Semmelweis Egyetem Doktori Iskola
„Krónikus betegségek megelozése gyermekkorban” program
CITOKINEK, ADHÉZIÓS MOLEKULÁK ÉS PROLIFERÁCIÓS MARKER VIZSGÁLATA TÁPLÁLÉKALLERGIÁBAN ÉS CÖLIÁKIÁBAN
Dr. Veres Gábor
Doktori Értekezés (Ph.D.) Tézisei
Programvezeto: Dr. Tulassay Tivadar egyetemi tanár
Témavezeto: Dr. Arató András egyetemi docens
I.sz. Gyermekklinika, Semmelweis Egyetem, Budapest
Budapest, 2003
1
TARTALOMJEGYZÉK
I
BEVEZETÉS…………………………………………………………………...5
II
CÉLKITUZÉSEK……………………………………………………………...7
III
IRODALMI ÁTTEKINTÉS…………………………………………………..9
III.1 Táplálékallergia………………………………………………………………….9 III.1.1 Táplálékallergia gyakorisága……………………………………………………9 III.1.2 Táplálékallergia patomechanizmusa…………………………………………...11 III.1.3 Táplálékallergia okozta klinikai tünetek……………………………………….13 III.1.4 Táplálékallergia diagnózisa…………………………………………………….20 III.2 Cöliákia………………………………………………………………………….21 III.2.1 Genetikai hajlam………………………………………………………………..22 III.2.2 A cöliákia patogenezise………………………………………………………...22 III.2.3 Cöliákia, mint az autoimmun betegségek modellje…………………………….28 III.2.4 Cöliákia és az 1. típusú diabétesz mellitusz együttes elofordulása…………….28 III.3 Gasztrointesztinális immunrendszer muködése, orális tolerancia…………..30 III.3.1 Peyer plakkok…………………………………………………………………..30 III.3.2 A bélnyálkahártya nem organizált immunkompetens struktúrái……………….30 III.3.3 Az intesztinális immunrendszer muködése…………………………………….32 III.3.4 Az orális tolerancia kialakulása………………………………………………...35 III.4 Citokinek………………………………………………………………………...38 III.4.1 Interferon-gamma és interleukin-4……………………………………………..38 III.4.2 Cöliákia és citokinek…………………………………………………………...39 III.4.3 Táplálékallergia és citokinek…………………………………………………...40 III.5 Adhéziós molekulák…………………………………………………………….40 III.5.1 ICAM-1 és LFA-1……………………………………………………………...41 III.5.2 Az ? 4? 7 integrin és komplementer ligandja, a MAdCAM…………………….43 IV
BETEGEK ÉS MÓDSZEREK……………………………………………….45
IV.1 Táplálékalle rgiás gyermekek…………………………………………………..45 IV.1.1 A táplálékallergia diagnózisa…………………………………………………...46 IV.1.2 Endoszkópos mintavétel………………………………………………………..46 IV.2 Táplálékallergiás felnottek……………………………………………………..48
2
IV.3 Az 1. típusú diabétesz mellitusz és cöliákia együttes elofordulása…………..49 IV.4 Vizsgálati módszerek…………………………………………………………...50 IV.4.1 Immunhisztokémiai vizsgálat és értékelés……………………………………..50 IV.4.2 Radioaktív in situ hib ridizáció…………………………………………………52 IV.4.3 Radioaktív in situ hibridizációs metszetek értékelése…………………………53 IV.4.4 Antiendomizium antitest és HbA1c meghatározás…………………………….53 IV.5 Statisztikai elemzés……………………………………………………………..53 IV.6 Etikai beleegyezés………………………………………………………………54 V
EREDMÉNYEK………………………………………………………………55
V.1 Táplálékallergiás gyermekek…………………………………………………..55 V.1.1 Intraepiteliális limfociták……………………………………………………….55 V.1.2 Adhéziós molekulák expressziója az epitéliumban…………………………….55 V.1.3 Limfociták a lamina propriában………………………………………………..55 V.1.4 Adhéziós molekulák expressziója a lamina propriában………………………..56 V.1.5 Citokinek expressziója a lamina propriában……………………………………56 V.1.6 Ki-67 proliferációs marker expressziója a kriptákban………………………….59 V.1.7 HLA-DR expressziója a mukózában…………………………………………...59 V.1.8 Radioaktív in situ hibridizáció……………………………………………….60 V.1.8.1 IFN-? mRNS expresszió………………………………………………………60 V.1.8.2 IL-4 mRNS expresszió………………………………………………………..61 V.2 Táplálékallergiás felnottek……………………………………………………..62 V.2.1 Intraepiteliális sejtek……………………………………………………………62 V.2.2 Lamina propria mononukleáris sejtjei………………………………………….63 V.2.3 Adhéziós molekulák expressziója……………………………………………...64 V.2.4 IFN-? és IL-4 expressziója……………………………………………………..65 V.3 Az 1. típusú diabétesz mellitusz és a cöliákia…………………………………67 VI
MEGBESZÉLÉS……………………………………………………………...70
IV.1. Táplálékfehérje indukálta enteropátiás gyermekek mukózája…………….70 VI.1.1 Limfonoduláris hiperplázia a duodénum bulbuszában…………………………70 VI.1.2 Limfociták a mukózában……………………………………………………….71 VI.1.3 ?? T sejtek fokozott száma az intraepiteliális régióban………………………...72 VI.1.4 Th1 dominancia a mukózában………………………………………………….73
3
VI.1.5 Adhéziós molekulák a mukózában……………………………………………..75 VI.2 Táplálékfehérje indukálta enteropátiás felnottek mukózája………………..76 VI.2.1 Intesztinális mukóza sejtes összetevoi………………………………………….76 VI.2.2 IFN-? és IL-4 expressziója a lamina propriában………………………………..77 VI.2.3 Fokozott ICAM-1 expressziója a lamina propriában…………………………..77 VI.2.4 Limfocita homing receptor (? 4? 7) expressziója a mukózában………………...78 VI.2.5 Miért nem egyeznek meg teljesen a késoi típusú táplálékallergiás gyermekek és felnottek duodenális mukózájában kimutatott eltérések?………………………80 VI.3 Cöliákia………………………………………………………………………….81 VI.3.1 IFN-? és IL-4 expressziója a duodenális mukózában…………………………..81 VI.3.2 Az 1. típusú diabétesz mellitusz és a cöliákia………………………………….82 VII
AZ ÉRTEKEZÉS FOBB MEGÁLLAPÍTÁSAI ÉS AZOK GYAKORLATI ALKALMAZÁSA………………………………………………………………..85
VIII
RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE………………………………………………..89
IX
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS………………………………………………..90
X
IRODALOMJEGYZÉK……………………………………………………..91
4
I. BEVEZETÉS
Az allergiás megbetegedések, atópiás kórképek gyakorisága a fejlett országokban folyamatosan no, amely egyre súlyosabb népegészségügyi problémát jelent, emellett gazdasági kihatásai sem elhanyagolhatóak. Cöliákiával kapcsolatban a közelmúltban végzett felmérések eredménye, hogy gyakorisága többszöröse a korábbi adatokénak, eléri az 1 százalékot. A klasszikus klinikai manifesztáció csak a „jéghegy csúcsát” jelenti, ezért az érzékenyebb módszerekkel kimutatható „silent” és látens forma diagnózisa az esetleges késoi szövodmények prevenciójában is igen nagy jelentoséggel bírhat. A táplálékallergia patomechanizmusa részleteiben nem ismert. Különösen abban a célszervben nem, ahol a táplálékkal történo elso érintkezés történik és a tünetek nagy része kialakul, vagyis a bélben. Cöliákiával kapcsolatban jóval több ismerettel rendelkezünk, egyrészt sokkal könnyebben juthatunk bélbiopsziás mintához, másrészt a szerológiai módszerek szenzitivitása és specifitása jóval felülmúlja a megfelelo allergiás módszerekét. Kutatásaimat
döntoen
két
különbözo
betegcsoporton
végeztem:
egyrészt
táplálékallergiások (késoi típusú táplálékallergiás gyermekek és felnottek) duodenális mukózájában citokinek, adhéziós molekulák, proliferációs- és immunmarkerek expresszióját
elemeztem
kontroll
mintákkal
összehasonlítva,
másrészt
egyes
paramétereket cöliákiás gyermekekben is meghatároztam. A táplálékallergia beosztása továbbra sem egyértelmu, hiszen gyakori átfedést találhatunk a csoportok között. A leginkább elfogadott felosztás szerint IgE és nem IgE mediált reakciótípusokra lehet a hiperszenzitív kórképeket kategorizálni. Az elobbire inkább az akut, I. típusú, az utóbbira pedig inkább a sejt mediált, IV. típusú immunmediáció jellemzo. A ketto között számos átmeneti kórkép fordul elo, az eozinofil
sejtek
különbözo
arányú
részvételével.
Vizsgálataimban
olyan
táplálékallergiás gyermekek és felnottek endoszkópos úton eltávolított mintáit elemeztem, akiknél az allergizáló étel elfogyasztását követoen legalább egy órával késobb jelentkeztek a tünetek, így ezek az úgynevezett késoi típusú csoportba sorolhatók. Másfelol a klinikai kép és a szövettani minta ismeretében a táplálékfehérje indukálta enteropátia elnevezéssel is lehet illetni az általam vizsgált táplálékallergiás
5
csoportokat. Már most hangsúlyozom, hogy annak ellenére, hogy a gyermekkori és a felnottkori táplálékallergiások hasonló csoportba sorolhatók (késoi reakciótípus, táplálékfehérje indukálta enteropátia), nem csak életkorbeli különbségek lesznek a két betegcsoport között. Érzékeny módszerekkel (immunhisztokémia és in situ hibridizáció) végzett különbözo citokinek, adhéziós molekulák és proliferációs markerek elemzése felfedhet olyan sajátosságokat, amelyek az adott patomechanizmusra lesznek jellemzoek. A leírt összefüggések a patomechanizmuson kívül diagnosztikus és terápiás konzekvenciával is járhatnak a jövoben. Jelenleg az invazív endoszkópia segítségével történik a makroszkópos megtekintés és a mukózából történo mintavétel. A kapszuláris endoszkópia térnyerésével az invazivitás a jövoben kiküszöbölheto, így a kórképek minél részletesebb feltérképezése jelentos gyakorlati haszonnal járhat. A cöliákiában jelenlevo mukózális történésekkel kapcsolatban több ismerettel rendelkezünk, de a T helper 1 (Th1) és Th2 citokin mintázat, valamint látens-silent cöliákia feltérképezése továbbra is izgalmas kérdések. Elobbit kezeletlen cöliákiás gyermekekben, utóbbit pedig 1. típusú diabétesz mellituszban és cöliákiában egyaránt szenvedo betegekben vizsgáltuk. Kísérletes munkámban döntoen az adott immunmediált bélbetegségben szenvedok mukózájában zajló immunológiai történéseket vizsgáltam, ennek megfeleloen az irodalmi áttekintés súlypontja a táplálékallergia és a cöliákia patomechanizmusára és az orális tolerancia ismertetésére fókuszálódik.
6
II. CÉLKITUZÉSEK
Táplálékallergiás és cöliákiás betegek vékonybélbiopsziás mintáin immunhisztokémiai és in situ hibridizációs módszerek alkalmazásával adhéziós molekulák, citokinek, proliferációs és immunmarkerek expresszióját vizsgáltam kontroll mintákhoz képest. 1. Frissen diagnosztizált és már kezelt táplálékallergiás gyermekek duodenális mukózájában analizáltam az adhéziós molekulák közül az intercelluláris adhéziós molekula-1 (ICAM-1), a leukocita funkcionális antigén-1 (LFA-1) és a limfocita „homing”
receptor
? 4? 7
megjelenését.
Fokozott
expresszió
esetén
arra
a
következtetésre juthatunk, hogy az adott adhéziós molekula szerepet játszik az antigén prezentáció, illetve az „intesztinális homing” folyamatában. Ezen kívül még számos immunmarker és két ellentétes pólusú citokin (interferon-?/ IFN-? és interleukin-4/ IL-4) expresszióját is vizsgáltam. Utóbbiak kijelölik az adott kórképre jellemzo citokin mintázatot, a Th1, illetve a Th2 dominanciát. Az adott citokin mintázat feltérképezése a jelenleg igen sok átfedést mutató csoportosítást is pontosíthatja. Annak ellenére, hogy a rutin szövettani vizsgálattal nem láttunk a kezeletlen táplálékallergiánál boholyk árosodást, Ki-67 proliferációs marker vizsgálatával esetleg már elore ki lehet mutatni a mélyben zajló fokozott epiteliális proliferációt. 2. A táplálékallergiás felnottek a gyerekekhez hasonlóan a késoi típusú, táplálékfehérje indukálta enteropátiás csoportba tartoztak. Fontos kiemelni, hogy az életkori eltéréseken kívül egyéb lényeges különbségek is fölfedezhetok a két betegcsoport között (rövidebb provokációs ido, a terhelést követo mintavétel módja), melyek feltehetoen megváltoztatják a vizsgált paraméterek dinamikáját. Ennek megfeleloen célkituzésnek tekintettem egyrészt a vizsgált adhéziós molekulák (ICAM1, LFA-1, ? 4? 7 és MAdCAM), citokinek (IFN-? és IL-4), immun- és proliferációs markerek expressziójának elemzését a táplálékallergiás felnottekben is, másrészt a kérdéses markerek összehasonlító vizsgálatára is lehetoségem nyílt a két populációban (gyerek vs. felnott). 3. A cöliákia önálló kórkép, bár a táplálékallergiák közé is besorolható, hiszen lényegében egy élethosszan tartó glutén allergiáról van szó. A kórképpel kapcsolatban a gyermekkori késoi típusú táplálékallergiásokhoz hasonlóan - az IFN-? és az IL-4 in
7
situ
hibridizációs vizsgálatot cöliákiás gyermekek duodenális mukózájában is
analizáltam. A fokozott IFN-? expresszió ismert az atrófiás, cöliákiás nyálkahártyában, ez az egyik dönto eleme a mukózális károsodás kialakulásának. A T helper 2 citokinek közé tartozó IL-4 esetleges emelkedett szintje magyarázhatná a cöliákiában megfigyelt fokozott B sejt aktivációt és az autoantitest képzést. 4. Az egyes típusú diabétesz mellituszban szenvedo gyermekekben (1TDM) a cöliákia prevalenciájának meghatározása mellett immunhisztokémiai módszerrel detektáltam az intraepiteliális ?? T sejteket olyan cukorbeteg gyermekek mukózájában, akik silent vagy látens cöliákiában is szenvedtek. Ezen kívül azt is elemeztem, hogy a diabéteszes gyermekekben a cöliákia igazolása után bevezetett gluténmentes diéta hogyan befolyásolta a glikémiás kontrollt, a testtömeg- indexet és az inzulin igényt.
8
III. IRODALMI ÁTTEKINTÉS
III.1. TÁPLÁLÉKALLERGIA Hippokratész írta le elsoként, hogy egy tehéntej-allergiás egyénben a tehéntej elfogyasztását követoen hányás, urtikária és fejfájás lépett föl, amely a táplálékok által kiváltott allergiás reakció elso leírásának tekintheto. Annak ellenére, hogy az ezt követo kb. 2400 évben jelentos felfedezések és megfigyelések történtek a táplálékallergia tudományában, a kórképpel kapcsolatban még mindig számos kérdés megválaszolásra vár (1,2). Továbbra sincs könnyen kivitelezheto és megbízható diagnosztikus eljárás a kórkép igazolására (3,4). Ennek egyik oka, hogy a táplálék elfogyasztását követoen olyan tünetek is kialakulhatnak, amelyek nem immunmediáltak és nem allergiás úton következnek be. Utóbbiak közé különbözo toxikus reakciók, enzimhiányon és különbözo bioaktiv mediátorok felszabadulásán alapuló pszeudoallergiás kórképek tartoznak. A táplálékokkal kapcsolatos reakciókat a III.1. táblázat tartalmazza.
III.1. táblázat. A táplálékokkal szemben kialakult különbözo reakciók Toxikus reakciók
bakteriális toxinok (Clostridiumok, Staphylococcus, Salmonellosis, E. coli), gombatoxinok enzimhiány (pl. laktáz), hisztamin és más biogén anyagok felszabadulása IgE és nem IgE mediált táplálékallergiák
Nem immunmediált reakciók Immunmediált reakciók
A táblázatból kitunik, hogy a toxikus és a pszeudoallergiával szemben „valódi” táplálékallergiáról akkor beszélünk, ha a táplálék vagy annak alkotórésze allergénként hatva immunológiai folyamatot indít be és létrehozza az adott klinikai tünetet.
III.1.1. Táplálékallergia gyakorisága A táplálékallergia (TA) bármely életkorban felléphet, leggyakrabban 3 éves életkor alatt, döntoen csecsemokorban jeletkezik. A korrekt diagnózis fontosságát mutatja az a prospektív tanulmány, ahol 480 újszülöttet követtek nyomon 3 éves korig. A gyermekek 28%-áról gondolták, hogy valamilyen ételre allergiások, de valójában csak 8%-ban sikerült elminináció-provokációs próbával verifikálni az adott táplálékallergiát (5).
9
További prospektív vizsgálatok alapján megállapítható, hogy a csecsemok kb. 2,5%-a tekintheto tejfehérje-allergiásnak. Az IgE mediált reakció a tejfehérje által kiváltott hiperszenzitív kórképek 60%-áért felelos. A tejfehérje-allergiák túlnyomó többségét a gyermekek 3 éves korra „kinövik”. Érdekes megfigyelés, hogy ezen gyermekek 15%ában tizenéves korban visszatér valamilyen étellel szembeni allergiás rekació, harmadukban többféle étellel szemben. Brit és amerikai adatok szerint a tojásallergia gyakorisága 1,3%, a földimogyoróval szembeni túlérzékenység 0,5%. Hazánkban végzett felmérések szerint, 1990-1994 között a budapesti régióban hároméves életkor alatt a tehéntej-allergia gyakorisága 2,1%, tojás- és szójaallergiát hozzáadva ez az érték 2,5%-ra no (6). A hazai táplálkozási szokásoknak megfeleloen csecsemo- és kisdedkorban a leggyakoribb táplálékfe hérje-allergia a tehéntej, tojás, szója és gabona fehérjéivel szemben alakul ki. Ugyanakkor a hal, dió, mogyoró, gyümölcsök (eper, málna, oszibarack, dinnye, alma, citrusfélék) és a zöldségfélék (paradicsom, bab, zeller, burgonya) allergiát kiváltó hatásával is számolni kell. Az atópiás dermatitiszben szenvedok egy részénél TA igazolható. Novembre vizsgálatai alapján megállapíthatjuk, hogy a közepesen súlyos - súlyos (moderate – severe) atópiás dermatitisz hátterében 35%-ban TA áll, továbbá az asztmás gyermekek 6 százalékában igazolható a légúti tüneteket kiváltó TA (7). Csecsemo- és kisgyermekkorban a táplálékokban levo tartósítószerek, különbözo additívok a TA szempontjából kisebb gondot jelentenek, hiszen a nemzetközi normák szerint a kisdedek táplálására használt készítmények ezeket nem tartalmazzák. Gyermekekben végzett felmérések szerint a táplálék additívokkal szembeni allergia aránya kevesebb, mint egy százalék (8). Felnottekben ritkábban találkozunk táplálékallergiával, gyakorisága 1-2%-ra teheto. Az USA-ban végzett felmérések szerint a földimogyoróval és mogyoróval szembeni allergia gyakorisága eléri az 1,3%-ot. Brit adatok szerint valamilyen táplálékkal szembeni allergia a felnott lakosság 1,4-1,8%-át érinti (9). Holland felmérés szerint az ottani lakosság körében a TA gyakorisága 2% (10).
10
III.1.2. A táplálékallergia patomechanizmusa Gasztrointesztinális barrier A megszületést követoen az újszülött gyermek idegen fehérjék és baktériumok millióival találkozik. A folyamatos antigén terheléssel és a patogén kórokozókkal szemben az intesztinális nyálkahártya jelentos védelmet nyújt. A mukózális immunrendszer fontosságát az is jelzi, hogy a szervezet összes immunglobulin termelo sejtjének 70-80%-a a bélnyálkahártyában helyezkedik el. Az intesztinális mukózának és a mukózális immunrendszernek feladata kettos, egyrészt biztosítani kell hiperszenzitív tünetek kialakulása nélkül a táplálék felszívódását és a kommenzális flórával szembeni békés együttélést (immuntolerancia), másrészt a patogén kórokozókkal szemben meg kell védeni a szervezet egészét (aktív immunválasz) (11). A folyamatban számos „nem immunológiai” és immunológiai faktor játszik fontos szerepet, melyeket a III.2. táblázat összegez. Az alábbi táblázat egyes összetevoi még éretlenek újszülöttkorban. Így a gyomorsavszekréció az élet elso hónapjában viszonylag alacsony, az intesztinális proteáz aktivitás csak 2 éves korban éri el a felnottekre jellemzo értéket. Különösen fontos, hogy a szekretoros IgA születéskor még hiányzik és hónapokon keresztül még alacsony értéken stagnál. Ennek alapján értheto, hogy különbözo táplálékféleségek korai bevezetése az adott epitópokkal szemben specifikus IgE antitest választ generál (12). Egy tízéves utánkövetéses, 1200 kisded bevonásával végzett prospektív tanulmány szerint direkt lineáris kapcsolat mutatható ki a korai ételfélék (szolidok) bevezetése és az atópiás dermatitisz elofordulása között. Utóbbi kórkép háromszor gyakrabban fordult elo azoknál a gyermekeknél, akik 4 hónapos kor elott négy vagy többféle szolidot kaptak (13). A folyamat összetett voltát mutatja az a tapasztalati tény, hogy a várakozással ellentétben a volt koraszülöttekben nem gyakoribb az allergia (14). Az elobb elmondottak szerint azt várnánk, hogy az éretlen enzimatikus muködés, fokozott bélpermeábilitás, csökkent szekretoros IgA és savszekréció miatt a kórkép gyakoribb lesz. Bár a magyarázat nem pontosan ismert, feltehetoen a koraszülöttek éretlen immunrendszere állhat a háttérben, vagyis a T helper 2 mediált, IgE produkció sem muködik – szerencsére ? érett szinten (15).
11
III.2. táblázat. A gasztrointesztinális mukózális barrier összetevoi
FIZIOLÓGIÁS BARRIER A táplálék emésztésében közremuködo
Rágás, nyál amiláz
faktorok
Gyomorsav, pepszin Pankreász és intesztinális enzimek Szomatosztatin, epesavak Bélepitel sejtjeinek lizoszómális aktivitása
Az emésztett táplálék penetrációjának
Kolumnáris epitel egyrétegu sejtsora
blokkolása
Glikokalix: glikoprotein és mucin komplex Intesztinális mikrovillus struktúra és „tight junctions” Intesztinális perisztázis
IMMUNOLÓGIAI BARRIER Természetes immunitás
Sejtes elemek: natural-killer (NK) sejt, makrofág, epiteliális sejt Toll- like receptorok családja
Adaptív immunitás
Antigén specifikus szekretoros IgA a béllumenben Bél-asszociált limfoid szövet Antigén specifikus IgA és IgG (szérum) T-sejtek/Intraepiteliális limfociták, masztociták Citokinek Adhéziós molekulák
Intesztinális epitelsejtek A közelmúltban végzett állatkísérletek szerint a lebontott táplálék felvételében a központi szerep az intesztinális epitelsejteknek jut. Az intesztinális epitelsejt nem professzionális antigén prezentáló sejtként is muködik, felszínén számos indukálható és konstitúcionális immunmarkerrel, adhéziós molekulával (III.3. táblázat). Normál
12
állapotban az IEC a kérdéses antigént a CD8 regulációs sejtnek mutatja be, amely szupresszor habitusánál fogva nem generál immunválaszt. Kóros körülmények között ez az aktivációs rendszer zavart szenved, perzisztáló gyulladás lesz a következmény. Regulációs T sejtek A közelmúltban a regulációs (szupresszor) T sejtek három csoportját fedezték fel, melyeknek nagy jelentoséget tulajdonítanak az orális tolerancia fenntartásában. Ennek részletes leírása azért az orális tolerancia fejezetben olvasható. Táplálékallergének Annak ellené re, hogy táplálékféleségek százait fogyasztja az ember, csak néhány okoz allergiás reakciót. Gyermekekben a hiperszenzitív reakciók 90%-áért a tehéntej, tojás, földimogyoró, szója és a gabonafélék okolhatók. Felnottkorban az allergének 85%-át a földimogyoró, hal, kagyló, gabonafélék és a mogyoró alkotja (16). Általánosságban elmondható, hogy az allergiás frakcióra jellemzo, hogy hostabil, a vízoldékony glikoprotein frakciójának nagysága 10 és 70kD között található. Saját munkámban az ételallergiás gyermekek és felnottek körében a táplálékallergének a tehéntej, a búza, a rozs és a zab voltak.
III.3. táblázat. T-sejt interakcióval kapcsolatos IEC immunmarkerek és adhéziós molekulák Intraepiteliális sejt (IEC) INDUKÁLHATÓ
KONSTITÚCIONÁLIS
CD 86 ICAM-1 HLA-E és HLA-G MIC-A és -B
MHC-I és II MHC-I b (CD1d, HLA-E) MIC-A és -B E-cadherin (? E? 7) gp 180 LFA-3 (CD2 ligand)
III.1.3. A táplálékallergia okozta klinikai tünetek Az újabb felosztás szerint a TA okozta hiperszenzitív kórképek döntoen két csoportra oszthatók:
azonnali,
IgE
mediált
vagy
késleltetett,
nem
IgE
mediált
reakciótípusokra (17). Azok az táplálékallergiás gyermekek, akik az elso típusba
13
tartoznak, klasszikus tüneteket prezentálnak: az étel elfogyasztása után, rendszerint néhány percen-órán belül hasmenés, hányás, kiütés és anafilaxia lép fel. Szerológiai vizsgálatokkal általában sikerül kimutatni a specifikus IgE antitestet (95%) (18). Ezzel ellentétben a "késoi immunreakciót" mutató TA-ás betegeknél általában nem tudjuk a specifikus IgE antitestet detektálni (19), továbbá a tünetek is mások: nem kielégíto gyarapodás, malabszorpció, krónikus hasmenés vagy csupán krónikus hasfájás (20-22). Ezekben az esetekben nem mindig várható mukózális lézió (23-25) a gyulladás enyhekrónikus természete folytán, bár a cöliákiát, malabszorpciós kórképeket itt is ki kell zárnunk. Vizsgálatunkban szereplo betegek az utóbbi a csoportba tartoztak, bár a két csoport mereven nem választható szét egymástól, kevert tünetek, laboratóriumi eltérések is jelentkezhetnek.
GASZTROINTESZTINÁLIS TÜNETEK Mivel a táplálékkal bejutó és lebomló fehérjék helye a gasztrointesztinális traktus, nem meglepo, hogy arra érzékenyekben változatos gyomor-bél panaszok alakulhatnak ki. Azonnali, IgE mediált (I. típusú immunreakció) kórképek Az azonnali típusú gasztrointesztinális hiperszenzitivitás (immediate gastrointestinal hypersensitivity) olyan IgE mediált kórkép, ahol a gyomor-bél panaszokon kívül más célszerv (bor, légutak) tünetei is jelentkeznek. 1993-ban felnotteken végzett radiológiai tanulmányok szerint báriumos kontrasztanyag segítségével gyomorretenciót, vékonybélhipermotilitást és kolonspazmust figyeltek meg (26). Néhány évvel késobb hasonló vizsgálatot gyermekeken is elvégeztek, ahol a provokációt követoen gyomorhipotónia és retenció, valamint kifejezett pilorusspazmus és következményes béldiszmotilitás lépett föl. Pollard és Stuart még rigid gasztroszkóppal végzett tanulmányában a kérdéses allergén apró darabját a betegek gyomrának mukózájára juttatták, majd 30 perc múlva újra megnézték a területet. Hiperémiás, ödémás nyálkahártyát, szürkés, mucinózus, foltos felrakódást és elszórtan petechiákat láttak (27). Ezeket az elváltozásokat több mint 40 évvel késobb flexibilis endoszkóppal végzett tanulmányban is verifikálták, továbbá masztociták hisztamin degranulációját is igazolták (28). A betegség akut tünetei közé hányinger, hányás, hasfájás, hasmenés tartozik, bár a csecsemok között az azonnali hányás helyett sokszor idonkénti vomitusszal és vontatott súlyfejlodéssel találkozunk. Érdekes megfigyelés, hogy atópiás dermatitiszben és
14
táplálékallergiában egyaránt szenvedo gyermeknél az antigénnel történo ismételt találkozások részleges gasztrointesztinális masztocita deszenzibilizációt okoznak, így komoly boholyatrófia, súlyos panaszok nem mindig jelentkeznek. Sokszor ezeknél a gyermekeknél gyengébb étvágy, krónikus hasfájás jelentkezik, és csak szénhidrát abszorpciós vizsgálattal lehet igazolni a malabszorpciót (29). Az orális allergia szindróma gyakorisága ez elmúlt évtizedben rohamosan nott, a pollenallergiás felnottek 40%-át érinti (30). A szindróma egy olyan kontakt allergia, amely az orofarinxot érinti. A lokális IgE mediált masztocita degranuláció következménye az ajkak, a nyelv és a környezo mukóza ödémája és viszketo érzése. A tünetek rövid életidejuek és általában friss zöldség és gyümölcs fogyasztását követik. (31). Az allergiás eozinofil özofagitisz, gasztritisz és gasztroenteritisz a kevert kórképek (mixed IgE/non IgE) közé tartoznak. A kórképekre jellemzo, hogy az adott mukózában eozinofil sejtek csoportosulnak, a bazális zónában hiperplázia, papilláris elongáció jelentkezik, vaszkulitisz nélkül. Perifériás eozinofilia az érintettek felében észlelheto. Annak ellenére, hogy a betegek perifériás vérében excesszív mennyiségu IL-4 és IL-5 mutatható ki, a betegség pontos patomechanizmusa ismeretlen (32). Az allergiás eozinofil özofagitisz jellemzo tünete a terápiarezisztens gasztro-özofageális reflux, intermittáló hányás, hasfájás, irritabilitás, alvászavar. Egy olasz munkacsoport egyéves refluxos gyermekeknél 40%-ban tudta igazolni a tehéntej-allergiát (33). Eozinofil gasztritisz szintén a fiatalabb életkorban jelentkezik, posztprandiális hányás, hasfájás,
anorexia,
hematemezis,
elmaradt
gyarapodás
és
„gasztrikus-outlet”
szindróma/pilórus sztenózis formájában. Utóbbi hátterében az eozinofil sejtek által indukált muszkuláris réteg megvastagodása, rigiditása állhat (34). Allergiás eozinofil gasztroenteritisz az elobbi két kórkép kevert tüneteivel jelentkezhet, jellemzoje a fogyás és a gyarapodásbeli elmaradás. Meglepo módon a tünetek között obstipáció is szerepelhet, bár a székrekedés eozinofil sejtes infiltráció nélkül is jelentkezhet a táplálékallergia egyéb formáiban (35). Az allergiás eozinofil kórképek 50%-ában mutatható ki atópia, IgE mediáció csak ritkán igazolható. A kórkép ritka, de markáns tünete lehet a fehérjeveszto enteropátia következtében kialakult hipoproteinémiás ödéma. A tünetek csak 3-8 héttel a felelos allergén megvonása után szanálódnak, a háttérben gyakran multiplex allergia igazolható (36).
