Mendelova univerzita v Brně Institut celoživotního vzdělávání
FUSARIÓZY KUKUŘICE ZÁVĚREČNÁ PRÁCE
Studijní program: Rostlinolékařství
Vedoucí: doc. Ing. Ivana Šafránková, Ph.D.
Brno 2013
9
Autor: Ing. Josef Svoboda, Ph.D.
10
11
Prohlášení o původu práce
Prohlašuji, že jsem závěrečnou práci na téma „Fusariózy kukuřice“ vypracoval samostatně a použil jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury.
V Brně dne 29. května 2013
Podpis studenta……………………
12
Poděkování
Rád bych touto cestou poděkoval doc. Ing. Ivaně Šafránkové, Ph.D. za odborné vedení po dobu studia a za cenné rady a připomínky při řešení závěrečné práce. Velké díky patří i mojí rodině za podporu, kterou mi dávali po dobu celého mého studia a poděkování patří rovněž kolegům ze zaměstnání.
13
OBSAH ABSTRACT ................................................................................................................................. 7 POUŽITÉ ZKRATKY ................................................................................................................ 8 1 ÚVOD .................................................................................................................................... 10 2 CÍL PRÁCE ........................................................................................................................... 11 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED...................................................................................................... 12 3.1 Kukuřice ........................................................................................................................................ 12 3.2 Rod Fusarium ................................................................................................................................. 12 3.2.1 Historie r. Fusarium ...................................................................................................................... 12 3.2.2 Charakteristika rodu Fusarium ..................................................................................................... 12 3.2.3 Výskyt druhů rodu Fusarium na kukuřici...................................................................................... 13 3.3 Mykotoxigenní druhy fusarií na kukuřici ........................................................................................ 14 3.3.1 Gibberella avenacea ..................................................................................................................... 14 3.3.2 Fusarium equiseti ......................................................................................................................... 15 3.3.3 Fusarium graminearum ................................................................................................................ 16 3.3.4 Fusarium oxysporum .................................................................................................................... 17 3.3.5 Fusarium culmorum ..................................................................................................................... 17 3.3.6 Fusarium poae .............................................................................................................................. 18 3.3.7 Fusarium proliferatum ................................................................................................................. 19 3.3.7 Fusarium semitectum .................................................................................................................. 20 3.3.8 Fusarium solani ............................................................................................................................ 20 3.3.9 Fusarium sporotrichioides ............................................................................................................ 21 3.3.10 Fusarium subglutinans ............................................................................................................... 22 3.4 Mykotoxiny ................................................................................................................................... 23 3.5 Mykotoxiny produkované druhy r. Fusarium ................................................................................. 24 3.5.1 Trichotheceny .............................................................................................................................. 24 3.5.1.1 Deoxynivalenol ..................................................................................................................... 25 3.5.1.2 T-2 toxin ............................................................................................................................... 27 3.5.2 Fumonisiny ................................................................................................................................... 28 3.5.2.1 Fumonisin B1 ........................................................................................................................ 30 3.5.2.2 Fumonisin B2 ........................................................................................................................ 30 3.5.3 Zearalenony ................................................................................................................................. 30 3.5.3.1 Zearalenon, F-2 toxin............................................................................................................ 31 3.5.4 Emerging mykotoxiny................................................................................................................... 32 3.5.5 Konjugované (maskované) mykotoxiny ....................................................................................... 33 3.6 Vliv mykotoxinů na zdraví člověka a zvířat .................................................................................... 33 3.7 Faktory vzniku toxinů .................................................................................................................... 34 3.8 Monitoring výskytu mykotoxinů v České republice ........................................................................ 35 3.8.1 Monitoring mykotoxinů v potravinářských obilninách v ČR ........................................................ 36 3.8.2 Monitoring mykotoxinů v krmivech v ČR ..................................................................................... 37
14
3.9 Způsoby a metody stanovení mykotoxinů ..................................................................................... 38 3.9.1 Odběr vzorků k laboratornímu stanovení .................................................................................... 38 3.9.2 Stanovení mykotoxinů ................................................................................................................. 39 3.9.2.1 Plynová chromatografie (GC) ............................................................................................... 39 3.9.2.2 Chromatografie na tenké vrstvě (TLC).................................................................................. 40 3.9.2.3 Vysokoúčinná tenkovrstvá chromatografie (HPTLC) ............................................................ 40 3.10 Legislativa v oblasti mykotoxinů .................................................................................................. 40 3.11 Ochrana kukuřice proti houbám rodu Fusarium........................................................................... 42 3.11.1 Preventivní opatření při pěstování kukuřice .............................................................................. 42 3.11.1.1 Hybridní kukuřice ............................................................................................................... 42 3.11.1.2 Agrotechnika ...................................................................................................................... 43 3.11.1.3 Sklizeň................................................................................................................................. 43 3.11.2 Preventivní opatření po sklizni kukuřice .................................................................................... 44 3.11.2.1 Skladování .......................................................................................................................... 44 3.11.2.2 Silážování ............................................................................................................................ 44
4 ZÁVĚR................................................................................................................................... 47 5 POUŽITÁ LITERATURA................................................................................................... 48 6 PŘÍLOHY .............................................................................................................................. 54 6.1 Seznam tabulek ............................................................................................................................. 54 6.2 Seznam obrázků............................................................................................................................. 55
15
ABSTRACT Phytopathogenic fungi of the genus Fusarium are important pathogens of maize, which negatively effect the yield and many of them are also among the secondary producers of mycotoxins. The aim was to describe the different species of the Fusarium that occur in the growing and processing corn. F. graminearum, F. culmorum, F. acuminatum, F. semitectum, F. verticillioides and others produce mycotoxins, especially trichothecenes, zearalenone and fumonisin contaminated and thus the overall production. The work also focuses on the description of mycotoxins and their effects on human and animal health. It also summarizes the valid legislation, which is controlled by the maximum amount of Fusarium toxins in raw materials intended for food and feed production. The final section is devoted to each measure, which should aim to minimize the infestation of plants fusariosis and by suppressing the production of mycotoxins.
Key words: Fusarium, maize, mycotoxins, legislation
ABSTRAKT Houby rodu Fusarium jsou významnými patogeny kukuřice, které negativně ovlivňují výnos a některé z nich se řadí mezi producenty mykotoxinů. Cílem práce bylo popsat jednotlivé druhy r. Fusarium, které se vyskytují při pěstování a zpracování kukuřice. F. graminearum, F. culmorum, F. acuminatum, F. semitectum, F. verticillioides a další produkují mykotoxiny, především trichotheceny, fumonisiny a zearalenon a kontaminují tak výsledné produkty. Uveden je přehled a charakteristika jednotlivých mykotoxinů a jejich vliv na zdraví lidí a zvířat. Stručně je sumarizována platná legislativa regulující maximální množství těchto fusariových toxinů v surovinách určených pro výrobu potravin a krmiv. Závěrečná část práce je věnována opatřením, která by měla směřovat k minimalizaci napadení rostlin fusarii a tím i výskyt mykotoxinů.
Klíčová slova: Fusarium, kukuřice, mykotoxiny, legislativa
7
POUŽITÉ ZKRATKY BEA DAS DDGS DON DNA ENNs EU IARC IOR OTA RNA TDI VFZ WHO ZEA ZON
beauvericin diacetoxyscirpenol sušené výpalky s rozpustným podílem deoxynivalenol deoxyribonukleová kyselina enniatiny Evropská unie Mezinárodní agentura pro výzkum rakoviny integrovaná ochrana rostlin ochratoxin A ribonukleová kyselina hladina tolerovatelného denního příjmu podíl fusariových zrn Světová zdravotnická organizace zearalenon zearalenon
8
1 ÚVOD V současné době je celosvětově kukuřice významně zastoupena ve struktuře pěstovaných plodin. V nedávné době považována za plodinu, která není ve velké míře napadána škodlivými patogeny a škůdci. V důsledku stále se rozšiřujících ploch, pěstování v monokulturách, minimálnímu zpracování půdy, používání úzkých osevních sledů a klimatickým změnám se začaly u kukuřice vyskytovat nezanedbatelné problémy. Za významné patogeny kukuřice jsou v poslední době považovány i fytopatogenní houby, které způsobují 10–30% snížení výnosu a tím značné ekonomické ztráty. Mezi houbové patogeny s vysokým potenciálem škodlivosti patří i houby z rodu Fusarium, které jsou rozšířeny ve všech oblastech pěstování kukuřice. Výskyt a rozvoj houbových chorob podstatným způsobem podporuje poškození kukuřice živočišnými škůdci, především zavíječem kukuřičným. Vedle snížení výnosů je daleko významnějším rizikem z pohledu bezpečnosti potravního řetězce kontaminace sklizňových produktů mykotoxiny. Tyto toxické sekundární metabolity jsou produkovány více druhy mikroskopických vláknitých hub, mezi které patří i houby r. Fusarium. Mykotoxinová kontaminace zemědělských komodit určených pro potravinářské zpracování a pro krmné účely, je závažným celosvětovým problémem. Dokládají to i opakované žádosti dozorčí organizace nad bezpečností potravin (EFSA) o nová data k této problematice. S minimalizací mykotoxinové kontaminace potravin a krmiv je potřeba začít už od prvovýroby, tj. dodržováním správných agrotechnických postupů. I když snaha o produkci kvalitních zemědělských surovin v souladu se zásadami správné zemědělské praxe je značná, přítomnost fusarií v obilninách úplně eliminovat nelze. Během technologického zpracování cereálií koncentrace fusarií sice klesá, ale k významnější degradaci vzhledem k jejich tepelné a chemické stabilitě nedochází. Přítomnost určité hladiny mykotoxinů v cereálních produktech dostupných v obchodní síti nebo v krmivech pro hospodářská i zájmová zvířata je tedy běžná.
10
2 CÍL PRÁCE Cílem závěrečné práce bylo vypracovat literární přehled nejzávažnějších fusarióz kukuřice, charakterizovat jednotlivé mykotoxigenní druhy r. Fusarium a jejich produkty, mykotoxiny. Popsat účinky mykotoxinů na živočišné organismy a člověka a doporučit vhodná opatření pro pěstování kukuřice směřující ke snížení napadení houbami rodu Fusarium.
11
3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Kukuřice Kukuřice setá (Zea mays L.) je rostlinou, která společně s hustě setými obilninami a řepkou představuje nezastupitelné místo ve struktuře pěstovaných plodin v České republice. Plochy oseté kukuřicí se ve světě, ale i v České republice, rozšiřují, a to i přesto, že za posledních dvacet let došlo k významnému snížení počtu chovaných hospodářských zvířat, která byla významnými konzumenty kukuřičné siláže. Kukuřičná siláž se ale stala stěžejním zdrojem biomasy pro bioplynové stanice a lze konstatovat, že kukuřice je dnes velmi žádanou komoditou se zajištěným odbytem.
3.2 Rod Fusarium Taxonomické zařazení rodu Fusarium: říše Fungi, oddělení Ascomycota, řád Hypocreales, čeleď Hypocreaceae, rod Fusarium (Malíř et al., 2003). 3.2.1 Historie r. Fusarium Rod Fusarium byl popsán Linkem v roce 1809 jako druh s vřetenovitými nedělitelnými konidiemi (Booth, 1971). S mikroskopickými houbami, pouhým okem nerozlišitelnými, se mohl člověk seznámit až s objevem mikroskopu a rozvojem mikroskopických metod (Ostrý, 2002). 3.2.2 Charakteristika rodu Fusarium Druhy tohoto rodu patří mezi nejvíce prostudované patogeny způsobující onemocnění nejen polních plodin (kukuřice, pšenice, ječmene), zeleniny a okrasných rostlin, ale i potravin a krmiv, snižující kvalitu pěstovaných plodin a způsobující značné ekonomické ztráty (Booth 1971, Glenn 2007). Některé druhy r. Fusarium produkují chemicky rozmanité mykotoxiny, např. diacetoxyscirpenol, deoxynivalenol, nivalenol, T-2 toxin, zearalenon, fumonisiny, fusarin C, beauvericin, moniliformin a fusaproliferin (Glenn 2007, Covarelli et al., 2012). Fusaria vytvářejí dobře vyvinuté vegetativní mycelium s konidiálním stadiem tvořícím buď volné jednotlivé konidiofory, na nichž se vyskytují mikrokonidie, nebo se konidiofory shlukují do makroskopicky viditelných, drobných polštářovitých útvarů, tzv. sporodochií. Makrokonidie jsou dvoubuněčné až vícebuněčné spory a mají typický srpovitý tvar. Mikrokonidie jsou jednobuněčné, elipsoidní, oválné nebo široce vejčité. 12
Na konci konidiogenní buňky tvoří řetězce nebo shluky. Pro určení druhu jsou charakteristické makrokonidie, u nichž se sleduje počet buněk, velikost, tvar zahnutí, velikost a způsob vzniku v řetízku nebo ve slizovém shluku (Malíř et al., 2003). Dle Bootha (1971) některé druhy vytvářejí v hojné míře chlamydospory, které jsou různého tvaru i velikosti, s různým počtem buněk, často se zbarvenou buněčnou stěnou. Fusaria mohou tvořit také tuhé kulovité útvary, tzv. sklerocia (Malíř et al., 2003). Některé druhy hub rodu Fusarium tvoří teleomorfní stadium, tj. perithecia s asky a askosporami (Širučková, Kroutil, 2007). 3.2.3 Výskyt druhů rodu Fusarium na kukuřici Malíř et al. (2003) řadí druhy rodu Fusarium k významným patogenům kořenového systému a báze stébla rostlin. Rostliny mohou napadat v každé fázi vývoje (Lepschy et al., 1992), ale hlavním obdobím, kdy dochází k napadení kukuřice, je fáze vzcházení. Riziko napadení kukuřice fusarii narůstá při častém zařazování kukuřice do osevního sledu, riziko napadení palic i zpracováním půdy s vynecháním orby. Rozvoj hub podporuje vysoká půdní a vzdušná vlhkost, nesprávná výživa (především dusíkem) a malý podíl organické hmoty (hlavně živočišného původu) v půdě (Hrudová et al., 2006). Podstatným faktorem je také napadení osiva během mokré sklizně či skladování vlhkého osiva (Kazda et al., 2010). Zrna kukuřice bývají osídlena mikroskopickými houbami, které mohou snižovat klíčivost a vzcházivosti rostlin. Jedná se především o zástupce rodu Penicilium, Aspergillus a Fusarium (Kazda et al., 2010). Infekci klasu kukuřice způsobují především druhy F. graminearum, F. verticillioides a F. proliferatum, zatímco stonku nejčastěji druhy F. equiseti, F. proliferatum a F. verticillioides (Dornem et al., 2011). Nejvyšší koncentrace fumonisinů ve stoncích i v klasu byla zjištěna ve fázi plné zralosti Uegaki et al. (2012). Přibližně od fáze časné mléčné zralosti (BBCH 73) začínají být patrné příznaky napadení palic fusarii – tzv. bílorůžová hniloba zrn. Příznakem napadení je nepravidelné vyzrávání, deformace, hnědavé až červenofialové zabarvení zrn. Při vyšší vlhkosti se na palici objevují bělavé, popřípadě narůžovělé povlaky mycelia. Fusaria mohou být příčinou i růžové hniloby stébel kukuřice. Produkty z kukuřice bývají často kontaminovány toxiny produkovanými fusarii ve větší míře, než povolují normy. Napadené palice a sláma by proto neměly být používány jako surovina pro výrobu potravin ani krmiv (Kazda et al., 2010). 13
V tropických oblastech je převládajícím druhem napadajícím kukuřici Fusarium graminearum, které produkuje mykotoxiny deoxynivalenol a zearalenon. Vzhledem k předpokládaným změnám v klimatu se předpokládá, že bude ovlivněn výskyt hub rodu Fusarium a tím i jejich druhotných metabolitů (Van Asselt et al., 2012). Scauflaire (2012) z kukuřice izoloval v 2012 v Belgii nový druh fusaria, Fusarium temperatum, který je morfologicky podobný a úzce souvisí s F. subglutinans.
