG megoszlás (össz BG%)

5.7

100 80

Hu

sz

BDG

60 *

40

*

*

*

20 *

0

n má

BM G

*

u

p sz

en

z ió

Hu

m

96 án

ó ra

P

a tk

y án

sz

u

p sz

en

z ió

Pa

tk á

24 ny

ó ra

Pa

tk á

72 ny

ó ra

Pa

tk á

96 ny

ó ra

17. ábra A szinuszoidális BDG/BMG arányának változása a sejtkultúra korának függvényében. (átlag±S.D.; *p<0,05; n=3)

Meghatároztuk a BDG/BMG arányt frissen izolált humán és patkány májsejtekben, illetve megvizsgáltuk, hogy hogyan változik a BDG/BMG arány a májsejtkultúra korának függvényében (17. ábra). A humán és patkány májsejt szuszpenzióban keletkező BDG/BMG arányban szignifikáns különbséget mértünk (0,574; 0,07). A humán májsejtek szuszpenzióban is több BDG-ot termelnek, mint a patkány májsejtek. Mind patkány, mind humán májsejtek esetében a BDG/BMG egyensúly a sejt kultúra korának függvényében a BDG keletkezésének irányába tolódik el. 96 órára a humán májsejtek esetében az arány a BDG javára megfordul. A 96 órás humán hepatocita kultúrában a szubsztrát tartalmú médium BDG tartalma 2,5-szer nagyobb, mint a BMG tartalma. Ezzel

- 51 -

EREDMÉNYEK

szemben patkány májsejtek esetében a médiumban a BDG aránya ugyan nő, de mennyisége szignifikáns mértékben kevesebb, mint a BMG mennyisége. 5.8

A BDG/BMG arány alakulása humán és patkány mikroszóma frakcióban

* 1000 BMG BDG

BMG és BDG képzõdés (pmol/mg protein/perc)

800

600

400

200

0

*

HM1 HM2 HM3 HM4 HM5

HM

RM

18. ábra BDG/BMG arány alakulása patkány és humán mikroszómában végzett inkubáció után. HM1-5: egyedi; HM: kevert humán donor májból származó mikroszóma; RM: kevert patkány mikroszóma. (átlag±S.D.; *p<0,05; n=3)

Meghatároztuk az UGT1A1 enzim aktivitását 5 egyedi donorból származó és egy 14 donorból származó kevert humán mikroszómában (HM), valamint 5 patkányból származó kevert mikroszómában (RM). Az öt egyedi humán májból származó mikroszóma UGT1A1 aktivitásának átlaga hasonló a kevert humán mikroszómában mérhető enzimaktivitáshoz: 0,603±0,232 és 0,67 nmol/mg protein/perc, azonban közel háromszoros különbség volt tapasztalható az egyedi enzimaktivitás értékekben. A kevert patkány mikroszómában mért enzimaktivitás (0,978 nmol/mg protein/perc) nagyobb volt, mint a kevert humán mikroszómában mért enzimaktivitás. Összehasonlítottuk a különböző mikroszóma mintákban kapott BDG/BMG arányt (18. ábra), mely a kevert humán mikroszóma esetében (0,1) nagyobb volt, mint a kevert patkány mikroszómáéban (0,04). A humán mikroszómákban több BDG keletkezik, mint a patkány mikroszómákban.

- 52 -

EREDMÉNYEK

5.9

Összehasonlító indukciós vizsgálat primer patkány hepatocita rigid és szendvics kultúrában

200

Heparocita szendvics kultúra Hepatocita rigid kultúra

* * *

*

*

Kummulatív efflux (BG) (Kontroll %)

*

*

150

100

50

0

Kontroll

DEX

RIF

CL

PB

19. ábra A bilirubin metabolizmus sebességének változása primer hepatocita szendvics és rigid kultúrában. (átlag±S.D.; *p<0,05; n=3)

Patkány rigid és szendvics konfigurációban tartott májsejteket 96 órán keresztül metabolikus enzim induktorokkal kezeltünk: PB (250 μM), DEX (10 μM), CL (100 μM), RIF (50 μM). A 19. ábra a rigid és a szendvics kultúrában tartott májsejtek indukciós profilját mutatja. A rigid kultúra esetében 4.5. fejezetben leírtak szerint határoztuk meg az indukciós periódus végén az UGT1A1 aktivitását, míg szendvics kultúra esetében a kumulatív BG effluxot (szinuszoidális + kanalikuláris efflux) tüntettük fel. A DEX, RIF, PB kezelés hatására mindkét kultúrában szignifikáns mértékben emelkedett a BG efflux mértéke. A CL kezelés esetében szendvics kultúrában nem figyelhető meg kumulatív BG efflux fokozódás.

- 53 -

EREDMÉNYEK

5.10 Induktorok hatása a BG szinuszoidális és kanalikuláris effluxára patkány hepatocita szendvics kultúrában

240

BEI: K DEX CL RIF PB

K o n tro ll DEX CL R IF PB

*

220 200 180

*

160

*

BG Kontroll %

140

54,0 ± 4,8 49,4 ± 6,6 25,5 ± 13,0* 47,7 ± 3,5 * 46,5 ± 11.0

120 100 80

*

60 40 20 0

S z in u s z

ff lu x ff lu x u lá ri s e o id á li s e K a n a li k

K u m u la

x tí v e ff lu

20. ábra Enzim induktorok hatása a BG kanalikuláris és szinuszoidális effluxára. (átlag±S.D.; *p<0,05; n=3)

A 96 órás indukciós periódus végén meghatároztuk a BG szinuszoidális és kanalikuláris effluxát (20. ábra). A májsejteket 15 percig bilirubin-oldattal inkubáltuk, majd a szubsztrát tartalmú médium eltávolítása után Ca2+/Mg2+ mentes és standard HBSS-el inkubáltuk a sejteket 60 percig. Az efflux médiumok konjugátum tartalma alapján meghatároztuk a BG szinuszoidális és kanalikuláris effluxát valamint a BEI értéket. Az

induktorok

a

BG

szinuszoidális

effluxát

nagyobb

mértékben

indukálták

RIF>CL>DEX=PB [181%, 169%, 144%, 146%], mint a kanalikuláris effluxát RIF>DEX [138%, 122%]. A PB nem fokozta a BG kanalikuláris effluxát. A BEI értékét kivétel nélkül mindegyik induktor csökkentette, a CL és RIF esetében a csökkenés szignifikáns volt (25,5±13,0; 47,7±3,5). Ez arra utal, hogy az induktorok hatására a BG effluxa a szinuszoidális irányba tolódott el. A CL kezelés esetében nem tapasztalható BG kumulatív efflux fokozódás, azonban, ha a szinuszoidális és kanalikuláris BG effluxot külön vizsgáljuk, akkor a szinuszoidális membránon BG efflux fokozódás (169±29%), míg a kanalikuláris membránon BG efflux csökkenés figyelhető meg (35±25%). Ezek az adatok azt mutatják, hogy a kumulatív BG efflux esetében szendvics kultúrában a kanalikuláris gátlás elfedi a CL indukciós hatását.

- 54 -

EREDMÉNYEK

5.11 Gátlószerek hatása a BG kanalikuláris és szinuszoidális effluxára patkány hepatocita szendvics kultúrában 250

* Kontroll IM CL RIF PR

BG (Kontroll%)

200

150

100

*

*

BEI: K IM CL RIF PR

42,3 ± 6,6 38,1 ± 11,6 38,8 ± 0,5 9,5 ± 0,1* 33,3 ± 0,7*

* *

50 * 0 x x idális efflu Kanalikuláris efflu Szinuszo

v efflux Kumulatí

21. ábra Transzport gátlószerek hatása a BG kanalikuláris és szinuszoidális effluxára. (átlag±S.D.; *p<0,05; n=3)

Megvizsgáltuk patkány hepatocita szendvics kultúrában néhány metabolikus enziminduktor (CL, RIF) és kolesztatikus mellékhatással rendelkező gyógyszer (IM, RIF, PR) hatását a BG kanalikuláris és szinuszoidális effluxára. A 4 napig kollagén szendvics konfigurációban tartott májsejteket B oldattal inkubáltuk, majd a szubsztrát tartalmú médium eltávolítása után, a sejteket Ca2+/Mg2+ mentes és standard HBSS-oldattal inkubáltuk egy órán keresztül. Mind a szubsztrát tartalmú, mind pedig az efflux médium tartalmazta a gátlószereket: IM (400 μM), RIF (50 μM), CL (100 μM), PR (100 μM). A kontroll 0,1% oldószert (DMSO) tartalmazott. Mindegyik vegyület a RIF-t kivéve csökkentette a BG kumulatív effluxát. Ha külön megvizsgáljuk a két membránon történő BG transzportot, azt láthatjuk, hogy a vizsgált ágensek jobban gátolták a kanalikuláris effluxot, mint a szinuszoidálisat. A RIF esetében a kanalikuláris efflux gátlással (28±1%) párhuzamosan szinuszoidális efflux fokozódás (202±28%) figyelhető meg. A kanalikuláris transzportra nézve a PR és az IM hatása közel azonos volt, mindkét vegyület gátolta azt (53±3%, 54±21%). A CL kismértékben csökkentette a BG kanalikuláris effluxát (75±11%), míg a szinuszoidális effluxot nem befolyásolta (21. ábra). A RIF és PR esetében BEI értékek szignifikáns mértékben csökkentek (9,5 ± 0.1; 33.3 ± 0,7).

- 55 -

EREDMÉNYEK

5.12 Gátlószerek hatása az 5(6)-karboxi-2',7'-diklórfluoreszcein-diacetát (CDF-DA) kanalikuláris akkumulációjára

Hogy láthatóvá tegyük az általunk vizsgált transzport gátló vegyületek (IM, RIF, BB, CL) hatását az MRP2 aktivitására, a sejteket egy specifikus MRP szubsztráttal (CDF-DA) inkubáltuk (10 percig) gátlószerek jelenlétében és hiányában (22. ábra). A módszer elve az, hogy az intracelluláris észterázok a sejtbe felvett CDF-DA acetil csoportjait lehasítják, majd az így létrejövő aglikon (CDF) az MRP2 és MRP3 transzport proteinek szubsztrátja. A CDF-t az MRP2 a csatornákba, míg az MRP3 a médiumba juttatja. Az inkubáció után konfokális pásztázó lézer mikroszkóppal felvételt készítettünk a sejtekről. A sejtekben és a csatornákban található CDF zöld fénnyel fluoreszkál. A BB, RIF, CL csökkentette a csatornák fluoreszcenciáját, míg az IM fokozta. A RIF és BB hatására a sejtek intracelluláris fluoreszcenciája fokozódott, míg a CL esetében nem. A CL esetében a csatornák kismértékben látszanak, így a CL kevésbé gátolta az MRP2-t, mint a BB. 22. ábra Gátlószerek hatása (BB, RIF, CL, IM) az MRP2 mediált CDF transzportra (40 szeres nagyítás) 22/A ábra. Kontroll (0,1% DMSO): A CDF az MRP2 transzport aktivitása következtében bekerül a csatornába, ahol felhalmozódik és a lézerfény hatására zöld színnel fluoreszkál.

