Az atherosclerosis pathogenezise: apró léptek az ezermérföldes úton
Ph.D. értekezés
Dr. Hortoványi Eszter
Budapest, 2003
Témavezeto: Dr. Kerényi Tibor egyetemi tanár / Dr. Kádár Anna egyetemi tanár
Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Patológia Tudományok Program
1
Az atherosclerosis pathogenezise: apró léptek az ezermérföldes úton Dr. Hortoványi Eszter Témavezeto: Dr. Kerényi Tibor egyetemi tanár / Dr. Kádár Anna egyetemi tanár 2003
Összefoglalás Az atherosclerosis multifaktorális eredete a betegség sokszínu megközelítését teszi lehetové. A tanulmány elso részében a nemi hormonok és az érsimaizom sejtek gap junction fehérjéje közti kapcsolat vizsgálata szerepel. A gap junction csatornák az érsimaizom sejtek közti kommunikáció fo útvonalát képezik, szintézisük az atherogenezis
során
megváltozik.
Hypothezisünk
felállításakor
a
terápiás
hormonpótlást világszerte alkalmazták. Az ösztrogén az uterus simaizom gap junction fehérjéinek expresszióját fokozza, ezért feltételeztük, hogy az érsimaizom sejtjeire is hasonló hatással lesz. Állatkísérletünkben a petefészekirtott, ösztrogén, progeszteron és
kombinált
hormonpótlásban
részesült
patkányok
érsimaizom
sejtjein
immunhisztokémiai módszerrel nem tudtunk változást igazolni a kontroll csoporthoz képest. Az atherosclerosis másik megközelítésére a Chlamydia pneumoniae vizsgálatával vállalkoztunk. Immunhisztokémiai módszerrel vizsgáltuk különbözo érmintákban (fiatalon elhunytak koszorúerei, carotis endarterectomia, aorta aneurysma, aorta dissectio, elzáródott coronaria bypass graft és aorta billentyu) a Chlamydia pneumoniae elofordulását. Atheroscleroticus elváltozást nem tartalmazó szövetben nem mutattuk ki a baktériumot, a laesiok súlyosságával a baktérium elofordulása is gyakoribbá vált. Mivel felmerült, hogy a media megvastagodása az atheroma kifejlodése szempontjából fokozott kockázatot jelez, megvizsgáltuk bal leszálló koszorúerek 3-3 szegmensének vastagságát plakkok melletti részeken és elváltozás- mentes erekben. Az eredményt összevetettük
a
Chlamydia
pneumoniae
immunhisztokémiai
vizsgálatával.
A
proximalis szegmensen az intima és a media megvastagodását, a distalis szakaszokon csak az intima megvastagodását találtunk, ha az ér egyéb részén volt atheroma. A Chlamydia pneumoniae antigén jelenléte a proximalis szakaszon intima és media hypertrophiával járt. Eredményeink alapján megállapítottuk, hogy a Chlamydia pneumoniae gyakran jelen van az atherosclerosisban és szerepe lehet a progresszióban.
2
The pathogenesis of atherosclerosis: small steps of the thousand miles journey
Dr. Hortoványi Eszter 2003
Summary The purpose of the first study was to determine the effects of ovariectomy and longterm combined sexual hormone replacement on the gap junctional protein of aortic smooth muscle cells in rats. Rats were ovariectomized, and received estrogen and/or progesterone. Neither the ovariectomy nor the hormone replacement had any effect on the gap junctional protein expression of aortic smooth muscle cells as compared to control animals. These results indicate that sexual steroids do not influence the gap junctional protein of the medial layer of aorta. Chlamydia pneumoniae has emerged as the most likely pathogen to have a causative role in the development and/or progression of atherosclerosis. In an effort to better understand the significance of finding Chlamydia pneumoniae in atheroma, we examined different artery segments – such as coronary arteries of young adults, carotis endarterectomies, dissected aortic specimens, failed coronary grafts and also aortic valves by immunohistochemistry. Chlamydia pneumoniae was not found in the intimal and medial layer of normal-appearing coronary arteries. The rate of Chlamydia pneumoniae positivity increased with the severity of lesions. In non-atheromatous segments of coronary arteries a sequence of preatherosclerotic changes was identified which consisted of medial thickening followed by intimal thickening. In the third study the intimal and medial thickness of the left descending coronary artery of young adults were measured, and were correlated with the presence of Chlamydia pneumoniae antigens. In the proximal segments, atherosclerosis was associated with the widening of both the intima and the media of lesion free sites. In the distal segments the proportion of the intimal thickening had a significant association with atherosclerosis. Compared to non- infected arteries, Chlamydia pneumoniae infection was associated with higher hypertrophy index in the intima as well as in the media. Chlamydia pneumoniae may favour arterial wall hypertrophy and plays a role in lesion progression. The presence of C. pneumoniae correlates with the severity of atherosclerosis, thus may initiate atherosclerotic injury or facilitate its progression, or both.
3
Tartalom:
1. Bevezetés: az atherosclerosis pathogenezise, a két támadáspont ismertetése
6
I: A nemi hormonok szerepe a vascularis simaizom sejtek gap junction
9
expressziójának szabályozásában Célkituzések
14
Metodika
15
Eredmények
16
Következtetés
19
II. Chlamydia pneumoniae fertozés
22
A/ Chlamydia pneumoniae gyakorisága különbözo erekben - bal elülso leszálló coronaria (LAD): metodika, eredmények
26
- aneurysmák: metodika, eredmények
32
- carotis-endarterectomiák és aorta-billentyuk: metodika, eredmé nyek
34
- coronaria bypass graftok: metodika, eredmények
37
Megbeszélés
39
B/ A falvastagság és a Chlamydia pneumoniae jelenléte koszorúerekben
46
Metodika
47
Eredmények
49
Megbeszélés
52
2. Összefoglalás
54
3. Irodalomjegyzék
55
4. Köszönetnyilvánítás
73
5. Saját közlemények jegyzéke
74
4
Az értekezésben használt rövidítések jegyzéke
ACHA: anti-cholesterin ellenes antitest Cx43: connexin 43 DOCA: deoxycortocosteron acetate FITC: fluorescein isothiocyanate HDL: nagy suruségu lipoprotein HE: hematoxillin eosin HERS: Heart and Estrogen/Progestin Replacement Study Hsp: ho-sokk protein ICAM: intercellularis sejt adheziós molekula IL: interleukin LAD: bal elülso leszálló koszorúér LDL: kis suruségu lipoprotein LPS: lipopolysacharid MCP: monocyta chemotactikus protein MMP: matrix metalloproteináz NO: nitrogén monoxid PBS: phosphat puffer PCR: polimerase láncreakció RF: resorcin fuchsin TNF: tumor necrosis factor TF: szöveti faktor Tskg: testsúly kilogramm
5
Bevezetés A szív és érrendszeri megbetegedések világszerte vezetik a morbiditási és a mortalitási statisztikákat. Magyarországon 1999-ben 74000 ember halt meg érbetegség következtében. Ez a szám több mint kétszerese a rákban, és közel hétszerese a balesetben meghaltak számának (KSH évkönyv, 2001).
Az érrendszer súlyos betegségeinek jelentos része az atherosclerosis következménye. Klinikai és epidemiológiai adatok szerint az atherosclerosis kialakulása multifaktoriális eredetu. A legfontosabb ismert rizikófaktorok a dohányzás, a hypertonia, a serum lipidrendellenességek, az életkor, valamint ismert a férfiak és a menopausa utáni nok fokozott atherogen hajlama, amely az ösztrogén védo hatásának hiányával magyarázható (81). Az elmúlt évtizedben a terápiás lehetoségek a serum lipid eltérések, a magas vérnyomás, a cukorbetegség rendezése mellett a noihormon-pótló kezelésre is kiterjedtek. A hormonpótló kezelést választó egyéneket beválogató, nagy esetszámú vizsgálatok eredményei azt mutatták, hogy a kezelés mellett a cardiovascularis események kockázata jelentosen, mintegy 30-40 %-kal csökkent (18, 33, 81, 114).
Az elmúlt években ugyancsak nagy figyelmet kapott a gyulladásos elmélet, mely az érfalban zajló krónikus gyulladást tekinti az atheroscle rosis dönto mozzanatának. E gyulladásos elmélet szerint bizonyos fertozo ágensek is szerepet játszhatnak az atherosclerosis pathogenezisében (42, 101). A gyulladásos elmélet alapján került a tudományos érdeklodés középpontjába egy microorganizmus, a Chlamydia pneumoniae, miután egy epidemiológiai vizsgálat az acut myocardialis infarctuson átesettek emelkedett Chlamydia pneumoniae ellenes antitest titerét igazolta (102).
6
A Semmelweis Egyetem II. számú Pathológiai Intézetében folyó kutatások hagyományait folytatva választottuk vizsgálódásaink témájául az érpathológiát. Az érelmeszesedés multifaktoriális jellege a betegség sokszínu megközelítését teszi lehetové. Az értekezés alapjául szolgáló vizsgálatok során az atherosclerosis pathogenezise szempontjából fo ntos rizikótényezok közül a noihormonok esetleges protektív hatása került az érdeklodésünk központjába, és ezt a kérdést kísérletes állatmodellen vizsgáltuk. A noihormonok hatásmechanizmusa sokat vizsgált, még nem tisztázott terület (1-3, 16, 18, 30, 33). Az érsimaizom sejtek rendelkeznek funkcionáló ösztrogén receptorral (55, 84), az ösztrogén közvetlen hatása a vascularis simaizomra bizonyítottnak tekintheto. Tanulmányunkban azt a felvetést vizsgáltuk, miszerint a noihormonok befolyásolják a simaizomsejtek közötti kommunikációt, mely jellegzetesen a sejtek közötti un. gap junction csatornák által valósul meg (19, 22).
A másik rizikótényezo, mely napjainkban az érdeklodés eloterében áll, az infekció lehetséges szerepe az atherosclerosis kialakulásában, esetleg progressziójában. Ezért vizsgáltuk a Chlamydia pneumoniae jelenlétét az atherosclerosisos elváltozások kialakulásában humán anyagon. E célból igazoltuk a fertozés jelenlétét fiatalon elhunytak (15-34 év) koszorúereiben, és tanulmányoztuk a Chlamydia pneumoniae fertozés összefüggését az atheroscleroticus elváltozások kialakulásával, valamint szerepét a gyulladásos válaszreakció kiváltásában. Vizsgáltuk a Chlamydia pneumoniae jelenlétét különbözo érsebészeti anyagokban, a fertozés általános érpathogén jellegének igazolása végett.
7
A kétféle vizsgálatsor közötti kapcsolatot a különbözo, egymástól eltéro rizikófaktorok az érelmeszesedés kialakulásában játszott szerepének vizsgálata jelenti. Az értekezésben a cardiovascularis rendszer arteriás részének morfológiáját tanulmányozva a terápiás problémákkal szorosan összefüggo kérdésekre kerestük a választ.
Ugyan az érsimaizomsejtek gap junction struktúráinak változásai az atherosclerosis kérdéskörének kis szegmensét érintik, jelentoségét csak teljes megismerése után ítélhetjük meg. Ismert a simaizomsejtek fontos szerepe az endothel sérülést követo intimaproliferáció kialakulásában, amely elofutára a kialakuló atheroscleroticus plakknak hosszú és bonyolult folyamatok révén. A vascularis simaizomsejtek kommunikációs csatornáinak mennyiségi változásai befolyással bírnak e bonyolult folyamatokra (12, 98). A Chlamydia pneumoniae – valószínuleg a gyulladásos mediátorok felszabadítása révén – szintén szerepet játszhat az intimaproliferáció folyamatában (61, 76, 97, 109, 119). A nemi hormonok szerepe és a gyulladásos elmélethez szorosan kapcsolódó Chlamydia pneumoniae vizsgálata látszólag távol esik egymástól az atherosclerosis rizikótényezoi közt, ám mindkét vizsgálat morfológiai alapokon nyugszik, mely a pathológiai vizsgálati eszköztár része.
Az atherosclerosis legyozéséhez csak a betegség jellegzetességeinek pontos megismerése által juthatunk el. A morfológiai változások nyomonkövetése a kóros struktúra és a kóros funkció kapcsolatának megértését célozza. Mindketto – általunk feszegetett kérdéskör rendelkezik terápiás konzekvenciával. A továbbiakban a jobb követhetoség érdekében a két vizsgálatcsoportot külön tárgyalom.
8
I. A nemi hormonok szerepe a vascularis simaizom sejtek gap junction expressziójának szabályozásában A cardiovascularis rizikófaktorok közül a nemi hormonok jelentosége jól ismert, a hatásmechanizmus sokat vizsgált, de még nem tisztázott terület (1, 16, 18, 30, 33, 88, 90, 110, 118, 114). A nok menopausa elott ritkán szenvednek coronaria-betegségben, ám e relatív védettségük a menopausa beálltával megszunik. Valószínunek tunik, hogy a védettség csökkenése az endogén ösztrogénszint csökkenésével van összefüggésben. Az ösztrogén javítja a serum lipidprofilt, emeli a HDL és csökkenti az LDL szintet, továbbá csökkenti a fibrinogénszintet (18, 114), valamint a lipoproteinA szintjét (108). Állatkísérletben az ovariectomia endothel dysfunctiot okozott, melyet ösztrogén kezelés javított (110). Biomechanikai vizsgálatok tanulsága szerint nostény patkányokban az ösztrogén fokozza az artériák reaktivitását (5). Kisartériákban az ovariectomia utáni ösztrogénpótlás az erek morfológiai lumenét megnövelte (6). Az ovariectomia serum lipid szint eltérés nélkül is intima- hyperplasiát okozott és megemelte a fibroblast növekedési faktor
szintjét
juhok
aortájában
(106).
Hormonpótlással
az
intimaproliferáció
megakadályozható volt (105). Ovariectomia utáni hormonpótlás kivédte a ballon catheterezés okozta intimaproliferációt (57, 92). Az ösztrogén csökkenti a vasoconstric tor hatású endothelin-1 produkciót (1), gátolja a vascularis simaizomsejtek proliferációját és migrációját (2, 11, 90). Az ösztrogén a bradykinin által kontrakcióba hozott coronaria preparátumon relaxációt idézett elo, és szignifikánsan lecsökkentette a simaizomsejtek Ca2+ koncentrációját (11). A vascularis simaizomsejtek rendelkeznek funkcionáló ösztrogén receptorral, e hormon tehát közvetlen hatással bír a vascularis simaizomsejtekre (55, 84).
9
A gap junction általános sejtkapcsoló struktúra. A sejtmembrán olyan speciális képzodménye, amely a szomszédos sejtek közt közvetlen kapcsolatot teremt, lehetové téve ionok, cukrok, kis molekulatömegu proteinek, jelzo molekulák átjutását az egyik sejtbol a másikba. Ezáltal alapvetoen fontos szerepet tölt be a sejtek közötti jelátvitelben, és a szomszédos sejtek aktivitásának szabályozásában. A gap junctionok alapegysége a connexon. Két szomszédos sejt connexonja együtt alkotja a membráncsatornát, melynek átméroje
emlossejtek
esetén
0,2-0,5
? m.
A
connexonok
külön-külön
hat
fehérjealegységbol - a connexinekbol - állnak, amelyek hatszögletu képzodményt alkotva helyezkednek el egy nyitott pórus körül ?1. ábra?. Jelenleg 13-féle connexint sikerült eddig azonosítani, osztályozásuk a molekulatömegük alapján történt (22, 69, 70).
1. Ábra. A gap junction szerkezete. A kép jobb alsó sarkában látható connexon 6 fehérje alegységbol, a connexinekbol épül fel. Két connexon együtt alkotja a membráncsatornát.