3.3 Mykotoxigenní druhy fusarií na kukuřici Vláknité houby rodu Fusarium se vyskytují především v půdě (Fassatiová, 1979), přezimují na poli na rostlinných zbytcích, převážně na zbytcích po pěstování kukuřice na zrno (Hýsek et al., 2003, Tvarůžek et al., 2000). Houby rodu Fusarium jsou producenty trichothecenů, fumonisinů a zearalenonu (Hajšlová et al., 2009). Jsou natolik adaptabilní, že mohou produkovat toxiny také v již sklizených obilninách, během skladování, a to v přímé závislosti na vlastnostech zrna a podmínkách prostředí (Polišenská, 2008). Zdrojem fusarií může být i napadené osivo (Leslie a Summerell, 2006). Tab. 1: Druhy rodu Fusarium v potravinách (Malíř et al., 2003) Druh F. acuminatum Ellis & Everh. F. avenaceum (Fr.) Sacc. F. culmorum (W. G. Smith) Sacc. F. equiseti (Corda) Sacc. F. graminearum Schwabe F. oxysporum Schltdl. F. poae (peck) Wollenw F. semitectum Berk. & Ravenel F. sporotrichioides Sherb. F. chlamydosporum Wollenw. & Reinking 3.3.1 Gibberella avenacea Anamorfa: Fusarium avenaceum (Fr., 1822) Teleomorfa: Gibberella avenacea (Sacc., 1886) F.avenaceum se vyskytuje v půdě mírného klimatického pásma, bylo však zjištěno i v poušti a v lesních půdách (Leslie a Summerell, 2006) a pro jeho šíření jsou ideální chladnější oblasti. Poprvé bylo popsáno v roce 1822 švédským profesorem Eliasem M. Friesem. F.avenaceum je patogenem mnoha druhů rostlin, u nichž 14
způsobuje různá onemocnění, např. suchá hnilobu bramborových hlíz, hniloba kořenů a klasů obilnin aj. F. avenaceum vytváří protáhlé makrokonidie, na konci prohnuté, se třemi až pěti septy. Mikrokonidie ani chlamydospory netvoří. Pohlavní stadium Gibberella avenacea bylo popsáno na klasu pšenice (Anne, 2006). V kultuře vytváří oranžové až světle hnědé porosty (Desjardins, 2006). Na umělé živné půdě dochází často k mutacím. F. avenaceum je nejčetnějším zástupcem rodu Fusarium, ale toxicita pro člověka a živočichy nebyla prokázána, ale půdní kultury jsou toxické pro myši a kuřata. F. avenaceum je odolné vůči fungicidům (Ostrý 2002, Anne 2006, Desjardins 2006). Obr. 1: Fusarium avenaceum (Fassatiová 1979)
a – konidiofory, b – makrokonidie
3.3.2 Fusarium equiseti F. equiseti (Corda, 1838) Sacc. bylo Augustem C. J. Cordou původně pojmenováno Selenosporium equiseti a název publikován v Praze roku 1838. Dříve bylo považováno za patogena starších rostlin, nyní je jeho výskyt sledován u více než 240 druh rostlin a semen. F. equiseti zatím nebylo potvrzeno jako patogen vyvolávající toxikózy lidí a zvířat (Anne, 2006). F. equiseti tvoří ve velkém množství chlamydospory, ale netvoří mikrokonidie.
15
Obr. 2: Fusarium equiseti (Fungi of Great Britain and Ireland, 2013)
3.3.3 Fusarium graminearum Teleomorfa: Gibberella zeae (Schwein., 1838) Petch Anamorfa: Fusarium graminearum Schwabe F. graminearum bylo izolováno v roce 1838 z kukuřice a pojmenováno americkým mykologem Lewisem Davidem von Schweinitzem. Na glukosobramborovém agaru kultury tvoří bílý, nahnědlý, růžový až červený pigment (Anne 2006, Leslie a Summerell 2006), mycelium je bílé, vločkovité. Zbarvení kultury závisí na typu živné půdy a pH (Fassatiová, 1979). Konidiofory jsou jednoduché, popřípadě větvené a často se shlukují do sporodochií (Demeke, 2010). Makrokonidie mají 3 až 7 přehrádek a dle Leslie a Summerella (2006) vytváří, ve srovnání s ostatními druhy, méně makrokonidií. Zřídka se tvoří kulovité tlustostěnné chlamydospory (Anne, 2006). Makrokonidie a askospory jako zdroj infekce mohou přetrvávat na rostlinných zbytcích až po dobu tří let (Širučková, Kroutil, 2007). F. graminearum se vyskytuje na obilninách (kukuřice, pšenice, rýže, oves, ječmen) a dalších plodinách (rajčata, luštěniny) celého světa. Produkuje zejména DON, ZEA a nivalenol. V 80. letech v USA F. graminearum vyvolalo dietetické a zdravotní problémy chovaných prasat (Anne 2006, Polišenská 2008, Polišenská 2009). F. graminearum tvoří na infikovaných palicích a zbytcích rostlin ve sporodochiích makrokonidie, které jsou deštěm rozstřikovány na další stébla a listy a vyvolávají sekundární infekce. Zdrojem primární infekce je napadené osivo nebo rostlinné zbytky ponechané na pozemku (Širučková, Kroutil, 2007) 16
Obr. 3: Fusarium graminearum (Fassatiová 1979)
a – konidiofor s makrokonidiemi, a1 – konidiofor s mikrokonidiemi, b – makrokonidie, c – chlamydospory
3.3.4 Fusarium oxysporum Anamorfa: Fusarium oxysporum (Schlechtend. Emend. Snyder & Hansen, 1824) F. oxysporum bylo poprvé popsáno německým botanikem D. F. L. von Schlechtendahlem v roce 1824. Napadá rostliny a osivo mnoha druhů plodin (Anne, 2006). Zabarvení kolonií je rozmanité, tvoří bílé, světle až tmavě fialové mycelium. Obr. 4: Fusarium oxysporum (Mycology online 2013)
3.3.5 Fusarium culmorum F. culmorum (W. G. Smith) Sacc. (1892) je významným zástupcem fusarií v oblastech mírného pásma, ale vyskytuje se i v chladnějších oblastech Evropy jako patogen především bramboru a obilnin (Leslie a Summerell 2006, Nicholson 1998). Produkuje mykotoxiny moniliformin, deoxynivalenol a trichotheceny (Wagacha, 2007), jejichž negativní působení je spojováno s dermatitidou člověka. F. culmorum na sladinovém agaru tvoří bílé vločkovité mycelium, jehož barva se postupným stárnutím mění na žlutou až červenou (Osborne, 2007). Makrokonidie jsou krátké a silné a vzhledem ke své délce poměrně široké. Vyznačují se většinou 17
jednotným tvarem a velikostí (Nicholson, 1998). Tvorba mikrokonidií nebyla pozorována (Leslie a Summerell, 2006). Výrazným znakem F. culmorum v přirozeném prostředí jsou korálově zbarvená sporodochia (Wagacha, 2007), která jsou zpočátku světle oranžová a později přecházejí do hnědé barvy (Leslie a Summerell, 2006). Chlamydospory jsou kulovité nebo oválné, na povrchu hladké nebo drsné a vyznačují se poměrně rychlým a hojným růstem (Fassatiová, 1979). Obr. 5: Fusarium culmorum (Fassatiová, 1979)
a – interkalární chlamydospory, b – konidiofor s makrokonidiemi, c – makrokonidie s chlamydosporou
3.3.6 Fusarium poae Anamorfa: Fusarium poae (Peck, 1902) Wollenw. Anamorfa F. poae byla v roce 1902 popsána Charlesem H. Peckem jako Sporottrichum poae. Na sladinovém agaru tvoří bílé až červenohnědé rychle rostoucí mycelium, na substrátu žluté až karmínově červené (Glenn, 2007) s vřetenovitými makrokonidiemi. Mikrokonidie vznikající v řetízcích jsou mírně zakřivené, hruškovité až citrónovité (Fassatiová, 1979). F. poae tvoří chlamydospory (Anne ,2006). Vyskytuje se na mnoha druzích plodin (rostliny i semena) a vyvolává nespecifikované humánní a zvířecí toxikózy (Anne, 2006). V ČR patří F. poae k dominantním patogenům ječmene. U tohoto druhu byla prokázána možnost koprodukce T2-toxinu a nivalenolu, mykotoxinů, které jsou mnohem toxičtější než např. DON. U ovsa spočívá hlavní problém v tom, že na rozdíl od pšenice, kukuřice a ječmene, kde jsou příznaky napadení zřejmé již za vegetace, nemusí být napadení lat fusarii pouhým okem pozorovatelné. (Polišenská 2008, Polišenská et al., 2009). Produkce mykotoxinu fusariogeninu, vyskytujícím se na přezimujících obilkách na poli, je zásadní ve vztahu ke zdraví lidí a zvířat (Ostrý, 2002).
18
Obr. 6: Fusarium poae (Fassatiová 1979)
a – makrokonidie, b – mikrokonidie
3.3.7 Fusarium proliferatum Fusarium proliferatum (Matsushima, 1971) Nirenberg ex Gerlach & Nirenberg. V roce 1971 popsal T. Matsushima F. proliferatum jako Cephalosporium proliferatum. Napadá kukuřici, rýži, sóju, asparágus, banány aj. a způsobuje značené ekonomické ztráty (Anne, 2006). Jednotlivé kmeny na substrátu vytvářejí rozmanité barevné variace od bílé, šedavé, po tmavě fialovou, popřípadě černou barvu. Obr. 7: Fusarium proliferatum (mycotoxinsinfo 2013)
19
3.3.7 Fusarium semitectum Fusarium semitectum (Berk. & Ravenel, 1875). Britský mykolog Miles J. Berkeley izoloval z řapíku banánového listu houbu, kterou roku 1875 popsal jako F. semitectum. Od té doby bylo zaznamenáno v různých druzích půd, rostlinných zbytích, tropických a subtropických rostlinách. Mycelium je zbarveno bíle, béžově až slabě růžově a podpovrchové vrstvy jsou tmavě hnědé. Mikrokonidie zpravidla chybí a produkce chlamydospor je variabilní (Anne, 2006). Obr. 8 Fusarium semitectum (Ecoport, 2013)
3.3.8 Fusarium solani Fusarium solani (Mart., 1842) Sacc. F. solani izoloval C. P. P. von Martius ze shnilých rajčat a popsal již v roce 1842 jako Fusisporium solani. Do rodu Fusarium byl zařazen v roce 1881 italským mykologem Piersem A. Saccardo. Tvoří řídké krémově bílé mycelium s podpovrchovou namodralou až světle hnědou barvou. Kmeny F. solani var. coeruleum mohou na živné půdě tvořit zářivě modrý pigment. Makrokonidie jsou v průměru tří až čtyř přehrádečné, mírně zakřivené. Četné jsou nepravidelné mikrokonidie i chlamydospory (Malíř et al. 2003, Anne, 2006).
