SEMMELWEIS EGYETEM DOKTORI ISKOLA MOLEKULÁRIS ORVOSTUDOMÁNYOK (MULTIDISZCIPLINÁRIS ORVOSTUDOMÁNYOK) TUDOMÁNYÁGI DOKTORI ISKOLA Vezető: Dr. Mandl József egyetemi tanár
Ph.D. értekezés
RÁCZ EMŐKE
A humán molekuláris genetika és géndiagnosztika alapjai Című program
Programvezető: Dr. Falus András egyetemi tanár Témavezető: Dr. Kárpáti Sarolta egyetemi tanár
1
MUTÁCIÓANALIZIS ÉS GÉNEXPRESSZIÓS VIZSGÁLATOK DARIER KÓRBAN ÉS HAILEY-HAILEY BETEGSÉGBEN
Dr. Rácz Emőke Budapest, 2005.
Programvezető:
Dr. Falus András egyetemi tanár
Témavezető:
Dr. Kárpáti Sarolta egyetemi tanár Dr. Csikós Márta, Ph.D.
Opponensek:
Dr. Hegyesi Hargita egyetemi adjunktus Dr. Kovács Tünde, Ph.D.
A bíráló bizottság elnöke:
Dr. Falus András egyetemi tanár
A bíráló bizottság tagjai:
Dr. Bodó Imre, Ph.D. Dr. Somogyi Anikó egyetemi docens
2
TARTALOMJEGYZÉK
1 BEVEZETÉS …………………………………………………………………………………9 2 SPECIÁLIS CÉLKITŰZÉSEK…………………………………………………………….10 3 ELMÉLETI HÁTTÉR………………………………………………...……………………..11 3.1. A vizsgált betegségek klinikuma és szövettana………………………………………...11 3.1.1. Darier-kór………………………………………………………………...11 3.1.2. Hailey-Hailey betegség…………………………………………………...18 3.2. A kórképek molekuláris biológiája……………………………………………………..21 3.2.1. Genetika…………………………………………………………………..21 3.2.2. Az intracelluláris kalciumpumpa fehérjék szerkezete és működése……...23 3.2.3. A sejten belüli kalcium homeosztázis és jelátvitel molekuláris alapjai ….27 3.3. Az intracelluláris kalciumkoncentráció szerepe a hámsejtek differenciációjában……..28 4 KLINIKAI ADATOK, ANYAG ÉS MÓDSZER………………………..…………………30 4.1. Betegek klinikai adatai………………………………………………………………...30 4.1.1. Darier-kór………………………………………………………………...30 4.1.2. Hailey-Hailey betegség…………………………………………………...39 4.2. Módszerek………………………………………………………………………………41 4.2.1. Mutációanalízis…………………………………………………………...41 4.2.2. A korai hámsejtdifferenciáció vizsgélata Hailey-Hailey-kórban…… …45 5 EREDMÉNYEK………………………………………………………………...…………...49 5.1. Mutációanalízis…………………………………………………………………………49 5.1.1. Darier-kór…………………………………………………………………….49 5.1.2. Hailey-Hailey betegség……………………………………………………….54 5.2. A korai hámsejtdifferenciáció vizsgélata Hailey-Hailey-kórban………………………56
3
6 MEGBESZÉLÉS……………………………………………………………………………59 7 A MUNKA JELENTŐSÉGE ÉS AZ EREDMÉNYEK HASZNOSITÁSA……………..65 8 KÖSZÖNETNYILVÁNITÁS……………………………………………………………….66 9 IRODALOM…………………………………………………………………………………68 10 Az értekezés témájában megjelent közlemények………………………………….74
4
Összefoglalás Mutációanalízis és génexpressziós vizsgálatok Darier-kórban és Hailey-Hailey betegségben Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Molekuláris Orvostudományok (Multidiszciplináris Orvostudományok) Tudományági Doktori Iskola Vezető: Dr. Mandl József egyetemi tanár
Dr. Rácz Emőke A Darier-kór, más néven dyskeratosis follicularis a pubertás után, kórosan elszarusosott, szemölcsszerű papulákkal jelentkezik a mellkason, háton, arcon. A Hailey-Hailey betegség, avagy krónikus familiáris pemphigus felnőttkorban a nagy hajlatok területén hólyagok, eróziók kialakulásával jár. A két betegség közös sajátossága szövettani képük: mindkettőben a sejtek egymás közötti kapcsolatainak felbomlását (acantholysis) figyelhetjük meg. A kórképek hátterében intracelluláris
kalciumpumpákat
kódoló
gének
mutációit
írták
le:
Darier-kórban
a
szarko(endo)plazmatikus retikulum kalcium ATPázát kódoló ATP2A2 gén, Hailey-Hailey-kórban a Golgi készülék kalcium pumpáját kódoló ATP2C1 gén heterozigóta eltéréseit. Doktori munkám során feladatom volt e két betegségben a magyarországi betegek összegyűjtése és a betegségük hátterében álló genetikai eltérések azonosítása a nemzetközi genetikai adatbázisok bővítése, esetleges régiónkra specifikus genetikai eltérések azonosítása, valamint genotípusfenotípus összefüggések keresése céljából. A University of California, San Francisco (UCSF) bőrgyógyászati kutatócsoportjának munkájába kapcsolódva a hámsejtek differenciációjának folyamatát vizsgáltam Hailey-Hailey betegségben. Magyarországi Darier-kóros betegekben keresve az ATP2A2 gén mutációit, 11 heterozigóta eltérést találtunk, melyből kilenc variációt mi detektáltunk először. Két pontszerű deléció, egy inszerció és egy splice-site módosító introniális báziscsere mellett 6 missense és egy nonsense mutációt írtunk le. Hailey-Hailey kóros betegekben az ATP2C1 gént vizsgálva 3 új mutációt: egy inszerciót, egy
5
nonsense mutációt és egy, a gén promoter szakaszát érintő, 25 bázispár kiesésével járó deléciót találtunk. Hailey-Hailey kóros betegekből származó hámsejtek tenyészetében a korai differenciáció zavarát figyeltük meg.
Programvezető:
Dr. Falus András egyetemi tanár, Ph.D., D. Sc., MTA tag
Témavezető:
Dr. Kárpáti Sarolta egyetemi tanár, Ph.D., D. Sc. Dr. Csikós Márta Ph.D.
A humán molekuláris genetika és géndiagnosztika alapjai című program, Budapest, 2005.
6
Summary Mutation analysis and gene expression studies in Darier’s disease and Hailey-Hailey disease Semmelweis University Ph. D. School Molecular Medicine Chairman: Prof. József Mandl M.D., Ph.D., D.Sc.
Emőke Rácz M.D. Darier’s disease (dyskeratosis follicularis) is a hereditary skin condition characterized by papules and plaques on the seborrheic areas of the skin. Mutations in the ATP2A2 gene encoding the sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase 2 (SERCA2) were identified as the cause of the disease in 1999. Two years later, mutations in the ATP2C1 gene encoding the calcium ATPase of the Golgi (hSPCA1) were identified in the background of Hailey-Hailey disease (benign chronic familial pemphigus), another autosomal dominantly inherited skin disease. The symptoms of Hailey-Hailey disease are superficial bullae and erosions typically in the inguinal and axillar regions, the trunk and the neck. A common characteristic of the two distinct, well-distinguishable diseases is one aspect of the histopathology: in both diseases the separation of keratinocytes (acantholysis) can be seen in the suprabasal layers of the epidermis. The aim of our study was to find Hungarian patients with Darier’s disease and Hailey-Hailey disease, characterize their symptoms and to identify their disease causing mutations. By coupling the results of the mutation analysis to the clinical data of the patients we attempted to reveal genotype-phenotype correlations. Joining the dermatological research unit of the University of California, San Francisco, my task was to compare the process of calcium-induced differentiation of cultured keratinocytes from healthy controls and patients with Hailey-Hailey disease. Studying the ATP2A2 gene in Hungarian patients with Darier’s disease, we found 11 distinct, heterozygous mutations, 9 of which were novel. Besides two deletions, one insertion and a new splice-site generating intronic nucleotid change we detected 6 missense and one non-sense
7
mutations. In the ATP2C1 gene of Hungarian patients with Hailey-Hailey disease we identified three novel heterozygous mutations: one nucleotid change leading to a STOP codon, one insertion and one gross deletion affecting the 5’ noncoding region of the gene. No clear correlation between genotype and phenotype could be observed in this cohort of patients. In our in vitro experiments we found that the levels of involucrin, a marker of the early keratinocyte differentiation was decreased in HHD keratinocytes, while the activation of the involucrin promoter upon calcium stimulation was normal or increased. The degradation of the involucrin mRNA transcripts was increased in HHD keratinocytes. The thesis summarizes the data of the first mutation analysis data in patients with Darier and Hailey-Hailey diseases from Hungary.
Leader of the program: Prof. András Falus Ph.D., D. Sc. Corresponding member of the Hungarian Academy of Sciences Tutor:
Prof. Sarolta Kárpáti M.D., Ph.D., D. Sc. Dr. Márta Csikós M.D., Ph.D.
Basics of Human Molecular Genetics and Gene Diagnostics, Budapest, 2005.
8
1 Bevezetés A Darier-kór, más néven dyskeratosis follicularis a pubertás után, kórosan elszarusosott papulákkal jelentkezik a szeborreás bőrterületeken (pl. mellkason, háton, arcon). Hátterében 1999-ben fedezték fel az endoplazmatikus retikulum kalcium ATP-ázát (SERCA2) kódoló ATP2A2 gén mutációit. Két évvel később egy másik autoszomális dominánsan öröklődő bőrbetegség, a Hailey-Hailey-kór (krónikus benignus familiáris pemphigus) okaként a Golgi készülék kalcium pumpáját (hSPCA1) kódoló ATP2C1 gén mutációit írták le. E kórkép felnőttkorban a nagy hajlatok területén hólyagok, eróziók kialakulásával jár. A két betegség közös sajátossága a sejtek egymás közötti kapcsolatainak szövettani képen megfigyelhető felbomlása (acantholysis) az epidermis szuprabazális rétegeiben. A SERCA2 fehérje az endoplazmatikus retikulum (ER) membránjában helyezkedik el, s működése során egy ATP molekula hidrolízisével két kalciumiont juttat az endoplazmatikus retikulum lumenébe. Ezáltal a citoplazma és az ER lumen kalciumion-koncentrációjának szabályozásában játszik fontos szerepet. A hSPCA pumpa egy ATP molekula bontásával egy kalcium- vagy mangániont juttat a Golgi készülék lumenébe. Szerepet játszik a citoplazmatikus kalciumion-koncentráció és a kalciumionoszcillációk szabályozásában, a citoplazma detoxikációjában mangánion túlsúly esetén, valamint a Golgi készülék és a szekretoros vezikulumok lumeneiben a fehérjék poszttranszlációs módosításához szükséges kalcium- és mangánion-koncentráció biztosításában. Mind a SERCA2, mind a hSPCA1 fehérje a szervezet valamennyi sejtjében megtalálható, ennek ellenére a két betegség tünetei a bőrre korlátozódnak. Nem ismert, hogyan vezetnek a kalciumpumpa-gének mutációi a két betegségben megfigyelhető strukturális eltérésekhez.
9
2 Speciális célkitűzések A Semmelweis Egyetem Bőr- Nemikórtani és Bőronkológiai Klinikáján az elmúlt 10 évben létrejött egy bőrgyógyászati genetikai központ az örökletes bőrbetegségek vizsgálatára. Kezdetben a laboratórium munkája az epidermolysis bullosa csoportba tartozó betegségekre és az ichthyosisokra koncentrált. 2000-ben a Hailey-Hailey betegség genetikai hátterének felfedezése új, izgalmas kutatási területet nyitott a bőrgyógyászati genetikában: ez volt, a Darier-kór után a második, szövettanilag acantholysis által jellemzett bőrbetegség, melynek hátterében intracelluláris kalciumpumpát kódoló gének mutációit írták le. Doktori munkám során feladatom volt e két betegségben a magyarországi betegek vizsgálata, a betegségük hátterében álló genetikai eltérések azonosítása a nemzetközi genetikai adatbázisok bővítése, esetleges régiónkra specifikus genetikai eltérések azonosítása, valamint genotípusfenotípus összefüggések keresése céljából. A University of California, San Francisco (UCSF) bőrgyógyászati kutatócsoportjának munkájába kapcsolódva a hámsejtek differenciációjának folyamatát vizsgáltam Hailey-Hailey betegségben. E laboratórium munkatársai kimutatták, hogy az ATP2C1 gén mutációinak következtében HaileyHailey betegségben a hámsejtekben mérhető bazális intracelluláris kalciumkoncentráció magasabb a normál sejtekben mérhetőnél.[1] Ismert, hogy az epidermis rétegeiben kimutatható kalciumionkoncentráció grádiens elengedhetetlen a hámsejtek normális differenciójához. Feltételezvén, hogy a kalciumion-koncentráció változása hozzájárulhat a kórkép pathomechanizmusához, célul tűztük ki e zavar további vizsgálatát.
10
3 A kutatás háttere 3.1.
A vizsgált betegségek klinikuma és szövettana
3.1.1. Darier-kór (dyskeratosis follicularis; OMIM 124200) Klinikai tünetek Az autoszomális domináns módon öröklődő Darier-kórt (dyskeratosis follicularis) először Darier írta le psorospermosis follicularis vegetans néven 1889-ben. [2] A kórkép gyakorisága 1:36000 és 1:100000 között változik a különböző felmérésekben. A betegség tünetei apró, elszarusodott, vörösesbarna papulák, melyek elsősorban a szeborreás bőrterületeken (arc, mellkas, hát) találhatók (1. ábra, a). A bőrtünetek 6-20 éves korban, leggyakrabban a pubertás körül jelennek meg. A betegség lefolyása krónikus. Néhányan váltakozó enyhülésről ill. súlyosbodásról, mások fokozatos rosszabbodásról számolnak be. A betegség nem rövidíti meg a várható élettartamot.
a b 1. ábra. a: A Darier-kór jellegzetes bőrtünetei vörösesbarna, dyskeratotikus papulák. b: A Darierkór tenyéri tünetei apró, pontszerű behúzódások.
11
A kezdetben megfigyelhető papulákon a betegség előrehaladtával sárgás vagy barnás, hámló felrakódás alakulhat ki. A papulák macerálódhatnak, begyulladhatnak, nedvezéssel, vérzéssel járhatnak; gyakran plakkokká folynak össze, felszínükön papillomatózus massza képződhet. Bakteriális, virális (herpex simplex), gombás felülfertőződésük gyakori. Ismert a betegség hólyagos formája is. A kezek és a lábak dorzális felszínén a betegek kb. felében lapos, bőrszínű vagy barnás, 2-4 mm-es papulák láthatóak; a tenyereken és a talpakon szinte minden betegben tűszúrásnyi behúzódások vannak jelen (1. ábra, b). Körömtünetek esetén a körömlemezek vaskosak, törékenyek, rajtuk hosszanti árkok, alattuk hiperkeratózis figyelhető meg (2. ábra).
2. ábra. A Darier-kórban gyakran látható körömeltérések: törékeny körömlemezek hosszanti árkokkal. Ritkán a nyálkahártyák (szájüreg, nyelőcső, vulva, végbél) is érintettek. A szájban, leggyakrabban a szájpadon fehér, csoportos elhelyezkedésű, közepükön besüppedt papulák látszanak, a bukkális nyálkahártyán olykor „utcakőszerű” mintázatot alakítva ki (3. ábra). Néhány esetben a
12
nyálmirigyekben is leírták a betegségre jellemző szövettani eltéréseket. Ritka komplikáció a kivezetőcsövek elzáródása esetén a nyálmirigyek fájdalmas duzzanata [3]. A kórkép klasszikus formája mellett atípusos klinikai variánsok is előfordulnak. Igy a tünetek ritkán a
Hailey-Hailey-kórhoz
hasonlóan
erozívak,
hólyagosak
lehetnek,
másokban
viszkető,
vesiculobullosus formában jelentkezhetnek.
3. ábra. A Darier-kórban olykor látható szájnyálkahártya-eltérések. A szájpadon fehér, csoportos elhelyezkedésű, közepükön besüppedt papulák látszanak. A betegség egy ritka variánsában vastag palmoplantáris keratoderma súlyosbítja a kórképet. Az akrális haemorrhagiás formában a kezeken és a lábakon alakulnak ki eróziók, berepedések. Meleg, nedvesség, UV sugárzás, mechanikai trauma provokálják a bőrtüneteket, ezért azok nyáron általában súlyosabbak. Szisztémás lithiumkezelés, fenol és etil-klorid spray is súlyosbító ill. a tüneteket kiváltó tényezők lehetnek. Herpes simplex vírus-fertőzés Darier-betegségben ritkán a lázzal, rosszulléttel járó Kaposi-féle varicelliform kiütést okozza, melynek szisztémás antivirális szerekkel való kezelése szükséges. Környezeti anyagokra való kontaktérzékenység olykor provokálja a tüneteket; ezek elkerülhetősége és ezáltal a betegek életminőségének várható javulása miatt az anamnézis alapján érdemes lehet epikután bőrtesztek elvégzése. 13
Szegmentális formák A Darier-kór szegmentális formája is ismert, melyben a Blaschko-vonalak lefutását követő körülírt területen láthatók a generalizált kórképre tipikus papulák, plakkok. A szegmentális Darier-kór szintén pubertás kor után jelentkezik. Társuló kórképek Klinikai megfigyelés, hogy Darier-kóros betegek között a neuropszichiátriai kórképek ill. tünetek gyakorisága nagyobb a normál populációban megfigyelhetőnél. Leírták viselkedési eltérések, tanulási nehézség, epilepszia, skizofrénia, bipoláris affektív zavar, depresszió, mentális retardáció, encephalopathia Darier-kórral való társulását. Retinitis pigmentosa és tünetmentes csontciszták is társulhatnak Darier-betegséghez [4, 5]. Acrokeratosis verruciformis Hopf (MIM 101900) Autoszomális dominánsan öröklődő bőrbetegség [6]. Tünetei a kéz- és lábhátakon, ritkábban a térden, könyéken, alkaron található apró, lapos szemölcsre emlékeztető, bőrszínű vagy vörösesbarna papulák (6. ábra). A tenyereken pontszerű behúzódások, a körmökön a Darier-kórban is megfigyelhető eltérések láthatók.