22/B ábra. A benzbromaron hatása (100 µM): A BB az MRP2 aktivitását gátolta, a csatornába nem kerül CDF, ezért a csatorna sötét. Az intracellulárisan felhalmozódott festék miatt a sejtek élénkebben fluoreszkálnak.

22/C ábra. A rifampicin hatása (50 µM): A RIF gátolja a CDF transportot, ezért RIF jelenlétében a csatornák sötétek. Az intracellulárisan felhalmozódott festék miatt a sejtek élénkebben fluoreszkálnak.

- 56 -

EREDMÉNYEK

22/D ábra. A klofibrát hatása (100 µM): A CL gátolta az MRP2 mediált CDF transzportot, ezért a csatornákban a kontrollhoz képest kevesebb festék és fluoreszcencia figyelhető meg.

22/E ábra. Az indometacin hatása (400 µM): A kontrollhoz képest intenzívebb fluoreszcencia figyelhető meg a csatornákban.

250,00

300,00 250,00

pmol/mg protein/perc

pmol/mg protein/perc

5.13 Gátlószerek hatása a 3H-estradiol-17β-D-glukuronid (3H-E217βG) MRP2,3 mediált transzportjára kifordított membrán vezikulákon

200,00 150,00 100,00 50,00 0,00 0,00

50,00

100,00

150,00

200,00 150,00 100,00 50,00 0,00 0,00

200,00

10,00

RIF Koncentráció

40,00

50,00

BB hatása az MRP2 mediált E217βG (50 µM) transzportra

RIF hatása az MRP2 mediált E217βG (50 µM) transzportra

450,00

350,00

400,00 pmol/mg protein/perc

300,00 pmol/mg protein/perc

30,00

23/B ábra

23/A ábra

250,00 200,00 150,00 100,00 50,00

350,00 300,00 250,00 200,00 150,00 100,00 50,00 0,00 0,00

0,00 0,00

20,00

BB koncentráció

50,00

100,00

150,00

200,00

50,00 100,00 150,00 200,00 250,00 300,00 350,00 400,00 IM Koncentráció

PR koncentráció (µM)

23/C ábra

23/D ábra

PR hatása az MRP2 mediált E217βG (50 µM) transzportra

IM hatása az MRP2 mediált E217βG (50 µM) transzportra

- 57 -

EREDMÉNYEK

A BG transzportot befolyásoló gátlószerek (IM, PR, BB, CL, RIF) hatását vizsgáltuk MRP2, illetve MRP3 transzportereket tartalmazó membrán vezikulákon. A módszer elve az, hogy a vezikula membránjában található transzporterek a

3

H-E217βG-ot a vezikula belsejébe

juttatják. A szubsztrát felesleg eltávolítása után a transzport aktivitás (pmol/mg protein/perc) a vezikula izotóp tartalma alapján számítható. Az MRP2 vezikulák esetén a szubsztrát koncentráció 50µM, míg az MRP3 vezikulák esetében 1 µM volt. A RIF (12,5; 25; 50; 100; 200 µM), a BB (6,25; 12,5; 25; 50 µM) koncentráció függő módon gátolta az MRP2 mediált E217βG transzportot (23/A, 23/B). A PR (23/C ábra) az alkalmazott koncentrációkban (6,25; 12,5; 50; 100; 200 µM) fokozta az MRP2 mediált E217βG transzportot (133%, 136%;165%; 182%; 195%). Az IM (6,125; 12,5; 25; 50; 100; 200 µM) szintén növelte az MRP2 aktivitást (106%; 128%; 172%; 204%; 137%). Kísérleteinkben az IM aktiváló hatása kb. 133 µM-ig fokozódott, majd 400 µM-nál csökkenni kezdett (23/D ábra). A CL (25; 50; 100; 200 µM) nem befolyásolta az MRP2 mediált E217βG transzportot (az adatok nincsenek bemutatva). Meghatároztuk IC50 értékeket MRP2 vezikulákra 50 µM

8,00

14,00

7,00

12,00

pmol/mg protein/perc

pmol/mg protein/perc

szubsztrát koncentráció mellett: BB (20 µM); RIF (50 µM).

6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00

10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00

0,00 0

100

200

300

0

400

20

40

60

80

100

BB koncentráció

RIF koncentráció

BB hatása az MRP3 mediált E217βG (2µM) transzportra

60,00 50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 0,00 0,00

50,00

100,00

150,00

pmol/mg protein/perc

24/B ábra

RIF hatása az MRP3 mediált E217βG (2µM) transzportra p m o l/m g p ro te in /p e rc

24/A ábra

200,00

20,00 15,00 10,00 5,00 0,00 0

IM koncentráció

50

100

150

200

CL koncentráció

24/C ábra

24/D ábra

IM hatása az MRP3 mediált E217βG (2µM) transzportra

CL hatása az MRP3 mediált E217βG (2µM) transzportra

- 58 -

EREDMÉNYEK

MRP3 tartalmú vezikulákon a RIF 50; 100; 200; 400 µM koncentráció tartományban 1 µM szubsztrát koncentráció mellett gátolta (77%; 83%; 65%; 28%) az MRP3 aktivitást (24/A ábra). A BB gátló hatása 50 µM-nál jelentkezett (68%) és 100 µM-nál az MRP3 aktivitás 23%-ra csökkent (24/B ábra). Az IM kettős hatást gyakorolt az MRP3 mediált E217βG transzportra (24/C ábra) kis koncentrációban (6,25; 12,5 µM) gátolta (63%, 89%), míg nagyobb koncentrációban (25, 50, 100, 200 µM) fokozta az MRP3 aktivitást (176%, 384%, 990%, 311%). A CL a vizsgált koncentrációkban (12,5; 25; 50; 100; 200 µM) nem befolyásolta az MRP3 aktivitását (24/D ábra). Az MRP3 transzporterekre is meghatároztuk az IC50 értékeket: RIF 150 µM és BB 69 µM.

- 59 -

EREDMÉNYEK

5.14 Eredmények összefoglalása

1. Módszert dolgoztunk ki az irodalomból jól ismert citokróm P-450 induktorok UGT1A1 enzimaktivitására gyakorolt hatásának vizsgálatára primer májsejt „monolayeren”, mely a diazotált BG spektrofotometriás meghatározásán alapult. Megállapítottuk, hogy a sejtkultúra idejének függvényében változik a bilirubin konjugáció sebessége: a letapadástól számított 4 órára az UGT1A1 aktivitás a kezdeti, sejtszuszpenzióban mérhető aktivitás 10%-ra csökken. Ezt követően folyamatosan emelkedik, majd 72 órában éri el a szuszpenzióban mérhető kezdeti aktivitást, amely ezután már nem változik. A 72 órás sejtkultúra már alkalmas a bilirubin UDPglukuronsavval történő konjugációjának vizsgálatára. A 4 órás kultúra vizsgálata során azt tapasztaltuk, hogy BG közel 90%-a az intracelluláris kompartmentekben akkumulálódott, amely a transzportproteinek csökkent működésére utal. 2. 96 órás primer rigid patkány hepatocita kultúrában: •

a vizsgált induktorok (CL, RIF, DEX) a MC kivételével szignifikáns módon fokozták (176%; 168%; 178%) a bilirubin konjugáció sebességét

•

a DEX (0,1; 1; 10 µM) koncentrációfüggő módon fokozta a bilirubin konjugáció mértékét (133%; 150%; 178%)

•

a CL+DEX kombináció további aktivitásfokozódást (210%) eredményezett

A DEX, RIF, CL kezelés hatására kialakuló enzimaktivitás fokozódás hátterében megnövekedett UGT1A1 expresszió állt, mely jelenséget Western-blot analzissel igazoltunk, tehát az UGT1A1 aktivitása fokozható volt a már ismert citokróm P-450 induktorokkal. 3. Rigid sejtkultúrában nem vizsgálható a polarizált májsejtek szinuszoidális és kanalikuláris transzport proteinjeinek aktivitása, ezért bevezettük a kollagén szendvics kultúrát. Módszert dolgoztunk ki a BG szinuszoidális és kanalikuláris transzportjának meghatározására humán és patkány primer hepatocita kultúrában. Megállapítottuk, hogy humán és patkány szendvics kultúrában a szinuszoidális és a kanalikuláris BDG/BMG arány nagymértékben hasonlít az in vivo paraméterekhez. Igy a kollagén szendvics kultúrában tartott májsejtek nem csak morfológiai, hanem funkcionális szempontból is hasonlítanak az in vivo környezetben található sejtekre. - 60 -

EREDMÉNYEK

A szinuszoidális és kanalikuláris transzport membrán specifikus működését egy szinuszoidális transzportszubsztráttal teszteltük (p-nitrofenol-glukuronid (pNPG)). A szubsztrát nem került számottevő mértékben a csatornákba, míg a kanalikuláris transzportszubsztrát, a BG igen, tehát a módszer alkalmas a szinuszoidális és a kanalikuláris transzport aktivitás meghatározására. 4. Primer patkány hepatocita szendvics kultúrában a vizsgált induktorok: •

a szinuszoidális effluxot növelték: DEX (144±9%), CL (144±47%), RIF (181±50%), PB (146±40%)

•

a kanalikuláris effluxot növelték: DEX (122±23%), RIF (138±29%), PB (105±21%)

• a kanalikuláris effluxot csökkentették: CL (42±23%) Megállapítható, hogy valamennyi vizsgált induktor elsősorban a BG szinuszoidális effluxát fokozta, míg a kanalikuláirs effluxot kevésbé. A CL a kanalikuláris effluxot szignifikáns mértékben gátolta, mely jelenség nem figyelhető meg primer rigid kultúrában. A CL kanalikuláris BG efflux gátló hatása egy szelektív MRP2 gátlószer felismeréséhez vezethet. Igy a továbbiakban a CL gátlószerként való alkalmazását is vizsgáltuk. 5. Primer patkány hepatocita szendvics kultúrában a vizsgált gátlószerek: • a szinuszoidális effluxot növelték: RIF (202±28%) •

a szinuszoidális effluxot csökkentették: IM (66±26%), CL (91±10%), PR (74±1%)

•

a kanalikuláris effluxot csökkentették: IM (53±21%), CL (74±11%), RIF (24±1%, PR (53±3%)

A RIF kivételével valamennyi gátlószer csökkentette, mind a kanalikuláris mind a szinuszoidális BG effluxot, megállapíthatjuk, hogy ez a módszer alkalmas a kolesztázist okozó transzport gátlószerek vizsgálatára. A módszerrel tanulmányozható a kolesztázis ellen ható kompenzatórikus folyamatok is, úgymint a RIF esetében jelentkező szinuszoidális efflux fokozódás. Hogy megerősítsük a modellrendszerünkben kapott eredményeinket a gátlószerek hatását másik két a transzport proteinek tanulmányozásában kiterjedten alkalmazott rendszerben is megvizsgáltuk.