15
III.4. táblázat. A táplálékallergia gasztrointesztinális kórképeinek csoportosítása (dolt betuvel az általam vizsgált betegek kórisméje)
IgE domináns
Kevert formák
IgE független
Azonnali gasztrointesztinális
Allergiás eozinofil özofagitisz
Táplálékfehérje okozta
hiperszenzitivitás Orális allergia szindróma
enterokolitisz Allergiás eozinofil gasztritisz
Proktitisz
Allergiás eozinofil enterit isz
Enteropátia (Cöliákia)
Késoi típusú, nem IgE mediált (IV. típusú immunreakció) táplálékallergia Táplálékfehérje okozta enterokolitisz (dietary protein enterocolitis) leginkább az élet elso hónapjaiban jelentkezik, akár dehidrációig fokozódó befolyásolhatatlan hányáshasmenés képében (37). A hányás 1-3 órával az étkezés után indul, a véres hasmenés következtében anémia is kialakulhat, gyakori a haspuffadás és a növekedésbeli elmaradás. A kiváltó allergén általában tehéntej- fehérje és szójatápszer, az elobbi szoptatáskor is átjuthat a gyermekbe. Felnottekben hasonló kórkép jöhet létre rák expozíciót követoen, ekkor a véres széklet neutrofilokat, eozinofileket és CharcotLeyden kristályt is tartalmazhat. Allergiás enterokolitiszben a Prick teszt a specifikus IgE hiányában általában negatív. A jejunális biopszia boholyatrófiát mutat, az ödémás mukózában emelkedett számú neutrofilt, eozinofilt és masztocitát lehet detektálni. Az IgA és IgM sejtek száma szintén magasabb (38). Bár a kórkép patomechanizmusa részleteiben itt sem ismert, a közelmúltban végzett vizsgálatok azt mutatják, hogy a mononukleáris sejtek által termelt fokozott TNF-?
következménye a fokozott
bélpermeábilitás és a hipotenzió. Utóbbi a betegek 15%-ában megfigyelheto (39). Táplálékfehérje okozta proktitisz és enteropátia szintén a pár hónapos csecsemoknél fordul elo leggyakrabban. A proktitiszes gyermekek 60%-a anyatejjel táplált, típusos tünet a csekély hematokézia a jó általános állapotú csecsemonél (40). Az endoszkópiás vizsgálatok limfonoduláris hiperpláziát, lineáris eróziót és mukózális ödémát mutatnak.
16
Az epitéliumban és a lamina propriában eozinofil sejtek lehetnek nagyobb számban jelen. Súlyosabb esetekben kripta destrukció és granulocita invázió észlelheto (41). Táplálékfehérje indukálta enteropátiánál (TFIE) (dietary protein/ food sensitive enteropathy) kevésbé súlyos tüneteket és mukózális elváltozásokat találunk, mint a korábban ismeretett enterokolitisznél. A csecsemoknél még a tehéntej, tojás, szója fehérjéi a leggyakoribb allergének, majd az életkor növekedésével egyre inkább a búza, rozs, rizs, csirke és hal kerül elotérbe. A biopsziás minta szövettana lehet normális is, az esetleges boholyatrófia foltos eloszlása következtében (III.4. táblázat) (42). Tudományos munkámban szereplo betegek is lényegében ide tartoznak (TFIE). A közelmúltban több közlemény is ismertetett olyan késoi típusú táplálékallergiás gyermekeket, akiknél enyhe, olykor csak gasztrointesztinális panaszok jelentkeztek. Átlagéletkoruk alapján iskolások voltak, a kérdéses allergén a tehéntej és a gabona volt. A felso endoszkópos vizsgálatnál az enyhe tünetekkel párhuzamosan nem találtak boholyatrófiát, de érdekes módon az allergiás proktitisznél leírt limfonoduláris hiperpláziát a betegek duodenum bulbuszában szintén kimutatták (21). Tágabb értelemben a késoi típusú, nem IgE mediált TA-ba tartozik a cöliákia is, ennek ismertetése a VI.3. fejezetben található. A "késoi" immunreakcióban a központi szerep a lamina propria T limfocitáinak jut, melyek jelentosége cöliákiában jól ismert (43). A glutén-reaktív T limfociták villus atrófiát és kripta hiperpláziát okoznak (44). Annak ellenére, hogy a T sejtes hiperszenzitivitás
kulcsszerepe
feltételezheto
táplálékallergiában
is,
ebben
a
vonatkozásban nagyon kevés vizsgálatot végeztek (45).
A TÁPLÁLÉKALLERGIA BORTÜNETEI Az elozo gondolatmenetet folytatva a változatos bortünetek itt is besorolhatók az IgE és az idofaktor függvényében. Az IgE mediált kórképek közé tartozik az akut urtikária, az akut kontakt urtikária és az angioödéma. Krónikus urtikáriát ritkán okoz TA. Egy 554 felnottön végzett felmérés tanúsága szerint a krónikus urtikária hátterében csak 1,4%-ban állt TA. Hasonló nagyságú tanulmányt gyermekek esetében is végeztek, itt a 226 krónikus urtikáriás gyermeknél csupán 4%-ban igazoltak táplálékallergiát, annak ellenére, hogy a Prick teszt 31%-ban bizonyult pozitívnak (46).
17
A
kevert
formák
közé
tartozik
az
atópiás
dermatitisz
(AD),
melynek
patomechanizmusát azért ismertetem részletesen, mert ez az elváltozás az általam vizsgált betegek egy részénél is jelen volt. Az AD olyan ekcémás jelenség, amely korai gyermekkorban kezdodik, viszketéssel, hullámzó lefolyással; ismert a késobbi asztmával és allergiás rinitisszel történo kapcsolata (atópiás marsch). Az AD patomechanizmusában számos sejttípus vesz részt. Így a bor professzionális antigén prezentáló sejtje, a Langerhans sejt, amely felszínén allergén-specifikus IgE antitestet visel és száma AD-ban kifejezetten emelkedett. (47). A sejtek felszínén található nagy affinitású IgE receptorok ezerszer hatékonyabban képesek az antigént prezentálni a Th2 sejteknek, mint a hagyományos receptorok. A bor akut ekcémás területén döntoen Th2 citokinek találhatók (IL-4, IL-5, IL-13), míg a krónikus elváltozásban az IL-5 és IL-13 dominál (48). Ez utóbbi ellentétes a klasszikus, sejt mediálta, tuberkulin típusú allergiában leírtakkal, ahol nem az IL-4 és IL-5, hanem az IFN- ?, IL-2 a jellemzo. Érdekes adat, hogy a tehéntej-specifikus, CLA (cutaneous lymphocyte antigen) adhéziós molekulát hordozó sejtek száma csak azokban a betegekben volt magas, akik bortünetet (AD) mutattak, ellentétben a gasztrointeszinális tünetekkel járó formák mononukleáris sejtjeivel (49). A bormanifesztációk nem IgE mediált elváltozása közé tartozik a dermatitisz herpetiformis (Duhring-kór). A viszketo papulove zikuláris elváltozást gyakran tévesztik össze atópiás dermatitisszel, pedig ez nem más, mint a cöliákiával rokon gluténszenzitív borbetegség (50). A betegek EMA pozitívok, és a cöliákiásokhoz hasonló az autoantitest targetje (51). A cöliákiához hasonlóan, Duhring-kórban is a betegek 80-90%-a HLA-DQ2 (DQ8) haplotípussal rendelkezik. A dermoepidermális junkcióban granuláris (85-90%) vagy lineáris (10-15%) IgA depozitumokat lehet kimutatni, amelyek döntoen az IgA1 családba tartoznak. Figyelemreméltó megfigyelés, hogy az IgA depozitumok J láncot is tartalmaznak, amely arra utal, hogy ezek az immunglobulinok a bélbol származnak. A bélmukóza elváltozása a cöliákiában leírtakhoz hasonló, bár annál általában enyhébb fokú. Újabb ismeret, hogy dermatitisz herpetiformiszban és cöliákiában más típusú transzglutamináz képezi a target antigént (52). Elobbi kórképben az epidermális transzglutamináz (3. típus) egyértelmu dominanciája mutatható ki a szöveti transzglutaminázzal szemben. Munkám szempontjából nagyon értékes az a legújabb megfigyelés, hogy Duhring-kóros és
18
cöliákiás betegek tünetmentes elsofokú rokonaiban az ép nyálkahártya ellenére finom módszerekkel kimutathatók bizonyos eltérések, így Th1 sejtekre jellemzo citokin mintázat (53).
A TÁPLÁLÉKALLERGIA LÉGÚTI TÜNETEI IgE mediált kórképek közé felso légúti (allergiás rinokonjunktivitisz) és alsó légúti elváltozások (bronchospazmus, asztma) tartoznak. Annak ellenére, hogy a köztudatban gyakran szerepel tejfehérje-allergiás gyermekek allergén provokálta rinitisze, ennek aránya csak 0.08%-0.2%. Érdekes megfigyelés, hogy amennyiben a táplálékallergiás gyermek egyben atópiás dermatitiszben is szenved, akkor ez az arány jóval magasabb; kettosvak, placebo kontrollált vizsgálatok szerint a légúti panaszok aránya 16% (54) Nem IgE mediált, táplálék által kiváltott pulmonális tünetek közé tartozik a Heiner szindróma
(pulmonális
hemosziderózis),
amely
egy
nagyon
ritka,
rekurráló
tüdogyulladás, hemosziderózissal, bélvérzéssel, vashiányos anémiával és növekedésbeli elmaradással (55). Leginkább tehéntej fogyasztását követoen, de tojással és sertéshússal kapcsolatban is találunk közleményeket. A betegség pontos patomechanizmusa nem ismert, bár a betegeknél általában kimutathatók a precipitáló IgG antitestek és a perifériás eozinofilia.
A TÁPLÁLÉKALLERGIA EGYÉB TÜNETEI A táplálékallergia egyéb tünetei közé tartozik a generalizált anafilaxiás reakció, mely évente több mint 100 áldozatot követel az USA-ban (56), valamint a táplálék asszociált, fizikai terhelés kiváltotta anafilaxia. Utóbbi formában rendszerint 18-35 éves felnotteknél (kétszer gyakoribb nokben) bizonyos ételek fogyasztását 2-4 órával követoen, fizikai terhelés alatt lépnek föl az anafilaxiás tünetek. Fizikai terhelés hiányában az adott étel probléma nélkül fogyasztható. Leggyakrabban gabonafélék (búza), tehéntej, zeller és kagyló fogyasztása elozi meg a fizikai terhelést (57). Bár az általam vizsgált felnott betegek jelentos része gabonaallergiás volt, ilyen panaszuk nem volt. Egyéb, táplálék által kiváltott ismert tüneteket sem észleltük az általunk vizsgált betegeknél (neurológiai és magatartászavar, alvászavar, migrén).
19
III.1.4. A táplálékallergia diagnózisa A mindennapi gyakorlatban a gondos anamnézisen és fizikális vizsgálaton túl a TA diagnosztikus algoritmusa a következo: Prick teszt, specifikus IgE meghatározás, rátevési próba (patch test) és az eliminációs/provokációs vizsgálat. Sajnos, egyértelmuen megbízható módszerrel nem rendelkezünk az elimináción és a provokáción kívül, ezért is tartottam fontosnak, hogy vizsgálataimban feltárjak olyan eltéréseket, melyeknek akár diagnosztikus jelentosége is lehet. Mivel a munkámban szereplo TA-ás betegek diagnózisának felállításában a fenti eljárásokat alkalmaztuk, részletesen csak ezeket ismertetem. A többi, gyakorlatban ritkán használt laboratóriumi módszert a III.5. táblázatban tüntettem föl (58).
III.5. táblázat. A táplálékallergia laboratóriumi diagnosztikája
IgE mediált kórkép
Nem IgE mediált kórkép
Specifikus IgE (RAST, ELISA, cap-RAST)
Ráhelyezéses („patch”) teszt
Prick teszt
Eozinofil kationos protein a székletben
In vitro teszt a szekvenciális („continuous”) Táplálékallergén-stimuláció
utáni
citokin
epitóp meghatározásra
meghatározás
Rekombináns allergének
Perifériás T sejt proliferációs teszt
Hisztamin degradációs vizsgálatok
IL-4 és TNF-? meghatározás a szérumban és a székletben Endoszkópos provokációs tesztek
Prick teszt. A borteszt menetének leírása a Betegek és módszer fejezetben (IV. fejezet) található. Diagnosztikus értéke elsosorban az azonnal reakciót adó, IgE mediált TA-ban van. A Prick teszt fiatalabb gyermekkorban nem ad olyan biztos választ, emiatt egyesek 3 éves kor elvégzése elott nem ajánlják. Idosebb korban a teszt pozitív prediktív értéke mindössze 50%, negatív prediktív értéke viszont 95%. A borteszthez hasonló alkalmazási körrel bír az antigénspecifikus IgE (RAST, ELISA, cap-RAST) vizsgálata (59). A korábban elmondottak szerint a késoi reakciót mutató TA-ban használata igen
20
limitált. Az antigénspecifikus IgG antitestek kimutatásának jelentosége TA-ban vitatott, leginkább az IgG4-et tekintik kórjelzonek. Ráhelyezéses („patch”) teszt. Ezt az ígéretes tesztet éppen a késoi típusú TA kimutatására vezette be a klinikai gyakorlatba a nagyhíru turkui (Finnország) munkacsoport, Isolauri vezetésével (60). A teszt lényege, hogy a kérdéses allergént hoszabb idore (48 óra), okklúzió alatt ráhelyezik a borre. A leolvasás a „patch” eltávolítása után 20 perccel, majd 72 órával késobb történik. A kezdeti adatok szerint a patch teszt a késoi TA gyermekeknél 89%-ban volt pozitív úgy, hogy a Prick teszt nem mutatott reakciót. Mások ilyen mértéku korrelációt nem tudtak kimutatni, így nemzetközi ajánlások szerint a patch teszt további vizsgálatokat és standardizációt igényel (61). A TA bizonyításának „gold standard” módja a kettosvak, placebo kontrollált táplálékterhelés. A mindennapi gyakorlatban ez a megbízható, de körülményes és nehezen kivitelezheto eljárás nem terjedt el. Teljes mértékben – sajnos még ez a diagnosztikus módszer sem tökéletes. Ugyanis a kapszulába csomago lt, sokszor a vékonybélben oldódó táplálékfehérjéknél nem történik meg a gyomorban az adott fehérje hidrolízise. Így olyan epitópok tunhetnek el, illetve kerülhetnek elotérbe, melyek kérdésessé tehetik a vizsgálat eredményét. Munkámban nyílt allergén eliminációt és provokációt alkalmaztunk, melynek részletes leírása a IV.1.1. fejezetben olvasható.
III.2. CÖLIÁKIA A cöliákia olyan élethosszan tartó táplálékallergia, ahol a kiváltó allergén a glutén. A betegség bármely életkorban felléphet. Az utóbbi idoben a cöliákia több alcsoportját is megkülönböztetik. A csendes („silent”) cöliákiában a beteg teljesen tünetmentes, de mégis kimutatható a vékonybélnyálkahártya atrófiája, a betegség felismerését ilyenkor szerológiai szurovizsgálat teszi lehetové. Látens cöliákiáról akkor beszélünk, ha egy betegben, egy bizonyos idopontban a vékonybélnyálkahártya szöveti szerkezete gliadin tartalmú étrend fogyasztása mellett nem mutat fénymikroszkópos eltérést, majd a késobbiekben mégis boholyatrófia alakul ki, ami gliadinmentes diétán normalizálódik. A cöliákiának ezt az utóbbi formáját potenciális cöliákiának is nevezik. Az utóbbi évek vizsgálatai alapján egyértelmuvé vált, hogy a cöliákia klinikai tünetekkel jelentkezo formája csupán a betegek kisebb hányadában fordul elo, a többségben
21
észrevétlenül áll fenn. Ezért a betegséget gyakran hasonlítják egy jéghegyhez, aminek csak a vízbol kinyúló csúcsa jelzi a manifeszt formát. A megbízható szerológiai vizsgálatoknak is köszönhetoen a cöliákiát egyre gyakrabban kórismézik, prevalenciája például Finnországban 1:99, mellyel korrelál a hazánkban végzett felmérés is (62,63). III.2.1. Genetikai hajlam A betegség kialakulását genetikai tényezok is befolyásolják, amit jelez az, hogy a betegek elsofokú rokonainak kb. 4-5%-ában mutatható ki a kórkép (64). A betegség örökletes meghatározottságát mutatja az is, hogy az egypetéju ikrek 75 %-ában konkordáns a cöliákia elofordulása (65). A diszkordánsnak tuno ikerpárok egy részében is igazolták, hogy az egészségesnek tuno gyermekben a cöliákia látens formában perzisztált. Genetikai vizsgálatok alapján ismert, hogy a cöliákiások többségében kimutatható a HLA B8, DR3 és DR7 antigén, a betegek egy csoportjában pedig a HLA DR5 és DR7. A DQ2 és/vagy DQ8
antigén gyakorlatilag minden cöliákiásban
elofordul. A cöliákiára hajlamosító HLA-DQ alfa/béta heterodimert a DQA1*0501 és a DQB1*0201 allélek kódolják (66). A heterodimer szintetizálása szempontjából mindegy, hogy ezek az allélok cisz, vagy transz pozícióban helyezkednek el. Az elobbi figyelheto meg a HLA-DR3 antigént hordozókban, az utóbbi pedig azokban, akik HLADR5/DR7 heterozigoták. A HLA-B8 antigén elterjedtsége és a cöliákia gyakorisága között egyenes arányosság figyelheto meg (67). III.2.2. A cöliákia patogenezise Habár a gliadin etiológiai szerepe egyértelmu a cöliákia kialakulásban, az a mechanizmus, ahogy a kórképre jellemzo elváltozások kialakulnak, máig sem pontosan ismert. A búzalisztbol vízzel kioldható a keményíto, és a megmaradó elasztikus massza tartalmazza a glutént, amibol alkohollal oldható ki a cöliákiások számára toxikus gliadin. A gliadin mintegy 40 különbözo frakcióból áll. Ezek a frakciók az elektroforetikus mobilitásuk alapján ? , ? , ? és ? gliadin csoportokba oszthatók. A gluténfehérjék mindegyikére jellemzo, hogy glutaminban és prolinban gazdagok. Az ? gliadin
frakció
bizonyult
in
vitro
vizsgálatokban
a
legtoxikusabbnak
a
vékonybélnyálkahártyára (68). In vivo is bizonyítható, hogy mind a négy frakció intraduodenális adása után már 6 órával kialakul a nyálkahártya károsodása. Az ? gliadinnak azt a részét, amelyik kifejti a toxikus hatást, máig sem ismerjük pontosan. Ismert azonban az ? -gliadin pontos aminosav sorrendje. Kagnoff és mtsai még 1984-
22
ben kimutatták, hogy az adenovírus 12 E1b proteinjének aminosav szekvenciája egy 12 aminosav
hosszúságú
szakaszon
homológ
az
? -gliadinéval
(69).
Tehát
a
gliadinszenzitivitás kialakulására a genetikus meghatározottság mellett szerepe lehet az adenovírus 12 szerotípussal történt fertozésnek, vagyis egy környezeti faktornak is. Ezt a késobbiekben magyar vizsgálatok is igazolták, hiszen cöliákiás betegekben ezzel a szerotípussal történt átfertozöttség szignifikánsan magasabb volt a kontrollokhoz képest (70). A cöliákia kialakulásában biokémiai és immunológiai mozzanatok egyaránt szerepet játszanak. Mivel munkámhoz az utóbbi tartozik szervesen, csak ezt ismertetem. Immunológiai elméletek A jelenlegi legelfogadottabb vélemények szerint a cöliákia patogenezisében az alapveto szerepet az immunmechanizmusok játszák. Erre utal az az elobbiekben már tárgyalt tény is, hogy bizonyos HLA antigének elofordulása gyakori a cöliákiás betegekben. A CD4 pozitív helper T-sejtek aktivációja csak az antigénprezentáló sejtek felszínén már feldolgozott antigén és az MHC II antigének megfelelo kapcsolódása esetén jön létre, más szavakkal kifejezve az immunaktiváció MHC korlátozás alatt áll. Ennek ismeretében feltételezheto, hogy a cöliákiásokban mindig kimutatható HLA-DQ alfa/béta heterodimer a DQA1*0501 és a DQB1*0201 a gliadin bizonyos fragmentumait specifikusan kötni képes. Ennek ellentmondani látszik azonban az a tény, hogy ez a heterodimer elsosorban a sok helyen negatív töltésu aminosavakat tartalmazó peptideket köti. Ez egy nehezen értelmezheto megfigyelés volt, hiszen a negatív töltésu aminosavak igen ritkán fordulnak elo a gliadin peptidekben. Ismert azonban, hogy a glutamin gyakori alkotórésze a gliadin peptideknek, amelyek dezaminálás
után
könnyen
negatív
töltésu
glutaminsavakká
alakulhatnak
át.
Bebizonyosodott, hogy a transzglutamináz enzim, ami nagy mennyiségben kimutatható a vékonybél- nyálkahártyában, képes ezt a feladatot betölteni. Ennek köszönhetoen kialakuló negatív töltésu aminosavakat tartalmazó gliadin peptidek már képesek kötodni a HLA-DQ2 molekulákhoz és megindítják a T-sejt aktivációt (71). Az immunaktivációt jelzi az is, hogy a kezeletlen cöliákiások vékonybélnyálkahártyájában gliadin specifikus antitestek és T-sejtek egyaránt kimutathatók. A gliadin specifikus ? /? T-sejtek akkor aktiválódnak, ha a gliadin peptidek a cöliákiára jellemzo DQ2, vagy DQ8 MHC molekulákkal kapcsolódnak. Cöliákiában azonban nem
23
csak gliadin elleni, hanem endomizium elleni ellenanyagok is kimutathatók. Az utóbbi évek egyik igen jelentos felismerése volt, hogy az antiendomizium antitest szubsztrátja a szöveti transzglutamináz, vagyis egy autoantigen (72). Késobb egyértelmuen igazolták, hogy a cöliákiában kimutatható autoantitestek mindegyike, így az antiendomizium (EMA), az antiretikulin és az antijejunalis antitestek a szöveti transzglutamináz (TG) ellen irányulnak (73). A TG a szervezetben mindenütt eloforduló fehérje, amely különbözo fehérjék között hoz létre keresztkötéseket úgy, hogy peptidkötések kialakulását katalizálja egyik fehérjelánc glutamin karboxiamid és a másik fehérjeláncon található lizin ?-aminocsoportja között. A szöveti TG egyik fontos funkciója, hogy keresztkötéseket hoz létre az extracellularis mátrix proteinjei között, aminek fontos szerepe van szöveti sérülés esetén. A TG elleni immunreakció feltétlenül szerepet játszik a patogenezisben. Nemrégiben Sollid és mtsai megalapozottnak tuno hipotézist dolgoztak ki arra, hogy miként veszíti el a szervezet a toleranciát a TG autoantigén ellen (74). A TG képes önmagához kötni a gliadint és így egy transzglutamináz- gliadin neoantigén komplex jön létre. A lamina propriában találhatók olyan B-sejtek, amelyek képesek felismerni a TG-t, de normális körülmények között a helper T-sejtek nem indukálják ezen specifikus B-sejtek ellenanyag képzodését. A TG-gliadin komplexet azonban a B-sejtek felveszik, feldolgozzák és bemutatják a gliadin specifikus CD4+ T-sejteknek is. Azokat természetesen csak akkor tudják aktiválni, ha a gliadin a DQ2, vagy DQ8 hisztokompatibilitási antigénekhez kötodik. Ebben az esetben a T-sejtek aktiválódnak és citokineket termelnek, amelyek aktiválják a bemutató B-sejteket, amelyek ezután EMA antitesteket fognak termelni. Az elmondottakból nyilvánvaló, hogy a cöliákiát elindító folyamathoz a megfelelo MHC II konstelláción és a gliadinon kívül egy harmadik faktorra: a szöveti TG-ra is szükség van (75). A fentiekben részletezett elmélet nem ad azonban választ arra, hogy a HLA-DQ2 és – DQ8 pozitív egyéneknek csupán egy kis hányadában alakul ki a cöliákia. Feltételezheto, hogy egyéb, még nem ismert faktorok is szükségesek a betegség kialakulásához, így a HLA-DR53, mely szelektíven köti a gliadinból származó peptideket. Szóba jöhet a stressz hatására indukált MHC I fehérjékhez hasonló MIC-A (MHC class I chain related gene-A) és MIC-B antigének szerepe is, ezek a molekulák hosokk fehérjék
24
segítségével az NKG2D receptoron hatva specifikus an képesek aktiválni a bélnyálkahártya NK, CD8+ T- és ?/? T-sejtjeit. A cöliákiára jellemzo citokin és adhéziós molelula- mintázatot a III.4.2. fejezetben ismertetem. A vékonybélnyálkahártya morfológiai és immunhisztológiai eltérései cöliákiában Mivel disszertációm dönto vonala a bélmukózában történo immunológiai eltérések vizsgálata, szükséges ezen ismeretek részletes leírása. A jejunum nyálkahártyában a bolyhok vagy totális, vagy szubtotális atrófia képét mutatják, így az epitélium felszíne nagymértékben csökkent, ezzel szemben a kripták átméroje és hossza megnövekedett (76). A lamina propria térfogata nem csökkent cöliákiában. Fénymikroszkóppal megfigyelheto, hogy az epiteliális sejtek laposabbak, a kefeszegély sérült.
Elektronmikroszkóppal látható, hogy a felszíni epiteliális sejtek
éretlenek kezeletlen cöliákiában, a mikrovillusok szabálytalanok. A kriptákban a mitózisok száma jelentos növekedést mutat, ötszöröse az egészségesekének. Hasonló kinetikai változások azonban más boholyatrófiával járó kórképekben, így például tehéntej-fehérje okozta enteropátiában is elofordulhatnak. Igazolást nyert, hogy kezeletlen cöliákiában az apoptózis jeleit mutató sejtek aránya növekszik az epiteliális sejtek között, ami hozzájárul a boholyatrófia kialakulásához. Az apoptotikus sejtek és a proliferáló kriptasejtek száma között korreláció mutatható ki (77). Intraepiteliális limfociták Az intraepiteliális limfociták (IEL) morfológiai és immunhisztológiai jellemzoit egészségesekben, cöliákiásokban és egyéb okból létrejövo boholyatrófiában a III.6. táblázat foglalja össze. Az elmúlt években számos adhéziós molekulát mutattak ki, amelyeknek szerepük van a limfocitáknak a vékonybélnyálkahártya epitéliumába jutásában (78,79). Nemrégiben derült ki, hogy az epiteliális sejteken kimutatható E-cadherin szintén adhéziós molekulaként funkcionál, és kulcsszerepet tölt be abban a folyamatban, ahol a lamina propria limfocitái az intraepiteliális térbe jutnak (80). Az IEL-ák majdnem kizárólag CD3+ T-sejtek, melyeknek 90 százaléka CD8 pozitív. A CD3+ sejtek száma sokkal magasabb aktív cöliákiában, és a sejtek túlnyomó többsége ekkor is CD8+ sejt. IL-2 receptor expressziót mutató aktivált T-sejtek nem mutathatók ki az IEL-ák felszínén sem egészségesekben, sem cöliákiásokban. Korábban végzett vizsgálatok szerint a CD3+ sejtek jelentos része nem mutat sem CD4, sem CD8 expressziót (81). Felmerült,
25
hogy ezek a sejtek a CD3+CD4-CD8- ?/? T-sejteknek felelnek meg. Ez a feltételezés késobb igazolódott. Korábban úgy gondolták, hogy ezeknek a sejteknek a száma permanens emelkedést mutat, vagyis gluténmentes diétát tartó cöliákiásokban normális nyálkahártya-struktúra mellett is kimutatható (82). Ezzel ellentétes Iltanen közelmúltban végzett vizsgálatainak eredménye, mely szerint a ?/? T-sejtek száma szigorú gluténmentes diéta mellett normalizálódik (83). A kérdés nem eldöntött, mindenesetre a ?/? T-sejtek száma látens cöliákia esetén is emelkedést mutat, amikor egyébként a nyálkahártya szöveti szerkezete még normális (84). Az epiteliális sejtek MHC II expressziója A vékonybélnyálkahártya felszíni epitéliumában mind egészségesekben, mind kontrollokban kimutatható az MHC II molekulák expressziója. Cöliákiásokban azonban a kripták epitéliumában is kifejezett HLA-DR expresszió figyelheto meg, míg a kontrollokban ez nem észlelheto. Gluténmentes diétán a kriptákban a HLA-DR expresszió megszunik (85). A kripták MHC II antigén expressziója a gluténszenzítiv Tsejtekbol glutén hatására felszabaduló interferon-? következménye lehet. Az MHC II antigén expressziót mutató sejtek antigénbemutatásra képesek, vagyis amikor az antigénbemutatást az epiteliális sejtek végzik, akkor szuppresszor típusú immunválasz jön létre. Így a kripták epiteliális sejtjeinek fokozott MHC II expressziója védelmet jelenthet a sérült nyálkahártyán keresztül a lamina propriába jutó nagymennyiségu antigénnel szembeni immunreakció mérséklésében. A lamina propria Kezeletlen cöliákiában a lamina propria térfogata 2-3-szor nagyobb, mint az egészségesekben. A plazmasejtek száma egységnyi területen lényegesen nagyobb, mint a kontrollokban, a T limfociták száma azonban inkább alacsonyabb. A CD3+ sejtek száma változatlan és a CD4/CD8 arányban sem mutatható ki eltérés. Kezeletlen cöliákiásokban az aktivált T-sejtek száma magasabb, ez különösen kifejezett a CD4+ sejtek között. (86). Kiderült, hogy a gluténspecifikus és HLA-DQ korlátozás alatt álló T-sejt klónok elsosorban a Th1 sejtekre jellemzo citokineket termelnek (interferon, TNF-? ) (87).
A Th1 citokinek jelentos szerepet játszanak a kripta hiperplázia
kialakulásában és a HLA II antigének expressziójában (88).
26
III.6. táblázat.
Az intraepiteliális limfociták jellemzoi egészségesekben és
cöliákiásokban, valamint egyéb okból kialakult boholyatrófiában
Jellemzo
Normális
Cöliákia
jejunum
Egyéb ok miatt létrejött boholyatrófia
Sejtszám/100
<40
>40
epiteliális sejt Morfológia
Normális, vagy emelkedett
Kis limfociták
Nagyobb mononukleáris sejtek
Mitózis ráta
<0.5%
>0.5%
>0.5%
CD8+ sejtek aránya
>90%
62-90%
>90%
CD4+ sejtek aránya
<10%
<10%
<10%
Interleukin-2 receptor
nincs
nincs
nincs
>90%
50-80%
>90%
<10%
20-50%
<10%
pozitív sejtek ? /? receptor pozitív T-sejtek ?/? receptor pozitív Tsejtek
A ?/? T-sejtek száma a cöliákiások lamina propriájában kétszer magasabb, mint a normális vékonybélnyálkahártyában. Az IgA-, IgG- és IgM-tartalmú plazmasejtek száma cöliákiában sokszorosa az egészségesekben található értékeknek (89). Az IgA plazmasejtek legsurubben közvetlenül a felszíni epitélium alatt helyezkednek el. Kezeletlen cöliákiásokban az IgA2 alosztályt termelo sejtek száma nagyobb arányban növekszik, mint az IgA1 plazmasejteké (90).