14
4. ábra. Acrokeratosis verruciformis Hopf. Lapos, bőrszínű papulák a lábháton. Acrokeratosis verruciformis Hopf gyakran társul Darier-kórral. Vitatott, hogy különálló kórképnek tekinthető-e. Szövettani képük különböző: acrokeratosis verruciformisban nem látunk acantholysist és dyskeratosist, bár ezek a Darier-kór akrális tüneteinek biopsziás mintáiban is hiányozhatnak. Dhitavat et al. egy, generációkon keresztül csak acrokeratosis verruciformis Hopf tüneteit hordozó családban az ATP2A2 gén P602L mutációját írta le, ezzel alátámasztva a feltételezést, hogy e kórkép a Darier-kór fenotípus-variánsa lehet [7]. E vitatott kérdés eldöntéséhez több eset feldolgozására van szükség. Terápiás lehetőségek A nyári fellobbanások enyhítésére általános lépésként könnyű ruházat viselése és fényvédelem ajánlható. A mindennapi tisztálkodás során antibakteriális tisztítószerekkel a bakteriális kolonizációt, keratolitikus emolliensekkel a hiperkeratotikus felrakódásokat és az irritációt előzhetjük meg. Helyileg retinoidok hatásosak lehetnek, az általuk okozott irritációt enyhe kortikoszteroidokkal való váltakozó alkalmazással valamint emolliensekkel lehet enyhíteni.
15
Másodlagos felülfertőzés esetén antimikrobiális externák, súlyos esetben szisztémás antimikrobás szerek szükségesek. Szisztémásan retinoidok (isotretinoin és acitretin) hatásosak a Darier-kóros betegek 90%-ában. Mellékhatásaik és az elhagyáskor fellépő súlyosbodás miatt csak a helyi kezelésre nem reagáló, súlyos tünetek esetén javasolhatók. Fogamzóképes korú nőkben fogamzásgátlás kötelező a szisztémás retinoidkezelés ideje alatt, e szerek teratogenitása miatt. Hólyagos vagy hajlati bőrtüneteket a szisztémás retinoid kezelés olykor súlyosbítja, ezért e betegekben használatuk óvatos bevezetése szükséges. A szisztémás retinoidkezelést nem toleráló vagy arra nem reagáló esetekben cyclosporin adása javasolható [8]. Fokális, elmeszesedő tünetek sebészi kimetszése jó megoldás lehet [9]. Irodalmi adatok szerint dermabrázió és lézeres eltávolítás (erbium:YAG lézer) is hosszú távú remissziót eredményezhetnek [10, 11]. Szövettan és ultrastruktúra Szövettani vizsgálat során az epidermis rétegeiben a bazális sejtsorok felett fokális lízist figyelhetünk meg (acantholysis), valamint a résben elszórtan a szomszédos sejtektől elvált, lekerekedett, kóros morfológiájú sejteket. Kerek testeknek vagy corps ronds-nak hívják a stratum spinosumban található nagy, kerek, sötét színű és olykor széttöredezett magvú sejteket, melyek magva körül a citoplazma világos, kerek szalag formájában látszik; grains-nek a stratum corneumban leírt kis, ovális sejteket. Mindezen elváltozások fokálisak; helyükön dermisben perivaszkuláris gyulladásos beszűrődés, felettük hiperkeratózis alakul ki (4. ábra). Ultrastrukturális vizsgálattal látható, hogy az acantholysis hátterében a dezmoszómák számának csökkenése, valamint a tonofilamentumok dezmoszómáktól való elválása áll.(5. ábra) A kerek testek számos lamelláris testet tartalmaznak; e sejtorganellum az elszarusodás későbbi fázisaival társítható. A kerek testek és a „grains” az elszarusodás folyamatának zavarát jelzik (dyskeratosis).
16
5. ábra. A Darier-kór (dyskeratosis follicularis) szövettana. Megfigyelhető a fokozott elszarusodás, szuprabazális acantholysis, valamint a stratum spinosumban a kerek testek (corps ronds).
6. ábra. A Darier-kór ultrastrukturális képe. Látható, hogy a tonofilamentumok elválnak a dezmoszómáktól, s sötét aggregátum formájában a sejmag körül csapzódnak össze.
17
3.1.2. Hailey-Hailey betegség (krónikus benignus familiáris pemphigus; OMIM 16960) Klinikum A kórképet krónikus benignus familiáris pemphigus néven az amerikai Hailey-testvérek írták le 1939-ben [12]. Gyakorisága 1: 40000-100000. A Hailey-Hailey betegség hólyagos tünetekkel jelentkezik, jellemzően a nagyhajlatokban: hónaljban, inguinalisan, vagy a nyakon az élet 2.-3. évtizedében, gyakran még később. Erythemás alapon kialakuló felületes hólyagok jellemzik, melyek könnyen lesodródnak, s a helyükön macerálódó vagy varral fedett eróziók jönnek létre (7. ábra). Gyakran súlyosbítják a klinikai képet krónikus, nedvedző, kellemetlen szagú vegetáció és fájdalmas
berepedések.
Az
elváltozások
heg
nélkül,
gyakran
posztinflammatórikus
hiperpigmentáció hátrahagyásával gyógyulnak. Ritkán a nyálkahártyák (szájüreg, nyelőcső, vulva) is érintettek lehetnek [13-15].
7. ábra. Hailey-Hailey betegség bőrtünete. Gyulladt alapon apró hólyagokat, eróziókat látunk. Kisebb mechanikai traumák, meleg és izzadás elősegíthetik a tünetek kialakulását. A betegség lefolyása
során
sokakban
remissziók
és
fellobbanások 18
váltakoznak,
mások
fokozatos
rosszabbodásról számolnak be; a tünetek életkorral való enyhülése is előfordul. A betegség nem rövidíti meg a várható élettartamot. A Hailey-Hailey betegség fenntartásában és exacerbációiban szerepet játszanak másodlagos bakteriális, virális vagy gombás fertőzések, környezeti anyagokra való kontakt érzékenység. I. és II. típusú szegmentális formája is ismert [16, 17]. Szövettan és ultrastruktúra Fénymikroszkóppal az epidermisben szuprabazálisan résképződés (acantholysis) figyelhető meg (8. ábra). A résen belül levált vagy részben egymáshoz kapcsolódó sejtek és sejtcsoportok találhatók. A granuláris rétegen belül ritkán kórosan elszarusodott sejtek láthatók (corps ronds). Hosszabb ideje fennálló bőrtünetek fénymikroszkópos képén hámhiperplázia, parakeratózis és varképződés is előfordulnak. A dermisz felszínes rétegeiben az erek körül limfocitás beszűrődés figyelhető meg. Elektronmikroszkópos felvételeken látható, hogy a tonofilamentumok elválnak a dezmoszómáktól, valamint hogy a sejtek felszínén a dezmoszómák száma csökkent. A tonofilamentumok a sejtmag körül elektrondenz aggregátumot képeznek (9. ábra).
8. ábra. Hailey-Hailey betegség szövettani képe.
19
9. ábra. Hailey-Hailey.kór ultrastrukturális képe. Megfigyelhető a dezmoszómák számának csökkenése és a sejtmag körül elektrondenz aggregátumként összecsapzódott tonofilamentumok. Terápiás lehetőségek Általános lépésként könnyű ruházat viselését és a mechanikai traumák kerülését javasoljuk a betegeknek. A bakteriális kolonizáció és a másodlagos bakteriális, gombás és vírusos fertőzések a megfelelő helyi és/vagy szisztémás antimikrobiális szerekkel kezelendők. A betegség elsődleges tünetei sok esetben hatékonyan kezelhetők kortekoszteroidokkal, helyi fertőtlenítő és antimikrobiális terápiával kombinálva. A lehető legalacsonyabb potenciálú szteroidok alkalmazása ajánlott a helyi mellékhatások (atrófia, striák, teleangiektáziák) elkerülése végett. Szóba jön helyi kezelésre nem reagáló bőrtünetek sebészi kimetszése [18]. Újabban felületes ablatív sebészi technikák váltották fel a korábban alkalmazott széles kimetszést és bőrátültetést. Dermabrázió és CO2 vagy erbium:YAG lézer egyaránt hatásos, évekre szóló remissziót előidéző kezelési módok lehetnek; ezek során az epidermiszt és a dermisz felső részét eltávolítják, s a kezelt területek 1-2 hét alatt újra behámosodnak [10, 19, 20]. Szisztémás kezelés retinoidokkal Hailey-Hailey betegségben hatástalannak bizonyult [21, 22]. A nemzetközi szakirodalom számos egyéb szisztémás szer (prednisolon, cyclosporin, methotrexat,
20
dapson) hatékonyságáról számol be esetismertetések formájában, nagy esetszámú, placebokontrollal végzett tanulmányok azonban egyelőre nem támasztják alá ezek alkalmazásának eredményességét. 3.2.
A kórképek molekuláris biológiája
3.2.1. Genetika A Darier-kór hátterében 1999-ben azonosította egy angol kutatócsoport pozicionális klónozással a 12. kromoszóma hosszú karján (12q23-24.1) található ATP2A2 gén heterozigóta mutációit [23]. Az ATP2A2 gén (GenBank NM001681) 21 exonból áll, hossza kb. 76 kilobázis; exonjai 15-466, intronjai 82-25097 bázispár hosszúságúak. Alternatív splicing révén három különböző fehérje kerülhet róla átírásra [24-26]. A Hailey-Hailey betegség okaként két évvel később két kutatócsoport egyidőben írta le a 3. kromószómán (3q21-24) elhelyezkedő ATP2C1 gén mutációit [1, 27]. E kb. 30 kilobázis hosszú gén (GenBank NT005612) 27, 36-172 bázispár hosszúságú exonból és 26 intronból áll. Alternatív splicing révén 4 különböző fehérje íródhat át róla [28]. Szegmentális formák Örökletes betegségek szegmentális formái hátterében posztzigotikus mutációk állnak. E mutációk eredményeképpen a fejlődő embrió szöveteiben legalább két, genetikailag különböző sejtpopuláció, klón keveredik (genetikai mozaicizmus). A mutáns gén és a mutáció megjelenésének időpontja határozzák meg, hogy mely szöveteket érint majd az elváltozás, és milyen mértékben, kiterjedésben. Bőrbetegségek esetén e szegmentális mintázat rendszerint az ún. Blaschko-vonalakat követi. E vonalak kialakulását a különböző sejtpopulációk embrionális fejlődés során történő vándorlásával magyarázzák. Az autoszomális dominánsan öröklődő bőrbetegségek szegmentális megjelenésének két típusát ismerjük [29]. Amennyiben a vad típusra homozigóta embrióban alakul ki egy betegségokozó mutáció az egyik allélon, I. típusú szegmentális manifesztációról beszélünk, melyben a szegmentálisan megjelenő tünetek súlyossága megegyezik a generalizált formában általában megfigyelhetővel. Ha a betegségokozó mutációt heterozigóta módon hordozó embrióban az adott
21
gén másik allélja elveszik vagy mutálódik, ezáltal homozigóta vagy hemizigóta mutáns klónt hozva létre, II. típusú szegmentális megjelenésről van szó. Ilyenkor a kórkép generalizált formája által érintett egyénben szegmentálisan a kórkép különösen súlyos tünetekkel jelentkezik (10. ábra). Mindkét, általunk vizsgált betegségnek ismert mind I., mind II. típusú szegmentális manifesztációja (DD,I: [30-34]; DD,II: [35-39]).
10. ábra. Örökletes bőrbetegségek I. és II. típusú szegmentális manifesztációja [17]. Előfordul, hogy egy kórkép szegmentális formájában szenvedő egyén gyermekénél a betegség generalizált formája alakul ki. E jelenség bizonyos kórképekben gyakrabban előfordul; Darierkórban és Hailey-Hailey betegségben még nem írták le. Szükséges hozzá, hogy a szegmentális kórformát hordozó szülőben a gaméták létrehozásáért felelős sejtek is hordozzák a mutációt. Darier-kórban két kutatócsoport végezte I. típusú szegmentális megjelenésű esetek genetikai analízisét, mely eredményeképpen perifériás vér limfocitáiban nem, csak az érintett bőrterület epidermális sejtjeiben tudták kimutatni az ATP2A2 gén mutációit [40, 41]. Poblete-Gutierrez és munkatársai II. típusú szegmentális megjelenésű Hailey-Hailey-kór genetikai analízisét közlik, melynek során a perifériás vér sejtjeiből is kimutatható splice site mutáció mellett a súlyosabb tüneteket mutató szegmentális bőrterület epidermális sejtjeiben az ATP2C1 gént is magában foglaló génszakasz kiesését, ezáltal hemizigócia létrejöttét írják le (az érintett keratinocyták csak a mutáns allélt hordozzák) [17].
22
3.2.2. Az intracelluláris kalciumpumpa fehérjék szerkezete és működése A humán genom projekt adatai alapján az emberi szervezetben kilenc kalcium transzport ATP-áz gén
található:
négy
plazma
membrán
kalcium
ATP-áz
(PMCA)
gén,
három
szarko(endo)plazmatikus retikulum kalcium ATP-áz (SERCA) gén, valamint kettő szekretoros útvonali kalcium ATP-áz (secretory pathway Ca2+ ATPase, SPCA) gén. E kilenc génről alternatív splicing révén 30-40 különböző kalciumpumpa fehérje keletkezhet. A PMCA fehérjék kalciumot pumpálnak ki a sejtből; a SERCA fehérjék citoplazmatikus kalciumionokat juttatnak a szarko(endo)plazmatikus retikulum belsejébe. Az SPCA pumpák a Golgi készülék membránjában helyezkednek el. A citoplazmából kalcium- és mangánionokat juttatnak a Golgi apparátus lumenébe. A PMCA csoporttal e dolgozatban nem foglalkozom. A SERCA és SPCA fehérjéket kódoló géneket és izoformáikat az 1. táblázat foglalja össze. Az ATP2A1 gén (16. kromoszóma rövid karja) két különböző izoformát kódol. A SERCA1a a felnőtt vázizomban expresszálódik, a SERCA1b ezen fehérje újszülöttkori variánsa. E fehérjéket kódoló gén mutációi a veleszületett izomdisztrófiák csoportjába tartozó Brody-kórt okozzák. Az ATP2A2 génnek, melynek mutációi a Darier-kór hátterében állnak, három izoformája található meg a szövetekben. A SERCA2a a lassú vázizomban és a szívizomban expresszálódik, valamint kis mértékben egyéb, nem-izom szövetekben (többek között a hámsejtekben) is. A SERCA2b izoforma a nem-izom szövetekben ubikviter, valamint ez a simaizmok SERCA fehérjéje is. A SERCA2c izoformát epiteliális, mezenchimális és hematopoetikus sejtekben találhatjuk [26]. Az ATP2A3 gén 6 izoformája számos nem-izom szövetben jelen van. E gén missense típusú mutációit 2. típusú diabetes mellitusban írták le [42].
23
1. Táblázat. A SERCA és hSPCA csoportokba tartozó kalciumpumpa gének izoformái és szöveti expressziója Gén ATP2A1 ATP2A2
Kromoszomális elhelyezkedés 16p12.1 12q23-q24.1
Izoformák
Expresszió
SERCA1a
Felnőtt gyors vázizom Neonatális vázizom Felnőtt lassú vázizom, szívizom, újszülött vázizom; egyéb, nem-izom szövetekben kis mértékben Nem-izom szövetek, simaizom Epiteliális, mezenchimális, hematopoetikus sejtek Vázizom, szív, méhizomzat, pancreas β-sejtek, vérlemezkék
SERCA1b SERCA2a
SERCA2b SERCA2c
ATP2A3
17p13.3
ATP2C1
3q22.1
ATP2C2
16q24.1
SERCA3a SERCA3b SERCA3c SERCA3d SERCA3e SERCA3f hSPCA1a hSPCA1b hSPCA1c hSPCA1d hSPCA2
Valamennyi eddig vizsgált szövettípus
Gyomor-bélrendszer sejtei
A SERCA fehérjék szerkezetét a SERCA1 kristályszerkezetének leírásából ismerjük [43]. E fehérjék három fő részre oszthatók: egy citoplazmatikus „fej” részre, egy összekötő (stalk) részre, valamint transzmembrán szakaszokra (11. ábra). A fehérje teljes tömegének több, mint fele a citoplazmatikus fej rész alkotásában vesz részt. E rész hat doménre osztható: N-terminus (1-40. aminosavak), béta-redőzet (131-238. aminosavak), foszforilációs domén (328-505. aminosavak), nukleotidkötő régió (505-680. aminosavak), hinge régió (681-738. aminosavak), végül a C-terminus (902-). A foszforilációs domén és a nukleotidkötő régió együtt felelősek az ATP molekula hidrolíziséért. A SERCA fehérjék a P-típusú ATP-ázok családjába tartoznak, azaz működésük során
24
kovalensen kötik meg az ATP molekuláról származó foszfátcsoportot. A SERCA2b izoformában a 11. transzmembrán régió révén a C-terminus a szarko(endo)plazmatikus retikulum lumenébe nyúlik.