- 61 -

EREDMÉNYEK

6. Széleskörben alkalmazott specifikus MRP szubsztrát a karboxifluoreszcein-diacetát. Munkánk során vizsgáltuk a festék kanalikuláris felhalmozódásának változását gátlószerek hatására. A CL, BB, RIF csökkentette a fluoreszcencia mértékét a csatornákban, míg IM fokozta. Megállapítható, hogy szendvics kultúrában CDF-DA alkalmazása mellett a vizsgált gátlószerek az IM kivételével, a BG effluxhoz hasonlóan gátolták az MRP2 aktivitást. 7. Szendvics kultúrában a fluoreszcein kanalikuláris felhalmozódásának vizsgálata szemikvantitatív eredményekhez vezetett. A gátlószerek hatását megvizsgáltuk MRP2 vagy MRP3 transzportereket tartalmazó kifordított membrán vezikulákon esztradiolglukuronid alkalmazása mellett. •

MRP2 aktivitást fokozta: IM, PR

•

MRP2 aktivitást csökkentette: IC50(RIF)=50µM, IC50(BB)= 20µM

•

MRP2 aktivitást nem befolyásolta: CL

•

MRP3 aktivitást csökkentette: BB; IC50(RIF)=150µM, IC50(BB)=69µM

•

MRP3 aktivitást nem befolyásolta: IM, CL

Az MRP2 mediált 3H-E217βG transzportot az IM és a PR is fokozta, mely jelenség hátterében a szubsztrátkötő hely és a modulációs hely közötti kooperativitás áll. Az aktiváció és gátlás kialakulása nagymértékben függ a szubsztrát és a gátlószer típusától, illetve koncentrációjától. Az IM és a PR hatására a BG efflux esetében nem figyelhető meg a 3H-E217βG transzport aktivációhoz hasonló jelenség. A BG efflux esetén megfigyelt gátlás egybevág a klinikai megfigyelésekkel, míg a másik két rendszerben a gátlással ellentétes hatás, azaz aktiváció figyelhető meg az IM esetében, mely jelenség nem ad magyarázatot a klinikumban tapasztalt kolesztázisos mellékhatásokra.

- 62 -

MEGBESZÉLÉS

6

MEGBESZÉLÉS

Napjainkban a vegyipar és a gyógyszeripar egyre nagyobb számban állít elő olyan vegyületeket, amelyek komoly kémiai terhelést jelentenek mind az emberi, mind az állati szervezetekre. A kémiai környezet változásához történő adaptáció egyik lehetséges formája a metabolikus enzimindukció43,44. Az indukció során nukleáris transzlokátor receptorok közreműködésével fokozódik az mRNS transzkripció15, amely de novo enzimszintézishez vezet. Ennek következtében gyorsulhat a xenobiotikumok eliminációjának sebessége45. A testidegen molekulák gátolhatják az eliminációban kulcsszerepet játszó transzport folyamatokat is, így az anyavegyület és metabolitjai a sejtben felhalmozódhatnak46. Mivel a metabolizmus központi szerve a máj, így a gátolt transzport következtében felhalmozódó toxikus metabolitok elsősorban a májparenchima sejteket károsítják. A májkárosodás következtében a májfunkciós paraméterek (pl. a bilirubin szintek) romolhatnak47. Munkám célja az volt, hogy olyan modellrendszert dolgozzak ki, melyben egyaránt tanulmányozható a kémiai terhelés ellen irányuló indukciós hatás és a transzport proteinek gátlása. Modell vegyületnek a bilirubint választottuk, mert plazma koncentrációjának változása in vivo is tükrözi a máj mind fiziológiás, mind patológiás állapotát. Első megközelítésben azt vizsgáltuk, hogy az in vitro környezethez történő alkalmazkodás, hogyan

befolyásolja

a

rigid

kollagén

ágyon

tartott

primer

májsejtek

bilirubin

metabolizmusának sebességét. Meghatároztuk a bilirubin UDP-glukuronsavval történő konjugációjának sebességét sejtszuszpenzióban (0 óra), valamint az ültetéstől számított 4, 24, 48, 72 és 96 órában. A sejtszuszpenzióban mért enzimaktivitáshoz képest a 4 órás kultúrában kb. 90%-kal csökkent az enzimaktivitás, majd a sejtkultúra korának függvényében folyamatosan emelkedett, és 72 órában érte el a szuszpenzióban mérhető enzimaktivitás értéket. A bilirubin metabolizmus sebessége ezután már nem változott (8. ábra). A csökkent bilirubin metabolizmus a sejtizolálás következménye lehetett. A sejtizolálás során ugyanis a sejtkapcsoló struktúrákat kémiai és enzimatikus úton is megbontottuk. A kollagenázzal történő emésztést egy hipotermiás és hipoxiás izolálási fázis követte. Csökkenhetett pl. az UDP-glukuronsav mennyisége, az UGT1A1 aktivitása, illetve a bilirubin és a konjugátumainak transzportjában szerepet játszó proteinek aktivitása. A 4 órás májsejteket szaponin kezeléssel vagy ciklikus olvasztással-fagyasztással feltártuk. A permeabilizálást követően UDP-glukuronsav jelenlétében bilirubin-oldattal inkubáltuk. A BG

- 63 -

MEGBESZÉLÉS

mennyiségét diaozotálás révén határoztuk meg. A kezeletlen sejtekhez képest egyik feltárás során sem emelkedett a bilirubin konjugáció sebessége (9. ábra). Ez arra utal, hogy nem az UDP-glukuronsav mennyiségének csökkenése okozta a bilirubin metabolizmus csökkenését. A szaponinos permeabilizálás esetében kissé csökkent a BG keletkezésének sebessége ennek oka az lehetett, hogy a szaponin zavarta a diazoreakciós detektálást. Western-blot analízis segítségével a vizsgált időpontokban megahatároztuk az UGT1A1 szinteket. A sejtek leültetésétől számított 4. órában az UGT1A1 szint nem változott, míg 24 órával később csökkent. A Western-blot analízis alapján megállapíthatjuk, hogy a 4 órás kultúrában még változatlan mennyiségben volt jelen az enzim, de aktivitásának meglétéről vagy hiányáról ez a módszer nem nyújt információt (11. ábra). A 4 órás kutúra UGT1A1 aktivitását úgy határoztuk meg, hogy a sejteket bilirubin-oldattal inkubáltuk, majd a szubsztrát tartalmú médium eltávolítása után a májsejteket 0,5%-os Triton X100-oldattal feltártuk. HPLC-vel történő elválasztás után meghatároztuk a médium és a Triton X100 oldat BG tartalmát. Az inkubáció alatt termelődött BG 90%-a az intracelluláris kompartmentekben volt található (10. ábra). Ez arra utal, hogy az UGT1A1 aktivitása nem csökkent számottevő mértékben, azonban a BG effluxában szerepet játszó transzport proteinek aktivitása igen. Keppler és munkatársai igazolták, hogy a májsejtek az izolálás során elvesztik a polarizált membránstruktúrát, transzport proteineket tartalmazó membrán vezikulák fűződnek le a sejtmembránról48. A folyamat során a transzporterek intracelluláris raktárakba kerülnek. A fagyasztással feltárt sejtek esetében az intracelluláris membránok (intracelluláris membrán vezikulák) nem válnak permeábilissá, míg a tritonos feltárás során igen. A fenti két feltárási kísérletből arra következtethetünk, hogy a keletkező glukuronid feltehetőleg az intracelluláris kompartmentekbe kerül (membrán vezikulákba vagy az ER lumenébe), ugyanis a fagyasztással feltárt sejtek esetén nem kerül BG az inkubációs médiumba, míg a tritonnal feltárt sejtek esetében igen. Lin Wang és James Boyer összefoglaló munkája alátámasztja eredményeinket; igazolták, hogy a transzport proteinek endocitózissal lefűződnek a membránról és átmenetileg intracelluláris raktárakba kerülnek49. A 4 órás rigid májsejt kultúra BG effluxában jelentkező csökkenés munkacsoportunk figyelmét a bilirubin metabolizmusban szerepet játszó transzport proteinekre irányította. Ahhoz, hogy vizsgálni tudjuk a BG transzportot, olyan rendszerre volt szükségünk, melyben a májsejtek megtartják az in vivo jellemző membránpolaritást és az adott membránra jellemző specifikus transzporter lokalizációt. A megoldás kulcsát a kollagén szendvics konfigurációban tartott májsejtek jelentették (14. ábra). - 64 -

MEGBESZÉLÉS

A kollagén szendvics konfigurációban a májsejtek megtartják az in vivo jellemző kubikális sejtmorfológiát (25/B). A rigid kultúrával (25/A) szemben ebben a rendszerben a Golgi és az aktin filamentumok elsősorban az apikális membrán körül lokalizálódnak, fokozott az intercelluláris kommunikáció a réskapcsolatokon keresztül. A differenciációs génprogram expressziója és csökkent DNS szintézis, fokozott májspecifikus transzkripciós faktor expresszió és csökkent protoonkogén aktiváció tapasztalható. Megfigyelték, hogy a szendvics kultúrában tartott májsejtek az életképességüket tovább tartják meg és kevésbé dedifferenciálódnak, mint a konvencionális rigid kultúrában tartott májsejtek. Végsősoron a szendvics konfigurációban tartott májsejtek tulajdonságai jobban közelítik a fiziológiás állapotot, mint a rigid kultúrában tartott májsejteké50. Korábbi tanulmányokban leírták, hogy a fenti konfigurációban tartott májsejtek kiterjedt és összefüggő epevezető rendszert hoznak létre mesterséges körülmények között is51. 25/A ábra Primer rigid májsejt kultúra A fibroblaszt típusú sejtekben a Golgi rendszer a mag közelében helyezkedik el, az in vivo különböző membránon lokalizálódó antigének itt azonos membránon helyezkednek el.

25/B ábra Primer kollagén szendvics májsejt kultúra A Golgi rendszer az apikális membrán környezetében van. A sejtek között tight junction (TJ) figyelhető meg. A membránspecifikus antigének lokalizációja az in vivo-éhóz hasonló.

