MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Ústav chemie
Bakalářská práce Technologie přípravy a isolace rekombinantních proteinů: studium chemických vlastností vybraných mutant rekombinantní kukuřičné β-glukosidasy Zm-p60.1
Pavel Klimeš
Brno
2011
Prohlašuji, že jsem tuto bakalářskou práci vypracoval samostatně pod vedením doc. RNDr. Přemysla Lubala, Ph.D. a RNDr. Tomáše Filipi a za použití uvedeného seznamu literatury. Brno 25. 5. 2011 ……………………………. v. r. Pavel Klimeš
2
Mé poděkování je směrováno především RNDr. Tomáši Filipi, který mě po celou dobu této práce vedl a pomáhal. Poděkovat bych chtěl také doc. RNDr. Přemyslu Lubalovi, Ph.D. za to, že mi umožnil realizovat bakalářskou práci mimo univerzitu. Za podporu a vstřícnost patří dík také Mgr. Pavlu Mazurovi, PhD., Bc. Dušanu Turkovi a mnoha dalším.
3
Abstrakt Kukuřičná β-glukosidasa (EC 3.2.1.21) Zm-p60.1 je enzym katalyzující hydrolýzu trans-zeatin-O-glukosidu na glukosu a trans-zeatin. Tato práce řeší technologie přípravy a izolace rekombinantních proteinů a studia vlastností mutant SB1 a SB2 kukuřičné β-glukosidasy Zm-p60.1. Teoretickou část představuje literární rešerše věnovaná problematice purifikace rekombinantních proteinů zapojených do cytokininového metabolismu rostlin. Praktická část práce řeší produkci, purifikaci a enzymovou kinetiku mutant SB1 a SB2 kukuřičné β-glukosidasy Zm-p60.1. Obě mutanty byly exprimovány v Escherichia coli BL21(DE3)pLysS-T1R a purifikovány afinitní chromatografií na koloně HisTrap HP (5 ml) a gelovou filtrací za využití kolony HiLoad 16/60 Superdex 200 prep grade. Čistota purifikovaných proteinů byla vyšší než 95 %. Enzymová kinetika byla měřena při 30 °C na umělém substrátu pNPG: u mutanty SB1 byly zjištěny hodnoty Km = 0,48 ± 0,02 mmol·l-1 a kcat = 12,94 ± 0,10 s-1; u mutanty SB2 byly hodnoty Km = 0,50 ± 0,02 mmol·l-1 a kcat = 19,12 ± 0,20 s-1. Hydrolytická eficience mutanty SB2 je asi o 30 % vyšší než u mutanty SB1 a dosahuje 60 % hydrolytické eficience wild-type. Připravené mutanty SB1 a SB2 β-glukosidasy Zm-p60.1 mohou sloužit jako nástroj k jemnému ovlivňování hladin cytokininů. Tyto a další připravené mutanty budou následně transformovány do rostlin určených ke studiu regulace cytokininové homeostáze. Klíčová slova: β-glukosidasa, purifikace, rekombinantní protein
4
Abstract The maize β-glucosidase (EC 3.2.1.21) Zm-p60.1 is an enzyme catalyzing the hydrolysis of trans-zeatin-O-glucopyranoside to glucose and trans-zeatin. This thesis is focused on the production, purification and partial characterization of the mutants SB1 and SB2 of Zm-p60.1. The thesis includes a theoretical part devoted to a review of the literature on purification of recombinant proteins involved in cytokinin metabolism of plant. The practical part contains part of the study of two obtained mutant forms of Zm-p60.1. The Zm-p60.1 mutants SB1 and SB2 were expressed in Escherichia coli BL21(DE3)pLysS-T1R and purified by affinity chromatography on a 5 ml HisTrap HP column followed by gel filtration on a HiLoad 16/60 Superdex 200 prep grade column to purities of > 95 %. Enzyme kinetics was measured at 30 °C with the artificial substrate pNPG: the values for the SB1 mutant were Km = 0.48 ± 0.02 mmol·l-1 and kcat = 12.94 ± 0.10 s-1. For SB2 the values were Km = 0.50 ± 0.02 mmol·l-1 and kcat = 19.12 ± 0.20 s-1. Hydrolytic efficiency of SB2 is about 30 % higher than SB1 and is equal to approximately 60 % of WT. These mutants of Zm-p60.1 can be a tool for subtle changes in cytokinin metabolism in plants. These and other mutated forms of Zm-p60.1 will be mobilized into transgenic plants as part of future research into the regulation of cytokinin homeostasis. Keywords: β-glucosidase, purification, recombinant protein
5
Obsah 1.