11. ábra. A SERCA2 fehérje sémás szerkezete [44]. A citoplazmatikus részeket a transzmembrán doménekkel az összekötő, ún. stalk régió (S1-S5) köti össze. A SERCA fehérjéket 10 transzmembrán szakasz rögzíti a membránhoz, melyek közül négy (M4, M5, M6 és M8) vesz részt a két kalciumion-kötőhely kialakításában. E magas affinitású kalciumion-kötőhelyek nyugalmi állapotukban csak a citoplazma felől vesznek fel kalciumot. A pumpa egy ATP molekula hidrolízisével 2 kalciumiont juttat a citoplazmából az endoplazmatikus retikulum lumenébe. Működése során a SERCA ciklusos konformációváltozáson megy keresztül (12. ábra), melyben a citoplazmatikus és a transzmembrán domének kapcsolódási régiói kritikus szerepet játszanak. Két kalciumion bekötődésekor az ATP egy foszfátcsoportja a fehérjére kerül, így a magas kalciumion-affinitású forma (E1) az alacsony affinitású formává (E2) alakul, s ezáltal a kalciumionok az endoplazmatikus retikulum lumenébe transzlokálódnak. A SERCA fehérjék működése fontos feladata a citoplazma kalciumkoncentrációjának szabályozása.
25
12. ábra. A SERCA pumpák ciklikus működése [44]. Az ATP2C1 gén a 3. kromoszóma hosszú karján helyezkedik el. Róla alternatív splicing révén 4 különböző mRNS és fehérjemolekula keletkezhet. Mutációi állnak a Hailey-Hailey betegség hátterében. Az ATP2C2 gén a 16. kromoszóma hosszú karján található. Az SPCA pumpák szerkezete és működése feltehetőleg hasonló a SERCA pumpákéhoz azzal a különbséggel, hogy e fehérjék egy ATP hidrolízisével egyetlen Ca2+-t juttatnak a Golgi készülék lumenébe (csak egy kalciumkötőhelyük van), valamint Ca2+-on kívül, hasonló hatékonysággal Mn2+ megkötésére és transzportjára is képesek. Szekvenciájuk a SERCA vagy a PMCA pumpákhoz képest több hasonlóságot mutat egyes bakteriális Ca2+ ATP-ázokhoz, tehát valószínűleg egy ősibb típusát képviselik a Ca2+ ATP-ázoknak. A szekrécióra kerülő fehérjék szintéziséhez és további feldolgozásához szükséges Ca2+-mal és Mn2+-nal az SPCA pumpák látják el a Golgi apparátust és a disztálisabb szekretoros sejtorganellumokat. E fehérjéknek detoxikációs szerepe lehet az intracelluláris mangánionkoncentráció kóros emelkedésekor. Az SPCA pumpák bizonyos típusú sejtekben a Golgi készülék mellett az endoplazmatikus retikulum (ER) membránjában is megtalálhatók, s működésüknek szerepe van a fehérjék poszttranszlációs modifikálásában ill. ER-függő lebontásában, valamint az ún. ER-stresszre adott válaszban [45]. A hSPCA1 fehérje a citoplazmatikus kalciumion-oszcillációk kialakításához is hozzájárul [46-48].
26
3.2.3. Az intracelluláris kalciumion-koncentráció jelentősége és sejten belüli szabályozása A szabad kalciumionok citoplazmatikus koncetrációja ([Ca2+]i) számos sejtfolyamatot szabályoz direkt vagy indirekt módon. A sejtek a működésükre vonatkozó specifikus információt nyernek a [Ca2+]i térbeli, időbeli változásaiból és ezek amplitúdójából, ezért mindezen paraméterek szigorúan szabályozottak. A citoplazma Ca2+ ionjai érkezhetnek a sejten kívülről, valamint sejten belüli raktárakból; e két forrás hasznosításának aránya jellemző az egyes sejttípusokra [49]. Extracelluláris Ca2+ ionok különböző (ún. feszültségfüggő, ligandfüggő, receptor-aktivált, másodlagos jelátvivő molekulák által aktivált, kalciumraktárak által szabályozott) Ca2+ csatornákon, nem szelektív kationcsatornákon át juthatnak a sejtekbe, vagy (a szívizomban) Na+/ Ca2+ antiporter közreműködésével. Egyensúlyi helyzetben a bejutó ionokkal azonos mennyiségű Ca2+ ionnak kell kijutnia a sejtből: e folyamatért a plazma membrán kalcium pumpák (PMCA1-4), valamint a Na+/ Ca2+ antiporterek felelősek. A
sejtek
legfontosabb
Ca2+
raktára
az
endoplazmatikus
retikulum
(izomsejtekben
a
szarkoplazmatikus retikulum). E raktárakból kétféle kalciumcsatornán át juthat kalcium a citoplazmába: inozitol triszfoszfát (IP3) receptorokon, melyeket a külső stimulusok hatására a citoplazmába kerülő IP3 aktivál, valamint ryanodin receptorokon keresztül. A kalciumionok endoplazmatikus retikulumba való felvételét a SERCA pumpák végzik. A mitokondriumok is részt vesznek az intracelluláris Ca2+ raktározásban. Kalciumionok egy alacsony affinitású uniporteren keresztül juthatnak be a mitokondriumba, a membrán elektromos grádiense mentén. Kijutásuk Na+-függő és Na+-tól független pumpákon keresztül lehetséges. A Golgi készülék SPCA pumpák révén halmoz fel kalciumot, s IP3 hatására juttatja őket a citoplazmába [50]. A kalciumionok a sejteken belül lényeges szabályozó funkciót töltenek be. Számos extracelluláris kémiai inger eredményezi az [Ca2+]i megemelkedését. [51]. Az egy-egy csatorna kinyílásakor keletkező [Ca2+]i -emelkedés maradhat lokális vagy más szomszédos csatornák aktivációja által generalizált [Ca2+]i-emelkedést eredményezhet, mely hullámként terjed szét a sejt belsejében. E hullám a plazmamembránhoz érve megállhat, de ha a sejt és szomszédja között gap junction létesít kapcsolatot, átterjedhet a szomszédos sejtre. A kalciumszignál gyakran repetitív, melynek
27
frekvenciája is jelentést hordoz a sejt számára. A szignál amplitúdója szintén meghatározza a sejt válaszát. A citoszolikus kalciumszignál közvetítésében különböző kalciumkötő fehérjék vesznek részt. Ezek egyik legfontosabb, valamennyi eukarióta sejtben megtalálható képviselője a kalmodulin. E fehérje egyes
sejttípusokban
a
fehérjék
teljes
tömegének
1%-át
képezheti,
s
intracelluláris
kalciumreceptorként számos kalciumionok által szabályozott folyamatban játszik közvetítő szerepet. A kalciumkötés során konformációja megváltozik, lehetővé téve más fehérjékhez való kötődését, s ezáltal azok aktiválását. Ilyen módon, direkt kötődéssel a kalmodulin számos membrán transzport fehérjét aktivál. Legfőbb hatásait azonban indirekt módon, széles specificitácú kalcium/kalmodulin-függő protein kinázok (CaM-kinázok) aktiválásán keresztül fejti ki. E kinázok némelyike transzkripciós faktorokat foszforilál (pl. CREB protein), ezáltal specifikus gének transzkripcióját aktiválja vagy gátolja. 3.3 Az intracelluláris kalciumion-koncentráció szerepe a hámsejtek differenciációjának szabályozásában Az epidermis legfőbb alkotóeleme a keratinocyta, mely differenciációja folyamán a bazális rétegből a felszín felé vándorol. E folyamat során, melynek végállapota az elszarusodott sejtborítékkal körülvett corneocyta, a sejtek programozott morfológiai és funkcionális változásokon mennek keresztül. Az epidermális differenciáció tehát függőleges irányú folyamat, melyet epidermisspecifikus struktúrproteinek szigorúan szabályozott szekvenciális expressziója jellemez. Az epidermis rétegeiben meredek intracelluláris kalciumkoncentráció-grádiens mérhető: a bazális és az alsó tüskés rétegben a sejtekben a kalciumkoncentráció alacsony,
a szemcsés réteg felé
emelkedik. E grádiens hozzájárul a hám szerkezetének és specifikus funkcióinak fenntartásához. A kalciumkoncentráció hatását a hámsejtek differenciációjára sejttenyészetben is megfigyelhetjük. Ha keratinocytákat 0.07 mM-nál alacsonyabb kalciumkoncentráción tenyésztünk, folyamatosan osztódnak, bennük a bazális réteg hámsejtjeire jellemző struktúrfehérjék (pl. keratin 5, 14, hemidezmoszomális proteinek) expresszálódnak. A kalciumkoncentráció 0.1 mM fölé emelésekor a sejtek új fehérjék szintézisével vagy redisztribúciójával új intercelluláris kapcsolatokat létesítenek: órákkal a kalciumkoncentráció megemelése után pl. már a differenciálódott hámsejtekre jellemző 1-
28
es és 10-es keratint és a dezmoglein 3-t termelik. Később megkezdődik az elszarusodó sejtboríték fehérjekomponenseinek szintézise is. Az elszarusodó sejtboríték első azonosított fehérjekomponense az involukrin volt [52]. E 66 kDa tömegű, glutamin-gazdag fehérje az elszarusodó sejtboríték vázának alkotásában vesz részt, s hozzá számos más struktúrprotein, valamint a lipidboríték ceramidmolekulái kapcsolódnak [53]. Az involukrin az elszarusodó laphám szuprabazális rétegeiben expresszálódik, vagyis a terminális differenciáció korai stádiumában [54, 55].
29
4 Klinikai adatok, anyag és módszer 4.1.
A betegek klinikai adatai
4.1.1. Darier-kór A vizsgált betegek klinikai adatait a 2. táblázat foglalja össze. DD-1: Az 57 éves nő bőrtünetei 16 éves korában jelentek meg. Többször került sor kórházi felvételére elsősorban az inguinális, perianális régióban kialakuló elhanyagolt, felülfertőzött tünetekkel (13. ábra, a). Vaskos tenyéri és talpi hiperkeratózis is kialakult, mely Darier-kórban ritkán látható (13. ábra, b). A családi anamnézis felmenői között elmondása alapján negatív; egyetlen fia örökölte a kórképet, nála a tünetek már 8 éves korában megjelentek, s pszichiátriai kezelés alatt is állt; a pszichiátriai diagnózis nem ismert.
a
b
13. ábra. DD-1. a. Vaskos plakkot képező felülfertőzött bőrtünetek a perianális régióban. b. Talpi hiperkeratózis. c. Családfa-analízis. c
30
DD-2: A 45 éves férfi bőrtünetei 30 éves korában a háton és a mellkason kezdődtek. Nyaranta az izzadás provokálja a tüneteket. Többször feküdt pszichiátriai osztályon depresszió, idegkimerültség miatt. A családi anamnézis negatív (14. ábra, a). DD-3: E férfi páciensünk 2001-ben, 49 évesen tüdőrákban elhalálozott. Bőrtünetei 25 éves korában jelentkeztek, majd körülbelül 5 évenként, subokban súlyosbodtak. Többször kezelték Klinikánkon impetiginizálódott, kiterjedt bőrtünetekkel. A családban édesanyja is a kórkép súlyos formájában szenved (14. ábra, b).
a.
b.
c.
14. ábra. Dd-2 (a), DD-3 (b) és Dd-4 (c) betegek családfa-analízise. DD-4: A 26 éves fiatalember két fiatalabb testvérével jelentkezett a klinikán, törzsre, nagy hajlatokra, arcra, hajas fejbőrre kiterjedő, pörkökkel fedett bőrtünetekkel, melyek 16 éves korában a mellkason jelentek meg először. 18 éves húga és 17 éves öccse hátán és mellkasán enyhébb fenotípussal, diszkrét sárgásbarna papulák formájában figyelhető meg a Darier-kór. A családfát a 14. ábra mutatja (c). DD-5: 46 éves nőbeteg bőrtünetei 18 éves korában jelentek meg. Jelenleg a homlokon, a mellkason, háton láthatók a tipikus, barnás papulák. Cutis verticis gyrata, a fejbőr redőzöttsége, megvastagodott állapota, melyet váltakozó kiemelkedések és árkok jellemeznek, gyermekkora óta jelen volt homlokán és a hajas fejbőr okcipitális részén (15. ábra). 22 éves korában fejfájás, magas vérnyomás, testsúlynövekedés, eszméletvesztéses rosszullétek nyomán végzett endokrinológiai vizsgálat acromegaliát, hiperprolaktinémiát, hipotireózist tárt fel, melyek hátterében CT vizsgálat a hipofízis mikroadenómáját mutatta ki. Évekig részesült bromocriptin és L-thyroxin kezelésben. Genetikai vizsgálataink idejében CT vizsgálattal mikroadenómát nem találtunk; a hormonértékek a
31
magas prolaktinszint kivételével normálisak voltak. Pszichiátriai vizsgálat enyhe depressziót tárt fel. Darier-betegségre nézve családi anamnézise negatív.
a. b. 15. ábra. DD-5. a. Cutis verticis gyrata a homlokon. b. DD-5 beteg családfa-analízise. DD-6: 38 éves férfi bőrtünetei 9 éves korában kezdődtek. Ugyanebben az évben, a Darier-betegség megjelenése előtt néhány hónappal, balesetet követően lépét eltávolították. Bőrtünetei jelenleg az arcra, hajas fejbőrre, törzsre, végtagokra és a szájnyálkahártyára terjednek ki, megjelenésüket meleg, napfény, illetve kobalt, lanolin, cink iránti kontakt szenzitivitás provokálják. Anamnézisében többféle pszichiátriai zavar: disztímia, amnézia, kóros játékszenvedély szerepelnek. A bőrbetegségre nézve a családi anamnézis negatív (16. ábra, a). DD-7: 79 éves nő bőrtünetei elmondása szerint szokatlanul későn, 50 éves korában indultak a törzsön, arcon, végtagokon. Nikkel, kobalt, PPD, IPPD iránti kontaktérzékenység provokálja a tüneteket. Elmondása szerint többször volt hónapokig tünetmentes, egy alkalommal majdnem 3 évig. A családban lánya örökölte a kórképet (16.ábra, b). a.
b.
16. ábra. Családfák. DD-6 (a), DD-7 (b).
32
2. Táblázat. A vizsgált Darier-kóros betegek klinikai adatai. Testtájak, tünetek típusa
Családi anamnézis
Fenotípus variáns
Hajas fejbőr, nyak, törzs, nagy hajlatok, végtagok; tenyér, talp körmök, szájnyálkahártya Hát,mellkas
pozitív
Súlyos +tenyéri-talpi hiperkeratózis
negatív
enyhébb
5 évenként subokban jelentkeznek a tünetek
DD-1
Életkor a tünetek első jelentkezésekor (év) 16
DD-2
30
DD-3
25
Hajas fejbőr, törzs, hajlatok
pozitív
DD-4a.
16
pozitív
DD-4b.
10
Mellkas, nyak, hónalj,arc,hajas fejbőr,hát,körmök Mellkas, hát
pozitív
Enyhe; megjelenés előtt a tünetek helye viszket
DD-4c.
14
Mellkas, nyak, hát, körmök, kézhátak
pozitív
Enyhe +acrokeratosis verruciformis; megjelenés előtt a tünetek helye viszket
DD-5.
18
Arc, törzs, hajlatok, körmök
Negatív
DD-6.
9
Mellkas,hát,arc,hajas fejbőr, combok, karok, axillák,szájnyálkahártya, körmök
Negatív
Kontakt erzékenység által provokált (kobalt); vérző, viszkető.
DD-7.
50 é
Mellkas,szemzug,arc, gerinc felett,végtagok, köröm
Pozitív
Súlyos
DD-8a.
36
Törzs, lábak, tenyér, köröm
Pozitív
Telenként teljesen elmúlik; acrokeratosis verruciformis Hopf
Proband
/Család
Idegrendszeri tünetek
Egyéb
Menstruáció és terhesség alatt a bőrtünetek súlyosabbak depresszió miatt többszörös kórházi kezelés
Allergia: fűkeverék, gabonakeverék, dermatophagoides farinae, pteronissimus
Depressziv zavar
33
Egyéb társuló kórképek
Dysthymiaás zavar; amnézia, térés időbeli dezorientáció; kóros játékszenvedély
Hypophysis microadenoma (hyperprolactinaemia), cutis verticis gyrata 9 évesen lépeltávolítás balesetet után
Menstruáció alatt a bőrtünetek súlyosabbak
Contact eczema: Ni, Co, PPD, IPPD késői leolvasásban pozitív
Max. 3 év tünetmentesség
DD-8b.
15
Egész testfelület, köröm is
Pozitív
DD-8c.
34
Hajas fejbőr, törzs, köröm
Pozitív
DD-9a.
30
Pozitív
DD-9b.
43
Mellkas, hát, nyak, fejbőr, karok Arc,nyak, mellkas, hát, tenyér
DD-9c.
19
DD-10.
14
DD-11. DD-12
Pozitív
Súlyos, viszkető
Viszkető. Nincs körömtünet. Kiterjedt impetiginizáció miatt hospitalizáció Viszkető (“Urticariform”). Van körömtünet.
Immun (amegakariocytás) trombocytopeniás Purpura miatt splenectomia (15 éves korában) Epilepszia, oligophenia, hospitalizáció agresszív viselkedés miatt, több öngyilkossági kísérlet Depresszió
Sosem volt tünetmentes.
Nyak, törzs, lábszárak, inguinális hajlat, keresztcsont Tenyér, köröm, szájnyálkahártya
Pozitív
17
Egész testre kiterjed, tenyér, körmök is
Negatív
Viszkető
DD-13
19
Arc, törzs
Pozitív
viszkető
Klippel-TrenaunayWeber szindróma
DD-14
>40
Pozitív
DD-15a
12
Mellkas, hát, karok, körmök Egész testre kiterjedt, körömtünetek is.
Acrohaemorrhagiás, hólyagos; viszkető, fájdalmas
Recurrens otitis media
DD-15b
12
Pozitív
DD-16
10
Arc, nyak, törzs, nagy hajlatok, karok, tenyér Testszerte
Negatív
Pozitív
Pozitív
Kancsalság, recurrens otitis media Terhesség alatt javult: csak a lábon; térdek és térdhajlatok megkíméltek
Kataton skizofrénia Enyhe; tetrankezelés provokálja.