A bilirubin metabolizmusában számos részfolyamat játszik szerepet pl.: a bilirubin felvétel, az ER transzport, a konjugáció, a szinuszoidális, illetve a kanalikuláris BG efflux. A rigid kultúrában végzett vizsgálatok a fenti folyamatok eredőjét képesek detektálni és nem tesznek különbséget a két eltérő típusú membránon lokalizálódó transzporterek aktivitása között. Az in vivo BG kiválasztás jól ismert folyamatát52 modelleztük primer hepatocita kollagén szendvics kultúrában, melynek célja a szinuszoidális és a kanalikuláris transzport differenciált tanulmányozása. Feltételeztük, hogy a BG egy része bekerül a kanalikuláris rendszerbe, majd a csatornák kalcium megvonással történő dezintegrálása után azok BG tartalma felszabadítható és kvantitatíve meghatározható. - 65 -

MEGBESZÉLÉS

A fenti hipotézis alapját Liu és munkatársai munkája képezte53: kollagén szendvics kultúrában tartott májsejteket kalcium jelenlétében és hiányában ruthénium vörös festékkel inkubáltak. Kalcium jelenlétében az intakt permeábilitási barrier gátolja a festék bejutását a csatornába és annak membránhoz való kötődését. Kalcium hiányában azonban a tight junction dezintegrálódik, a csatornák barrierje áteresztővé válik, így a festék bediffundál a csatorna belsejébe és a kanalikuláris membránhoz kötődik. A kísérlettel igazolták, hogy kalcium jelenlétében az intakt permeabilitási barrier mellett a csatorna tartalma nem közlekedik az extracelluláris térrel, míg kalcium hiányában igen. A 96 órás hepatocita szendvics kultúrában azt tapasztaltuk, hogy a BG konjugátumok kb. 40%-a a szinuszoidális membránon keresztül ürül, míg a csatornákba kb. 60% kerül, ahonnan a kalcium megvonásával felszabadítható (15. ábra). Az in vivo fiziológiásan nem jellemző nagy szinuszoidális BG efflux hátterében az állhat, hogy in vitro körülmények között a májsejtek ugyan megtartják a fiziológiás membrán polaritást, de a transzport proteinek expressziójának mértékében eltérés van. A BG szinuszoidális effluxában szerepet játszó MRP3 overexpresszálódik, ami hozzájárul a vártnál magasabb szinuszoidális effluxhoz54. A hepatocita kultúra nem osztódó sejteket tartalmaz és nem képez konfluens sejtréteget, továbbá a preparátum minősége is befolyásolja a kanalikuláris membránon ürült BG mennyiséget, ugyanis azokban a sejtpreparátumokban, ahol több a „magányos” sejt ott a kanalikuláris rendszer kiterjedése is kisebb, így a csatornákba ürített BG mennyiség kisebb lesz. A BEI értéke megmutatja, hogy egy adott metabolit milyen mértékben ürül a kanalikuláris illetve a szinuszoidális membránon, valamint tükrözi a májsejtpreparátum minőségét. Minél nagyobb a BEI értéke, annál több metabolit ürül a kanalikuláris transzportereken keresztül. A pNP az UGT1A6 hatására UDP-glukuronsavval konjugálódik. A keletkező pNPG moltömege 300-nál kisebb, így az empirikus tapasztalat alapján főleg a szinuszoidális transzportereken keresztül visszakerül a véráramba, majd vizelettel ürül. A pNPG a fenti megfigyelésnek megfelelően nem halmozódott fel számottevő mértékben a csatornákban (15. ábra). A BG BEI értéke humán sejtek esetében 62,5 –nek, míg patkány sejtek esetében 80,6 –nak adódott. Látható, hogy a BG mind humán, mind patkány sejtek esetében főként a kanalikuláris transzportereken keresztül ürül. A BG-al szemben a pNPG BEI értéke 5,2, tehát főként a szinuszoidális transzport proteineken keresztül ürül. Ez az in vitro rendszer jól - 66 -

MEGBESZÉLÉS

tükrözi az in vivo viszonyokat, alkalmas a kanalikuláris MRP2, illetve a szinuszoidális MRP3 mediált BG efflux térbeli elválasztására és tanulmányozására. Már korábbi tanulmányok felvetették, hogy a BDG/BMG arány függ a transzport proteinek aktivitásától55. Kolesztázis során BDG/BMG arány a BDG képződés felé tolódik el. Az emelkedett BDG szint a kolesztázis korai előjele lehet. A 96 órás kultúrában az in vitro szinuszoidális és kanalikuláris BDG/BMG arányt az in vivo epében és szérumban mért aránnyal hasonlítottuk össze. Az in vivo szérumban mért BDG/BMG arány (0,6) majdnem azonos a szinuszoidális efflux BDG/BMG aránnyal (0,55), és az epében mért arány (1,5) pedig majdnem azonos a csatornákban mért aránnyal (1,48). Ezek az eredmények megerősítik, hogy nem csak az irodalomból ismert morfológiai hasonlóság figyelhető meg az in vivo májsejtek és az in vitro szendvics kultúrában tartott hepatociták között, hanem a máj egyik legfontosabb szekréciós tevékenysége, a BG exkréció is hasonló módon működik (16. ábra). A BG MRP szubsztrátként való alkalmazása előnyösebb az általánosan elterjedt szintetikus fluoreszcens festékeknél, mivel az MRP2,3 affinitása nagyobb a BG-hoz, mint a szintetikus szubsztrátokhoz. Így az in vitro hepatocita szendvics kultúrában végzett BG efflux vizsgálatok közelebb állnak a valós fiziológiai folyamatokhoz, mint a szintetikus szubsztrátok alkalmazása mellett folytatott vizsgálatok. A bilirubin metabolizmusát érintő gyógyszeres hatások két típusát vizsgáltuk: indukció, gátlás.

A következő kérdésekre kerestük a választ: 1. Primer rigid májsejt kultúrában vizsgálható-e az UGT1A1 indukciója a különböző mechanizmussal működő induktorok hatására? 2. Primer hepatocita szendvics kultúrában megfigyelhető-e különbség a BG effluxban

szerepet

játszó

kanalikuláris

és

szinuszoidális

transzporterek

indukálhatóságában. 3. A kollagén szendvics kultúra alkalmazásán alapuló módszer alkalmas-e a gyógyszer-indukált kolesztázis in vitro modellezésére, előrejelzésére? A DEX a GR-nak és a PXR-nek is ligandja. A DEX által aktivált PXR az UGT1A1 gén promoterében is megtalálható XRE-hez kötődik és fokozza az mRNS transzkripció sebességét56,57. Eredményeink öszhangban vannak az irodalommal, a növekvő DEX - 67 -

MEGBESZÉLÉS

koncentráció hatására az UGT1A1 aktivitása koncentráció-függően emelkedett (133, 150, 178%; 0,1, 1, 10 µM DEX). A Western-blot analízis alapján a 10µM DEX kezelés hatására az UGT1A1 mennyisége 367%-ra növekedett, tehát valódi indukció történt. A fokozott BG exkrécióban szerepet játszott a megnövekedett UGT1A1 aktivitás (12. ábra). Rágcsáló májsejteken a CL a PPARα-án keresztül fejti ki indukciós hatását, azonban emberben a PPARα expressziója alacsony58. Kísérleteinkben a CL kezelés hatására fokozódott a BG exkréció (176%). A Western-blot analízis alátámasztotta, hogy az emelkedett BG exkréció hátterében szerepet játszhat a megnövekedett UGT1A1 mennyiség. A CL és a 10 µM DEX kombinációja további BG exkréció fokozódáshoz vezetett (210%). Humán májsejtekben a MC az AhR-on keresztül fokozza az UGT1A1 gén átíródását59,60. Li és munkatársai61 leírták, hogy a bilirubin, mint endogén ligand képes az AhR-on keresztül fokozni az UGT1A1 génátíródását62,63. A MC nem fokozta sem a BG exkréció mértékét, sem az UGT1A1 enzim mennyiségét vizsgálataink során. A RIF indukciós hatását a PXR-on keresztül fejti ki64,65. Vizsgálatainkban a RIF fokozta az UGT1A1 mennyiségét (250%) és így a BG exkréció mértékét (168%). A fokozott BG exkrécióban a megnövekedett UGT1A1 aktivitás játszott szerepet (13. ábra). A kémiai inger hatására a legtöbb esetben fokozódott a májsejtek UGT1A1 aktivitása (kivéve MC). A májsejtek a kémiai környezet megváltozásához történő adaptációjuk során fokozták a metabolizáló rendszer kapacitását és ezt reprezentálja az UGT1A1 aktivitás fokozódása. A kémiai terheléshez történő alkalmazkodás nemcsak a fázis I és fázis II folyamatokat érinti, hanem a transzport proteinek működését is. A transzport proteineken keresztül zajló adaptációs folyamatok vizsgálatára jól alkalmazható a fenti modell. A májat érintő gyógyszer mellékhatások közel 17%-a akut kolesztázis21, aminek következtében felborulhat a máj metabolikus homeosztázisa. A gyógyszerindukált kolesztázis klinikai manifesztációja a prekolesztatikus és antikolesztatikus folyamatok egyensúlya mellett nagymértékben függ az egyén farmakogenetikai adottságaitól (pl. genetikai polimorfizmus)66. A gyógyszerindukált kolesztázist létrehozó prekolesztatikus folyamatok hátterében vagy közvetlenül a transzport fehérjék gátlása áll, vagy a transzport aktivitás csökkenése egyenes következménye a toxikus májártalomnak. Az antikolesztatikus folyamatok a prekolesztatikus hatásokat kompenzálják alternatív hepatikus és renális útvonalakon keresztül: a gátolt kanalikuláris transzport aktivitás hatására a toxikus metabolitok intracelluláris koncentrációja emelkedik, ennek hatására a májsejtek szinuszoidális membránjában megnövekszik az MRP3 - 68 -

MEGBESZÉLÉS

mennyisége. A fokozott szinuszoidális transzport aktivitás átveszi a csökkent kanalikuláris transzport működést, így az epével szekretálódó molekulák a vérbe kerülnek, majd a vesén keresztül ürülnek67. A fenti antikolesztatikus hatásokat először az obstrukciós kolesztázis és a bevezetésben részletesen ismertetett Dubin-Johnson syndroma esetében írták le. A különböző etiológiával bíró kolesztázis típusok közös vonása a csökkent bilirubin exkréció, amit a szérum bilirubin szintek emelkedése követ21. A BG exkréció változása primer hepatocita szendvics kultúrában a gyógyszerindukált kolesztázis in vitro markere lehet. A konvencionális rigid kultúra alkalmazásával végzett indukciós kísérletek nem adnak választ arra a kérdésre, hogy milyen mértékben változik meg a szinuszoidális és a kanalikuláris transzport proteinek aktivitása (15. ábra). A fenti kérdést a fiziológiás szubsztrátként alkalmazott BG és a már ismert kollagén szendvics konfigurációban tartott májsejtek kombinációjának segítségével próbáltuk megválaszolni. MRP2, illetve MRP3 proteineket érintő gyógyszer interakciók vizsgálata primer hepatocita szendvics kultúrában