Az IgM tartalmú sejtek száma a cöliákiás betegekben ötször
magasabb, mint az egészségesekben (91). Kezeletlen cöliákiában az IgG sejtek száma is jelentos mértékben emelkedik. Az IgA, IgG és IgM sejtek száma gluténmentes diétán
27
normalizálódik. Az IgE tartalmú sejtek számában nincs eltérés a betegek és a kontrollok között. III.2.3. Cöliákia, mint az autoimmun betegségek modellje A transzglutamináz felfedezése óriási impulzust adott a cöliákiával kapcsolatos kutatásoknak. Ez azért nagyon fontos, mert a kórkép modellként szolgálhat más autoimmun betegségek patomechanizmusának megértésében is. Utóbbiaknál általában ismeretlen a fo kiváltó tényezo és a „target antigén”, ellenben cöliákiában a toxikus glutén és a transzglutamináz is ismert. Shan és mtsai izoláltak egy olyan 33 aminosavból álló peptidfragmentumot, amely a gliadinnak a béllumen enzimjeinek lebontásából származó oligopetid és ellenáll a további hidrolízisnek. Ez a frakció felelos a kóros intesztinális immunaktivációért. Kimutatták továbbá, hogy egy bakteriális endopeptidáz (propil- endopeptidáz) ezt az oligopeptidet képes lebontani, így esetleg lehetséges lenne a cöliákia kezelése ennek az endopeptidáznak a segítségével (92). III.2.4. Cöliákia és az 1.típusú diabétesz mellitusz együttes elofordulása Ismert az az összefüggés, hogy a cöliákia elofordulási gyakorisága bizonyos betegségek esetén (pl. Down kór, autoimmun kórképek, atópia, IgA hiány, krónikus aktív hepatitisz, reumatoid artritisz) a vártnál nagyobb. Többek között akkor is, ha az egyén 1. típusú diabetesz mellituszban (1TDM) szenved. Mivel a két kórkép együttes elofordulásának elemzése saját vizsgálatomban is szerepel, indokolt ennek részletesebb ismertetése. Szurovizsgálatok alapján a különbözo országokban a cöliákia prevalenciája 2 és 16,4% között mutatkozott 1TDM-ben (93-103) (III.7. táblázat). Egy olyan tanulmány is ismeretes, ahol elozetes szelekció nélkül 110, 1TDM-ban szenvedo gyermeknél végeztek jejunális biopsziát és 7%-ban találtak boholyatrófiát (104). Az 1TDM-ban megfigyelt magas cöliákia prevalencia okaként közös genetikai hajlam állhat, hiszen mindkét kórképben a HLA-DR 3 nagyobb gyakorisággal fordul elo (105). A cöliákiásokban megfigyelt DQA1*0501-DQB1*0201 heterodimer jelenléte az 1TDMban is jelentos rizikófaktor.
28
III.7. táblázat. 1. típusú diabétesz mellituszban a cöliákia gyakorisága különbözo országokban végzett felmérések szerint
Ország
Prevalencia
Hivatkozás
Algéria
16,4
93
Ausztria
3,0
94
Ausztrália
1,8
95
Kanada
5,1
96
Csehország
4,1
97
Finnország
2,4
98
Németország
1,3
99
Olaszország
5,7
100
Svédország
6,0
101
Anglia
2,0
102
USA
4,1
103
Annak ellenére, hogy a kettos betegséget (cöliákia és 1TDM) mutató gyermekeknél sorvadt nyálkahártyát találunk, nem biztos, hogy a cöliákia típusos tünetei megfigyelhetok. Ennek megfeleloen a „csendes” (silent) cöliákia esetleges diagnózisa az 1TDM-ban csak megfelelo szurovizsgálatokkal biztosítható. Erre kiválóan alkalmas a magas szenzitivitású és specifitású IgA osztályba tartozó antiendomizium antitest (EMA), amely immunfluoreszcens módszert alkalmazva köldökzsinórra applikálva jó hatásfokkal valószínusíti a glutén szenzitív enteropátiát (106). Mindazonáltal néhány olyan tanulmányban, amelyben az 1TDM-ban a cöliákia elofordulását vizsgálták, számos EMA álpozitív eredményt találtak (107). Ennek egyik lehetséges oka lehet, hogy a pozitív EMA látens cöliákiát mutatott, vagyis már azelott jelzi a betegséget, mielott a boholyatrófia kialakulna. Látens cöliákiát az intraepiteliális ?/? T sejtek nagyobb száma is jelzi, hiszen megnövekedett számuk már akkor detektálható, amikor a bélbolyhok szerkezete még normális (108).
29
III.3. GASZTROINTESZTINÁLIS IMMUNRENDSZER MUKÖDÉSE, ORÁLIS TOLERANCIA Kísérletes munkáimban döntoen a táplálékallergia és a cöliákia intesztinális mukózában történo patomechanizmusát kutattam. Ennek értelmében a bevezeto részben nagyobb terjedelemben
ismertetem
a
patomechanizmussal
kapcsolatos
alapkutatások
eredményeit, így a gasztrointesztinális immunrendszer muködését és az orális tolerancia szabályozásának lehetoségeit. A gasztrointesztinális immunrendszer struktúrális szempontból organizált és nem organizált részekre osztható. Az organizált limfoid struktúrák közé tartoznak a Peyer plakkok, a vékonybél szoliter follikulusai és a mezenteriális nyirokcsomók. A bélnyálkahártya egészében jelentos számú immunkompetens sejt található az organizált struktúrákon kívül is. III.3.1. Pe yer plakkok A Peyer plakkokat fedo epitélium jellegzetes sejtjei az M sejtek, amelyek luminális felszínén rövid, irreguláris mikroredok találhatók. Elnevezésük is innen ered (M: microfold). Ezeken a sejteken keresztül történik a makromolekulák fiziológiás abszorpciója. Az M sejtek szinte zsebszeruen ölelik körül az alattuk elhelyezkedo limfocitákat és makrofágokat, amelyek feltehetoen eloször találkoznak a béllumenbol bekerülo antigénekkel. A „dome” régióban található nagyszámú dendritikus sejtnek és makrofágoknak az antigén prezentációban van fontos szerepük. III.3.2. A bélnyálkahártya nem organizált immunkompetens struktúrái A lamina propria nagy számban tartalmaz diffúzan elhelyezkedo limfocitákat, plazmasejteket és makrofá gokat. A lamina propriában a limfocitáknak nagyjából a fele CD3 pozitív T sejt, amelyeknek hozzávetolegesen 2/3-a CD4 pozitív helper/inducer sejt. A limfociták másik fele B sejt, amelyeknek többségén felszíni IgA található, de kimutathatók felszíni IgM-et, IgG-t és IgD-t tartalmazó B sejtek is. A lamina propriában nagy mennyiségben találhatóak plazmasejtek, amelyek túlnyomó részben a Lieberkühn kripták közelében helyezkednek el. A plazmasejtek megjelenése csak antigén hatásra következik be, ezért születéskor még nem mutathatók ki a vékonybélnyálkahártyában. Eloször az IgM tartalmú nyiroksejtek jelennek meg, a születés után 2 héten belül, ezt követoen már IgA sejtek is megfigyelhetok, 6 hetes korban számuk már eléri az IgM
30
plazmasejtek számát, majd fokozatosan meghaladja azt. Végül az IgA tartalmú plazmasejtek az összes plazmasejtnek 80%-át teszik ki, míg az IgM tartalmúak aránya 15 % (109). Kiemelésre érdemes, hogy a szekretoros IgA nem köt komplementet, így nem indítja be a komplement aktivációval törvényszeruen együtt járó gyulladásos reakciót, ugyanakkor gátolja az antigén IgG-hez kötodését is. A szekretoros IgA megakadályozza a baktériumok adhézióját az intesztinális epitéliumhoz, gátolja a patogén kórokozók növekedését, s növeli a vírusenteritisz kialakulásával szembeni rezisztenciát. A lumenbe került IgA a szekretoros komponens által élvez védelmet. Ezt a glikoproteint az epitélsejtek termelik. Az immunglobulinok közül egyedül az IgM képes még arra, hogy hozzákötodjön a szekretoros komponenshez. Ez a magyarázata annak, hogy a gyakori IgA hiányban (1:300-1:600) az IgM kompenzálni képes. Figyelemreméltó, hogy IgA hiányban nagyobb a speciális táplálékfehérje ellenes IgG antitestek aránya (110). Az intraepiteliális limfociták (IEL) a felszíni epitéliumot és a lamina propriát elválasztó bazális membrán felett helyezkednek el, az epiteliális sejtek között. Az IELák száma tükrözi a béllumenbol származó antigénstimuláció mértékét, így számuk a vékonybélben magasabb, mint a kolonban. Kimutatható, hogy a lamina propria limfocitái és az IEL-k között állandó kicserélodés folyik. Ennek ellenére a lamina propria és az epiteliális terek mononukleáris sejtjeinek összetétele alapvetoen különbözik egymástól. Egészen a közelmúltig úgy gondolták, hogy az IEL-ák kizárólag T-sejtekbol állnak, azonban kiderült, hogy a funkcionálisan aktív és érett NK sejtek (CD3-, CD7+) is fontos összetevoi. Mivel az NK sejtek IFN-? szekrécióra képesek, nagyon valószínu, hogy fontos szerepük van az intesztinális homeosztázisban (111). Az IEL szubpopulációk megoszlása is alapvetoen eltér a lamina propriában leírtaktól. Több, mint 90%-uk CD8 pozitív sejt és csak 5-6%-ra teheto a CD4 pozitív sejtek elofordulása. A CD8 pozitív szuppresszor sejtek dominanciája értheto, hiszen a lebontott táplálékkal közvetlenül
érintkezo
epitéliumban
alapveto
fontosságú
az
elsodleges
toleranciaképesség (112). Egészségesekben az intraepiteliális ?/? T sejtek száma elenyészo, számuk azonban jelentosen emelkedik cöliákiában. Az epitéliumban B sejtek és plazmasejtek egyáltalán nem fordulnak elo, és ugyancsak hiányoznak a makrofágok és a dendritikus sejtek. Antigénprezentációra azonban az
31
epitéliumban is van lehetoség, hiszen a kolumnáris epiteliális sejtek HLA II osztályú antigénexpressziót mutatnak (113) (III.8. táblázat).
III.8. táblázat.
A normális bélnyálkahártya nem organizált immunkompetens
struktúráinak fobb jellemzoi
Intraepiteliális terek
Intraepiteliális limfociták CD3 pozitív T-
(felszíni epitélium és Lieberkühn kripták)
sejtek Több, mint 90%- uk CD8 pozitív sejt, a fennmaradó sejtek többsége CD4 pozitív Gamma/delta receptor pozitív T-sejtek száma elenyészo CD25 pozitív (interleukin-2 receptor pozitív) sejt nincs
Lamina propria
CD4/CD8 arány: 2/1 Foként IgA és IgM tartalmú sejtek fordulnak elo, az IgG tartalmú sejtek száma csekély
Epiteliális HLA-II antigén expresszió
Vékonybélnyálkahártya felszíni epitéliumában fiziológiásan is mindig kimutatható Vastagbélnyálkahártyában csak kóros körülmények között jelenik meg
III.3.3. Az intesztinális immunrendszer muködése A Peyer plakkokban elhelyezkedo limfociták találkoznak eloször az M-sejteken keresztül a béllumenbol bekerülo nem szolubilis
antigénekkel, amelyek lehetnek
aggregált proteinek, vagy olyan vírusok és baktériumok, amelyek az M-sejtek ezen mikroorganizmusokra specifikus receptoraihoz kötodnek. Az M-sejtek alatt közvetlen elhelyezkedo
makrofágok
az
antigént
prezentálják
a
CD4+
sejteknek.
Az
antigénbemutató sejtek az antigént eloször feldolgozzák, kisebb részekre hidrolizálják,
32
majd ezek a kisebb peptidek (epitópok) a sejtfelszínre kerülnek, s ott az MHC II molekulákkal (HLA-DP, -DQ, -DR) komplexet képezhetnek. A genetikailag determinált HLA II molekulák szerkezete dönti el, hogy azok a bejutó antigénekkel képesek-e komplexet létrehozni, ami feltétele az immunrendszer aktiválásának. Az így kialakult komplexek aktiválni tudják a T-helper sejteket. Az aktív immunválasz kialakulásához azonban az antigénprezentáló sejteken és a T-helper sejteken található kostimuláló molekuláknak is kapcsolódni kell egymáshoz. Ilyen kostimulációs molekula a munkámban vizsgált ICAM-1 is. A T-helper sejtekbol citokinek szabadulnak fel, amelyek kiváltják a T és B sejtek további aktivációját. Ezt a folyamatot, tehát az antigénnel való elso találkozáskor létrejövo aktivációt nevezzük „primingnak” (114). A „priming” során izotípus átkapcsolás révén (switch) elsosorban IgA izotípusú, az egyes antigénekkel szemben specifikusan elkötelezett, ún. memória B sejtek alakulnak ki. Ugyancsak ebben a folyamatban létrejönnek memória T sejtek is. Citokin termelésük alapján többféle T-helper sejttípus különítheto el egymástól (részletes leírás III.1.3. fejezet). A Th1 sejtek elsosorban sejtközvetített immunválaszt hoznak létre. A Th2 sejteknek a humorális immunválasz kialakulásában van fontos szerepük. Az IgEplazmasejtek prekurzorait elsosorban az IL-4 és IL-13, míg az eozinofil sejteket az IL-5 aktiválja, s így a Th2 sejteknek fontos szerepük van az allergiás/atópiás jelenségek kialakulásában. A Th1 és a Th2 sejtek az általuk termelt citokinekkel egymást kölcsönösen
gátolják.
Újabban
derült
ki,
hogy
a
helper
sejtek
között
megkülönböztethetok citokin mintázatuk alapján Th3 és T regulátor 1 (Tr1) sejtek is. Az elobbiek transforming growth factor ? -t (TGF-? ), az utóbbiak pedig IL-10-et termelnek (115,116). Látni fogjuk a késobbiekben, hogy ezeknek a sejteknek az orális tolerancia kialakulásában van fontos szerepük. A legfrissebb kutatások a regulációs T sejtek harmadik csoportját is körvonalazták, ezek a CD4+, CD25+ és CD45RA+ helper sejtek (117) (III.9. táblázat). Ezeket a sejteket már régebben ismerték különbözo autoimmun folyamatok, immungasztritiszek szereplojeként, azonban regulációs szerepükre mostanában derült fény (118). Ezek a sejtek direkt sejtkontaktus révén regulálnak, a CTLA-4 nevu adhéziós molekula segítségével. A tímuszból származnak, ez a magyarázata annak, hogy neonatális timektómia autoimmun kórképekre prediszponál (119). A regulációs sejtek közé sorolható a CD8+ szupresszor T sejt is.
33
Az elkötelezett limfociták „homing” folyamata Az elkötelezett T és B sejtek a „priming” után a nyirokereken keresztül elhagyják a Peyer plakkokat és a duktusz toracikuszon keresztül a véráramba jutnak. Útközben keresztezik a mezenteriális nyirokcsomókat, ahol a limfociták további érési folyamata történik (120). A véráramon keresztül a nyiroksejtek jelentos része ismét visszakerül a vékonybélbe, elsosorban a lamina propriába, ahol az elkötelezett B sejtekbol már az IgA szekretáló plazmasejtek közvetlen prekurzorai alakulnak ki (121). Az immunkompetens sejtek vándorlását a felszínükön, valamint az endotélium sejtjeinek felszínén elhelyezkedo
speciális
molekulák
irányítják
(ún.
homing
receptorok).
A
bélnyálkahártyába visszakerülo limfociták a felszínükön expresszált ? 4?7 integrin segítségével kötodnek a mukóza endotelén megjeleno MAdCAM nevu adhéziós molekulával. Ez az interakció teszi lehetové, hogy a szenzibilizált limfociták visszatérhetnek a mukóza lamina propriájába és az intraepiteliális régiójába. Ezt a folyamatot a késobbiekben részletesen ismertetem, hiszen ennek az adhéziós molekulapárnak és a „hazatérés” (homing) folyamatának vizsgálata adta kutatásom egyik fo vonalát. A lamina propriából az epitéliumba vándorló IEL-ák az ? E? 7 integrint expresszálják és speciálisan kötodnek az epiteliális sejtek E-cadherin adhéziós molekulájához. III.9. táblázat. A különbözo regulációs T sejtek és hatásmechanizmusuk
Regulációs T sejtek
Hatásmechanizmus
CD4+ Th3 sejt
TGF-?
CD4+ Tr1 sejt
IL-10
CD4+/CD25+ T sejt
CTLA-4
CD8+ T szupresszor sejt
(mechanizmus?)
III.3.4. Az orális tolerancia kialakulása Tolerancián többnyire azt értik, hogy az autoreaktív B vagy T sejtek az autoantigének hatására nem aktiválódnak. Ennek egyik módja a klonális deléció, ami egy irreverzibilis folyamat, ilyenkor az autoreaktív sejtek apoptózissal elhalnak. A másik lehetoség az anergia, vagy immunológiai válaszképtelenség, amikor az immunkompetens sejtek az
34
autoantigén hatására nem aktiválódnak. Ez a folyamat azonban reverzibilis, és a sejtaktivációhoz kedvezo feltételek biztosításával a válaszképtelen sejtek ismét aktivá lhatók (122). A toleranciának azonban mindez csak szuk köru értelmezése, hiszen a bélnyálkahártyával kapcsolatba kerülo antigének is bizonyos fokig saját antigéneknek tekinthetoek azáltal, hogy közvetlen kapcsolatba kerülhetnek a belso környezettel. Ez a milliárdnyi antigén immunológiai keresztreakció révén viszonylag könnyen autoimmun folyamatokat indíthatna el. Így az immunológiai toleranciának magában kell foglalni a bélnyálkahártyával kapcsolatba kerülo antigénekkel szembeni toleranciát is. Az intesztinális immunrendszer muködésének egyik legizgalmasabb kérdése, miként tudja megkülönböztetni a veszélytelen antigéneket (ételek, saját bélflóra) a patogén kórokozóktól. Régóta ismert jelenség, hogy az ételek antigénjével történo találkozásnál az immunrendsze r általában specifikus toleranciát generál. Ezt a jelenséget orális toleranciának nevezzük és a legtöbb szolubilis antigénnel kiváltható (123). Természetesen a bélbe kerülo patogén kórokozókkal szemben nem alakul ki tolerancia, hanem aktív immunválasz jön létre. Ebben az antigének eltéro szerkezete is szerepet játszik. Toleranciát általában oldható antigének váltanak ki, míg az aggregált antigének immunválaszt hoznak létre. Célszeru azonban a mukózális immunrendszert úgy tekinteni, hogy alaphelyzetben jellemzo reakció az orális tolerancia, és csak speciális esetekben alakul ki aktív immunválasz. A mukózális immunválasz jellegét befolyásolja az antigén dózisa is. Egyszeri alacsony dózisú orális antigén bevitele általában Th1 immunválaszt indukál, és jellemzo rá a ?-interferon termelés, ami gátolja a TGF-? -t termelo T-sejteket. Ez utóbbi citokinnek alapveto szerepe van az orális tolerancia kialakulásában. Így értheto, hogy az egyszeri, kisdózisú antigénbevitel inkább aktív immunizációt hoz létre. Megjegyzendo azonban, hogy a Th1 sejtek élettartama igen rövid, programozott sejthalállal megsemmisülnek. Ezzel szemben, ha a kisdózisú orális antigénbevitel sorozatosan ismétlodik, akkor a TGF-? termelo sejtek száma fog megemelkedni (124). Ezeket a sejteket újabban egyesek Th3 sejteknek is nevezik, citokin mintázatuk hasonlít a Th2 sejtekéhez, de azoktól eltéroen TGF-? -át is termelnek. A Peyer plakkok mikrokörnyezete igen kedvezo helyzetet teremt ezeknek a toleranciát kiváltó sejteknek a proliferációjához. Megjegyzendo az is, hogy a TGF-? termelo sejtek gátolják a Th1 válasz kialakulását, TGF-? pedig „pozitív feedback” révén fokozza a Th3 sejtek termelodését. A mukózális immunrendszerben termelodo TGF-? a
35
közvetlen környezetében más antigénekre specifikus aktív toleranc iát kiváltó sejtek muködését is aktiválhatja, ezt a jelenséget nevezzük „bystander szuppressziónak”. Fontos azt is hangsúlyozni, hogy szemben a klonális delécióval, vagy anergiával, az orális tolerancia kialakulása aktív folyamat révén alakul ki. Más hatása van a nagydózisú antigén bevitelnek. Egyszeri nagy adagú antigén eroteljes Th1 választ vált ki, míg a Th2 citokin termelés és a TGF-? termelés teljesen gátlás alá kerül. A keringésen keresztül a szisztémás
nyirokszervekbe kerülo
feldolgozott antigén pedig klonális delécióhoz, vagy anergiához vezet. Hasonló helyzet alakul ki ismételt nagydózisú antigén bevitele esetén is, de ilyenkor a Th1 sejtek válasza sem alakul ki a deléció miatt. Ha az orális tolerancia létrejött, akkor az hosszú ideig fennállhat, de ez az idotartam változik attól függoen, hogy milyen típusú immunválasz került gátlás alá. A késoi típusú hiperszenzitivitási reakciók hosszabb ideig gátoltak, mint a humorális immunválaszok. Ennek az a magyarázata, hogy a TGF? eroteljesebben gátolja a Th1 választ, mint a Th2-t. A Th1 a sejt mediált, késoi típusú immunreakciókban, a Th2 sejtek pedig a humorális válasz kialakításában játszanak központi szerepet. Munkámban a táplálékallergiás felnottek és gyermekek a késoi reakciótípusba tartoztak. A humorális immunválaszban a részleges szupprimálás a jellemzo, ilyenkor a szisztémás IgG és IgM válasz gátlás alá kerül, de az adott antigén ellen a szekretoros IgA termelés továbbra is folytatódik. A TGF-? fokozott termelodése azonban az IgA válasz kialakulását is gátolja. Az immunválasz minoségét jelentosen befolyásolja az antigénbemutató sejt típusa is. Az epiteliális sejtekkel történo prezentáció tolerancia kialakulásához vezet. A klasszikus antigénbemutató sejtek is toleranciát hoznak létre, ha a felszínükön nincs aktivált kostimuláló molekula, ami szükséges az MHC-vel komplexet képzo antigén mellett a CD4 T-sejtek aktivációjához. A B7 egy ilyen fontos kostimuláló molekula, ami a CD4 sejtek felszínén levo CD28 felszíni markerhez kapcsolódik. Hasonló hatásúak a CD40-CD40L, ICAM--LFA-1 interakciók is (125). Az eddig elmondottak alapján tehát akkor lesz aktív immunválasz, védekezo reakció egy adott antigénnel szemben, ha az a Peyerplakkot fedo „M”-sejteken keresztül szívódik fel partikulumként (nem szolubilis formában), a citokin mintázat Th1-re jellemzo és a kostimulációs szignálok jelen
36
vannak. Az ezzel ellentétes, orális toleranciát meghatározó tényezoket az III.10. táblázat szemlélteti.
III.10. táblázat.
Orális toleranciát meghatározó tényezok
Szolubilis antigén, monomér forma Antigén mennyisége Felszívódás végig az epitéliumon keresztül (nem a Peyer plakk) Th3 által termelt TGF-? , Tr által elválasztott IL-10 Th1/Th2 citokin mintázat megváltozása Kostimulációs szignál hiánya
Az orális tolerancia kialakulásában jelentos szerepe van a ?/? -T sejteknek is, állatkísérletes modellben már 500-1000 antigénspecifikus ?/? -T sejt átvitelével egyik állatból a másikba sikerült toleranciát indukálni. Az orális tolerancia kialakulásában jelentos szerepet játszik a közelmúltban leírt „Tolllike” receptor család, valamint a probiotikumok. A probiotikumok egyik hatása, hogy az antigénprezentáció szempontjából fontos B7---CD28 közötti kostimulációs választ gátolja. Ebben az esetben nem fog létrejönni aktív immunválasz, hiszen a T sejt aktiválása elégtelen lesz. A probiotikumoknak a bélimmunológiára gyakorolt másik hatása az IgA elválasztás serkentése. Az IgA jelentosen különbözik a többi immunglobulintól,
hiszen
a
korábban
elmondottak
szerint
nem
tudja
a
komplementrendszert aktiválni. Ennek szintén az lesz a következménye, hogy a béllumenbe került idegen fehérjékhez kötodve toleranciát kölcsönöz a molekulának. A probiotikumok további lényeges hatása az, hogy gátolják a citokin kaszkád legfontosabb faktorának (Nuk leáris faktor kappaB) aktivációját, így ezúton sem lesz aktív immunválasz. Ez a hatás a Toll- like receptorok mediációján keresztül valósul meg (126). A mukózális immunrendszerben a toleranciát és az aktív immunválaszt létrehozó folyamatok igen finom szabályozás alatt állnak. Amennyiben ebben zavar történik, akkor különbözo kóros állapotok alakulhatnak ki, elsosorban allergiás és gyulladásos kórképek, többek között az általam vizsgált táplálékallergiák és a cöliákia is.
37
III.4. CITOKINEK A citokinek elsosorban intercelluláris kapcsolatokat közvetíto, kis molekulatömegu (1040kD) glikoproteinek, melyek az immunválaszban töltenek be fontos szerepet. Szinonimaként az interleukin (IL) elnevezés használatos, mely a leukociták közötti kapcsolatra utal. Újabban a kemotaktikus hatású citokineket kemokineknek nevezik. Különbözo betegségekre más és más citokin mintázat jellemzo, melyek termelésében az egyik kulcsfontosságú szerep a T limfocitáknak jut (127-130). Az általuk termelt citokinek alapján három különbözo sejtpopulációt különböztetünk meg, amit korábban részletesen ismertettem (III.3.3. fejezet). A T helper 1 (Th1) sejtek döntoen sejtmediálta reakciókban vesznek részt IFN- ?, TNF-? , IL-2 termelésével, így cöliákiában és késoi típusú, nem IgE mediált táplálékallergiában várható fokozott szintézisük (131). Az azonnali, IgE mediált allergiás kórképekre a Th2 nyiroksejtek által termelt IL-4, IL-13 és IL-5 jellemzo, hiszen az elobbiek felelosök az IgE produkcióért, az utóbbi pedig az eozinofil sejtek proliferációs és aktivációs citokinje (132). III.4.1. Interferon-gamma és az interleukin-4 Az ismert citokinek száma egyre gyarapszik. Csak az interleukinoknak 2000-ben 26 képviselojük volt (133), 2003-ra ez a szám 30 fölé nott (134). Vizsgálatainkban az ismert, számos citokin közül az IFN- ? és az IL-4 expressziót határoztuk meg (mRNS ill. fehérjeszinten), így részletesebben csak ezeket ismertetem. Kettejük aránya döntoen befolyásolhatja az adott immunreakció kimenetelét, hiszen elobbi a Th1, utóbbi a Th2 válasz létrejöttében tölt be kulcsszerepet. Az IFN- ? és az IL-4 egymás hatását kölcsönösen gátolja, vagyis az IFN- ? a Th1 hatás elomozdítása mellett gátolja a Th2 aktivációt, és vice versa. Az IFN-?-át kódoló gén az emberben a 12. kromoszómán található, három intront tartalmaz és fehérjeterméke 146 aminosav- maradékból áll. A poszttranszlációs termék egy 18kD méretu láncokból álló homodimér, amely különbözo mértékben lehet glikozilált (40-70kD). Az IL-4-et eredetileg mint B-sejt növekedési faktort írták le. Csak késobb derült ki, hogy a T sejtek által termelt B sejt-proliferációt fokozó faktor, az IgG1-et termelo B sejtek fejlodését elosegíto faktor és a B sejtek MHC-II expressziót fokozó faktora ugyanaz a molekula. Az IL-4 szerkezetét tekintve a 4 alfa hélixet tartalmazó citokinek közé tartozik. A humán IL-4 molekula 153 aminosavmolekulából álló, 15-20kD molekulatömegu glikoprotein, amely három, láncon belüli diszulfidhidat tartalmaz. Ezt kódoló négy exont és három intront
38
tartalmazó gén az 5. kromoszómán helyezkedik el, egyéb interleukinokat kódoló gének (IL-3, IL-5, IL-9, IL-13 és GM-CSF) közelében. A két citokin karakterisztikája a III.11. táblázatban található. III.11. táblázat. Az IFN-? és az IL-4 jellemzoi
Tulajdonság
IFN-?
IL-4
Család
Interferon
Interleukin
Termelo sejt
Th1, NK sejt, Ts, ?? T sejt
Th2, masztocita, bazofil, CTL
Célsejt
NK, T, B sejt, makrofág
Th2, B, timocita, makrofág
Hatás
Aktiváció, MHC fokozás,
B sejt aktiválás, MHCII, IgG1
izotípusváltás
és IgE, izotípusváltás
III.4.2. Cöliákia és a citokinek Cöliákiában számos vizsgálatot végeztek a közelmúltban, mind mRNS, mind fehérjeszinten elemezték a különbözo citokinek megjelenését (135). A fent említett „alapcitokineken” kívül kimutatták az IL-4, IL-6, IL-7, IL-15 és IL-18 fokozott expresszióját a bélmukózában. Az IL-18-at foként antigénprezentáló sejtek és az epitel termeli, a Th1 polarizációért, a Th válasz fennmaradásáért és a T sejtek IFN-? produkciójáért felelos. Továbbá az IL-18 fokozza a monociták ICAM-1 expresszióját is, valamint a T-bet elnevezésu Th1 specifikus T box transzkripciós faktor expresszióját, mely közvetlenül felelos a naív Th sejtek Th1 irányú differenciálódásában (136). A keratinocita növekedési faktor, a TGF-? és az IL-15 a felelos a mukózában bekövetkezo proliferációs változások indukálásban. Utóbbi hatására fokozódik az enterociták Ki67 proliferációs markerének exp ressziója és FAS mediált apoptózisa (137). Az IL-7, hasonlóan az IL-15-höz, szerepet játszik az epiteliális ?? T sejtek érésében, migrációjában (138). A fontos „down-reguláló” faktor, az IL-10 mennyisége
39
cöliákiában alacsony, viszont meglepo módon a más Th1 kórképekben kiemelten fontos Th1 induktor, az IL-12 expressziója nem fokozott (139). III.4.3. Táplálékallergia és a citokinek Ételallergiával kapcsolatban jóval kevesebb mukózális citokinanalízist végeztek. Ez értheto, hiszen biopsziás mintákhoz sokkal könnyebben hozzájutunk cöliákia, mint TA esetében. Atópiás kórképek, asztma, illetve táplálékallergiások szérumának vizsgálata Th2 (IL-4) dominanciát mutattak, bár késoi típusú reakciókban Th1 (IFN-?) túlsúlyt is találhatunk (140-142). Sajnos a szerológiai vizsgálatok és a szérumból nyert limfociták stimulációs vizsgálatai nem tükrözik huen a bélmukózában zajló történéseket. Erre példa egy svéd munkacsoport vizsgálata, akik Prick teszt és speciális IgE negatív TA felnottek duodenális mukózájában kimutatták a kérdéses IgE-t, annak ellenére, hogy a szérumban az IgE nem volt magas, itt a domináns citokin az IL-4 volt, IgE tartalmú nyiroksejtekkel, eozinofiliával (143). Az egyetlen releváns közlemény Hauer és mtsai nevéhez fuzodik, akik TA-ás gyermekek duodenumában ELISA módszerrel tízszer több IFN-? szecernáló sejtet detektáltak, mint IL-4 termelo sejtet, ez tehát Th1 citokin mintázatra jellemzo adat (45). Az irodalomban még három közleményt találunk a témával kapcsolatban, bár ezekben nem késoi típusú TA-ás betegeket vizsgáltak. Az egyikben allergiás eozinofil gasztroenteritiszben szenvedo gyermekek duodenumából nyert limfocitáit stimulálva Th2 citokin mintázatot (döntoen IL-13) (144), a másikban hasonló betegcsoportban fokozott IL-5 expressziót detektáltak (145). A harmadik közleményben csökkent TGF-? értéket közöltek úgy, hogy a Th1 és Th2 arány érdemben nem változott (146).