34
Szülés után terjedt ki az egész testre; menstruáció alatt rosszabb, terhesség alatt jobb volt
DD-8: 38 éves nő. Bőrünetei 15 éves korában kezdődtek. 14 éves korában légúti hurutos betegség gyógyulása után immun trombocytopéniás purpura (ITP) alakult ki testszerte. A szteroid kezelés eredménytelensége miatt fél évvel később lépét eltávolították. A Darier-kór bőrtünetei jelenleg az egész testre kiterjedőek, viszketnek. A beteg 37 éves férfi féltestvérének bőrtünetei 34 éves korában jelentek meg a hajas fejbőrön, a háton és a mellkason. Szellemi fogyatékossága miatt gondozóintézetben él, epilepsziás, anamnézisében többszöri öngyilkossági kísérlet, agresszív viselkedés miatti hospitalizáció szerepelnek. A családban édesanyjuk és édesanyjuk egyik nővére szenvednek Darier-kórban (17. ábra). Édesanyjuk bőrtünetei 36 éves korában jelentek meg, a törzsre és a lábakra lokalizálódnak, valamint tenyéri- és körömtünetek láthatóak. A törzs és a lábak dyskeratotikus papulái telenként olykor teljesen eltűnnek.
17. ábra. DD-8 család családfa-analízise. DD-9: 57 éves férfi bőrtünetei 19 éves korában kezdődtek. Izzadás, meleg, mechanikai trauma provokálja a tüneteket, melyek erős viszketéssel járnak. Jelenleg a nyak, törzs, lábak, inguinalis hajlat és a keresztcsonti tájék érintettek. A családi anamnézis kiterjedten pozitív (18. ábra, a). Egy lánytestvére többször feküdt kórházban bőrtüneteinek kiterjedt (arc, nyak, mellkas, hát) impetiginizációja miatt. Édesanyjuk bőrtünetei 30 éves korában alakultak ki a mellkason, háton, végtagokon és a hajas fejbőrön; szintén erősen viszketnek; anamnézisében depresszió, spondylosis dorsalis et lumbosacralis szerepelnek.
35
a.
b.
18. ábra. DD-9 (a) és DD-10 (b) betegek családfája. DD-10: A 35 éves fiatalember anamnézisében strabismus, kiterjedt herpes simplex-fertőzés, gyakori otitis media szerepelnek. A Darier-betegség tünetei 14 éves korában jelentkeztek először nyakán, arcán, mellkasán. Szájnyálkahártya, köröm-, és tenyéri tünetek is megfigyelhetők. A családi anamnézis negatív. DD-11: Klinikai adatok nem állnak rendelkezésre. DD-12: A 37 éves nőbeteg 17 éves kora óta szenved a betegség különösen súlyos, egész testre kiterjedő (csak a térdek és a térdhajlatok megkíméltek), viszkető formájában (19. ábra). Bőrtünetei terhességei alatt javultak. A családi anamnézis negatív.
a. b. 19. ábra. DD-12 beteg bőrtünetei (a) és családfa-analízise (b). 36
DD-13: A 31 éves fiatalember viszkető bőrtünetei 19 éves korában jelentek meg az arcon és a törzsön. A családi anamnézis pozitív (pater). Klippel-Trenaunay-Weber szindróma társul a kórképhez (20. ábra).
a. b. 20. ábra. a. A jobb kar megvastagodása és a nagy kiterjedésű cavernosus haemangioma (KlippelTrenaunay-Weber szindróma) mellett a mellkas felső részén néhány vörös, gyulladt papula is megfigyelhető (Darier-kór). b. DD-13 beteg családfa-analízise. DD-14: A 60 éves férfi bőrtünetei elmondása szerint 40 éves kora után jelentek meg, jelenleg a törzsre és a karokra terjednek ki. A családi anamnézis pozitív (21. ábra, a).
a.
b.
21. ábra. Családfa-analízis. DD-13 (a), DD-14 (b). DD-15: A 45 éves nő 12 éves kora óta szenved a Darier-kór különösen súlyos, hólyagos, acrohaemorrhagiás formájában. A családfát a 21. ábra (b) mutatja. Bőrtünetei viszketéssel,
37
fájdalommal társulnak. Az elvégzett epikután vizsgálat negatív volt. Terhesség alatt a bőrtünetek enyhülnek, menstruáció alatt rosszabbodnak. 26 éves fiának bőrtünetei 12 éves korában alakultak ki. Jelenleg az arcra, nyakra, törzsre, végtagokra, nagy hajlatokra terjednek ki. Kataton skizofrénia miatt rendszeres pszichiátriai kezelés alatt áll; kataton skizofréniára nézve a családi anamnézis pozitív (pater). DD-16: Az 58 éves férfi bőrtünetei 10 éves korában jelentek meg. A családi anamnézis negatív (22. ábra). Jelenleg testszerte elszórtan diszkrét, vörösesbarna papulák láthatók.
22. ábra. DD-16 beteg családfa-analízise. Szegmentális Darier-kór DD-17: Az 58 éves nő hasán, a köldöktől jobbra 20 éves korában jelentek meg a Darier-kórra jellemző, viszkető dyskeratotikus papulák (23. ábra). A bőrtünetek azóta változó intenzitással folyamatosan jelen vannak, viszketéssel járnak. Hasonló bőrbetegség a családban nem fordul elő. Depresszív zavar miatt 15 éve gyógyszeres kezelésben részesül. Depresszióra nézve a családi anamnézis több generációra visszamenőleg pozitív.
23. ábra. Szegmentális Darier-kór (DD-17).
38
A betegek csoportosítása a klinikai tünetek típusa szerint A tünetek súlyossága szerint csoportosítva a vizsgált betegeket, három sporadikus esetet (DD-2,10,16) és két családot (Dd-4,13) sorolhatunk az enyhe; egy sporadikus (DD-5) és két familiáris esetet (DD-3,14) a mérsékelt; valamint öt familiáris (DD-1,6,7,9,15) és egy sporadikus (DD-12) esetet a súlyos tünetekkel jelentkező csoportba. Egy családban (DD-8) két érintett családtag (anya és fia) tünetei kifejezetten enyhék és későbbi életkorban jelentkeztek, míg egy érintett családtag gyermekkora óta mérsékelt-súlyos bőrtünetektől szenved. Nyálkahártyaérintettséget két, sporadikus esetben észleltünk (DD-1,6). Egy betegünkben (DD-1) járt a Darier-kór tenyéri-talpi
hiperkeratózissal.
Három
sporadikus
és
két
familiáris
esetben
társultak
neuropszichiátriai tünetek a bőrbetegséghez: két sporadikus (DD-2,5) és egy familiáris (DD-9) esetben depresszió; a familiáris esetben azonban ez csak az egyik érintett családtagnál volt jelen. Egy sporadikus esetben kóros játékszenvedély, disztímia, amnézia, tér- és időbeli dezorientáció (DD-6). Két családban (DD-8,15) csak az egyik érintett családtagnál figyelhetők meg neuropszichiátriai tünetek. Egyikükben (DD-8) epilepszia, oligofrenia, többszörös öngyilkossági kísérlet és agresszív viselkedés miatti hospitalizáció, a másik családban (DD-15) katatón skizofrénia társulnak a bőrbetegséghez. Egy betegünkben (DD-8) láttuk a Darier-betegség acrohaemorrhagiás formáját. 4.1.2. Hailey-Hailey kór HH-1: A 65 éves férfi kórelőzményében jobb lábon elvégzett varicectomia és perianalis condyloma szerepelnek. A Hailey-Hailey betegség tünetei 24 éves korában kezdődtek a nyakon. Erythemás alapon hólyagok, majd erózió alakulnak ki, mely 2-3 hét alatt barnás pigmentáció hátrahagyásával gyógyulnak. Tünetek változóan a nagy hajlatokban, a scrotumon, perianalisan és a háton jelentkeznek (24. ábra). Kórtörténetében egy hónaptól egy évig terjedő tünetmentes időszakok is előfordultak. A családi anamnézis negatív. HH-2: Az 57 éves nő anamnézisében szülés utáni méhszájseb miatti többszörös méhplasztika, később rendellenes vérzés miatt többször nőgyógyászati kórházi felvétel szerepelnek. Bőrbetegsége 33 éves korában kezdődött. A családban Hailey-Hailey betegség nem fordul elő. A hónaljak, mellkas, nyak, a térdek hajlító oldala érintettek: e területeken hólyagok, nedvedző eróziók alakulnak ki. Kátrány, fakátrány, fragrance mix, jód, PPD (parafenilén-diamin) iránti kontakt érzékenység a 39
Hailey-Hailey-betegség tüneteit váltja ki [56]. A kórkép kezelésére alkalmazott szisztémás prednisolon hatására néhány év alatt Cushing-szindróma alakult ki. A későbbiekben Tigason kezelés mellékhatásai is fokozottan jelentkeztek (tenyéri-talpi hámlás, hajhullás).
24. ábra. HH-1 beteg bőrtünetei: erythemás alapon hólyagok, eróziók láthatók a törzs jobb oldalán. HH-3: 56 éves nő anamnézisében appendectomia, 4 terhességmegszakítás, myoma eltávolítás szerepelnek. Bőrbetegsége 45 éves korában kezdődött. A családban édesanyja és lánya is érintettek. A nedvedző eróziók leggyakrabban a hónaljban és az inguinális hajlatban, olykor a törzsön alakulnak ki (25. ábra).
a. b. 25. ábra. HH-3. a. Hólyagos, erozív bőrtünetek az inguinalis hajlatban. b. Családfa-analízis.
40
4.2.
Módszerek
4.2.1. Mutációanalízis DNS izolálás Kisózás 18 ml, EDTA-val alvadásgátolt perifériás vér felhasználásával lymphocyták genomiális DNS-ét vonjuk ki [57]. DNS preparáló kit 180 μl alvadásgátolt perifériás vérből végezzük, standard kit technológiával (SIGMA Gen TM Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit). Valamennyi vizsgált beteg írásban engedélyezte a genetikai vizsgálatok elvégzését. PCR amplifikáció Polimeráz láncreakció segítségével a számunkra érdekes rövid génszakaszokat a további vizsgálatokhoz szükséges nagyobb koncentrációban tudjuk előállítani. A vizsgálni kívánt génszakaszt 18-22 bázis hosszúságú, a szakasz elejével és végével komplementer oligonukleotid szekvenciákkal (primerekkel) jelöljük ki. Mivel elsősorban a kódoló szekvenciák eltéréseit kerestük, primereink az exonok közelében introniális szakaszokra illeszkednek. Darier és HaileyHailey betegségekben keresve a kóroki mutációt, az érintett gének valamennyi exonját vizsgálnunk kell, mivel az irodalmi adatok tanúsága szerint e génhibák nem csoportosulnak a gén egy bizonyos szakaszán (nincs – bizonyos genetikai betegségekben megfigyelt – hot spot). A primer szekvenciák meghatározásához a vizsgálandó gén szekvenciájának és exon-intron szerkezetének ismerete szükséges. Saját vizsgálataink során leggyakrabban az irodalomban már ismertetett oligonukleotid primereket használtunk ([27, 58]), melyeket a laborban meglévő feltételekhez és alkalmazott PCR reakcióhoz optimalizáltunk. Az alkalmazott primerek tulajdonságait táblázatban foglaltuk össze (3-4. táblázat).
41
3. Táblázat. Az ATP2A2 gén vizsgálatához alkalmazott oligonukleotid primerek tulajdonságai. Exon Forward szekvencia
1 2+3 4 5 6 7 8 9 10 11 12+13 14 15 16 17 18 19+20 21
CGAGGCGGAGGCGAGGAG ACCTCCCTCTTGACACATTG CGTGCCATTTCTCTTCTAGG AGTGTCAGGCAGGTCTTTAC AGCCTCATTCTCTTCCTTCC CTTGGTGTGGGTCGCAGAG GTTGTATGGCTGGTTGCTTG GGTGTTTGCCTTTGTCCTAA GGCGACCATACCCTGCTC TCAGAGGAGGATAAAAATGGC ATTGCCACCCAGTAGTATCC CTAGAACTTGCCACTTTTATTTA TTTCCTCCTGCTTCCCATTC TCATTTATTTTTCTGGAGGAGG TGATCTTCGTCCTTGTGGGG GGGTTGGAGCCTGGACTTG TCCCCACCTCTCCTTGCTC GTTCCTTTTCATCTGTCGCTG
Reverse szekvencia
Annellációs PCR hőmérséklet termék (ºC) hossza (bázispár)
GGAGCCGAAGCCCACGAG GACAACTCCTAACCACACTG CTCAACACATCAGGAAAAACAG AGGAAGGGAGGTGCTAAAAC ATGGAGCGAGACTAAAGCAC CCTTTAGAATGATAGCCAGTG GAACAAAGAACCACGACACG ATAACAAACACAAATCCCTCTT CCCACCCCACCCTTGAAC CTGTAAGTTTGAGGAGATAAGG GAACTGTTTGACCTTTTGCTTG GAGGCTACTATGTGCTTGTG GCAATCTGGAGAGCAAACTG CATCTCTGTCTTTTGCTACCC TGATAGATACCGAAACCACAG TTTTGGGAAGGGAAGAACTGT CCTCCATCACCAGCCAGTAT TCTTTTTCCCCAACATCAGTC
271 464 222 368 455 238 657 426 202 389 568 436 400 430 261 312 609 228
61 62 58 59 61 61 58 61 60 61 61 61 61 58 59 61 58 61
A folyamathoz 50 μl össztérfogatú reakcióelegyben a DNS-szintézishez szükséges valamennyi összetevőt megfelelő koncentrációban biztosítjuk. A reakció első lépésében 5 perces 95˚C-os inkubáció során denaturáljuk a genomiális DNS-t, majd 40 cikluson keresztül ismételjük az alábbi három lépést: 45 s 95˚C–on denaturáció, 45 s 57-63˚C–on a primerek bekötődése (annelláció), 72˚C–on az amplifikálni kívánt szakasz szintézise (extenzió). A vizsgálni kívánt génszakasz mennyisége ideális körülmények között elméletileg minden ciklusban megkétszereződik. A 40 ciklus végén 4 perces 72˚C-os extenzióval a termék mennyiségét tovább növelhetjük. A megfelelő hőfokon megfelelő ideig tőrténő inkubálást programozható automata thermocyclerek végzik.
42
4. Táblázat. Az ATP2C1 gén analíziséhez használt oligonukleotid primerek. Exonok Fw szekvencia 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
Reverse szekvencia
Termék Annellációs hossza hőm. CTTCCAGGTTCTGAAGGAAG GGACACTTCACATACACAG 58 TAGACTGCATTACACTTGTTT AAGAAAAGTAAATTAGACAGCAC 260 60 GCTAACATTTTCAATAACTTT ATTACACAGTAGAAGAGGAAG 192 58 CCTTTGCTGAGAGAACTGTC CCCAATTTATACACTTACTCAAC 205 58 AGTTGTGATTTCTTTTCCAGC TAAGCAATTAACATACCATTTTCA 222 60 GGAAAAGATGAGAATTGGGGG TTTTAAAGGGGCAGAAATCCA 214 60 ACAAGCCTACTGGAAATAATT TCTACATCCACGTATTTTCAC 240 58 TAGAGATGTTAAATGTAGCAC AGAAAATAGTTTCAAACAAAGG 267 58 TGTGTTTTGGTTTACATTTCA GAATAAAATACTGCTCTCAATAG 235 58 CTTGATAAAGCTTAGTAAATA CTTCACATTCAAAAAACAAAA 194 58 TAGGTGATTGTATGTAAAAGG TGATCTCCATAATAAAACGTAAG 202 58 AAGCTTTAAGTAACATCCAAT ATTCACTATTGACATAAACTTAC 268 58 ACAGGATTCTAGTCTTTG AAGGGATACTGTTTTTGTTTGTT 229 63 GTTTGTAGTGTTTGTATTATT GCCTAAGAAAAATACACATAAAC 230 58 GACACAGTGATAGGTTCATAG CTGCATTCTGTTGTGAGGGC 191 61 GTGGTGACCCTTGTTCTTTGT ATCTAAGCTAAACAGGAAATAAG 228 61 GGACTCCAATGGCAGGTAAG GGCTCTACCTTTCCACCCCA 266 61 TCTGATGTTTTCATGACTCAC AGAAAAACTATCGAAAACAAAAGA 271 60 GCATTACGTTGACTAGCCTG TTAAGATAGTAGTAGAAATGGTA 240 58 TGAGTTTTTCATCATTAGTTA ATAACAAAAGTAAAGTAGCAGCA 206 58 TTATCAAAATTCCTTCCTCTC AAAGGATAGGGGAAGATTCTC 261 60 TTCAAAATTAGCTCTACAGTG ATATAATTTATCCAGAAGACCCA 205 58 GTGGTATCATAGAATCAACAG TATCAGGGTAGTACACATTCC 238 60 AATCCAGACCTTAAAACTTGA CCATCAAAATAACTAAGAATCCT 273 60 TTATCCATTAAATTCAGCCAC CAAAGCTAAAAACCCATAATCT 244 60 TGTGACCAAGGAGTAATAAAT AACAAACACATTAGAAAATATGAT 251 54 TTCAAAGAAATGTAAAACCCA TTGCCCTTCTAAATGATCCTC 234 54 CAGCTCTTCAGCTGTAACAG GGAAGAGCTGCAGGAAGATG 60
Heteroduplex analízis, konformációszenzitív gélelektroforézis A mutációt hordozó exonok kiszűrésére alkalmas módszer. Elve az, hogy normál PCR terméket mutánssal összekeverve, majd az elegyet melegítéssel denaturálva és hűtéssel renaturálva az eredeti elegyben található normál és mutáns homoduplexek mellett egy normál és egy mutáns lánc nem tökéletesen komplementer összekapcsolódása által ún. heteroduplexek is keletkeznek (mismatch hibridizáció). Ha az így kezelt termékeket nagy felbontású, denaturálószert is tartalmazó poliakrilamid gélen megfuttatjuk, a denaturálószer hatására a heteroduplexek nem komplementer részei között gyengül a kapcsolat, e helyen a bázisok kifelé rotálnak és a DNS molekula ezen a ponton megtörik. A megváltozott konformációjú DNS szál a gélben lassabban vándorol, ezért, ha a futtatás leállítása 43
után a gélt a DNS-hez kötődő SYBR Greennel festjük, a heteroduplexet is tartalmazó termékek helyén két csíkot látunk (shift). Mivel Darier- és Hailey-Hailey betegségekben heterozygota mutációkat kerestünk, heteroduplex analízis előtt a PCR termékeket önmagukban denaturáltuk 98˚C-on 5 percig, majd 68˚C-on 55 percig renaturáltuk. Futtatásukat 8%-os poliakrilamid gélben végeztük, mely denaturálószerként 10% ethylen glycolt és 15% formamidot tartalmazott [59]. Automatizált szekvencia analízis A heterozigóta eltérést tartalmazó, shift-pozitív PCR termékeket újra amplifikálva
automata
szekvenálásnak vetettük alá. (Ismert, hogy PCR amplifikáció során a Taq polimeráz enzim hibákat követhet el, vagyis a heteroduplex analízis során detektált eltérések elvileg létrejöhettek a PCR reakcióban is; kicsi azonban a valószínűsége annak, hogy a genomiális DNS-ről történő ismételt amplifikáció során ismét hiba jöjjön létre.) A szekvenálást a H-MED Diagnosztikum Kft. (Budapest, Magyarország) valamint a GENODIA Kft.