A továbbiakban néhány, a klinikai gyakorlatban jelentős gyógyszer vegyület MRP2 és MRP3 transzport proteineket érintő interakcióját tárgyalom. A RIFAMPICIN esetében kettős interakció figyelhető meg, úgymint indukció illetve transzport gátlás. A vegyület széles körben alkalmazott antituberkulotikum, melyet elsősorban kombinációban alkalmaznak izoniaziddal és/vagy pirazinamiddal68. A RIF több megfigyelt esetben okozott klinikai tüneteket eredményező kolesztázist. Ennek ellenére számtalan közleményben leírták azt, hogy a RIF antikolesztatikus hatással is rendelkezik69. Továbbá a kolesztázisos pruritus kezelésére is kiterjedten alkalmazzák70. Szintén irodalmi adatok alapján a RIF-t úgy ismerjük, mint diagnosztikumot a Gillbert-kór esetében71,72; egyszeri orális dózis után szignifikánsan emelkedik a szérum bilirubin szintje. A RIF a fenti hatásokon felül, ahogy azt korábban írtam, indukciós tulajdonsággal is rendelkezik, mint PXR ligand fokozza a bilirubin metabolizmusában kulcsszerepet játszó UGT1A1 és MRP2 aktivitását73,74. A RIF által okozott interakció az uptake proteinek gátlásában is jelentkezik75. A kezeletlen 96 órás hepatocita szendvics kultúrában a RIF nagymértékben csökkentette a BG kanalikuláris, és ezzel egyidőben fokozta szinuszoidális effluxát (21. ábra). A jelenség hátterében a megnövekedett mennyiségű kémiai anyag eliminálását célzó kompenzációs folyamat állhat, amelyet a RIF hatására kialakuló kanalikuláris MRP2 gátlás idézhet elő. A kanalikuláris transzport proteinek gátlása a BG és egyéb toxikus anyagok, mint például a RIF- 69 -

MEGBESZÉLÉS

el kombinációban alkalmazott pirazinamid és izoniazid intracelluláris akkumulációjához vezet, így fokozódik a toxikus anyagok sejtkárosító hatása. A szinuszoidális transzport aktivitás fokozódása az intracelluláris akkumuláció ellen hat, így csökken a metabolitok toxikus hatása. A gátlással párhuzamosan megfigyelhető szinuszoidális efflux fokozódás hátterében a szinuszoidális membrán megnövekedett MRP3 aktivitása állhat, amely létrejöhet pl. transzlokáció útján14. A májsejtekben intracelluláris membrán vezikulákban tárolódnak a transzport proteinek. A sejtmembrán és az intracelluláris raktár között dinamikus vezikuláris membránforgalom van. A membránforgalom a mikrotubulus rendszer közreműködésével zajlik. A sejtmembrán transzport kapacitása a szükségleteknek megfelelően nő vagy csökken76. A konfokális lézermikroszkópiával készített felvételeken jól látható, hogy a RIF gátolja a fluoreszcens szintetikus MRP szubsztrát, a CDF kanalikuláris rendszerbe történő bejutásátát, ami megerősíti azt, hogy a RIF gátolja az MRP2 aktivitását és alátámasztja a bilirubinnal végzett kísérletek eredményét (22/C ábra). A krónikus adagolás során a vizsgált vegyületek közül a RIF bizonyult a leghatásosabb induktornak (20. ábra). A szinuszoidális MRP3 aktivitás fokozódás a RIF indukciós hatásának az eredménye. Luttringer és társai leírták, hogy RIF kezelés hatására az MRP3 mRNS szint fokozódott, míg az MRP2 nem77. Más irodalmi adatok arra utalnak, hogy az MRP2 szintén indukálható RIF kezeléssel78. A RIF MRP2 gátló hatását alátámasztják nem csak a fluoreszcens szubsztrát jelenlétében készített felvételek, hanem a vezikulásris 3H-E217βG trasnszport kísérletek is. Megfigyeltük, hogy a 3H-E217βG szubsztrát esetében a RIF az MRP3-at is gátolta (24/A. ábra), de kisebb mértékben. Az 50%-os gátlás MRP2 esetében jóval kisebb koncentrációnál (50 µM) jelentkezik (23/A. ábra), mint MRP3-nál (150 µM). Ez a jelenség az MRP3 fehérjén keresztül történő adaptációt teszi lehetővé, mivel a szinuszoidális transzporter gátlásához magassabb RIF koncentrációra van szükség, így a RIF által gátolt kanalikuláris MRP2 transzportot részben át tudja venni a szinuszoidális MRP3. A KLOFIBRÁT szintén kettős interakciós hatással rendelkezik; jól ismert, az antihiperlipidémiás szerek csoportjába tartozó gyógyszer. Primer hepatocita szendvics kultúrában a CL kezelés hatására a szinuszoidális efflux fokozódott, míg a kanalikuláris efflux nagymértékben csökkent (20. ábra). A CL valószinűleg az MRP3 aktivitást indukció révén fokozta, míg az MRP2 aktivitást gátolta. Az indukciós kísérlethez hasonló eredményt kaptunk - 70 -

MEGBESZÉLÉS

akkor, amikor a 96 órás szendvics kultúrában gátló szerként alkalmaztuk a CL-ot (21. ábra). A szinuszoidális efflux gyakorlatilag nem változott, míg a kanalikuláris efflux szignifikánsan csökkent, de a csökkenés mértéke kisebb volt, mint amit az indukciós kísérletben kaptunk. Az indukciós kísérlet eredményeit alátámaszthatja egy korábbi tanulmány, melyben a CL-al végzett indukció szignifikánsan növelte az MRP3 mRNA szintet, míg az MRP2 mRNA szintet nem79. A rigid kultúrában végzett indukciós kezelés során a CL megemelte a BG efflux mértéket, de ebben a rendszerben a nagy mértékű indukció elfedte az MRP2 gátlását (19. ábra). Ebben a rendszerben a szinuszoidális és a kanalikuláris efflux nem különíthető el. A konfokális lézermikroszkópiával készített felvételeken látható, hogy a CL gátolja a specifikus MRP szubsztrát, a CDF kanalikuláris rendszerbe történő szekretálódását, ami CL esetében megerősítette az MRP2 gátlását, amelynek mértéke jóval kisebb, mint ami a RIF és a BB esetében megfigyelhető (22/D. ábra). A fenti gátló hatásnak látszólag ellentmondanak a kifordított membránvezikulákon végzett transzport kísérletek, ugyanis a CL sem az MRP2, sem pedig az MRP3 mediált 3H-E217βG effluxot nem befolyásolta (24/C). Ennek egyik magyarázata lehet, hogy a három rendszerben eltérő szubsztrátot alkalmaztunk. A PROBENECID urát ürítő tulajdonsága transzport gátló hatásán alapul. Az irodalomból jól ismert mind az apikális efflux (MRP2) gátló tulajdonsága, mind a bazolaterális uptake gátló hatása. A 96 órás hepatocita szendvics kultúrában a PR kis mértékben csökkentette a BG kanalikuláris effluxát, míg a szinuszoidális effluxát gyakorlatilag nem változtatta meg, ami arra utal, hogy jobban gátolta a kanalikuláris MRP2-t, mint a szinuszoidális MRP3-at (21. ábra). Az MRP2 esetében is elsősorban a BDG effluxát gátolta, ezzel azt sugallva, hogy az MRP2-nek nagyobb az affinitása a BMG-hoz, mint a BDG-hoz, mivel BMG efflux gyakorlatilag változatlan maradt a PR jelenlétében. Viszonylag nagy különbséget tapasztaltunk a szinuszoidális és kanalikuláris efflux gátlása között. A mi rendszerünkben valószínűleg az MRP2 efflux gátlás és nem az uptake gátlás volt a számottevő. Mi ugyan ezt nem vizsgáltuk, de irodalmi adatok alapján tudjuk, hogy a PR gátolja a fluoreszcens szintetikus MRP szubsztrát, a CDF kanalikuláris rendszerbe történő szekretálódását is, ami öszhangban van az általunk kapott eredményekkel, hogy a PR gátolja az MRP2 aktivitását80,81.

- 71 -

MEGBESZÉLÉS

A PR fokozta az MRP2 mediált 3H-E217βG transzportot. A jelenség nem ismeretlen az irodalomban, bizonyos vegyületek paradox módon hatnak egyik vagy másik vegyület transzportjára. Bodo és munkatársai leírták, hogy a PR esetében gyenge, de konzekvens allosztérikus aktiváció figyelhető meg az MRP2 mediált 3H-E217βG transzport esetén (23/C. ábra)82. Az INDOMETACIN kiterjedten alkalmazott nem szteroid gyulladáscsökkentő (NSAID). A NSAID vegyületek a klinikumban gyakran okoznak kolesztázist21. Választásunk az IM-ra esett, mert az irodalmi adatok alapján ismert volt, hogy az MRP család több tagjának is inhibitora82,83,. Vizsgálataink során azt tapasztaltuk hasonlóan a többi vizsgált vegyülethez, hogy a BG szinuszoidális effluxát kis mértékben, míg a kanalikuláris effluxát nagymértékben csökkentette, ez arra utal, hogy az IM mind az MRP2-t, mind az MRP3-at gátolja, de nem egyforma mértékben (21. ábra). Nem tapasztaltuk a RIF esetében jelentkező szinuszoidális efflux kompenzatórikus fokozódását. A rutin laboratóriumi tesztek során a totál és direkt bilirubin szinteket határozzák meg, ami nem tesz különbséget a BDG és BMG között. Ahogy korábban írtam, a BDG/BMG arány eltolódása a BDG irányába a kolesztázis korai előjele lehet. A HPLC analízis alkalmazása lehetővé teszi a BMG és BDG arány változásainak detektálását is. Ez esetben szignifikáns csökkenést a kanalikuláris BDG és szinuszoidális BMG esetében tapasztalunk, amíg a kanalikuláris BMG és szinuszoidális BDG nem változott szignifikánsan. A konfokális lézermikroszkópiával készített felvételeken látható, hogy az IM nem gátolta, sőt inkább fokozta a CDF szekretálódását a kanalikuláris rendszerbe (22/E. ábra). Ezt a jelenséget allosztérikus aktivációval magyarázhatjuk. Az IM kis szubsztrát koncentrációnál aktiválja az MRP2-t (23/D. ábra). Az MRP2 és MRP3 aktiválhatóságában a nagy szubsztrát átfedés ellenére különbség van, aminek fontos szerepe van a fiziológiás epeszekrécióban82. Az MRP2-re nagy vmax és kapacitás jellemző, míg az MRP3-ra alcsony. Normál körülmények között a kis affinitású pumpa rendszer a metabolitokat az epébe juttatja. A nagy affinitású, de kis kapacitású MRP3 csak a nagy affinitású metabolitokat juttatja a szinuszoidokba, amelyek később vizelettel ürülnek. Normál körülmények között az alacsony szinuszoidális effluxhoz hozzájárul az intracelluláris metabolitok kompetitív gátlása82. A BB kis koncentrációban fokozta, míg nagyobb koncentrációban gátolta az MRP3 mediált 3H-E217βG transzportot (24/B. ábra). Széleskörben tanulmányozott a stimulatív kotranszport jelensége, mely kis szubsztrát koncentrációnál (1 µM) pl. PR és IM esetében is megfigyelhető. Magasabb gátlószer koncentrációval a transzport proteinek gátolhatóak. - 72 -