Rekombinantní proteiny..................................................................................................... 8 Expresní systémy.................................................................................................................... 8
2.
Metody isolace a identifikace rekombinantních proteinů ................................................ 10 Chromatografie..................................................................................................................... 10 Afinitní chromatografie.................................................................................................... 11 Gelová filtrace .................................................................................................................. 12 Chromatografie využívající hydrofobní interakce ........................................................... 13 Iontově výměnná chromatografie..................................................................................... 13 Chromatofokusace............................................................................................................ 14 FPLC (fast protein liquid chromatography) ......................................................................... 15 Gelová elektroforéza ............................................................................................................ 16 SDS-PAGE....................................................................................................................... 16 NATIV-PAGE.................................................................................................................. 16
3.
Popis cytokininového metabolismu ................................................................................. 17 Kukuřičná β-glukosidasa Zm-p60.1..................................................................................... 19
Cíle Práce ................................................................................................................................. 20 4.
Literární rešerše purifikace rekombinantních proteinů zapojených do cytokininového
metabolismu rostlin .................................................................................................................. 21 5.
Experimentální část .......................................................................................................... 28 Přístrojové a softwarové vybavení ....................................................................................... 28 Použité chemikálie a pufry................................................................................................... 29 Transformace bakterií .......................................................................................................... 34 Mikroexpresní analýza ......................................................................................................... 34 Příprava lysatů...................................................................................................................... 35 Purifikace rekombinantních proteinů ................................................................................... 35 Gelová elektroforéza za denaturujících podmínek – SDS-PAGE........................................ 36 Gelová elektroforéza za nedenaturujících podmínek – NATIV-PAGE............................... 36 Aktivitní barvení – ZYMOGRAM................................................................................... 36 Stanovení koncentrace proteinů (dle Bradfordové) ......................................................... 37 Enzymová kinetika............................................................................................................... 38
6
Výsledky a diskuse............................................................................................................... 39 Mikroexpresní analýza ..................................................................................................... 39 Purifikace mutanty SB1 a SB2......................................................................................... 40 Určení molekulové hmotnosti dimeru a monomeru z gelové filtrace .............................. 42 Enzymová kinetika mutant SB1 a SB2 ............................................................................ 45 Závěr......................................................................................................................................... 48 Seznam použitých zkratek........................................................................................................ 49 Seznam použité literatury......................................................................................................... 50
7
1. Rekombinantní proteiny Rekombinantní proteiny jsou takové proteiny, které jsou získávány expresí rekombinantní DNA v heterologních expresních systémech. Exprese rekombinantních proteinů je využívána převážně v případech, kdy je obtížné studovaný protein z přirozeného zdroje izolovat, nebo je-li míra exprese studovaného proteinu v daném organismu nízká. Rekombinantní proteiny se využívají hlavně v biotechnologii (produkce inzulínu, interferonu, erytropeotinu aj.) a pro výzkumné účely [1].