III.5. ADHÉZIÓS MOLEKULÁK Az adhéziós molekulák közismerten központi szerepet játszanak számos élettani folyamat mediálásában. Csoportosításukat a III.1.2. táblázat ismerteti. Tágabb értelemben az immunglobulin géncsaládba sorolható az MHC I és II, CD4, CD8, ? ? TCR, ?? TCR, citokin receptorok és egyéb CD (cluster of differentiation) molekulák. Az integrinek ketto, egymással nem kovalens módon kapcsolódó alfa és béta láncból állnak. 16 alfa lánc (25-65%-os homológia) és 8 béta lánc (37-75%-os homlógia) ismert, melyek egymással kombinálódnak, például az ? L lánc a ? 2-vel alkotja az LFA-
40
1-et, vagy az ? 4 a ? 7-tel a limfocita „homing” receptort. Mindkét béta integrin vizsgálata munkám szerves részét alkotta.
III.12. táblázat. Az adhéziós molekulák csoportosítása. (Vastagon szedve az általam vizsgált molekulák)
szuperglobulinok
ICAM-1, VCAM-1, MAdCAM
integrinek
LFA-1, VLA-4, ? 4? 7
szelektinek
E-szelektin (ELAM-1)
kadherinek
E-, A-, P-, R kadherin
A
III.12.
táblázatból
MAdCAM/? 4? 7)
kitunik,
elemeztem
az
hogy
2
molekulapárt
ételallergiások
(ICAM-1/LFA-1
duodenális
mukózájában.
és A
továbbiakban csak ezt a 4 molekulát jellemzem.
III.5.1. ICAM-1 és LFA-1 Az ICAM-1 szuperglobulint (CD54) az aktivált T és B sejtek, M sejtek, makrofágok és az aktivált endotelsejtek egyaránt expresszálják. Alapállapotban az ICAM-1 a lamina propriában foként az erek endotelsejtein, valamint néhány makrofágon található. Gyulladás esetén foként az utóbbiak expressziója fokozott (147). Cöliákiában az ICAM1 expressziója kifejezettebb, amit az IFN-?, TNF-? és IL-1 indukál (148). Az LFA-1 nevu ? L? 2 integrin a legtöbb T sejten megtalálható, két láncból áll, az egyik a specificitás meghatározója (CD11? =? L), a másik az integrin alosztályt determinálja (CD18? =? 2). Elobbi minden LPL sejten egészségesekben is elofordul. Az IEL-en csak a kriptákban található meg nagyobb számban, de cöliákiában a felszíni epitel is megjeleníti. A ?? T sejtek nem expresszálják. Utóbbi lánctípus minden LPL és follikulusz-asszociált T sejten megtalálható. IEL-en kisebb számban expresszálódik a CD11? -hoz képest (149). Az LFA-1-nek az ICAM-1-en kívül az ICAM-2 és ICAM-3 is ligandja lehet, elobbi az extravazációban, utóbbi a T sejt aktivációjában tölt be szerepet. Összegezve: a molekulapárnak szerepe kettos, egyrészt a leukocita extravazációban, másrészt az antigénprezentációban töltenek be fontos szerepet (III.1. ábra) (150,151).
41
ICAM-1/ LFA-1 kettos szerepe
Leu
APS
LFA-1
Ko-stimulációs szignál ICAM-1
LFA-1 / ICAM-1
Endotel
Leu Extravazáció
Immunaktiváció
III.1. ábra. Az ICAM-1/LFA-1 interakció szerepe az immunaktivációban és az extravazációban (APS: antigén prezentáló sejt, Leu: leukocita).
Elobbire, a leukocita extravazációra példa a molekulapár kapcsolata. Általánosságban elmondható, hogy az érpályából a gyulladás helyére történo leukocita vándorlást adhéziós molekulák sorozata teszi lehe tové. A folyamatot az adhéziós molekulák különbözo családjainak citokinek által koordinált muködése regulálja, az ereken (pl. ICAM-1) és a limfocitákon (pl. LFA-1) expresszálódnak. Az adhéziós molekulák segítségével történik egy adott kórképben, egy adott helyen a leukociták érpályán belüli lelassulása, endotelhez történo kötodése és extravazációja. A limfociták kötodése az érendotelhez függ az adott limfocita-szubpopulációtól, annak differenciáltságától és az antigénnel történo elso találkozás helyétol is (152). A másik funkció, az antigén prezentáció fontosabb elemei között szintén megtalálható az ICAM-1/LFA-1, így tehát dönto elemek az MHC-hez kötött antigén-prezentáció folyamatában, ahol nem antigénspecifikus kölcsönhatásuk intracelluláris jeleket generál és sejtaktivációt eredményez. Ezen kostimulációs szignál hiánya a sejtek válaszképtelenségét, vagyis specifikus anergiát okoz (153).
42
ICAM-1, LFA-1 és táplálékallergia Táplálékallergiások mukózájában LFA-1 meghatározás még nem történt, ICAM-1 vonatkozásában pedig mindössze egy közlemény született, ahol tehéntej- fehérje indukálta enteropátiában nem találtak fokozott ICAM-1 expressziót (154). III.5.2. Az ? 4? 7 integrin és komplementer ligandja, a MAdCAM Az LFA-1-hez hasonlóan az ? 4? 7 is a béta integrinek közé tartozik, csak itt az alosztályt meghatározó ? 7 az ? 4 lánccal egyesül. Az ? 4? 7 megtalálható a bélmukóza T sejtjein, az IgA tartalmú B sejteken, a lépben és a timuszban. Felnottek perifériás vérében a B és T sejtek 50%-án, NK sejteken és az eozinofilokon mutatható ki (155). A molekulának 4 ligandja ismeretes: MAdCAM, fibronektin, VCAM-1 és az ? 4 saját maga. Utóbbi teszi lehetové a homofil adhéziót. Legfontosabb ligandja humán viszonylatban a MAdCAM nevu adhéziós molekula, amely megtalálható a vékony- és vastagbélben, a lépben; expressziója fokozódik gyulladásos bélbetegségben (156,157). Legfontosabb szerepe az ? 4? 7-tel történo kapcsolódással megvalósuló limfocita „homing” folyamatban van, amit korábban részletesen ismertettem ( III.3.3. fejezet). Az ? 4? 7 , MAdCAM és a táplálékallergia Annak ellenére, hogy a két adhéziós molekula szerepét - egyéb immunológiai kórképek, limfocita „homing” illetve stimulációs kísérletek alapján - sokan feltételezték TA-ban is, táplálékallergiában szenvedok bélmukózájában nem történtek ezirányú vizsgálatok. Egy adott kórképben az adhéziós molekulák meghatározásának hármas célja lehet. Egyrészt a betegség patomechanizmusának jobb megértését szolgálja, másrészt diagnosztikus eszköz is lehet, valamint terápiás konzekvenciával is járhat. Utóbbira példaként megemlítheto a Crohn betegségben szenvedok bélmukózájában kimutatott ? 4 fokozott expressziója. A korábban leírtak szerint ez az integrin teszi lehetové, hogy a szenzibilizált limfociták a MAdCAM nevu szuperglobulinnal kapcsolódva a bél nyálkahártyájába visszatérjenek és elmélyítsék a gyulladást. Az ? 4 ellen termelt antitestet (anti-? 4, natalizumab) sikerrel próbálták ki a klinikai gyakorlatban 248 Crohn-betegségben szenvedon (158). Legfrissebb adatok az anti- LFA-1 (efalizumab) jótékony hatásáról számoltak be atópiás asztmában (159). Az irodalmi áttekintés összegzése: a mukózális immunológia, citokin milio és adhéziós molekula- mintázat részletes ismertetését az indokolta, hogy késobb az általam vizsgált paraméterek eredményeit a már ismert adatok közé könnyebben be lehessen
43
illeszteni. Tudományos munkám dönto célja az volt, hogy meghatározzam különbözo citokinek,
adhéziós
molekulák
és
proliferációs
markerek
expresszióját
táplálékallergiások és cöliákiások vékonybél- nyálkahártyájában. Célkituzéseim részletes ismertetése a II. fejezetben található.
44
IV. BETEGEK ÉS MÓDSZEREK Késoi típusú táplálékallergiás gyermekek és felnottek, valamint cöliákiás gyermekek tartoztak vizsgálataim betegcsoportjaiba. IV.1. Táplálékallergiás gyermekek Tizennégy táplálékallergiás gyermeket és öt kontrollt (átlagéletkor: 11.7 év, tartomány: 5-15 év, 5 lány) vontunk be a vizsgálatba. A tizennégy TA-ás gyermekeket két csoportra osztottuk, egyrészt azokra, akiknek diagnózisa a vizsgálat idején született (7 fo, átlagéletkor: 7.7 év, tartomány: 2-14 év, 4 lány), vagyis még nem folytattak speciális diétát (NDA: nem diétázó allergiások). A másik csoportot szintén hét fo alkotta (átlagéletkor: 8.7 év, tartomány: 1-14 év, 5 lány), akiknél a kórisme már korábbról ismert volt, és ennek megfeleloen speciális diétát folytattak (DA: diétázó allergiások). Ebben a csoportban az endoszkópiás vizsgálat indikációja a boholykárosodás, malabszorpció kizárása volt. A gyermekek az oului egyetem gyermekklinikájának gasztroenterológiai osztályának beteganyagába tartoztak. Itt számos gyermeket vizsgáltak TA gyanújával (atópiás dermatitisz, krónikus hasmenés, hasfájás, növekedésbei elmaradás), de a késobb ismertetett elimináció/provokáció csak egy részükben igazolta a diagnózist. Ok képezték a táplálékallergiás csoportot, melynek jellemzoit a IV.1. táblázat mutatja. A táblázatban az elso hét gyermek a még nem diétázó, frissen diagnosztizált csoportot (NDA), a vonal alatti hét gyermek pedig az ismert táplálékallergiások diétázó csoportját alkotja (DA). A táblázatban szereplo valamennyi gyermek, a 7. kivételével limfonoduláris hiperpláziát (LNH) mutatott az endoszkópos vizsgálatnál. A kontrolloknál az anamnézisben allergiás panasz vagy tünet nem szerepelt, egyéb kiegészíto vizsgálatok (D-xilóz, H2 kilégzési teszt, székletvizsgálat, vér- és vizeletelemzés) negatívnak bizonyultak. Cöliákiát a negatív EMA és a normális szövettani struktúrát mutató bélmukóza nem emelkedett számú ?? T sejteinek jelenléte zárta ki. Hasi panaszaik hátterében funkcionális hasfájást véleményeztünk. Vizsgálatunkba 5 cöliákiás gyermeket (átlagéletkor: 7.0 év, tartomány: 2-15 év) is bevontunk, kettos céllal. Egyrészt
kíváncsiak voltunk az IFN-? és IL-4 mRNS
expressziójára a cöliákiás mukózában, másrészt a reakció pozitív kontrollként is szolgált az in situ hibridizációs citokinmeghatározáshoz. A cöliákia diagnózisát a pozitív EMA
45
és a típusos szövettani kép (szubtotális vagy totális boholyatrófia kripta hiperpláziával) alapján állítottuk föl. IV.1.1. A táplálékallergia diagnózisa A betegek diagnózisát eliminációs/ terheléses vizsgálattal állapítottuk meg annak alapján, hogy a kérdéses allergént eliminálva megszuntek a panaszok, míg visszaterhelés után azok újra megjelentek. Nyolc esetben kórisméztünk tejfehérjeallergiát, 3-3 gyermeknél pedig gabona- illetve kevert hiperszenzitivitást (IV.1. táblázat). A táplálékallergiásoknál az eliminációs étrend két hétig tartott, majd attól függoen, hogy tej vagy gabona volt a gyanúba vett ételallergén, a terhelésnél az elso napon a gabonafélék vagy a tehéntej fokozatosan emelkedo (1g, 5g, 10g ill. 1ml, 5ml, 10ml, 25ml, 50ml, 100ml) adagját kapták. A második napon a gabona félékbol 20g-ot, tehéntejbol pedig 150-200ml-t fogyasztottak. A megfigyelési idoszak két héten keresztül tartott. A tünetek megjelenése a frissen diagnosztizált csoportban átlagosan 5 nap (tartomány: 1-9 nap) múlva, a diétázó gyermekeknél pedig 3,9 nap (tartomány: 1-7 nap) múlva jelentek meg. Mivel minimun egy óra után léptek föl a típusos tünetek, a gyermekek betegsége „késoi típusú” TA-ként kategorizálandó. A felnottkori TA- val ellentétben specifikus IgE-t ritkábban sikerült kimutatni, az NDA-ban ketto, a DA-ban pedig három gyermeknél. IV.1.2. Endoszkópos mintavétel A duodénumbiopszia vétele általános anesztéziában Olympus GIF Q140 endoszkóppal történt. Gyermekeknél az endoszkópiás mintavétel „alapállapotban”, az eliminációs étrend bevezetése elott történt, ellentétben a felnottekével (lásd késobb). Mintavétel történt az antrumból is, így a korábban végzett urea-kilégzési teszt, majd a szövettani elemzés alapján (Giemsa festés) a Helicobacter pylori (H. pylori) fertozést kizártuk. A duodénum bulbuszának makroszkópos megfigyelésénél – egy kivételtol eltekintve – mindenkinél limfonoduláris hiperpláziát láttunk. Innen történtek a mintavételek rutin szövettani feldolgozásra és kutatási célból (immunhisztológia és in situ hibridizáció). A késobb részletezett módon a biopsziás mintákat hutoben tároltuk, majd közvetlenül a speciális feldolgozás elott metszeteket készítettünk, melyeket kóddal láttuk el. Az immunhisztológiai vizsgálatokat és a radioaktív hibridizációs reakciókat a metszetek származásának ismerete nélkül, „vakon” végeztük.
46
IV.1. táblázat. A táplálékallergiás gyermekek karakterizálása Az elso hét gyermek a kezeletlen, még nem diétázó, frissen diagnosztizált csoportot - (NDA), a vonal alatti hét gyermek pedig az ismert táplálékallergiások diétázó csoportját alkotja (DA)
Beteg Nem Kor
Fo panasz
Fo panasz
Terhelésnél a
Elimi-
beutaláskor
a
tünet
nációs
(év)
terhelésnél megjelenésé-
Allergén
diéta
nek ideje
ideje
(nap)
(év)
1.
L
8
RAF
AF
4
-
tej
2.
F
5
RAF
AF
5
-
gabona
3.
L
2
D, anémia
D
7
-
tej
4.
F
14
AD, NE
AD
1
-
tej
5.
L
11
D
D
9
-
tej/ gabona
6.
F
6
RAF
AF
2
-
tej
7.
L
8
RAF
AF
7
-
tej/ gabona
8.
L
14
RAF,AD
D
5
12
tej/ gabona
9.
L
12
RAF
AF
7
3
tej
10.
L
6
RAF/D
AF
3
5
tej
11.
L
2
D
D
1
1
gabona
12.
L
3
RAF/D
AF
7
2
tej
13.
F
11
D,NE
D
3
3
tej
14.
F
14
D,AD
AD
1
13
gabona
F: fiú, L: lány, AF: abdominális fájdalom, RAF: rekurráló abdominális fájdalom, D: diarrhoea, AD: atópiás dermatitisz, NE: növekedésbeli elmaradás
47
IV.2.Táplálékallergiás felnottek Tíz táplálékallergiás (tej-, gabonaallergia) felnott (átlagéletkor: 34 év, tartomány 18-50 év, 8 no) és 9 kontroll (átlagéletkor: 36 év, tartomány 24-54 év, 6 no) endoszkópos úton eltávolított
duodénum
mintáit
elemeztük.
A
betegek
a
helsinki
egyetem
gasztroenterológiai osztályának beteganyagába tartoztak. A TA-ás felnotteknél 3 esetben kórisméztünk búza-, 3 esetben zab- és szintén 3 esetben zaballergiát, egy betegnél pedig tejallergiát. A betegek klinikai jellemzoit a IV.2. táblázat mutatja. A TAás felnotteknél csak frissen kórismézett, még nem diétázó betegeket vontunk be a vizsgálatba. Minden betegnél gondosan rögzítettük a visszaterhelés során megjeleno respirációs (asztma, rinokonjunktivitisz), dermatológiai (urtikária, pruritus, ekcéma) és gasztrointesztinális (hányinger, hányás, hasfájás, haspuffadás) tüneteket. Az esetleges cöliákiát szerológiai és vékonybélbiopsziás vizsgálattal zártuk ki. A H. pylori fertozést a C13 urea kilégzési teszt, az endoszkópos kép és a szöve ttani vizsgálat alapján zártuk ki. Prick tesztet egyrészt a 10 leggyakoribb aeroallergénnel, másrészt a leggyakoribb alimentáris allergénekkel (tehéntej, tojás, szója és hal) végeztünk (Allergologisk Laboratorium A/S ALK-Abello, Dánia). Gabonafélékkel a Prickt teszt az adott liszt (búza, rozs, árpa és zab) és fiziológiás sóoldat 1:10 arányú keverékével történt. Pozitív kontrollként hisztamin dihidroklorid (10mg/ml) szolgált. A Prick tesztet az alkar voláris felszínén végeztük. A reakciót 15 perc után olvastuk le, és pozitívnak akkor tekintettük, ha a reaktív terület átméroje legalább 3mm volt és a sóoldat nem adott reakciót. A tízbol 7 felnottnél bizonyult a Prick teszt és hatnál a specifikus IgE pozitívnak. A speciális IgE antitestet radioallergoszorbent teszt (RAST Pharmacia, Uppsala, Svédország) segítségével határoztuk meg, 0.3 kU/l fölötti értéket tekintve pozitívnak. TA-ás felnottekben a TA-ás gyermekekhez képest kevesebb ido telt el az allergizáló étel elfogyasztása és a tünet megjelenése között (átlagosan 5 óra), de valamennyi esetben több, mint egy óra telt el, így a „késoi típusú” TA diagnózisa itt is fölállítható. A kontrolloknál az anamnézisben allergiás panasz vagy tünet nem szerepelt, hasi panaszaik hátterében irritábilis bélszindrómát véleményeztünk. A TA-ás felnotteknél a diagnózis felállítása (elimináció /terhelés) és az endoszkópos mintavétel a TA-ás gyermekeknél leírt módon történt. Az egyetlen fontos különbség az allergénnel történo terhelés és az endoszkópiás vizsgálat között eltelt ido vonatkozásában adódott. Ugyanis felnotteknél az adott táplálékallergénnel történo
48
eliminációs idoszak utáni, pozitív terhelést követoen másnap történt a biopsziás mintavétel. Ennek megfeleloen más lehet egy adott, vizsgálandó paraméter expressziója, dinamikája, mint amikor folyamatos allergénterhelés éri a bélrendszert és ekkor veszünk biopsziát.
IV.2. táblázat. A táplálékallergiás felnottek jellemzoi
Beteg Nem Kor (év)
TM
Étel-
(óra) allergén
PT
RAST
PT
Vezeto Tünet
(aero-
(étel- tünet
allergén)
aller-
súlyossága
gén)
1.
F
45
26
búza
+
+
+
R
enyhe
2.
N
36
2,5
zab
-
+
+
G
enyhe
3.
N
49
4,0
búza
-
+
+
B
közepes
4.
N
45
2,0
rozs
-
+
+
G
enyhe
5.
N
26
1,5
zab
+
-
-
B
enyhe
6.
N
18
3,0
rozs
-
-
+
G
súlyos
7.
N
50
2,5
zab
+
+
+
G
súlyos
8.
F
35
3,0
tej
+
+
+
G
enyhe
9.
N
26
4,0
rozs
-
-
-
B
közepes
10.
N
50
1,5
búza
-
-
-
G
közepes
F: férfi, N: no, TM: tünet/panasz megjelenése a kérdéses allergénnel történo terhelés során, PT: Prick teszt, RAST: radioallergosorbent teszt, R: respirációs, G: gasztrointesztinális, B: bortünet
IV.3. Az 1TDM és a cöliákia együttes elofordulása Vizsgálatunkat a Semmelweis Egyetem I.sz. Gyermekklinikájának Diabetológiai részlegén végeztük 1998 szeptember és 2000 február között. 205 gyermeknél (88 lány,
49
117 fiú, átlegéletkor: 11.3 év, tartomány: 2-17 év) végeztük el az EMA vizsgálatot esetleges cöliákia iga zolására. A vizsgálat és a diabétesz diagnosztizálása óta eltelt ido átlagosan 4.4 év volt (tartomány: 0.16-15 év). Egyik gyermeknél sem láttuk a cöliákiára jellemzo típusos klinikai képet, komoly gasztrointesztinális tünet és panasz nem állt fent. Az EMA pozitív 1. típusú diabéteszes gyermekeknél (24 gyermek, 11 fiú, átlagéletkor: 8.9 év, tartomány: 4.7-13.5 év) a jejunális biopsziát Crosby kapszulával vettük. A minta egyik fele rutin szövettani feldolgozásra, a másik pedig az intraepiteliális ?? T sejt analizálására (TCR? 1) került.
IV.4. VIZSGÁLATI MÓDSZEREK Az eltávolított biopsziás mintákon immunhisztokémiai módszerrel elemeztem az adott fehérje (citokin, adhéziós molekula, immun- és proliferációs marker) expresszióját. Ezen felül TA-ás gyermekek duodenális mintáiban radioaktív in situ mRNS hibridizációval is detektáltuk a kérdéses citokin mukózális megjelenését. IV.4.1. Immunhisztokémiai vizsgálat és értékelés A duodenális minták egy részét paraffinba ágyaztuk, abból rutin hisztológiai feldolgozás történt. Az immunhisztológiai vizsgálatokhoz a biopsziás mintákat azonnal –80 °C-ra hutöttük, és a feldolgozásig ott tároltuk. A metszetekhez 5 ? m vastag fagyasztott készítményeket használtunk. A felhasznált monoklonális antitestek specifitását és az alkalmazott hígításokat mutatja a IV.3. és IV.4. táblázat. Az adott primer antitesttel végzett inkubáció szobahomérsékleten 2 órán keresztül tartott. Az immunhisztokémiai eljárás Vectastain Elite ABC kit (PK-6106, Burlinghame, Ca, USA) felhasználásával történt. Az endogén peroxidáz blokkolása 0.3%-os hidrogén-peroxiddal a primer antitesttel végzett inkubáció után történt, 20 perces inkubációs idovel. A második réteg biotinnal konjugált ló-antiegér IgG volt, míg a harmadik réteg avidint és biotinnal konjugált tormaperoxidáz makromolekula komplexet tartalmazott. Az utóbbi két inkubációt is szobahomérsékleten végeztük, és 30-30 percig tartott. A színreakciót hidrogénperoxiddal aktivált AEC-vel (3-amino-9etilkarbazol, Sigma, St. Luis, Mo, USA) végeztük, végül a készítményeket 1 percig hematoxilinnel festettük meg. Mindegyik szövetmintából olyan kontrollmetszeteket is készítettünk, melyekre monoklonális antitesteket nem applikáltunk (negatív kontroll).
50
IV.3. táblázat. Az alkalmazott T-, B-sejtmarkereket és HLA struktúrát meghatározó monoklonális antitestek specifitása és jellemzoi
Specifitás
Név
Gyártó
Hígítás
TCR ? ?
? F1
T Cell Sciences
1:100
TCR ??
TCR
T Cell Sciences
1:100
CD3
Leu4
Becton Dickinson
1:400
CD4
T4
Coulter
1:400
CD8
OKT8
Ortho
1:400
IL-2 receptor
CD25
Dakopatts
1:10
IgA
Anti-IgA
Oxoid
1:20000
IgA1
Anti-IgA1
Oxoid
1:100
IgA2
Anti-IgA2
Oxoid
1:10000
HLA-DP
Anti-HLA-DP
Becton Dickinson
1:40
HLA-DR
Anti-HLA-DR
Becton Dickinson
1:1000
A szövetminták kiértékelése fénymikroszkóp segítségével történt, 1000-szeres nagyítással. A bélnyálkahártya felszíni epitéliumában és a lamina propriában a pozitív sejtek számát egy ismert oldalhosszúságú kalibrációs négyzet segítségével határoztuk meg, s az értékeket az epitéliumban sejt/mm, a lamina propriában pedig sejt/mm2 -ben adtuk meg. Az ICAM-1, MAdCAM és HLA pozitív struktúrák összehasonlító elemzését egy 100 pontos hálózattal végeztük, ahol minimálisan 1500 pontot értékeltünk minden metszeten, legyen az pozitív vagy negatív, és a pozitív pontok százalékos arányát adtuk meg. MAdCAM meghatározást csak a TA-ás felnotteknél és a hozzá tartozó kontrolloknál végeztem. Az 1. típusú diabétesz mellituszban szenvedo EMA pozitív gyermekeknél a jejunális vékonybélbiopsziában az intraepiteliális ?/? T sejtek számát akkor tekintettük kórosan magasnak, ha az meghaladta a 7 sejt/mm értéket (43).
51
IV.4. táblázat. Az alkalmazott adhéziós molekulák, proliferációs marker és citokinek elleni monoklonális antitestek specifitása és jellemzoi
Specifitás
Név
Gyártó
Hígítás
ICAM-1
CD54
T Cell Diagnostic
1:2000
MAdCAM
Anti-MAdCAM
T Cell Sciencies
1:50
LFA-1
CD11a
Immunotech
1:50
? 4? 7
ACT-1
Leukosite
1:200
Proliferációs marker
Ki-67
Dakopatts
1:20
IL-4
IL-4
Mabtech
1:200
IFN-?
IFN-?
Mabtech
1:200
IV.4.2. Radioaktív in situ hibridizáció Az in situ hibridizációs vizsgálathoz a duodénum bulbuszából vett, majd lefagyasztott és –80 fokon tárolt mintákból 10? m vastag metszeteket készítettünk és 4%-os paraformaldehid oldatban fixáltuk. Az in situ hibridizációhoz szükséges humán IFN-? és IL-4 ribopróbákat a megfelelo cDNS-bol Ilkka Julkunen MD, PhD bocsátotta rendelkezésünkre, melynek részletes leírása egy korábbi közleményben olvasható (160). A szövettani mintákat 1.2 x 106 P 33 izotóppal jelölt CPM oldattal inkubáltuk (teljes volumen: 80? l), a megfelelo antiszenz és szenz ribopróbával együtt (1000-3000 Ci/mmol; Amersham, Life Technologies, Arlington Heights, IL l). A radioaktív elegyet akkor tekintettük me gfelelonek, ha az 1? l-re vonatkoztatott szcintillációs érték 1 millió felett volt. A prehibridizációs fázisban a fixálás és a felszálló alkoholsorral végzett dehidrálás között 0.1M trietanolaminnal pH=8 értéken permeabilizáció történt 3 percig. A hibridizációs fázisnál a korábban elkészített radioktív „ribopróbát” és a hibridizációs elegyet (50% dextránszulfát, Denhard oldat, 5M NaCl, 1M Tris-HCl, 0.5M EDTA, formamid) helyeztük a szövettani metszetekre. A poszthibridizáció után a pozitív
52
struktúrák megjelenítését sötétkamrában Kodak Developer D-19 segítségével végeztük. A radioaktív in situ hibridizációs eljárást teljes részletességgel lásd másutt (161). IV.4.3. Radioaktív in situ hibridizációs metszetek értékelése Az IFN-? és IL-4 mRNS értékelését egy speciális, mikroszkópra illesztheto kamerával végeztük. Minden szövettani metszeten (400x nagyítás) a lamina propriában két reprezentatív területet, valamint a szövet szomszédos területén jelentkezo aktivitást (háttér-reakció) egyaránt megszámoltuk. Az adott citokin mRNS relatív intenzitását úgy kaptuk, hogy a szöveti pozitivitást osztottuk a háttér pozitivitásával. Minden szövettani metszeten két területet analizáltunk, és minden betegbol két mintát értékeltünk, a kapott értékeket átlagoltuk. IV.4.4. Antiendomizium antitest (EMA) és a HbA1c meghatározása Az EMA meghatározásra a vérvétel a rutin kontrollvizsgálatoknál történt. A szérumot a centrifugálás után maximum egy hónapig, –80?C-on tároltuk. Az EMA meghatározása indirekt immunfluoreszcens metodikával történt, humán köldökzsinórból kriosztáttal metszett 5? m vastag képleten. A metszeteket eloször 1:5 arányban hígított, a betegbol származó szérummal inkubáltuk, majd PBS-sel mostuk. Fluoresceinizotiocianáttal konjugált kecske anti-IgA szérum segítségével detektáltuk az esetleges EMA jelenlétét (Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA, USA). Végül fluorescens mikroszkóp alatt elemeztük a metszeteket. A glikált hemoglobin mennyiségét (HbA1c) immunfluorescens metodikával határoztuk meg (IMx Glycated Hemoglobin test, Abbott Laboratories, Abbott Park, IL, USA). Minden betegnél rögzítettük a testtömeg- indexet (BMI) és az inzulin szükségletet a gluténmentes diéta elott és 3 hónappal azt követoen. IV.5. Statisztikai elemzés A táplálékallergiásokban és cöliákiásokban, valamint a kontrollokban talált sejtszámok, pozitív struktúrák statisztikai összehasonlítását az értékek „nem normál eloszlása” miatt Mann-Whitney
U-teszttel
végeztem.
táplálékallergia)
összehasonlító
Kettonél
elemzésénél
több
csoport
varianciaanalízist
(gyermekkori használtam.
A
mukózában detektált denzitások értékét mediánban, valamint 25-75 percentilis értékben tüntettem föl. A diabéteszes és cöliákiás gyermekek diéta elotti és utáni paramétereinek összehasonlító elemzését egymintás és kétmintás t-próbával végeztem. A P < 0,05 értéket tekintettem statisztikailag szignifikánsnak.
53
IV.6. Etikai beleegyezés Megfelelo felvilágosítás után valamennyi beteg, illetve szülo írásban beleegyezését adta, hogy részt vesz, illetve gyermeke részt vehet a vizsgálatban. A vizsgálati tervet a TA-ás gyermekeknél és felnotteknél, illetve a cöliákiásoknál és az adott kontrolloknál a Helsinki Egyetem Etikai Bizottsága jóváhagyta. Az I. típusú diabétesz mellituszos és cöliákiás gyermekeknél, valamint a kontrolloknál a Semmelweis Egyetem Etikai Bizottsága engedélyezte a kutatási terv végrehajtását.