(Budapest, Magyarország) munkatársai
végezték. Verifikálás restrikciós endonukleázokkal végzett hasítással A tévedés lehetőségének csökkentésére ideálisan a detektált mutációk meglétét egy második, független módszerrel is igazolni kell. Erre alkalmas lehet a mutáció helyén csak a mutáns vagy csak a normál szekvenciát hasító restrikciós endonukleázzal végzett inkubáció után a keletkezett fragmentumok agaróz gél-elektroforézissel való vizsgálata. A mutáció jelenléte esetén a normál kontrollból és a betegből származó PCR termékek hasítása eltérő mintázatot eredményez. Neutrális polimorfizmus kizárása normál kontrollok szűrésével Egyetlen aminosav cseréjét okozó, missense mutációk detektálása esetén ki kell zárnunk, hogy az eltérés a normál populációban is előforduló, betegséget nem okozó neutrális polimorfizmus. Ennek bizonyítására laborunkban 50, a betegségben nem szenvedő normál kontroll egyén 100 allélján vizsgáljuk az adott eltérés jelenlétét vagy hiányát, általában konformációszenzitív gélelektroforézissel.
44
In silico analízis Egy Darier-kóros betegünknél (DD-6) talált splice-site-gyanús mutáció in silico elemzésére a hasítási helyek szekvenciájának felismerésére alkalmas SpliceView szoftvert alkalmaztuk [60]. RNS vizsgálat Ugyanezen beteg (DD-6) perifériás vérének limfocitáiból teljes RNS-t vontunk ki, majd reverz transzkripciót végeztünk. Az így kapott teljes cDNS-oldatból az ATP2A2 mRNS egy 162 bázispár hosszú szakaszának amplifikációját végeztük az alábbi, a 9. illetve a 11. exon területére eső saját tervezésű PCR primerek felhasználásával: forward szekvencia: AACTGGATCAACTTATGCACC; reverse szekvencia: CCAACTTTTTCATACACACCC . A kapott PCR-termékek hosszát agaróz gél-elektroforézissel határoztuk meg. A PCR-termékeket tisztítottuk, majd automatizált szekvencia analízist végeztünk, két irányban. 4.2.2. A korai hámsejtdifferenciáció vizsgálata Hailey-Hailey betegségben Keratinocyta tenyészet Hámsejttenyészethez Hailey-Hailey betegekből vett biopsziás mintáiból és normál kontroll egyéneken más okból eltávolított bőrsebészeti minták eltérést nem tartalmazó szegélyéből nyertünk keratinocytákat. Sejtszuszpenzió készítését követően 37˚C-os termosztátban speciális keratinocyta tápoldatban (Cascade Biologics) szaporítottuk a sejteket. A kísérleteket megelőzően 100 mm-es tenyésztőedényekbe telepítettük őket 0.07 mM-os kalciumion-koncentrációjú tápoldatban. Amint elérték a kívánt sűrűséget (70-80%-ban összefüggő réteget képeztek), a sejtek felének tápoldatát 1.2 mM-os kalciumion-koncentrációjúra cseréltük, ezzel stimulálva differenciációjukat. A sejtek másik feléhez ismét alacsony, 0.07 mM kalciumion-koncentrációjú tápoldatot adtunk. 24 óra elteltével, kétszeri, PBS-sel való mosás után gyűjtöttük össze a sejteket további vizsgálatokhoz. Ezáltal valamennyi kísérletben differenciálódott és differenciálatlan normál és Hailey-Hailey-kóros betegekből származó hámsejtek fehérje- vagy RNS-tartalmát hasonlíthattuk össze.
45
Fehérjekivonás és Western immunoblotting A keratinocytákat homogenizációs pufferben reszuszpendáltuk és a szuszpenziót szonikátorral homogenizáltuk. A minták fehérjetartalmát BCA kittel határoztuk meg (Pierce). Western Immunoblotting előtt mintánként 20 μg fehérjeoldatot 10%-os SDS tartalmú akrilamid gélen, β-merkaptoetanollal való 5 perces forralás után futtattunk Laemmli módszere szerint [61]. Futtatás után a gélek fehérjetartalmát PVDF membránra vittük át, majd a membránokat 5% tehéntejet, 0.05% Tween 20-at tartalmazó PBS oldatban (blokkoló oldat) mostuk. Az elsődleges ellenanyagot (egérben termelt, IgG1 típusú anti-involucrin ellenanyag (Sigma)) 1:1000 arányban blokkoló oldattal hígítottuk, s az így készült oldatban a membránokat egy éjszakán keresztül 4˚C-on inkubáltuk. A másodlagos, 1:2000 arányban blokkoló oldatban hígított ellenanyagot (peroxidázhoz kötött, egér IgG1 ellenes ellenanyag, Amersham Pharmacia Biotech Inc.) 6-szori, blokkoló oldatban való mosás után adtuk a membránokhoz, szobahőmérsékleten, 2 órára. A mintákat kemilumineszcencia révén detektáltuk (Perkin Elmer Life Sciences). A detektált fehérjemolekulák méretét standard molekuláris markerek segítségével határoztuk meg. Mivel célunk egyes fehérjék mennyiségének összehasonlítása volt a normál kontrollokból és a betegekből származó minták között, több módszerrel is kontrolláltuk, hogy egyenlő mennyiségű fehérjét alkalmaztunk-e valamennyi mintából: Colloidal Coomassie Brilliant Blue (Invitrogen) festéssel a géleken, valamint a PVDF membránokon a kemilumineszcenciás detektálás után az ellenanyagokat leválasztva a β-aktin mennyiségének meghatározásával. A végső értékeléshez a kemilumineszcenciával nyert fotókon az egyes minták kvantitatív összehasonlításához denzitometriát végeztünk, majd mintánként az involucrin csíkhoz rendelhető számadatokat a β-aktinhoz tartozóval normalizáltuk, s a betegekből nyert minták fehérjetartalmát a normál kontrollok fehérjetartalmának százalékában határoztuk meg. RNS kivonás, reverz transzkripció és valódi idejű kvantitatív PCR Sejtkultúrából gyűjtött mintákból standard, kereskedelemben kapható kittel (QIAGEN) teljes RNS kivonást végeztünk. Mivel a későbbiekben a kvantifikálás alapja a kétszálú nukleinsav molekulákhoz aspecifikusan kötődő SYBR Green festék alkalmazása volt, a genomiális DNSmaradványok eltávolítására Dnáz I-gyel való DNS-emészést iktattunk. Reverz transzkripcióhoz random primerekkel az Applied Biosystems kitjét használtuk.
46
Real-time kvantitatív PCR-t ABI 7900 PCR készüléken SYBR Green módszerrel végeztünk [62], az Applied Biosystems SYBR Green PCR kitjét használva. Az irodalomban ismertetett oligonukleotid szekvenciákkal
dolgoztunk:
GCTGATCCCTTTGTGTT
INVup:
[63];
TCCTCCTCCAGTCAATACCC;
18Sup:
INVdo:
GTAACCCGTTGAACCCCATT;
18Sdo:
CCATCCAATCGGTAGTAGCG [64]. 20 μl reakcióelegy a gyári beállítású PCR mixen kívül (Applied Biosystems) 1 μg cDNS-t és mindkét végi primerszekvenciából 3.3 μM-t tartalmazott az involucrin mRNS mérésére összeállított mintákban.
A
belső
kontrollként
alkalmazott
18S
riboszomális
fehérje
mRNS-ének
meghatározására szánt mintákba 10 ng cDNS-t és mindkét primerből 500 nM-t mértünk. Minden sejtmintából 3 azonos involucrin-, és 3 azonos kontroll PCR reakciót futtattunk. A PCR során 2 perces 50˚C-os inkubációt, majd 10 perces 95˚C-os denaturációs lépést követően 40 cikluson keresztül 15 s 95˚-os denaturáció, 30 s 60˚C-os annelláció, végül 45 s 72˚C-os extenzió követte egymást. Az adatokat a 2-ΔΔCT módszer alkalmazásával analizáltuk [65, 66]. Luciferáz assay A kalciumionok involukrin promoterre kifejtett szabályozó hatását normál kontrollokból ill. HaileyHailey betegekből származó keratinocytákban luciferáz esszével határoztuk meg (Dual-Luciferase Reporter Assay System, Promega). A sejttenyésztő edényben 40%-ban összefüggő sejteket két különböző vektor-konstrukttal transzfektáltuk, lipofekt alapú SuperFect transzfekciós reagens felhasználásával (QIAGEN). Egyikük (Dr.Yuko Oda ajándéka) tartalmazta az involucrin promoter 3.7 kb hosszúságú szakaszát (-2461-től +1228-ig, +1-gyel jelölve a transzkripció start kodonjának első bázisát) ún. pGL-3 basic vektorba klónozva (Promega) a szentjánosbogár luciferáz enzim fehérje kódoló szekvenciája elé (ebben a konstruktban az involucrin promoter aktivációja luciferáz enzim termelődéséhez vezet). A másik konstruktban az SV40 promoterhez a tengeri uborka (Renilla reniformis) luciferáz enzimének kódoló szekvenciáját kötötték (pRL-TK, Promega). Mivel az SV40 promoter aktivációja nem függ a kalciumkoncentrációtól, e konstruktot a transzfekció hatékonyságának kontrollálására alkalmaztuk. A transzfekció után a sejteket 0.06 mM kalciumot tartalmazó tápoldatban szaporítottuk 80%-os sejtsűrűség eléréséig. Ekkor a tenyészetek felének tápoldatát 1.2 mM kalciumot tartalmazóra
47
cseréltük, így stimulálva bennük az involucrin promotert. 24 óra elteltével a sejteket a sejttenyésztő edények aljáról enzimatikus emésztéssel leválasztva oldatba vittük, az oldatokhoz először az egyik, majd a másik luciferéz enzim megfelelő szubsztrátjait adva és a felvillanások számát (mely a sejtekben termelt luciferáz enzim mennyiségével volt arányos) luminométerrel meghatározva a két szám arányával határoztuk meg az involukrin promoter aktivitását az egyes mintákban. Az involukrin mRNS féléletidejének meghatározása Normál kontroll egyénekből és Hailey-Hailey-kóros betegekből származó keratinocytákat 0.06 mM kalciumkoncentrációjú tápoldatban 70-80% sűrűségig szaporítottunk. 24 óra elteltével kalciumkloridot adtunk a sejtekhez 1.2 mM koncentrációig az involucrin promoter stimulálására, majd 4 órával később 10 µg/ml actinomycin D hozzáadásával állítottuk le az mRNS szintézist. 0, 1, 6 és 18 óra elteltével gyűjtöttünk mintákat. A mintákban a fent részletesen leírt módszerrel RNS extrakció és reverz transzkripció után valódi idejű kvantitatív PCR-rel határoztuk meg az involukrin mRNS mennyiségét. Mivel actinomycin D hatására a 18S riboszomális fehérje mRNS mennyisége nagyon gyorsan lecsökken, e kísérletekben belső kontrollként GAPDH mRNS mennyiségét mértük kereskedelmi forgalomban kapható primerekkel és fluoreszcens próbával, TaqMan módszerrel (Applied Biosystems).
48
5 Eredmények 5.1.
Mutációanalízis
5.1.1. Darier-kór Darier betegségben 17 betegben végeztük el a teljes kódoló régió mutációanalízisét, s a munka eredményeként 11 különböző, heterozigóta mutációt azonosítottunk (6. táblázat), köztük 9 új, az irodalomban korábban nem ismertetett mutációt. Aminosavcserét okozó (missense) nukleotidcserék Hat betegünkben azonosítottunk aminosavcserét okozó (missense) mutációt (26.ábra, a-f). Egy betegben (DD-1) a 116. pozícióban található adenin nukleotid citozinra való kicserélődése révén a fehérjelánc 39. aminosava (stalk régió) aszparaginról treoninra változott. E mutációt korábban más kutatócsoport is azonosította Darier-kór hátterében [67]. A 6. exonban, a fehérje citoplazmatikus fej részének β-redőzetet alkotó területén három betegben (DD-2,3,4) azonosítottunk egymástól eltérő missense mutációkat. A 482. pozícióban található citozin adeninre cserélődése révén a 161. aminosav alaninról aszpartátra, a 492. pozícióban található guanin citozinra cserélődése révén a 164. aminosav argininról szerinre, az 542. pozícióban található citozin guaninra cserélődése révén a 181. aminosav treoninról argininra módosul. E mutációkat elsőként azonosítottuk Darier-kóros betegekben. A DD-9 kódolású férfibetegben a 2104. pozícióban álló guanin adeninre cserélődése miatt fehérje szinten a 702. helyen álló aszpartát aszparaginra változik. E mutációt Sakuntabhai et al. is detektálták Darier-kóros betegek genetikai analízise során [68]. Végül egy betegünkben a 16. exonban, a 2369. pozícióban található adenin citozinra cserélődését detektáltuk; e báziscsere következtében a fehérjelánc 790. aminosava (6. transzmembrán domén) glutaminról prolinra változik. Egyik fenti missense mutációt sem detektáltuk 50 normál kontroll személy 100 alléljának konformációszenzitív gél-elektroforézissel történt szűrése során, ezáltal nagy valószínűséggel kizárható, hogy ezen elváltozások a normál populációban is előforduló szekvenciavariánsok lennének.
49
a. DD-1
b. DD-2
c. DD-3
d. DD-4
e. DD-9
f. DD-10
26. ábra. Missense mutációk az ATP2A2 génben Darier-kóros betegekben. A fehérjeszintézis terminációjához vezető (nonsense) nukleotidcsere Egy betegben azonosítottuk a 2727. pozícióban található timin adeninra cserélődését, mely által a ciszteint kódoló TGT kodon a fehérjeszintézis terminációját jelölő TGA STOP kodonra változik (27. ábra).
27. ábra. A fehérjeszintézis korai terminációjához vezető báziscsere az ATP2A2 génben (DD-11).
50
Deléciók Két betegben detektáltunk egy-egy nukleotid delécióját. Egy esetben a 11. exonban található, a cDNS szekvencia 1320. pozícióját elfoglaló timin elvesztése által a leolvasási keret eltolódik, s 8 kodonnal később STOP kodon alakul ki; egy másik családban a 14. exonban található, 1821. pozícióban álló citozin esett ki, ezáltal szintén kereteltolódás révén 3 kodonnal lejjebb alakul ki STOP kodon (28. ábra, a-b).
a.DD-7, 1320delT
b. DD-8, 1821delC 28. ábra. Deléciók az ATP2A2 génben. Inszerció Egy sporadikus esetben az 558. pozícióba ékelődő timin bázist találtunk; e pontszerű inszerció a leolvasási keret eltolódásához, s 5 kodonnal az elváltozás után STOP kodon kialakulásához vezet (29. ábra).
29. ábra. 558insT mutáció az ATP2A2 génben, DD-5.
51
5. Táblázat. Darier-kórban azonosított mutációk az ATP2A2 génben. Mutáció helye
Mutáció
A mutáció típusa
DD-1 DD-2 DD-3 DD-4 DD-5
Exon 1 Exon 6 Exon 6 Exon 6 Exon 7
116A→C 482C→A 492G→C 542C→G 558insT
DD-6
Intron 10
1288-6A→G
DD-7
Exon 11
1320delT
DD-8
Exon 14
1821delC
DD-9 DD-10
Exon 15 Exon 16 Exon 18
2104G→A 2369A→C 2727T→A
missense missense missense missense Leolvasási keret eltolódása (frameshift) New splice site → Leolvasási keret eltolódása (frameshift) Leolvasási keret eltolódása (frameshift) Leolvasási keret eltolódása (frameshift) Missense Missense nonsense
DD-11
A mutáció következménye fehérje szinten N39T A161D R164S T181R PTC +5as
A fehérje mely részén
Verifikáció módja
Új mutáció?
S1 β-redőzet β-redőzet β-redőzet β-redőzet
szekvenálás Szekvenálás Hind III c) Szekvenálás Szekvenálás
Nem Igen Igen Nem Igen
PTC +21as
P-domén
Szekvenálás
Igen
PTC+8as
foszforilációs hely (P-domén)
Szekvenálás
Igen
PTC +3as
Nukleotid-kötő (N-) domén
Szekvenálás
Igen
D702N Q790P C909X
Hinge domain M6 M8
Szekvenálás Pvu II c) szekvenálás
Nem Igen Igen
Splice-site mutáció Egy betegünkben (DD-6) egy introniális nukleotidcserét (1288-6A→G) detektáltunk, mely a downstream hasítási helyekre jellemző AG motívumot hozta létre 6 nukleotiddal a 11. exon első nukleotidja előtt (30. ábra, a). A SpliceView szoftverrel elemezve az érintett intront, az új hasítási helyet a program szerint nagyobb valószínűséggel választhatják a spliceosome enzimei, mint az eredeti hasítási helyet. RNS kivonás, reverz transzkripció, az érintett mRNS régió amplifikációja és a kapott RNS termékek szekvencia analízise során a két hasítási hely között elhelyezkedő 5 introniális nukleotidot megtaláltuk az mRNS szekvenciájában, a 11. exon szekvenciája előtt, vagyis a mutáció által létrehozott új hasítási hely valóban erősebbnek biztonyult az eredetinél. Az öt beékelődött nukleotid révén a leolvasási keret eltolódik, s 21 triplettel később STOP kodon alakul ki.