20
Obr. 9: Fusarium solani (Life-Worldwide.org, 2013)
3.3.9 Fusarium sporotrichioides Fusarium sporotrichioides (Sherb., 1915). F. sporotrichioides bylo poprvé popsáno v roce 1915 rostlinným patologem Constantine D. Sherbakoffem v New Yorku, který ho izoloval z
hnijících
bramborových hlíz. Patogen je přítomen v různých druzích půd, rostlin (především obilnin) vyskytujících se a pěstovaných v mírném podnebném pásmu, kde způsobuje značné ekonomické ztráty (Anne, 2006). Obr. 10: Fusarium sporotrichoides (Schimmel-finden.de, 2013)
21
3.3.10 Fusarium subglutinans Fusarium subglutinans (Wollenw, & Reinking) P. E. Nelson, Toussoun & Marasas (1893). F. subglutinans bylo objeveno a popsáno jako F. moniliforme var. subglutinans. Mycelium je šedo-oranžové až tmavě fialové. Tenkostěnné makrokonidie jsou děleny třemi až pěti přepážkami, mikrokonidie jsou vřetenovité F. subglutinans napadá kukuřici, čirok, cukrovou řepu, banány a ananas aj. (Anne, 2006). Obr. 11: Fusarium subglutinans (Wiki.bugwood.org, 2013)
Tab. 2: Výskyt hub r. Fusarium v potravinách (Malíř et al., 2003) Druh F. avenaceum
F. equiseti F. graminearum F. longines
F. moniliforme
F. oxysporum
F. poae
Potravina kukuřice, pšenice, ječmen, čirok, triticale, hrášek, jablka, hrušky, asparágus, rajčata, lilek, brambory, arašídy kukuřice, obiloviny, obilné zrno, pšenice, kukuřice, ječmen, žito, rýže, čirok, sójové boby, vikev, rajčata, banány, dýně, ovocný džus, paprika, arašídy, vlašské ořechy kukuřice, pšenice, ječmen, čirok, triticale, cukrová řepa, sójové boby, banány, sušené maso kukuřice, rýže, vikev, sója, sezamová semena, arašídy zrno kukuřice, rýže, čirok, ječmen, sladké brambory, květák, česnek, ananas, banány, asparágus, lískové a pekanové ořechy, arašídy, ořechy kola, koriandr, pískavice = řecké seno, kardamon, pepř, sušené maso, sýry kukuřice, obiloviny, rýže, čirok, ječmen, sladké brambory, květák, okurky, meloun, olej z datlové palmy, rajčata, hrách, sójové boby, vikev, banány, citrusové plody, jablka, ovocný džus, česnek, brambory, semena koriandru, kakaové boby, paprika, sýr kukuřice v chladnějších oblastech, pšenice, ječmen, oves, sójové boby
22
F. proliferatum
kukuřice, čirok, rýže, sója, banány
F. sporotrichioides
kukuřice, čirok, rýže, nahnilé ovoce, banány, sójové boby, slunečnicové semeno, citrusové ovoce, rajčata, meloun, okurka, brambory, arašídy, koriandr kukuřice, čirok, rýže, sladké brambory, zelenina, meloun, nezralé ovoce, boby, fazole, sójové boby, hrách, banány, cukrová řepa, česnek, arašídy, paprika, koriandr, pepř kukuřice, obiloviny, pšenice, čirok, cukrová řepa, sójové boby, arašídy, černý pepř, paprika
F. subglutinans
kukuřice, čirok, cukrová řepa, banány, ananas
F. semitectum
F. solani
3.4 Mykotoxiny Mykotoxiny představují význačný fenomén, který se jako závažný problém objevil až ve druhé polovině minulého století (Polster ,1984). Ovšem samotné důsledky kontaminace potravin mykotoxiny získala dle Waśkiewitze et al. (2012) celosvětovou pozornost v posledních deseti letech a OSN uvádí, že až čtvrtina světové produkce potravin je znehodnocena mykotoxiny. Mykotoxiny jsou toxické sekundární metabolity produkované mikroskopickými vláknitými houbami napadajícími drobnozrnné cereálie a kukuřici (Ostrý 2002, Malíř et al. 2003, Moretti et al. 2006, Schneiderová 2007, Hajšlová et al. 2009). Mykotoxiny jsou strukturně odlišné komplexní organické sloučeniny o nízké molekulové hmotnosti (do 700 g.mol-1). Jsou nebílkovinné povahy, toxické pro člověka a živé organismy. Pravděpodobnou příčinou produkce mykotoxinů je boj o potravu a přežití (Malíř et al., 2003). Způsobují závažná onemocnění akutního i chronického rázu, negativně ovlivňující život člověka i zvířat (Paříková, Kučerová 2001). Dle Hajšlové et al. 2009 se jedná především o druhy r. Alternaria, Aspergillus, Penicillium a Fusarium. Kromě značného snížení technologické kvality pěstovaných cereálií, závažným problémem v potravinářství je hlavně přenos mykotoxinů do potravin, případně další uvolňování jejich tzv. „maskovaných forem“, ke kterému běžně dochází při technologickém zpracování, zejména během sladařsko-pivovarské technologie. Přítomnost mykotoxinů v plodinách nebo v krmivech závisí na mnoha faktorech, např. klimatických podmínkách, druhu a citlivosti plodiny, typu plísně, poškození zrnin hmyzem nebo mechanicky, užití fungicidů při sklizni, podmínky skladování a následná manipulace (Schneiderová, 2007).
23
Do těla se mykotoxiny dostávají se sporami při jejich vdechnutí a mají cytotoxické účinky na organismus (Paříková, Kučerová 2001). I když je obtížné charakterizovat nebezpečnost mykotoxinů komplexně, některé základní charakteristiky jsou společné. Kromě toho, že mykotoxiny jsou produktem houbových organismů, které jsou produkovány jako prostředky pro přežití v boji s konkurenčními organismy a látky, napomáhající houbovým patogenům kolonizovat hostitelské rostliny, mají celou škálu nepříjemných vlastností pro teplokrevné živočichy. Mykotoxiny totiž působí na většinu orgánů v těle konzumenta (Nedělník, 2012).
3.5 Mykotoxiny produkované druhy r. Fusarium Zástupci rodu Fusarium jsou součástí půdního ekosystému, kde se podílí na rozkladu organické hmoty. Řada druhů se během evoluce přizpůsobila k parazitismu rostlin, část za určitých podmínek může být patogenní i pro živočichy, včetně člověka (Malíř et al., 2003). Mezi houby s významným potenciálem škodlivosti patří mj. i fusaria. Škodlivost klasových fusarií spočívá zejména v redukci výnosu a kontaminace sklizně mykotoxiny. Maximální obsahy některých fusariových mykotoxinů v obilninách určených pro produkci potravin jsou v EU limitovány (Polišenská et al., 2009). 3.5.1 Trichotheceny Dosud bylo identifikováno a popsáno více než 150 trichothecenových mykotoxinů, které tvoří nejpočetnější skupinu fusariových mykotoxinů (Paříková, Kučerová 2001). Jde o tricyklické seskviterpeny charakterizované dvojnou vazbou mezi uhlíkem 9 a 10 a jedním epoxy kruhem mezi uhlíkem 12 a 13 a jsou klasifikovány jako 12, 13-epoxytrichotheceny (Gutleb et al., 2002). Jednotlivé trichotheceny jsou odlišné kvůli různým substituentům na uhlíku 3,4,7,8 a 15 (Hussein, Brasel 2001). Dle Hajšlové et al. (2009) je kontaminace sledována u cereálií, především u pšenice a kukuřice. Trichotheceny byly prokázány i u sójových bobů, banánů, manga, ale i v pivu, kam přechází z kontaminovaného ječmene. Podle charakteristických vlastností, počtu funkčních a substitučních skupin se rozlišují čtyři základní skupiny trichothecenů. Trichotheceny typu A (T-2 a HT-2 toxiny, NEO, DAS) mají vyšší akutní toxicitu
než
trichotheceny
typu
B
(deoxynivalenol
DON,
nivalenol
NIV,
acetyldeoxynivalenol 3-ADON, 15-acetyldeoxynivalenol 15-ADON, fusarenon-X FUS24
X), které vykazují toxicitu chronickou (Hajšlová et al. 2009, Hajšlová et al. 2010). Dle Hajšlové et al. (2010) se intoxikace trichotheceny projevuje krvácením sliznic trávicího ústrojí a zánětlivými projevy v organismu. Akutní intoxikaci provází zvracení, u chovaných hospodářských zvířat odmítáním potravy (Gutleb et al., 2002, Kushiro 2009). Ztrátou hmotnosti, poruchami imunologického systému se projevuje chronické působení trichothecenů (Larsen et al., 2004). Trichotheceny způsobují inhibici mitochondriálních funkcí, proteosyntézy a syntézy DNA a RNA in vitro a in vivo. Studiemi bylo prokázáno, že trichotheceny typu A i B mají imunosupresivní účinky (Gutleb et al., 2002, He et al., 2009). Autoři Gutleb et al., (2002) a He et al. (2009) uvádějí, že nejnižší akutní toxicitu ve skupině trichothecenů vykazuje DON, naopak nejvíce toxický je trichothecen T-2 toxin, jenž ovlivňuje funkci mnohobuněčných membrán a způsobuje apoptózu, tzv. řízenou buněčnou smrt (Hajšlová et al., 2010). Na základě Doporučení komise č. 2013/165/EU byly k T2 a HT2 toxinům doplněny limity, pro kukuřičné zrno k lidské výživě je maximální hodnota stanovena na 100 µg.kg-1. Pro výrobky z kukuřice pro výrobu krmiv je hodnota stanovena na 500 µg.kg-1 a pro výrobu krmných směsí pro kočky je tato dávka poloviční (250 µg.kg-1), (Doporučení Komise 2013/165/EU). 3.5.1.1 Deoxynivalenol Deoxynivalenol (DON, Rd toxin, vomitoxin), C15H20O6, Číslo CAS: 51481-10-8 Název:
Trichothec-9-en-8-one,
12,
13-epoxy-3,7,15-trihydroxy-
(3a,
7a).
Deoxynivalenol patří mezi významné zástupce mykotoxinů trichotecenové skupiny B (Lepschy et al., 1992). Z hlediska způsobu biosyntézy patří mezi seskviterpeny, je dobře rozpustný v acetronitrilu, chloroformu, směsi octan etylnatý + acetonitril (4:1), ve směsi chlorofrom+metanol (9:1) a nerozpustný v hexanu a petroléteru (Malíř et al., 2003, Hajšlová et al., 2009). Producenti deoxynivalenolu Producenty DON jsou toxinogenní kmeny F. culmorum, F. graminearum, F. poae a F. sporotrichioides (Malíř et al., 2003, Hajšlová et al., 2009). Působení deoxynivalenolu Akutní toxicita, způsobená DON, se projevuje zvracením a střevními potížemi (Hajšlová et al., 2009). Schneiderová (2007) uvádí, že tyto projevy byly shledány 25
především u prasat. Přítomnost DON vyšší než 1 mg.kg-1 omezuje použitelnost krmiva pro prasata a z tohoto důvodu se akutní otravy u prasat vyskytují velmi zřídka. Canibe et al. (2010) sledovali u prasat přítomnost DON v podávaném zkvašeném krmivu. Organické kyseliny ve zkvašeném krmivu snižovaly pH krmiva a tím došlo ke snížení obsahu DON. Změna v poměru organických kyselin negativně ovlivňovala i přítomnost tohoto mykotoxinu. Naproti tomu u kuřat a slepic intoxikace DON zhoršuje kvalitu vajec a snižuje jejich hmotnost, i když v mase nebo vejcích nebyla rezidua DON zjištěna (Malíř et al., 2003, Schneiderová 2007). Schneiderová 2007 poukazuje, že krůty nejsou vůči působení DON příliš citlivé, pouze po podání vysokých dávek DON došlo k redukci jejich růstu a k poškození zobáku. U skotu snižuje příjem krmiva, negativně ovlivňuje reprodukci a nádoj mléka. Kromě toho byly u zvířat navíc prokázány i kožní změny, poruchy zažívání, hematologické, imunosupresivní změny či teratogenní účinky (Malíř et al., 2003, Schneiderová 2007). Výskyt DON v potravinách DON je pravděpodobně nejčastěji se vyskytující a nejznámější mykotoxin v potravinách a výrobcích z obilnin. DON byl nalezen v obilninách, kukuřici, ječmeni, triticale, prosu, čiroku a výrobků z nich, v otrubách, pivu, koření (koriandr, zázvor) a zelenině (sójové boby, česnek, brambory). DON je z hlediska distribuce v zrnu primárně nalézán na místech růstu mycelia mikromycetů, pouze malé množství je nalézáno uvnitř zrna. Při nízkých koncentracích vláknitých mikromycetů a mykotoxinové kontaminace (0,05–1,0 mg.kg-1) dochází k akumulaci DON blízko vnějšího povrchu zrna a s největší pravděpodobností existuje korelace mezi distribucí DON a stupněm napadení zrna (Malíř et al., 2003). Výskyt DON v krmivech V krmivu se nachází poměrně vysoké koncentrace DON, což je způsobeno obsahem lepku a vlhkosti zrna. Přenos DON na skot přes krmivo je možný, ale v samotném mléce jsou nálezy extrémně nízké. Rychlé vylučování nízkých a středně vysokých koncentrací DON u krmiv pro prasata má za následek, že rezidua DON nejsou akumulována. Přechod reziduí do mléka, masa, vajec je zanedbatelný (Malíř et al., 2003). Výše uvedené potvrzuje i Hajšlová et al. (2009), která uvádí, že polygastři jsou na DON méně citliví než monogastři, protože v bachoru se DON konvertuje na méně toxickou formu deepoxydeonivalenolu.
26
DON byl dříve považován za marker mykotoxinové kontaminace, protože bývá detekován s největší frekvencí. Ovšem s rozvojem moderních analytických metod bylo prokázáno, že jej stále častěji doprovázejí další, nejenom trichothecenové toxiny. V některých letech bývá dokonce DON zjišťován spíše minoritně a převládají toxiny, jako jsou NIV, nebo trichotheceny skupiny A-HT-2 a T-2. Další nezodpovězenou otázkou jsou jejich potenciální synergické toxické účinky (Hajšlová et al., 2010). Stanovení DON v potravinách je stanovován metodou TLC, HPTLC, HPTLC, HPLC, GC a imunochemickým metodami ELISA (Malíř et al., 2003). 3.5.1.2 T-2 toxin T-2 toxin, C24H34O9, Číslo CAS: 21259-20-1 Název: {3-Hydroxy-4, 15-diacetoxy-8-[3-methyl-butyryloxy]-12, 13-epoxytrichothec 9ene}. T-2 toxin je dobře rozpustný v acetonitrilu, chloroformu, směsi octan etylnatý+acetonitril, ve směsi chloroform + metanol (9:1) a nerozpustný v hexanu a petroléteru (Malíř et al., 2003). T-2 toxiny jsou řazeny mezi významné zástupce mykotoxinů trichotecenové skupiny A. Z hlediska způsobu biosyntézy patří mezi seskviterpeny (Malíř et al., 2003, Hajšlová et al., 2009). Dle Hajšlové et al. (2009) je pro obilniny běžný souběžný výskyt T-2 a HT-2 toxinu, jelikož jeden přechází v druhý (HT-2 je deacetylová forma T-2 toxinu). Producenti T-2 toxinu Producenty T-2 toxinu jsou toxinogenní kmeny F. acuminatum, F. culmorum, F. oxysporum, F. poae, F. chlamydosporum, F. semitectum, Fusarium equiseti, F. sporotrichioides, F. graminearum a F. avenaceum (Malíř, Ostrý et al., 2003). Působení T-2 toxinu T-2 toxin způsobuje nekrózy kůže, po požití nutí ke zvracení, snižuje imunitu, zvyšuje
vnímavost
vůči
kandidózám,
listeriózám,
salmonelózám
aj.