54
V. EREDMÉNYEK V.1. TÁPLÁLÉKALLERGIÁS GYERMEKEK A táplálékallergiás gyermekek allergológiai vizsgálatának eredményeit a IV.1. táblázat tartalmazza. Kiemelésre érdemes, hogy a hiperszenzitív gyermekeknél makroszkóposan - egy kivételtol eltekintve limfonoduláris hiperpláziát láttunk az endoszkópiás vizsgálatnál. A metszetek rutin szövettani vizsgálata (fénymikroszkóp, hematoxilineozin festés) nem mutatott boholykárosodást. V.1.1. Intraepiteliális limfociták A ?? T sejtek száma szignifikánsan nagyobbnak bizonyult a frissen diagnosztizált, még nem diétázó allergiás gyermekeknél (NDA) a kontrollhoz képest (P = 0.01). Amennyiben a frissen diagnosztizált, még nem diétázó csoportot kétfelé osztottuk az allergén típusa szerint (tejallergiás és gabonaallergiás csoportra), akkor a ?? T sejtek a gabonaallergiások intraepitéliumában nem jelentek meg nagyobb számban, mint a tejallergiásoknál (2.7 vs 3.1 sejt/mm). A diétát folytatóknál (DA) a ?? T sejtek száma (medián) már lényegében megegyezett a kontrollokéval, a két csoport között nem találtam szignifikáns különbséget (V.1. ábra). Az intraepiteliális kompartmentben a CD3, CD4, CD8 és az ? ? TCR + sejtek denzitása a betegekben és a kontrollokban hasonló volt (V.1. táblázat). V.1.2. Adhéziós molekulák expressziója az epitéliumban Az LFA-1 + sejtek száma a vizsgált három csoportban hasonlónak bizonyult. A limfocita „homing receptor” (? 4? 7) pozitív mononukleáris sejtek száma a NDA-ban magasabb volt, mint a diétázó és a kontrollcsoportban, bár a különbség nem volt szignifikáns. ICAM-1 expressziót sem az epitelsejteken, sem az IEL sejteken nem detektáltam (V.1. kép). V.1.3. Limfociták a lamina propriában A T sejtmarkerek (CD3, CD4, CD8, ? ? -TCR) és a B sejtek (IgA és alosztályai) esetében a három vizsgált csoport között nem találtam szignifikáns különbséget, csakúgy, mint az IL-2 receptort jelzo CD25 pozitív sejtek aránya es etében sem (V.2. táblázat).
55
V.1. táblázat. CD3, CD4, CD8, ? ? -TCR, ?? -TCR, LFA-1 és ? 4? 7 pozitív sejtek a még nem diétázó (NDA), a diétázó allergiások (DA) és a kontrollok epitéliumában (sejt/mm), medián, (25-75 percentil)
Marker
NDA
DA
Kontroll
CD3
22.0 (15.5-23.2)
20.2 (11.7-29.0)
20.8 (19.2-29.2)
CD4
1.67 (0.83-2.5)
0.83 (0.83-1.67)
1.61 (0.83-4.63)
CD8
12.9 (11.5-23.3)
19.5 (17.7-24.2)
13.7 (11.8-26.9)
? ? TCR
18.1 (13.4-29.0)
23.3 (11.0-35.8)
26.5 (14.2-31.8)
?? -TCR
3.23 (2.42-4.03)*
1.67 (0.83-3.33)
1.56 (1.00-1.67)
LFA-1
12.5 (11.0-34.7)
9.17 (5.4-12.1)
10.0 (8.33-17.5)
? 4? 7
5.95 (3.33-7.56)
3.33 (3.03-5.00)
3.91 (3.85-4.84)
P = 0.01 NDA vs. kontroll
V.1.4. Adhéziós molekulák expressziója a lamina propriában Az NDA csoport lamina propriájában az LFA-1 integrint hordozó sejtek aránya nagyobb volt, mint a diétázókban és a kontrollban, de a különbség nem bizonyult szignifikánsnak (P = 0.12 és P = 0.14). Érdekes módon az ? 4? 7 denzitás a kontrollokban magasabbnak tunt, mint a két TA csoportban, szignifikáns különbség nélkül (NDA: P = 0.106 és DA: P = 0.07). ICAM-1 pozitív endotelsejtek/kapilláris átmetszetek és mononukleáris sejtek foként szubepiteliálisan festodtek a 3 csoportban azonos mértékben (V.1. kép, V.4. táblázat). V.1.5. Citokinek expressziója a lamina propriában IFN-?+ sejteket döntoen a lamina propriában találtunk, az NDA csoportban lényegesen nagyobb számban, mint a kezeltekben (DA) és a kontrollokban (P = 0.053 és P = 0.018) (V.2. ábra). A lamina propria IL-4+ sejtjei a három csoportban egymástól szignifikánsan nem különbözött (V.3. táblázat). Az epitéliumban az IFN-? és az IL-4+ sejtek csak elvétve mutatkoztak (0-1 sejt/mm).
56
V.2. táblázat. CD3, CD4, CD8, ? ? -TCR, ?? -TCR és HLA-DR pozitív sejtek a még nem diétázó (NDA), a diétázó allergiások (DA) és a kontrollok lamina propriájában (sejt/mm2 ), medián, (25-75 percentil)
Marker
NDA
DA
Kontroll
CD3
762 (701-1521)
854 (606-882)
1177 (1125-1292)
CD4
736 (689-920)
703 (649-857)
760 (442-968)
CD8
303 (208-353)
208 (190-229)
333 (194-467)
? ? TCR
744 (591-1296)
625 (438-729)
781 (675-1154)
IgA
1136 (1041-1520)
1406 (119-1531)
1250 (1086-1369)
IgA1
887 (6251035)
740 (423-961)
1074 (559-1294)
IgA2
1227 (1062-1425)
1200 (793-1458)
1328 (1018-1936)
CD25 (IL-2R)
271 (202-352)
260 (104-313)
213 (195-323)
HLA-DR
988 (625-1042)
972 (841-1085)§
650 (469-817)
§
P = 0.03 DA vs. kontroll ?? T sejtek száma a még nem diétázó (NDA), a diétázó allergiások (DA) és a kontrollok lamina propriájában (medián, 25-75 percentil)
5 Sejt/mm * P=0,01
4 3 2 1 0 NDA
DA
Kontroll
V.1. ábra
57
V.1. Kép. ICAM-1 expressziója egy búzaallergiás felnott szubepiteliális kapillárisának hosszmetszetén Epitel
Kapilláris
Lamina propria
V.3. táblázat. LFA-1, ? 4? 7, IFN-?, and IL-4 pozitív sejtek a még nem diétázó (NDA), a diétázó allergiások (DA) és a kontrollok lamina propriájában (sejt/mm2 ), medián, (25-75 percentil)
Marker
NDA
DA
Kontroll
LFA-1
771 (508-797)
477 (303-532)
479 (380-607)
? 4? 7
144 (83-268)
146 (104-223)
282 (236-590)
IFN-?
208 (179-229)†‡
129 (114-167)
101 (83-121)
IL-4
188 (98-242)
152 (67-282)
171 (125-375)
†
P = 0.05 NDA vs. DA
‡
P = 0.02 NDA vs. kontroll
58
IFN-? pozitív sejtek száma a még nem diétázó (NDA), a diétázó allergiások (DA) és a kontrollok lamina propriájában (medián, 25-75 percentil) Sejt/mm 2 250
* P=0.02
* P=0.05
200 150 100 50 0 NDA
DA
Kontroll
V.2. ábra
V.1.6. Ki-67 proliferációs marker a kriptákban Annak ellenére, hogy a rutin szövettani vizsgálat egyetlen vizsgált biopsziás mintán sem jelzett kórosat: a bélbolyhok épek voltak, a Ki- 67 proliferációs marker százalékos aránya a kezeletlen TA-ás gyermekekben magasabb volt, mint a diétázó csoportban (P = 0.03) és a kontrollokban. Ez a frissen diagnosztizált TA-ás gyermekek magasabb epiteliális „turnoverére” utalt (V.4. táblázat). V.1.7. HLA-DR expressziója a mukózában Szignifikánsan nagyobb HLA-DR kriptális festodési rátát észleltem az NDA csoportban a kontrollhoz képest (P = 0.048). A diétázó TA-ás gyermekekben a felszíni epitélium HLA-DR reakciója volt szignifikánsan magasabb a kontrollhoz képest (P = 0.048) (V.4. táblázat). A lamina propria mononukleáris sejtjeinek HLA-DR expressziója mind a kezeletlen (NDA), mind a diétázó (DA) táplálékallergiás gyermekekben magasabbnak bizonyult, mint a kontrollokban, bár szignifikáns különbség csak az utóbbi párosításban mutatkozott (P = 0.03) (V.2. táblázat).
59
V.4. táblázat. Ki-67 kriptális proliferációs ráta, HLA-DR pozitív struktúrák és az ICAM-1 százalékos aránya a még nem diétázó (NDA), a diétázó allergiások (DA) és a kontrollok lamina propriájában (sejt/mm2 ), medián, (25-75 percentil)
Marker
NDA
DA
Kontroll
Ki-67
45.9 (36.8-53.9)*
33.5 (14.5-45.5)
30.0 (29.7-38.9)
HLA-DR kripta
20.5 (13.7-26.3)†
9.09 (5.33-16.2)
2.79 (2.67-11.1)
HLA-DR felszín
32.6 (29.1-42.0)
45.8 (40.3-60.5)§
35.4 (33.6-37.0)
ICAM-1
10.3 (9.13-12.6)
10.7 (6.80-11.8)
10.7 (10.1-11.5)
*
P = 0.03 NDA vs. DA
§
P = 0.048 DA vs. kontroll
†
P = 0.048 NDA vs. kontroll
V.1.8. Radioaktív in situ hibridizáció IFN-? mRNS expresszió IFN-? antiszenz próba alapján megjelölt sejtek döntoen a lamina propria felso részében helyezkedtek el, csak szórványosan jelentek meg pozitív sejtek a lamina propria mélyebb régiójában. A felszíni epitélium és az intraepiteliális limfociták nem, vagy alig mutattak radioaktív jelet. Az IFN-? mRNS expresszió szignifikánsan nagyobbnak bizonyult a cöliákiás gyermekekben a diétázó allergiásokhoz és a kontrollokhoz képest (P = 0.017 és P = 0.016). Fontos kiemelni, hogy ennek a citokinnek az expressziója cöliákiában nem volt szignifikánsan magasabb, mint a frissen diagnosztizált, diétát még nem folytató gyermekekben. Az IFN-? szenz próba (negatív kontroll) csak háttérjelet mutatott (V.3. ábra).
60
Relatív denzitás
* P < 0.05
Cöliákia
NDA
DA
Kontroll
V.3. ábra. Az IFN-? mRNS expressziója cöliákiában, kezeletlen és kezelt táplálékallergiásokban, valamint kontrollokban (in situ hibridizáció)
IL-4 mRNS expresszió Minden vizsgált gyermek lamina propriája elszórtan jelzett olyan sejteket, amelyek IL-4 mRNS szignált tartalmaztak. Néhány pozitív jel az extracelluláris térben is megjelent. Cöliákiásokban az IL-4 mRNS expressziója szignifikánsan nagyobb volt, mint az NDA (P = 0.006), DA csoportban (P = 0.01) és a kontrollokban (P = 0.029) (V.4. ábra). Az IL-4 expressziója a TA-ás gyermekek két csoportjában és a kontrollokban hasonlónak bizonyult. Az IL-4 szenz próba is csak háttér szignált jelzett (negatív kontroll).
61
Relatív denzitás
* P < 0.05 ** P < 0.01
Cöliákia
NDA
DA
Kontroll
V.4. ábra. Az IL-4 mRNS expressziója cöliákiában, kezeletlen és kezelt táplálékallergiásokban, valamint kontrollokban (in situ hibridizáció)
V.2. TÁPLÁLÉKALLERGIÁS FELNOTTEK A táplálékallergiás felnottek allergológiai vizsgálatának eredményeit a IV.2. táblázat tartalmazza. vizsgálata
Az ételallergiás gyermekekhez hasonlóan a metszetek rutin szövettani (fénymikroszkóp,
hematoxilin-eozin
festés)
itt
sem
mutatott
boholykárosodást.
V.2.1. Intraepiteliális sejtek Az intraepiteliális kompartmentben a CD3, CD4, CD8, ? ? és ?? T sejtek száma lényegében megegyezett a kontrollokéval (V.6. táblázat). Az epitélium anti-DR és -DP festodése nem mutatott szignifikáns különbséget a vizsgált csoportokban. A korábban ismertetett TA-ás gyermekekhez hasonlóan itt is teljesen normális boholystruktúrát találtunk, ennek ellenére a Ki- 67 proliferációs marker aktivitása itt is nagyobbnak bizonyult a TA-ás csoportban (V.7. táblázat).
62
V.2.2. Lamina propria mononukleáris sejtjei A lamina propria CD3, CD4, CD8, CD25 és ?? T sejtek denzitása a két csoportban egymástól nem különbözött. ?? T sejteket csak az epitélumban, CD25+ sejteket (IL-2 receptor) csak a lamina propriában számoltam, mivel egyéb régiókban csak egy-egy sejt mutatkozott. A HLA-DR és CD4 pozitív sejtek aránya viszont a TA-ás csoportban szignifikánsan nagyobbnak bizonyult (P = 0.04 és P = 0.05). A HLA-DP, az IgA és alosztályait (IgA1 és IgA2) prezentáló sejtek tekintetében különbséget nem találtunk (V.6. és 8. táblázat). V.6. táblázat. CD3, CD4, CD8, CD25, ? ? , és ?? TCR, HLA-DR és -DP pozitív struktúrák expressziója táplálékallergiás felnottek (TA) és kontrollok duodenális mukózájában
Sejtdenzitás az epitéliumban (sejt/mm), HLA-DR és -DP %-os megoszlása, medián, (25-75 percentil)
Sejtdenzitás a lamina propriában (sejt/mm²), medián, (25-75 percentil)
Marker
TA
Kontroll
TA
Kontroll
CD3
48 (35-51)
44 (34-49)
1570 (1184-1757)
1298 (983-1523)
CD4
6.5 (4.6-11)
6.8 (3.5-9.4)
1265 (781-1491)*
1053 (602-1188)
CD8
43 (30-46)
33 (28-44)
350 (259-482)
423 (249-466)
CD25
229 (177-398)
189 (135-388)
TCR ? ?
36 (29-45)
31 (29-43)
TCR ??
1.6 (1.1-2.8)
1.1 (0.8-3.5)
HLA-DR
7.5 (5.4-13)
7.5 (4.5-8)
1229 (1183-1507)**
1064 (910-1204)
HLA-DP
60 (58-66)
66 (60-70)
1291 (1082-1471)
1136 (921-1334)
*P = 0.05, **P = 0.04
63
1504 (1091-1663) 11208 (1058-1397)
V.2.3. Adhéziós molekulák expressziója Az intraepiteliális LFA-1+ sejtek száma a vizsgált két populációban megegyezett, a lamina propriában viszont TA-ban több sejtet számoltam, bár a különbség nem érte el a szignifikancia határát, csakúgy, mint ugyanezen régióban az ? 4? 7 + sejtek denzitása. Ezzel ellentétben a táplálékallergiás felnottek intraepitéliumában az ? 4? 7 homing receptort viselo limfociták szignifikánsan nagyobb számban voltak jelen a kontrollhoz képest (P = 0.01) (V.2. kép, V.5. ábra). ICAM-1 vonatkozásában pozitív reakciót az intraepiteliális régióban nem találtam, a TA-ások lamina propriájában viszont szignifikánsan jelentosebb százalékban festodtek a kapillárisok és mononukleáris sejtek a kontrollhoz képest (P = 0.003). A reakció különösen a szubepiteliális régióban volt intenzív. MAdCAM tekintetében a csoportok között különbséget nem tudtam kimutatni, az ICAM-1-hez hasonlóan itt sem volt reakció az epitéliumban, viszont az ICAM-1-hez képest kisebb arányú expressziót mutattak a lamina propria megfelelo sejtjei (V.7. táblázat).
V.2. kép. ? 4? 7 pozitív sejtek (nyíl) egy táplálékallergiás beteg lamina propriájában
? 4? 7
64
V.7. táblázat. LFA-1, ? 4? 7 integrin, MAdCAM-1, ICAM-1, Ki-67 expressziója táplálékallergiás felnottek (TA) és kontrollok duodenális mukózájában Sejtdenzitás az epitéliumban (sejt/mm), Ki- 67 esetében % -os megoszlás medián, (25-75 percentil)
Sejtdenzitás a lamina propriában (sejt/mm²), ICAM-1 és MadCAM-1 esetében %-os megoszlás medián, (25-75 percentil)
Marker
TA
Kontroll
TA
Kontroll
LFA-1
14 (11-18)
12 (8.5-16)
696 (625-801)
575 (452-744)
? 4? 7
3.2 (2.9-4)*
2.5 (2.2-2.9)
293 (263-496)
239 (120-387)
MAdCAM-1
NV
NV
3.1 (2.6-4)
3.4 (2.7-4.1)
ICAM-1
NR
NR
20.2 (17-25)**
14 (12-16)
Ki-67
42 (37-54)
35 (31-40)
NR
NR
*P = 0.01, **P = 0.003 NV: nem vizsgáltam NR: nincs reakció
V.2.4. IFN-? és IL-4 expresszió A két citokinnel kapcsolatban szignifikáns eltérést nem találtam, bár a TA-ás felnottek mukózájában az IL-4+ sejtek száma közel másfélszerese volt a kontrollokénak. A citokint tartalmazó sejtek túlnyomó része a lamina propriára korlátozódott, az epiteliális kompartmentben csak elszórtan jelentkeztek (0-1sejt/mm) (V.8. táblázat).
65
? 4? 7 expressziója TA felnottek duodenális mukózájában (medián, 25-75 percentil) IE: intraepitélium, LP: lamina propria Sejt/mm
*
* P < 0.05
4,00 3,00
ételallergia 2,00 kontroll 1,00 0,00 IE
LP
V.5. ábra
V.8. táblázat. IgA, IgA1, IgA2 tartalmú sejtek, valamint az IFN-? és IL-4 expressziója
táplálékallergiás
felnottek
(TA)
és
kontrollok
mukózájában
Sejtdenzitás a lamina propriában (sejt/mm²), medián, (25-75 percentil) Marker TA Kontroll
IgA
962 (871-1130)
1054 (972-1125)
IgA1
594 (509-755)
698 (535-926)
IgA2
474 (429-565)
547 (454-694)
IFN-?
325 (194-397)
333 (120-423)
IL-4
296 (206-400)
208 (191-313)
66
duodenális
V.3. Az 1TDM és a cöliákia Az 1TDM-ben szenvedo gyermekekben vizsgáltuk a cöliákia incidenciáját, a ?? T sejtek mukózális megjelenését és a gluténmentes étrendnek anyagcserére gyakorolt hatását. A fontosabb adatokat folyamatábrán rögzítettük (V.6. ábra). EMA pozitivitást a 205 gyermek közül 24 esetben (11 fiú, 13 lány, átlagéletkor: 8,9 év, tartomány: 4.7-13.5 év) találtunk (11.7%). A két kórkép (1TDM és cöliákia) diagnosztizálása között 3.1 év (tartomány: 0.16-9.9 év) telt el. A jejunális biopszián 17 esetben (8.3%) találtunk szubtotális boholyatrófiát. Ezek a gyermekek a „csendes” (silent) cöliákia csoportjába sorolandók, hiszen egyikük sem jelzett klinikai tünetet. A másik hét gyermeknél a bélmukóza a rutin szövettani vizsgálatnál nem mutatott boholyeltérést. A gyermekek hossza normális volt (átlag percentil: 36.8%, tartomány: 3-65). Hat gyermeknél a retrospektív analízis enyhe gasztrointesztinális tüneteket (hasmenés, hasi disztenzió, visszatéro hasfájás) fedett föl.
V.6. ábra. Az 1TDM-ben szenvedo EMA+ gyermekek jellemzoi 1TDM betegek száma n = 205 EMA pozitív n = 24
Boholyatrófia n = 17
EMA negatív n = 181
Normális mukóza n=7
Emelkedett számú ?? T sejtek n=5
Normális számú ?? T sejtek n=2
Az intraepiteliális ??? T sejtek száma az EMA pozitív gyermekeknél magas volt (átlag + SD: 9.7 + 4,5 sejt/mm, tartomány: 4-22). Ezen sejtek száma a boholyatrófiás gyermekeknél nagyobbnak bizonyult, mint a normális mukózával rendelkezoknél, bár a különbség nem volt szignifikáns (9.6 + 1,1 vs 7.6 + 0.9) (V.7. ábra). Annál a 7 EMA
67
pozitív gyermeknél, akinél normális mukózát láttunk, 5 esetben magas intraepiteliális ??? T sejtszámot detektáltunk. Így ezek a gyermekek a látens cöliákiások csoportjába tartoztak (2,4%). V.7. ábra. Az intraepiteliális ?/? T sejtek száma EMA pozitív, 1. típusú diabétesz mellituszban szenvedo gyermekek boholyatrófiás és normális mukózájában
25
Sejt/mm
c e lls/mm
20 15 10 5 0 Boholyatrófia (n:17)
Normális mukóza (n:7)
Gluténmentes diétát kezdtünk azoknál az 1TDM-ban szenvedo gyermeknél, akiknél „csendes” cöliákiát kórisméztünk. Ezen kívül egy látens cöliákiás gyermekeknél is bevezettük a speciális étrendet, a jelentos hipotrófia és a rossz cukoranyagcsere kontroll miatt. A BMI a gluténmentes diétát követoen szignifikánsan emelkedett (átlag + SD: 14.7 + 1.8 vs 16.1 + 1.7 kg/m2 , P<0.05). A 6 gyermeknél észlelt enyhe gasztrointesztinális tünetek, amelyek esetleg a gluténnel kapcsolatba hozhatók, teljesen megszuntek. A diagnosztizált cöliákiásoknál a gluténmentes étrend bevezetését követoen szignifikánsan fokozott inzulinszükségletet mértünk (0.61 + 0.12 vs 0.49 + 0.09 U/kg/nap, p<0.05), miközben a glikált hemoglobin (HbA1c) százalékos aránya nem változott (7.54 + 1.54 vs 7.71 + 1.5%). Annál az egy betegnél, akinél az 1TDM és a látens cöliákia együttesen
68
jelentkezett, a gluténmentes étrenden szignifikáns súlygyarapodást és jobb metabolikus kontrollt észleltünk.
69
VI. MEGBESZÉLÉS
Értekezésem fo vonalát táplálékfehérje indukálta enteropátiás (gyermekek és felnottek) és cöliákiás betegek intesztinális mukózájában végbemeno immunológiai történések vizsgálata képezte. Immunhisztokémiai és radioaktív in situ hibridizációs módszerek segítségével vizsgáltam az IFN-? és az IL-4, a különbözo adhéziós molekulák, proliferációs és immunmarkerek expresszióját a bélbiopsziás mintákon. 1. típusú diabétesz mellituszban szenvedo gyermekekben kiszurt cöliákiásokban az intraepiteliális ?? T sejtek meghatározásán kívül metaboliás paraméterek elemzése is történt.
VI.1. TÁPLÁLÉKFEHÉRJE INDUKÁLTA ENTEROPÁTIÁS GYERMEKEK MUKÓZÁJA VI.1.1 Limfonoduláris hiperplázia a duodénum bulbuszában Egy kórkép patomechanizmusának vizsgálatához elengedhetetlen, hogy a tüneteket okozó célszervben végezzük a vizsgálatokat. Például táplékfehérje indukálta enteropátiában (TFIE) a szerológiai vizsgálatok utalhatnak valamilyen szinten az intesztinális történésekre, azonban az újabb vizsgálatok szerint ez a kapcsolat nagyon esetleges
(143).
Nem
véletlen,
hogy
a
táplálékallergia
bélben
történo
patomechanizmusának irodalma nagyon szegényes, hiszen más betegségektol eltéroen (pl. cöliákia, IBD, H. pylori fertozés) biopsziás vizsgálatra ritkábban kerül sor. Vizsgálatunkban szereplo TFIE-ás gyermekekben az endoszkópiánál – egy kivételtol eltekintve – makroszkóposan limfonoduláris hiperpláziát (LNH) észleltünk. A legújabb irodalmi adatok szerint ez az elváltozás táplálékallergiára utalhat (162,163). A közleményeket összefoglalva: az LNH-át mutató TA-ás gyermekek idosebbek, átlagos életkoruk az iskoláskor elejére esik, bélbiopsziás mintájukon rutin szövettani vizsgálatnál boholykárosodást és jelentos gyulladásos infiltrációt nem lehet kimutatni. Ezekben a „késoi reakciótípust” mutató gyermekekben a speciális IgE meghatározáson alapuló vizsgálatok (Prick teszt, RAST) diagnosztikus értéke nagyon csekély (21,22). Az egyik tanulmányban visszatéro, makacs hasfájásról panaszkodó 84 gyermeknél végeztek felso endoszkópiát és a gyermekek 33%-ában tudtak valamilyen TA-át igazolni. Közülük 75%-ban láttak a duodénum bulbuszában LNH-át (164).
70
Természetesen ez nem azt jelenti, hogy a „köldökkólikások” harmada táplálékallergiás, hiszen ez egy igen szelektált beteganyag volt, akiknél endoszkópiás vizsgálatot is indikáltak. Viszont ezek a cikkek felhívják a figyelmet arra, hogy gasztrointesztinális panaszok hátterében (atópiás tünetekkel vagy anélkül) is állhat TA, nemcsak csecsemoés kisdedkorban, de kora iskoláskorban is. Vizsgálatunkban szereplo TA-ás gyermekek ebbe a csoportba tartoztak. A LNH nem újkeletu jelenség a táplálékallergiában: hematokéziával járó allergiás kolitiszben is látható a kolonoszkópiánál. Újabban aspecifikus, foként bal oldali kolitisznál észleltek kifejezett LNH-át a terminális ileumban (165). Ennek jelentosége még nem tisztázott, mindenesetre itt is fokozott ?? T sejt denzitást találtak. Valószínuleg az LNH és a fokozott ?? T sejtdenzitás együttesen a megbomlott orális tolerancia jele lehet. H. pylori fertozésre jellemzo az antrális
noduláris
gasztritisz, amely szintén egy LNH. Utóbbi kórképet a
betegcsoportokban biztonsággal kizártuk.
VI.1.2. Limfociták a mukózában A
rutin
szövettani
mikroszkópos
vizsgálatnál
valamennyi
mintán
normális
boholystruktúrát találtunk, eozinofil infiltráció nélkül. A normális kép ellenére a kezeletlen, frissen diagnosztizált (NDA) gyermekekben fokozott kriptális proliferáció jelentkezett, amely a mélyben nyugvó epitelsejtek kifejezett proliferációs készségét jelzi. Egy kivételtol eltekintve (?? T sejt) valamennyi T és B sejtmarker megoszlása a vizsgált 3 csoportban (NDA, DA és kontroll) hasonló volt. Ez nem meglepo, hiszen a normális boholystruktúra nem feltételezi, hogy a mukóza számottevo celluláris eltérést fog mutatni. Korábbi vizsgálatok a mukózális károsodás foka és a lamina propria CD4, CD8 és HLA-DR+ sejtei között korrelációt igazoltak, vagyis ezek a markerek akkor mutattak kifejezett expressziót, ha a bolyhok struktúrális szerkezete megbomlott (23). Enyhe vagy hiányzó mukózális léziónál viszont ennél részletesebb vizsgálattal mégis igazolhatók bizonyos különbségek. Erre példa a közelmúltban megjelent finn közlemény, ahol 1TDM-ban szenvedo gyermekek normális jejunális nyálkahártyájában kifejezett HLA-DR és -DP expressziót, valamint több ? 4? 7+ limfocitát mutattak ki (166). De erre utal a látens cöliákiásokban a normális boholystruktúra mellett kimutatott ?? T sejtszaporulat, vagy cöliákiás és dermatitisz herpetiformiszban szenvedo betegek
71
elsofokú rokonaiban az ép mukóza mellett megfigyelt Th1 citokinek fokozott jelenléte (53). Bár a csoportok között a T és B sejtmarkerek tekintetében különbséget nem találtunk, a korábban már leírt összefüggések korreláltak az adataimmal. Vagyis az IEL-at zömében CD8+ T sejtek alkotják, a lamina propriában viszont éppen fordítva, a CD4+ T helper sejtek dominálnak. Ennek eredményeként az ép epitéliumban (béllumennel közvetlenül érintkezve) jelen levo CD8+ szupresszor T sejtek az orális toleranciát „muködtetik”, így nem lesz aktív immunválasz. Amikor az epitélium sérül, akkor az idegen partikulumok, patogén baktériumok a lamina propriába jutva az ott domináló CD4+ helper T sejtek közremuködésével már aktív immunválaszt generálnak. VI.1.3. ?? T sejtek fokozott száma az intraepiteliális régióban Vizsgálatunkban a NDA-ások epitéliumában szignifikánsan emelkedett számú ?? T sejtet detektáltunk, mind a diétázó, mind a kontroll gyermekekhez képest. Fontos kiemelni, hogy az NDA-ban a sejtek száma nem érte el a cöliákiában látott, kórosnak tartott 7 sejt/mm értéket, ennek kb. fele volt, bár így is duplája, mint a diétázókban és a kontrollokban. Ennek magyarázata a gyulladás, illetve az immunválasz enyhébb foka lehet. Ezek alapján a vékonybél kezdeti szakaszán észlelt kórosan magas (7 sejt/mm) ?? T sejtek jelenléte továbbra is a cöliákia sajátossága. Cöliákiában a ?? T limfocitáknak fontos diagnosztikus szerepük van, hiszen számuk a gluténmentes diéta ellenére is magas marad, bár a diéta bevezetésével számuk valamelyest csökken (167). A ?? T sejtek csoportosulása jól ismert cöliákiában, bár nem kizárólag csak erre a kórképre jellemzo. Leírták jelenlétüket kolitisz ulcerózában, reumatoid artritiszes szinoviumban, leprában, leishmániázisban és számos daganatos elváltozásban is (168,169). Ezek a sejtek fontosak az orális tolerancia szabályozásában is, továbbá, amennyiben az ? ? T sejtek száma csökken, azokat "vészhelyzetben" helyettesíthetik. A ?? T sejtek – ellentétben az ? ? TCR-t hordozó T sejtekkel – képesek MHC II restrikció nélkül, közvetlenül felismerni az adott antigént. Ebben a folyamatban stressz által indukált (pl. heat shock protein-65) „nem MHC II markerek” (pl. MIC-A és –B, CD1d) felismerése révén vesz részt (170,171). Nagyon érdekes megfigyelés, hogy tehéntej indukálta enteropátiában a duodenális mukózában fokozódik az elobb említett CD1d expressziója, amely diéta hatására normalizálódik (171). Különleges képességüket
72
bizonyítja, hogy a ?? T sejtek számos citokint termelnek (IL-4, IL-5, IL-13, IFN-?), továbbá fokozzák a B sejt IgE termelését. Fontos megfigyelés, hogy a CD8+ ?? T sejtek allergiás indukcióra heves IFN-?
szekrécióval válaszolnak, amely a B sejt IgE
termelését gátolja. A fenti adatok arra utalnak, hogy ezek a speciális sejtek mind a két fajta T helper irányba tudnak mozdulni, a kiváltó allergéntol és immunmilliotol függoen. Atópiás kórképekben betöltött szerepére utal, hogy allergiás rinitiszben a nazális mukózában levo ?? T sejtek számaránya a normális 5-10%-ról 25-30%-ra emelkedik. Érdekes adat, hogy a nazális mukóza ?? T-sejtjei egyben a CD4 markert is hordozták és Th2 citokint (IL-4 és IL-13) termelnek, míg ugyanannak a betegnek perifériás vérébol kimutatott ?? T sejtek CD8 pozitívak voltak, Th1 citokin (IFN-?) mintázattal (173). Vizsgálatunk eredményével teljesen megegyezett az a közelmúltban megjelent közlemény, ahol a ?? T sejtek fokozott számban jelentek meg TA-ás gyermekek mukózájában, azonban sohasem olyan nagy számban, mint amely cöliákiában elofordul (164). Ezek az eredmények a ?? T sejtek fontos szerepére utalnak TA-ban is.