52
a. b. 30. ábra. Introniális báziscsere, mely új akceptor splice-site-ot hoz létre.(DD-6) a. A mutáns genomiális szekvencia. Aláhúzás jelöli a 11. exonhoz tartozó nukleotidokat. b. A mutáció vizsgálata mRNS szinten. Aláhúzással az mRNS szekvenciájába ékelődő 5 introniális nukleotidot jelöltem, melyek kereteltolódás hozva létre később STOP kodon kialakulását okozzák. Verifikáció restrikciós endonukleázokkal végzett hasítással Darier-kórban két beteg mutációit verifikáltuk restrikciós endonukleázokkal végzett emésztéssel. DD-3 betegünknél a 492G→C szubsztitúció a 6. exonban a HindIII bakteriális restrikciós endonukleáz hasítási helyét hozta létre. Ezáltal a beteg DNS-éről amplifikált, 6. exont és környezetét magában foglaló 455 bázispár hosszúságú PCR termék egy 250 és egy 205 bp hosszúságú szakaszra hasadt (31. ábra, a). A 2369A→C szubsztitúció (DD-10) által a 16. exont magában foglaló PCR termékből a PvuII enzim restrikciós helye eliminálódott, így a beteg mutáns alléljáról készült terméket az enzim nem képes hasítani (31. ábra, b).
31. ábra. PCR termékek restrikciós fragment hossz analízise. a. DD-3 (R164S). A mutáció a HindIII enzim hasítási helyét hozta létre a 6. exonban, így a beteg mutáns alléljáról amplifikált termék hasítási képén két kisebb méretű csík is megfigyelhető. b. DD-10 (Q790P). A mutáció következtében a PvuII bakteriális enzim nem kötődik a mutáns allélról készült termékhez, így a betegből származó PCR-termékek egy részét az enzim nem hasítja.
53
Polimorfizmusok Az ATP2A2 gén vizsgálata során két gyakori polimorfizmussal találkoztunk. A 15. exonban a 2172G→A báziscserét (A724A) Darier-kóros betegekben 12.07%-ban, egészséges kontrollok 10%ában találtuk. A 18. intronban a 2741+54G→A báziscserét a betegek 10.4, az egészséges kontrollok 17%-ában figyeltük meg. 5.1.2. Hailey-Hailey betegség Új mutációk az ATP2C1 génben A Hailey-Hailey-kóros betegekben azonosított mutációkat a 7. táblázat foglalja össze. Hailey-Hailey-kórban az ATP2C1 gén teljes kódoló szakaszának vizsgálatával 3 heterozigóta mutációt azonosítottunk. Egy betegben (HH-1) a 13. exonban található 1085. pozíciót érintő adenin inszerció (Ains1085) kereteltolódás révén STOP kodon kialakulásához vezet 11 kodonnal az eltérés után (32. ábra, a). Egy másik páciensnél (HH-2) a genetikai vizsgálat a 17. exonban az 1516. pozícióban álló citozin timinre cserélődését mutatta ki. Ezáltal a cDNS 506. triplete CAG helyett TAG STOP kodonra változott (32. ábra, b). A harmadik betegben (HH-3) egy 25 bázispár hosszúságú szakasz delécióját detektáltuk a gén 5’ nem kódoló régiójából (nt+4-+29del) (32. ábra, c).
a.
b.
c. d. 32. ábra. Az ATP2C1 génben detektált heterozigóta mutációk. a. HH-1: Ains1085. b. HH-2: 1516C→T. c-d. HH-3: nt+4-+29del. A d. ábrán csak a mutáns allél szekvenciája látható. 54
6. Táblázat. Hailey-Hailey-kóros betegekben azonosított mutációk az ATP2C1 génben. Mutáció helye
Mutáció
A mutáció típusa
1.
13. exon
1085insA
inszerció
A mutáció következménye fehérje szinten PTC
2.
17. exon
1516C→T
Non-sense
Q506X
3.
5’ nemkódoló régió
Nt+4-+29del
deléció
Csökkent expresszió?
Verifikáció módja
Új mutáció?
MseI, Szekvenálás TseI, Szekvenálás Szekvenálás
Igen Igen Igen
Verifikáció restrikciós endonukleázokkal végzett hasítással Két Hailey-Hailey-kóros beteg mutációját verifikáltuk restrikciós endonukleázokkal végzett hasítással. Az adenin inszerció a 1085. pozícióban (Ains1085) az MseI restrikciós endonukleáz egy további hasítási helyét hozta létre. A vad típusú allélról készült PCR terméket ez az enzim három helyen hasítja, ezáltal négy fragmenset hozva létre; ezek hosszúsága 27, 28, 49 és 125 bázispár. A mutáns allélről készült PCR-termékben a 125 bázispár hosszúságú fragment tovább hasad egy 72 és egy 53 bázispár hosszúságú szakaszra (33. ábra, a). Az 1516C→T szubsztitúció a TseI restrikciós enzim hasítási helyének elveszéséhez vezet (33. ábra, b). M
U
P
C
M
M
U
P
C
Å 300 bp 229 bp Æ
Å200 bp
125 bp Æ 72 bp Æ 49 bp Æ
←266 bp
Å100 bp
←163 bp
Å50 bp
←103 bp
28 bp Æ
M a. b. 33. ábra. Az ATP2C1 génben azonosított mutációk verifikálása restrikciós fragment hossz analízissel. a. HH-1: Az Ains1085 mutáció az MseI restrikciós endonukleáz újabb hasítási helyét hozta létre, mely egy 72 bp hosszúságú fragmens megjelenéséhez vezetett. b. HH-2: Az 1516C→T báziscsere révén a TseI restrikciós endonukleáz kötőhelye a mutáns allélon megszűnt, a mutáns allélról keletkezett PCR terméket az enzim nem hasította.
55
5.2.
A korai hámsejtdifferenciáció vizsgálata Hailey-Hailey betegségben
Involukrin fehérje szintjének vizsgálata Egészséges kontroll személyek, valamint Hailey-Hailey kóros betegek tenyésztett hámsejtjeiben Western blottal határoztuk meg az involukrin fehérje mennyiségét. Hailey-Hailey-kóros betegek hámsejtjei eleve kevesebb involukrint tartalmaztak, s a kalciumion-koncentráció emelésére kevésbé fokozták az involukrin expresszióját. Normál sejtekben 1.2 mM-os kalciumkoncentráció mellett 45-ször magasabb involukrin fehérjeszintet találtunk az alacsony kalciumkoncentráción tenyésztett normál sejtekhez képest, míg Hailey-Hailey betegek keratinocitáiban ez a különbség 1.6-szoros volt. 0.07 mM Ca2+ 1.2 mM Ca2+ N HH N HH
a. involukrin
Involukrin fehérjeszint emelkedés mértéke kalcium-stimuláció hatására
b. β-aktin 5 4 3 2 1 0 N
HH
c. 34. ábra. Az involukrin fehérjeszintjének vizsgálata Western blottal. N: Egészséges kontrollból, HH: Hailey-Hailey-kóros betegek keratinocytáiból nyert minta. a. Involukrin b. β-aktin ugyanazon membránon. c. Denzitometriával mértük az a és b ábrákon látható csíkok intenzitását. Az ábra két, független kísérlet eredményét foglalja össze, s az involukrin fehérjeszintjének emelkedését mutatja a kalciumkoncentráció megemelésének hatására.
56
Az involukrin mRNS szintjének meghatározása Az involukrin fehérje csökkent szintjét csökkent szintézis vagy fokozott lebomlás okozhatja. Kvantitatív valós idejű PCR-rel vizsgáltuk, hogy az involukrin mRNS szintje Hailey-Hailey betegekből származó tenyésztett hámsejtekben különbözik-e a normál keratinocitákban mérhetőtől. Hámsejteket 0.06 mM-os kalciumkoncentrációjú tápoldatban tenyésztettünk, majd 60-70%-os konfluencia elérésekor a kalciumkoncentrációt 1.2 mM-ra emeltük, vagy alacsony szinten tartottuk, s 24 óra elteltével a sejteket RNS meghatározásra gyűjtöttük. Magas kalciumkoncentráció mellett normál sejtekben az involukrin mRNS szintje legalább 3-szorosára, míg Hailey-Hailey-kóros keratinocitákban 1.3-szorosára emelkedett (35. ábra).
Involukrin mRNS
0.0007 0.0006 0.0005 0.0004 0.0003 0.0002 0.0001 0.0000 N,0.07mM HH,0.07mM N,1.2mM
HH,1.2mM
35. ábra. Az involukrin mRNS szintjének meghatározása valós idejű kvantitatív PCR-rel. Belső kontroll génként a 18S riboszomális RNS-t használtuk. Az ábra 4, független kísérlet eredményeit foglalja össze. Az involukrin promoter aktiváció vizsgálata Feltételeztük, hogy a Hailey-Hailey betegek keratinocitáiban megváltozott kalcium homeosztázis a kalcium által szabályozott involukrin promoter aktivitásának csökkenéséhez vezetett, s ez állhat a csökkent involukrin expresszió hátterében. E hipotézis kísérletes bizonyítására luciferáz enzim génje elé kötött involukrin promotert juttattunk be normál, valamint Hailey-Hailey-kóros betegekből származó hámsejtekbe, s a kalciumkoncentráció emelésével aktiválva az involukrin promotert, a luciferáz enzim aktivitását indirekt módon, luminométerrel határoztuk meg. E kísérletek tanúsága szerint a kalciumkoncentráció megemelésének hatására az involukrin promoter aktivitása normál sejtekben négyszeresére, Hailey-Hailey kóros sejtekben hatszorosára fokozódott 57
(36. ábra). Hipotézisünk tehát nem bizonyult igaznak; az involukrin promoter jól reagál a kalciumkoncentráció emelkedésére Hailey-Hailey-kóros betegek keratinocytáiban.
Relative light unit firefly/renilla
5 4 3 2 1 0 normal
HHD
0.07 mM Ca2+
normal
HHD
1.2 mM Ca2+
36. ábra. Az involukrin promoter aktivációját normál és Hailey-Hailey-kóros keratinocytákban luciferáz esszével mértük. Az ábra két független kísérlet eredményét foglalja össze. Az involukrin mRNS degradációjának vizsgálata A sejtek mRNS-szintézisének actinomycin D-vel való leállítása után Hailey-Hailey-kóros betegek hámsejtjeiben az involukrin transzkriptum lebomlását fokozottnak találtuk (37. ábra).
37. ábra. Az involukrin mRNS lebomlása Hailey-Hailey kóros betegek keratinocytáiban fokozott.
58
6 Megbeszélés Magyarországi Darier-kóros betegekben keresve az ATP2A2 gén mutációit, 11 heterozigóta eltérést találtunk, melyből kilenc mutációt mi detektáltunk először. Két pontszerű deléció, egy inszerció és egy splice-site módosító introniális báziscsere mellett 6 missense és egy nonsense mutációt írtunk le. Hailey-Hailey-kóros betegekben az ATP2C1 gént vizsgálva 3 új mutációt: egy inszerciót, egy nonsense mutációt és egy, a gén 5’ nem-kódoló szakaszát érintő, 25 bázispár kiesésével járó deléciót találtunk. Az ATP2A2 gén mutációinak következményei Valamennyi általunk detektált, kereteltolódáshoz vezető mutáció (deléciók, inszerció, splice-site mutáció) kevéssel az elváltozást követően STOP kodon kialakulásához vezet. E transzkriptumok sorsa kétféle lehet: lebomlanak a transzláció megkezdődése előtt az ún. nonsense-mediated mRNA decay mechanizmus révén [69, 70], vagy megtörténik transzlációjuk, mely által csonka fehérjelánc jön létre. Ugyanez érvényes a nonsense mutációkat tartalmazó transzkriptumokra is. A missense mutációk elhelyezkedésüktől függően különböző funkcionális következményekkel járhatnak. Az általunk talált missense mutációk egy részében e következményeket in vitro irányított mutagenezis kísérletekben más kutatócsoportok vizsgálták. Ahn et al. 12 Darier-betegség okozó mutáció hatását vizsgálta tenyésztett keratinocitákban [71]. Az N39T mutánciót hordozó ATP2A2 gént juttatva e sejtekbe, a SERCA2 expresszió jelentősen csökkent. E mutánsokat együtt expresszálva vad típusú SERCA2 pumpákkal, a mutánsok jelentősen csökkentették a vad típusú pumpa kalcium transzport aktivitását. E szerzők SERCA2b pumpák ko-immunoprecipitációjával kimutatták, hogy e fehérjék dimerként fordulnak elő a sejtekben; a mutáns fehérjék ezáltal képesek befolyásolni a vad típusú allélról átíródó fehérjék működését. Ezen kísérletes megfigyelések alapján a Darier-betegség domináns öröklésmódja domináns-negatív hatással lenne magyarázható: mivel a mutáns és a vad típusú allél termékei összekapcsolódnak a működés során, a mutáns pumpa hibája a vad típusú fehérje működését is befolyásolja, csökkenti vagy lehetetlenné teszi. A T181 esszenciális fontosságára utal, hogy a T181A mutáns COS-1 sejtekbe való bevitelekor a kalcium transzport funkció teljes kiesését figyelték meg [72]. Clarke et al. a D702N mutáns COS-1 sejtekben való expresszálása és funkciójának vizsgálata során kimutatta, hogy míg e variáns ATP-kötése és foszforilációja normális, kalciumionok transzportjára 59
nem képes [73]. E megfigyelést hasonló kísérletekben más szerzők is alátámasztották [44, 74]. Rice et al. kísérleti eredményei szerint a kation transzport ATPázok majdnem mindegyikében konzervált módon, a 790. pozícióban lévő glutamint érintő Q790P mutáció a kalcium transzport aktivitás csökkenésén kívül a kalciumionok iránti affinitás csökkenését is magával vonta [75]. Számos missense mutációt hordozó mutáns fehérje esetében kimutatták, hogy a SERCA2 expressziója a vizsgált sejtekben normális vagy fokozott, csak a mutáns pumpa funkciója csökkent. Ezekben az esetekben a patomechanizmus nem magyarázható a pumpafunkció domináns-negatív hatás általi kiesésével. A jelenleg elterjedten elfogadott hipotézis szerint a kóros fenotípus ezen esetekben haploinszufficienciával magyarázható, vagyis azzal, hogy a normális funkció betöltéséhez két ép allél termékére van szükség. Mutációk az ATP2A2 génben Mindeddig az ATP2A2 gén több, mint 140 mutációját írták le Darier-kóros betegekben. [23, 58, 67, 68, 76-82] Megfigyelhető, hogy kevés az ismétlődő mutáció, nincs ún. hot spot. Mégis két régióban a mutációk csoportosulása látható: az N-terminus közelében a felszálló stalk régióban, valamint a C-terminus közelében található transzmembrán doménok területén. Két kutatócsoport azonosított Darier-kóros betegekben az ATP2A2 gén 20. exonjában mutációkat. Ez az exon csak a SERCA2b izoformában található meg; ezáltal bizonyított, hogy a SERCA2b izoforma kiesése önmagában elegendő a Darier-kór kialakulásához [83] [79]. Ezen izoforma kiterjedt szöveti expressziójának ismeretében Tavadia et al. Darier-kóros betegek kardiális és vérlemezke-funkcióit vizsgálták, s nem találtak kóros eltérést [84]. A SERCA2b fehérje jelen van az idegsejtekben, s a kalcium homeosztázis és jelátvitel pontos szabályozása e sejtek normális működéséhez is elengedhetetlen [85]. Mindezek alapján felmerül, hogy az ATP2A2 mutációi az idegrendszeri tünetekért is felelős lehetnek. Mindeddig nem sikerült az idegrendszeri tünetekkel való társulást bizonyos mutációkhoz kötni. Idegrendszeri érintettség megléte vagy hiánya egy családon belül is gyakran változik. Ezek a megfigyelések inkább arra utalnak, hogy egymástól független betegségek (bőr- és idegrendszeri) együttes előfordulásáról lehet szó, vagy az idegrendszeri tünetek megjelenéséhez más faktorok megléte vagy hiánya szükséges. A genetikai kapcsoltság lehetőségét Darier-kór és bipoláris affektív zavar esetében kizárták [86].