Během
toxikologického testování byly u krav a prasat prokázány záněty a hemoragie trávicího traktu, edémy, leukopenie, degradace kostní dřeně. Navíc bylo prokázáno, že T-2 toxin snižuje iniciaci proteinové syntézy na polyribozomech a u hlodavců způsobuje poškození DNA spolu s chromozoálními aberacemi. Toxikologické studie T-2 toxinu na zvířatech prokázaly, že toxin byl u prasat rozsáhle metabolizován a z tkání rychle eliminován. V játrech se akumulují rezidua T-2 toxin. V rámci experimentů „in vivo“
27
bylo u pokusných zvířat prokázáno, že T-2 toxin a jeho metabolity pronikají rychleji do masa kuřat než do masa prasat. Přestup do mléka je nižší než 1%. Otázka možného zesílení účinků T-2 toxinu s deoxynivalenolu je stále dostatečně neprobádaná (Malíř et al., 2013). 3.5.2 Fumonisiny Hudec (2007) spojuje fumonisiny s výskytem hub Fusarium verticillioides, Fusarium globosum, Fusarium thapsinum, Fusarium nygamai, Fusarium proliferatum, Fusarium antophilum, Fusarium dlamini a Fusarium napiforme. Významným mezníkem v objevu mykotoxinů fumonisinů byla roku 1988 izolace Fusarium moniliforme MRC 826 z kukuřice a jeho využití v toxikologických produkčních stanicích v Jihoafrické republice (Malíř et al., 2003). Nacházejí se především v kukuřici, kukuřičné siláži, ale i v rýži a prosu. Chemicky je možné fumonisiny charakterizovat jako složité alifatické sloučeniny, které jsou relativně termostabilní, účinně je lze z povrchu kukuřice odstranit omytím, zejména v alkalických roztocích (Hajšlová et al., 2009). Působení fumonisinů Fumonisiny v organismu degradují buňky, poškozují endocytózu, negativně ovlivňují metabolismus tuků nebo jejich vlivem dochází k poškození sfingamin N – acetyltranferázy (Schneiderová 2007). Toxické účinky fumonisinů byly experimentálně ověřeny u hospodářských a laboratorních zvířat. Fumonisiny B1 a B2 v dávce 10 mg.kg-1 živé váhy vyvolaly u testovaných koní leukoencefalomalacii, u prasat plicní edémy (100 mg.kg-1 tělesné hmotnosti) a u potkanů fumonisiny B1 a B2 vyvolaly nádorové změny v játrech (dávka cca 15 mg.kg-1). Z těchto důvodů v USA Food and Drug Administration (FDA) doporučilo, aby koně, prasata a drůbež nebyli krmeni krmivy obsahujícími více než 50 mg fumonisinů na kg (Malíř et al., 2003, Schneiderová 2007, Waśkiewicz et al., 2012). Toxický vliv fumonisinu B1 na prasata (plicní patologické změny) ve své studii potvrdili i Delegado a Wolt (2010). Přestože jsou fumonisiny (B1) pro přežvýkavce méně toxické než pro monogastry, někteří autoři uvádějí jeho toxické účinky na ovce a býčky. Při příjmu krmiva s vyšší koncentrací B1 (nad 148 ppm) byl zaznamenán nižší příjem krmiva a menší přírůstek hmotnosti. Testované dojnice vykazovaly o šest litrů nižší nádoj mléka a nižší příjem krmiva. Uvádí se, že mléčný skot je vůči působení fumonisinů citlivější než skot chovaný bez tržní produkce mléka (Schneiderová, 2007). Emadem et al. (2012) 28
uvádějí rozdíly ve vnímavosti toxických účinků u drůbeže, kdy u kachen byla prokázána velká citlivost vůči fumonisinů, zatímco krůty byly méně vnímavé. Při inhibici biosyntézy sfingolipidů dochází k útlumu ceramide syntetázy, což bylo prokázáno u poníků, prasat, potkanů, opic. Nejvíce postiženými orgány byly játra, plíce, ledviny. Účinek fumonisinů na ledviny byl prověřován na základě sledování poměru sfinganinu a sfingosinu v moči a v ledvinách. Stanovení fumonisinů v krevní plazmě a moči může být markerem pouze krátké expozice těmto toxinům, neboť je známo, že fumonisiny jsou u všech živočišných druhů jen nepatrně biodostupné. Ve východní a jižní Africe byly fumonisiny prokázány dokonce v 92,5 % analyzovaných vzorků kukuřice (Malíř et al., 2003). Shodné výsledky byly získány i v České Republice, kdy v letech 1995 a 1996 bylo analyzováno celkem 210 vzorků potravin vyrobených z kukuřice (výrobky z kukuřičné mouky, cornflakes apod.) a 89 % vzorků bylo pozitivních na obsah fumonisinů v rozsahu 9–4 594 µg.kg-1 (průměrně 180 µg.kg-1). U 4 % vzorků byla hodnota fumonisinů vyšší než 1 000 µg.kg-1, u 10 % vzorků byla hodnota stanovena na více než 500 µg.kg-1 a většina vzorků spadala do kategorie do 100 µg.kg-1. Kukuřičný křehký chléb, extrudované kukuřičné výrobky a polenta patří k potravinám s nejvyšší koncentrací fumonisinů. U 27 výrobků z kukuřice pěstované v ČR, určených pro bezlepkovou dietu, bylo 88 % vzorků pozitivních na obsah fumonisinů (FB1, FB2, FB3). Diskutován je i možný vznik reziduí fumonisinů v potravinách živočišného původu (mléko aj.) po předchozí konzumaci krmiv na bázi kukuřice s vysokými hodnotami fumonisinů zvířaty (Malíř et al., 2003). Fumonisiny jsou také dalšími fusariovými mykotoxiny, jejichž maximální přípustná množství jsou limitována legislativou. Pro B1 je tato hodnota stanovena na 2 000 ng.kg-1 t.hm/den (Malíř et al., 2003, Hajšlová et al., 2010). Tab. 3: Producenti fumonisinů (Malířet al., 2003) Druh F. moniliforme J. Scheldon F. proliferatum (T. Matsushima) Nirenberg F. anthophilum (A. Braun) Wollenw F. oxysporum Schlecht. var. Redolens (Wollenw.) Gordon F. dlaminii Marasas, P. E. Nelson & T. A. Toussoun, Trimboli F. nygamai Burgess a Trimboli F. napiforme Marasas, P. E. Nelson & Rabie, Trimboli
29
Fumonisiny lze chemicky definovat jako složité alifatické sloučeniny a z hlediska způsobů biosyntézy patří mezi nonaketidy. Doposud byla izolována řada fumonisinů a jejich metabolitů (A1, A2, B1 až B4, C1 až C4, P1, P2, P3). Významné jsou zejména fumonisiny skupiny B (B1, B2, B3), běžně se vyskytující v přírodě. Fumonisiny se v potravinách dle Malíře et al. (2003) a Ostrého (1995) stanovují laboratorními metodami TLC, HPTLC, HPLC, GC-MS a i biochemickými metodami. 3.5.2.1 Fumonisin B1 Fumonisin B1 (macrofusin), C34H59NO15, Číslo CAS: 116355-83-0 Název: diestery propan-1, 2, 3-tricarboxylic and 2-amino-12, 16-dimethyl-3,5,15pentahydroxyicosanu Fumonisin B1 je amorfní pevná látka, rozpustná ve vodě, více rozpustná ve směsi acetonitril-voda,
dobře
rozpustná
v metanolu
a
nerozpustná
v nepolárních
rozpouštědlech (Malíř et al., 2003). 3.5.2.2 Fumonisin B2 Fumonisin B2 C34H59NO14 Fumonisin B2 je amorfní pevná látka s bodem tání 103 až 105 ⁰C a molekulovou hmotností 705,8 g.mol-1. Rozpustný ve vodě, více rozpustný ve směsi acetonitril-voda, dobře rozpustný v metanolu, nerozpustný v nepolárních rozpouštědlech (Malíř et al., 2003). 3.5.3 Zearalenony Producenty zearalenonu jsou zejména toxigenní kmeny fusarií, z nichž nejvýznamnější jsou F. graminaerum s F. semitectum (Hajšlová et al., 2009, Atoui et al., 2012). Mykotoxin byl poprvé izolován Stobem v roce 1964 z kultury Gibberella zeae (anamorfa F. graminearum). Tab. 4: Významní producenti zearalenonu (Malíř et al., 2003) Druh F. culmorum (W. G. Smith) Sacc. F. equiseti (Corda) Sacc. F. graminearum Schwabe F. moniliforme Sheld. F. oxysporum Schltdl. F. sambucinum F. semitectum Berk. & Ravenel F. sporotrichioides Sherb. 30
3.5.3.1 Zearalenon, F-2 toxin Zearalenon, F-2 toxin (C18H22O5), Číslo CAS: 17924-92-4 Název: {6[10 – Hydroxy-6-oxo-trans-1-undecenyl] – 2,4-hydroxybenzoic acid lactone}. Bílá krystalická látka bez zápachu, rozpustná v organických rozpouštědlech (éter, etanol, metanol), v alkalických vodných roztocích, nerozpustná ve vodě, chemicky charakterizována jako lakton kyseliny β-resocylové. Producenti zearalenonu Mezi významné producenty zearalenonu patří toxinogenní kmeny F. graminearum, F. culmorum, F. equiseti, F. moniliforme, F. sambucinum, F. semitectum, F. sporotrichioides a F. oxysporum (Malíř et al., 2003, Ostrý et al., 2003). Působení zearalenonu Při
orálním
podání
je
zearalenon
zvířaty
rychle
absorbován
a redukován na metabolity 7α a 7β-zearalenol. V bachoru přežvýkavců je zearalenol převáděn na zeranol derivát, jenž netvoří dvojnou vazbu v poloze 1 a 2. Zearalenon byl dle Malíře et al. (2003) objeven i ve žluči, kdy po jednorázovém podání 100 mg zearalenonu dospělému člověku byly v moči prokázány jeho metabolity 7α a 7βzearalenol. V tenkém střevě je zearalenon krevním řečištěm distribuován do různých částí těla, kde se spojuje s globulinem, na který jsou navázány lidské pohlavní hormony. U myší se zearalenon koncentruje v uteru, intersticiálních buňkách varlat a ovariálních folikulech, naproti tomu u potkanů je deponován do tukové tkáně. U prasat byl zearalenon prokázán v játrech po příjmu takto znehodnoceného krmiva. U krav a ovcí byl tento mykotoxin detekován v mléce. Navíc bylo potvrzeno vylučování metabolitů zearalenonu močí a stolicí u potkana, psa, opice, prasete. U přežvýkavců se jeví přechod zearalenonu do bachoru z hlediska jeho kontaminace jako nevýznamný. Ze všech zvířat jsou prasata nejvnímavějším druhem, kdy jednorázovou deponací zearalenonu (> 3,5 mg.kg-1 tělesné hmotnosti) byly u mladé prasnice vyvolán zánět a otok vulvy. U skotu může zearalenon způsobit problémy v koncentraci 0,5–1,0 mg.kg-1 krmiva. Problémy s říjí (hyperestrogenismus) jsou u krav pozorovatelné už po čtyřech až sedmi dnech po podání kontaminovaného krmiva a odezní až po třech až čtyřech týdnech po ukončení příjmu krmiva. Hyperestrogenní syndrom byl zjištěn po aplikaci dávky zearalenonu od 25 do 100 mg.kg-1 živé váhy zvířete. I když zearalenová intoxikace nemá fatální následky, k úhynu zvířat dochází obvykle po napadení 31
vyhřeznutých orgánů a sekundární bakteriální infekci. Z těchto důvodů není vhodné krmit prasata krmivy s obsahem zearalenonu vyšší než 500 µg.kg-1 krmiva (Malíř et al., 2003). Chronická toxicita se promítá do problémů s reprodukčním cyklem zvířete, kdy u prasnic způsobuje atrofii vaječníků, přerušovanou říji, falešnou březost, neplodnost. Opakované dávky dospívajícím prasnicím způsobovaly sterilitu. U samců dochází k atrofii varlat s rozvojem prsních žláz. Markantní účinky toxinu na drůbež nebyly prokázány, protože koncentrace do 800 mg.kg-1 nevyvolaly žádné účinky. Při podání vyšších koncentrací byl u krocanů zjištěn pouze úbytek spermatu, bez vlivu na jeho kvalitu. Také přežvýkavci jsou odolnější než prasata, pravděpodobně díky bachoru, kde dochází k degradaci zearalenonu na zearalenol (Malíř et al., 2003, Schneiderová 2007). Zearalenon byl zjištěn nejen v kukuřici, ale i v dalších obilovinách, v senu a v siláži mnoha oblastí světa. Hromadění ZEA v kukuřici aktivuje vlhké počasí, které udržuje její vlhkost v rozmezí 22 až 25 % nebo oddálená prodloužená sklizeň (Schneiderová, 2007). Stanovení zearalenonu Zearalenon lze detekovat metodou HPLC ze vzorků kukuřice (Atoui et al., 2012). 3.5.4 Emerging mykotoxiny Předchozí skupiny fusariových mykotoxinů jsou studovány již několik desetiletí, a informace o jejich výskytu a toxickém působení těchto látek jsou dostupné. V současné době se však začaly objevovat také jiné skupiny fusariových mykotoxinů tzv. „emerging“ mykotoxiny, o kterých není mnoho informací (Hajšlová et al., 2010). Dle Hajšlové et al. (2010) by měla být pozornost směřována především enniatinům (ENNs), beauvericinu (BEA), moniliforminu a fusaproliferinu jejichž producenty jsou F. subglutinans, F. proliferatum, F. avenaceum. F. tricinctum, F. acuminatum, F. oxysporum, F. sporotrichiodes a F. sambucinum (Jestoi et al., 2009). Nejvíce postiženou plodinou je kukuřice (Hajšlová et al., 2010). Toxické účinky těchto kontaminantů jsou přičítány jejich ionoformním vlastnostem, avšak jejich případná akutní ani chronická toxicita doposud nebyla potvrzena a toxické působení těchto látek je neustále zkoumáno (Munkvold et al., 1998).
32
3.5.5 Konjugované (maskované) mykotoxiny Vedle
„volných“
mykotoxinů
se
v krmivech
mohou
vyskytovat
tzv.
„maskované“ (konjugované) mykotoxiny. První zmínky o těchto maskovaných mykotoxinech jsou známy z 80. let minulého století, kdy byly pozorovány mykotoxikózy zvířat, u kterých klinický obraz zvířete neodpovídal množství stanovenému ve zkrmovaném krmivu (Savard, 1991). Maskované formy vznikají pravděpodobně při detoxikačních procesech obilnin a z důvodu vyšší polarity jsou obtížně stanovitelné (Hajšlová et al., 2009). Konjugované mykotoxiny se vyskytují ve formě rozpustné (maskované mykotoxiny) nebo asociované v makromolekule jako vázané mykotoxiny. Působením enzymových systémů rostlin vznikají zejména konjugované formy mykotoxinů, které vznikají v těle savců jako konjugáty s krevními složkami (albuminy) nebo s aminokyselinami (lysin, cystein) (Berthiller et al., 2005). Tvorbou konjugátů se rostlina snaží snížit toxicitu mykotoxinu navázáním polární molekuly (např. ß-D-glukosy) a zvýšit rozpustnost mykotoxinu ve vodě a vyloučit vzniklý konjugátu do vakuoly (Berthiller et al., 2009). Zejména u deoxynivalenolu a zearalenonu může být až polovina mykotoxinů v maskované formě (Vendl et al., 2010, cit. Pavelková, Bořutová, 2012). Tyto formy mykotoxinů není možné analyzovat metodami ELISA, nebo HPLC, ovšem jsou uvolňovány z trávicího traktu a mohou se podílet na projevech mykotoxikóz. V současnosti je možné detekovat maskovaný deoxynivalenol-3β-Dglucopyranoside (DON-3-Glc), odvozený od DON (Hajšlová et al., 2009, Vendl et al., 2010, cit. Pavelková, Bořutová, 2012).