VI.1.4. Th1 dominancia a táplálékallergiás gyermekek mukózájában A T sejtek által felerosített immunaktiváció nagymértékben attól függ, hogy milyen proinflammációs citokineket szecernálnak. Általánosságban elmondható, hogy a hiperszenzitív kórképekre (asztma bronchiale, rinitisz allergika) a Th2 citokin mintázat jellemzo (174). Atópiás dermatitiszben is megnövekedett IL-4 és csökkent IFN-? szintet mutattak ki (175). A TA ebbol a szempontból jóval ellentmondásosabb. Ételallergiások perifériás vérébol nyert mononukleáris sejtjeit stimulálva egyesek emelkedett IL-4 és csökkent IFN-? szekréciót találtak (Th2 válasz), míg mások fokozott IFN-? termelodést (Th1 mintázat) (176). Az allergiások szérumából nyert stimulációs kísérletek adatai szerint azonnali, IgE mediált kórképekben Th2, késoi reakciót mutató enteropátiára pedig inkább Th1 citokin mintázat a jellemzo. Mindazonáltal a patomechanizmus szempontjából fontosabb annak az ismerete, hogy milyen folyamatok játszódnak le az allergénnel történt találkozás helyén: a bélnyálkahártyában. Akut, IgE mediált TA-ás gyermekek mukózájában a fokozott IL-5 expresszió (145), allergiás eozinofil enteropátiában pedig a magasabb IL-13 jelezte a Th2 dominanciát (144). Késoi típusú, nem IgE mediálta enteropátiával
73
kapcsolatban (citokina nalízis) egyetlen közleményt találtunk az irodalomban. Hauer és mtsai tejallergiások vérében és vékonybél-biopsziás mintáiban jelentosen emelkedett számú IFN-? szekretáló sejteket mutattak ki (ELISA módszer), és döntoen ennek tulajdonították a Th1 típusú "késoi típusú" tehéntej-indukálta enteropátia kialakulását (45). Ez az adat korrelál az általunk kimutatott IFN-? jelezte Th1 dominanciával, hiszen a frissen diagnosztizált TA-ás gyermekek lamina propriájában jelentosen nagyobb számban mutattunk ki (fehérje- és mRNS szinten is) IFN-?+ sejteket. Ez sejt mediált, késoi típusú immunreakció jelenlétére utal. Az immunhisztokémiai (fehérje) és in situ hibridizációs (mRNS) módszerrel meghatározott citokinértékek pontosan nem egyeztek meg. Ennek okaként az adott idopillanatban különbözo mértékben zajló szintézis-fázis (mRNS: transzkripció, fehérje: transzláció) és a sejten belüli poszttranszlációs modifikációk állhatnak (87,88). A citokint szecernáló sejtek feltehetoen olyan Tblasztok, amelyek a kérdéses antigénnel a Peyer-plakkokban szenzibilizálódtak, és a továbbiakban a megfelelo "homing" receptor segítségével térnek vissza a mukózába. Az IFN-gammát szekretáló sejtek szignifikáns jelenlétét cöliákiában és Crohn betegségben is leírták, mindkét kórképben bizonyítva, hogy részben a Th1 típusú hiperszenzitivitás felelos a mukózális károsodás kialakításáért (127,128). Vizsgálatomban a táplálékallergiások fokozott HLA-DR expressziót mutattak, mely leginkább az NDA csoportban a lamina proriában és a proliferáció szempontjából fontos kriptális régióban mutatkozott meg. A fokozott HLA-DR aktivitás jól ismert következménye az IFN-? szekréciónak. TA-ás gyermekek duodenális mukózájában végzett citokinmeghatározással kapcsolatos legújabb közlemény csökkent TGF-? válaszról tudósít a kontrollhoz képest (146). Ez bizonyítja azt a korábbi feltevést, hogy TA-ban az orális tolerancia megszunéséért nemcsak az általam is igazolt a Th1/Th2 arány megváltozása, hanem a szupresszív citokinnak (TGF-? ) csökkenése is okolható. A gabonaallergiás betegeknél fölmerülhet differenciáldiagnosztikai szempontból az a kérdés, hogy vajon nem látens cöliákiában szenvednek-e? Látens cöliákiában még szintén nem látunk boholykárosodást, de magasabb lehet az IFN-?, a ?? T sejtek száma és nagyobb a HLA-DR expresszió (53). Ezek olyan paraméterek, amelyeket én is kimutattam, ráadásul a beteganyag egy része gabonaallergiás volt. Ennek ellenére látens cöliákia náluk azért nem valószínu, mert egyrészt nem tudtam kimutatni fokozott CD3,
74
CD25 és ICAM-1 expressziót, másrészt az LNH jelenléte nem jellemzo a cöliákia kezdeti formájára, továbbá valamennyi betegnél az EMA negatív volt.
VI.1.5. Adhéziós molekulák mukózális expressziója Annak ellenére, hogy a fokozott ICAM-1 expressziót a látens cöliákia még normális struktúrájú mukózájában és más hiperszenzitív kórképek biopsziás mintáin sikerült kimutatni, jelen vizsgálatomban nem észleltem az ICAM-1 megváltozását. Ez az eredmény egyébként megegyezik az ezzel kapcsolatos egyetlen publikált vizsgálat eredményével, ahol TA-ás gyermekek duodenális mukózájában az ICAM-1 expresszója a kontrollokéval egyezett (154). Érdekes, hogy az intraepiteliális régióban egyik vizsgált mintán sem tudtam kimutatni ICAM-1 festodést. Ez arra utal, hogy az ezzel a szuperglobulinnal történo kostimulációs jelátvitel a lamina propriára korlátozódik, annak is a felszínhez közeli, szubepiteliális régiójára. Az ICAM-1 ligandpárja, az LFA-1 szerepét TA-ás állatmodellen már vizsgálták (177). Ebben az egérmodellben az allergén hatására kriptaproliferáció és a lamina propriában LFA-1+ T sejtek akkumulációja látható. Az általam vizsgált adhéziós molekulákat (LFA-1, ? 4? 7, MAdCAM) humán TA-ás mukózán legjobb tudomásom szerint még nem elemezték. Kezeletlen TA-ás gyermekek lamina propriájában az LFA-1+, az intraepiteliális régiójában pedig az ? 4? 7+ sejtek másfélszer nagyobb számban jelentek meg a diétát már folytatókhoz és a kontrollokhoz képest. Hangsúlyozni kell, hogy az elobb említett megfigyelések csak tendenciák, szignifikáns különbségeket nem tudtam kimutatni, így messzemeno következtetéseket ezekbol az eredményekbol nem lehet levonni. Ennek alapján még inkább indokolt, ho gy a jövoben egyéb adhéziós molekulákat is vizsgáljanak a TA-ások mukózájában. Elsosorban a különbözo kemokinek jönnek szóba a legfrissebb állatkísérletek „limfocita- homing” eredményei alapján (178). Mivel TA-ás felnotteknél szignifikánsan fokozott ICAM-1 és ? 4? 7 expressziót mutattam ki, a témakört késobb még részletesen ott diszkutálom (VI.2.3.).
75
VI.2. TÁPLÁLÉKFEHÉRJE INDUKÁLTA ENTEROPÁTIÁS FELNOTTEK MUKÓZÁJA Táplálékallergiás felnottek endoszkópiás vizsgálatánál makroszkóposan nem láttunk LNH-t. A rutin szövettani vizsgálatnál – a gyerekkorihoz hasonlóan - itt sem mutatkozott sem boholykárosodás, sem eozinofilia, azonban az immunhisztokémiai eljárások kifejezett különbségeket fedtek föl. A normális villus jelenléte nem meglepo felnottkori TA-ban sem. Ro senkrants vizsgálatánál az ép jejunális mukózában immunhisztokémiai eljárással sikerült IgE tartalmú nyiroksejteket kimutni (25). Az ép boholystruktúra oka lehet az elváltozás foltos elhelyezkedése („patchy lesion”) vagy az elváltozás enyhe foka is. A gyermekkori TA-hoz hasonlóan itt is fokozott kriptális proliferációt mutattam ki, amely az epiteliális sejtek megnövekedett „turn-over”-ére utal.
VI.2.1. Intesztinális mukóza sejtes összetevoi A TA-ás felnottek lamina propriájában szignifikánsan fokozott CD4+ és HLA-DR+ sejteket detektáltunk, mely szintén az antigénprezentáció fo helyszínén zajló immunaktivációra utal. A gyermekkori TA- hoz hasonlóan itt sem találtam az IgA és alosztályai vonatkozásában különbséget. Annak ellenére, hogy az IgA és alosztályai (IgA1 és IgA2) funkcionálisan hasonlóak, gyulladásos bélbetegségben fokozott IgA1 szekréciót írtak le, elorevetítve annak a lehetoségét, hogy más gasztrointesztinális, illetve allergiás kórképekben esetleg a normálistól eltéro megoszlást észlelhetünk. IgA tartalmú plazmasejtek száma cöliákiában sokszorosa az egészségesekben található értékeknek. Az IgA plazmasejtek legsurubben közvetlenül a felszíni epitélium alatt helyezkednek el. Kezeletlen cöliákiásokban az IgA2 alosztályt termelo sejtek száma nagyobb arányban növekszik, mint az IgA1 plazmasejteké (91). Ezen adatok ellenére vizsgálataim nem mutattak számottevo eltérést, amit az magyarázhat, hogy az elobb említett IBD-ben és cöliákiában a citokinkaszkád okozta immunaktiváció és mukózális károsodás jelentosen meghaladta az áltam vizsgált enyhe fokú nyálkahártya-léziót.
76
IV.2.2. IFN-? és IL-4 expressziója a táplálékfehérje indukálta enteropátiás felnottek lamina propriájában A TA-ás felnottek lamina propriájában másfélszer több IL-4+ sejtet és valamivel kevesebb IFN-?+ sejtet detektáltam a kontrollhoz képest. Bár a különbség nem volt szignifikáns, egyértelmuen fordított a kép a táplálékallergiás gyermekekben kimutatott eredményeimhez
képest.
Ez
az
adat
megegyezik
a
TA-ás
felnottek
citokinmeghatározását analizáló egyetlen tanulmány eredményével, ahol a duodenális mukózában szintén a Th2 mintára utaló fokozott IL-4/IFN-? arányt igazoltak (143). Ebben a svéd tanulmányban egy nagyon izgalmas eredmény is olvasható: annak ellenére, hogy a specifikus IgE nem volt kimutatható a szérumban és a betegek túlnyomó többségében a Prick teszt is negatívnak bizonyult, a TA-ás betegek bélbiopsziás mintáiban fokozott IgE tartalmú sejteket találtak, mely elváltozás a bevezetett diéta hatására normalizálódott. Így bármilyen kérdéses paramétert vizsgálva a szérumban, egyáltalán nem biztos, hogy az allergénnel történo tényleges találkozás helyén – a bélben- ugyanazt találjuk. Mindamellett TA-ás felnottek perifériás vérének citokinanalízise a kontrollhoz képest hétszer magasabb IL-4 produkciót jelzett (179). A Th2 sejtek a STAT6 szignál transzdukció útján fejtik ki hatásukat (180). Ez az adat is arra utal, hogy a kórkép patomechanizmusában az IL-4 fontos tényezo, hiszen ismert, hogy a jelátvitel során a STAT6-ot az IL-4 aktiválja (181). Az IL-4 legfontosabb forrása a CD4+ T limfocita. Ez összhangban áll vizsgálataink adataival, ahol emelkedett számú CD4+ sejtet és fokozott IL-4 expressziót találtunk, fokozott HLA-DR denzitással, amely immunmediált folyamat jelenlétére utal. VI.2.3. Fokozott ICAM-1 expresszió a lamina propriában Táplálékallergiás felnottek bélmukózájában legjobb tudomásom szerint nem történt eddig semmilyen adhéziós molekula vizsgálata, annak ellenére, hogy jelentoségükre számos állakísérletes eredmény és atópiás kórképben szerzett tapasztalat utalt. Az ICAM-1 szuperglobulin nagyobb expresszióját igazolták számos hiperszenzitív kórkép biopsziás mintáin is (atópiás dermatitisz: bor, allergiás rinitisz: nazális nyálkahártya, asztma bronchiale: bronchiális mukóza). Nagyon érdekes az a megfigyelés, hogy atópiás dermatitiszben a látszólag érintetlen, épnek tuno borben is már kimutatható a fokozott ICAM-1 reakció (182). Ez arra utal, hogy még a kifejezett celluláris infiltráció és szöveti destrukció elott az ICAM-1 az induló immunaktivációnak egy érzékeny
77
markere lehet. Ugyanezt a gondolatmenetet erosíti az a megfigyelés, miszerint látens cöliákiában ennek az adhéziós molekulának az expressziója még a kifejezett villuskárosodás elott fokozódik (24). A közelmúlt egyik fontos megfigyelése volt, hogy Crohn betegségben az ICAM-1 és a MAdCAM expressziója egyaránt fokozott (157). Vizsgálatomban a TA-ás felnottek duodenális mukózájában a vizsgált adhéziós molekulák közül a MAdCAM és az LFA-1 expressziója változatlan, az ICAM-1 festodése viszont jelentosen fokozott volt a néhány órás terhelést („short food challenge”) követoen. Ezek az adatok arra utalnak, hogy rövidebb ideig tartó antigén terhelés (esetünkben 1.5-26 óra, átlagosan 5 óra) inkább az ICAM-1, mint a MAdCAM vagy a VCAM-1 fokozott expresszióját okozza. Másfelol 1TDM-ban szenvedok látszólag normális mukózájában nagyobb ICAM-1 aktivitást változatlan VCAM-1 expresszóval írtak le (104). Ezek az adatok arra utalnak, hogy a T és B sejtek bélmukózába történo hazatérésében (intesztinális homing) az ICAM-1-nek fontos szerepe lehet. Az adott adhéziós molekula fokozott expressziójának megjelenése mindig szekunder jelenség, valamilyen citokin- hatás következménye. Milyen citokin okozhatja a megfigyelt ICAM-1 növekedést? Legvalószínubb válasznak a TNF-? tunik. A TA-ás betegeink nagy részénél (7/10) a kérdéses antigénnel végzett Prick teszt pozitívnak bizonyult, továbbá a relatíve rövid ido alatt pozitívvá váló terhelés alapján a masztociták szerepe nagymértékben valószínusítheto. Ismert adat, hogy a masztocita jelentos forrása a TNF-? -nak, amely a vaszkuláris epitelen ICAM-1 expressziót indukál (183). A kérdéses citokin másik celluláris forrása az intesztinális epitel is lehet, hiszen ez a régió ismert egyrészt számos citokin szekréciójáról, másrészt az MHC II expresszióról. Mindkét ténye zo fontos az antigén prezentáció és az adhéziós molekula expressziója szempontjából (44). Harmadik lehetséges forrásként a lamina propria mononukleáris sejtjei is szóba jöhetnek, annál is inkább, mert a CD4+ T helper sejtek aggregációját észleltük a TA-ás felnottek ezen régiójában.
VI.2.4. Limfocita homing receptor (? 4? 7) expressziója a mukózájában A biopsziás mintákon végzett immunhisztokémiai vizsgálat során TA-ás felnottek intraepiteliális régiójában szignifikánsan fokozott ? 4? 7 expressziót találtunk a
78
kontrollhoz képest. Hasonló tendenciát észleltünk ennek az integrinnek a lamina propriában történo megjelenésében, bár a különbség nem volt szignifikáns. Az ? 4? 7
integrin a nyiroksejtek ún. hazatérésért felelos (homing) receptora, a
MAdCAM szuperglobulinnal történo kapcsolódása teszi lehetové, hogy a limfociták az intesztinális mukóza érfalán átlépve megjelennek a bélnyálkahártyában. A CD4 memóriasejtek különösen nagy számban jelenítik meg az ? 4? 7 integrint. Ennek az adhéziós molekulának a kulcsszerepét mutatja az a kísérlet, melyben tejfehérje-allergiás gyermekek limfocitáit béta- laktoglobulinnal stimulálva az ? 4? 7 szignifikánsan nagyobb számban jelent meg rajtuk. Ennek az integrinnek az expressziója szelektívnek bizonyult, mivel sem az ? 4? 1 sem az ? E? 7 nem volt emelkedett a tejfehérje-allergiások limfocitáin (184). Az ? 4? 7 homing receptort hordozó sejtek döntoen T helper sejtek, az integrin expresszióját rotavírus fertozés is fokozza (185). Érdekes az a tanulmány, amelyben egészséges önkénteseket ugyanazzal az antigénnel (hemocianin), de különbözo úton (per os vs. parenterális) immunizáltak. Az immunizáció után az ? 4? 7 expressziója szignifikánsan akkor volt fokozott, amikor a hemocianinnal történt szenzibilizáció orális úton történt (186). Kantele és mtsai kimutatták, hogy amennyiben az antigénnel történo találkozás a bélmukózában történik, akkor a B sejtek mukózális recirkulációja szintén az ? 4? 7 homing receptor segítségével történik (187). Ugyanez a munkacsoport állapította meg, hogy amikor ugyanazt az antigént orálisan illetve parenterális úton juttatják be a szervezetbe, akkor a per os bevitt csoportban a perifériás vérben jelenlevo mononukleáris sejtek a felszínükön jóval nagyobb arányban jelenítik meg az ? 4? 7 ligandot (188). Ezen vizsgálatok tehát azt bizonyítják, hogy az antigénnel történo találkozás helye (béltraktus) határozza meg a limfociták felszínén expresszálódó homing receptort (? 4? 7), melynek segítségével a nyiroksejtek a szenzibilizáció után visszatérnek a mukózába. Vizsgálataink is ezt a teóriát erosítik, hiszen TA-ás felnottek duodenális mukózájában emelkedett számú ? 4? 7
limfocitákat találtunk, melynek
alapján ennek az adhéziós molekulának fontos szerepe lehet az immunkompetens sejtek „homing” folyamatában és a következményes klinikai tünetek megjelenésében.
79
VI.2.5. Miért nem egyeznek meg teljesen a késoi típusú TA-ás gyermekek és felnottek duodenális mukózájában kimutatott eltérések? Vizsgálatainkban a táplálékallergiás gyermekek és felnottek a késoi típusú hiperszenzitív csoportba sorolhatók, hiszen legalább egy óra telt el a táplálék elfogyasztása és a klinikai tünetek megjelenése között. Azonban a nyilvánvaló életkori különbségeken kívül további eltérések is felfedezhetok. Egyrészt a provokációs ido a felnotteknél rövidebb volt, mint a gyermekeknél (5 óra vs. 5 nap), másrészt itt az eliminációs diéta utáni terhelést követoen történt a biopsziás mintavétel, továbbá a felnotteknél jóval gyakoribb volt a speciális IgE jelenléte. Utóbbi tényezovel magyarázható, hogy a gyermekkorival ellentétben nem sikerült fokozott Th1 dominanciát kimutatni, hiszen itt az IgE mediált történések a Th2 irányt erosítik. Az ICAM-1 típusos indukciós adhéziós molekula, nem véletlen, hogy a megvonást követo gyors visszaterhelés után (felnottek) találtam csak fokozott expressziót. A gyermekkori kezeletlen TA-nál már egyértelmu Th1 mintázatot észleltem, amely a speciális diéta mellett visszatért a normál szintre. Mind a gyermekkori, mind a felnottkori TA-ások duodenális mukózájában - annak ellenére, hogy a rutin szövettani vizsgálattal nem találtunk boholykárosodást - fokozott proliferációs aktivitás és immunaktiváció jegyei mutatkoztak. Vizsgálataim alapján az ? 4? 7 adhéziós molekula jelentosége az intesztinális homing folyamatában fontosnak tunik.
VI.3. CÖLIÁKIA A cöliákia patomechanizmusa teljes egészében még nem ismert, de azt tudjuk, hogy genetikailag
fogékony
egyénben
a
táplálékkal
elfogyasztott
glutén
hatására
szenzibilizált T limfociták által mediált kóros celluláris és humorális immunfolyamatok lépnek fel a vékonybél- nyálkahártyában. A kórképpel kapcsolatban két vizsgálatot végeztünk. Egyrészt a gyermekkori késoi típusú táplálékallergiásokhoz hasonlóan az IFN-? és az IL-4 in situ hibridizációs vizsgálatot cöliákiás gyermekek duodenális mukózájában is elvégeztük. Másik
vizsgálatunkban
az
egyes
típusú
diabétesz
mellituszban
a
cöliákia
prevalenciájának meghatározása mellett immunhisztokémiai módszerrel detektáltuk az intraepiteliális ?? T sejteket olyan cukorbeteg gyermekek mukózájában, akik silent vagy látens cöliákiában is szenvedtek.
80
Ezenkívül azt is elemeztük, hogy a diabéteszes gyermekekben a cöliákia igazolása után bevezetett gluténmentes diéta hogyan befolyásolta a glikémiás kontrollt és az inzulinszükségletet. VI.3.1. Az IFN-?
és IL-4 expressziója cöliákiás gyermekek duodenális
mukózájában Frissen diagnosztizált cöliákiás gyermekek duodénumának lamina propriájában egyaránt fokozott IFN-? és IL-4 expressziót detektáltam. Korábbi vizsgálatok alapján kezeletlen cöliákiások bélbiopsziás mintáiban történt Th1 és Th2 típusú citokinek vizsgálatai ellentmondó eredményt mutattak. Az elso vizsgálat azzal a meglepo eredménnyel járt, hogy a cöliákiásokban háromszor alacsonyabb volt az IFN-? expresszió, mint a kontrollokban. Ennek az lehetett az oka, hogy ekkor még poliklonális antitesteket használtak, továbbá az extracelluláris tér nem membránho z kötött citokinjeit is számításba vették (189). A továbbiakban már nagyobb pontosságú módszert alkalmazva (monoklonális antitestek, in situ hibridizáció) Th1 dominanciáról (fokozott IFN-?) számoltak be a közlemények (190-193). Egy vizsgálatban makrofág eredetu (TNF-? , IL-6, IL-8) és Th2 asszociált citokinek (IL-4 és IL-5) fokozott intesztinális expressziójáról számoltak be (194). A témával kapcsolatban nagyon érdekes megfigyeléseket közölt az egyik legfrissebb közlemény, ahol kezeletlen cöliákiás gyermekek jejunális mukózájában emelkedett IFN-? és IL-10 szintet detektáltak (195). Az utóbbi elso pillanatban furcsának tunik, hiszen egy downregulációs citokinrol van szó, bár az IL-10 proinflammációs hatással is rendelkezik: IL2-vel együtt a CD8+ T sejt IFN-? produkcióját fokozza (196). Ez az adat is arra utal, hogy a Th1 és Th2 felosztás mesterkélt, a bélben zajló immunológiai történések nem egyszerusíthetok le Th1 és Th2 dominanciára, még abban az esetben sem, amennyiben a T regulációs sejteket is számításba vesszük. A közlemény további fontos adata, hogy kezelt, gluténmentes diétán lévokben is - bár kisebb mértékben, mint az aktív cöliákiában - még emelkedett a kontrollhoz képest az IFN-? szint. A szerzok összehasonlították a kezeletlen, frissen diagnosztizált cöliákiások citokintermelését az eloször diétázó, majd gluténterhelt betegekével. Gondolhatnánk azt, hogy a két mintázat hasonló lesz, hiszen mindkét csoport cöliákiás, akiket gluténnel terhelnek. Azonban a terhelés idotartama más volt, ez az oka annak, hogy a rövidebb gluténexpozíció magasabb IL-2 szinttel járt, mint a frissen diagnosztizált cöliákiásokban (195). Ez az
81
eredmény szintén utalhat a táplálékallergiás gyermekeknél és felnotteknél általam észlelt különbözo adatokra, hiszen a felnotteknél rövid terhelés után, az NDA gyermekeknél viszont frissen diagnosztizált állapotban történt az analízis. Összességében a témával kapcsolatban csak csekély számú közleményt publikáltak, melyek között olyannal is találkozunk, amely nemcsak az IFN-?, hanem az IL-4 fokozott expressziójáról is beszámol. Ez megegyezik az általam kimutatott adatokkal. Egyáltalán nem meglepo, hogy a Th1 és a Th2 citokinek együttesen megjelennek a cöliákiások bélnyálkahártyájában, hiszen az IFN-? kulcsszerepet tölt be a permeábilitás növekedésében, a szöveti destrukcióban, a sejt- mediálta immunválasz kialakításában és felerosödésében. Másrészt a lamina propriában megjeleno plazmasejtek immunglobulin termelodéséért döntoen az IL-4 a felelos (Th2 citokin). Pontosan ennek a következménye a cöliákia felismerésében fontos szurovizsgálatnak számító EMA és a TG elleni ellenanyag megjelenése, melyek termelésében szintén meghatározó az IL-4.
VI.3.2. Az 1TDM és a cöliákia Eredményeim alapján az 1TDM-ban szenvedo gyermekekben a cöliákia prevalenciája hazánkban magas. Ennek hátterében a betegek magasabb életkora és a két betegség felismerése közt eltelt hosszabb ido állhat, hiszen ekkor a glutén expozíciója is hosszabb ideju. Ezt támasztják alá azok az adatok is, amelyek 1TDM-os felnottek felmérése alapján születtek: itt is magasabb cöliákia prevalenciáról számoltak be (105,107). Egészséges gyermekekben a különbözo szurovizsgálatok 0.33-1.3%-os prevalenciát mutattak (198,199). Ennek értelmében a mi betegeink között hatszor gyakoribbnak bizonyult a silent cöliákia megjelenése, még akkor is, ha a viszonyításhoz a magasabb értéket vesszük. Az általunk vizsgált diabéteszes és cöliákiás gyermekekben a lisztérzékenységre jellemzo típusos tünetek egyáltalán nem jelentkeztek. Ez összhangban áll azokkal a korábbi megfigyelésekkel, ahol az 1TDM-ben a cöliákia silent formáját figyelték meg (200,201). Az elmúlt évtizedekben a cöliákia tünettana megváltozott, súlyos malabszorpcióval, növekedésbeli elmaradással egyre ritkábban találkozunk (202). A komoly tünettel nem járó, de boholykárosodást már mutató „csendes” (silent) forma viszont egyre gyakrabban kerül felismerésre, ez a jellemzo 1TDM-ban is. Hasonló a helyzet a látens formával is, azzal a lényeges különbséggel, hogy a diagnózis jóval
82
nehezebb, hiszen a rutin szövettani vizsgálat normális boholyszerkezetet mutat. Finomabb eltérések viszont már ekkor, a boholykárosodás elott kimutathatók, így az emelkedett számú intraepiteliális ??? T sejtek jelenléte, mint a „mukóza testorei” elore jelzik az eljövendo mukózális károsodást (203,204). Ezen intraepiteliás T sejtek pontos szerepe cöliákiában nem ismert, de tudjuk azt, hogy a károsodott mukózális sejtek által expresszált hosokk-fehérjék közvetítésével ezek a sejtek vesznek részt az epitelsejtek eliminációjában (206,207). Vizsgálataink szerint a 7 EMA pozitív, de normális boholystruktúrát mutató 1TDM-os gyermek között 5 esetben detektáltunk emelkedett számú ??? T sejtet, jelezve a látens cöliákiát. Ezen sejtek száma az EMA pozitív gyermekek 2 csoportjában (boholyatrófia ill. normális nyálkahártya) egymástól nem különbözött. Ez a megfigyelés korrelál azokkal a korábbi tanulmányokkal, ahol kimutatták, hogy ezek a sejtek cöliákiában tartósan nagyobb számban vannak jelen. Így számuk még akkor is magas marad, amikor a beteg már gluténmentes diétát folytat (43). Eredményeink alapján úgy gondoljuk, hogy a pozitív EMA boholyatrófia nélkül is jelezhet korai lisztérzékenységet, amely csak késobb okozna tünetet és rutin szövettani vizsgálattal kimutatható nyálkahártyaelváltozást. Ennek értelmében álpozitív EMA eredményrol akkor van szó, ha érzékenyebb módszerekkel (pl. immunhisztokémia) sem sikerül mukózális elváltozást a bélbiopsziás mintán kimutatni. A rektális mukózára helyezett glutén a cöliákiás, vagy cöliákiára hajlamos egyénben CD3 és ?? T sejtszaporulatot okoz. Ez az összefüggés a legújabb adatok szerint 1TDMben szenvedo betegekre is igaz. Troncone vizsgálatai szerint az 1TDM-ben szenvedok 20%-a kórosan válaszol a rektális gluténterhelésre (208). Növekedési elmaradás olykor elofordul cöliákia és 1TDM együttes jelenlétekor (209), azonban a mi felmérésünkben a kettos betegségben szenvedokben nem volt növekedési elmaradás, hasonlóan más kutatások eredményéhez (210). Másokhoz hasonlóan mi sem találtunk kedvezo metabolikus hatást a gluténmentes étrend bevezetését követoen (94,100,202,). A HbA1c szintje gluténmentes étrenden nem változott, bár ezek az értékek a diétás változtatás elott sem voltak a kóros tartományban. Az irodalomban ellentmondó adatokat közöltek a gluténmentes étrend alatti inzulin igényrol, eredményünkhöz hasonlóan egyesek növekvo inzulin szükségletrol számoltak be (211-213), míg mások nem találtak ilyen összefüggést (214). Cöliákiában és 1TDMban egyaránt szenvedokben a gluténmentes étrenden megfigyelt magasabb inzulinigény
83
oka lehet az, hogy a teljes mukózális integritás visszaállításakor javul a tápanyagok felszívódása. Amennyiben a cöliákiát nem kezeljük az adekvát diétával, akkor az oszteoporózis, daganatos elváltozás és infertilitás gyakorisága no (215-217). Látens cöliákia is összefüggésbe hozható malignus limfóma és más tumorok elofordulásával, és valószínusítheto, hogy a megnövekedett rizikó a gluténmentes étrenddel csökkentheto (218). Jelen munkánkban egy olyan látens cöliákiás gyermeket kórisméztünk, akinél a hipotrófia és a rossz anyagcsere kontroll miatt bevezettük a gluténmentes étrendet. Ez a diéta javította a metabolikus eltérést és szignifikáns súlygyarapodást okozott. Saját megfigyeléseink és az irodalomban található adatok is arra utalnak, hogy 1TDMben a cöliákia rendszeres szurése rendkívül nagy gyakorlati jelentoséggel bír.
84
VII. AZ ÉRTEKEZÉS FOBB MEGÁLLAPÍTÁSAI ÉS AZOK GYAKORLATI ALKALMAZÁSA
1. Táplálékfehérje indukálta enteropátiás gyermekek mukózájának rutin szövettani vizsgálatánál normális boholystruktúrát találtunk, viszont érzékenyebb módszerekkel immunaktiváció jeleit sikerült kimutatni. A kezeletlen TA-ás gyermekek lamina propriájában fehérje- és mRNS szinten is IFN-? dominanciát láttunk, amely valószínuleg a felelos citokin az immunaktivációs jegyekért. Az ép boholyszerkezet ellenére a még nem diétázó TA-ás gyermekek fokozott kriptaproliferációt és HLADR expressziót mutattak, továbbá az intraepiteliális ?? T limfociták denzitása magasabb volt. A kimutatott eltérések túlnyomó része - az IFN-? csökkenésével párhuzamosan - a kezelt, diétát folytatókban már a kontrollokhoz hasonló volt. A látott kép részben emlékeztet a cöliákia kezdeti stádiumára, a látens fázisra, azonban az észlelt immunhisztológiai eltérések segítségével attól könnyen elkülönítheto. Érdekes megfigyelés a TA-ás gyermekek duodenumában észlelt limfonoduláris hiperplázia, amely a magas ?? T sejtszámmal együtt az orális tolerancia csökkenésére utal. Ebbol az eredménybol levonható az a konklúzió, hogy amennyiben felso endoszkópiás vizsgálatnál látjuk a limfonoduláris hiperpláziát, akkor gondoljunk táplálékallergia lehetoségére, még akkor is, ha a rutin szövettani vizsgálat normális, sem boholykárosodás, sem eozinofil infiltráció nem észlelheto. Jelenleg az endoszkópiás eljárás invazív, de a kapszuláris endoszkópia (wire-less endoscopy) szélesköru alkalmazásával - mely már hazánkban is elérheto – a vizsgálat lényegesen könnyebben kivitelezheto lesz.