MEGBESZÉLÉS

A FENOBARBITÁL és a DEXAMETAZON az irodalomból jól ismert induktorok. A DEX főként a PXR-on keresztül fejti ki hatását84, a PB a CAR-on keresztül85. A PB UGT1A1 aktivitást fokozó hatását használták ki az újszülöttkori sárgaság kezelésénél86. Mindkét receptor szerepet játszik az UGT1A1 és az MRP2 regulációjában. PB indukció hatására fokozódik az MRP3 mRNS és protein szint is87,88. Cherrington és munkatársai igazolták, hogy ez független a CAR aktiválódásától89. A PB kezelés a mi rendszerünkben fokozta az MRP3 aktivitást, míg az MRP2 aktivitás nem változott (20. ábra). Fiziológiás glukokortikoid (DEX) szint mellett a GR és CAR/PXR receptorok közösen szabályozzák a transzporterek és az UGT1A1 aktivitását. Korábban leírták, hogy DEX hatására növekszik az MRP2 mRNS szintje90, míg mások azt találták, hogy az MRP3 expresszió is fokozódik79. Vizsgálataink során a DEX a szinuszoidális és a kanalikuláris effluxot egyaránt fokozta, ez a megfigyelés öszhangban áll a korábbi irodalmi tapasztalatokkal (20. ábra). Munkacsoportunk három különböző módszerrel vizsgálta a gátlószerek hatását a transzport proteinek aktivitására: BG efflux és CDF kanalikuláris akkumuláció hepatocita szendvics kultúrában;

valamint

3

H-estradiol-17β-D-glukuronid

transzport

kifordított

membrán

vezikulában. Megállapíthatjuk, hogy a három különböző módszerrel végzett gátlási vizsgálatokat csak bizonyos megszorításokkal hasonlíthatjuk össze: 1. A kollagén szendvics konfigurációban végzett gátlás vizsgálatok során nem csak a transzport proteinekre gyakorolt gátló hatás, hanem a májsejtekben működő prekolesztatikus hatások is jelentkeznek (pl. RIF). Ezzel szemben a vezikuláris transzport esetében az aktuálisan tanulmányozott transzport fehérje-szubsztrát-gátlószer kölcsönhatás vizsgálható, mely rendszer független a sejt regulációs folyamataitól. Az utóbbi módszer alkalmas arra, hogy egy egyedi transzport fehérje tulajdonságait vizsgáljuk, míg az előbbi hozzájárulhat a gyógyszerindukált kolesztázis mechanizmusainak mélyebb megértéséhez. 2. Az alkalmazott szubsztrátok (BG, 3H-E217βG, CDF) különböző mértékben kötődnek a transzport fehérjékhez. A gátlás mértéke függ a szubsztrát és az alkalmazott gátlószer kinetikai paramétereitől (KM, vmax).

- 73 -

MEGBESZÉLÉS

Dolgozatom célja volt azt bemutatni, hogy a bilirubin konjugációján keresztül modellezhető a az élő szervezetek változó kémiai környezethez történő adaptációja. Elsőként számoltunk be arról, hogy a BG szekréciója a sejtkultúra első négy órájában drámaian csökken. Feltételezésünk szerint ennek oka a transzport proteinek lefűződése a membránról. Továbbá megállapítottuk, hogy modell-rendszerünkben az ismert citokróm p450 induktorok (DEX, CL, RIF) a MC kivételével metabolikus enzim indukció révén fokozzák az UGT1A1 aktivitást. A CL UGT1A1 indukciós hatásáról szintén elsőként számoltunk be. Így ez a modellrendszer alkalmas a mennyiségét tekintve egyik leggyakoribb fázis II reakció, az UDP-glukuronsavval történő konjugáció tanulmányozására primer rigid májsejt kultúrában. A BG keletkezése és exkréciója egy komplex, több lépésből álló folyamat, melyben részt vesznek uptake proteinek, az UGT1A1, illetve a kanalikuláris, valamint a szinuszoidális membránon lokalizálódó MRP2, illetve MRP3 transzporterek is. A hepatocita-kollagén szendvics kultúra és a BG, mint specifikus szubsztrát alkalmazásának kombinációja egy olyan módszert eredményezett, amelynek segítségével a két efflux folyamat külön-külön is tanulmányozhatóvá vált. Munkánk során felismertük, hogy az MRP2 és MRP3 transzport proteinek mennyisége eltérő mértékben változik a már ismert citokróm p-450 induktorok hatására. A szendvics konfigurációban tartott májsejtek gátlószerekre adott válaszából kiderül, hogy hatásukra nem egyformán reagál a kanalikuláris és a szinuszoidális efflux. A metabolizáló rendszer a szinuszoidális efflux fokozódásával kompenzálhatja a gátolt kanalikuláris effluxot, mely lehetővé teszi a toxikus kémiai hatás elhárítását. Munkám gyakorlati jelentőségét abban látom, hogy a BG efflux meghatározása primer hepatocita szendvics kultúrában alkalmas lehet a gyógyszer-indukált kolesztázis in vitro előrejelzésére. A vizsgált kolesztatikus hatású gyógyszerek (IM, RIF), illetve transzportgátló szerek (PR, BB) kolesztatikus hatása kimutatható volt a BG effluxának csökkenésén keresztül. Így a gyógyszerjelölt molekulák preklinikai vizsgálata hepatocita szendvics kultúrában előrevetítheti egy súlyos mellékhatás lehetőségét is. Továbbá, eredményeink hozzájárulnak a kolesztázis molekuláris mechanizmusainak mélyebb megértéséhez.

- 74 -

ÖSSZEFOGLALÁS

7

ÖSSZEFOGLALÁS

A bilirubin metabolizmusában kulcsszerepet játszik az UGT1A1 konjugációs enzim, illetve a bilirubin glukuronidok (BG) effluxában a multidrog rezisztenciával kapcsolatos proteinek (MRP2, MRP3). A bilirubin és a BG szérum koncentrációjának változása jól tükrözi a máj mind fiziológiás, mind patológiás állapotát. Munkám célja az volt, hogy in vitro primer hepatocita kultúrában a bilirubin metabolizmusán keresztül modellezzem az emlősök változó kémiai környezethez történő adaptációját. Az adaptációt kiváltó ingert egyrészt indukciós hatású

gyógyszeres

dexametazon),

kezeléssel

másrészt

(rifampicin,

transzport

gátló

klofibrát, vegyületekkel

fenobarbitál,

metilkolantrén,

(indometacin,

probenecid,

benzbromaron) értük el. A BG szekréció a sejtkultúra első négy órájában drámaian csökkent. Ennek oka feltehetőleg az, hogy a transzport proteinek lefűződtek a membránról. Modellrendszerünkben az ismert citokróm P-450 induktorok (dexametazon, klofibrát, rifampicin), a metilkolantrén kivételével, metabolikus enzimindukció révén fokozták az UGT1A1 aktivitást (Jemnitz K, Lengyel G, Vereczkey L. In vitro induction of bilirubin conjugation in primary rat hepatocyte culture. Biochem Biophys Res Commun. 2002;291(1):29-33). Kollagén szendvics konfigurációban tartott májsejteken módszert dolgoztunk ki a kanalikuláris MRP2, illetve a szinuszoidális MRP3 transzport aktivitás izolált tanulmányozására (Lengyel G et al. Canalicular and sinusoidal disposition of bilirubin mono- and diglucuronides in sandwich-cultured human and rat primary hepatocytes. Drug Metab Dispos. 2005;33:1355-60). Hepatocita szendvics kultúrában valamennyi gátlószer nagyobb mértékben gátolta a kanalikuláris effluxot, mint a szinuszoidálisat. A rifampicin esetében a metabolizáló rendszer a szinuszoidális efflux fokozódásával kompenzálta a gátolt kanalikuláris effluxot, mely lehetővé tette a toxikus kémiai hatás elhárítását. Munkám gyakorlati jelentőségét abban látom, hogy a BG efflux meghatározása primer hepatocita szendvics kultúrában alkalmas lehet a gyógyszer-indukált kolesztázis in vitro előrejelzésére. A vizsgált kolesztatikus hatású gyógyszerek (indometacin, rifampicin), illetve transzportgátló szerek (probenecid, benzbromaron) kolesztatikus hatása kimutatható volt a BG effluxának csökkenésén keresztül. Így a gyógyszerjelőlt molekulák BG transzportjának preklinikai vizsgálata hepatocita szendvics kultúrában előre vetítheti egy súlyos mellékhatás lehetőségét (György Lengyel at al, In vitro prediction of drug induced cholestasis using sandwich culture of primary rat hepatocytes (kézirat formájában)).

- 75 -

SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE

8

SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE

Az értekezés témájához kapcsolódó közlemények 1. Jemnitz K, Lengyel G, Vereczkey L. In vitro induction of bilirubin conjugation in primary rat hepatocyte culture. Biochem Biophys Res Commun 2002;291(1):29-33 [IF. 2002: 2.935]. 2. Lengyel G, Veres Z, Szabo P, Vereczkey L, Jemnitz K. Canalicular and sinusoidal disposition of bilirubin mono- and diglucuronides in sandwich-cultured human and rat primary hepatocytes. Drug Metab Dispos 2005;33:1355-60 [IF. 2004: 3.839]. 3. György Lengyel, Zsuzsa Veres, Tünde Molnár, Vereczkey László, Katalin Jemnitz. In vitro prediction of drug induced kolesztázis using sandwich culture of primary rat hepatocytes (kézirat formájában).

Az értekezés témájához szorosan nem kapcsolódó közlemény 4. Csuzdi E, Migleczi K, Hazai I, Berzsenyi P, Pallagi I, Horvath G, Lengyel G, Solyom S. Potential metabolites of a condensed 2,3-benzodiazepine derivative. Bioorg Med Chem Lett. 2005;15:4662-5 [IF.2004: 2.333].