A connexinek jelenléte faj - és sejtspecifikus. Egyazon sejt többféle connexint is tartalmazhat, ugyanazon connexin különbözo szövetekben is elofordul. Így az elsoként
10
szívizomból izolált connexin-43 (Cx43) megtalálható a myometriumban, a májban, a limphoid rendszerben, az ovariumban és a vascularis simaizomban is (10, 22, 31, 43, 60, 64, 67, 71, 77, 83, 93, 95-96, 104, 121-122).
A gap junctionok leírása óta számos kutató vizsgálta e membráncsatornák funkcióit és regulációját. E kapcsolatnak jelentos szerepe van a sejtmuködések összehangolásában - ide értve a növekedés és a differenciálódás szabályozását is (13, 37). A szívizomzatban és a vascularis simaizomban, valamint az endothelsejtekben ezek a csatornák az akciós potenciál, valamint a membránpotenciál- változások sejtrol-sejtre való terjedését gyorsító alacsony ellenállású utat képeznek. Még a relatíve kisfokú depolarizációk is képesek passzívan tovaterjedni az érsimaizomban a gap junctionokon keresztül viszonylag nagy távolságokban. A hyperpolarizáció és a depolarizáció az ér relaxációjával és a kontrakciójával van össze függésben. Az egymással a gap junction csatornák által összeköttetésben lévo sejtek az „aktív vascularis egységet” képezik, az egységben akár sejtek százai is részt vehetnek (22). Így a kontrakciók koordináltsága illetve az erek reaktivitása összefügg a gap junctionok suruségével és a funkcionális állapotával (19, 22, 65, 118). Újabb adatok szerint a NO és az EDHF által közvetített endothelium-dependens vasodilatatio is részben a gap junction csatornákon keresztül valósul meg (20, 22, 52).
Az érfalban 3- féle connexin található. Cx43 és ritkábban Cx40 található a simaizom sejtekben és az endothel sejtekben, a harmadik connexint, a Cx37-t az endothelsejtekbol izolálták (22, 83). Az érfal simaizom sejtjeinek domináns gap junction fehérjéje a Cx43 (22, 46, 107). Suruségének és eloszlásának változásait a különbözo noxák hatására számos kutatócsoport vizsgálta. Patkányokon indukált hypertonia során (DOCA-só modell ill. féloldali nephrectomia és Na gazdag diéta) „freeze fracture” elektromikroszkópos
11
vizsgálattal a gap junctionok mennyiségét változatlannak, a morfológiáját abnormálisnak találták (50). Immunhisztokémiai módszerrel DOCA-só modell valamint az arteria renalis ligatúra
alkalmazása
során
a
Cx-43
fehérje
denzitásának
közel
azonos
fokú
megnövekedésérol számo ltak be (38), míg a NO szintézis gátlásával létrehozott hypertoniában (L-NAME kezelés) a Cx43 messenger RNS és a fehérje mintegy 50 %-os csökkenésérol számoltak be patkány aorta vizsgálatakor (39). Koleszterin dús diéta a macrophag eredetu habsejtek Cx43 expressziójának növekedésével járt, ugyanakkor a media simaizom sejtjeinek Cx43 tartalma lecsökkent (99). A ballon katéterezés által kiváltott intimaproliferáció és az alatta lévo media simaizom sejtjeiben Polacek és munkatársai nem találtak változást a csatornák eloszlását illetoen a kontroll érhez képest (99), míg Severs kutatócsoportja a Cx43 expresszió jelentos megnövekedésérol számolt be mind az intimaproliferáció, mind a media simaizom sejtjeiben ballonkatéterezést követoen (127). Az atheroscleroticus
egyénbol származó frissen izolált monocyták, valamint a
differenciálódott monocyta/macrophag sejttenyészetek Northern analízissel vizsgálva nem expresszáltak gap junction messenger RNS-t. A humán atheroscleroticus carotisokból származó macrophagok azonban tartalmaztak Cx43 messenger RNS-t (98). A Cx43 expressziójának csökkenését figyelték meg atheroscleroticus plakkok simaizom sejtjein, míg az intima megvastagodásokban és a korai atheroscleroticus laesiókban e gap junction fehérjék növekedését észlelték, mely növekedés mintegy 10-szeres volt az egészséges erekhez képest (12). A medialis simaizom sejtek közti Cx43 expresszió növekedése a sejtek
phenotípus
változásával
jár.
Humán
koszorúerek
korai
atheroscleroticus
elváltozásainak vizsgálata alapján a megnövekedett Cx43 tartalmú simaizom sejtek phenotípusa az un. kontraktilis phenotípust a szintetikus állapotra jellemzo phenotípussal váltja fel (107, 127). Mindezen adatok alapján úgy tunik, hogy a gap junction kapcsolatok
12
– mint a sejtek közti kommunikáció útvonalai – kiemelkedo szerepet játszanak az atherosclerosis pathogenezisében.
A Cx43 fehérje az uterus simaizom sejteinek is domináns gap junction fehérjéje, ahol expressziója hormonálisan is szabályozott. A myometrium Cx43 expressziójának változását figye lték meg az ösztrogén/progeszteron ráció függvényében juhon (77), szarvasmarhán
(25),
patkányon
(71,
93,
96).
Nem
vemhes
nostény
egerek
myometriumának Cx43 tartalma megnövekedett ösztrogén kezelés után, vemhes állatok méhsimaizom Cx43 expressziója ugrásszeruen megnott ellés elott és alatt (67). A Cx43 messenger RNS transcripciójára az ösztrogén pozitívan, míg a progeszteron negatívan hatott patkányokon (67, 95). Szintén patkánykísérlet eredménye az a megállapítás, miszerint mind a progeszteron, mind egy bizonyos anti-ösztrogén (ICI 182780) meggátolta a gap junction csatornák képzodését. Míg azonban az anti-ösztogén a szintézist blokkolta, a progeszteron alkalmazásával nem a Cx43 fehérje szintézise, hanem annak a plazmamembránba való beépülése gátlódott (43). Találtunk adatokat arra utalóan is, miszerint a szívizomsejtek Cx43 expressziója hormonhatásra változna. Sejttenyészeten a tamoxifen (anti-ösztrogén szer) reverzibilisen gátolta a szívizomsejtek közti gap junction csatornákon keresztüli átvitelt patkányban (122).
Minthogy a gap junctionok összefüggése az erek funkcionális állapotával már igazoltnak látszik, valamint más szövettípusok (ti. uterus simaizom) esetén a connexinek hormonális szabályozása bizonyított, valószínunek tunt, hogy az ösztrogén hatása is - legalább részben - a gap junctionok expressziójának befolyásolásával valósul meg. Kísérletünkben választ kerestünk arra, hogy a nemi hormonok befolyásolják-e az erek simaizomsejtjeinek gap junction expresszióját.
13
Célkituzéseink
Célunk az ösztrogén, a progeszteron illetve a kombinált hormonpótlás feltételezett hatásának igazolása volt a vascularis simaizomsejtek gap junction kapcsolatainak vonatkozásában. Mivel a patkány aorta simaizom domináns gap junction fehérjéje – és egyben a legtöbbet vizsgált vascularis connexin - a Cx43, munkánk alapjául e fehérje expressziójának vizsgálatát választottuk (46). A kísérletben teszteltük a noi nemi hormon hiány - mint a menopausában bekövetkezo változás - és a hormonpótló terápia hatását a vascularis simaizomsejtek sejtközötti kapcsolatainak változására.
Figyelmünket arra összpontosítottuk, hogy tisztázzuk, okoz-e változást az érsimaizom Cx43 expresszálódásában -
a noi nemi hormonok hiánya,
-
a human hormonpótlás mértékének megfelelo ösztrogén alkalmazása
-
van-e önmagában hatása a progeszteronnak a gap junctionokra
-
milyen
hatást
érhetünk
el
a
fentiekhez
képest
kombinált
hormonpótlással.
A Cx43 jelenlétének detektálására immunhisztokémiai módszert alkalmaztunk. A költségesebb
felszerelést
igénylo
molekuláris
biológiai
módszerek
mellett
az
immunhisztokémia létjogosultsága sem kérdojelezheto meg e tárgyban, minthogy igazolt, hogy csak a kommunikáció-kompetens sejtekben lokalizálható immunhisztokémiai módszerrel látható gap junction plakk (87).
14
Metodika
Kísérleti protokoll A kísérletben 20 nostény patkány vizsgálatát terveztük, 5 vizsgálati csoportban. 200-250 g tömegu Wistar nostény patkányok (4 állat / csoport) petefészkeit mutétileg eltávolítottuk. A kísérlet idotartama: 15 hét volt.
Vizsgálati csoportok: 1. áloperált kontroll (E csoport) 2. petefészekirtott, hormonpótlásban nem részesülo állatok (A csoport) 3. petefészekirtott, ösztogén kezelt állatok (B csoport) 4. petefészekirtott, csak progeszteron kezelt állatok (C csoport) 5. petefészekirtott, kombinált hormonpótlásban részesülo nostények (D csoport).
A hormonpótlás a humán gyakorlatban alkalmazott dózisokkal arányos mértéku volt. Ösztrogén:
450? g/tskg/hét
ösztradiol
propionát
intramuscularis
depoinjekció,
progeszteron: 15mg/tskg/2 hét medroxiprogeszteron acetát intramuscularis depoinjekció formájában alkalmaztuk. Az alkalmazott hormondózisok elozetes mérések szerint a fiziológiás szintre állítják vissza a petefészekirtott állatok serum szexualszteroid értékeit (5-6).
Az állatokat állandó homérsékletu helyiségben helyeztük el, tartásuk körülményeit a magyar és a nemzetközi szabályokkal összhangban alakítottuk ki (128). A mutéti anaesthesiát intraperitonealis pentobarbital (50 mg/tskg) alkalmazásával értük el.
15
A 15 hetes kezelési periódus végén az állatokat elaltattuk, a hasi aortán keresztül 20 ml PBS-sel átmostuk az érrendszert, majd a mellkasi aortát és a szívet kivettük. Az eltávolított szöveteket gyorsfagyasztottuk folyékony nitrogénben elohutött 2-metilbutánb an, és O.C.T. mediumba ágyaztuk. A blokkokból 6-8 µm vastagságú fagyasztott metszetek készültek.
Immunhisztokémiai vizsgálat
A Cx-43 protein immunhisztokémiai detektálása immunfluoreszcens technikával történt. A gyorsfagyasztott metszeteket poly- L- lysin-agarózzal kezelt tárgylemezekre helyeztük, fixálás nélkül PBS-ben mostuk. Az aspecifikus antitestek blokkolását 4%-os borjú serum albuminnal végeztük. A monoclonalis egér anti-connexin 43 antitesttel (Chemicon Inc, USA) +4 ºC fokon 1:100 –as hígításban 24 órán keresztül végeztük a reakciót. A primer antitestet indirekt FITC technikával tettük láthatóvá. A negatív kontrollt a primer antitest nélkül inkubáltuk. Pozitív kontrollként az állatok szívizom szövete szolgált.
Az elkészült fluoreszcens metszeteket konfokális lézer szkenning mikroszkóppal lefényképeztük (MRC 1024, BIO-RAD). A digitalizált képeket a Scion image programot felhasználva elemeztük. A mediára eso immunfluorescens pontokat a program leszámolta, és a mért felületnek megfelelo arányszámmal látta el. Az adatok százalékos megoszlást tükröztek. Az eredményeket one-way ANOVA és Tuckey- féle post hoc teszttel értékeltük.
Eredmények
A Cx43 fehérje ellenes antitesttel végzett immunhisztokémiai reakció eredményeként apró fluorescens pontokat láttunk
az aortafalon és a pozitív kontrollként használt
szívizomzatban egyaránt. ?2. ábra? A szívizomzatban a reakció foként az intercalaris
16
discusokon jelentkezett. Az aortában a media simaizomsejtek membránja és az endothelium festodött. A reakció intenzívebbnek bizonyult a media külso részein.
Nem találtunk különbséget sem az immunfluoreszcens pontok eloszlásában, sem a suruségében a különbözo csoportokból származó aorták médiájának vizsgálatakor. Ezt az észlelésünket a statisztikai vizsgálat is alátámasztotta (ANOVA, Tuckey- féle post hoc teszt). (1. Táblázat)
Ovariektomia Ösztradiolpropionate Medroxyprogeszteron acetate N
A ?
B ?
C ?
D ?
E ?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
%
%
%
%
%
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
0,25
0,39
0,29
0,27
0,35
0,22
0,29
0,27
0,39
0,21
0,25 0,19
0,23 0,29
0,3 0,27
0,29 0,22
0,27 0,27
0,22
0,27
0,29
0,26
0,19
0,37 0,29
0,25 0,19
0,19 0,21
0,23 0,21
0,34 0,25
0,34
0,32
0,3
0,21
0,26
0,25 0,27
0,21 0,2
0,24 0,2
0,25 0,27
0,29 0,21
0,28
0,24
0,21
0,24
0,23
0,21 0,26
0,28 0,22
0,36 0,25
Mean SD
0,26 0,05
0,26 0,06
0,26 0,05
0,26
0,26 0,05
0,26 0,05
1. Táblázat. Cx43 suruség a patkány aorta simaizom sejtekben a különbözo hormonkezelésben részesülo csoportok között (A, B, C, D, E). % jelenti a Cx43 pozitív reakciók területegységre számított százalékos megoszlását.
17
2. ábra lsd CD melléklet
18
5. Következtetések
Kísérletünk alapjául az a feltételezés szolgált, hogy az ösztrogén – akárcsak a méh simaizomsejt esetén – közvetlen befolyással bír a Cx43 expressziójára. Kísérletünk indításakor az ösztrogén védo szerepe a cardiovascularis történések tekintetében nagyon valószínunek tunt. A hormonpótló kezelést a human terápiában is széles körben alkalmazták. Nagy esetszámú vizsgálatok eredményei azt mutatták, hogy a hormonpótlás mellett a cardiovascularis események kockázata jelentosen, mintegy 30-40 %-kal csökkent (18, 30, 33, 81). A pontos hatásmechanizmus azonban még tisztázásra várt. Az ösztrogén kedvezo hatása a lipid profilra, valamint antioxidáns tulajdonsága nem magyarázta maradéktalanul a megfigyelt különbségeket. Felmerült, hogy az ösztrogénnek a vascularis endothelre közvetlen hatása is van. Ezt elobb kísérletesen igazolták, majd emberi erekben is kimutatták az endothelsejtekben – s késobb a vascularis simaizomsejtekben is az ösztrogén receptort (2, 11, 18, 30, 33, 81). Ugyancsak bizonyított volt a gap junctionok jelentos szerepe a vascularis simaizomsejtek muködésének összehangolásában (19, 22, 65, 69-70). Valószínunek tunt, hogy a vascularis simaizomsejtek connexin expressziója is hormonálisan szabályozott.
Kísérleti eredményeink ezt a feltételezést nem támasztották alá. Azonos mennyiségu és eloszlású jeleket kaptunk mind az öt csoportban az immunhisztológiai vizsgálat során. A petefészekirtott, de más szempontból intakt, normotenzív, normocholesterinaemiás állatok aorta-simaizomsejtjein nem találtunk a vizsgált gap junctionok tekintetében változást. A petefészekhormonok krónikus hiánya egyéb rizikófaktorok jelenléte nélkül nem módosította a Cx43 fehérjék bioszintézisét. Kísérletünkben nem találtunk összefüggést a hormonális status és a Cx43 expresszió között. Noha az expresszálódott csatornák
19
funkcionális állapotát nem vizsgáltuk, ezen eredményünk alapján úgy találtuk, hogy a szexualszteroidoknak nincs egyértelmu, jelentos hatása a vascularis simaizomsejtek gap junction csatornáira.