3.6 Vliv mykotoxinů na zdraví člověka a zvířat Důsledky působení mykotoxinů na živočišný organismus jsou velmi různorodé v závislosti na typu toxinu, dávce a délce doby jeho působení, druhu, stáří, pohlaví a aktuálnímu zdravotnímu stavu (Nedělník, 2012). Malíř et al. (2003) uvádějí, že některé druhy mykotoxinů způsobují hyalohyfomykózy člověka. U relativně zdravých jedinců se jedná nejčastěji o mykotickou keratitidu po traumatické inokulaci, onychomykózu nebo tyto toxiny způsobují subkutánní mykózy manifestující se jako cysta nebo absces. Nejběžněji se
33
vyskytujícími se agens jsou F. solani, F. oxysporum, F. verticillioides. Případy systémových mykóz byly rovněž popsány u F. aquaeductum, F. chlamydosporum, F. incarnatum, F. napiforme, F. nygamai, F. proliferatum, F. sacchari a F. subglutinans. Intoxikace mykotoxiny u zvířat se projevuje např. snížením imunity, alergickými reakcemi, poruchami nervové, reprodukční soustavy, dýchacího ústrojí, snížením konverze a využitím podávaných krmiv, nebo zvýšenou mortalitou u chovaných zvířat. mykotoxiny poškozují střevní sliznici, čímž dochází k omezené adsorbci živin, působením toxinů je také zhoršena funkce jater, ledvin, reprodukčních orgánů či imunitního systému. Gastrointestinální absorbcí dochází k pronikání toxinů přes krevní řečiště do ostatních tkání (Nedělník, 2012). Hajšlová et al. (2010) zdůrazňuje, že kontaminace mykotoxiny je velice závažná hlavně v potravinách určených pro děti, které ještě nemají dokonale vyvinutý detoxikační potenciál. V souvislosti se vzrůstající poptávkou po zdravých a kvalitních potravinách živočišného původu začala být pozornost soustředěna také na nutriční složení a hygienicko-toxikologickou nezávadnost krmiv, která je obzvláště důležitá z hlediska transferu metabolitů mykotoxinů do živočišných produktů. Všechny poznatky o negativním působení mykotoxinů na zdraví lidí a zvířat potvrzují, že nejúčinnější (a také nejlevnější) je prevence a zabránění vzniku mykotoxinů v krmivech (Nedělník, 2012).
3.7 Faktory vzniku toxinů Pro výskyt fusariových mykotoxinů je jedním z nejdůležitějších faktorů průběh počasí v dané vegetační sezóně, především četnost a vydatnost srážek, denní teploty, vlhkost vzduchu a délka slunečního svitu. Pro úspěšnou infekci se musí v příznivých podmínkách prostředí setkat zralé inokulum patogena a rostlina v náchylné růstové fázi. Pokud k infekci klasů dojde, následující průběh počasí přímo ovlivňuje míru rozvinutí infekce i intenzitu tvorby mykotoxinů. Zastoupení jednotlivých druhů fusarií na obilninách je variabilní v závislosti na geografických podmínkách, ročníku i zvolené agrotechnice (Polišenská et al., 2009). Ke kontaminaci obilnin dochází v průběhu jejich růstu a dozrávání na poli, případně i po sklizni, v období skladování (Polišenská, 2008). Whitlow a Hagler (2007) uvádějí, že faktory ovlivňující růst hub na plodinách, tj. klimatické podmínky (dešťové srážky, teplota, vlhkost), stres rostlin vyvolaný suchem, napadení škůdci, aplikace fungicidů sice mohou redukovat růst hub, ale nemusí 34
redukovat produkci mykotoxinů. Další růst hub a tvorba mykotoxinů po sklizni plodin je dle Schneiderové (2007) ovlivňován skladovacími podmínkami (teplota, vodní aktivita a aktivita hmyzu). Za příznivou teplotu pro optimální infekci klasů pšenice druhem F gramineaurum jsou považovány t 15–30 ⁰C a relativní vzdušná vlhkost vyšší než 90 % po 48–72 hodin v době květu ozimé pšenice. Různé druhy fusarií však mohou mít mírně odlišné nároky na optimální teplotu i délku ovlhčení (Polišenská et al., 2009). Teploty v období 10–20 dnů před kvetením nebyly pro obsah DON rozhodující. Hromadění mykotoxinu bezprostředně po infekci podporují podle Radové (2013) spíše nižší teploty (kolem 16 ⁰C). Jako výrazně omezující produkci DON se ukázaly až průměrné teploty nad 22 ⁰C. Z praktického hlediska lze těchto poznatků využít při rozhodování o použití fungicidní ochrany (Radová, 2013). Úhrn srážek se řadí k faktorům přímo ovlivňujícím rozvoj houbových patogenů. Radová (2013) udává, že rozhodujícím obdobím je deset, případně 20 dní před kvetením a období těsně po infekci. Pokud úhrn srážek v tomto období činil 33 % celkového průměru, dochází k vysoké akumulaci DON. Naopak vysoce podlimitní koncentrace mykotoxinu DON byla zaznamenána při srážkách nižších než 10 mm v období deset dnů před kvetením. Pozitivní korelaci mezi vlivem počasí a produkcí fusariových mykotoxinů uvádí Polišenská (2008) a navíc je zde ve výskytu jednotlivých mykotoxinů značná variabilita a je tak typické, že v rámci jedné lokality a jednoho ročníku je na rostlině přítomno více druhů fusarií najednou, popřípadě je znatelná postupná změna v druhovém zastoupení v různých růstových fázích vegetace (Polišenská 2008, Polišenská et al., 2009).
3.8 Monitoring výskytu mykotoxinů v České republice Vzhledem k ochraně lidského zdraví a v zájmu dodržení legislativních limitů je nezbytné provádět kontrolu obilnin již v době jejich vstupu do potravinového řetězce. Pokud by měly být vzorky analyzovány plošně je jedním z hlavních problémů praktického uplatnění nařízení limitujících obsah fusariových mykotoxinů v obilninách počet a především nákladnost prováděných laboratorních analýz (Polišenská, 2008). Vzhledem
k silné
závislosti
úrovně
kontaminace
obilnin
fusariovými
mykotoxiny na průběhu počasí v dané vegetační sezóně (Cook, Christen 1976, McMullen et al. 1997, Obst et al., 1997) je pro získávání údajů o výskytu mykotoxinů i 35
pro studium rizikových faktorů bezpodmínečně nutné víceleté sledování. Kromě počasí je stupeň kontaminace obilnin fusariovými mykotoxiny závislý na dalších faktorech, např. předplodině, způsobu zpracování půdy, odrůdě a provedení fungicidní ochrany (Beyer et al., 2006). Vlastní odběr vzorku může představovat při analýzách fusariových mykotoxinů v obilninách velký zdroj chyb. Kontaminován je obvykle pouze malý podíl zrn, avšak tato kontaminovaná zrna mají extrémně vysoké hodnoty mykotoxinů (Polišenská, 2008). Cílem je sestavit dostatečně velký reprezentativní vzorek tak, aby v maximální možné míře odpovídal vzorkované šarži obilniny. 3.8.1 Monitoring mykotoxinů v potravinářských obilninách v ČR Monitoringu výskytu mykotoxinů v potravinách je v současné době věnována značná pozornost v celosvětovém měřítku (Gallo et al., 2011). V Zemědělském výzkumném ústavu v Kroměříži je systematicky sledován výskyt fusariových mykotoxinů v obilninách v ČR od roku 2003. V období 2003 až 2007 zde bylo analyzováno celkem 633 vzorků pšenice, ječmene a žita. Kukuřice a oves jsou sledovány od roku 2005. Obsah DON byl analyzován kvalitativní metodou ELISA s limitem kvantifikace (LOQ) pro pšenici 0,167 mg.kg-1 a pro ječmen 0,042 mg.kg-1 (Polišenská, 2008). Pšenice U 414 vzorků potravinářské pšenice bylo v rozmezí let 2003 až 2007 provedeno stanovení obsahu DON. Vzorky pocházely přímo od pěstitelů z jednotlivých oblastí ČR. U všech vzorků byl vizuálně zhodnocen podíl fusariových zrn (VFZ). Analýzy mykotoxinů byly poté prováděny pouze u vzorků s pozitivním nálezem (VFZ). Bylo zjištěno, že limit (1,250 mg.kg-1), který je platný pro potravinářské obiloviny, byl překročen v průměru sledovaných pěti let u 2,5 % vzorků. Nejméně v roce 2003 (1,6 %), nejvíce v letech 2004 a 2007 (3,3 %). V tomto průzkumu, založeném na výběru dle pozitivního obsahu VFZ, byla zjištěna maximální hodnota 20,28 mg.kg-1 (Polišenská, 2008). Ve Velké Británii, v obdobně založeném výzkumu, Edwards a Ray (2005) v letech 2001 až 2004 zjistili 2,6 % nadlimitních vzorků z celkového počtu 1 298 stanovovaných a udávají maximální zjištěnou hodnotu 20 333 µg.kg-1 (tj. 20,333 mg.kg-1). Čonková et al. (2006) udávají maximální zjištěnou hodnotu DON u vzorků pšenice na Slovensku (60 vzorků) a Polska (45 vzorků), 2 770 µg.kg-1 a 970 µg.kg-1.
36
Hajšlová et al. (2008) v souboru 175 vzorků potravinářské pšenice, odebraných v letech 1999, 2000, 2001 a 2005 uvádí maximální hodnotu DON 2 265 µg.kg-1. Ječmen Vzorky pro laboratorní stanovení byly vybírány náhodně se zohledněním lokality pěstování a odrůdy. V letech 2005 až 2007 bylo provedeno laboratorní hodnocení 167 vzorků ječmene, z nichž 5 vzorků (2,99 %) nevyhovělo potravinářskému limitu. V roce 2005 nebyl zjištěn žádný nevyhovující vzorek, v následujícím roce nevyhověl 1 vzorek z 57 analyzovaných (1,75 %) a v roce 2007 nevyhověly vzorky 4 z 50 analyzovaných (8 %). Hajšlová et al. (2008) uvádějí, že mezi 56 sledovanými vzorky z období 2001 a 2005, byl jeden nadlimitní (1,79 %) s hodnotou 2 021 µg.kg-1. Je nutné však upozornit, že srovnávané průzkumy neprobíhaly ve stejných sklizňových letech. Žito Obsah DON byl ve vzorcích ze všech sledovaných obilnin nejnižší. V letech 2005 až 2007 bylo testováno 52 náhodně vybraných vzorků žita a maximální hodnota byla 0,851 mg.kg-1, tj. bez přesahu potravinářského limitu (Polišenská et al., 2008). Obdobné závěry uvádí i Sýkorová et al. (2005). 3.8.2 Monitoring mykotoxinů v krmivech v ČR Živočišnou výrobu nepříznivě ovlivňuje nejen mykoflóra a její produkty obsažené v obilninách důležitých pro výživu prasat a drůbeže, ale i mykoflóra a její produkty obsažené v objemné píci, která je významná pro výživu přežvýkavců (Schneiderová, 2008). Obr. 12: Zaplísnění slámy (Svoboda 2012)
37
Ústřední kontrolní a zkušební ústav zemědělský odebírá v rámci úředních kontrol odběr vzorků krmiv pro laboratorní stanovení přítomnosti mykotoxinů. Pro toto stanovení jsou odebírány vzorky rostlinných komodit např. ječmene, kukuřice, ovsa, otrub, sena, ale i vzorky krmných směsí (doplňkové krmné směsi pro chov skotu, kompletní krmné směsi pro výkrm prasat aj.). V r. 2013 je naplánován odběr jen 50 vzorků krmiv na stanovení obsahu mykotoxinů, protože od roku 2009, kdy v rámci monitoringu začaly být odebírány vzorky krmiv k laboratornímu stanovení, byly zachyceny pouze dva pozitivní vzorky s obsahem vyšším než ukládá legislativa (tab. 5). Celkový objem odebíraných vzorků v rámci monitoringu výskytu mykotoxinů se od roku 2009 snížil o cca 43 %. Průměrné obsahy mykotoxinů v kukuřici, siláži a senáži za období 2006-2011 v µg.kg-1 uvádí tabulka 6. V případech, kdy se obsah zjišťovaného mykotoxinu nacházel pod hranicí meze stanovitelnosti, byla pro výpočet průměru použita poloviční hodnota meze stanovitelnosti. Tab. 5: Vzorky krmiv pro stanovení mykotoxinů (Svoboda, 2013) Období
Vzorky
2009 2010 2011 2012 19.4.13
116 100 99 70 35
Vzorky kukuřice 9 7 7 9 3
Nevyhovující vzorky 0 1 (KKS) 1 (KKS) 0 0
Mykotoxin
Hodnota
x DON Aflatoxin B1 x x
x 1283 µg.kg-1 21,78 µg.kg-1 x x
Maxim. hodnota x 900 µg.kg-1 10 µg.kg-1 x x
* zdroj: LIMS – interní program využívaný ÚKZÚZ
Tab. 6: Průměrné obsahy mykotoxinů v krmné kukuřici (µg.kg-1 ) (Svoboda, 2013) Komodita
ZEA
kukuřice senáž siláž
47,73 8,21 21,17
Fumonisin B1 + B2 167,06 4,15 124,95
DON
T2-toxin
HT2-toxin
615,32 47,83 905,79
7,53 1,50 1,78
8,19 1,00 7,84
* zdroj: LIMS – interní program využívaný ÚKZÚZ
3.9 Způsoby a metody stanovení mykotoxinů 3.9.1 Odběr vzorků k laboratornímu stanovení Odběr vzorků za účelem detekce mykotoxinů je velice náročný, protože mykotoxiny jsou ve vzorkovaném materiálu většinou rozloženy velmi nerovnoměrně. Je tedy nutné k vlastnímu vzorkování přistoupit s vhodně zvolenou strategií. 38
Metody odběru
vzorků
pro
úřední
kontrolu
fusariových
mykotoxinů
v potravinách upravuje nařízení Komise (ES) č. 401/2006. Definován je počet dílčích vzorků, hmotnost souhrnného vzorku atd. (Nařízení Komise 2006). Princip odběru úředních vzorků krmiv definuje nařízení Komise (ES) č. 152/2009, kterým se stanoví metody odběru vzorků a laboratorního zkoušení pro úřední kontrolu krmiv. Správná technika odběru vzorků a jeho následná manipulace (vlhké vzorky zmrazit, popřípadě usušit) je tedy velice důležitá pro následnou laboratorní analýzu (Schneiderová, 2007). 3.9.2 Stanovení mykotoxinů Existují stovky mykotoxinů, ale málo z nich bylo rozsáhle zkoumáno a ještě pro menší počet mykotoxinů existují využitelné analytické metody (Heidler, Schatzmayr 2002, Managing mycotoxins 2007, Whitlow, Hagler 2007). Stanovení rizikovosti každého toxinu začíná studiem mechanismu toxicity a její intenzity na buněčné úrovni a na tkáňových systémech. Mykotoxiny jsou pak obvykle testovány na zvířatech, získané výsledky extrapolovány pro lidský organismus a je stanovena hladina tolerovatelného denního příjmu (TDI). TDI je takové množství toxinu, které, je-li přijato během jediného dne, nemá dle současné dostupných poznatků negativní vliv na lidský organismus (Polišenská, 2008). Mykotoxiny jsou ve vzorcích prokazovány laboratorní metodou plynové chromatografie CC-MS, CC-MS/MS, LC-MS nebo chromatografickými metodami TLC a HPTLC (Malíř et al., 2003). V současné době je většina používaných metod založena výhradně na použití kapalinové chromatografie s hmotnostně-spektrometrickou detekcí. Důraz je kladen na vývoj nových moderních multidetekčních metod, které budou rychlé, přesné a především levnější. V rámci kontaminace je také důležité postupně rozkrýt mechanismus tvorby, vzájemné interakce mykotoxinů, což bude umožňovat odhadnout míru rizika, s jakou se budou kontaminované vzorky v rámci určitého systému pěstování vyskytovat (Polišenská, 2008). 3.9.2.1 Plynová chromatografie (GC) Metoda je separační a současně analytická, umožňující kvalitativní a kvantitativní analýzu plynných vzorků, popř. veškerých těkavých látek (kapaliny či tuhé látky), pokud je lze před separací převést v páry. Separace se uskutečňuje v soustavě plyn-kapalina (GLC) nebo plyn-tuhá látka (GSC). V obou případech je mobilní fáze 39
plynná a stacionární fáze (tuhý sorbent nebo zakotvená kapalná báze) – umístěná v chromatografické koloně. GSC je založena na adsorbci, GLC na rozpouštění (Malíř et al., 2003). 3.9.2.2 Chromatografie na tenké vrstvě (TLC) Metoda je založena na separaci složek z kapalného média. Její výhodou je rychlost, jednoduchost a především nízká finanční náročnost. V našich laboratořích se ke stanovení mykotoxinů využívá jen výjimečně, slouží hlavně jako orientační stanovení aflatoxinů, ochratoxinu A, deoxynivalenolu, patulinu, zearalenonu aj. Metody TLC je využíváno především v rozvojových zemích. 3.9.2.3 Vysokoúčinná tenkovrstvá chromatografie (HPTLC) Výhodou HPTLC oproti klasické TLC je miniaturizace celého zařízení a podstatné nižší množství nanášených látek. Některé mykotoxiny vytvářejí komplexy s vápenatými kationty (Ca2+) obsaženými v pojivu adsorbentu a nelze je tak dobře vyhodnotit. Před samotnou identifikací mykotoxinů je nutné vzorky upravit (Malíř et al., 2003). Při stanovení mykotoxinů se dle Schneiderové (2007) mohou vyskytnout komplikace, pokud je jeden toxin produkovaný více houbami a jeden druh houby může produkovat více různých mykotoxinů. Objemná a vlhká krmiva mohou obsahovat mykotoxiny, které se běžně v komerčních laboratořích nestanovují a množství spor hub slouží jen k hrubému odhadu potenciální toxicity krmiva. Detekováním zearalenonu metodou HPLC ze vzorků kukuřice se zabývali Atoui et al. (2012). Efektivní a rychlou kontrolu potravin a krmiv umožňují moderní citlivé multidetekční metody, na jejichž vývoj a optimalizaci je oprávněně kladen stále větší důraz (Hajšlová et al., 2010).