60
Több kutatócsoport említi, hogy Darier-kóros betegek mutációanalízise során a betegek mintegy harmadában a teljes kódoló szakasz szekvenálásával sem detektáltak genetikai eltérést. E megfigyelés hátterében a nem kódoló, szabályozó régiók esetleges eltéréseit feltételezik, melyek szintén befolyásolhatják a fehérje expresszióját vagy funkcióját. Saját vizsgálataink során 16 betegben végeztük el konformációszenzitív gél-elektroforézissel a teljes kódoló génszakasz szűrését, melynek eredményeképpen 11 betegben azonosítottunk betegségokozó mutációt, 5 betegben nem találtunk eltérést. Genotípus-fenotípus összefüggések Négy sporadikus és hét familiáris Darier-kóros esetben azonosítottunk mutációkat. Egy beteg (DD-11) pontos fenotípusáról nincs adatunk. Az azonosított mutációk mindegyike egyedi eltérés volt, ismétlődő mutáció a különböző családok között nem fordult elő. A mutációk típusa szerint vizsgálva az egyes típusok fenotípusos következményeit, az aminosavcseréhez vezető mutációkat hordozó betegek bőrtünetei az enyhétől a súlyosig változhatnak. A fehérjeszintézis korai terminációjához vezető mutációk is vezethetnek mind enyhe (DD-8), mind súlyos fenotípushoz. A missense mutációkat tovább vizsgálva a fehérje harmadlagos szerkezetében betöltött helyük szerint, a stalk doménban változást okozó N39T mutáció súlyos fenotípussal, tenyéri-talpi hiperkeratózissal, nyálkahártyatünetekkel járt. Jacobsen et al. korábban már detektálták e mutációt egy Darier-kóros betegnél, akinek fenotípusáról csak annyit tudunk, hogy bőrtünetei nem társultak neuropszichiátriai tünetekkel [67]. Ringpfeil et al. az ugyanezen kodont érintő N39D mutációt hordozó betegnél mérsékelt bőrtüneteket, talpi hiperkeratózist és agresszív viselkedés miatti hospitalizációt figyeltek meg [76]. A β-redőzet területére eső A161D mutáció enyhe bőrtünetekkel és depresszió miatti többszörös kórházi kezeléssel társuló fenotípust okozott. Az ugyanezen régiót érintő T181R mutáció szintén enyhe fenotípussal járt, míg az R164S eltérés mérsékelten súlyos tüneteket okozott. A citoplazmatikus hinge domén területén a D702N aminosavcserét okozó 2104G→A báziscsere súlyos, viszkető bőrtünetekkel társult az érintett család valamennyi tagjában. Sakuntabhai et al. ugyanezen mutációt hordozó betegnél mérsékelten súlyos bőrtüneteket figyelt meg, a mi betegünkhöz hasonlóan szájnyálkahártya eltérések és neuropszichiátriai tünetek társulása nélkül.
61
Az M6 transzmembrán domént érintő Q790P aminosavcserét okozó 2369A→C mutáció enyhe bőrtünetekkel társult. Hozzánk hasonlóan több kutatócsoport is megfigyelte a tünetek súlyosságának intrafamiliáris variációit [58, 81]. Egy kutatócsoport megfigyelései szerint a missense mutációk és az in-frame deléciók gyakrabban okoznak szokatlan, ill. súlyos fenotípust [58, 68], míg egy másik csoport 17 mutáció elemzése után arra a következtetésre jutott, hogy a bőrtünetek súlyossága, megjelenése nem hozható összefüggésbe a mutációk típusával, elhelyezkedésével [67]. Többen próbáltak a neuropszichiátriai tünetek társulásához vezető genetikai eltéréseket azonosítani. Jacobsen et al. megfigyelései szerint a neuropszichiátriai tüneteket is mutató betegekben gyakrabban (70%) mutathatók ki missense mutációk, s ezek általában a 13. és a 19. exon között helyezkednek el. Két, nem rokon, Darier-kóros családban is leírják affektív zavar társulását az ATP-kötő régió területére lokalizálódó mutációkkal [67]. Velük ellentétben két kutatócsoport nem tudott összefüggést felállítani a mutációk típusa és az idegrendszeri tünetek megjelenése között [68, 76]. Ringpfeil et al. leírják az F487S mutációt hordozó Darier-kóros betegnél skizofrénia és epilepszia együttes megjelenését. Ruiz-Perez et al. három akrális haemorrhagiás fenotípust mutató, nem rokon családnál detektálta az N767S mutáció jelenlétét; egy további, hasonló fenotípusú családban a C268S eltérést mutatták ki [58]. A ritka tenyéri-talpi hiperkeratózissal járó variáns hátterében Yang et al. a D149N mutációt azonosították [77]. Acrokeratosis verruciformis Hopf-os családnál Dhitavat et al. a P602L mutációt írták le [7]. Két kutatócsoport is leírta a P160L mutáció társulását különösen súlyos bőrtünetekkel [76, 82]. Súlyos fenotípussal, nyálkahártya-tünetekkel, nyálmirigy-elzáródással jártak a ΔL41, ΔP42, F487S mutációk [76]. Hailey-Hailey betegség Hailey-Hailey-kóros
betegek
genetikai
vizsgálatának
eredményeként
három
mutációt
azonosítottunk az ATP2C1 génben. A 13. exonban azonosított inszerció kereteltolódáshoz, s kevéssel az elváltozást követően STOP kodon kialakulásához vezet. A 17. exonban azonosított báziscsere révén a cDNS 506. triplete CAG helyett TAG STOP kodonra változott. Mindkét esetben kétféle lehet a transzkriptumok sorsa: lebomlanak a transzláció megkezdődése előtt az ún. nonsense-mediated mRNA decay mechanizmus révén [69, 70], vagy megtörténik transzlációjuk, mely által csonka fehérjelánc jön létre.
62
Harmadik betegünkben egy 25 bázispár hosszúságú szakasz delécióját detektáltuk (nt+4-+29del). Az ATP2C1 gén ezen nem kódoló szakasza magában foglalja az Sp1 transzkripciós faktor kötőhelyét. E transzkripciós faktor, mely emelkedett intracelluláris kalciumion-koncentráció hatására felhalmozódik a sejtmagban, szerepet játszik a terminális differenciáció során hámsejtspecifikus gének (loricrin, transzglutamináz 3, involucrin) expressziójának szabályozásában. A kalciumion-koncentráció megemelése normál sejtekben Kawada et al. kísérleteiben az Sp1 transzkripciós faktor nukleáris felhalmozódásához, valamint az ATP2C1 gén expressziójának fokozódásához vezetett. Luciferáz-esszével vizsgálva az Sp-1 kötőhely deléciójának hatását, ezen mutánsoknál minimális expressziót figyeltek meg [87]. Mindeddig 72 mutációt írtak le Hailey-Hailey betegségben [1, 17, 27, 88-93]. Ezek csaknem fele missense mutáció. Az eltérések az ATP2C1 génben elszórtan, hot spot nélkül helyezkednek el. Egyik kutatócsoport sem tudott összefüggést felállítani a mutációk típusa és a klinikai tünetek súlyossága (a progresszió mértéke, az életkor tünetek jelentkezésekor) között. A kórkép súlyossága családokon belül is eltérő lehet, valamint ugyanazon mutációt hordozó, nem rokon betegek klinikai jellemzői is különbözőek [89]. Fairclough et al. vizsgálták 10, Hailey-Hailey-kórban leírt missense mutáció hatását a hSPCA1 pumpa expressziójára és működésére COS-1 sejtekben [28]. Hat mutáns fehérjeszintjét csökkentnek mérték, míg további négy mutánsnál a fehérjefunkció bizonyos lépéseinek zavarát figyelték meg. A mutációk következménye tehát a legtöbb esetben a teljes értékű funkcióval bíró pumpafehérjék számának csökkenése. Ennek megfelelően a kórkép domináns öröklésmenetének jelenleg leginkább elfogadott magyarázata Hailey-Hailey kórban is a haploinszufficiencia. Bár a hSPCA1 fehérje a szervezet számos szövetében kifejeződésre jut, Hailey-Hailey-kórban csak a bőrön figyelhetők meg eltérések. Úgy tűnik tehát, hogy a keratinocyták a pubertás után különösen érzékenyek a hSPCA1 pumpák számának csökkenésére. Ezt alátámasztják Callewaert et al. kísérletei is, melyek szerint míg a legtöbb sejtben mind SERCA, mind SPCA pumpák találhatók a Golgi készülék membránjában, s mindkettő felelős lehet a megfelelő kalciumion-koncentráció biztosításáért a Golgi készülék lumenében, keratinocytákban ezt a feladatot elsődlegesen az hSPCA1 fehérje látja el [94]. Hailey-Hailey-kóros betegek keratinocytáiban a citoplazmatikus kalciumkoncentráció emelkedett, a bőrben in vivo az epidermális kalciumkoncentráció-grádiens csökkent. Tenyészetben a Hailey-
63
Hailey-kóros betegekből származó hámsejtek normál keratinocytáknál kevésbé reagálnak az extracelluláris kalciumion-koncentráció emelkedésére [1, 95]. A korai hámsejtdifferenciáció vizsgálata Hailey-Hailey betegségben Hailey-Hailey-kóros
betegekből
származó
hámsejtekben
a
megemelkedett
intracelluláris
kalciumkoncentráció strukturális és funkcionális következményeit kerestük. Az elszarusodó sejtboríték vázfehérjéjének, az involukrinnak fehérjeszintjét betegekből származó sejtekben csökkentnek találtuk, míg a késői differenciációs markerek (filaggrin) szintje e sejtekben nem változott. Bergman et al. a különböző keratin fehérjék expresszióját vizsgálva Hailey-Hailey betegségben a szuprabazális rétegekben figyelték meg a keratinexpresszió átmeneti zavarát, melyet másodlagos jelenségnek értékeltek [96]. A csökkent involukrinszint okát kutatva az involukrin mRNS szintjét csökkentnek találtuk, s későbbi vizsgálataink tanúsága szerint e jelenség hátterében a transzkriptum fokozott lebomlása állt. Mindezen in vitro eredmények jelentőségének értékeléséhez szükség van további, in vivo vizsgálatok elvégzésére, illetve annak vizsgálatára, vajon a fokozott mRNS lebomlás más struktúrfehérjék transzkriptumait is érinti-e.
64
7 A munka jelentősége és az eredmények hasznosítása Magyarországi Darier-kóros betegekben keresve az ATP2A2 gén mutációit, 11 heterozigóta eltérést találtunk, melyből kilenc mutációt elsőként írtunk le. Két pontszerű deléció, egy inszerció és egy splice-site módosító introniális báziscsere mellett 6 missense és egy nonsense mutációt detektáltunk. Hailey-Hailey kóros betegekben az ATP2C1 gént vizsgálva 3 új mutációt: egy inszerciót, egy nonsense mutációt és egy, a gén 5’ nem-kódoló szakaszát érintő, 25 bázispár kiesésével járó deléciót találtunk. A klinikai kép és a háttérben álló genotípus között egyértelmű összefüggést nem állapítottunk meg. Az elvégzett munka révén lehetővé vált az ATP2A2 és az ATP2C1 gének molekuláris genetikai vizsgálata a Semmelweis Egyetem Bőrklinikáján. A beállított mutációanalízis segítségével Darierkórban és Hailey-Hailey betegségben szükség esetén prenatális vizsgálat elvégzése is lehetséges. A dolgozat Darier és Hailey-Hailey betegségekben végzett genetikai vizsgálatok eredményeit foglalja össze és beszámol a két kórképben az első magyarországi mutációanalízisekről.
65
8 Köszönetnyílvánítás Köszönettel tartozom Dr. Kárpáti Sarolta professzorasszonynak, aki lehetőséget adott, hogy laboratóriumában kezdetben tudományos diákköri, majd Ph.D. hallgatóként kutatómunkát végezzek, illetve Dr. Csikós Márta témavezetőmnek, akitől a mutációanalízis molekuláris technikáit sajátítottam el, s aki a doktori munka későbbi fázisait is folyamatosan segítette. Dr. Horváth Attila professzor úrnak, akinek igazgatósága idején megkezdhettem doktori tanulmányaimat. Dr. Mandl Péter és dr. Falus András professzor uraknak, a doktori iskola és a doktori program vezetőinek, akik támogatták felvételemet a doktori programba. Dr. Theodora Maurónak és Dr. Ervin Epsteinnek, akik lehetőséget adtak a UCSF bőrgyógyászati kutatócsoportjában való munkára. Dr.
Kornseé
Zoltánnak,
aki
tudományos diákkörös
hallgatóként
Darier-kóros betegek
mutációanalízisében vett részt. Benkő Rékának és Bóna Annamáriának, akik szükség esetén mindig segítettek a laboratóriumi munkában. Dr. Székely Katalinnak, aki korábban, tudományos diákköri munkája részeként a Darier-kóros betegek klinikai adatait összegyűjtötte. Munkája fontos alapját képezte e dolgozatnak is. Menyhárt Ferencnének, aki az immunfluoreszcens laboratóriumban zajló minden munka folytonosságát, hátterét biztosította ott-tartózkodásom alatt. Dr. Becker Krisztina adjunktus asszonynak az ultrastrukturális felvételekért és a sok bátorításért. Dr. Hársing Judit adjunktus asszonynak a szövettani analízisért és felvételekért. A szövettani laboratórium regiszterei képezték a kiindulópontot a betegek összegyűjtéséhez. Dr. Martin Behnének, akinek munkája az involukrinnal kapcsolatos kísérletek alapját képezte. Ida Aronchiknak, Sally Pennypackernek, Dr. Yuko Odának és Dr. Yoshikara Uchidának, akik a szükséges technikák elsajátítását segítették. Dr. Karin Abergnek, aki távozásom után az involukrin lebomlásával kapcsolatos kísérleteket folytatta. Dr. Temesvári Erzsébet professzor asszonynak a betegek epikután tesztjeinek elvégzéséért. Dr. Dobos Matild docens asszonynak számos Darier-kóros beteg kromoszómavizsgálatának elvégzéséért. Dr. Salacz Pál egyetemi adjunktusnak a Darier-kóros betegek pszichiátriai vizsgálatáért.
66
Szaák Tamásnak a klinikai fotók elkészítéséért, Nyírfalvy Károlynak a szükséges irodalom beszerzésében nyújtott segítségéért. Czippán Ágnesnek a betegek adataihoz való hozzáférésben, ügyintézésben nyújtott segítségért. Családomnak a gyakori külföldi tartózkodásaim alatti ügyintézésért, az adatok digitalizálásában adott segítségért, a folyamatos támogatásért. Valamennyi, a kutatásban részt vevő betegnek a vizsgálatokkal való együttműködésért.
67
9 Irodalom 1.
Hu Z, Bonifas JM, Beech J, Bench G, Shigihara T, Ogawa H, Ikeda S, Mauro T, Epstein EH, Jr. (2000) Mutations in ATP2C1, encoding a calcium pump, cause Hailey-Hailey disease. Nat Genet, 24, 61-5.
2.
Darier J. (1889) Psorospermose folliculare vegetante. Ann Dermatol Syphiligr, 10, 597-612.
3.
Graham-Brown R. (1983) Darier's disease with salivary gland obstruction. J R Soc Med, 76, 609.
4.
Crisp A. (1984) The prevalence of bone cysts in Darier's disease: A survey of 31 cases. Clin Exp Dermatol, 9, 78.
5.
Itin P. (1984) Darier's disease and retinitis pigmentosa; is there a patho-genetic relationship? Br J Dermatol, 119, 397.
6.
Hopf G. (1931) Uber eine bisher noch nicht beschriebene disseminierte keratose (Acrokeratosis verruciformis). Dermatol Z., 60, 227-250.
7.
Dhitavat J, Macfarlane S, Dode L, Leslie N, Sakuntabhai A, MacSween R, Saihan E, Hovnanian A. (2003) Acrokeratosis verruciformis of Hopf is caused by mutation in ATP2A2: evidence that it is allelic to Darier's disease. J Invest Dermatol, 120, 229-232.
8.
Martini P, Peonia G, Benedetti A, Lorenzi S. (1995) Darier-White syndrome and cyclosporine. Dermatology, 190, 174-5.
9.
Wheeland R, Gilmore W. (1985) The surgical treatment of hypertrophic Darier's disease. J Dermatol Surg Oncol, 11, 420.
10.
Beier C, Kaufmann R. (1999) Efficacy of erbium:YAG laser ablation in Darier disease and Hailey-Hailey disease. Arch Dermatol, 135, 423-427.
11.
Zachariae H. (1979) Dermabrasion in Darier's disease. Acta Derm Venereol, 59, 184-186.
12.
Hailey H, Hailey H. (1939) Familial benign chronic pemphigus. Arch Dermatol Syphilol, 39, 679-685.
68
13.
Botvinick I. (1973) Familial benign chronic pemphigus with oral mucous membrane lesions. Cutis, 12, 371.
14.
Kahn D, Hutchnison E. (1974) Esophageal involvement in familial benign chronic pemphigus. Arch Dermatol, 109, 718.
15.
Fischer H, Nikolowski W. (1962) Die Mundschleimhaut beim Pemphigus benignus familiaris chronicus. Arch Klin Exp Dermatol, 214, 261-273.
16.
Konig A, Horster S, Vakilzadeh F, Happle R. (2000) Type 2 segmental manifestation of Hailey-Hailey disease: poor therapeutic response to dermabrasion is due to severe involvement of adnexal structures. Eur J Dermatol, 10, 265-8.
17.
Poblete-Gutierrez P, Wiederholt T, Konig A, Jugert FK, Marquardt Y, Rubben A, Merk HF, Happle R, Frank J. (2004) Allelic loss underlies type 2 segmental Hailey-Hailey disease, providing molecular confirmation of a novel genetic concept. J Clin Invest, 114, 1467-74.
18.
Menz P, Jackson I, Connolly S. (1987) Surgical control of Hailey-Hailey disease. Br J Plast Surg, 40, 557-61.
19.
Christian M, Moy R. (1999) Treatment of Hailey-Hailey disease (or benign familial pemphigus) using short pulsed and'short dwell time carbon dioxide lasers. Dermatol Surg, 25, 661-3.
20.
Hamm H, Metze D, Brocker E. (1994) Hailey-Hailey disease. Eradication by dermabrasion. Arch Dermatol, 130, 1143-9.
21.
Happle R, Van de Kerkhof P, Traupe H. (1987) Retinoids in disorders of keratinization: their use in adults. Dermatologica, 175, 107-24.
22.
Burge S. (1992) Hailey-Hailey disease: the clinical features, response to treatment and prognosis. Brit J Dermatol, 126, 275-282.
23.
Sakuntabhai A, Ruiz-Perez V, Carter S, Jacobsen N, Burge S, Monk S, Smith M, Munro CS, O'Donovan M, Craddock N, Kucherlapati R, Rees JL, Owen M, Lathrop GM, Monaco AP, Strachan T, Hovnanian A. (1999) Mutations in ATP2A2, encoding a Ca2+ pump, cause Darier disease. Nat Genet, 21, 271-7.
69
24.
Verboomen H, Wuytack F, De Smedt H, Himpens B, Casteels R. (1992) Functional difference between SERCA2a and SERCA2b Ca2+ pumps and their modulation by phospholamban. Biochem J, 286(Pt2), 591-595.
25.