Az 1998-ban publikált Heart and Estrogen/Progestin Replacement Study (HERS) nagy meglepetést hozott. A cardiovascularis események száma a kezelés elso évében nagyobb volt a hormonpótlásban részesülok között, mint a kontroll csoportban (49). A négyéves kezelés további szakaszában már a placebo csoporthoz képest kisebb cardiovascularis morbiditás és mortalitás jellemezte a hormonpótlásban részesüloket, de végeredményben a kezelt és a placebo csoport morbiditása és mortalitása nem különbözött a teljes követési idore vonatkozóan. A HERS vizsgálatot követoen hamarosan megjelentek további közlemények,
melyek
hasonlóan
a
HERS
eredményeihez,
nem
igazolták
a
hormonpótlásnak a tényleges védo hatását. Koronarografiás vizsgálatok alapján nem tudtak különbséget kimutatni a konjugált ösztrogén monoterápia, vagy a konjugált ösztrogén + medroxiprogeszteron kezelésben részesülo ischaemiás szívbeteg nok, valamint a kontroll csoport között (44). Az utóbbi idok vizsgálatai alapján úgy tunik, hogy a hormonpótlás nem csökkenti az infarctus utáni stroke elofordulását sem (3). Az American Heart Association (AHA) 2001. augusztusi állásfoglalása szerint cardiovascularis betegség fennállása esetén noihormon-pótló kezelés bevezetése nem javallt (85). 2002-ben a National Institute of Health (NIH) közleményt adott ki, miszerint hormonpótlás primer prevencióként való alkalmazása sem javasolt (89).
20
E meglepo eredmények ismeretében nehéz magyarázatot adni a nemek közötti ill. a menopausa elott megfigyelheto szív-érrendszeri kockázat különbségre. Hypothezisünk felállítása óta az ösztrogénterápia megítélése gyökeresen megváltozott. Csekély öröm az ürömben, hogy eredményeink összecsengenek a nagy nemzetközi vizsgálatok végso megállapításaival: a hormonpótlást arányos dózisban alkalmazva állatkísérletünk során nem tudtunk szignifikáns változást igazolni az erek funkcionális alapegységének, a simaizomsejteknek a kommunikációt befolyásoló gap junction fehérjéinek expresszióját illetoen. Az ösztrogén szerepe, hatásmechanizmusa további tisztázásra vár.
21
II. Chlamydia pneumoniae fertozés
Az elmúlt években újra nagy figyelmet kapott a gyulladásos elmélet szerint bizonyos fertozo ágensek is szerepet játszhatnak az atherosclerosis pathogenesisében (42, 101). Eloször a Herpes simplex vírust, majd a Cytomegalovírust és a Helicobacter pylori-t is sikerült kimutatni atheroscleroticus elváltozásokban (79, 80, 125). Néhány éve – foleg sero-epidemiológiai vizsgálatok eredményeként a Chlamydia pneumoniae kóroki szerepe is felmerült (102).
Áttekintés a Chlamydia pneumoniae kutatás eredményeirol
A Chlamydiák obligát intracelluláris paraziták, amelyek nem képesek a szokásos energiahordozó
vegyületek
szintetizálására
(„energia-paraziták”
Moulder,
1974).
Egyedülálló fejlodési ciklusuk van: replikációjuk a fertozoképes és igen ellenálló, „spóraszeru” elemi testek (elementary body, EB) gazdasejthez való kitapadásával és endocitózisával kezdodik. Ezt követoen az EB az endosomán belül az un. retikulált testté (reticulate body, RB) alakul. A RB metabolikusan aktív és további RB-vé osztódik a növekvo endosomában, majd visszaalakul EB-vé, kiszabadul az elpusztított gazdasejtbol, és szomszédos sejteket fertoz meg (123). Az intracelluláris szaporodásuk miatt e baktériumok gyenge immunogenitásúak, az okozott fertozések gyakran krónikus formában zajlanak (58).
A Chlamydia pneumoniae-t eloször 1983-ban izolálták légúti fertozésekbol. Ekkor még a Chlamydia psittaci „humán” formájának tartották. Az új fajnak 1989-ben javasolták a Chlamydia pneumoniae elnevezést (123). E baktériumot azóta is mint a pneumoniák és
más légúti fertozések – bronchitisek, pharingitisek, sinusitisek és esetenként asthma okozóját tartjuk számon (40).
Az újabb mérföldko a Chlamydia pneumoniae „pályafutásában” az a finnországi tanulmány volt, amelyben Pekka Saiku és kollégái acut myocardiális infarctuson átesett betegek Chlamydia pneumoniae ellenes antitesteinek emelkedett titerét mutatták ki az egészséges kontrol csoporthoz képest (102). Ezt követoen sikerült a Chlamydia pneumoniae-t
atheromás
plakkokban
kimutatni
elektronmikroszkóppal,
immunhisztokémiailag és polimeráz láncreakció (PCR) technikával (63), majd e microorganismust izolálták közvetlenül is human atheroscleroticus plakkból (4, 72). Egészséges erekben nem találtak Chlamydia pneumoniae pozitivitást (23, 63). Az állatkísérletek eredményei ugyancsak valószínusítik a Chlamydia pneumoniae kóroki szerepét az atherosclerosis kifejlodésében. Chlamydia pneumoniae- val fertozött nyulak aortájában zsíros csík és preatheroma fejlodött ki (28). Ugyanakkor az acut myocardiális infarctuson
átesett
betegek
körében
a
makrolid
antibiotikumok
(azitromycin,
roxythromycin) csökkentették a cardiovascularis történések számát (34, 36).
Sejttenyészeten folytatott tanulmányok szerint a Chlamydia pneumoniae képes szaporodni endothel és simaizom-sejtekben, valamint macrophagokban (29). Ezekben a sejtekben in vivo is kimutatták a Chlamydia pneumoniae-t. A macrophagok/monocyták elszállíthatják a Chlamydia pneumoniae-t a légzorendszerbol az erekhez (9). A Chlamydia pneumoniae és egyes antigénjei, mint például a lipopolysacharidok (LPS) képesek hosszan megmaradni macrophagokban. A baktérium vagy a bakteriális antigén tartós jelenléte az érfalban gyulladáshoz vezet. A chlamydiális LPS kapcsolódik LDL- lel vagy az oxidált LDL- lel és a keletkezett komplex gyulladásos mediátorokat szabadít fel az endothel sejtekbol, továbbá
23
ezt a komplexet felveszik a macrophagok a scavanger receptorokkal, ami habsejtképzodéshez vezet (123). Az LPS ezen kívül megemeli a triglicerid szintet és csökkenti a HDL szintjét, így közvetve is atherogén hatású (66).
A fenti folyamatokban valószínuleg nagy szerepe van a „ho-sokk-proteinek”- nek (hsp). Az érfal hsp termelését a sejtek védelmében a hemodinamikai stress, valamint az oxidatív ártalmak indukálják. Az atherosclerosis rizikófaktorai, mint az emelkedett LDL szint, a diabetes, a dohányzás oxidatív stresszt okoznak, ily módon beindítják az érfal sejtjeinek hsp expresszióját. A hsp molekulák különbözo cytokinek megjelenését indukálják (IL-1, IL-2, TNF-? ) (76, 97). A chlamydialis hsp a human atheroscleroticus plakk macrophagjaiban gyakran megtalálható, és indukálja a TNF-? , valamint matrix metalloproteinase (MMP) termelését macrophagokban (61). In vitro kísérlet szerint a Chlamydia pneumoniae egy, a human macrophagok által termelt MMP, a 92 kDa gelatinase termelodését szelektíven növeli (119), továbbá a Chlamydia pneumoniae környezetében jelentosen emelkedett MMP-9 aktivitást is igazoltak (109). Ezek a fehérjék az érfalban a kollagén rostok degradációját idézi elo, elosegítik a monocyták érfali migrációját és talán a simaizomsejtek mediából az intimába való vándorlását is. A hsp expresszió és az atherosclerosis súlyossága korrelá l, ugyanakkor a human serumból izolált hsp ellenes antitestek a felszínükön hsp-t expresszáló endothelsejtek cytotoxicitását okozzák. Emelkedett anti- hsp szintet igazoltak carotis- és koszorúér- atherosclerosisban (17, 76, 97, 120). Az emelkedett anti-chlamydialis hsp szintet koszorúér betegségben önálló rizikófaktornak találták (73). A bakteriális hsp-ek az intercelluláris sejt adhéziós molekula (ICAM-1) termelodésének fokozódását okozzák (97). Ugyancsak leírták az ICAM-1, a monocyta chemotactikus protein (MCP-1) és az interleukin-8 termelodésének fokozódását Chlamydia pneumoniae-val fertozött humán endothel sejtekben (82). A
24
chemokinek és az adhé ziós molekulák fontos szerepet játszanak a gyulladásos folyamatok létrejöttében. A chemotaxis az atherosclerosis kialakulásának egyik kritikus pontja. A monocyta chemotacticus protein-1, valamint az interleukin-8 olyan chemotactikus proteinek, melyek felszaporodása monocyták és T sejtek megjelenését eredményezi, az adhéziós molekulák pedig a kitapadást és a sejtfalba való migrációt segítik (100, 101). Újabban kimutatták, hogy a Chlamydia pneumoniae-val fertozött keringo monocyták in vivo kitapadnak a carotis predilekciós helyein (75). Igazolták a Chlamydia pneumoniae- val fertozött endothel és simaizom sejtek a procoaguláns szöveti faktor (TF) és a plasminogén aktivátor inhibitor-1 termelését is (24).
Mindezek alapján nagyon valószínu, hogy a plakkokban talált Chlamydia pneumoniae nem secunder fertozés, hanem ok-okozati összefüggés van a fertozés és az atherosclerosis kialakulása között.
2. Saját vizsgálatok
A/ Chlamydia pneumoniae elofordulási gyakorisága különbözo cardiovascularis szövetekben - bal elülso leszálló coronaria (LAD) - aneurysmák, aorta dissectio - carotis-endarterectomiák és aorta-billentyuk - coronaria bypass graftok
25
LAD
Anyag és módszer A „Fiatalkori Arteriosclerosis Pathobiologiai Determinánsai” (PBDAY) elnevezésu WHO által koordinált tanulmány keretén belül gyujtött ér anyagot használtuk fel (51, 59). A programban hazánkból a Semmelweis Egyetem II. Pathológiai valamint Iga zságügyi Orvostani Intézete vett részt. A tanulmányban vizsgált halottak a 15-34 éves korcsoportba tartoztak, és váratlan halálok következtében hunytak el. ?40 eroszakos halál (54%), 9 etilizmus következtében (12%), 7 daganatos betegségben (10%), 9 szív-érrendszeri betegségben (12%), amibol 8 cardiomyopathia és 1 carotis interna thrombosis volt, 9 egyéb halálok (12%)?. A boncolás a halál beállta után legfeljebb 12 órával történt. Jelen tanulmányunkban a bal elülso leszálló koszorúereket vizsgáltuk (LAD). A Chlamydia pneumoniae immunhisztokémiai kimutatását a formalinban fixált, paraffinba ágyazott erek 3-3 meghatározott szegmensén végeztük el, az eredéstol 0,5, 2,5 és 3,5 cm-re lévo szakaszokon ?3. ábra? monoclonalis ellenanyaggal (RR 402; Washington Research Foundation). A reakciót streptavidin-biotin peroxidáz rendszerrel és chromogénnel tettük láthatóvá. Ugyanezen szakaszokat HE, orcein festés után szövettanilag osztályoztuk. Az osztályozás alapjául a Stary által javasolt beosztást tekintettük (112). ?I. típus: intimamegvastagodás, II. típus: intima- megvastagodás intracelluláris lipid- felszaporodással (zsíros csík; habsejt-csoportosulás a lumenhez közel), III. típus: preatheroma (kis mennyiségu extracelluláris lipid), IV. típus: atheroma, V. típus calcificálódott atheroma, VI. típus: fibrosus atheroma.? A 3-3 érszakasz esetén mindig a pozitív Chlamydia pneumoniae reakciót mutató érszakaszt, illetve a súlyosabb elváltozást tekintettük mérvadónak. Az adatokat kontingencia analízissel vizsgáltuk (függetlenség- vizsgálat ?2 próbával).
26
A Chlamydia pneumoniae immunreakció intenzitását az adott metszeten a következo kritériumok alapján értékeltük: 3+ az intenzív immunreakció nagy számú sejtben; 2+ a közepes mennyiségu sejtben megfigyelheto pozitív reakció (10-50 sejt); 1+ a gyenge immunreakció néhány sejtre korlátozódik. Minden metszetet két független vizsgáló értékelt. A Chlamydia pneumoniae-t tartalmazó sejtek tipizálása céljából a pozitív reakciót mutató érszakaszok paraffinos blokkjaiból 4-4 ? m-es metszeteket készítettünk, majd az immunhisztokémiai reakciót anti-human ? -simaizom actin (1:120) és anti- human macrophag (1:100) monoclonalis antitesttel elvégeztük. Az azonosított sejtek mennyiségét a fenti semikvantitatív módon becsültük meg. Eredményeinket egybevetettük a dohányzásra vonatkozó anamnesztikus adatokkal.
3. Ábra: Vizsgálatainkhoz felhasznált LAD szegmentek. 5 mm széles karikákat metszettünk le az ér eredésénél, az eredéstol 2,5 ill. 3,5 cm távolságra. A szakaszokat a továbbiakban LAD 1, LAD 5 és LAD 7 jelöléssel láttuk el. A szaggatott vonal oldalágat jelöl.
27
Eredmények A HE- festett metszetek alapján a 74 esetbol 19-ben találtunk épnek tuno arteriát vagy diffúz intima-megvastagodást, 23 esetben II. típusú elváltozást és 32 esetben III-IV típusú atheroscleroticus elváltozást találtunk. Chlamydia
pneumoniae
jelenlétét
igazoltuk
a
plakkokban
(IV-VI.
típus),
preatheromában és a II. típusú elváltozásban. Az ugyanazon metszeten az atheroma melletti épnek tuno érszakasz 4 esetben tartalmazott Chlamydia pneumoniae antigént. Észleltünk pozitivitást intima- megvastagodás (I. típus) esetén is. Nem találtunk pozitív reakciót elváltozás nélküli érszakasz intimájában és médiájában. ?2. Táblázat? A plakkokban szignifikánsan gyakoribb volt a pozitív reakció, mint a korai laesiokban (p <0,05; kontingencia analízis).
2. Táblázat. A Chlamydia pneumoniae pozitív esetek gyakorisága a különbözo atheroscleroticus elváltozásokban
0. típus
I. típus
II. típus
III. típus
IV. típus
Összes
5
14
23
15
17
Pozitív
?
1
7
6
11
?
?
7?
30 ?
40 ?
65 ?
A Chlamydia pneumoniae pozitivitás intenzitását elemezve azt találtuk, hogy a kevesebb sejtre kiterjedo reakció (1+ és 2+) foként a kezdo laesiokra volt jellemzo, míg az intenzív reakciót a súlyos atheroscleroticus elváltozások esetén láttuk ?3. Táblázat?.
28
C.p. reakció intenzitása
Korai laesio
III-VI típusú laesio
1+
5
2
2+
3
6
3+
-
9
N
8
17
3. Táblázat. Chlamydia pneumoniae reakció intenzitása korai és elorehaladott elváltozásokban. N az összes esetszám, 3+: intenzív immunreakció nagyszámú sejtben; 2+: közepes mennyiségu sejtet érinto pozitivitás (10-50 sejt); 1+: néhány sejtben megfigyelheto immunreakció.