3.10 Legislativa v oblasti mykotoxinů Mykotoxiny jsou známy již po dlouhou dobu a až do šedesátých let minulého století nebyla jejich existence v potravinách a v krmivech regulována. Teprve od roku 1960, kdy byly objeveny aflatoxiny, bylo uznáno, že mykotoxiny vzhledem ke svým toxickým účinkům představují významné zdravotní riziko pro lidi i hospodářská zvířata. Na základě těchto důvodů začaly být postupně navrhovány předpisy týkající se 40
sledování výskytu mykotoxinů v potravinách a v krmivech. Nejprve se regulační opatření týkala pouze aflatoxinů (Moretti et al., 2006, Ovesi et al., 2007). Současně platná nařízení jsou založena na vědecky podložených stanoviscích a závěrech společného výboru expertů FAO/WHO pro potravinářská aditiva (JECFA – „Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives“) a Evropským úřadem pro bezpečnost potravin (EFSA – „European Food Safety Autority“). Nejvyšší přípustná množství těchto sekundárních metabolitů a dalších kontaminantů potravin jsou stanovena pro danou potravinářskou komoditu v jednotlivých nařízeních (Nařízení č. 1881/2006, 1126/2007, 105/2010, 165/2010, 594/2012). Aktuálnost problematiky se promítá také do komunitární legislativy. Ve srovnání se situací v roce 1995 se v roce 2003 zvýšil počet zemí, které mají směrnice pro mykotoxiny přibližně o 30 % (Schneiderová, 2007). Pro oblast krmiv platí směrnice Evropského Parlamentu a Rady 2002/32/ES o nežádoucích
látkách
v krmivech,
novelizovaná
směrnicí
Evropské
Komise
2003/100/ES, která stanoví maximální přípustná množství obsahu aflatoxinu B1 v produktech určených ke krmení zvířat. Dosud ale v rámci EU zcela chybí závazná pravidla pro regulaci ostatních mykotoxinů. Speciálním předpisem platným pro oblast krmiv je také doporučení Komise 2006/576/ES o přítomnosti deoxynivalenolu, zearalenonu, ochratoxinu A, T-2 a HT-2 a fumonisinů v produktech určených ke krmení zvířat (Nedělník, 2012). Podle Polišenské et al. (2009) se již delší dobu předpokládá revize legislativy limitující obsahy mykotoxinů. V obilninách určených k produkci potravin je nyní z fusariových mykotoxinů limitován obsah deoxynivalenolu (DON) v pšenici, v ječmeni a v žitě, kde platí maximální limit 1250 µg.kg-1 (1,25 mg.kg-1, tj. 1,25 ppm) a také v ovsu, pšenici tvrdé a v kukuřici, kde je limitní hodnota vyšší a to 1750 µg.kg-1. Dále je stanoven maximální limit pro zearalenon (ZEA), který je pro ječmen, žito a oves stanoven na 100 µg.kg-1 a pro kukuřici 350 µg.kg-1. Fumonisiny jsou limitovány pouze v kukuřici a to sumou fumonisinů B1 a B2. Tento limit byl v roce 2007 zvyšován, oproti původní hodnotě 2000 µg.kg-1 a nyní je platná hodnota 4000 µg.kg-1. Již delší dobu se diskutuje nad zavedením souhrnného limitu pro T2 a HT-2 toxinu, zatím však není konkrétní hodnota legislativně ošetřena.
41
Souhrnné obsahy aflatoxinů B1, B2, G1 a G2 jsou u nás vzhledem ke svým závažným negativním účinkům na zdraví lidí i zvířat také legislativně limitovány stejně jako již výše uvedené mykotoxiny (Polišenská, 2008). K prevenci a snižování fusariových mykotoxinů v obilovinách a výrobcích z nich přijala EK další Doporučení č. 583/2006/EK. V uváděných zásadách jsou popsány faktory podporující infekci a rozvoj toxinů v obilovinách na úrovni prvovýroby a metody jejich kontroly (Hajšlová et al., 2009).
3.11 Ochrana kukuřice proti houbám rodu Fusarium Pokud se houbové patogeny objeví na poli nebo ve skladech krmiv, je potřeba přijmout opatření vyžadující monitoring hladiny mykotoxinů. Mykotoxiny se zřídka vyskytují rovnoměrně v celé sklizni a často jsou lokalizovány jen na některých místech pole. Je potřeba věnovat pozornost při dodávce krmných složek a neuskladňovat společně kontaminované a nekontaminované dodávky obilnin. Likvidace houbových patogenů a tvorby jejich mykotoxinů je zájmem celého řetězce výroby od pěstitelů plodin a šlechtitelů osiva až po zpracovatele krmných složek a chovatele hospodářských zvířat (Schneiderová 2007). Pro zmírnění rizika rozvoje patogenní mikroflóry a následné produkce mykotoxinů lze dle Porta et al. (2004), Whitlowa a Haglera (2007), Schneiderové 2007, Nedělníka (2012) doporučit preventivní a kurativní opatření. 3.11.1 Preventivní opatření při pěstování kukuřice 3.11.1.1 Hybridní kukuřice Prvořadým opatřením je výběr vhodného hybridu pro danou pěstitelskou oblast s adekvátním číslem FAO a vysokou odolností vůči houbovým patogenům (Porta et al., 2004). Transgenní Bt-kukuřice vykazuje ve srovnání s netransgenní kukuřicí nižší výskyt poškození způsobeného zavíječem kukuřičným, nižší výskyt infekce způsobené F. verticillioides a nižší hladinu kontaminace fumonisinem (Whitlow, Hagler 2007). Drimal (2005), který testoval odolnost hybridních druhů kukuřic vůči napadení Fusarium graminearum, F. culmorum a F. moniliforme dosáhl podobné výsledky. S využitím moderních hybridů kukuřice v rámci preventivních opatření ke snížení rizika výskytu plísní souhlasí i Doležal et al. (2012), neboť při významném napadení 42
houbovými patogeny je nejenom snížen výnos, ale také nutriční kvalita kukuřičného zrna i celé rostliny. Stejné závěry publikují Hung a James (2012), který na základě pokusů s mezihybridními kříženci kukuřice uvádějí jistou spojitost s jejich nízkým napadením fusarii. Ke stejnému výsledku dospěli i Ellis et al. (2012) při testování sójových hybridů. Problematika geneticky modifikovaných organismů je v Evropské unii stále kontroverzním tématem, přičemž Česká republika se řadí spíše k liberálním státům (Trnková, 2013). 3.11.1.2 Agrotechnika Mezi zásadní agrotechnická opatření patří správná hustota porostu, optimální výživa během vegetace a chemická ochrana proti patogenům a škůdcům (Doležal et al. 2012). Marin et al. (2012) uvádějí, že požerky od hmyzu jsou tzv. vstupní branou k sekundární infekce houbami. Kazda et al. (2001) doporučují střídání plodin, zejména omezení pěstování kukuřice po kukuřici. V rámci preventivních opatření je také doporučováno řádné zapravení posklizňových zbytků, vyvážená výživa plodin a potlačování plevelů v porostu vzhledem k tomu, že některé z nich jsou hostiteli fusarií Kruczek (1997) poukazuje na vyšší náchylnost porostu kukuřice na napadení houbami v případě, že byly plodiny v chladném jarním období přehnojeny dusíkem. U těžších půd nebo pozemků v chladnějších oblastech je doporučován pozdější výsev s mořením osiva (Kazda et al., 2001, Porta et al., 2004). Ochraně proti fusariózám kukuřice během vegetace se dlouho nevěnovala řádná pozornost. Teprve v roce 2011 se v České republice objevila první registrace fungicidu Prosaro 250 EC pro ošetření kukuřice proti fusariózám palic, spále kukuřičné, rzi kukuřičné a antraknóze . Podle Radové (2013) je účinnost fungicidů značně variabilní, ovlivněná odrůdou, agresivitou patogena a podmínkami prostředí. Kvalitní fungicidní ochrana a především pak kvalitní ošetření klasu, podstatně napomáhá k omezení výskytu choroby a výskytu toxinů ve sklizňovém produktu. Samotná aplikace fungicidu musí být provedena v době největší vnímavosti k infekci, tj. ve fázi kvetení. Rychlý a velmi silný nástup infekce za příznivých povětrnostních podmínek výrazně zkracuje vhodnou dobu pro aplikaci (Radová,2013). 3.11.1.3 Sklizeň Sklizeň se provádí včas v optimální silážní zralosti, nejčastěji ve stadiu 30–33 % celkové sušiny. Při silážování kukuřice na siláž se strništěm vyšším než 30 cm je u 43
sklizené hmoty téměř vždy zjišťován částečně omezený výskyt fusarií za předpokladu, že během vegetace nedošlo k vyššímu napadení kukuřičného klasu zavíječem kukuřičným (Ostrinia nubilalis) a následnému sekundárnímu rozšíření fusarií v této části rostliny. Ze špatného vstupního materiálu není možné vyrobit kvalitní siláž Doležal et al. (2012). 3.11.2 Preventivní opatření po sklizni kukuřice 3.11.2.1 Skladování Dle Whitlowa a Haglera (2007) a Schneiderové (2007) růst hub závisí především na vlhkosti materiálu. Zdrojem vlhkosti v krmivu jsou krmné složky, proces zpracování a skladovací prostředí. Ve vlhkých krmivech umožňuje vyšší hladina vlhkosti růst hub pouze v aerobním prostředí (Schneiderová 2007). Ovšem samotné optimální podmínky pro růst hub nemusí být optimální pro tvorbu mykotoxinů. Bylo zjištěno, že fusaria, která rostou nejlépe při teplotě 25 až 30 °C aniž by produkovala velké množství mykotoxinu, vykazují při teplotě blízké bodu mrazu minimální růst, ale vysokou produkci mykotoxinů (Schneiderová, 2007). 3.11.2.2 Silážování Kukuřice je nejvyužívanější plodinou pro výrobu siláže a k jejímu infikování mykotoxiny může dojít buď přímo na poli, nebo během samotného uskladnění siláže. Tato případná infekce významně snižuje nutriční hodnotu kukuřice a představuje zdravotní riziko pro zvířata (Schneiderová 2008). Ve vlhké trávě nebo senu se často můžeme setkat s toxikogenními mikromycety rodu Fusarium, Aspergillus a Penicillium (Schneiderová 2008, Hajšlová et al., 2009). Majoritními mykotoxiny v siláži jsou DON, ZON, FB1, OTA, citrinin, PAT. Spektrum přítomnosti jednotlivých druhů mikromycet v kukuřičných silážích závisí na délce uskladnění. Po dvou měsících od počátku uskladnění lze ještě detekovat mikromycety rodu Fusarium a Penicillium (Hajšlová et al., 2009). Po sklizni následuje neprodleně silážování s dokonalým pořezáním na
optimální
velikost
částic,
maximálním
utužením,
vytěsněním
vzduchu
a neprodyšným uzavřením. Vyšší pravděpodobnost rozvoje hub a tvorby mykotoxinů lze očekávat při nedodržení správné techniky silážování. Zejména pomalé a přerušované plnění silážních žlabů, dále kontaminace rostlinné hmoty zeminou, nedostatečné vytěsnění vzduchu v důsledku nevhodného dusání a nezakrývání silážované hmoty vede
44
vždy ke zvýšení rizika výskytu nežádoucích bakterií a hub. V důsledku sekundární kontaminace dochází ke značným ztrátám živin a k potenciálnímu ohrožení fyziologických funkcí zvířete (Doležal et al., 2012). Vhodný způsob odběru hotové siláže se zajištěním vysoké hygieny: Silážní žlaby je důležité udržovat v naprosté čistotě (Whitlow a Hagler, 2007). Nedodržení nebo dokonce vynechání některé technologické zásady vede k neúměrným ztrátám a ke snížení jakosti kukuřičné siláže (Doležal et al., 2012). Tab. 7: Příčiny vyššího obsahu mykotoxinů v kukuřici (Sprinch 2008, cit Doležal et al., 2012) Faktory
Druhy fusarií
Mykotoxiny
Nedostatečný rozklad slámy
F. graminearum F. moniliforme
deoxynivalenol, zearalenon, fumonisin
Teplotní stres během vegetace
F. graminearum
deoxynivalenol, zearalenon
Velké množství srážek během vegetace
F. moniliforme
fumonisin
F. moniliforme F. graminearum F. graminearum F. moniliforme F. graminearum
fumonisin, deoxynivalenol, zearalenon, deoxynivalenol, zearalenon fumonisin, zearalenon, deoxynivalenol
Napadení kukuřice zavíječem kukuřičným Pozdní sběr kukuřice Mezičas mezi sklizní následnou konzervací (sušením, silážováním)
Aplikovat desinfekční přípravky na suroviny určené pro výrobu potravin a krmiv je z hlediska
ochrany zdraví
spotřebitelů
a
zvířat
nemožné.