Verboomen H, Wuytack F, Van den Bosch L, Mertens L, Casteels R. (1994) The functional importance of the extreme C-terminal tail in the gene 2 organellar Ca2+-transport ATPase (SERCA2a/b). Biochem J, 303(Pt3), 979-984.
26.
Gelebart MV, Enouf J, Papp B. (2003) Identification of a new SERCA2 splice variant regulated during monocytic differentiation. Biochem Biophys Res Commun, 300, 676-684.
27.
Sudbrak R, Brown J, Dobson-Stone C, Carter S, Ramser J, White J, Healy E, Dissanayake M, Larregue M, Perrussel M, Lehrach H, Munro CS, Strachan T, Burge S, Hovnanian A, Monaco AP. (2000) Hailey-Hailey disease is caused by mutations in ATP2C1 encoding a novel Ca(2+) pump. Hum Mol Genet, 9, 1131-40.
28.
Fairclough RJ, Dode L, Vanoevelen J, Andersen JP, Missiaen L, Raeymaekers L, Wuytack F, Hovnanian A. (2003) Effect of Hailey-Hailey Disease mutations on the function of a new variant of human secretory pathway Ca2+/Mn2+-ATPase (hSPCA1). J Biol Chem, 278, 24721-30.
29.
Happle R. (1996) Segmental forms of autosomal dominant skin disorders: different types of severity reflect different states of zygosity. Am J Med Genet, 66, 241-2.
30.
Starink TM, Woerdeman MJ. (1981) Unilateral systematized keratosis follicularis. A variant of Darier's disease or an epidermal naevus (acantholytic dyskeratotic epidermal naevus)? Br J Dermatol, 105, 207-14.
31.
Moore JA, Schosser RH. (1985) Unilateral keratosis follicularis. Cutis, 35, 459-61.
32.
Munro CS, Cox NH. (1992) An acantholytic dyskeratotic epidermal naevus with other features of Darier's disease on the same side of the body. Br J Dermatol, 127, 168-71.
33.
Cambiaghi S, Brusasco A, Grimalt R, Caputo R. (1995) Acantholytic dyskeratotic epidermal nevus as a mosaic form of Darier's disease. J Am Acad Dermatol, 32, 284-6.
70
34.
O'Malley M, Haake A, Goldsmith L. (1997) Localized Darier disease. Implications for genetic studies. Arch Dermatol, 133, 1134-1138.
35.
Happle R, Itin P, Brun A. (1999) Type 2 segmental Darier disease. Eur J Dermatol, 9, 449-51.
36.
Itin P, Buchner S, Happle R. (2000) Segmental manifestation of Darier disease. What is the genetic background in type 1 and type 2 mosaic phenotypes? Dermatology, 200, 254-7.
37.
Itin P, Happle R. (2002) Darier disease with paired segmental manifestation of either excessive or absents involvement: a further step in the concept of twin spotting. Dermatology, 205, 344-347.
38.
Chester B, Brown L. (1959) Darier's disease resembling linear verrucosus epidermal nevus. Arch Dermatol, 80, 625-626.
39.
Esche C, Pier A, Zumdick M, Krutmann J, Ruzicka T. (1995) Morbus Darier im Verlauf der Blaschko-Linien. Z Hautkr, 70, 758-760.
40.
Sakuntabhai A, Dhitavat J, Burge S, Hovnanian A. (2000) Mosaicism for ATP2A2 Mutations Causes Segmantal Darier's Disease. J Invest Dermatol, 115, 1144-1147.
41.
Wada T, Shirakata Y, Takahashi H, Murakami S, IIzuka H, Suzuki H, Hashimoto K. (2003) A Japanese case of segmental Darier's disease caused by mosaicism for the ATP2A2 mutation. Br J Dermatol, 149., 185-188.
42.
Varadi A, Lebel L, Hashim Y, Mehta Z, Ashcroft S, Turner R. (1999) Sequence variants of the sarco(endo)plasmic reticulum Ca2+ transport ATPase 3 gene (SERCA3) in caucasian type II diabetic patients (UK prospective diabetes study 48). Diabetologica, 42, 1240-1243.
43.
Toyoshima C, Nakasage M, Nomura H, Ogawa H. (2000) Crystal structure of the calcium pump of sarcoplasmic reticulum at 2.6 A resolution. Nature, 405, 647-655.
44.
Dode L, Andersen JP, Leslie N, Dhitavat J, Vilsen B, Hovnanian A. (2003) Dissection of the functional differences between sarco(endo)plasmic reticulum Ca2+-ATPase (SERCA) 1 and 2 isoforms and characterization of Darier disease (SERCA2) mutants by steady-state and transient kinetic analyses. J Biol Chem, 278, 47877-89.
71
45.
Ramos-Castaneda J, Park YN, Liu M, Hauser K, Rudolph H, Shull GE, Jonkman MF, Mori K, Ikeda S, Ogawa H, Arvan P. (2005) Deficiency of ATP2C1, a Golgi ion pump, induces secretory pathway defects in endoplasmic reticulum (ER)-associated degradation and sensitivity to ER stress. J Biol Chem, 280, 9467-73.
46.
Wuytack F, Raeymaekers F, Missiaen L. (2003) PMR1/SPCA Ca2+ pumps and the role of the Golgi apparatus as a Ca2+ store. Pflugers Arch - Eur J Physiol, 446, 148-153.
47.
Van Baelen K, Vanoevelen J, Callewaer G. (2003) The contribution of the SPCA Ca2+ pump to the Ca2+ accumulation in the Golgi apparatus of HeLa cells assessed via RNA-mediated interference. Biochem Biophys Res Commun, 306, 430-436.
48.
Mitchell K, Tsuboi T, Rutter G. (2004) Role for plasma membrane-related Ca2+ ATPase I (ATP2C1) in pancreatic beta-cell Ca2+ homeostasis revealed by RNA silencing. Diabetes, 53, 393-400.
49.
Missiaen L, Robberecht W, Van Den Bosch L, Callewaert G, Parys J, Wuytack F, Raeymakers L, Nilius B, Eggermont J, De Smedt H. (2000) Abnormal intracellular Ca2+ homeostasis and disease. Cell Calcium, 28, 1-21.
50.
Pinton P, Pozzan T, Rizzuto R. (1998) The Golgi apparatus is an inositol 1,4,5-trisphosphatesensitive Ca2+ store, with functional properties distinct from those of the endoplasmic reticulum. EMBO J, 17, 5298-5308.
51.
Berridge M, Bootman M, Lipp P. (1998) Calcium - a life and death signal. Nature, 395, 645-648.
52.
Rice R, Green H. (1979) Presence in human epidermal cells of a soluble protein precursor of the cross-linked envelope: activation of the cross-linking by calcium ions. Cell, 18, 681-694.
53.
Marekov L, Steinert P. (1998) Ceramids are bound to structural proteins of the human foreskin epidermal cornified cell envelope. J Biol Chem, 273, 17763-17770.
54.
Steven A, Steinert P. (1994) Protein composition of cornified cell envelopes of epidermal keratinocytes. J Cell Sci, 107, 693-700.
72
55.
Steinert P, Marekov L. (1997) Direct evidence that involucrin is a major early isopeptide cross-linked component of the keratinocyte cornified cell envelope. J Biol Chem, 272, 2021-2030.
56.
Ponyai G, Karpati S, Ablonczy E. (1999) Benign familial chronic pemphigus (Hailey-Hailey) provoked by contact sensitivity in 2 patients. Contact Dermatitis, 40, 168-169.
57.
Miller S, Dykes D, Polesky H. (1988) A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucl Acid Res, 16, 1215.
58.
Ruiz-Perez VL, Carter SA, Healy E, Todd C, Rees JL, Steijlen PM, Carmichael AJ, Lewis HM, Hohl D, Itin P, Vahlquist A, Gobello T, Mazzanti C, Reggazini R, Nagy G, Munro CS, Strachan T. (1999) ATP2A2 mutations in Darier's disease: variant cutaneous phenotypes are associated with missense mutations, but neuropsychiatric features are independent of mutation class. Hum Mol Genet, 8, 1621-30.
59.
Ganguly A, Rock M, Prockop D. (1993) Conformation-sensitive gel electrophoresis for rapid detection of single-base differences in double-stranded PCR products and DNA fragments: evidence for solvent-induced bends in DNA heteroduplexes. Proc Natl Acad Sci USA, 90, 10325-10329.
60.
SpliceView "http://l25.itba.mi.cnr.it/webgene/wwwspliceview.html"
61.
Laemmli U. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227, 680-685.
62.
Tirmenstein M, Nicholls-Grzemski F, Schmittgen T, Zakrajsek B, Fariss M. (2000) Characterization of nitric oxide production following isolation of rat hepatocytes. Toxicol Sci, 53, 56-62.
63.
Bosset S, Bonnet-Duquennoy M, Barre P, Chalon A, Lazou K, Kurfurst R, Bonte F, Schnebert S, Disant F, Le Varlet B, Nicolas J. (2003) Decreased expression of keratinocyte beta1 integrins in chronically sun-exposed skin in vivo. Br J Dermatol, 148.
64.
Schmittgen T, Zakrajsek B. (2000) Effect of experimental treatment on housekeeping gene expression: validation by real-time, quantitative RT-PCR. J Biochem Biophys Methods, 46.
73
65.
Winer J, Jung C, Shackel I, Williams P. (1999) Development and validation of real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction for monitoring gene expression in cardiac myocytes in vitro. Anal Biochem, 270.
66.
Schmittgen T, Zakrajsek B, Mills A, Gorn V, Singer M, Reed M. (2000) Quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction to study mRNA decay: comparison of endpoint and real-time methods. Anal Biochem, 285.
67.
Jacobsen NJ, Lyons I, Hoogendoorn B, Burge S, Kwok PY, O'Donovan MC, Craddock N, Owen MJ. (1999) ATP2A2 mutations in Darier's disease and their relationship to neuropsychiatric phenotypes. Hum Mol Genet, 8, 1631-6.
68.
Sakuntabhai A, Burge S, Monk S, Hovnanian A. (1999) Spectrum of novel ATP2A2 mutations in patients with Darier's disease. Hum Mol Genet, 8, 1611-9.
69.
Muhlrad D, Parker R. (1994) Premature translational termination triggers mRNA decapping. Nature, 370, 578-581.
70.
Frischmeyer P, Dietz H. (1999) Nonsense-mediated mRNA decay in health and disease. Hum Mol Genet, 8, 1893-1900.
71.
Ahn W, Lee M, Kim K, Muallem S. (2003) Multiple effects of SERCA2b mutations associated with Darier's disease. J Biol Chem, 278, 20795-20801.
72.
Clarke D, Loo T, MacLennan D. (1990) Functional consequences of mutations of conserved amino acids in the B-strand domain of the Ca2+ ATPase of sarcoplasmic reticulum. J Biol Chem, 24, 14088-14092.
73.
Clarke D, Loo T, MacLennan D. (1990) Functional consequences of alterations to amino acids located in the nucleotide binding domain of the Ca2+ ATPase of sarcoplasmic reticulum. J Biol Chem, 265, 22223-22227.
74.
Vilsen B, Andersen J, MacLennan D. (1991) Functional consequences of alterations to amino acids located in the hinge domain of the Ca2+ ATPase of sarcoplasmic reticulum. J Biol Chem, 266, 16157-16164.
74
75.
Rice W, MacLennan D. (1996) Scanning mutagenesis reveals a similar pattern of mutation sensitivity in transmembrane sequences M4, M5 and M6, but not in M8, of the Ca2+-ATPase of sarcoplasmic reticulum (SERCA1a). J Biol Chem, 271, 31412-31419.
76.
Ringpfeil F, Raus A, DiGiovanna JJ, Korge B, Harth W, Mazzanti C, Uitto J, Bale SJ, Richard G. (2001) Darier disease--novel mutations in ATP2A2 and genotype-phenotype correlation. Exp Dermatol, 10, 19-27.
77.
Yang Y, Li G, Bu D, Zhu X. (2001) Novel point mutations of the ATP2A2 gene in two Chinese families with Darier disease. J Invest Dermatol, 116, 482-3.
78.
Takahashi H, Atsuta Y, Sato K, Ishida-Yamamoto A, Suzuki H, Iizuka H. (2001) Novel mutations of ATP2A2 gene in Japanese patients of Darier's disease. J Dermatol Sci, 26, 169-72.
79.
Ikeda S, Mayuzumi N, Shigihara T, Epstein EH, Jr., Goldsmith LA, Ogawa H. (2003) Mutations in ATP2A2 in patients with Darier's disease. J Invest Dermatol, 121, 475-7.
80.
Dhitavat J DL, Leslie N, Sakuntabhai A, Lorette G, Hovnanian A. (2003) Mutations in the sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca2+ ATPase isoform 2 cause Darier's disease. J Invest Dermatol, 121, 486-489.
81.
Onozuka T, Sawamura D, Yokota K, Shimizu H. (2004) Mutational analysis of the ATP2A2 gene in two Darier disease families with intrafamilial variability. Br J Dermatol, 150, 652-7.
82.
Godic A, Glavac D, Korosec B, Miljkovic J, Potocnik M, Kansky A. (2004) P160L mutation in the Ca(2+) ATPase 2A domain in a patient with severe Darier disease. Dermatology, 209, 142-4.
83.
Dhitavat J, Dode L, Leslie N, Sakuntabhai A, Lorette G, Hovnanian A. (2003) Mutations in the sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca2+ ATPase isoform cause Darier's disease. J Invest Dermatol, 121, 486-9.
84.
Tavadia S, Tait R. (2001) Platelet and cardiac function in Darier's disease. Clin Exp Dermatol, 26, 696-699.
75
85.
Baba-Aissa F, Raeymaekers L, Wuytack F, Dode L, Casteels R. (1998) Distribution and isoform diversity of the organellar Ca2+ pumps in the brain. Mol Chem Neuropathol, 33, 199-208.
86.
Jacobsen NJ, Franks EK, Elvidge G, Jones I, McCandless F, O'Donovan MC, Owen MJ, Craddock N. (2001) Exclusion of the Darier's disease gene, ATP2A2, as a common susceptibility gene for bipolar disorder. Mol Psychiatry, 6, 92-7.
87.
Kawada H, Nishiyama C, Takagi A, Tokura T, Nakano N, Maeda K, Mayuzumi N, Ikeda S, Okumura K, Ogawa H. (2005) Transcriptional regulation of ATP2C1 gene by Sp1 and YY1 and reduced function of its promoter in Hailey-Hailey disease keratinocytes. J Invest Dermatol, 124, 1206-1214.
88.
Ikeda S, Shigihara T, Mayuzumi N, Yu X, Ogawa H. (2001) Mutations of ATP2C1 in Japanese patients with Hailey-Hailey disease: intrafamilial and interfamilial phenotype variations and lack of correlation with mutation patterns. J Invest Dermatol, 117, 1654-6.
89.
Dobson-Stone C, Fairclough R, Dunne E, Brown J, Dissanayake M, Munro CS, Strachan T, Burge S, Sudbrak R, Monaco AP, Hovnanian A. (2002) Hailey-Hailey disease: molecular and clinical characterization of novel mutations in the ATP2C1 gene. J Invest Dermatol, 118, 33843.
90.
Yokota K, Yasukawa K, Shimizu H. (2002) Analysis of ATP2C1 gene mutation in 10 unrelated Japanese families with Hailey-Hailey disease. J Invest Dermatol, 118, 550-1.
91.
Chao SC, Tsai YM, Yang MH. (2002) Mutation analysis of ATP2C1 gene in Taiwanese patients with Hailey-Hailey disease. Br J Dermatol, 146, 595-600.
92.
Fairclough RJ, Lonie L, Van Baelen K, Haftek M, Munro CS, Burge SM, Hovnanian A. (2004) Hailey-Hailey disease: identification of novel mutations in ATP2C1 and effect of missense mutation A528P on protein expression levels. J Invest Dermatol, 123, 67-71.
93.
Li H, Sun X, Zhu X. (2003) Four novel mutations in ATP2C1 found in Chinese patients with Hailey-Hailey disease. Br J Dermatol, 149, 471-474.
76
94.
Callewaert G, Parys J, De Smedt H, Raeymaekers L, Wuytack F, Vanoevelen J, Van Baelen K, Simoni A, Rizzuto R, Missiaen L. (2003) Similar Ca2+-signaling properties in keratinocytes and in COS-1 cells overexpressing the secretory pathway Ca2+ ATPase SPCA1. Cell Calcium, 34, 157-162.
95.
Aronchik I, Behne M, Leypoldt L, Crumrine D, Epstein E, Ikeda S, Mizoguchi M, Bench G, Pozzan T, Mauro T. (2003) Actin reorganization is abnormal and cellular ATP is decreased in Hailey-Hailey keratinocytes. J Invest Dermatol, 121, 681-687.
96.
Bergman R, Levy R, Pam Z, Lichtig C, Hazaz B, Friedman-Birnbaum R. (1992) A study of keratin expression in benign familial chronic pemphigus. Am J Dermatopathol, 14, 32-36.
77
10 Az értekezés témájában megjelent közlemények Rácz E, Csikós M, Kornsée Z, Horváth A, Kárpáti S. Identification of mutations in the ATP2A2 gene in patients with Darier's disease from Hungary. Experimental Dermatology 2004 Jun;13(6):396-9. Rácz E, Csikós M, Benkó R, Kornsée Z, Kárpáti S. Three novel mutations in the ATP2A2 gene in Hungarian families with Darier's disease, including a novel splice site generating intronic nucleotide change. Journal of Dermatological Science 2005 Jun;38(3):231-4. Rácz E, Csikós M, Kárpáti S. Novel mutations in the ATP2C1 gene in two patients with HaileyHailey disease. Clinical and Experimental Dermatology 2005 Sep;30(5):575-7. Rácz E, Kornsée Z, Csikós M, Dobos M, Salacz P, Kárpáti S. Darier's Disease Associated with Cutis Verticis Gyrata, Hyperprolactinaemia and Depressive Disorder. Acta DermatoVenereologica 2005.
78