A különbözo szegmentumokat (LAD 1, 5, 7) megvizsgálva a proximalis szegmentben (LAD 1) abban az esetben is intenzívebb reakciót találtunk, ha az atherosclerosis súlyossága a távolabbi szakaszok (LAD 5, 7) elváltozásaival megegyezett. A 25 pozitív koszorúér közül 11 esetben a proximalis szegmentre korlátozódott a pozitivitás, 7 esetben a másik két distalis szegmentum valamelyike volt pozitív. Mindössze egy koszorúérben igazoltunk mind a 3 szakaszra kiterjedo pozitivitást, 6 esetben a proximalis és valamely distalis érszakasz is pozitívnak bizonyult. Az alacsony esetszámra tekintettel statisztikai elemzést nem végeztünk.
Pozitív reakciót habsejtekben, valamint leggyakrabban a plakkok un „válli részén” lévo sejtekben detektáltunk ?4. ábra?. A simaizom és a macrophag markerekkel jelzett koszorúér- metszeteket elemezve azt találtuk, hogy a Chlamydia pneumoniae gyakrabban van jelen macrophagokban, mint simaizomsejtben ?5. ábra?.
29
4.-5. ábra, lsd CD melléklet
Gyakori volt az adventitia érintettsége is. Pozitív intima- media esetén 88 % -ban volt az adventitia is pozitív. Pozitív reakciót adó adventitiát figyeltünk meg több olyan esetben is, ahol az intima és a media nem reagált a Chlamydia pneumoniae elleni antitesttel (49 esetbol 29 pozitív, 59%) ?4. Táblázat?. Az atheroscleroticus laesiok adventitiája 75%ban volt pozitív, a laesio-mentes erek 32%-a. A különbség statisztikailag nem bizonyult szignifikánsnak.
pozitív I-M
negatív I-M
pozitív A
negatív A
pozitív A
negatív A
22
3
29
20
4. Táblázat. Chlamydia pneumoniae pozitivitás az intima-média és az adventitia terüle tén. I-M: intima és media; A: adventitia. A számok az eloforduló esetek számát jelentik.
A pozitív esetek anamnézisében 17–nél szerepelt a dohányzás, a nemdohányzók közül 3 esetben lett pozitív a Chlamydia pneumoniae vizsgálat. Kontingencia analízissel a dohányzás és az erek Chlamydia pneumoniae elofordulása között összefüggést tudtunk igazolni. (p<0,05). ?5. Táblázat?.
D C. pneumoniae N
Nd
+
-
+
-
17
25
3
20
5. Táblázat. A C. pneumoniae elofordulása dohányzók és nemdohányzók ereiben D: dohányzók, Nd: nemdohányzók, N: esetszám
Aneurysmák, aorta dissectio Anyag és módszer
Aneurysma: a II. sz. Pathológiai Intézet érsebészeti anyagai közül 15 hasi aorta aneurysmát vizsgáltunk. A szövetek 55-75 év közötti betegektol származtak, átlag életkoruk 68 év volt. A paraffinba ágyazott szöveteken eloször hagyományos érfestéseket alkalmaztunk (HE, orcein, PAS). A paraffinos blokkokból párhuzamos metszeteket készítettünk és a „LAD anyag
és
módszer”
fejezetben
részletezett
módon
a
Chlamydia
pneumoniae
immunhisztokémiai kimutatását elvégeztük.
Aorta dissectio: Intézetünk érsebészeti anyagából 9 aorta dissectiot mutató szövetet is megvizsgáltunk. A szövetek 24-56 év közötti betegek felszálló aortáiból származnak (átlagéletkor: 49 év, férfi/no arány: 6: 3). A paraffinos blokkból 4 µm vastag metszeteket készítettünk. HE, orcein és PAS festés után elvégeztük a Chlamydia pneumoniae kimutatását.
Eredmények
Szövettanilag mind a 15 aorta aneurysma atheroscleroticus elváltozás mutatott, gyulladásos infiltrációval. Chlamydia pneumoniae antigén jelenlétét a 15 aorta aneurysma immunhisztokémiai vizsgálata során 13 esetben igazoltuk (13/15, 86%). A vizsgált aorta dissectiok közül 6 pozitív esetet találtunk (6/9, 66%). 6.Táblázat, 6-7. ábra. Az alacsony esetszám miatt statisztikai elemzést nem végeztünk, a százalékos értékek csupán a tendenciát jelölik.
32
6. Táblázat. Chlamydia pneumoniae elofordulása aorta aneurysmában és dissecált aorták falában.
N
Aorta aneurysma
Aorta dissectio
Pozitív
13
6
Negatív
2
3
Összes
15
9
%
86
66
6-7 ábra CD melléklet
33
Carotis-endarterectomiák és aorta-billentyuk Anyag és módszer
A 14 carotis endarterectomiat és a 15 aorta-billentyu resecatumot a Szegedi Orvostudományi Egyetem Érsebészeti Klinikájáról kaptuk a Chlamydia pneumoniae jelenlétének meghatározása céljából. A formalinban fixált, paraffinba ágyazott szöveteket HE, orcein és RF festés után szemikvantitatív módon osztályoztuk a bennük fellelheto Ca, thrombus és gyulladásos jelek alapján. (7.-8.Táblázat) Az aorta billentyuk indításánál igyekeztünk mind a meszes billentyu-területrol, mind pedig az épnek tuno (ha volt ilyen) területrol mintát venni. A carotis endarterectomiák 54-79 év közötti személyekbol (átlag: 69 év, férfi/no arány 11:3), az aorta billentyuk 32-74 éves betegekbol származtak (átlag: 59 év, férfi/no arány 5:10). A Chlamydia pneumoniae immunhisztokémiai kimutatását a fentiek szerint végeztük.
Eredmények
A carotis endarterectomiák 92%-a (13/14) pozitívnak bizonyult Chlamydia pneumoniae immunhisztokémiai vizsgálat során. 7. Táblázat.
34
kor/nem gyulladás
Ca
thrombus
C. p
71/ffi
-
+
+
-
54/ffi
+
-
-
+
64/ffi
-
-
-
+
61/no
-
-
-
+
72/ffi
-
2+
-
+
58/ffi
-
+
-
+
69/ffi
-
+
-
+
66/ffi
-
3+
-
+
64/ffi
-
-
-
+
79/no
+
-
-
+
64/ffi
+
2+
-
+
73/ffi
-
3+
+
+
74/no
-
+
-
+
54/no
-
-
-
+
7. Táblázat. Chlamydia pneumoniae pozitív reakció carotis endarterectomiák falá ban. Az ábrán jelöljük a szövettani vizsgálat során észlelt gyulladásos elváltozások, thrombus és a Ca2+ jelenlétét is. C.p: Chlamydia pneumoniae.
Aorta billentyu: a 15 vizsgált billentyu közül 6 adott pozitív reakciót (40%). Az épnek tuno területeken az immunhisztokémiai reakció minden esetben negatív volt. Nem találtunk semmi összefüggést a billentyuben jelenlévo gyulladás, meszesedés és vascularisatio, valamint a vizsgált bakteriális antigén pozitivitása között. 8. Táblázat, 8. ábra.
35
kor/nem gyulladás
Ca
thrombus
C. p
66/no
+
2+
-
+
70/ffi
-
3+
-
-
71/no
-
3+
-
-
62/no
-
-
-
-
47/ffi
-
-
-
+
70/no
-
-
-
-
55/ffi
-
-
-
-
32/no
-
-
-
+
68/no
-
-
-
-
45/no
-
2+
+
+
34/ffi
+
+
-
-
61/no
-
-
-
-
63/no
-
2+
-
+
70/no
+
3+
-
+
8. Táblázat. Az aorta billentyuk elemzése a falban található gyulladásos jelenségek, Ca2+, thrombus ill. pozitív Chlamydia pneumoniae immunhisztokémiai reakció alapján.
8. ábra lsd CD melléklet
36
Coronaria bypass graftok vizsgálata
A vizsgált 34 elzáródott coronaria bypass graft 21 újraoperált személybol származott. Az átlagéletkor: 61 év, 19 férfi, 2 no. Az elso bypass operáció és az ismételt operáció között átlagosan 10 év telt el. A 34 graftból 30 vena saphena graft volt, 4 pedig az arteria mammariából származott. Az ismételt operáció során 0,5-4 cm hosszúságú elzáródott szakaszt nyertünk, majd a szövetet 4%-os pufferolt formalinban fixáltuk. 28 új, beültetésre szánt érbol is vettünk mintát, 24 a vena saphenaból, 3 a radialis arteriából és 1 az arteria mammaria internaból származott. Az érmintákat a szokásos rutinfestések (HE és orcein) után fénymikroszkóppal megvizsgáltuk, majd párhuzamos metszeteken elvégeztük a Chlamydia pneumoniae immunhisztokémiai vizsgálatát. Pozitív kontrollként Chlamydia pneumoniae- val
megfertozött
HL
sejteket
használtunk,
negatív
kontrollként
az
inoculációban nem részesülo HL sejtek szolgáltak.
Az újraoperált betegek serumából a III. Belgyógyászati Klinikán, együttmuködés keretén belül elvégezték az IgG típusú anti-cholesterin antitest (ACHA) titerének meghatározását, és az eredményt összevetettük egészséges kontrolloktól származó mintákkal, valamint az immunhisztokémiailag
igazolt
Chlamydia
pneumoniae
pozitivitással.
Az
ACHA
meghatározást a serum 0,1 %-os kazein oldattal való 1:400 arányú hígítása után ELISA módszerrel végezték (ELISA Reader 490 nm, referencia 620) (48). Kontroll serum hasonló koreloszlású, egészséges populációtól származott. Statisztikai analízist a Mann-Whitney – féle teszttel végeztük.
37
Eredmények
Az elzáródott graftok intimájában és mediájában az immunhisztokémiai vizsgálat során 82%-ban találtunk Chlamydia pneumoniae antitest pozitivitást (28/34). Az adventitia egy érszakasz kivételével minden esetben pozitív volt (97%). 9-10 ábra. Lsd CD melléklet
38
A 24 beültetés elotti vena saphena közül 20 nem varicosus, 4 varicositást mutató ér volt. 9 nem varicosus vena falának intima- media részén pozitív lett a Chlamydia pneumoniae reakció (45%), ugyancsak pozitív lett 19 nem varicosus vena adventitiája (95%). Mind a 4 varicosus, beültetés elotti vena intima- media és adventitiája pozitív lett. Az új arteria graftok intima- mediája mentes volt a vizsgált bakteriális antigéntol, de az adventitiájuk pozitívnak bizonyult.
ACHA meghatározás: valamennyi vizsgált serum tartalmazott ACHA-t. Az ACHA szintek kissé alacsonyabbak voltak a reoperált személyektol származó serumban, mint a kontroll serumban, de a különbség nem volt szignifikáns (p=0,077).
Megbeszélés A fiatal felnottek ereiben talált érelváltozások vizsgálatával fontos adatok nyerhetoek annak tisztázására, hogy a fertozés az atherosclerosis progressziójában vagy a keletkezésében játszik-e szerepet. Az irodalmi adatok szerint mindösszesen két közlemény foglalkozik a C. pneumoniae elofordulásával fiatalon elhunytakból származó erekben (23, 63). A Kuo és munkatársai által vizsgált populáció életkora megegyezik az általunk vizsgáltéval (15-34 év), a 49 esetben a 11 intima- megvastagodásból 2 (18%), a 7 atheromából 6 (86%) adott pozitív reakciót és nem találtak pozitív reakciót az ép erekben (63). A koszorúér betegségek szempontjából alacsony rizikócsoportba tartozó alaszkai indiánok között (1557 év, átlag 34 év) az I.-II. típusban a 11 esetbol 7 (39 %), a III.-VI típus esetén a vizsgált 40 esetbol 15 (38 %) eset bizonyult Chlamydia pneumoniae pozitívnak (23).
39
Saját eredményeink szerint a III.-VI típusú elváltozások 53%-a bizonyult Chlamydia pneumoniae pozitívnak. Ez az eredmény az átlag amerikai ifjúság és az alaszkai népcsoport ereiben talált Chlamydia pneumoniae fertozöttség közé esik, holott a cardiovascularis halálozás hazánkban magasabb, mint az Egyesült Államokban. A százalékos adatok értékelésekor gondolnunk kell arra, hogy az alacsony esetszám miatt az adatok egy-egy újabb ér figyelembe vételekor jelentosen módosulhatnak. A tendencia azonban - az általunk vizsgált éranyaggal együtt - mindhárom fiatal populációt vizsgáló tanulmányban azonos: a laesio nélküli erek nem tartalmaztak Chlamydia pneumoniae baktérium antigént, a korai és az elorehaladott elváltozások közül a súlyosabb laesiokban általában gyakrabban fordult elo a Chlamydia pneumoniae, ami e baktériumnak a betegség progresszióját befolyásoló szerepét veti fel. Tanulmányunkban
a
Chlamydia
pneumoniae-t
foként
a
proximalis
érszegmentumban igazoltuk. Ugyancsak jellemzoen a proximalis szakaszon volt intenzívebb
az
immunreakció.