- 76 -

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

9

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Ezúton szeretnék köszönetet mondani témavezetőimnek, Dr. Vereczkey Lászlónak és Dr. Jemnitz Katalinnak, hogy tanítottak és megteremtették a TDK, valamint a Ph.D. munkám elvégzéséhez szükséges feltételeket. Hálával és köszönettel tartozom Dr. Veres Zsuzsának, akitől elsajátítottam a precíz kísérlettervezést és a pontos laboratóriumi munkát. Köszönöm egykori farmakológia professzorom, Dr. Tekes Kornélia támogatását, aki nagy segítségemre volt a nem elsősorban tudományos jellegű problémáim megoldásában. Köszönettel tartozom Dr. Szabó Pálnak a tömegspektrometriás mérésekért; Lasztóczi Bálintnak a fénymikroszkópiás felvételekért; Molnár Tündének a konfokális mikroszkópiás felvételekért; Dr. Krajcsi Péternek és a SOLVO Rt.-nek a vezikula transzport kísérletekért. Végezetül hálával tartozom családomnak türelmükért és szeretetükért.

"Az élet értelme a Küzdele.m A győzelem vagy a vereség az Istenek kezében van. Ünnepeljük hát a Küzdelmet!" (Szuahéli csatadal)

- 77 -

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

10 IRODALOMJEGYZÉK 1

Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P. Molecular Biology of the Cell. New York and London: Garland Science; 2002: Figure 22-21. The structure of the liver (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=mboc4).

2

Boyer JL. Nuclear receptor ligands: rational and effective therapy for chronic cholestatic liver disease? Gastroenterology 2005;129(2):735-40.

3

Hagenbuch B, Meier PJ. The superfamily of organic anion transporting polypeptides. Biochim Biophys Acta 2003;1609(1):1-18.

4

Tirona RG, Kim RB. Pharmacogenomics of organic anion-transporting polypeptides (OATP). Adv Drug Deliv Rev 2002;54(10):1343-52.

5

Faber KN, Muller M, Jansen PL. Drug transport proteins in the liver. Adv Drug Deliv Rev 2003;55(1):107-24.

6

Schinkel AH, Jonker JW. Mammalian drug efflux transporters of the ATP binding cassette (ABC) family: an overview. Adv Drug Deliv Rev 2003;55(1):3-29.

7

Pauli-Magnus C, Stieger B, Meier Y, Kullak-Ublick GA, Meier PJ. Enterohepatic transport of bile salts and genetics of cholestasis. J Hepatol 2005;43(2):342-57.

8

Chan LM, Lowes S, Hirst BH. The ABCs of drug transport in intestine and liver: efflux proteins limiting drug absorption and bioavailability. Eur J Pharm Sci 2004;21(1):25-51.

9

Dietrich CG, Geier A, Oude Elferink RP. ABC of oral bioavailability: transporters as gatekeepers in the gut. Gut 2003;52(12):1788-95.

10

Fardel O, Payen L, Courtois A, Vernhet L, Lecureur V. Regulation of biliary drug efflux pump expression by hormones and xenobiotics. Toxicology 2001;167(1):37-46.

78

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

11

Kipp H, Arias IM. Trafficking of canalicular ABC transporters in hepatocytes. Annu Rev Physiol 2002;64:595-608.

12

Lecureur V, Courtois A, Payen L, Verhnet L, Guillouzo A, Fardel O. Expression and regulation of hepatic drug and bile acid transporters. Toxicology 2000;153(1-3):203-19.

13

Crocenzi FA, Mottino AD, Roma MG. Regulation of synthesis and trafficking of canalicular transporters and its alteration in acquired hepatocellular cholestasis. Experimental therapeutic strategies for its prevention. Curr Med Chem 2004;11(4):501-24.

14

Kullak-Ublick GA, Stieger B, Meier PJ. Enterohepatic bile salt transporters in normal physiology and liver disease. Gastroenterology 2004 Jan;126(1):322-42.

15

Tirona RG, Kim RB. Nuclear receptors and disposition gene regulation. J Pharmaceutical Sciences 2005;94:1169-1186.

16

Nies AT, Cui Y, König J, Keppler D. Transport of bilirubin conjugates across hepatocellular membrane domains and the conjugated hiperbilirubinemia of Dubin-Johnson Syndrome. In: Traunen M, Jansen P, editors. Molecular Pathogenesis of Cholestasis, Eurekah.com. 2003:199214.

17

Iyanagi T, Emi Y, Ikushiro S. Biochemical and molecular aspects of genetic disorders of bilirubin metabolism. Biochim Biophys Acta 1998;1407(3):173-84.

18

Zucker SD, Goessling W. Mechanism of hepatocellular uptake of albumin-bound bilirubin. Biochim Biophys Acta 2000;1463(2):197-208.

19

Mackenzie PI, Gregory PA, Gardner-Stephen DA, Lewinsky RH, Jorgensen BR, Nishiyama T, Xie W, Radominska-Pandya A. Regulation of UDP glucuronosyltransferase genes. Curr Drug Metab. 2003;4(3):249-57.

20

Tierney LM, McPhee SJ, Papadakis MA. Korszerű orvosi diagnosztika és terápia 1996. Melania Kft. Budapest.

79

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

21

Chitturi S, Farrell GC. Drug-induced cholestasis. Semin Gastrointes Dis 2001;12:113-124.

22

Scala S, Akhmed N, Rao US, Paull K, Lan LB, Dickstein B, Lee JS, Elgemeie GH, Stein WD, Bates SE. P-glycoprotein substrates and antagonists cluster into two distinct groups. Mol Pharmacol 1997;51(6):1024-33.

23

Leier I, Jedlitschky G, Buchholz U, Keppler D. Characterization of the ATP-dependent leukotriene C4 export carrier in mastocytoma cells. Eur J Biochem 1994;220(2):599-606.

24

Yamazaki M, Neway WE, Ohe T, Chen I, Rowe JF, Hochman JH, Chiba M, Lin JH. In vitro substrate identification studies for p-glycoprotein-mediated transport: species difference and predictability of in vivo results. J Pharmacol Exp Ther 2001;296(3):723-35.

25

Evers R, Zaman GJ, van Deemter L, Jansen H, Calafat J, Oomen LC, Oude Elferink RP, Borst P, Schinkel AH. Basolateral localization and export activity of the human multidrug resistanceassociated protein in polarized pig kidney cells. J Clin Invest 1996;97(5):1211-8.

26

Hooijberg JH, Broxterman HJ, Heijn M, Fles DL, Lankelma J, Pinedo HM. Modulation by (iso)flavonoids of the ATPase activity of the multidrug resistance protein. FEBS Lett 1997;413(2):344-8.

27

Robey RW, Honjo Y, van de Laar A, Miyake K, Regis JT, Litman T, Bates SE. A functional assay for detection of the mitoxantrone resistance protein, MXR (ABCG2). Biochim Biophys Acta 2001;1512(2):171-82.

28

Bayliss MK, Skett P. Human Cell Culture Protocols. 1996;369-389, Humana Press, New Jersey.

29

Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Meth Cell Biol 1976;13:29-83.

30

Van der Hoeven, T. A. and Coon, M. J. Preparation and properties of partially purified cytochrome P-450 and reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-cytochrome P-450 reductase from rabbit liver microsomes. J Biol Chem 1974;249:6302-10.

80

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

31

Lowry OH, Rosenbrough NJ, Farr AL, Randall J. Protein measurment with the folin phenol reagent. J Biol Chem 1951;193:265-75.

32

Burchell, B Bilirubin UDP glucuronyltransferase. In Methods in Enzymology Vol. 77. (Jakoby, W. B. ed.) 1981;188-192. Academic Press, New York.

33

Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 1970;227:680-685.

34

Towbin, H, Staehelin, T, and Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci USA 1979;76:4350-4.

35

Pollard-Knight D, Read CA, Downes MJ, Howard LA, Leadbetter MR, Pheby SA, McNaughton E, Syms A, Brady MA. Nonradioactive nucleic acid detection by enhanced chemiluminescence using probes directly labeled with horseradish peroxidase. Anal Biochem 1990;185:84-89.

36

Koebe HG, Pahernik S, Eyer P, Schildberg FW. Collagen gel immobilization: a useful cell culture technique for long-term metabolic studies on human hepatocytes. Xenobiotica 1994;24(2):95-107.

37

Bakos E, Hegedus T, Hollo Z, Welker E, Tusnady GE, Zaman GJ, Flens MJ, Varadi A, Sarkadi B. Membrane topology and glycosylation of the human multidrug resistance-associated protein. J Biol Chem 1996;271(21):12322-6.

38

Bakos E, Evers R, Szakacs G, Tusnady GE, Welker E, Szabo K, de Haas M, van Deemter L, Borst P, Varadi A, Sarkadi B. Functional multidrug resistance protein (MRP1) lacking the Nterminal transmembrane domain. J Biol Chem 1998;273(48):32167-75.

39

Muller M, Bakos E, Welker E, Varadi A, Germann UA, Gottesman MM, Morse BS, Roninson IB, Sarkadi B. Altered drug-stimulated ATPase activity in mutants of the human multidrug resistance protein. J Biol Chem 1996;271(4):1877-83.

81

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

40

Bakos E, Evers R, Sinko E, Varadi A, Borst P, Sarkadi B. Interactions of the human multidrug resistance proteins MRP1 and MRP2 with organic anions. Mol Pharmacol 2000;57(4):760-8.

41

Brower JO, Lightner DA, McDonagh AF. Aromatic congeners of bilirubin: synthesis, sterochemistry, glucuronidation and hepatic transport. Tetrahedron 2001;57:7813-7827.

42

Mesa VA, De Vos R, Fevery J. Elevation of the serum bilirubin diconjugate fraction provides an early marker for cholestasis in the rat. J Hepatol. 1997;27(5):912-6.

43

Nebert DW. The Ah locus: genetic differences in toxicity, cancer, mutation, and birth defects. Crit Rev Toxicol 1989;20(3):153-74.

44

Honkakoski P, Zelko I, Sueyoshi T, Negishi M. The nuclear orphan receptor CAR-retinoid X receptor heterodimer activates the phenobarbital-responsive enhancer module of the CYP2B gene. Mol Cell Biol 1998;18(10):5652-8.

45

Pascussi JM, Gerbal-Chaloin S, Daujat M, Drocourt L, Pichard-Garcia L, Vilarem MJ, Maurel P, Klieber S, Torreilles F, Bourrié M, Guillou F, Fabre G. Cyp gene induction by xenobiotics and drugs. Drug Metab Disp 2003;?:337-374.

46

Chan LM, Lowes S, Hirst BH. The ABCs of drug transport in intestine and liver: efflux proteins limiting drug absorption and bioavailability. Eur J Pharm Sci 2004;21(1):25-51.

47

Victor M, Pineiro-Carrero, Eric O Pineiro. Liver. Pediatrics 2004;113:1097-1106.