2. Táplálékfehérje indukálta enteropátiás felnottek struktúrálisan normális duodenális mukózájában - a gyermekekéhez hasonlóan - immunaktiváció jelei mutatkoztak, amit a fokozott kriptális proliferáció, a HLA-DR+ és CD4+ T sejtek nagyobb számaránya jelzett. A lamina propriában megjeleno fokozott ICAM-1 expresszió egyrészt a nagyobb méretu antigénprezentációra (kostimulációs szignál), másrészt
a
fokozott
extravazációra
utalhat.
Az ICAM-1
mellett
kimutatott
szignifikánsan emelkedett számú ? 4? 7 homing receptort hordozó sejtek azt jelzik, hogy ezek az adhéziós molekulák a TA-ban fontos szerepet kapnak (limfocita „homing”). A
85
táplálékallergiás gyermekekben megfigyelt azonosságok mellett a felnotteknél a vizsgált két citokin tekintetében különbséget találtam (IL-4 dominancia). Ennek hátterében az életkori eltérések mellett egyéb tényezok, így az allergén expozíció és a mintavétel ideje, valamint a provokáció eltéro dinamikája is állhat. A kimutatott azonosságok és különbségek éppen az immunológia történések sokszínuségét igazolják. Eredményeim gyakorlati jelentosége egyrészt az, hogy az immunhisztokémiai eljárással kimutatott eltérések segítenek a normális szövettani kép ellenére felismerni a mukózában zajló immunológiai történéseket, melyek egy adott kórképre jellemzoek. Másrészt az adhéziós-, proliferációs- és citokinmintázat feltérképezése nemcsak a betegség patomechanizmusára ad információt, hanem a jövoben diagnosztikus, és akár terápiás konzekvenciával is járhat.
3. Frissen diagnosztizált cöliákiás gyermekek duodenális mukózájában in situ hibridizációs módszerrel egyaránt fokozott IFN-? és IL-4 expressziót detektáltam. Ez nem meglepo, hiszen az IFN-? kulcsszerepet tölt be a permeábilitás növekedésében, a szöveti destrukcióban, a sejt- mediálta immunválasz kialakításában és felerosödésében. Másrészt a lamina propriában megjeleno plazmasejtek immunglobulin termeléséért döntoen az IL-4 a felelos (Th2 citokin). Pontosan ennek a következménye a cöliákia felismerésében fontos szurovizsgálatnak számító EMA és a TG elleni ellenanyag megjelenése, melyek termelésében szintén meghatározó az IL-4.
4. Az 1. típusú diabétesz mellituszban szenvedo gyermekekben a cöliákia prevalenciája vizsgálataink alapján magas (11.7%). Az EMA vizsgálattal kiszurt 24 gyermek közül 17 esetben (8.3%) találtunk szubtotális boholyatrófiát a jejunális mukózában. Ezek a gyermekek a „csendes” (silent) cöliákia csoportjába sorolandók, hiszen egyikük sem jelzett klinikai tünetet. A másik hét gyermeknél a bélmukóza a rutin szövettani vizsgálatnál nem mutatott boholyeltérést, de ötnél detektáltunk emelkedett számú ??? T sejtet, jelezve a látens cöliákiát. Eredményeink alapján úgy gondoljuk, hogy a pozitív EMA boholyatrófia nélkül is jelezhet korai lisztérzékenységet, amely csak késobb okozna tünetet, és rutin szövettani vizsgálattal kimutatható nyálkahártya elváltozást. Ennek gyakorlati következménye, hogy álpozitív EMA csak akkor
86
mondható ki, ha érzékenyebb módszerekkel (pl. immunhisztokémia) sem sikerül mukózális elváltozást a bélbiopsziás mintán kimutatni. Növekedési elmaradás olykor elofordul cöliákia és 1TDM együttes jelenlétekor, azonban a mi felmérésünkben a kettos betegségben szenvedoknek nem volt növekedési elmaradása. A cöliákia diagnózisát követoen bevezetett gluténmentes étrend hatására kedvezo metaboliás hatást nem találtunk. A HbA1c szintje gluténmentes étrenden nem változott, bár ezek az értékek a diétás változtatás elott sem voltak a kóros tartományban. Érdekes módon a betegeknél a gluténmentes étrenden magasabb inzulin igény jelentkezett. Ennek magyarázata az lehet, hogy a teljes mukózális integritás visszaállításakor
javul
a
tápanyagok
felszívódása.
A
gluténmentes
étrenden
szignifikánsan magasabb BMI értéket mértünk, mutatva a korai diagnózis és étrendi változtatás jótékony hatását.
Az értekezés gyakorlati jelentosége
1. Endoszkópiás
vizsgálatnál
a
duodénum
bulbuszában
látott
limfonoduláris
hiperplázia késoi típusú táplálékallergiára utalhat a gyermekkorban. A gyanút megerosíti, ha a szövettani metszeten az intraepiteliális régióban magas a ?? T sejtszám. 2. A normális szövettani kép ellenére a finomabb módszerekkel kimutatott eltérések az orális tolerancia megbomlására utalnak késoi típusú táplálékallergiában, és segítenek a kórkép diagnosztikájában és csoportosításában. 3. Táplálékallergiában végzett megfigyeléseim kiindulás alapok lehetnek további kutatások elvégzéséhez. Segíthet egyéb immunmediált kórképek (pl. látens cöliákia) differenciál diagnosztikájában is. 4. Az 1. típusú diabétesz mellituszban kimutatott magas cöliákia-prevalencia a rendszeres szurés fontosságát támasztja alá. 5. Normális boholystruktúra mellett a látens cöliákiát a magas ?? T sejtszám jelezheti. Ennek megfeleloen álpozitív endomizium antitest csak akkor véleményezheto, ha ennek a T sejtpopulációnak száma normális.
87
Értekezésemet összegezve: immunmediált bélbetegségekben (táplálékallergia és cöliákia) immunhisztokémiai és in situ hibridizációs módszerekkel elemeztem különbözo citokinek, adhéziós molekulák és egy proliferációs marker megjelenését a vékonybél mukózájában. A kimutatott sajátosságok segítenek megérteni az adott kórkép patomechanizmusát, de diagnosztikus és terápiás konzekvenciával is járhatnak a jövoben. Jelenleg az endoszkópia segítségével a mukózából történo mintavétel és a makroszkópos megtekintés invazív úton történik. A kapszuláris endoszkópia térnyerésével az invazivitás a jövoben kiküszöbölheto, így a kórképek minél részletesebb feltérképezése jelentos gyakorlati haszonnal járhat. Egy adott kórkép patomechanizmusának részletes megismerését a kutató orvostól egy fa l választja el; hiszem, hogy munkámmal ebbol a falból egy téglát levehettem.
88
VIII. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE
1TDM: 1. típusú diabétesz mellitusz AD: atópiás dermatitisz BMI: testtömeg- index CTL: citotoxikus limfocita EMA: antiendomizium antitest H. pylori: Helicobacter pylori ICAM-1: intercelluláris adhéziós molekula IEC: intraepiteliális sejt IEL: intraepiteliális limfocita IFN: interferon IL: interleukin DA: diétázó allergiások LFA-1: leukocita funkcionális adhéziós molekula LNH: limfonoduláris hiperplázia LPL: lamina propria limfociták MAdCAM: mukózális addresszin adhéziós molekula NDA: nem diétázó allergiások NK: natural killer sejt RAST: radioallergoszorbent teszt TA: táplálékallergia TCR: T sejt receptor TFIE: táplálékfehérje indukálta enteropátia TG: transzglutamináz TGF: transzformáló növekedési faktor Th: T helper TNF: tumor nekrózis faktor Tr: T sejt regulációs faktor
89
IX. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS
Dr. Arató Andrásnak, témavezetomnek, aki munkám elkészítésének minden fázisában aktívan részt vett, önzetlenül segített és támogatott. Kapcsolatai és ösztönzése révén jutottam el Finnországba, ahol kísérletes munkám jelentos részét végeztem. Dr. Erkki Savilahtinak, a Helsinki Gyermekklinika kutatólaboratóriumának egyik vezetojének, akinek irányításával végeztem alapkutatásaim jelentos részét. Dr. Jorma Kokkonennek és Dr. Timo Helinnek a betegek kiválasztását és az endoszkópiás anyag rendelkezésemre bocsájtását. Dr. Mia Westerholmnak és Sirrku Kristiansennek az in situ hibridizációban és az immunhisztokémiában nyújtott segítségért. Az I.sz. Gyermekklinika gasztroenterológiai munkacsoportjának, Dr. Bodánszky Hedvignek, Dr. Dezsofi Antalnak, Dr. Szonyi Lászlónak. Dr. Körner Annának, Dr. Madácsy Lászlónak és a klinikánk dolgozóinak, akik támogattak disszertációm elkészítésében. Bornemissza Beryll asszisztensnek az immunhisztológiai munkákban nyújtott segítségéért. Dr. Tulassay Tivadar Professzornak, aki biztosította számomra a zavartalan külföldi és hazai kutatómunkát, kritikus biztatása nagymértékben segítette disszertációm minél elobb történo elkészülését. A vizsgálataim elvégzését az Országos Tudományos Kutatási Alap (OTKA T-31791), az Egészségügyi Minisztérium (ETT 297/2000) és a finn Sigrid Juselius Alapítvány támogatta, amit nagyon köszönök.
90
X. IRODALOMJEGYZÉK
1. Walker-Smith J. Cow's milk allergy: a new understanding from immunology. Ann Allergy Asthma Immunol 2003;90:81-3 2. Sabra A, Bellanti JA, Rais JM, Castro HJ, de Inocencio JM, Sabra S. IgE and nonIgE food allergy. Ann Allergy Asthma Immunol 2003;90:71-6 3. Bahna SL. Diagnosis of food allergy. Ann Allergy Asthma Immunol 2003;90:77-80 4. Moneret-Vautrin DA, Kanny G, Fremont S. Laboratory tests for diagnosis of food allergy: advantages, disadvantages and future perspectives. Allerg Immunol (Paris). 2003;35:113-9 5. Nickel R, Kulig M, Forster G, és mtsai. Sensitization to hen’s egg at the age of twelve months is predictive for allergic sensitization to common indoor and outdoor allergens at the age of three years. J Allergy Clin Immunol 1997;99:613-7 6. Polgár M. A csecsemokorban fellépo allergia és kimenetele. Gyermekgyógyászat 1995, Különkiadás, 37-48 7. Novembre E, de Martino M, Vierucci A. Foods and respiratory allergy. J Allergy Clin Immunol 1988;81:1059-65 8. Fuglsang G, Madsen C, Saval P, Osterballe O. Prevalence of intolerance to food additives among Danish school children. Pediatr Allergy Immunol 1993;4:123-9 9. Young E, Stoneham MD, Petruckevitch A, Barton J, Rona R. A population study of food intolerance. Lancet 1994;343:1127-30 10. Niestijl Jansen JJ, Kardinaal AFM, Huijbers GH, Vlieg-Boerstra BJ, Martens BPM, Ockhuizen T. Prevalence of food allergy and intolerance in the adult Dutch population. J Allergy Clin Immunol 1994;93:446-56 11. Mayer L. Mucosal immunity. Pediatrics 2003;111:1595-600 12. Sbothill JF, Stokes CR, Turner MW, és mtsai. Predisposing factors and the development of reaginic allergy in infancy. Clin Allergy 1976;6:305-19 13. Fergusson DM, Horwood LJ, Shannon FT. Early solid feeding and recurrent eczema: a 10-year longitudinal study. Pediatrics 1990;86:541-6 14. Siltanen M, Kajosaari M, Pohjavuori M, Savilahti E. Prematurity at birth reduces the long-term risk of atopy. J Allergy Clin Immunol 2001;107:229-34
91
15. Zeiger RS. Food allergen avoidance in the prevention of food allergy in infants and children. Pediatrics 2003;111:1662-71 16. Sicherer SH. Clinical aspects of gastrointestinal food allergy in childhood. Pediatrics 2003;111:1609-16 17. Freed DLJ. Laboratory diagnosis of food intolerance. In: Brostoff J, Challacombe SJ, eds. Food allergy and intolerance. London: WB Saunders, 1987:873-97 18. Walker-Smith JA. Food sensitive enteropathies. Clin Gastroenterol 1986;15:55-69 19. Leung D.Y.M. Immunologic basis of chronic allergic diseases: clinical message from the laboratory bench. Ped Res 1997;42:559-68 20. Walker-Smith JA. Food allergies and bowel disease. J R Soc Med 1985; 78:3-6 21. Kokkonen J. Lymphonodular hyperplasia on the duodenal bulb indicates food allergy in children. Endoscopy 31:464-467, 1999 22. Kokkonen J, Karttunen T.J, Niinimäki A. Lymphonodular hyperplasia as a sign of food allergy in children. J Ped Gastroent Nutr 29:57-62, 1999 23. Nagata S, Yamashiro Y, Ohtsuka Y, Shioya T, Oguchi S, Shimizu T, Maeda M. Quantitative analysis and immunohistochemical studies on small intestinal mucosa of food-sensitive enteropathy. J Ped Gastr Nutr 1995;20:44-8 24. Picarelli A, Maiuri L, Mazzilli MC, Coletta S, Ferrante P, Digiovambattista F, Greco M, Torsoli A, Auricchio S. Gluten-sensitive disease with mild enteropathy. Gastroenterology 1996; 111:608-16. 25. Rosenkrans PCM, Meijer CJLM, Cornelisse CJ, Wal AM, Lindeman J. Use of morphometry
and imunohistochemistry of small intestinal biopsy specimens in the
diagnosis of food allergy. J Clin Pathol 1980;33:125-30 26. Rowe AH. Roentgen studies of patients with gastrointestinal food allergy. JAMA 1933;100:394-400 27. Pollard H, Stuart G. Experimental reproduction of gastric allergy in human beings with controlled observations on the mucosa. J Allergy 1942;13:467-73 28. Reimann HJ, Lewin J. Gastric mucosal reactions in patients with food allergy. Am J Gastroenterol 1988;83:1212-9 29. DuMont GCL, Beach RC, Menzies IS. Gastrointestinal permeability in food-allergic eczematous children. Clin Allergy 1984;14:55-9
92
30. Bircher AJ, Van Melle G, Haller E, Curty B, Frei PC. IgE to food allergens are highly prevalent in patients allergic to pollens with and without symptoms of food allergy. Clin Exp Allergy 1994;24:367-74 31. Vieths S, Janek K, Aulepp H, Petersen A. Isolation and characterization of the 18kDa major apple allergen and comparison with the major birch pollen allergen (Bet v 1). Allergy 1995;50:421-30 32. Jaffe J, James S, Mullins G, Braun-Elwert L, Lubensky I, Metcalfe D. Evidence for an abnormal profile of interleukin-4 (IL-4), IL-5, and gamma interferon in peripheral blood T cells from patients with allergic eosinophilic gastroenteritis. J Clin Immunol 1994;14:299-309 33. Iacono G, Carroccio A, Cavataio F, és mtsai. Gastroesophageal reflux and cow’s milk allergy in infants: a prospective study. J Allergy Clin Immunol 1996;97:822-7 34. Snyder JD, Rosenblum N, Wershil B, Goldman M, Winter HS. Pyloric stenosis and eosinophilic gastroenteritis in infants. J Pediatr Gastroenterol 1987;6:543-7 35. Iacono G, Cavataio F, Montalto G, és mtsai. Intolerance of cow’s milk and chronic constipation in children. N Engl J Med 1998;339:1100-4 36. Kelly KJ, Lazenby AJ, Rowe PC, Yardley JH, Perman JA, Sampson HA. Eosinophilic esophagitis attributed to gastroesophageal reflux: improvement with an amino-acid based formula. Gastroenterology 1995;109:1503-12 37. Powell GK. Milk- and soy- induced enterocolitis of infancy. J Pediatr 1978;93:55360 38. Perkkio M, Savilahti E, Kuitunen P. Morphometric and immunohistochemical study of jejunal biopsies from children with intestinal soy allergy. Eur J Pediatr 1981;137:63-9 39. Heyman M, Darmon N, Dupont C, és mtsai. Mononuclear cells from infants allergic to cow’s milk secrete tumor necrosis factor alpha, altering intestinal function. Gastroenterology 1994;106:1514-23 40. Odze R, Wershil B, Leichtner A. Allergic colitis in infants. J Pediatr 1995;126:16370 41. Goldman H, Proujanksy R. Allergic proctitis and gastroenteritis in children. Am J Surg Pathol 1986;10:75-86
93
42. Kosnai I, Kuitunen P, Savilahti E, és mtsai. Mast cells and eosinophils in the jejunal mucosa of patients with intestinal cow’s milk allergy and celiac disease of childhood. J Pediatr Gastroenterol Nutr 1984;3:368-74 43. Savilahti E, Arato A, Verkasalo M. Intestinal ?? receptor bearing T lymphocytes in celiac disease and inflammatory bowel disease in children. Constant increase in celiac disease. Pediatr Res 1990;28:579-781 44. Lundin KEA, Scott H, Fausa O. T cells from the small intestinal mucosa of a DR4, DQ7/DR4, DQ8 celiac diesease patient prefertially recognise gliadin when presented by DQ8. Hum Immunol 1994;41:285-291 45. Hauer CA, Breese EJ, Walker-Smith JA, MacDonald TT. The frequency of cells secreting interferon-gamma and interleukin-4, -5, and 10 in the blood and duodenal mucosa of children with cow's milk hypersensitivity. Pediatr Res 1997;42:629-638 46. Volonakis M, Katsarou-Katsari A, Stratigos J. Etiologic factors in childhood chronic urticaria. Ann Allergy 1992;69:61-5 47. Bruynzeel-Koomen C, Van Wicker DF, Toonstra J, és mtsai. The presence of IgE molecules on epidermal Langerhans cells in patients with atopic dermatitis. Arch Dermatol Res 1986;297:199-205 48. Hamid Q, Naseer T, Minshall EM, Song YL, Boguniewicz M, Leung DYM. In vivo expression of IL-12 and IL-13 in atopic dermatitis. J Allergy Clin Immunol 1996;98:225-31 49. Abernathy-Carver K, Sampson H, Picker L, Leung D. Milk-induced eczema is associated with the expansion of T cells expressing cutaneous lymphocyte antigen. J Clin Invest 1995;95:913-8 50. Hall RP. The pathogenesis of dermatitis herpetiformis: recent advances. J Am Acad Dermatol 1987;16:1129-44 51. Karpati S, Meurer M, Stolz W, Burgin-Wolff A, Braun-Falco O, Krieg T. Ultrastructural binding sites of endomysium antibodies from sera of patients with dermatitis herpetiformis and coeliac disease. Gut 1992;33:191-3 52. Sardy M, Karpati S, Merkl B, Paulsson M, Smyth N. Epidermal transglutaminase (TGase 3) is the autoantigen of dermatitis herpetiformis. J Exp Med 2002;195:74757
94
53. Westerholm-Ormio M, Garioch J, Ketola I, Savilahti E. Inflammatory cytokines in small intestinal mucosa of patients with potential coeliac disease. Clin Exp Immunol 2002;128:94-101 54. Bock SA, Atkins FM. Patterns of food hypersensitivity during sixteen years of double-blind, placebo-controlled food challenges. J Pediatr 1990;117:561-7 55. Heiner DC, Sears JW. Chronic respiratory disease associated with multiple circulating precipitins to cow’s milk. Am J Dis Child 1960;100:500-2 56. Sampson HA. Fatal food- induced anaphylaxis. Allergy 1998;53:125-30 57. Horan RF, Sheffer AL. Food-dependent exercise- induced anaphylaxis. Immunol Allergy Clin North Am 1991;11:757-66 58. Nowak-Wegrzyn A. Future approaches to food allergy. Pediatrics 2003;111:167280 59. Samson HA. Utility of food-specific IgE concentrations in predicting symptomatic food allergy. J Allergy Clin Immunol 2001;107:891-6 60. Isolauri E, Turnjamaa K. Combined skin prick and patch testing enhances identification of food allergy in infants with atopic dermatitis. J Allergy Clin Immunol 1996,97:9-15 61. Saarinen KM, Suomalainen H, Savilahti E. Diagnostic value of skin-prick and patch tests and serum eosinophil cationic protein and cow's milk-specific IgE in infants with cow's milk allergy. Clin Exp Allergy 2001;31:423-9 62. Maki M, Mustalahti K, Kokkonen J, és mtsai. Prevalence of Celiac disease among children in Finland. N Engl J Med 2003;348:2517-24 63. Korponay-Szabo IR, Kovacs JB, Czinner A, Goracz G, Vamos A, Szabo T. High prevalence of silent celiac disease in preschool children screened with IgA/IgG antiendomysium antibodies. J Pediatr Gastroenterol Nutr 1999;28:26-30 64. Rolles CJ, Kyaw-Myint T B, Sin W-K, Anderson CM. Family study of coeliac disease. Gut 1974;15:827 65. Maki M, Collin P. Coeliac disease. Lancet 1997;349(9067):1755-9 66. Sollid LM, Markussen G, Ek J, Gjerde H. Vartdal F. Thorsby E. Evidence for a primary association of coeliac disease to a particular HLA-DQ alpha-beta heterodimer. J Exp Med 1989;169:345-50
95
67. Sollid LM, Thorsby E. HLA susceptibility genes in celiac disease – genetic mapping and role in pathogenesis. Gastroenterology 1993;105:910-22 68. Kendall MJ, Cox PS, Schneider W, Hawkins CF. Gluten subfractions in coeliac disease. Lancet 1972;II:1065 69. Kagnoff MF, Austin RK, Hubert JJ, Kasarda DD. Possible role for a human adenovirus in the pathogenesis of coeliac disease. J Exp Med 1984;160:1544-57 70. Arató A., Kósnai I., Szonyi L., Tóth M.: Frequent past exposure to adenovirus 12 in coeliac disease. Acta Paediatr Scand 1991;13:1101-02 71. Molberg O, Mcadam SN, Korner R, Quarsten H, Kristiansen C, Madsen L, Fugger L, Scott H, Noren O, Roepstorff P, Lundin KE, Sjostrom H, Sollid LM. Tissue transglutaminase selectively modifies gliadin peptides that are recognized by gutderived T cells in celiac disease Nature Med 1998; 4:713-7 72. Dieterich W, Ehnis T, Bauer M, Donner P, Volta U, Riecken EO, Schuppan D. Identification of tissue transglutaminase as the autoantigen of celiac disease. Nature Med 1997;3:797-801. 73. Korponay-Szabó IR, Sulkanen S, Halttunen T, Maurano F, Rossi M, Mazzarella G, Laurila K, Troncone R, Maki M. Tissue transglutaminase is the target in both rodent and primate tissues for celiac disease-specific autoantibodies. J Pediatr Gastroenterol Nutr 2000;31:320-7 74. Sollid, L.M., Molberg, O., McAdam, S., Lundin, K. E.: Autoantibodies in coeliac disease: tissue transglutaminase – guilt by association? Gut 1997; 851-2. 75. Van De Wal Y. Kooy Y. Van Veelen P. Vader W. Koning F. Pena S. Coeliac disease: it takes three to tango. Gut 2000;46:734-7 76. Hayday A, Theodoris E, Rambsburg E, Shires J. Intraepithelial lymphocytes: exploring the Third Way in immunology. Nat Immunol 2001, 2:997-1003 77. Moss SF, Attia L, Scholes JV, Walters JRF, Holt PR. Increased small intestinal apoptosis in coeliac disease. Gut 1996;39:811-7 78. Shaw SK, Brenner MB. The ? 7 integrins in mucosal homing and retention. Semin Immunol 1995;7:335-42 79. Guy-Grand D, Vassali P. Gut intraepithelial T lymphocytes. Curr Opin Immunol 1993;5: 247-52
96
80. Cepek KL, Shaw SK, Parker CM. Adhesion between epithelial cells and T lymphocytes mediated by E-cadherin and ? E? 7 integrin. Nature 1994;272:190-3 81. Jenkins D, Goodall A, Scott BB. T- lymphocyte populations in normal and coeliac small intestinal mucosa defined by monoclonal antibodies. Gut 1986;27:1330-7 82. Halstensen TS, Scott H, Brandtzaeg P. Intraepithelial T cells of the TcR/+ CD8- and V 1/J 1+ phenotypes are increased in coeliac disease. Scand J Immunol 1989,30:665-72 83. Iltanen S, Holm K, Ashorn M, Ruuska T, Laippala P, Maki M. Changing jejunal ?? T cell receptor (TCR)-bearing intraepithelial lymphocyte density in coeliac disease. Clin Exp Immunol 1999;117:51-55 84. Maki M, Holm K, Collin P, Savilahti E. Increase in ?/? T cell receptor bearing lymphocytes in normal small bowel mucosa in latent coeliac disease. Gut 1991;32:1412-4 85. Arató A, Savilahti E, Tainio V-M, Verkasalo M, Klemola T. HLA-DR expression, natural killer cells and IgE containing cells in the jejunal mucosa of coeliac children. Gut 1987; 28:988-94. 86. Griffiths CEM, Barrison EG, Leonar JN, Caun K, Valdimarsson H, Fry L. Preferential activation of CD4 T lymphocytes in the lamina propria of glutensensitive enteropathy. Clin Exp Immunol 1988;73:280-283 87. Nilsen EM, Lundin KEA, Krajci P, Scott H, Sollid LM, Brandtzaeg P. Gluten specific, HLA-DQ restricted T cells from coeliac mucosa produce cytokines with Th1 or Th0 profile dominated by interferon. Gut 1995;37:766-76 88. Beckett CG, Dell'Olio D, Kontakou M, Przemioslo RT, Rosen-Bronsen S, Ciclitira PJ. Analysis of interleukin-4 and interleukin-10 and their association with the lymphocytic infiltrate in the small intestine of patients with coeliac disease Gut 1996;39:818-23 89. Savilahti E. Intestinal immunoglobulins in children with coeliac disease. Gut 1972;13: 958-64 90. Arató A, Savilahti E. Subclass distribution of IgG- and IgA-containing cells in the jejunal mucosa of children with coeliac disease. Acta Paediatr Hung 1993;33:105-17
97
91. Scott H, Ek J, Baklien K, Brandtzaeg P. Immunoglobulin-producing cells in jejunal mucosa of children with coeliac disease on a gluten free diet and after gluten challenge. Scand J Gastroenterol 1980;15:81-8 92. Shan L, Molberg O, Parrot I. Structural basis for gluten intolerance in celiac sprue. Science 2002;297:2218-20 93. Boudraa G, Hachelaf W, Benbouabdellah M. és mtsai. Prevalence of coeliac disease in diabetic children and their first- degree relatives in west Algeria: screening with serological markers. Acta Paediatr 1996;Suppl. 412:58-60 94. Schober E, Bittma nn B, Granditsch G, és mtsai. Screening by anti-endomysium antibody for CD in diabetic children and adolescents in Austria. J
Pediatr
Gastroenterol Nutr 2000;30:391-6 95. Page SR, Lloyd CA, Hill PG, és mtsai. The prevalence of coeliac disease in adult diabetes mellitus. QJM 1994;87:631-7 96. Aktay AN, Lee PC, Kumar V, és mtsai. The prevalence and clinical characteristics of CD in juvenile diabetes in Wisconsin. J Pediatr Gastroenterol Nutr 2001;33:462-5 97. Sumnik Z, Kolouskova S, Cinek O, és mtsai. HLA –DQA1*05-DQB1*0201 positivity predisposes to coeliac disease in Czech diabetic children. Acta Paediatr 2000;89:1426-30 98. Saukkonen T, Savilahti E, Reijonen H, mtsai. Coeliac disease: frequent occurrence after clinical onset of insulin-dependent diabetes mellitus. Childhood Diabetes in Finland Study Group. Diab Med 1996;13:464-70 99. Koletzko S, Burgin-Wolff A, Koletzko B, és mtsai. Prevalence of coeliac disease in diabetic children and adolescents: a multicentre study. Eur J Pediatr 1988;148:113-7 100.
Not T, Tommasini A, Tonini G, és mtsai. Undiagnosed coeliac disease and risk
of autoimmune disorders in subjects with type I diabetes mellitus. Diabetologia 2001;44:151-5 101.
Carlsson AK, Axelsson IE, Borulf SK, és mtsai. Prevalence of IgA-
antiendomysium and IgA-antigliadin autoantibodies at diagnosis of insulindependent diabetes mellitus in Swedish children and adolescents. Pediatrics 1999;103:1248-52
98
102.
Verge CF, Howard NJ, Rowley MJ, és mtsai. Anti- glutamate decarboxylase and
other antibodies at the onset of childhood 1TDM: a population-based study. Diabetologia 1994; 37:1113-20 103.
Fraser-Reynolds KA, Butzner JD, Stephure DK, mtsai. Use of immunoglobulin
A-antiendomysial antibody to screen for CD in North American children with type 1 diabetes Diabetes Care 1998;21:1985-9 104.
Savilahti E, Simell O, Koskimies S, és mtsai. CD in insulin-dependent diabetes
mellitus. J Pediatr 1986;108:690-3 105.
Cronin C, Feighery A, Ferriss, JB, és mtsai. High prevalence of coeliac disease
among patients with insulin dependent (type I) diabetes mellitus. Am J Gastroenterol 1997;92:2210-2 106.
Pittschieler K, Ladinser B. Coeliac diseases: screened by a new strategy. Acta
Paediatr 1996;Suppl 412:42-45 107.
De Vitis I, Ghilranda G, Gasbarrini G. Prevalence of coeliac disease in type I
diabetes: a multicentre study. Acta Paediatr 1996;Suppl 412:56-7 108.
Maki M, Huupponen T, Holm K, Hallström O. Seroconversion of reticulin
autoantibodies predicts coeliac disease in 1. Type diabetes mellitus. Gut 1995;36:239-42 109.
Brandtzaeg P. History of oral tolarance and mucosal immunology. Ann.
N. Y. Acad. Sci. 1996; 778, 1-27 110.
Cunningham- Rundles C. Physiology of IgA and IgA deficiency. J Clin
Immunol 2001;21:303-9 111.
Leon F, Roldan E, Sanchez L, Camarero C, Bootello A, Roy G. Human small-
intestinal
epithelium
contains
functional
natural
killer
lymphocytes.
Gastroenterology 2003;125:345-56 112.
Kagnoff MF. Immunology of the intestinal tract. Gastroenterology 1993;
105:1275-1280 113.
Savilahti E, Kuitunen M. Allergenicity of cow milk proteins. J Pediatr
1992; 121:S12-S20 114.
Strober, W., Kelsall, B.: To be responsive or not to be responsive, that is
the mucosal question. Gastroenterology, 1998;114:214-217
99
115.
Mayer L, So LP, Yio XY, Small G. Antigen trafficking in the intestine. Ann NY
Acad Sci 1996;778:28-35 116.
Strobel, S, Mowat A.: Immune responses to dietary antigens: oral tolerance.
Immunol. Today, 1998;19:173-181 117.