Minthogy
a
vizsgált
proximalis
szegmentek
atheroscleroticus elváltozásai nem voltak súlyosabbak a distalis szakaszok elváltozásainál, elképzelhetonek tartjuk, hogy a bifurcatio által okozott, a proximalis szakaszokat érinto nagyobb áramlási stressz hajlamosít a Chlamydia pneumoniae érfali inváziójára. A proximalis szakaszt érinto változások kiemelkedo jelentoséguek, hiszen az acut myocardialis infarctust foként a LAD proximalis szakaszának elzáródásával hozzák összefüggésbe (111). Pozitív reakciót az endothel sejtekben, a macrophagokban és a simaizomsejtekben találtunk. Az antigént tartalmazó sejtek többsége macrophag eredetunek bizonyult, mely eredmény a macrophagok transporter szerepét támasztja alá. Atheroma esetén a lipidmagban, valamint jellemzoen a plakkok „válli” régiójában bizonyult intenzívnek az immunreakció. Ugyancsak a plakkok válli régiója és a lipid-mag az a terület, ahol a MMP
40
expresszió különösen fokozott. Mivel a Chlamydia pneumoniae fokozza egyes MMP proteinek termelodését (61, 119), segítheti a plakk kialakulását, és tovább csökkentheti a plakk stabilitását. Irodalmi adatok szerint a Chlamydia pneumoniae és más rizikófaktorok között kapcsolat van: így a dohányzás, a lipid profil eltérések, a hypertensio között (35). Beteganyagunkban vizsgáltuk a dohányzás és a Chlamydia- fertozés kapcsolatát. A dohányzás és a pozitív esetek közt az összefüggés szignifikáns volt, a nemdohányzók ereiben lényegesen kevesebb volt a Chlamydia pneumoniae fertozés. Úgy gondoljuk, hogy ennek oka a dohányzásnak az erekre gyakorolt káros hatásában rejlik. A károsodott intima permeabilitása, adhéziós kapacitása megno (101), így könnyebben fertozodik. Másfelol a dohányzással együtt járó chronikus bronchitis Chlamydia pneumoniae fertozéssel társulhat (40), és a fertozött légutakból a Chlamydia pneumoniae-t a monociták az erekhez szállítják. Az irodalom pozitív leletként a plakk területén, azaz az intimában és legfeljebb a mediában észlelt pozitív immunhisztokémiai reakciót értékeli. Az adventitia érintettségével kevés tanulmány foglalkozik (45, 126). A mi anyagunkban az adventitia érintettsége meglepoen gyakori volt mind az atheroscleroticus laesiok, mind a laesio-mentes erek esetén. Miért pozitív az adventitia olyan esetekben is, amikor az intima nem ad reakciót? Kell-e foglalkoznunk az adventitiával is, van-e jelentosége a Chlamydia pneumoniae- val fertozött adventitiának? Az adventitia Chlamydia pneumoniae pozitivitását egy tanulmány rupturált plakkok esetén szignifikánsan gyakrabban észlelte, mint nem-rupturált plakkok esetében (45). Az adventitia általunk is észlelt magas érintettsége felvet egy másik fertozési módot a lumen felöli fertozodés mellett. Elképzelheto, hogy a fertozés „kívülrol”, a vasa vasorumok felol is eljuthat az erekhez (126). Véleményünk szerint a fertozött adventitia a media és az intima késobbi fertozodésében is szerepet játszhat. Ugyanakkor
41
tekintetbe véve, hogy ép intimájú arteriák adventitiájában is jelentos számban találtunk chlamydialis antigén pozitivitást, valószínubb, hogy az atherosclerosis kialakulásában az intima lumen feloli fertozodése a lényegesebb. A Chlamydia pneumoniae a vasa vasorum keringésére is hatással lehet. A vasa vasorum kísérletes eltávolítása az aorta külso harmadában media necrosist idézett elo (113). Az adventitia fertozöttsége ronthatja a media adventitia felöli vérellátását. Az aorta aneurysmák vizsgálata során az irodalomban közölt tanulmányokkal összhangban mi is az aneurysmák jelentos hányadában igazolni tudtuk Chlamydia pneumoniae jelenlétét. Egy esettanulmányban 40 vizsgált aorta aneurysmából PCR technikával 14-ben sikerült Chlamydia pneumoniae DNS-t kimutatni (35%), a kontroll aortákból mindössze 2 esetben igazolták e microorganizmus jelenlétét (2/40, 5%) (94). Karlsson és társai (2000) az általuk vizsgált 26 hasi aorta aneurysma közül 20 esetben igazolták a fertozés jelenlétét pozitív immunhisztokémiai vizsgálattal (77%), ebbol 10 alkalommal e kórokozó tenyésztése is sikeres volt (56). A Chlamydia pneumoniae kimutatását illetoen általánosan elmondható, hogy kevésbé sikeres a PCR technika az immunhisztokémiai vizsgálatokhoz képest. Azokban a vizsgálatokban, amelyek mind PCR-t mind immunhisztokémiát is használtak, a PCR technikával igazolt Chlamydia jelenlét alacsonyabb esetszámot eredményezett, mint az immunhisztokémia (23, 63). Ennek hátterében az is állhat, hogy az aorta aneurysmák falában inkább az antigén tartós jelenléte jellemzo, nem pedig a fertozo ágens (78). Ugyanakkor a fertozés tényleges kóroki szerepét támaszthatják alá serologiai vizsgálatok, melyek során az aorta aneurysmában szenvedo betegek többségében serum pozitivitást igazoltak (14, 15, 68, 74). A krónikus Chlamydia pneumoniae fertozés jelentoségét (perzisztáló antigén!) húzza alá, hogy az aneurysma progressziója és az emelkedett (20 ill. 32 feletti) Chlamydia pneumoniae ellenes IgG és IgA antitest titer között összefüggést találtak (68). Itt kell megemlítenünk
42
azt is, hogy a hasi aorta aneurysma falából Chlamydia pneumoniae specifikus T lymphocytákat sikerült nyerni (41). Mindez azt sugallja, hogy ezen betegség esetén a gyulladásos folyamatokban aktívan vesz részt az általunk is vizsgált baktérium. E nagyszámú tanulmány mellett, mely a baktérium jelenlétét volt hivatott igazolni, megjelentek a kóroki szerepére irányuló klinikai vizsgálatok is az aneurysma-kutatásban. Hasi aorta aneurysmában (átméro <55 mm) szenvedo betegek 34 fos csoportja részesült 3 hónapos doxycyclin kezelésben, ill. kapott placebót. További 18 hónapig ellenorizték az állapotukat. A doxycyc lin kúrában részesülok körében szignifikánsan kisebb volt az aneurysma növekedésének mértéke (86). Az aorta dissectiot egészen napjainkig degeneratív folyamat eredményének tekintettük. Pathogenezisében a media elastikus rostjainak és izomelemeinek gócos pusztulásával járó folyamatoknak tulajdonítottunk alapveto szerepet. Szövettanilag az alapállományt érinto degeneratív elváltozások dominálnak. /Pathologia – egyetemi tankönyv 481-482. old./ (62). Újabban felmerült, hogy bizonyos fertozéseknek is szerepe lehet a pathomechanizmusban. Egy tanulmány a carotis arteria dissectio elemzése során szignifikáns összefüggést talált a dissectio és a légúti fertozések között (32). Az általunk vizsgált 14 carotis endarterectomia 13 esetben tartalmazott Chlamydia pneumoniae antitestet. Ez az eredmény az irodalomban fellelheto adatokkal korrelál (21, 126). Habár a carotisok szerkezete némileg eltér az aortáétól, megvizsgáltuk immunhisztokémiai módszerrel a baktérium jelenlétét dissecált aorták falában. A baktérium antigénjei az esetek több mint felében megtalálhatóak voltak anyagunkban. Jelen ismereteink szerint ezt az összefüggést eddig még nem vizsgálták. A fentiek alapján elképzelhetonek tartjuk, hogy bizonyos esetben az érfalban lévo antigén generálhat olyan folyamatokat, melyek a media mechanikus faktorokkal való ellenállását rontják. Igazolt, hogy az aorta dissectio acut és subacut fázisaiban a hematoma mögötti terület MMP aktivitása megemelkedik (103). A
43
Chlamydia pneumoniae fertozés és az MMP fokozott expressziója bizonyított (61, 109, 119). Tanulmányunkban e lehetoség elemzésére nem tértünk ki, a feltételezés további vizsgálatok tárgyát képezheti. A stenotikus aorta billentyuk Chlamydia pneumoniae fertozöttségére vonatkozó irodalmi adatok összhangban vannak a vizsgála taink eredményével (53, 54, 91). Az a tény, hogy a kardiológiai indikáció alapján eltávolított aorta billentyuk is tartalmazhatnak chlamydiális antigént, míg az ép területeken nem mutatható ki a baktérium, alátámasztja e baktérium általános szív- és érrend szeri károsító szerepének lehetoségét. További megerosítést kapott ez a szemlélet Juvonen és munkatársai (1997) azon munkája során, melyben fiatal egészséges egyének billentyuin sikerült kimutatni a kórokozót. A makroszkóposan épnek tuno billentyuk 44%-ában (15/34), az un. korai laesiot mutató billentyuk 83%-ában (10/12) igazolták a Chlamydia pneumoniae jelenlétét (53-54). Ezek alapján feltételezheto, hogy a Chlamydia pneumoniae szerepet játszik mind a korai billentyu elváltozások, mind pedig a stenosis kifejlodésében. A késoi graft elégtelenség okainak elemzésekor a Chlamydia pneumoniae kóroki szerepét a közelmúltban több tanulmány is vizsgálta (7, 8, 124). Ezek a vizsgálatok kimutatták ugyan az elégtelenné vált graftok egy részében (25%) a Chlamydia pneumoniae-t, ám ez az arány nem támasztotta alá a baktérium kóroki szerepét a graft elzáródásában. Ugyanakkor érdemes megjegyezni, hogy e tanulmányok nem az immunhisztokémiai vizsgálatot alkalmazták a kórokozó kimutatására, hanem a PCR technikát. A PCR technika során a Chlamydia pneumoniae prevalenciája elmarad az immunhisztokémiai vizsgálatok eredményeitol (lsd. fent). Saját vizsgálataink során immunhisztokémia alkalmazásával a különbözo atheroscleroticus szövetminták PCR technikával kapott adataihoz képest nagyobb hányadban találtunk Chlamydia pneumoniae pozitivitását. Ez a megállapításunk a carotis endarterectomiák vizsgálataira is vonatkozik,
44
amely esetben különösen magas volt a találati arány, más érszakaszokon végzett vizsgálatainkhoz képest is. Bár az is nyilvánvaló, hogy az elzáródott bypass graftok súlyosabb atheroscleroticus elváltozásokat tartalmaztak. További megfigyelésünk, hogy a beültetésre kerülo venák falában nagy számban fellelheto chlamydialis antigén, míg az arteria graftok beültetés elott csak az adventitiának megfeleloen mutattak pozitív reakciót. Annak a régóta vizsgált ténynek a tükrében, hogy az arteria graftok hosszabb életuek, mint a vena graftok, ezen eredményünk a kis esetszám ellenére is elgondolkoztató. Az anti-cholesterin antitest (ACHA) állatkísérletek eredménye szerint véd az atherosclerosis kialakulása ellen (47). Egészséges emberek serumából az eddigi vizsgálatok alapján mindig kimutatható. Az ACHA szint jelentosen alacsonyabb perifériás érbetegségben, valamint a cerebrovascularis betegségben szenvedo betegek esetén, ugyanakkor a cardiovascularis betegségben szenvedok ACHA titere emelkedettebb, mint a kontroll egyénektol vett mintákban mért ACHA szint (48). A re-operációra kerülo betegek vizsgálata során mérsékelten csökkent ACHA titert találtunk. Tekintettel arra, hogy az általunk vizsgált személyek érmintáiban 95 %-ban igazoltunk Chlamydia pneumoniae fertozést,
a
tervezett
összehasonlítást
ACHA
titer
–
Chlamydia
pneumoniae
vonatkozásában nem tudtuk elvégezni. Újabb, nagy esetszámú vizsgálat szerint azonban nem sikerült összefüggést kimutatni a Chlamydia pneumoniae fertozés és az ACHA szérumszintje között (120). Következtetés A Chlamydia pneumoniae-t egyöntetuen gyakrabban igazoltuk atheroscleroticus laesiokban illetve azok adventitiájában, mint laesio- mentes érben. A Chlamydia pneumoniae jelentos elofordulása a különbözo cardiovasculáris mintákban felveti a baktérium általános cardiovascularis pathogen szerepét. A fertozés felelos lehet mind az atherosclerosis kialakulásában, mind a progresszióban.
45
B/ A falvastagság és a Chlamydia pneumoniae jelenléte koszorúerekben - metodika; eredmények; következtetések
Bevezeto „Az atherosclerosist lényegében az atheromának nevezett intimális plakkok jellemzik. Ezek bedomborodnak a lumenbe, meggyengítik az alattuk fekvo mediát.” (Jellinek: A Pathologia alapjai – egyetemi tankönyv 278. o.) (62) Az American Heart Association által 1992-ben közzétett állásfoglalás szerint az „advanced” azaz az elorehaladott laesiora az intimában megfigyelheto lipid-accumulatio és az ezzel járó szerkezeti desorganisatio, megvastagodás és érfali deformáció jellemzo – míg a kezdo laesiok esetében az intima szerkezetének felbomlása minimális, a laesio alatt fekvo media és adventitia pedig érintetlen (112). Az elmúlt években elotérbe kerültek olyan elképzelések is, amelyek az atherosclerosist mint az érfal egészének betegségét vizsgálják. Tracy és munkatársai (1998) összefüggést találtak a koszorúerekben a media megvastagodása és az atheroma jelenléte között. Hosszában felmetszett koszorúér szegmenteket vizsgáltak, és úgy találták, hogy azokon az artériákon, ahol atheroma elofordul, mind az intima, mind a media vastagabb egyebütt (atheroma mentes érszakaszokon), és ez a megvastagodás nem jár az intima illetve a media sejtsuruségének növekedésével (116, 117). Úgy találták, hogy a media megvastagodása az atheroma kifejlodése szempontjából fokozott kockázatot jelez (117). Vizsgálataik szerint a media megvastagodása együtt jár az intima fibroplastikus megvastagodásának felgyorsulásával. Az Intézetünkben a WHO által szervezett „PBDAY” tanulmányban a 15-34 éves korcsoportban a bal elülso leszálló koszorúér és az aorta esetében az intima / media ratio korral összefüggo emelkedését észleltük (59). Napjaink széles körben elfogadott nézete szerint az intimaproliferáció simaizomsejtjei a mediából chemotactikus ingerekre az
46
intimába migráló és ott proliferáló simaizomsejtek (112). Ez a gondolat alapjául szolgálhat a feltevésnek, miszerint a media megvastagodása, hypertrophiája megelozné az atheroma kialakulását. Az athe rosclerosis kulcsfontosságú eseményének jelenleg – a gyulladásos elmélet alapján - az intimában zajló macrophag akkumulációt tartjuk (101). Habár számos tanulmány vizsgálta, elemezte a Chlamydia pneumoniae kóroki szerepét az atherosclerosis kialakulásában, perdönto eredmények jelenleg még nem állnak a rendelkezésünkre. Újabban összefüggést találtak az arteriák falvastagsága és a serológiailag igazolt Chlamydia pneumoniae fertozés között (26). Jelen munkánkban vizsgáljuk a bal leszálló koszorúér különbözo szegmenseinek megvastagodását igazolt távolabbi atheroma megléte, illetve elváltozásmentes ér esetén, valamint a falvastagodás összefüggését immunhisztokémiailag igazolt Chlamydia pneumoniae fertozéssel. Immunhisztokémiai módszerrel igazolt fertozés és a falvastagodás összefüggéseit az irodalomban fellelheto adatok szerint eddig még nem tanulmányozták.
Anyag és módszer
Az anyaggyujtés, a klasszifikáció és a Chlamydia pneumoniae immunhisztokémiai reakció részleteit illetoen utalok az elozo fejezetre. 1. Morfometriai vizsgálat fiatalon elhunytak (15-34 év) bal elülso koszorúerein (LAD), azok 3-3 szakaszán, összesen 30 eset 90 mintáján történt. ?3. ábra? A mintákat 2 alcsoportra osztottuk. „A” artériák: az artéria más szegmensein sem találtunk atheromát, non-A arteriák: a koszorúér más szakaszán atheromát igazoltunk. A 4 µm vastag, HE festett paraffin metszetekrol digitális fényképek készültek. A továbbiakban image analysis (Scion Image for Windows version Beta 4.0.2., Scion Corporation) program segítségével az érfal különbözo részeinek vastagságát (intima és media) a lemért terület és az intima
47
belso felszínének erre a területre eso hossza alapján számítottuk. (A vizsgált területek kiválasztásakor törekedtünk arra, hogy a lamina elastica interna a leheto legkevésbé legyen hullámos a lemért területen.) Az eredményeket statisztikai vizsgálat során értékeltük. 1. Morfometriai vizsgálat Chlamydia pneumoniae antigén jelenléte függvényében: Az elozoleg Chlamydia pneumoniae antigén vizsgálatba bevont 74 koszorúér közül kiválasztottunk 8 proximalis érszakaszt (Chlamydia antigénre nézve 4 pozitív és 4 negatív LAD 1 szegmens, a bal leszálló koszorúér eredésétol 1 cm- nyi távolságon belüli szakasz), melyek hisztológiailag I és II típusú laesiot tartalmaztak és a non-A csoportba tartoztak, azaz az érszakasz távolabbi szegmensei sem tartalmaztak atheroscleroticus elváltozást. A fentiek szerint lemértük a felso intima (intima a myoelasticus rész nélkül) és a media vastagságát, valamint a lemért területre eso sejtsuruséget ?11. ábra?. Lsd CD melléklet
48
A hypertrophia index számítására Tracy tanulmányát alapul véve (116) egy új módszert fejlesztettünk ki. A hypertrophia indexet az adott réteg átlagos vastagságának és sejtsuruségének hányadosaként kaptuk. A myoelasticus réteget, mely az intima media felé határos részét képezi és az un. felso intimától jelentosen eltér szerkezetileg - nagy sejtsuruség jellemzi, nem tekintheto stabilnak, valószínuleg folyamatosan változó szövet -, kizártuk a hypertophia index meghatározásakor. A felso intima (intima a myoleasticus réteg nélkül), a myoelasticus réteg és a media hypertrophia index értékeit összevetettük a Chlamydia immunhisztokémiai reakciók eredményével.