Samotný postřik
kontaminovaných míst (skladů, sklepů aj.) je možný pouze v případě preventivního ošetření před naskladněním surovin (Paříková, Kučerová 2001). Eliminace mykotoxinů, především v našich podmínkách je komplikovaná z hlediska nízké polarity jejich molekul, a tím i omezené možnosti adsorpce, která je navíc málo stabilní. Na vyvazování těchto toxinů se donedávna používaly jílové přípravky, které selektivně adsorbovaly polární mykotoxiny (aflatoxiny, částečně ochratoxin). Adsorpční složkou jsou speciálně upravené aktivované hlinitokřemičitany s krystalickou strukturou. Velikostí pórů v krystalické struktuře je zajišťován selektivní účinek pouze na žádanou velikost molekul a rozmístění polárních skupin. Adsorbce je však možná pouze u molekul s funkční polární skupinou. Adsorbované mykotoxiny tak neprocházejí přes střevní stěnu pomocí krevního řečiště, procházejí trávicím traktem zvířete přes trus z těla ven.
45
V současné době je od těchto přípravků inkorporována biomasa Sacharomyces cerevisiae se zachovanou enzymatickou aktivitou esteráz a epoxidáz. Tyto enzymy degradují molekuly trichotecenů a zearalenonu na netoxické metabolity, které jsou opět vyloučeny přirozenou cestou ven z těla zvířete. Tyto přípravky jsou přimíchány do krmiva v rámci prevence (Nedělník, 2012). Od 1. 1. 2014 vstoupí v České republice v platnost zásady integrované ochrany rostlin (IOR). Tato pravidla budou od příštího roku uplatňována na základě čl. 14 a přílohy č. III směrnice 2009/128/ES. Dodržování osmi obecných zásad bude závazné pro profesionální uživatele přípravků na ochranu rostlin a očekává se, že kontrola jejich dodržování bude součástí systému Cross compliance. Řada pěstitelů polních plodin dosud zásady IOR nevyužívala, nebo uplatňovala postupy, které byly v rozporu se systémem integrované ochrany rostlin (Kocourek, 2012). V současné době je možné při pěstování polních plodin uplatňovat zásady IOR a připravit se tak v předstihu na změny v legislativě (Binder, 2007). Pro prevenci kontaminace krmiv mykotoxiny se podobně jako při výrobě potravin užívá k výrobě krmiv systém HACCP (Hazard Analysis and Critical Control Points), tj. systém kritických bodů při výrobě. V celém řetězci výroby potravin a krmiv je nutné určit všechna rizika možného výskytu mykotoxinů (Binder, 2007).
46
4 ZÁVĚR Závažným celosvětovým problémem je kontaminace zemědělských komodit pro potravinářské zpracování a výrobu krmných surovin mykotoxiny. K minimalizaci mykotoxinové kontaminace potravin a krmiv je potřeba začít už od prvovýroby, tedy dodržováním správné zemědělské praxe. Kukuřice je výnosově nejvýznamnější rostlinou nejen v teplém, ale i v mírném klimatickém pásmu. Pro její efektivní pěstování je nutné mít na zřeteli i působení fytopatogenních hub během růstu, při sklizni a během následného zpracování. Zelená hmota určená k silážování, která byla napadena houbami, může vyústit ve výrobu kukuřičných
siláží
s neúspěšným
fermentačním
procesem,
siláží
mikrobiálně
změněných činností kvasinek, hub a bakterií. Plesnivé krmivo je zvířaty vždy hůře přijímáno, má vždy horší nutriční zhodnocení a je zdrojem velkých mikrobiálních rizik i pro samotná zvířata. Výsledná kvalita siláží a její nutriční zhodnocení je závislé na řadě agrotechnických a technologicko-technických faktorech. Pro řešení problematiky mykotoxinů je potřeba získat více informací o příčině jejich výskytu, o situacích kdy se jejich výskyt dá očekávat, o možnostech prevence a likvidace. V krátkém čase je pak zcela nezbytné stanovení maximálních limitů jejich obsahu v krmivech pomocí regulativních předpisů. Stanovení bezpečné hladiny jednotlivých mykotoxinů ovšem ztěžuje interakce mezi mykotoxiny a dalšími faktory. Na základě výsledků stanovení mykotoxinů v potravinách, které provádí dozorové organizace, a výsledků monitoringu dietární expozice chemickým látkám, je riziko akutního toxického účinku mykotoxinů pro populace v ČR obvykle považováno za minimální. Za významné se však považuje toxicita po příjmu vysokých jednorázových nebo opakovaných koncentrací mykotoxinů v potravinách. Vzhledem k nerovnoměrnému výskytu mykotoxinů v potravinách je potřebné pokračovat ve stanovení biomarkerů a sledovat trendy dietární expozice vybraných mykotoxinů. Všichni, kdo jsou zapojeni do dodavatelského řetězce, by měli pravidelně provádět vlastní posuzování rizika a rozhodovat tak o rozsahu preventivních opatření k minimalizaci kontaminace fusariovými toxiny.
47
5 POUŽITÁ LITERATURA 1. ANNE, E. D. (2006): Fusarium Mycotoxins, Chemistry, Genetics and Biology, The American Phytopathological Society, ISBN: 978-0-89054-335-1 2. ATOUI, A.; EL-KHOURY, A.; KALLASSY, M.; LEBRIHI, A. (2012): Quantification of Fusarium graminearum and Fusarium culmorum by real-time PCR system and zearalenone assessment in maize, In International Journal of Food Microbiology, n. 154, ISSN 0168-1605, pp. 59-65, 3. BEYER, M.; KLIX, M. B.; KLINK, H.; VERRET, J. A. (2006): Quantifying the effects of previous crop, tillage, cultivar and triazole fungicides on the deoxynivalenol content of wheat grain – a review. Journal of Plant Diseases and Protection, s. 113, 241 – 246 4. BERTHILLER, F., SCHUHMACHER, R., ADAM, G., KRSKA, R. (2009): Formation, determination and significance of masked and other conjugated mycotoxins, Anal. Bioanal. Chem., 395, 1243 - 1252 s. 5. BINDER, E. M. (2007): Managing the risk of mycotoxins in modern feed production. Anim. Fd. Sci. and Techn.,n. 133, pp. 149–166 6. BOOTH, C. (1971): The genius fusarium, ISBN: 0851983952, p. 31 7. CANIBE, N., PEDERSEN, A. O.; JENSEN, B. B. (2010): Impact of acetic acid concentration of fermented liquid feed on growth performance of piglets. Livestock Science, n. 133, pp. 117-119 8. COOK, R. J.; CHRISTEN, A. A. (1976): Growth of cereal root rot fungi as affected by temperature-water potential interactions, Phytopathology 66, s. 193197 9. COVARELLI, L.; STIFANO, S.; BECCARI, G.; RAGGI, L.; LATTANZIO, V.;ALBERZINI, E. (2011): Characteristics of Fusarium verticillioides strains isolated from maize in Italy: Fumonisin production, pathogenicity, and genetic variability, In Food Microbiology, n. 31 pp. 17-24 10. ČONKOVÁ, E.; LACIAKOVÁ, A.; ŠTYRIAK, I.; CZERWIECKO, L.; WILCZYŃSKA, G. (2006): Fungal contamination and the levels of mycotoxins (DON and OTA) in cereal samples from Poland and east Slovakia. Czech Journal of Food Sciences 24, pp. 33 – 40 11. DEMEKE, T., GRAFENHAN, T., CLEAR, R. M., PHAN, A., RATNAYAKA, I., CHAPADOS, J., PATRICK, S. K., GABA, D., LEVESQUE, C. A., S EIFERT A. (2010): Development of a specific TaqMan® real–time PCR assai of quantification of Fusarium graminearum clade 7 and comparison of fungal biomass determined by PCR with deoxynivalenol content in wheat and barley. International Jornal of Food Microbiology n. 141, pp.45–50 12. DELEGADO, J. E.; WOLT, J. D. (2010): Fumonisin B1 and implications in nursery swine productivity: a quantitative exposure assessment, In Journal of Animal Science, n. 88, ISSN 0021-8812, pp. 3767-3777 13. DESJARDINS A. E. (2006): Fusarium Mycotoxins: Chemistry, Genetics and Biology. APS Press: pp. 260 14. DOLEŽAL, P; ZEMAN, L.; POŠTULKA R. (2012): K faktorům ovlivňujícím kvalitu silážní kukuřice a výsledné siláže, Krmivářství č. 4/2012, s. 28-31, ISSN 1212-9992 MK ČR E 7525, s. 38, 15. DOM, B.; FORRER, H. R.; JENNY, E.; WETTSTEIN, F. E.; BUCHELI, T. D.; VOGEL, VOGELGSANG, S. (2011): Fusarium species complex and
48
mycotoxins in grain maize from maize hybrid trials and from grower's fields, Journal of Applied Microbiolog, n. 111, ISSN 1364-5072, pp. 693-706 16. DOPORUČENÍ KOMISE č. 2013/165/ES ze dne 27. března 2013 ohledně přítomnosti toxinů T-2 a HT-2 v obilovinách a výrobcích z obilovin 17. DRIMAL J. (2005): Use of phytopathology - mycopathology - methods in biological disease control of maize and other applications, Konference v Nitře, s. 80-85 18. ECOPORT (2013): Dostupné na http://ecoport.org/ep?SearchType=pdb&PdbID=2402, [2013-05-07] 19. EDWARDS, S. G.; RAY, R. (2005): Fusarium and mycotoxins in UK wheat production. Congress Proceedings, The BCPC International Congress Crop Science and Technology 2005, 31 Oct - 2 Nov 2005, Glasgow, Scotland, UK, pp. 437 – 440 20. ELLIS MARGARET, L.; WANG HEHE, P.; PIERCE, A; MARTIN STEVEN, K.; McHALE LEAH, K.; DORRANCE ANNE, E. (2012): Identification of Soybean Genotypes Resistant to Fusarium graminearum and Genetic Mapping of Resistance Quantitative Trait Loci in the Cultivar Conrad, In Crop Science, n. 52, pp. 2224-2233 21. EMAD, B.; XIUYU, G.; NGOC THANH XUAN, N.; DIDIER, T.; JEANDENIS, B.; ALAIN, A.; PHILIPPE, G. (2012): Comparative Effects of Fumonisins on Sphingolipid Metabolism and Toxicity in Ducks and Turkys, In Mycotoxicologie, n. 23, pp. 87614, 31076 22. FASSATIOVÁ, O. (1979): Plísně a vláknité houby v technické mikrobiologii: příručka k určování. Praha, s. 240 23. FUNGI OF GREAT BRITAIN AND IRELAND (2013): Dostupné na http://fungi.myspecies.info/all-fungi/fusarium-equiseti, [2013-05-07] 24. GALLO, A.; CERIOLI, C.; GIUBERTI, G.; MASOERO, F. (2011): Food and mycotoxins: a summary of what we know, In Informatore Agrario, n. 67, ISSN 0020-0689, pp. 74-77 25. GLENN, A. E. (2007): Mycotoxigenic Fusarium species in animal feed, In Animal Feed Science and Technology, n. 137, ISSN 0377-8401, pp. 213-240 26. GUTLEB, A.C.; MORRISON E.; MURK, A. J. (2002): Cytotoxicity assays for mycotoxin produced by Fusarium strains, A review, Env. Tox. and Pharm., 11, s. 309-320 27. HAJŠLOVÁ, J.; ZACHARIÁŠOVÁ, M.; MALACHOVÁ A..; KOSTELANSKÁ M; KOCOUREK, V. (2009): Mykotoxiny, dokument vědeckého výboru pro fytosanitární a životní prostředí, vydal VÚRV, s. 82 28. HE, J.; ZHOU, T.; YOUNG, J. C.; BOLAND, G. J.; SCOTT, P. M (2009): Chemical and biological transformations for detoxixication of trichothecenes mycotoxins in animal and human chain, A. review, Tr. in Food Sc & Tech, s. 110 29. HEIDLER, D.;SCHATZMAYR, G. A new approach to managing mycotoxins. World Poultry, n. 5, pp. 14-15 30. HUDEC, K., (2007): Exkurzia do sveta fuzáriotoxínov - 1. čast', Nové Agro 3, s. 24 - 29 31. HUNG HSIAO-YI; JAMES, B. (2012): Diallel Analysis of Resistance to Fusarium Ear Rot and Fumonisin Contamination in Maize, In Crop Science 52, pp. 2173-2181 32. HUSSEIN, H. S.; BRASEL, J. M. (2001): Toxicity, metabolism ,and impact of mycotoxins on humans and animals, Tox. Lett., 167, s. 101-134 49