Shevach EM, McHugh RS, Thorton AM. Control of autoimmunity by regulatory
T cells. Adv Exp Med Biol 2001;490:21-32 118.
Sakaguchi S, Sakaguchi N, Asano M, Itoh M, Toda M. Immunologic self-
tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alfa chains (CD25). J Immunol 1995;155:1151-64 119.
Shevach EM, McHugh RS, Piccirillo CA. Control of T-cell activation by CD4+
CD25+ suppressor T cells. Immun Rev 2001;182:58-67 120.
Strober, W., Kelsall, B., Marth, T.: Oral tolerance. J Clin Immunol 1998;18:1-30
121.
Butcher EC, Picker LJ: Lymphocyte homing and homeostasis. Science 1996;
272:60-66 122.
Husby S. Normal immune response to ingested foods. J Ped Gastroent Nutr
2000;30:13-19 123.
Garside P, Mowat MA, Khoruts A. Oral tolerance in disease. Gut 1999;44:137-
142 124.
Iqbal N, Oliver JR McCabe RP. B7-1 expression on intestinal epithelium
prevents oral tolerance induction. FASEB 1999;13 A606 (476.4) 125.
Mayer L. Oral tolerance: new approaches, new problems. J Ped Gastroent Nutr
2000;94:1-8 126.
Köhler H, McCormick BA, Walker WA. Bacterial-enterocyte crosstalk: cellular
mechanism in health and disease. J Ped Gastroent Nutr 2003;36:175-85 127.
Breese EJ, Farthing MJG, Kumar P, MacDonald TT. Interleukin-2 and
interferon-gamma producing cells in the lamina propria in coeliac disease. Dig Dis Sci 1994;39:2243 128.
Breese EM, Braegger CP, Corrigan CP, Walker-Smith JA, MacDonald TT.
Lymphokine secreting cells in the intestinal mucosa in inflammatory bowel disease. Immunology 1993;78:127-131 129.
Liblau RS, Singer SM, McDevitt HO. Th1 and Th2 CD4+ T cells in the
pathogenesis of organ-specifik immune diseases. Immunol Today 1992;16:34-38
100
130.
Del Prete G, Maggi E, Romagnani S. Human Th1 and Th2 cells: functional
properties, mechanism of regulation, and role in disease. Lab Invest 1994;70:299306 131.
Eigenmann PA, Frossard CP. The T lymphocyte in food-allergy disorders. Curr
Opin Allergy Clin Immunol 2003;3:199-203 132.
Romagnani S. Biology of human Th1 and Th2 cells. J Clin Immunol
1995;15:121-129 133.
Kotenko SV. The family of IL-10-related cytokines and the ir receptors: related,
but to what extent? Cytokine Growth Factor Rev 2002;13:223-40 134.
Sheppard P, Kindsvogel W, Xu W et al. IL-28, IL-29 and their class II cytokine
receptor IL-28R. Nat Immunol 2003;4:63-8 135.
Green PHR, Jabri B. Coeliac disease. Lancet 2003; 362: 383-91
136.
Salvati VM, MacDonald TT, Bajaj-Elliot et al. Interleukin 18 and associated
markers of T helper cell type 1 activity in celiac disease. Gut 2002;50:186-90 137.
Maiuri L, Ciacci C, Auricchio S, Brown V, Quaratino S, Londei M. Interleukin
15 mediates epithelial changes in celiac disease. Gastroenterology 2000;119:9961006 138.
Maiuri L, Ciacci C, Ricciardelli I, Vacca L, Raia V, Auricchio S, Picard J,
Osman M, Quaratino S, Londei M. Association between innate response to gliadin and activation of pathogenic T cells in coeliac disease. Lancet 2003;362(9377):30-7 139.
Mizrachi A, Broide E, Buchs A, Kornberg A, Aharoni D, Bistritzer T, Rapoport
MJ. Lack of correlation between disease activity and decreased stimulated secretion of IL-10 in lymphocytes from patients with celiac disease. Scand J Gastroenterol 2002;37:924-30 140.
André F, Péne J, André C. Interleukin-4 and interferon- gamma production by
peripheral
blood
mononuclear
cells
from
food-allergic
patients.
Allergy
1996;51:350-355 141.
Tang MLK, Coleman J, Kemp AS. Interleukin-4 and interferon-gamma
production in atopic and non-atopic children with asthma. Clin Exp Immunol 1995;25:515-521 142.
Hill DJ, Ball G, Hosking CS, Wood PR. Gamma- interferon production in cow
milk allergy. Allergy 1993;48:75-80
101
143.
Lin XP, Magnusson J, Ahlstedt S, Dahlman-Hoglund A, Hanson L LA,
Magnusson O, Bengtsson U, Telemo E. Local allergic reaction in foodhypersensitive adults despite a lack of systemic food-specific IgE. J Allergy Clin Immunol 2002;109:879-87 144.
Beyer K, Castro R, Birnbaum A, Benkov K, Pittman N, Sampson HA. Human
milk-specific mucosal lymphocytes of the gastrointestinal tract display a Th2 cytokine profile. J Allergy Clin Immunol 2002;109:707-13 145.
Vandezande LM, Wallaert B, Desreumaux P, Tsicopoulos A, Lamblin C, Tonnel
AB, Janin A. Interleukin-5 immunoreactivity and mRNA expression in gut mucosa from patients with food allergy. Clin Exp Allergy 1999;29:652-9 146.
Perez-Machado MA, Ashwood P, Thomson MA, Latcham F, Sim R, Walker-
Smith JA, Murch SH. Reduced transforming growth factor-beta1-producing T cells in the duodenal mucosa of children with food allergy. Eur J Immunol 2003;33:230715 147.
Fromont G, Cerf-Bensussan N, Patey N, és mtsai. Small bowel transplantation in
children: an immunohistochemical study. Gut 1995;37:783-90 148.
Butcher EC. The regula tion of lymphocyte traffic. Curr Top Microbiol Immunol.
1986;128:85-122 149.
Smart CJ, Calabrese A, Oakes DJ, Howdle PD, Trejdosiewicz LK. Expression of
the LFA-1 ? 2 Integrin (CD11a/CD18) and ICAM-1 (CD54) in Normal and Coeliac Small Bowel Mucosa. Scand J Immunol 1991;34:299-305 150.
Springer TA. Adhesion receptors of the immune system. Nature 1990;346:425
151.
Dustin ML, Springer TA. Lymphocyte function associated antigen-1 (LFA-1)
interaction with intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) is one of at least three mecha nisms for lymphocyte adhesion to cultured endothelial cells. J Cell Biol 1988;107:321-29 152.
Duijvestijn A, Hamann A. Mechanisms and regulation of lymphocyte migration.
Immunol Today 1989;10:23-28 153.
Boyd AW, Wawryk SO, Burns GF, Fecondo JV. Intercellular adhesio n
molecule-1 (ICAM-1) has a central role in cell-cell contact-mediated immune mechanism. Proc Natl Acad Sci USA 1988;85:3095-99
102
154.
Chung HL, Hwang JB, Kwon YD, Park MH, Shin WJ, Park JB. Deposition of
eosinophil- granule major basic protein and expression of intercellular adhesion molecule-1 and vascular cell adhesion molecule-1 in the mucosa of the small intestine in infants with cow's milk-sensitive enteropathy. J Allergy Clin Immunol 1999;103:1195-201 155.
Schweighoffer T, Tanaka Y, Tidswell, és mtsai. Selective epxression of
alpha4beta7 on a subset of human CD4+ memory T cells with hallmarks of guttropism. J Immunol 1993;151:717-29 156.
Briskin M, Winsor-Hines D, Shyjan A. Human mucosal addressin cell adhesion
molecule-1 is preferentially expressed in intestinal tract and associated lymphoid tissue. Am J Pathol 1997;151:97-110 157.
Souza HS, Elia CC, Spencer J, MacDonald TT. Expression of lymphocyte-
endothelial receptor- ligand pairs, alpha4beta7/MAdCAM-1 and OX40/OX40 ligand in the colon and jejunum of patients with inflammatory bowel disease.
Gut
1999;45:853-63 158.
Ghosh S, Goldin E, Gordon FH, Malchow HA, Rask-Madsen J, Rutgeerts P,
Vyhnalek P, Zadorova Z, Palmer T, Donoghue S. Natalizumab for active Crohn's disease. N Engl J Med 2003;348:68-72 159.
Gauvreau GM, Becker AB, Boulet LP, Chakir J, Fick RB, Greene WL, Killian
KJ, O'byrne PM, Reid JK, Cockcroft DW. The effects of an anti-CD11a mAb, efalizumab, on allergen- induced airway responses and airway inflammation in subjects with atopic asthma. J Allergy Clin Immunol 2003;112:331-338 160.
Sareneva T, Pirhonen J, Cantell K, Kalkkinen N, Julkunen I. Role of N-
glycosylation in the synthesis, dimerization and secretion of human interferongamma. Biochem J 1994;303(Pt 3):831-40. 161.
Wilkinson DG. Whole mount in situ hybridization of vertebrate embryos in: In
situ hybridization- a practical approach, Oxford:IRL Press 1992;75-83 162.
Kokkonen J, Haapalahti M, Laurila K, Karttunen TJ, Maki M. Cow's milk
protein-sensitive enteropathy at school age. J Pediatr 2001;139:797-803 163.
Kokkonen J, Ruuska T, Karttunen TJ, Niinimaki A. Mucosal pathology of the
foregut associated with food allergy and recurrent abdominal pains in children. Acta Paediatr 2001;90:16-21
103
164.
Kokkonen J, Holm K, Karttunen TJ, Maki M. Children with untreated food
allergy express a relative increment in the density of duodenal gammadelta+ T cells. Scand J Gastroenterol 2000;35:1137-42 165.
Kokkonen J, Ruuska T, Karttunen TJ, Maki M. Lymphonodular hyperplasia of
the terminal ileum associated with colitis shows an increase gammadelta+ t- cell density in children. Am J Gastroenterol 2002;97:667-72 166.
Savilahti E, Örmala T, Saukkonen T, Sandinin-Pohjavuori U, Kantele M, Arato
A, Ilonen J, Akerblom H.K. Jejuna of patients with IDDM show sign of immune activation. Clin Exp Immunol 1999;116:70-7 167.
Mäki M, Holm K, Collin P, Savilahti E. Increase of ?/? T cell receptor bearing
lymphocytes in normal small bowel mucosa in latent coeliac disease. Gut 1991;32:1412-4 168.
Haas W, Tonegawa S. Development and selection of gamma delta T cells. Curr
Opin Immunol 1992;4:147-55 169.
Yeung MMW, Melgar S, Baranov V, Öberg A, Danielsson A, Hammarström S,
Hammarström ML. Characterisation of mucosal lymphoid aggregates in ulcerativ colitis:immune cell phenotype and TcR-gamma/delta expression. Gut 2000;47:215227 170.
Groh V, Steinle A, Bauer S. Recognition of stress- induced MHC molecules by
intestinal epithelial ?? T cells. Science 1998;279:1737-1740 171.
Iltanen S, Rantala I, Laippala P, Holm K, Partanen J, Maki M. Expression of
HSP-65 in jejunal epithelial cells in patients clinicly suspected of coeliac disease. Autoimmunity 1999;31:125-132 172.
Ulanova M, Torebring M, Porcelli SA, Bengtsson U, Magnusson J, Magnusson
O, Lin XP, Hanson LA, Telemo E. Expression of CD1d in the duodenum of patients with cow's milk hypersensitivity. Scand J Immunol 2000;52:609-17 173.
Pawankar R. gammadelta T cells in allergic airway diseases. Clin Exp Allergy
2000;30:318-23 174.
Benson M, Adner M, Cardell LO. Cytokines and cytokine receptors in allergic
rhinitis: how do they relate to the Th2 hypothesis in allergy. Clin Exp Allergy 2001;31:361-7
104
175.
Jujo K, Renz H, Abe J, Gelfand EW, Leung DYM. Decreased interferon-gamma
and increased interleukin-4 production in atopic dermatitis promotes IgE synthesis. J Allergy Clin Immun 1992;90:323-331 176.
NakjimaH, Hachimura S, Nishiwaki S, Katsuki T, Shimojo N, Ametani A,
Kohno Y, Kaminogawa S. Establishment and characterisation of alfa s1-casein specific T-cell lines from patients allergic to cows milk:unexpected higher frequency of CD8 T cell lines. J Allergy Clin Immunol 1996;97:1342-1349 177.
Ohtsuka Y, Yamashiro Y, Maeda M, és mtsai. Food antigen activates
intraepithelial and lamina propria lymphocytes in food-sensitive enteropathy in mice. Pediatr Res 1996;39:862-6 178.
Eigenmann PA. T lymphocytes in food allergy: Overview of an intricate
network of circulating and organ-resident cells. Pediatr Allergy Immunol 2002:13:162-71 179.
Bartuzi Z, Zbikowska-Gotz M, Romanski B. Evaluating the profile of selected
cytokines in patients with food allergy and chronic gastritis. Med Sci Monit 2000;6:1128-35 180.
Kweon MN, Yamamoto M, Kajiki M és mtsai. Systemically derived large
intestinal CD4+ Th2 cells play a central role in STAT6- mediated allergic diarrhea. Clin Invest 2000;106:199-206 181.
Sherman MA. The role of STAT6 in mast cell IL-4 production. Immunol Rev
2001;179:48-56 182.
Jung K, Linse F, Heller R, Moths C, Goebel R, Neumann Ch. Adhesion
molecules in atopic dermatitis: VCAM-1 and ICAM-1 expression is increased in healthy-appearing skin. Allergy 1996;51:452-60 183.
Lin T-J, Befus AD.
Mast cells and eosinophils in mucocal defences and
pathogenesis. In: Mucosal Immunology ed. Ogra PL, Mestecky J, Lamm ME, Strober W, Bienenstock J and McGhee JR, second ed. 1999, Academic Press, San Diego p 469-82 184.
Eigenmann PA, Tropia L, Hauser C. The mucosal adhesion receptor ? 4? 7 is
selectively increased in lymphocytes stimulated with ? -lactoglobulin in children allergic to cow’s milk. J Allergy Clin Immunol 1999;103:931-6
105
185.
Rott LS, Rose JR, Bass D, Williams MB, Greenberg HB, Butcher EC.
Expression of mucosal homing receptor alpha4beta7 by circulating CD4+ cells with memory for intestinal rotavirus. J Clin Invest 1997;100:1204-08 186.
Kantele A, Zivny J, Häkkinen M, Elson C, Mestecky J. Differential homing
commitments of antigen-specific T cells after oral or parenteral immunization in humans. J Immunol 1999;162:5173-7. 187.
Kantele JM, Arvilommi H, Kontiainen S, Salmi M, Savilahti E, Westerholm M,
Jalkanen S, Kantele A. Mucosally activated circulating human B-cells in diarrhoea express homing receptors directing them back to the gut. Gastroenterology 1996;110:1061-7. 188.
Kantele A, Kantele JM, Savilahti E, Westerholm M, Arvilommi H, Lazarovits
A, Butcher EC, Mäkelä PH. Homing potentials of circulating lymphocytes in humans depend on the site of activation: oral, but not parenteral, typhoid vaccination induces circulating antibody-secreting cells that all bear homing receptors directing them to the gut. J Immunol 1997;158:574-9 189.
al-Dawoud A, Nakshabendi I, Foulis A, Mowat AM. Immunohistochemical
analysis of mucosal gamma- interferon production in coeliac disease. Gut 1992;33:1482-6 190.
Kontakou M, Przemioslo RT, Sturgess RP, Limb GA, Ellis HJ, Day P, Ciclitira
PJ. Cytokine mRNA expression in the mucosa of treated coeliac patients after wheat peptide challenge. Gut 1995;37:52-7 191.
Kontakou M, Przemioslo RT, Sturgess RP, Limb AG, Ciclitira PJ. Expression of
tumour necrosis factor-alpha, interleukin-6, and interleukin-2 mRNA in the jejunum of patients with coeliac disease. Scand J Gastroenterol 1995;30:456-63 192.
Przemioslo RT, Kontakou M, Nobili V, Ciclitira PJ. Raised pro-inflammatory
cytokines interleukin 6 and tumour necrosis factor alpha in coeliac disease mucosa detected by immunohistochemistry. Gut 1994;35:1398-403 193.
Kontakou M, Sturgess RP, Przemioslo RT, Limb GA, Nelufer JM, Ciclitira PJ.
Detection of interferon gamma mRNA in the mucosa of patients with coeliac disease by in situ hybridisation. Gut 1994;35:1037-41 194.
Beckett CG, Dell'Olio D, Kontakou M, Przemioslo RT, Rosen-Bronson S,
Ciclitira PJ. Analysis of interleukin-4 and interleukin-10 and their association with
106
the lymphocytic infiltrate in the small intestine of patients with coeliac disease. Gut 1996;39:818-23 195.
Forsberg G, Hernell O, Melgar S, Israelsson A, Hammarstrom S, Hammarstrom
ML. Paradoxical coexpression of proinflammatory and down-regulatory cytokines in intestinal T cells in childhood celiac disease. Gastroenterology 2002;123:667-78 196.
Santin AD, Hermonat PL, Ravaggi A, Bellone S, Pecorelli S, Roman JJ, Parham
GP, Cannon MJ. Interleukin-10 increases Th1 cytokine production and cytotoxic potential in human papillomavirus-specific CD8(+) cytotoxic T lymphocytes. J Virol. 2000;74:4729-37 197.
Savilahti E, Örmala T, Arató A, és mtsai. Density of gamma/delta T cells in the
jejunal epithelium of patients with coeliac disease and dermatitis herpetiformis is increased with age. Clin Exp Immunol 1997;109:464-7 198.
Catassi C, Ratsch IM, Fabiani E, és mtsai. Coeliac disease in the year 2000:
exploring the iceberg. Lancet 1994;343:200-3 199.
Carlsson AK, Axelsson IE, Borulf SK, és mtsai. Serological screening for CD in
healthy 2.5-year-od children in Sweden. Pediatrics 2001;107:42-5 200.
Collin P, Salmi J, Hallstrom O. High frequency of coeliac disease in adult
patients with type I. diabetes. Scand J Gastroenterol 1989; 24: 81-84. 201.
Sigurs N, Johansson C, Elfstrand PO, és mtsai. Prevalence of coeliac disease in
diabetic children and adolescents in Sweden. Acta Paediatr 1993;82:748-5l 202.
Collin P, Kaukinen K, Maki M, és mtsai. Clinical features of CD today. Digest
Dis 1999;17:100-6 203.
Maki M, Holm K, Collin P, és mtsai. Increase in gamma/delta T cell receptor
bearing lymphocytes in normal small bowel mucosa in latent coeliac disease. Gut 1991;32,1412-4 204.
Arranz E, Bode J, Kingstone K, és mtsai. Intestinal antibody pattern of coeliac
disease: association with gamma/delta T cell receptor expression by intraepithelial lymphocytes, and other indices of potential coeliac disease. Gut 1994;35: 476-82 205.
Troncone R, Greco L, Mayer M, és mtsai. Latent and potential coeliac disease.
Acta Paediatr 1996; Suppl 412:1-4 206.
Schlesinger MJ. How the cell copes with the stress and the function of heat
shock proteins. Pediatr Res 1994;36:1-6
107
207.
Groh V, Steinle A, Bauer S, és mtsai. Recognition of stress- induced MHC
molecules by intestinal epithelial gammadelta T cells. Science. 1998;279:1737-40 208.
Troncone R, Franzese A, Mazzarella G, Papro F, Auricchio R, Coto I, Mayer M,
Greco L. Gluten sensitivity in a subset of children with insulin dependent diabetes mellitus. Am J Gastroenterol 2003;98:590-5 209.
Barera G, Bianchi C, Calisti L, és mtsai. Screening of diabetic children for
coeliac disease with antigliadin antibodies and HLA typing. Arch Dis Child 1991;66:49 210.
Gadd S, Kamath KR, Silink M, és mtsai. Co-existence of coeliac disease and
insulin dependent diabetes mellitus in children: screening sera using an ELISA test for gliadin antibody. Aust NZ J Med 1992;22:262-4 211.
Walsh CH, Cooper BT, Wright AD, és mtsai. Diabetes mellitus and coeliac
disease: a clinical study. QJM 1978;47:89-100 212.
Shanahan F, Mckenna R, McCarthy CF, és mtsai. Coeliac disease and diabetes
mellitus: a study of 24 patients with HLA typing. QJM 1982;51:329-35 213.
Sategna-Guidetti C, Grosso S, Pulitano R, és mtsai. CD and insulin-dependent
diabetes mellitus. Screening in an adult population. Dig Dis Sci 1994;39:1633-7 214.
Kaukinen K, Salmi J, Jorma L, és mtsai. No effect of gluten-free diet on the
metabolic control of Type 1 diabetes in patients with diabetes and CD: retrospective and controlled prospective survay. Diabetes Care 1999;22:1747-8 215.
Holmes GK, Prior P, Lane MR, és mtsai. Malignancy in coeliac disease – effect
of gluten free diet Gut 1989;30:333-8 216.
Sher KS, Jayanthi V, Probert CS, és mtsai. Infertility, obstetric and
gynaecological problems in coeliac sprue. Dig Dis 1994;12:186-90 217.
Valdimarsson T, Lofman O, Toss G, és mtsai. Reversal of osteopenia with diet
in adult coeliac disease. Gut 1996;38:322-7 218.
Freeman HJ, Chiu BK. Multifocal small bowel lymphoma and latent celiac
sprue. Gastroenterology 1986;90:1992-7
108
109
A
DOLGOZAT
TÉMÁJÁVAL
KAPCSOLATBAN
MEGJELENT
KÖZLEMÉNYEK
1. Veres G, Westerholm OM, Kokkonen J, Arató A, Savilahti E. Cytokines and adhesion molecules in duodenal mucosa of children with delayed-type food allergy. J Ped Gastroent Nutr 2003;37:27-34, IF: 2.077 2. Arató A, Körner A, Veres G, Dezsofi A, Ujpál I, Madácsy L. Frequency of coeliac disease in Hungarian children with type 1 diabetes mellitus. Eur J Pediatr 2003; 162: 1-5, IF: 1.22 3. Veres G, Helin T, Arató A, Farkkila M, Kantele A, Suomalainen H, Savilahti E. Increased expression of intercellular adhesion molecule-1 and mucosal adhesion molecule alpha(4)beta(7) integrin in small intestinal mucosa of adult patients with food allergy. Clin Immunol 2001;99:353-9, IF: 2.76 4. Veres G, Kokkonen J, Westerholm-Ormio M, Savilahti E, Arató A. In situ citokin mRNS hibridizáció és immunhisztokémiai markerek expressziója coeliákiás és ételallergiás
gyermekek
duodenum
nyálkahártyájában.
Gyermekgyógyászat,
2002;53:297-304 5. Veres G, Helin T, Farkkila M, Kantele A, Suomalainen H, Savilahti E, Arató A. Interleukin-4, interferon- gamma és lymphocyta sejtfelszíni markerek vizsgálata gabonaallergiás felnottek vékonybél- nyálkahártyájában. Orv Hetil 2002;143:455459 6. Veres G, Kokkonen J, Savilahti E, Arató A. Interferon-gamma és interleukin-4 expressziója
ételallergiás
gyermekek
vékonybél- nyálkahártyájában.
Gyermekgyógyászat, 2001;52:234-240 7. Veres G., Helin T., Arató A., Savilahti E. Adhéziós molekulák és lymphocyta markerek
vizsgálata
ételallergiások
Gyermekgyógyászat 2000, 51;3,224-231
110
vékonybél- nyálkahártyájában.
A DOLGOZAT TÉMÁJÁVAL KAPCSOLATBAN MEGJELENT IDÉZHETO ELOADÁSKIVONATOK JEGYZÉKE:
1. Veres G, Westerholm-Omio M, Kokkonen J, Arató A, Savilahti E. Characteristics of cytokine production and immunohistochemical markers in duodenal mucosa of children with coeliac disease and delayed-type food allergy. J Pedia tr Gastroenterol Nutr 2002, 34, 470 2. Veres G, Ujpál I, Kokkonen J, Westerholm-Ormio M, Savilahti Erkki, Arató A. Increment of gamma/delta T cells and crypt proliferation rate in duodenal mucosa of children with coeliac disease and delayed-type food allergy. Z. Gastroenterol 2002, 39,229 3. Veres G, Kokkonen J, Dezsofi A, Arató A, Savilahti E. Expression of cytokines and adhesion molecules in duodenal mucosa of children with food- hypersensitivity. J. Pediatr Gastroenterol Nutr 2001, 32, 377 4. Veres G, Kokkonen J, Dezsõfi A, Arató A, Savilahti E. Increased expression of interferon-gamma in duodenal mucosa of children with food hypersensitivity. Z Gastroenterol, 2001, 39, 429 5. Arató A, Körner A, Veres G, Bodánszky H, Szonyi L, Madácsy L. Prevalence of silent and latent coeliac disease in children with insulin-dependent diabetes mellitus. J. Pediatr Gastroenterol Nutr 2001, 32, 346 6. Arató A, Körner A, Veres G, Bodánszky H, Szonyi L, Madácsy L. Association of coeliac disease and insulin dependent diabetes mellitus in children. Z. Gastroenterol 2001, 39, 380 7. Veres G., Helin T., Arató A., Savilahti E. Expression of adhesion molecules and lymphocyte markers on small intestinal mucosa of patients with food hypersensitivity. Z. Gastroenterol. 2000, 38, 429 8. Veres G., Helin T., Arató A., Färkkilä M., Kantele A., Suomalainen H., Savilahti E. Increased intercellular adhesion molecule-1 and mucosal adhesion receptor alfa4beta7 integrin expression in small intestinal mucosa of patients with food hypersensitivity. J Pediatr Gastroenterol Nutr 2000, 31; Suppl 2, S128,
111
KÖNYVFEJEZET:
Arató A, Veres, G: A bélrendszer immunológiája. In: Gyermekgasztroenterológia ed: Arató A, Szonyi L, Elso kiadás, Medicina, Budapest, 2003;57-64
A
DOLGOZAT
TÉMÁJÁVAL
KAPCSOLATBAN
MEGJELENT
KÖZLEMÉNYEKKEL ELNYERT DÍJAK
1. Veres G., Helin T., Arató A., Färkkilä M., Kantele A., Suomalainen H., Savilahti E. Increased ICAM-1 and mucosal adhesion receptor alfa4beta7 integrin expression in small intestinal mucosa of patients with food hypersensitivity ?
Petényi Géza Alapítvány pályázata, I. díj, 2002
?
World Congress of Pediatric Gastroenterology, Hepatology and Nutrition, Boston, 2000, „Young Investigator Award” (kiemelt eloadás)
?
Országos Gyermekgyógyászati Kongresszus, Debrecen, 2000 „Legjobb eloadás díja”, elméleti kutatás tárgykörében
2. Veres G, Helin T, Färkkilä M, Kantele A, Suomalainen H, Savilahti E, Arató A. Interleukin-4, interferon- gamma és lymphocyta sejtfelszíni markerek vizsgálata gabonaallergiás felnottek vékonybél-nyálkahártyájában. ?
Babics Antal Alapítvány pályázata, II. díj
112
ÖSSZEFOGLALÓ
CITOKINEK, ADHÉZIÓS MOLEKULÁK ÉS PROLIFERÁCIÓS MARKEREK VIZSGÁLATA TÁPLÁLÉKALLERGIÁBAN ÉS CÖLIÁKIÁBAN Semmelweis Egyetem Doktori Iskola, Budapest, 2003
Témavezeto: Dr. Arató András
A táplálékfehérje indukálta enteropátia és cöliákia patomechanizmusa részleteiben nem ismert, foként az elobbi kórképben csak igen csekély ismeret áll rendelkezésünkre. Értekezésemben immunhisztokémiai és in situ hibridizációs módszerekkel különbözo citokinek, adhéziós molekulák és proliferációs markerek megjelenését elemeztem táplálékallergiások és cöliákiások vékonybél mukózájában. A táplálékallergiás gyermekek lamina propriájában IFN-? dominancia mutatkozott, amely valószínuleg a felelos citokin az immunaktivációs jegyekért. Az ép boholyszerkezet ellenére a még nem diétázó táplálékallergiás gyermekek fokozott kriptaproliferációt és HLA-DR expressziót mutattak, továbbá az intraepiteliális ?? T limfociták denzitása magasabb volt. Érdekes megfigyelés a TA-ás gyermekek duodenumában észlelt limfonoduláris hiperplázia, amely a magas ?? T sejtszámmal együtt az orális toleranc ia csökkenésére utalhat. Táplálékfehérje indukálta enteropátiás felnottek strukturálisan normális duodenális mukózájában - a gyermekekéhez hasonlóan - immunaktiváció jelei mutatkoztak, amit a fokozott kriptális proliferáció, a HLA-DR+ és Thelper CD4 sejtek nagyobb számaránya jelez. Az ICAM-1 mellett kimutatott szignifikánsan fokozott számú ? 4? 7 homing receptort
hordozó
sejtek
azt
jelzik,
hogy
ezek
az
adhéziós
molekulák
a
táplálékallergiában is fontos szerepet kapnak. Frissen diagnosztizált cöliákiás gyermekek duodenális mukózájában in situ hibridizációs módszerrel egyaránt fokozott IFN-? és IL-4 expressziót detektáltam. Az 1. típusú diabétesz mellitusban szenvedo gyermekekben a cöliákia prevalenciája vizsgálataink alapján 11.7%. Tünet- és panaszmentes, normális boholystruktúrával rendelkezo, de antiendomízium pozitív gyermekek többségénél detektáltunk emelkedett számú ??? T sejtet, jelezve a látens cöliákiát. A kimutatott sajátosságok segítenek megérteni az adott kórkép patomechanizmusát, de diagnosztikus és terápiás konzekvenciával is járhatnak a jövoben.
113
ABSTRACT
EXPRESSION OF CYTOKINES, ADHESION MOLECULES AND PROLIFERATION MARKERS IN FOOD ALLERGY AND IN CELIAC DISEASE
Semmelweis Medical University, Budapest, 2003 Supervisor: András Arató, MD
The pathomechanism of food-protein induced enteropathy and of celiac disease is not well known. My work was based on the ana lysis of cytokines, adhesion molecules and proliferation markers in the small intestinal mucosa of patients with food allergy and celiac disease by means of immunohistochemistry and in situ hybridisation. Increased expression of IFN-? found in the lamina propria of children with food allergy indicating its role for immune activation. Despite the normal structure, higher rate of cryptal proliferation, increased density of intraepithelial ?? T cells and HLA-DR staining were observed. It is of interest that lymphonodular hyperplasia was a characteristic finding in the duodenal bulb of children with food allergy which suggesting, with the increment of intraepithelial ?? T cells, the loss of oral tolerance. Like in children, signs for immune activation (higher crypt proliferation rate, increased density of HLA-DR and CD4 positive T cells) in the normal duodenal mucosa of adult patients with food allergy were shown. Increased expression of ICAM-1 and ? 4? 7 homing receptor positive cells suggest their role in the pathomechanism of food allergy. Higher number of IFN-? and IL-4 containing cells in the duodenal lamina propria of children with freshly diagnosed celiac disease using in situ hybridisation were detected. The prevalence of celiac disease among children with 1. type diabetes mellitus was 11.7%. In antiendomysium positive children, without symptoms and signs, and with normal villus structure, higher number of ??? T cells were found indicating latent celiac disease. Pattern of cytokines, adhesion molecules and other markers could help to understand the pathomechanism of immune mediated disorders like food allergy, and could attract diagnostic and therapeutic consequences in the near future.
114