Statisztika: ANOVA analízist alkalmaztunk. Korreláció vizsgálata kontingencia teszttel történt. A szignifikancia szint minden esetben 0,05 volt.
Eredményeink:
A LAD proximalis
szegmensén mind az intima, mind a media megvastagodott, ha
atherosclerosis az ér más szakaszán jelen volt („A” artériák). A relatív intimamegvastagodás nem mutatkozott kórjelzonek a koszorúerek proximalis szakaszán. Ezzel szemben a distalis szakaszokon (LAD 5 ill. LAD 7: 2,5 ill. 3,5 cm- nyire az ér eredésétol) a relatív intima- megvastagodás kórjelzonek bizonyult, ha az ér egyéb részén már kialakult az atheroma. ?9.Táblázat?
49
Vizsgált érszakasz
LAD 1
LAD 5
LAD 7
Atherosclerosis
A
non A
A
non A
A
non A
n
15
15
15
15
15
15
149 ?17
115 ?19
109 ? 18
101 ? 11
79 ?13
92 ?8
I (um) ? SEM
153 ?11
123 ?11
91 ?11
70 ?7
44 ?7
30 ?9
I/(I+M) ? SEM
50% ? 3
51% ? 3
45% ? 3
38% ? 4
36% ? 3
22% ? 3
M
(um) ? SEM
9. Táblázat. Az átlagos falvastagság a bal leszálló koszorúér (LAD) különbözo szakaszain, a koszorúérben
eloforduló
atheroscleroticus
elváltozások
függvényében.
A:
kimutatható
atheroscleroticus elváltozás a koszorúérben, non A: nem igazolható atherosclerosis másutt a koszorúéren. Szignifikáns vastagodást találtunk a proximalis szegmens mindkét vizsgált rétegében, és szignifikáns növekedést észleltünk a distalis szegmensek relatív intima vastagságában az atherosclerosis megléte esetén (A versus nonA). A szignifikáns értékek (P< 0,05) vastagon szedettek. M: media, I: intima, SEM: standard error of means.
A Chlamydia fertozés emelkedett hypertrophia index értékekkel járt együtt mind az intimában, mind a mediában, mely az intercellularis matrix felszaporodását valószínusíti. ?10. Táblázat? Hasonló elváltozások nem voltak a myoelasticus rétegben megfigyelhetoek. Az intima és a media vastagsága megnott ugyan Chlamydia fertozés jelenlétekor, ám ez nem bizonyult statisztikailag szignifikánsnak.
50
Chlamydia pneumoniae
negatív
pozitív
Felso intima vastagság (? m)
104 ± 21
119 ± 17
Media vastagság (? m)
117 ± 11
129 ± 15
Hypertrophia index - intima (? m3 ) 27781 ± 2166 42889± 1034 Hypertrophia index - media (? m3 ) 26033 ± 5471 39952 ± 5581
10. Táblázat Falvastagság és hypertrophia index a Chlamydia pneumoniae antigén pozitív és negatív koszorúerekben. A felso intima és a media átlagos vastagságának megnövekedése figyelheto meg Chlamydia antigént tartalmazó koszorúerekben. A hypertrophia index mind a felso intima, mind a media esetében szignifikáns növekedést mutatott Chlamydia pozitív esetekben a Chlamydia negatív coronariákhoz képest. A szignifikáns értékpárokat (P< 0,05) vastagon szedtük. ± értékek: SEM (standard error of mean).
51
Megbeszélés
A nemzetközi irodalom napjainkig elfogadott álláspontja szerint az intima megvastagodás (adaptív intimaproliferáció) hajlamosít az atheroma kialakulására (72). Jelen munkánkban azt vizsgáltuk, hogy milyen összefüggés mutatható ki a media változásai és az atheroma megjelenése között fiatalok koszorúereiben. Vizsgálataink alapjául Tracy és munkatársainak tanulmánya szolgált. Hosszában feltárt koszorúerek vizsgálatakor azon erekben, ahol atheroma elofordult, az elváltozás- mentes érszakaszokon a media vastagabbnak bizonyult, mint az egészséges erek mediája (116, 117). E tanulmányaikban arra az érdekes álláspontra jutottak, hogy az intima megvastagodását a media hypertrophiája megelozi - koszorúerekben. Vizsgálataink szerint is a koszorúerek proximalis szakaszán az intima és/vagy a media megvastagodása gyakran együtt jár atheromás elváltozásokkal. A distalis LAD szakaszokon azonban csak az intima megvastagodása bizonyult preatheroscleroticus elváltozásnak. Az intima és a media megvastagodása magyarázatául az extracelluláris matrix felszaporodása, a simaizomsejt hypertrophia ill. hyperplasia szolgálhat. A Tracy által vizsgált erekben a sejt denzitás nem növekedett meg sem az intimában, sem a mediában atherosclerosis fennállásakor (117). Ez a tény arra enged következtetni, hogy a különbözo rétegek megvastagodásakor döntoen nem a proliferáció, hanem a megnövekedett extracellularis mátrix szintézis játszik szerepet. Az észlelt különbségek a distalis és a proximalis érszakaszok media és az intima megvastagodása között ezen szakaszok különbözo funkciójával és struktúrájával magyarázhatóak. A proximalis szegmens több elasztikus elemet tartalmaz, felépítése inkább elastomuscularis. Intézetünkben elozoleg megfigyeltük az aorta szerkezeti
52
változását atherosclerosis megjelenésekor, miszerint a media megvastagodása megelozte az intima megvastagodását (nem közölt adat, Illyés, Kádár). Mindazonáltal a kapcsolat a media megvastagodása és az intimában zajló atheroscleroticus változások között nem egyértelmu. Nem ismert, hogy a media szerkezeti változása vezet-e az intima funkciójának károsodása révén intimális atheroscleroticus folyamatok kialakulásáho z, vagy az intima indukálja-e a media elváltozásit. E kérdésben érdekes lehet a sokat vitatott Chlamydia pneumoniae esetleges szerepe. Klinikai vizsgálatok szerint a koszorúerek falvastagsága a Chlamydia pneumoniae seropozitív esetekben szignifikánsan nagyobb (27, 76). Adataink ezekkel a tanulmányokkal összecsengenek, ugyanakkor elsoként vizsgáltuk koszorúérben immunhisztokémiailag igazolt fertozés és a fertozés közvetlen környezetében megfigyelheto falvastagság változást. Az intima és média hypertrophiája valamint a fertozo ágens jelenléte között szignifikáns összefüggést találtunk. A Chlamydia pneumoniae jelenléte magasabb hypertrophia index-szel járt együtt az intima felso részében és a mediában – foként a megnövekedett extracellularis matrix miatt. Ez az adat arra enged következtetni, hogy a Chlamydia pneumoniae stimuláló hatással lehet a simaizom sejtek extracellularis matrix szintézisére mind az intimában, mind a mediában. A fenti eredményünk hozzájárulhat a Chlamydia pneumoniae baktériumnak az érelmeszesedésben játszott szerepének tisztázásához. Összegezve: a proximalis koszorúér szakaszon mind az intima és a media megvastagodás, a
distalis
szakaszon
pedig
csak
az
intima
megvastagodása
tekintheto
korai
atheroscleroticus változásnak. A Chlamydia pneumoniae jelenléte az extracellularis matrix mennyiségének megnövekedésével együtt jár, amely megfigyelésünk a fertozés és az atherosclerosis közti ok-okozati összefüggést valószínusíti. Eredményeink jelentoségét emeli az a tény, hogy a vizsgált koszorúerek 15-34 év közötti személyekbol származnak, a falvastagság korral függo változásai így az eredményt nem befolyásolják.
53
Összefoglalás
A jelenleg rendelkezésre álló adatok alapján az ösztrogén kísérletesen is igazolt kedvezo érrendszeri hatása a hormonpótlás során nem érvényesül maradéktalanul. Noha a noihormon-pótló kezelés cardioprotectív hatásának megítélése az elmúlt évek folyamán alapjaiban változott meg, az atherosclerosis pathogenezisében minden bizonnyal szerepet játszik a noi nemi hormonok hiánya. Az ösztrogén biológiai szerepének tisztázása továbbra is fontos szempont. A már feltárt összefüggések mellett feltételezheto más kölcsönhatások létezése is. Azonban - eredményeink alapján - valószínu, hogy az ösztrogén és a progeszteron vascularis hatásainak mechanizmusa nem a simaizomsejtek gap junction kommunikációjának befolyásolásával valósul meg.
Az infekció szerepének tisztázásához járul hozzá a Chlamydia pneumoniae jelenlétének illetve hatásának vizsgálata az atheroscleroticus elváltozásokban. A Chlamydia pneumoniae-t egyöntetuen gyakrabban igazoltuk a különbözo vascularis szövetek atheroscleroticus elváltozásaiban és azok adventitiájában, mint laesio- mentes érben. A vizsgálatunk
során
talált
emelkedés
a
Chlamydia
pneumoniae
környezetének
extracellularis matrix tartalmában felveti, hogy e microorganizmus krónikus gyulladást tart fenn az érfalban. Ez a krónikus gyulladás vezet bonyolult folyamatokon keresztül az évek során az intima struktúrájának feltöredezéséhez, lipid-accumulációhoz, és végso soron az atheroscleroticus elváltozások kialakulásához. Úgy gondoljuk, hogy a Chlamydia pneumoniae nem „véletlen” lelet a károsodott érfalban, hanem krónikus gyulladást fenntartva, felelos lehet az atherosclerosis kialakulásáért, és a progressziójáért. A jelenlegi érvek és ellenérvek tükrében úgy tunik, hogy a kérdés a makrolid típusú antibiotikumok hatékonyságának eredménye alapján fog eldolni.
54
Ha beigazolódik az a feltevés, miszerint a Chlamydia pneumoniae az atherosclerosis egyik rizikófaktora, és jelenléte a betegség progressziójában is szerepet játszik, úgy az antibiotikumok alkalmazásával új távlatok nyílnak a cardiovascularis betegségek kezelésében.
55
Irodalomjegyzék 1.
Akishita M, Ouchi Y, Miyoshi H, Orimo A, Kozaki K, Eto M, Ishikawa M, Kim S, Toba K, Orimo H: Estrogen inhibits endothelin-1 production and c-fos gene expression in rat aorta Atherosclerosis 1996;125:27-38.
2.
Akishita M, Ouchi Y, Miyoshi H, Kozaki K, Inoue S, Ishikawa M, Eto M, Toba K, Orimo H: Estrogen inhibits cuff-induced intimal thickening of rat femoral artery: effects on migration and proliferation of vascular smooth muscle cells. Atherosclerosis 1997;130:110
3.
Angeja BG, Shlipak MG, Go AS, Johnston SC, Frederick PD, Canto JG, Barron HV, Grady D, for the National Registry of Myocardial Infarction 3 Research Group: Hormone therapy and the risk of stroke after acute myocardial infarction in postmenopausal women. J Am Coll Cardiol 2001;38:1297-1301.
4.
Apfalter P, Loidl M, Nadrchal R, Makristathis A, Rotter M, Bergmann M, Polterauer P, Hirschl AM: Isolation and continuous growth of Chlamydia pneumoniae from atherectomy specimens. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2000;19:305-308.
5.
Ács N, Székács B, Nádasy Gy, Várbíró Sz, Kakucs R, Monos E: The effect of ovariectomy and estrogen replacement on small artery biomechanics in the rat. Br J Obstet Gynecol 1999; 106:148-154
6.
Ács N, Székács B, Nádasy Gy, Várbíró Sz, Miklós Zs, Szentiványi M, Monos E: Effects of combined sex hormone replacement on small artery biomechanics in pharmacologically ovariectomized rats. Maturitas 2000;34:83-92
7.
Bartles C, Maass M, Bein G, Malisius R, Brill N, Bechtel M, Sayk F, Feller AC, Sievers HH: Detection of Chlamydia pneumoniae but not cytomegalovirus in occluded saphenous vein coronary bypass grafts. Circulation 1999;99:879-882.
56
8.
Bartles C, Maass M, Bein G, Brill N, Bechtel M, Leyk R, Sievers HH: Association of serology with the endovascular presence of Chlamydia pneumoniae and cytomegalovirus in coronary artery and vein graft disease Circulation 2000;101:137-141.
9.
Berger M, Schroder B, Daeschlein G, Schneider W, Busjahn A, Buchwalow I, Luft FC, Haller H: Chlamydia pneumoniae DNA in non-coronary atherosclerotic plaques and circulating leukocytes. J Lab Clin Med 2000;136:194-200.
10.
Beyer EC, Paul DL, Goodenough DA: Connexin43: a protein from rat heart homologous to a gap junction protein from liver. J Cell Biol 1987;105:2621-2629.
11.
Bhalla RC, Toth KF, Bhatty RA, Thompson LP, Sharma RV: Estrogen reduces proliferation and agonist-induced calcium increase in coronary smooth muscle cells. Am J Physiol 1997; 272:H1996-2003
12.
Blackburn-JP, Peters-NS, Yeh-HI, Rothery S, Green CR, Severs NJ: Upregulation of connexin43 gap junctions during early stages of human coronary atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1995;15(8):1219-1228
13.
Blackburn JP, Connat JL, Severs NJ, Green CR: Connexin43 gap junction levels during development of the thoracic aorta are temporally correlated with elastic laminae deposition and increased blood pressure. Cell Biol 1997;21:87-97.
14.
Blanchard JF, Armenian HK, Peeling R, Friesen PP, Shen C, Brunham RC: The relation between Chlamydia pneumoniae infection and abdominal aortic aneurysm: case-control study. Clin Infect Dis 2000;30:946-947.
15.
Blasi F, Denti F, Erba M, Cosentini R, Raccanelli R, Rinaldi A, Fagetti L, Esposito G, Ruberti U, Allegra L: Detection of Chlamydia pneumoniae but not Helicobacter pylori in atherosclerotic plaques of aortic aneurysms. J Clin Microbiol 1996;34:2766-2769.
57
16.
Bold MLK: Estrogen, natriuretic peptides and the renin-angiotensin system. Review. Cardiovasc Res 1999;41:524-531.
17.
Burian K, Kis Z, Virok D, Endresz V, Prohaszka Z, Duba J, Berencsi K, Boda K, Horvath L, Romics L, Fust G, Gonczol E: Independent and joint effects of antibodies to human heat-shock protein 60 and Chlamydia pneumoniae infection in the development of coronary atherosclerosis. Circulation 2001;103:1503-1508.
18.
Bush TL, Barret-Connor E, Cowan LD, Crigui MH, Wallace RB, Suchindram CM, Tyroler HA, Rifkind BM: Cardiovascular mortality and noncontraceptive use of estrogen in women: results from the Lipid Research Clinic s Program Follow-up Study. Circulation 1987;75:1102-1109.
19.
Chaytor A.T., Evans W.H., Griffith T.M.: Peptides homologous to extracellular loop motifs of connexin 43 reversibly abolish rhythmic contractile activity in rabbit arteries. J Phys 1997; 503:99-110.
20.
Chaytor AT, Evans WH, Griffith TM: Central role of heterocellular gap junctional communication in endothelium-dependent relaxations of rabbit arteries. J Physiol 1998;508:561-573.
21.
Chiu B, Viira E, Tucker W, Fong IW: Chlamydia pneumoniae, cytomegalovirus, and herpes simplex virus in atherosclerosis of carotid artery. Circulation 1997;96:2144-2148.
22.
Christ GJ, Spray DC, El-Sabban M, Moore LK, Brink PR: Gap Junctions in vascular tissues. Evaluating the role of intercellular communication in the modulation of vasomotor tone. Mini Review. Circ Res 1996;79:631-646.
23.
Davidson M, Kuo CC, Middaugh JP, Campbell LA, Wang SP, Newman WP, Finley JC, Grayston JT: Confirmed previous infection with Chlamydia pneumoniae (TWAR) and its presence in early coronary atherosclerosis. Circulation 1998;98:628-633.