48

Roelofsen H, Soroka CJ, Keppler D, Boyer JL. Cyclic AMP stimulates sorting of the canalicular organic anion transporter (MRP2/cMoat) to the apical domain in hepatocyte couplets. J Cell Sci 1998;111:1137-45.

49

Wang L, Boyer JL. The maintenance and generation of membrane polarity in hepatocytes. Hepatology 2004;39(4):892-9. Review.

82

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

50

Liu X, Chism P, LeCluyse EL, Brouwer KR, Brouwer KLR. Correlation of biliary excretion in sandwich-cultured rat hepatocytes and in vivo in rats. Drug Metab Dispos 1999;27:637-644.

51

LeCluyse EL, Fix JA, Audus KL, Hochman JH. Regeneration and maintenance of bile canalicular networks in collagen-sandwiched hepatocytes. Toxicol In Vitro 2000;14:117-132.

52

Takashi I, Yoshikazu E, Shin-ichi I. Biochemical and molecular aspects of genetic disorders of bilirubin metabolism. Biochim Biophys Acta 1998;1407:173-187.

53

Liu X, LeCluyse EL, Brouwer KR, Lightfoot RM, Lee JI and Brouwer KLR. Use of Ca2+ modulation to evaluate biliary excretion in sandwich-cultured rat hepatocytes. J Pharmacol Exp Ther 1999;289:1592-1599.

54

Luttringer O, Theil FP, Lavé T, Wernli-Kuratli K, Guentert TW, de Saizieu A. Influence of isolation procedure, extracellular matrix and dexamethasone on the regultaion of membrane transporters gene expression in rat hepatocytes. Biochem Pharmacol 2002;64:1637-1650.

55

Mesa VA, De Vos R, Fevery J. Elevation of the serum bilirubin diconjugate fraction provides an early marker for cholestasis in the rat. J Hepatol 1997;27:912-916.

56

Hartley DP, Dai X, He YD, Carlini EJ, Wang B, Huskey SE, Ulrich RG, Rushmore TH, Evers R, Evans DC. Activators of the rat pregnane X receptor differentially modulate hepatic and intestinal gene expression. Mol Pharmacol 2004;65(5):1159-71.

57

Emi Y, Ikushiro S, Iyanagi T. Xenobiotic responsive element-mediated transcriptional activation in the UDP-glucuronosyltransferase family 1 gene complex. J Biol Chem 1996;271(7):3952-8.

58

Palmer CN, Hsu MH, Griffin KJ, Raucy JL, Johnson EF. Peroxisome proliferator activated receptor-alpha expression in human liver. Mol Pharmacol 1998;53(1):14-22.

59

Ritter JK, Kessler FK, Thompson MT, Grove AD, Auyeung DJ, Fisher RA. Expression and inducibility of the human bilirubin UDP-glucuronosyltransferase UGT1A1 in liver and cultured

83

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

primary hepatocytes: evidence for both genetic and environmental influences. Hepatology 1999;30(2):476-84. 60

Viollon-Abadie C, Bigot-Lasserre D, Nicod L, Carmichael N, Richert L. Effects of model inducers on thyroxine UDP-glucuronosyl-transferase activity in vitro in rat and mouse hepatocyte cultures. Toxicol In Vitro 2000;14(6):505-12.

61

Li YQ, Prentice DA, Howard ML, Mashford ML, Desmond PV. Bilirubin and bile acids may modulate their own metabolism via regulating uridine diphosphate-glucuronosyltransferase expression in the rat. J Gastroenterol Hepatol 2000;15(8):865-70.

62

Sinal CJ, Bend JR. Aryl hydrocarbon receptor-dependent induction of cyp1a1 by bilirubin in mouse hepatoma hepa 1c1c7 cells. Mol Pharmacol 1997;52(4):590-9.

63

Phelan D, Winter GM, Rogers WJ, Lam JC, Denison MS. Activation of the Ah receptor signal transduction pathway by bilirubin and biliverdin. Arch Biochem Biophys 1998;357(1):155-63.

64

Adachi Y, Nanno T, Yamashita M, Ueshima S, Yamamoto T. Induction of rat liver bilirubinconjugating enzymes and glutathione S-transferase by rifampicin. Gastroenterol Jpn 1985;20(2):104-10.

65

Mackenzie PI, Gregory PA, Gardner-Stephen DA, Lewinsky RH, Jorgensen BR, Nishiyama T, Xie W, Radominska-Pandya A. Regulation of UDP glucuronosyltransferase genes. Curr Drug Metab 2003;4(3):249-57.

66

Trauner M, Wagner M, Fickert P, Zollner G. Molecular regulation of hepatobiliary transport systems. J Clin Gasroenterol 2005;39:S111-S124.

67

Keppler D, König J. Hepatic secretion of conjugated drugs and endogenous substances. Seminar Liver Disease 2000;20:265-272.

68

Medinger A. Death associated with rifampin and pyrazinamide 2 month treatment of latent mycobacterium tuberculosis. Chest 2002;121:1710-1712.

84

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

69

Marschall HU, Wagner M, Zollner G, Fickert P, Diczfalusy U, Gumhold J, Silbert D, Fuchsbichler A, Benthin L, Grundstrom R, Gustafsson U, Sahlin S, Einarsson C, Trauner M. Complementary stimulation of hepatobiliary transport and detoxification system by rifampicin and ursodeoxycholic acid in humans. Gastroenterology 2005;129: 476-485.

70

Hofmann AF. Rifampicin and treatment of cholestatic pruritus. Gut 2002;51(5):756-7.

71

Erdil A, Kadayifci A, Ates Y, Bagci S, Uygun A, Dagalp K. Rifampicin test in the diagnosis of Gilbert’s syndrome. Int J Clin Pract 2001;55:81-83.

72

Mousavi S, Malek M, Babaei M. Role of overnight rifampin test in diagnosing Gilbert’s syndrome. Indian J Gastroenterol 2005;24:108-110.

73

Boyer J. Nuclear receptor ligands: rational and effective therapy for chronic cholestatic liver disease. Gastroenterology 2005;129: 735-740.

74

Saini SP, Mu Y, Gong H, Toma D, Uppal H, Ren S, Li S, Poloyac SM, Xie W. Dual role of orphan nuclear receptor pregnane X receptor in bilirubin detoxification in mice. Hepatology 2005;41:497-505.

75

Lau YY, Wu CY, Okochi H, Benet LZ. Ex situ inhibition of hepatic uptake and efflux significantly

changes

metabolism:

hepatic

enzyme-transporter

interplay.

J Pharmacol Exp Ther 2004;308(3):1040-5. 76

Wakabayashi Y, Kipp H, Arias IM. Transporters on demand: Intracellular reservoirs and cycling

of

bile

canalicular

ABC

transporters.

J

Biol

Chem

2006.

(In

press;

http://www.jbc.org/cgi/reprint/R600013200v1) 77

Luttringer O, Theil FP, Lave T, Wernli-Kuratli K, Guentert TW, de Saizieu A. Influence of isolation procedure, extracellular matrix and dexamethasone on the regulation of membrane transporters gene expression in rat hepatocytes. Biochem Pharmacol. 2002;64(11):1637-50.

85

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

78

Marschall HU, Wagner M, Zollner G, Fickert P, Diczfalusy U, Gumhold J, Silbert D, Fuchsbichler A, Benthin L, Grundstrom R, Gustafsson U, Sahlin S, Einarsson C, Trauner M. Complementary stimulation of hepatobiliary transport and detoxification systems by rifampicin and ursodeoxycholic acid in humans. Gastroenterology 2005;129(2):476-85.

79

Maher JM, Cheng X, Slitt AL, Dieter MZ, Klaassen CD. Induction of the multidrug resistanceassociated protein family of transporters by chemical activators of receptor-mediated pathways in mouse liver. Drug Metab Dispos 2005;7:956-962.

80

Horikawa M, Yukio K, Tyson CA, Sugiyama Y. The potential for an interaction between MRP2 (ABCC2) and various therapeutic agents: probenecid as a candidate inhibitor of the biliary excretion of irinotecan metabolites. Drug Metab Pharmacokinet 2002;17:23-33.

81

Zamek-Gliszczynski MJ, Xiong H, Patel NJ, Turncliff RZ, Pollack GM Brouwer KLR. Pharmacokinetics of 5(and 6)- carboxi-2’,7’-dichlorofluorescein and its diacetate promoiety in the liver. J Pharmacol Exp Ther 2003;304:801-809.

82

Bodó A, Bakos E, Szeri F, Váradi A, Sarkadi B. Differential modulation of the human liver conjugate transporters MRP2 and MRP3 by bile acids and organic anions. J Biol Chem 2003;278:23529-23537.

83

Payen L, Courtois A, Campion JP, Guillouzo A, Fardel O. Characterization and inhibition by a wide range of xenobiotics of organic anion excretion by primary human hepatocytes. Biochem Pharmacol 2000;60:1967-1975.

84

Courtois A, Payen L, Guillouzo A, Fardel O. Up-regulation of multidrug resistance-associated protein 2 (MRP2) expression in rat hepatocytes by dexamethasone. FEBS Letters 1999;459:381-385.

85

Sugatani J, Nishitani S, Yamakawa K, Yoshinari K, Sueyoshi T, Negishi M. Transcriptional regulation of human UGT1A1 gene expression: activated glucocorticoid receptor enhances constitutive androstane receptor/ pregnane X receptor-mediated UDP-glucuronosyltransferase

86

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

1A1 regulation with glucucorticoid receptor-interacting protein 1. Mol Pharmacol 2005;67:845-855. 86

Huang W, Zhang J, Chua SS, Qatanani M, Han Y, Granata R. Induction of bilirubin clearance by the constitutive androstane receptor (CAR). Proc Natl Acad Sci USA 2003;100:4156-61.

87

Boyer J. Nuclear receptor ligands: rational and effective therapy for chronic cholestatic liver disease. Gastroenterology 2005;129: 735-740.

88

Kast HR, Goodwin B, Tarr PT, Jones SA, Anisfeld AM, Stoltz CM. Regulation of multidrug resistance-associated protein 2 (ABCC2) by the nuclear receptors pregnane X receptor, farnesoid X-activated receptor, and constitutive androstane receptor. J Biol Chem 2002;277:2908-15.

89

Cherrington NJ, Slitt AL, Maher JM, Zhang XX, Zhang J, Huang W, Wan YJ, Moore DD, Klaassen CD. Induction of multidrug resistance protein 3 (MRP3) in vivo is independent of constitutive androstane receptor. Drug Metab Dispos 2003;31:1315-9.

90

Suzuki H, Sugiyama Y. Single nucleotide polymorphisms in multidrug resistance associated protein 2 (MRP2/ABCC2): its impact on drug disposition. Adv Drug Deliv Rev 2002;54:13111331.

87