33. HÝSEK, J.,VÁŇOVÁ, M., HAJŠLOVÁ, J., HAVLOVÁ, P., SKOPAL, J. (2003): The Fusarium head blight on spring barley and its influence on health state, the level of trichothecene mycotoxins and malt characteristics. Proc. 8th Int. Congr. Plant Pathology, n. 1: pp. 1574 34. HRUDOVÁ, E.; POKORNÝ, R.; VÍCHOVÁ, J. (2006): Integrovaná ochrana rostlin, MZLU, ISBN: 80-7157-980-7, s. 151 35. JESTOI, M.; ROKKA, M.; JARVENPAA, E.; PELTONEN, K. (2009): Determination of Fusarium mycotoxins beauvericin and enniatins (A, A1, B, B1) in eggs of laying hens using liquid chromatography-tanddm mass spectrometry (LC-MS/MS). Food Chem., 115, s. 1120-1127 36. KAZDA, J.; JINDRA, Z.; KABÍČEK, J.; PROKINOVÁ, E.; RYŠÁNEK, P.; STEJSKAL, V. (2001): Choroby a škůdci polních plodin, ovoce a zeleniny, druhé doplněné vydání. Týdeník Farmář – Zemědělec ve spolupráci se Studiem F, Praha, ISBN: 80-902413-3-6 37. KAZDA, J.; MIKULKA, J.; PROKINOVÁ, E. (2010): Encyklopedie ochrany rostlin, polní plodiny, Profi Press s.r.o., ISBN: 978-80-86726-34-2, s. 399 38. Keeping moulds out of food and animal feed with propionic acid (2006): Feed Tech, n. 7 39. KOCOUREK, F. (2012): Zásady integrované ochrany rostlin, povinnosti a přínosy pro pěstitele, Úroda č. 4, s. 68-69, s. 94 40. KRUCZEK, A. (1997): Influence of meteorological factors and nitrogen fertilization on damage by diseases, insects and lodging of maize, In Roczniki Akademii Rolniczej w Poznaniu. Rolnictwo,n. 50, ISSN: 0137-1754, pp. 63-71 41. KUSHIRO M. (2009): Effects of milling and cooking processes on the deoxynivalenol content in wheat, Int. J. Mol. Sci., 9, s. 2127-2145 42. LARSEN, J. C.; HUNT, J.; PERRIN, I.;ROCKENBAUER, P. (2004): Workshop on trichothecenes with focus on DON, summary report, Tox. Lett., 153, s. 1-22 43. LEPSCHY J. (1992): Fusarium toxins in cereals - formation and preventive measures, In Gesunde Pflanzen,n. 44(2) pp. 35-39, ISSN: 0367-4223 44. LESLIE, J. F., SUMMERELL, B., A. (2006): The Fusarium laboratory manual. 1. Vyd. Ames, lowa: Blackwell Pub., pp. 388 45. LIFE-WORLDWIDE.ORG (2013). Dostupné na: http://www.lifeworldwide.org/fungal-diseases/fusarium-oxysporum/, [2013-05-07] 46. MALÍŘ, F., OSTRÝ, V.; BÁRTA, I.; BUCHTA, V.; PAŘÍKOVÁ, H.; SEVERA, J.; ŠKARKOVÁ, J. (2003): Vláknité mikromycety (plísně), mykotoxiny a zdraví člověka, Národní centrum ošetřovatelství a nelékařských zdravotnických oborů v Brně, ISBN: 80-7013-395-3 47. MANAGING MYCOTOXINS (2007): Partnering detection with control. Feed Management, n. 4, pp. 22 – 2 48. MARÍN, S.; RAMOS, A.; CANO-SANCHO, G.; SANCHIS, V. (2012): Reduction of mycotoxins and toxigenic fungi in the Mediterranean basin maize chain, In Phytopathologia Mediterranea; n. 51, pp. 93-118 49. McMULLEN, M.; JONES R.; GALLENBERG, D. (1997): Scab of wheat and barely: A reemerging disease of devastating impact, Plant Disease 81, s. 13401348 50. MORETTI, A.; LOGRIECO, A.; BOTTALICO, A. (2006): Mycotoxins in cereals, In Informatore Fitopatologico, n. 56 (2), pp. 7-13, ISSN: 0020-0735 51. MUNKVOLD, G.; STAHR, H. M.; MORETTI, A.;RITIENI A. (1998): Occurence of fusaproliferin an beauvericin in Fusarium-contaminated livestock feed on Iowa, Applied and Environmental Mikrobiology 64, s. 3923-3926 50
52. MYCOTOXINSINFO (2013), Dostupné na: http://mycotoxinsinfo.blogspot.cz/2012_07_01_archive.html, [2013-05-07] 53. MYCOLOGY ONLINE (2013): Dostupné na: http://www.mycology.adelaide.edu.au/Fungal_Descriptions/Hyphomycetes_(hy aline)/Fusarium/oxysporum.html, [2013-05-07] 54. NAŘÍZENÍ KOMISE (ES) č. 401/2006, kterým se stanoví metody odběru vzorků a metody analýzy pro úřední kontrolu množství mykotoxinů v potravinách 55. NAŘÍZENÍ KOMISE (ES) č. 1881/2006, kterým se stanoví maximální limity některých kontaminujících látek v potravinách 56. NAŘÍZENÍ KOMISE (ES) č. 1126/2007, kterým se mění nařízení (ES) č. 1881/2006, kterým se stanoví maximální limity některých kontaminujících látek v potravinách, pokud jde o fusariové toxiny v kukuřici a ve výrobcích z kukuřice 57. NAŘÍZENÍ KOMISE (ES) č. 152/2009, kterým se stanoví metody odběru vzorků a laboratorního zkoušení pro úřední kontrolu krmiv, Úřední věstník Evropské unie, L 54/1. 58. NAŘÍZENÍ KOMISE (ES) č. 105/2010, kterým se mění nařízení (ES) č. 1881/2006, kterým se stanoví maximální limity 59. NAŘÍZENÍ KOMISE (ES) č. 165/2010, kterým se mění nařízení (ES) č. 1881/2006, kterým se stanoví maximální limity některých kontaminujících látek v potravinách, pokud jde o aflatoxiny 60. NAŘÍZENÍ KOMISE (ES) č. 594/2012, kterým se mění nařízení (ES) č. 1881/2006, pokud jde o maximální limity kontaminujících látek ochratoxinu A, PCB bez dioxinového efektu a melaminu v potravinách 61. NEDĚLNÍK, J. (2012): Fytopatologické aspekty pěstování kukuřice, Úroda č. 12, s. 48 – 50, s. 74 62. NICHOLSON, P., SIMPSON, D., R., WESTON, G., REZANOOR, H., N., LEES, A., K., PARRY, D., W., JOYCE, D. (1998): Detection and quantification of Fusarium culmorum and Fusarium graminearum in cereals using PCR assay. Physiol. Mol. Plant Pathol. 53: 17–37. 63. OBST A.; LEPSCHY – VON GLEISSENTHAL , J.; BECK R. (1997): On the etiology of Fusarium head blight of wheat in south Germany – preceding crops, weather conditions for inoculum production and head infection, proneness of the crop to infection and mycotoxin production. Proceedings of the Fifth European Fusarium Seminar. Cereal Research Communications 25, s. 699 - 703 64. OSBORNE, E., L., STEIN, J., M. (2007): Epidemiology of Fusarium head blight on small grain cereals. International Journal of Food Microbiology 119: s. 103– 108. 65. OSTRÝ, V. (1995): Zdravotní a hygienický význam mykotoxinů fumonisinů v potravinách, Průběžná zpráva grantového projektu IGA, MZ ČR, Brno 66. OSTRÝ, V. (2002): Vláknité mikromycety a mykotoxiny – vliv na zdraví člověka a živých organismů, In Biotoxiny - mykotoxiny č. 2, SZÚ v Brně, s. 27 67. OVESI, M.; JANNAT, B.; SADEGHI, N.; HAJIMAHMOODI, M. NIKZAD, A. (2007): Prescence of aflatoxin M1 in milk and infant milk products in Tehran, Iran; Food Control, 18, s. 1216-1218 68. PAŘÍKOVÁ, J.; KUČEROVÁ, I. (2001): Jak likvidovat plísně, Grada Publishing, spol. s.r.o., ISBN: 80-247-9029-7 69. PAVELKOVÁ, D., BOŘUTOVÁ, R. (2012): Boj proti nežádoucím účinkům mykotoxinů v krmivech, Krmivářství č. 2, s. 13 - 15
51
70. POLIŠENSKÁ, I.; JIRSA, O.; SALAVA, J.; MATUŠINSKÝ, P.; PROKEŠ, J.; AGROTEST fyto s.r.o. Kroměříž, VÚRV, v.v.i.; Výzkumný ústav pivovarský a sladařský a.s., Sladařský ústav Brno (2009): Fusáriové mykotoxiny a patogeny Fusarium v obilovinách sklizně 2009, Obilnářské listy 1/2010, s. 12-15 71. POLIŠENSKÁ, I. (2008): Fuzáriové mykotoxiny v obilovinách v ČR, Mykotoxiny 2008, s. 25 72. POLSTER, M. (1984): Mikrobiologie v hygieně výživy, Avicentrum, Praha, s. 21 - 42 73. PORTA, G. DELLA; VERDERRIO, A.; MOTTO, M. (2004): Maize mycotoxins: results and perspectives. Cultural and genetic strategies to contrast toxigenic fungi and reduce mycotoxins in maize, In Informatore Fitopatologico, n. 12, ISSN: 0020-0735 74. RADOVÁ, Š. (2013): Růžovění klasů a ochrana. Týdeník Zemědělec č. 16, s. 26, s. 55 75. SAVARD, M. E. (1991): Deoxynivalenol fatty acid and glucoside conjugates, In Journal of agricultural and food chemistry, n. 39, pp. 570 - 574 76. SCAUFLAIRE, J.; GOURGUE, M.; CALLEBAUT, A.; MUNAUT, F. (2012): Fusarium temperatum, a mycotoxin-producing pathogen of maize, In European Journal of Plant Pathology, n. 133, pp. 911-922 77. SCHIMMEL-FINDEN.DE (2013): Dostupné na http://www.schimmelfinden.de/web/verdacht_schimmel/1-4-1-6_fusarium_sporotrichioides.php, [2013-05-07] 78. SCHNEIDEROVÁ, P. (2008): Bezpečnost krmiv a zdraví zvířat – mykotoxiny, UZPI, s. 45 79. Směrnice Evropského parlamentu a Rady 2002/32/ES o nežádoucích látkách v krmivech, Úřední věstník Evropské unie, L140/10. 80. Směrnice Komise 2003/100/ES, kterou se mění příloha I směrnice Evropského parlamentu a Rady 2002/32/ES o nežádoucích látkách v krmivech, Úřední věstník Evropské unie, L 285/33. 81. SYMPOZIUM Posviťme si na mykotoxiny, Brno Alltech, 21. 10. 2003 82. SÝKOROVÁ, S.; MATĚJOVÁ, E.; CHRPOVÁ, E. (2005): Monitorig obsahu fusariových mykotoxinů ve vzorcích pšenice, ječmene a žita (2000 – 2004). Sborník z konference „Jakost obilovin“, Kroměříž, 10. 11. 2005 83. ŠIRUČKOVÁ, I.; KROUTIL, P. (2007): Fuzariózy na obilninách (Fusarium spp.), MZe, SRS, Praha 84. TRNKOVÁ (2013): Pravidla pro pěstování Bt-kukuřice, Týdeník Zemědělec č. 18, s. 17. 85. TVARŮŽEK, L., JI, L., CAO, K. (2003): Reaction of winter wheat genotypes from Chinese and Czech collection to Fusarium head blight and leaf diseases. In: Liu D. (ed.): Research of Plant Pathology in Hebei. China Agr. Press, Vol. 1: 94–100. 86. UEGAKI, R.; KOBAYASHI, H.; TOHNO, M.; TSUKIBOSHI, T. (2012): Identification of mycotoxin-producing Fusarium spp. isolated from corn and the changes in concentration of fumonisin during the cultivation period, In Grassland Science; n. 58 pp121-126 87. VAN ASSELT, E. D.; BOOIJ, C. J. H.; VAN DER FELS-KLERX, H. J. (2012): Modelling mycotoxin formation by Fusarium graminearum in maize, In The Netherlands, In Food Additives & Contaminants. Chemistry, Analysis, Control, Exposure & Risk Assessment; n. 29 pp. 1572-1580
52
88. WAGACHA, J., M., MUTHOMI, J., V. (2007): Fusarium culmorum: Infection process, mechanisms of mykotoxin production and their role in pathogenesis in wheat. Crop protection 26: 877–885. 89. WAŚKIEWICZ, A.; BESZTERDA, M.; GOLINŚ SKI, P. (2012): Occurrence of fumonisins in food - an interdisciplinary approach to the problém, In Food Control, n. 26(2) pp. 491-499, ISSN 0956-7135 90. WIKI.BUGWOOD.ORG (213): Dostupné na : http://wiki.bugwood.org/Archive:Forestnursery/Fusarium_subglutinans, [201305-07] 91. WHITLOW, L. W. HAGLER; W. M. (2007): Mycotoxins, Feedstuffs 38, pp. 8796
53
6 PŘÍLOHY 6.1 Seznam tabulek Tab. 1: Výskyt zástupců rodu Fusarium v potravinách
str. 14
Tab. 2: Výskyt zástupců rodu Fusarium v potravinách
str. 22
Tab. 3: Producenti fumonisinů
str. 29
Tab. 4: Významní producenti zearalenonu
str. 30
Tab. 5: Vzorky krmiv pro stanovení mykotoxinů
str. 38
Tab. 6: Průměrné obsahy mykotoxinů v krmné kukuřici
str. 38
Tab. 7: Příčiny vyššího obsahu mykotoxinů v kukuřici
str. 45
54
6.2 Seznam obrázků Obr. 1: Fusarium avenaceum
str. 15
Obr. 2: Fusarium equiseti
str. 16
Obr. 3: Fusarium graminearum
str. 17
Obr. 4: Fusarium oxysporum
str. 17
Obr. 5: Fusarium culmorum
str. 17
Obr. 6: Fusarium poae
str. 19
Obr. 7: Fusarium proliferatum
str. 19
Obr. 8: Fusarium semitectum
str. 20
Obr. 9: Fusarium solani
str. 21
Obr. 10: Fusarium sporotrichioides str. 21 Obr. 11: Fusarium subglutinans
str. 22
Obr. 12: Zaplísnění slámy
str. 37
55