58
24.
Dechend R, Maass M, Gieffers J, Dietz R, Scheidereit C, Leutz A, Gulba DC: Chlamydia pneumoniae Infection of Vascular Smooth Muscle and Endothelial Cells Activates NF-?B and induces Tissue Factor and PAI-1 Expression. Circulation 1999;100:1369-1373.
25.
Doualla -Bell F, Lye SJ, Labrie F, Fortier MA: Differential expression and regulation of connexin-43 and cell-cell coupling in myocytes from the circular and longitudinal layers of bovine myometrium. Endocrinology 1995;136:5 322-5328.
26.
Ericson K, Saldeen TG, Lindquist O, Pahlson C, Mehta JL: Relationship of Chlamydia pneumoniae infection to severity of human coronary atherosclerosis. Circulation 2000; 101:2568-2571.
27.
Espinola -Klein C, Rupprecht HJ, Blankenberg S, Bickel C, Kopp H, Rippin G, Hafner G, Pfeifer U, Meyer J: Are morphological or functional changes in the carotid artery wall associated with Chlamydia pneumoniae, Helicobacter pylori, cytomegalovirus, or herpes simplex virus infection? Stroke 2000;31:2127-2133.
28.
Fong IW, Chiu B, Viira E: Rabbit models for Chlamydia pneumoniae infection J Clin Microbiol 1997;35:48-52.
29.
Gaydos CA, Summersgill JT, Sahney NN: Replication of Chlamydia pneumoniae in vitro in human macrophages, endothelial cells, and aortic smooth muscle cells. Infect Immunol 1996;64:1614-1620.
30.
Gerhard M, Ganz P: How do we explain the clinical benefit of estrogen? Circulation 1995;92:5-8.
31.
Gourdie RG, Harfst E, Severs NJ, Green CR: Cardiac gap junctions in rat ventricle: localization using site-directed antibodies and laser scanning confocal microscopy. Cardioscience 1990;1:75-82.
59
32.
Grau AJ, Brandt T, Buggle F, Orberk E, Mytilineos J, Werle E, Conradt, Krause M, Winter R, Hacke W: Association of cervical artery dissection with recent infection. Arch Neurol 1999; 56:851-856.
33.
Grodstein F, Stampfer MJ, Manson JA: Postmenopausal estrogen and progestin use and the risk of cardiovascular disease. New Engl J Med 1996;335:453-461.
34.
Gupta S, Leatham EW, Carrington D: Elevated Chlamydia pneumoniae antibodies, cardiovascular events and azithromycin in male survivors of myocardial infarction. Circulation 1997;96:404-407.
35.
Gupta S: Chronic infection in the aetiology of atherosclerosis-focus on Chlamydia pneumoniae. Atherosclerosis 1999;143:1-6.
36.
Gurfinkel E, Bozovich G, Darcoca A, Beck E, Mautner B: Randomised trial of roxithromycin in non-Q-wave coronary syndromes: ROXIS pilot study. Lancet 1997;350:404-407.
37.
Guthrie SC, Gilula NB: Gap junctional communication and development. Trends Neurosci 1989;12:12-6.
38.
Haefliger JA, Castillo E, Waeber G, Bergonzelli GE, Aubert JF, Sutter E, Nicod P, Waeber B, Meda P: Hypertension increases connexin43 in a tissue-specific manner. Circulation 1997;95:1007-1014.
39.
Haeflinger JA, Meda P, Formenton A, Wiesel P, Zanchi A, Brunner HR, Nicod P, Hayoz D: Aortic connexin43 is decreased during hypertension induced by inhibition of nitric oxide synthase. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1999;19:1615-1622.
60
40.
Hahn DL: Chlamydia pneumoniae, asthma, and COPD: what is the evidence? Ann Allergy Asthma Immunol 1999;83:271-88.
41.
Halme S, Juvonen T, Laurila A, Juvonen J, Mosorin M, Saikku P, Surcel HM: Chlamydia pneumoniae reactive T lymphocytes in the walls of abdominal aortic aneurysms. Eur J Clin Invest 1999;29:462-465.
42.
Hansson GK: Immune Mechanisms in Atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2001;21:1876-1881.
43.
Hendrix EM, Myatt L, Sellers S, Russel PT, Larsen WJ: Steroid hormone regulation of rat myometrial gap junction formation: effect on Cx43 levels and trafficking. Biol Reprod 1995;52:547-560.
44.
Herrington DM, Reboussin DM, Brosnihan KB, Sharp PC, Shumaker SA, Snyder TE, Furberg CD, Kowalchuk GJ, Stuckey TD, Rogers WJ, Givens DH, Waters D: Effects of estrogen replacement on the progression of coronary-artery atherosclerosis. N Engl J Med 2000;343:522-529.
45.
Higuchi MD, Castelli JB, Aiello VD, Palommo S, Reis MM, Sambiase NV, Fukasawa S, Bezerra HG, Remires JA: Great amount of C. pneumoniae in ruptured plaque vessel segments at autopsy. A comparative study with stable plaques. Arq Bras Cardiol 2000;74:149-151.
46.
Hong T, Hill CE: Restricted expression of the gap junctional protein connexin 43 in the arterial system of the rat. J Anat 1998;192(Pt 4):583-593.
47.
Horváth I, Szende B, Horváth AN, Kocsis I, Horváth A: Influence of cholesterol liposome immunisation on rabbits atherosclerosi induced by a high cholesterol diet. Med Sci Monit 1998;4:403-407.
61
48.
Horváth A, Füst G, Horváth I, Vallus G, Duba J, Harcos P, Prohászka Z, Rajnavölgyi É, Jánoskuti L, Kovács M, Császár A, Romics L, Karádi I: Anti-cholesterol antibodies (ACHA) in patients with different atherosclerostic vascular diseases and healthy individuals. Characterization of human ACHA. Atherosclerosis 2000;34:1188-1193.
49.
Hulley S, Grady D, Bush T, Furberg C, Herrington D, Riggs B, Vittinghoff E, for the Heart and Estrogen/Progestin Replacement Study (HERS) Research Group: Randomized trial of estrogen plus progestin for secondary prevention of coronary heart disease in postmenopausal women. JAMA 1998;280:605-13.
50.
Huttner I, Costabella PM, De Chastonay C, Gabbia ni G: Volume, surface, and junctions of rat aortic endothelium during experimental hypertension: a morphometric and freeze fracture study. Lab Invest 1982;46:489-504.
51.
Illyés Gy. Kádár Anna: Atheroscleroticus laesiók immunhisztokémiája. Lege Artis Medicinae 1993;3:528-536.
52.
Javid PJ, Chaytor AT, Evans WH, Griffith TM: Inhibition of the gap junctional component of endothelium-dependent relaxations in rabbit iliac artery by 18-a-glycyrrhetinic acid. Br J Pharmacol 1998;125:1-3.
53.
Juvonen J, Laurila A, Juvonen T, Alakarppa H, Surcel HM, Lounatamaa K, Kuusisto J, Saikku P: Detection of Chlamydia pneumoniae in human nonrheumatic stenotic aortic valves. J Am Coll Cardiol 1997;29:1054-1059.
54.
Juvonen J, Juvonen T, Laurila A, Kuusisto J, Alarakkola E, Sarkio T, Bodian CA, Kairaluoma MI, Saikku P: Can degenerative aortic valve stenosis be related to persistent Chlamydia pneumoniae infection? Ann Intern Med 1998;128:741-744.
62
55.
Karas-RH; Patterson-BL; Mendelsohn-ME: Human vascular smooth muscle cells contain functional estrogen receptor. Circulation. 1994;89:1943-1950
56.
Karlsson L, Gnarpe J, Naas J, Olsson G, Lindholm J, Steen B, Gnarpe H: Detection of viable Chlamydia pneumoniae in abdominal aortic aneurysms. Eur J Vasc Endovasc Surg 2000;19:630-635.
57.
Kauffman RF, Bean JS, Fahey KJ, Cullinan GJ, Cox DA, Bensch WR: Raloxifene and estrogen inhibits neointimal thickening after balloon injury in the carotid artery of male and ovariectomized female rats. J Cardiovasc Pharmacol 2000;36:459-465.
58.
Kádár A, Bucsek M, Kardos M, Corradi G: Chlamydia trachomatis kimutatása in situ hibridizációval krónikus prostatitisben. Orv Hetilap 1995;136:659-662.
59.
Kádár A, Mózes G, Illyés Gy, Schönfeld T, Kulka J, Sipos B, Glasz T, Tökés AM, Szik Á: World Health Organization (WHO) and the World Heart Federation (WHF) Pathobiological Determinants of Atherosclerosis in Youth Study (WHO/WHF PBDAY Study) 1986-1996. Histomorphometry and histochemistry of atherosclerotic lesions in coronary arteries and the aorta in a young population. Nutr Metab Cariovasc Dis 1999;9:220-227.
60.
Krenács T, Rosendaal M: Immunohistological detection of gap junctions in human lymphoid tissue: connexin43 in follicular dendritic and lymphoendothelial cells. J Histochem Cytochem 1995;43:1125-1137.
61.
Kol A, Sukhova GK, Lichtman AH, Libby P: Chlamydial heat shock protein 60 localizes in human atheroma and regulates macrophage tumor necrosis factor-? and matrix metalloproteinase expression. Circulation 1998;98:300-307.
63
62.
Kumár V, Cotran, Robbins: A Pathológia alapjai – egyetemi tankönyv. Semmelweis Kiadó 1994.
63.
Kuo CC, Grayston JT, Campbell LA, Goo YA, Wissler RW, Benditt EP: Chlamydia pneumoniae (TWAR) in coronary arteries of young adults (15-34 years old) Proc Natl Acad Sci USA 1995;92:6911-6914.
64.
Lang LM, Beyer EC, Schwartz AL, Gitlin JD: Molecular cloning of a rat uterine gap junction protein and analysis of gene expression during gestation. Am J Physiol 1991;260: E787-E793.
65.
Larson D.M., Haudenschild C.C., Beyer E.C.: Gap Junction Messenger RNA Expression by Vascular Wall Cells. Circ. Res. 1990;66:1074-1081
66.
Laurila A, Bloigu A, Nayha S, Hassi J, Leinonen M, Saikku P: Chronic Chlamydia pneumoniae infection is associated with a serum lipid profile known to be a risk factor for atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1997;17:2910-2913.
67.
Lefebvre DL; Piersanti M; Bai XH: Myometrial transcriptional regulation of the gap junction gene, connexin-43. Reprod-Fertil-Dev. 1995;7:603-611.
68.
Lindholt JS, Juul S, Vammen S, Lind I, Fasting H, Henneberg EW: Immunoglobulin A antibodies against Chlamydia pneumoniae are associated with expansion of abdominal aortic aneurysm. Br J Surg 1999;86:634-638.
69.
Loewenstein WR: Junctional intercellular communication: The cell-to-cell membrane channel. Physiol Rev 1981;61:830-898.
70.
Loewenstein WR: The Cell-to-Cell Channel of Gap Junctions. Minireview. Cell 1987;48:725-726.
64
71.
Lye SJ, Nicholson BJ, Mascarenhas M, MacKenzie L, Petrocelli T: Increased expression of connexin-43 in the rat myometrium during labor is associated with an increase in the plasma estrogen:progesterone ratio. Endocrinology 1993;132:2380-2386.
72.
Maass M, Bartels C, Engel PM, Mamat U, Ísievers HH: Endovascular presence of viable Chlamydia pneumoniae is a common phenomenon in coronary artery disease. J Am Coll Cardiol 1998;31:827-832.
73.
Madhi OS, Horne BD, Mullen K, Muhlestein JB, Byrne G: Serum Immunoglobulin G antibodies to Chlamydial heat shock protein 60 but not to human and bacterial homologs are associated with coronary artery disease. Circulation 2002;106:1659-1663.
74.
Maraha B, den Heijer M, Wullink M, van der Zee A, Bergmans A, Verbakel H, Kerver M, Graafsma S, Kranendonk S, Peeters M : Detection of Chlamydia pneumoniea DNA in buffy-coat samples of patients with abdominal aortic aneurysm. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2001;20:111-116.
75.
May AE, Redecke V, Gr üner S, Schmidt R, Massberg S, Miethke T, Ryba B, da Costa C, Schömig A, Neumann FJ: Recruitment of Chlamydia pneumoniae-infected macrophages to the carotid artery wall in noninfected, nonatherosclerotic mice. Arteriosc Throm Vasc Biol 2003;10:1161-1167.
76.
Mayr M, Kiechl S, Willeit J, Wick G, Xu Q: Associations of antibodies to Chlamydia pneumoniae, Helicobacter pylori, and Cytomegalovirus with immune reactions to Heatshock protein 60 and carotid or femoral atherosclerosis. Circulation 2000;102:833-839.
77.
McNutt-CM; Nicholson-BJ; Lye-SJ: ACTH-induced preterm labour in the ewe is associated with increased mRNA and protein levels of myometrial gap junction protein, connexin-43. J-Endocrinol. 1994;141:195-202
65
78.
Meijer A, van Der Vliet JA, Roholl PJ, Gielis-Proper SK, de Vries A, Ossewaarde JM: Chlamydia pneumoniae in abdominal aortic aneurysms: abudance of membrane components in the absence of heat shock protein 60 and DNA. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1999;19:2680-2686.
79.
Melnick JL, Petrie BL, Dreesman GR: Cytomegalovirus antigen within human arterial smooth muscle cells. Lancet 1983;2:644-647
80.
Mendall MA, Goggin PM, Molineaux N: Relation of Helicobacter pylori infection and coronary heart disease. Br Heart J 1994;71:437-439.
81.
Mijatovic V, van der Mooren MJ, Stehouwer CD, Netelenbos JC, Kenemans PL: Postmenopausal hormone replacement, risk estimators for coronary artery disease and cardiovascular protection Gynecol Endocrinol 1999;13:130-144.
82.
Molestina RE, Dean D, Miller RD, Ramirez JA, Summersgill JT: Characterization of a strain of Chlamydia pneumoniae isolated from a coronary atheroma by analysis of the omp1 gene and biological activity in human endothelial cells. Infect Immun 1998;66:13701376.
83.
Moore LK, Burt JM: Gap junction function in vascular smooth muscle: influlence of serotonin. Am J Physiol 1995;269:H1481-H1489.
84.
Moraghan-T; Antoniucci-DM; Grenert-JP; Sieck-GC; Johnson-C; Miller-VM; FitzpatrickLA: Differential response in cell proliferation to beta estradiol in coronary arterial vascular smooth muscle cells obtained from mature female versus male animals. Endocrinology. 1996;137:5174-5177.
85.
Mosca L, Collins P, Herrington DM, Mendelson ME, Pasternak RC, Robertson RM, Schenck-Gustafsson K, Smith SC, Taubert KA, Wegnert NK: Hormone replacement
66
therapy and cardiovascular disease. A statement for healthcare professionals from the American Heart Association. Circ 2001;104:499-507. 86.
Mosorin M, Juvonen J, Biancari F, Satta J, Surcel HM, Leinonen M, Saikku P, Juvonen T: Use of doxycycline to decrease the growth rate of abdominal aortic aneurysms: a randomized, double -blind, placebo-controlled pilot study. J Vasc Surg 2001;34:606-610.
87.
Musil LS, Cunningham BA, Edelman GM, Goodenough DA: Differential phosphorylation of the gap junction protein connexin43 in junctional communication-competent and – deficient cell lines. J Cell Biol 1990;111:2077-2088.
88.
Nabulsi AA, Folsom AR, White A, Patsch W, Heiss G, Wu KK, Szklo M, the Atherosclerosis Risk in Communities Study Investigators: Association of hormonereplacement therapy with various cardiovascular risk factors in postmenopausal women. N Eng J Med 1993;328:1069-1075.
89.
N I H közlemény az interneten: http://www.nklbi.nih.gov/whi/index.html
90.
Nishigaki I, Sasaguri Y, Yagi K: Anti-proliferative effect of 2-methoxyestradiol on cultured smooth muscle cells from rabbit aorta. 1995;113:167-170.
91.
Nystrom-Rosander C, Thelin S, Hjelm E, Lindquist O, Pahlson C, Friman G: High incidence of Chlamydia pneumoniae in sclerotic heart valves of patients undergoing aortic valve replacement. Scand J Infect Dis 1997;29:361-365.
92.
Oparil S, Levine RL, Chen S-J, Durand J, Chen YF: Sexually dimorphic response of the balloon-injured rat carotid artery to hormone treatment. Circulation 1997;95:1301-1307.
93.
Orsino-A, Taylor-CV: How Connexin-26 and connexin-43 are differentially expressed and regulated in the rat myometrium throughout late pregnancy and with the onset of labor. Endocrinology. 1996;137:1545-1553
67
94.
Petersen E, Boman J, Persson K, Arnerlov C, Wadell G, Juto P, Eriksson A, Dahlen G, Angquist KA: Chlamydia pneumoniae in human abdominal aortic aneurysms. Eur J Vasc Endovasc Surg 1998;15:138-142.
95.
Petrocelli T, Lye SJ: Regulation of transcripts encoding the myometrial gap junction protein, connexin-43, by estrogen and progesterone. Endocrinology 1993;133:284-90.
96.
Piersanti M, Lye SJ: Increase in messenger ribonucleic acid encoding the myometrial gap junction protein, connexin-43, requires protein synthesis and is associated with increased expression of the activator protein-1, c-fos. Endocrinolo gy 1995;136:3571-3578.
97.
Pockley AG: Heat Shock Proteins, Inflammation, and Cardiovascular Disease. Circulation 2002;105:1012-1017.
98.
Polacek D, Lal R, Volin MV, Davies PF: Gap junctional communication between vascular cells. Induction of connexin43 messenger RNA in macrophage foam cells of atherosclerotic lesion. Am J Pathol 1993;142:593-606.
99.
Polacek D, Bech F, Davies P.F: Connexin43 Gene Expression in the Rabbit Arterial Wall: Effects of Hypercholesterolemia, Ballon Injury and Their Combination. J Vasc Res 1997; 34:19-30
100. Ross: The pathogenesis of atherosclerosis: a perspective for the 1990s. Nature 1993;362:801-808.
101. Ross R: Atherosclerosis- an inflammatory disease. N E J of Med 1999;340:115-124.
102. Saikku P, Mattila K, Nieninen MS, Huttunen JK, Leionen M, Ekman MR, Makela PH, Valtonen V: Serological evidence of an association of a novel Chlamydia, TWAR, with coronary heart disease and acute myocardial infarction. Lancet 1988;2:983-986.
68
103. Schneiderman J, Bordin GM, Adar R, Smolinsky A, Seiffert D, Engelberg I, Dilley RB, Thinnes T, Louskutoff DJ: Patterns of expression of fibrinolytic genes and matrix metalloproteinase-9 in dissecting aortic aneurysms. Am J Pathol 1998;152:703-710.
104. Schreiber JR, Beckmann MW, Polacek D, Davies PF: Changes in gap junction connexin43 messenger ribonucleic acid levels associated with rat ovarian follicular development as demonstrated by in situ hybridization. Am J Obstet Gynecol 1993;168:1094-1104. 105. Selzman CH, Turner S, Johnson SM, Cain BS, Harken AH, Whitehill TA: Chronic estrogen replacement inhibits aortic intimal hyperplasia independent of serum lipids. J Card Surg 1997;12:228-234. 106. Selzman CH, Gaynor JS, Turner S, Johnson SM, Horwitz LD, Whitehill TA, Harken AH: Ovarian ablation alone promotes aortic intimal hyperplasia and accumulation of fibroblast growth factor. Circulation 1998;98:2049-2054. 107. Severs NJ: Cardiovascular disease. Novartis Found Symp 1999;219:188-206. 108. Shlipak MG, Simon JA, Vittinghoff E, Lin F, Barrett-Connor E, Knopp RH, Levy RI, Hulley SB: Estrogen and progestin, lipoprotein(a), and the risk of recurrent coronary heart disease events after menopause. JAMA 2000;283:1845-1852. 109. Song YG, Kwon HM, Kim JM, Hong BK, Kim DS, Huh AJ, Chang KH, Kim HY, Kang TS, Lee BK, Choi DH, Jang YS, Kim HS: Serologic and histopathologic study of Chlamydia pneumoniae infection in atherosclerosis: a possible pathogenetic mechanism of atherosclerosis induced by Chlamydia pneumoniea. Yonsei Med J 2000;41:319-327.
110. Squadrito F, Altavilla D, Squadrito G, Saitta A, Cucinotta D, Minutoli L, Deodato B, Ferlito M, Campo GM, Bova A, Caputi AP: Genistein supplementation and estrogen replacement therapy improve endothelial dysfunction induced by ovariectomy in rats. Cardiovasc Res 2000;45:454-462.
69
111. Stadius ML, Maynard C, Fritz JK, Davis K, Riotchie JL, Sheehan F, Kennedy L: Coronary anatomy and left ventricular function in the first 12 hours of acute myocardial infarction: the Western Washington Randomized Intracoronary Sterptokinase Trial. Circulation 1985;72:292-301.
112. Stary HC: The Histological classification of atherosclerotic lesions in human coronary arteries. Atherosclerosis and Coronary Artery Disease, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia 1996. Chapter 26;463-474.
113. Stefanadis C, Vlachopoulos C, Karayannacos P, Boudoulas H, Stratos C, Flippides T, Agapitos M, Toutouzas P: Effect of Vasa Vasorum Flow on Structure and Function of the Aorta in Experimental Animal. Circulation 1995;91:2669-2673.
114. The Writing Group for the PEPI Trial: Effects of estrogen or estrogen/progestin regimens on heart disease risk factors in postmenopausal women. The Postmenopausal Estrogen/Progestin Interventions (PEPI) Trial. JAMA 1995;273:199-208. 115. Thompson LP, Weiner CP: Long-term estradiol replacement decreases contractility of Guinea pig coronary arteries to the thromboxane mimetic U46619. Circulation 1997;95:709-714. 116. Tracy RE: Medial thickness of coronary arteries as a correlate of atherosclerosis. Atherosclerosis 1998;139:11-19.
117. Tracy RE: Medial thickenings of coronary artery and the aging risk factor for atherosclerosis. Atherosclerosis 2001;155:337–346.
118. Tsai ML, Watts SW, Loch-Caruso R, Webb RC: The role of gap junctional communication in contractile oscillations in arteries from normotensive and hypertensive rats. J Hypertension 1995;13:1123-1133.
70
119. Vehmaan-Kreula P, Puokkainen M, Sarvas M, Welgus HG, Kovanen PT: Chlamydia pneumoniae proteins induce secretion of the 92-kDa gelatinase by human monocytederived macrophages. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2001;21:E1-8.
120. Veres A, Füst G, Smieja M, McQueen M, Horváth A, Qilong Yi, Bíró A, Pogue J, Romics L, Karádi I, Singh M, Gnarpe J, Prohászka Z, Yusuf S, FRCP for the Heart Outcomes Prevention Evaluation (HOPE) Study Investigators. Circulation 2002;106:2775-2781.
121. Verheule S, van Kempen MJA, Welscher PHJA, Kwak BR, Jongsma HJ: Characterization of gap junction channels in adult rabbit atrial and ventricular myocardium. Circ Res 1997;80:673-681. 122. Verrecchia F, Hervé J-C: Reverzible inhibition of gap junctional communication by tamoxifen in cultured cardiac myocytes. Eur J Physiol 1997;434:113-116. 123. Ward ME: The immunobiology and immunopathology of chlamydial infections. APMIS 1995;103:769-796.
124. Wong YK, Thomas M, Tsang V, Gallagher PJ, Ward ME: The prevalence of Chlamydia pneumoniae in atherosclerostic and nonatherosclerotic blood vessels of patients attending for redo and first time coronary artery bypass graft surgery. J Am Coll Cardiol 1999;33:152-156. 125. Yamashiroya HM, Ghosh L, Yang R, Robertson AL: Herpesviridae in the coronary arteries and aorta of young trauma victims. Am J Pathol 1988;130:71-79.
126. Yamashita k, Ouchi K, Shirai M, Gondo T, Nakazawa T, Ito H: Distribution of Chlamydia pneumoniae infection in the atherosclerotic carotid artery. Stroke 1998;29:773-778.
71
127. Yeh HI, Lupu F, Dupont E, Severs NJ: Upregulation of connexin43 gap junctions between smooth muscle cells after balloon catheter injury in the rat carotid artery. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1997;17:3174-3184. 128. A Semmelweis Egyetem Állatvédelmi Szabályzata. Budapest 2001; 53/2001.(V.31) ET.
72
Köszönetnyilvánítás
Köszönettel tartozom témavezetom és programvezetom, Kádár Anna professzor asszonynak, és témavezetom, Kerényi Tibor professzor úrnak a szakmai támogatásukért. Hálás vagyok kollegámnak, dr. Illyés György docens úrnak, hogy munkám során mindvégig ellátott értékes gyakorlati és elméleti útmutatásokkal, lelkesen segített, bíztatott. Köszönöm Gönczöl Éva professzor asszonynak, hogy a rendelkezésemre bocsátotta a carotis endarterectomiákat és aorta billentyuket. Köszönöm dr. Várbíró Szabolcsnak, dr. Glasz Tibornak, dr. Lódi Csabának, dr. Horváth Annának és dr. Tokés Anna-Máriának az együttmuködésünk során tapasztalt odaadásukat. Meleg szeretettel köszönöm Szik Lászlóné asszisztensnonek az immunhisztokémiai reakciók kivitelezésében nyújtott segítségét, és dr. Schönfeld Tibornak a statisztikai elemzés elkészítését. Köszönöm Balogh Lenkének és Linder Ilának, hogy az adminisztráció útvesztoiben nem hagytak eltévedni. Köszönöm a II. sz. Pathológiai Intézet minden dolgozójának, hogy ösztöndíjas éveim alatt befogadtak és szurkoltak nekem, Schaff Zsuzsa professzor asszonynak, hogy ösztöndíjam lejárta után is biztosított támogatásáról. Köszönöm két kicsi fiamnak, hogy néha lemondtak az esti mesérol, és férjemnek, hogy mindig mellettem állt.
73
Az értekezés témakörében megje lent publikációk:
Folyóirat közlemények: 1. Eszter Hortoványi, György Illyés, Tibor Glasz, Anna Kádár: Chlamydia pneumoniae in different coronary artery segments in the young. Pathology Research and Practice, 2002;198:19-23. 2. Hortoványi Eszter, Illyés Gyö rgy, Glasz Tibor, Kulka Janina, Kádár Anna: Chlamydia pneumoniae fiatal felnottek koszorúereiben. Lege Artis Medicinae, 2001;11(8-9):54247.
3. Eszter Hortoványi, Szabolcs Várbíró, Anna-Mária Tokés, György Illyés, Béla Székács, Sándor Paku, Tibor Kerényi, Anna Kádár: Connexin 43 expression in rat aortic smooth muscle after ovariectomy and hormonal replacement. Pathology Research and Practice, 2001;197:109-12. 4. Eszter Hortoványi, György Illyés, Anna Kádár: Early atherosclerosis and Chlamydia pneumoniae infection in the coronary arteries. Pathology Oncology Research 2003;9(1):42-46. 5. Tibor Glasz, Eszter Hortoványi, Géza Mózes, Ágnes Szik, Magdolna Kardos, István Sziller, Zoltán Bán, András Tóth, István Kassai, Ferenc Horkay, Anna Kádár: Chlamydia pneumoniae in coronary bypass grafts of redo patients. Nutr Metab and Cardiovasc Dis-be elküldve.
Nyomtatásban megjelent absztraktok: 1. A. Horváth, T. Glasz, E. Hortoványi, G. Füst, I. Karádi, A. Kádár, F. Horkay, G. Mózes, Á. Szik, I. Sziller, B. Nagy, Z. Bán, A. Tóth, I. Kassai, G. Dudás. Infection of restenotic coronary bypass grafts by Chlamydia pneumoniae and anti-cholesterol antibodies (ACHA) in the serum of patients with severe coronary artery disease. XVIIIth Congress of the European Society of Pathology 2001 September, Berlin. 2. E. Hortoványi, A.-M. Tokés, Sz. Várbiró, M. Jäckel, Gy. Illyés, T. Kerényi: Effect of ovariectomy and hormone replacement on the connexin43 expression of the vascular smooth muscle cells. J of Submicroscopic Cytology and Pathology 2000, 32(3):452E. Eloadások: 1. Chlamydia pneumoniae fiatal felnottek koszorúereiben. Hortoványi E., Illyés Gy. Ph.D. Tudományos Napok 2001. Február 21-22, Budapest
74
2. Development and Fate of Atherosclerosis. A. Kádár, Gy. Illyés, E. Hortoványi, T. Glasz. 50th Congress of European Society for Cardiovascular surgery; 2001. June 2023, Budapest.
3. Effect of Chlamydia pneumoniae infection on long-term coronary artery bypass grafts. T. Glasz, F. Horkay, E. Hortoványi, G. Mózes, Á. Szik, A. Kádár, I. Sziller, B. Nagy, Z. Bán, A. Tóth, I. Kassai, G. 50th Congress of European Society for Cardiovascular surgery; 2001. June 20-23, Budapest. 4. Early atherosclerotic changes. A. Kádár, G. Illyés, E. Hortoványi. European Congress of Pathology, XVIIIth Congress of the European Society of Pathology; 2001 Sept 8-13, Berlin.
Egyéb témában megjelent közlemények: Folyóirat: 1. A.-M. Tokés, E. Hortoványi, Gy. Csordás, J. Kulka, G. Mózes, A. Hatalyák, A. Kádár: Immunohistochemical localisation of tenascin in invasive duvtal carcinoma of the breast. Anticancer Research, 1999 19:175
2. A.-M. Tokés, E. Hortoványi, J. Kulka, M. Jäckel, T. Kerényi, A. Kádár: Tenascin expression and angiogenesis in breast cancers. Pathology Research and Practice, 1999 195:821-828. Nyomtatásban megjelent absztrakt: 1. A.-M. Tokés, S. Paku, S. Toth, E. Paál, E. Hortoványi, A. Kádár: The effect of tenascin on focal adhesion plaques added to cell cultures. 17th European Congress of Pathology and XIX Spanish Congress of Pathology. Virchow Archiv. 1999, 435 (3): P-140:227 2. E. Hortoványi, A.-M. Tokés, M. Jäckel, T. Kerényi, A. Kádár: The reation of tenascin and angiogenesis in breast cancer. XXII International Academy of Pathology and 13th World Congress of the Environmental Pathology 1998 Oct 1823, Nice- France 3. A.-M. Tokés, E. Hortoványi, Z. Szentirmay, M. Jäckel, T. Kerényi, A. Kádár: Examination on tenascin distribution and DNA content in invasive ductal breast carcinomas. XXII International Academy of Pathology and 13th World Congress of the Environmental Pathology 1998 Oct 18-23, Nice- France 4. M. Jäckel, T. Kerényi, E. Hortoványi, A.-M. Tokés, H. Gyory, A. Kádár: Metastatic posttraumatic angiosarcoma of the bones. XXII International Academy of Pathology and 13th World Congress of the Environmental Pathology 1998 Oct 18-23, Nice- France
75