Expresní systémy Heterologní expresní systémy jsou živé organismy, které jsou využívány k produkci rekombinantních proteinů (existují i nebuněčné expresní systémy, které jsou tvořeny směsí organel a potřebných chemických látek). Expresní systémy se dělí na prokaryotní a eukaryotní. Mezi eukaryotní expresní systémy patří kvasinky, hmyzí buňky, savčí buňky a transgenní rostliny [2]. Prokaryotní systém je velmi oblíbený pro svoje vlastnosti, kterými jsou rychlý růst buněk, relativně velká výtěžnost exprimovaného proteinu, jednoduchá manipulace a nízké náklady na chemikálie a instrumentaci. Tento systém je využíván pro expresi bakteriálních proteinů, dále plastidových a mitochondriálních proteinů, které nevyžadují post-translační modifikace. Nicméně prokaryotický expresní systém má i své nevýhody: Při expresi řady eukaryotních proteinů může nastat problém s „codon-usage“ – některé aminokyseliny v prokaryotách jsou kódovány jiným tripletem, než je tomu v eukaryotách. Může se tedy stát, že translace mRNA neproběhne korektně, nebo vůbec. Tento problém lze obejít syntézou umělého genu, který má již „codon-usage“ optimalizovaný pro expresi v prokaryotním systému, nebo ko-expresí rekombinantního proteinu s animo-acyl-tRNA-transferasami, které odpovídají eukaryotní „codon-usage“ (geny pro eukaryotní amino-acyl-tRNA-transferasy jsou obvykle součástí dalšího plasmidu). Další nevýhodou může být absence vhodných chaperonů, které zajišťují správné skládání do terciální struktury proteinu. Nebývá tedy výjimkou, že řada rekombinantních proteinů (často eukaryotních) nemusí být vhodně poskládána do své nativní terciální a kvarterní struktury a nevykazují požadované vlastnosti. Problém s nedostatkem vhodných chaperonů lze částečně eliminovat vhodnou ko-expresí rekombinantního proteinu s chaperony (geny chaperonů jsou kódovány dalším plasmidem). Rekombinantní proteiny mohou u bakterií vytvářet tzv. inkluzní tělíska, což jsou nerozpustné agregáty 8
rekombinantního proteinu. Tvorbu inkuzních těles lze částečně eliminovat změnami kultivačních podmínek (snížením teploty) koexpresí rekombinantního proteinu s vhodnými chaperony, nebo ko-translační fúzí s proteiny zvyšující rozpustnost rekombinantního proteinu [např. thioredoxin, glutathion-S-transferasa, transcription termination anti-termination factor (NusA), maltose-binding protein]. Z inkluzních tělísek můžeme získat protein procesem zvaným „refolding“, ale výsledek tohoto procesu je poměrně nejistý a využívá se jen omezeně [3]. Posledním a asi nejvýznamnějším nedostatkem prokaryotního expresního systému je to, že není schopen post-translačních modifikací (glykosylace, fosforylace, acetylace, atd.), které jsou často klíčové pro funkci řady eukaryotních proteinů. Nejčastěji používanou bakterií pro produkci rekombinantních proteinů je Escherichia coli, méně využívanou bakterií je Bacillus subtilis. Na rozdíl od prokaryot jsou v eukaryotních buňkách přítomny všechny potřebné systémy zajišťující post-translační modifikace proteinů. Správné složení proteinů do terciární struktury je zajištěno přítomností mnoha chaperonů. Rekombinantní proteiny jsou přirozeně produkovány do kultivačního média. Nejčastěji využívaným eukaryotním expresním systémem jsou kvasinky Sacharomyces cerevisce a Pichia pastoris. Jejich velkou výhodou je rychlý růst a vysoká produkce rekombinantních proteinů. Jistou nevýhodou může být masivní N-hyperglykosilace proteinů. Tato skutečnost může způsobit ztrátu aktivity proteinu [2]. Hmyzí buňky (Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda), stejně jako savčí, jsou velmi dobrým expresním systémem pro většinu eukaryotních proteinů. Nevýhodou těchto systémů je náročná manipulace a vysoké náklady na instrumentaci. V rostlinách jsou připravovány rekombinantní fragmenty protilátek. Tyto protilátky mohou chránit přímo rostlinu, nebo je lze extrahovat a použít v medicíně či diagnostice. Nejpoužívanější jsou buňky tabáku BY-2 odvozené z dřeně Nicotina tabacum [2].
9
2. Metody isolace a identifikace rekombinantních proteinů Chromatografie Proteiny jsou isolovány především chromatografickými metodami. Chromatografie byla poprvé použita v roce 1903, kdy botanik M. S. Cvět na skleněné koloně naplněné CaCO3 separoval chloroplastové pigmenty z rostlinných extraktů. Chromatografie je separační metoda, která je založena na rozdílné distribuci analytu mezi stacionární a mobilní fázi. Poměr koncentrací analytu ve stacionární a mobilní fázi je vyjádřen jako distribuční konstanta (KD). KD =
Kde:
cs cm
KD je distribuční konstanta dané látky cs je koncentrace látky ve stacionární fázi cm je koncentrace látky v mobilní fázi
Z chromatogramu lze určit retenční charakteristiky (retenční objem a čas), které se využívají pro identifikaci složek vzorku. Plocha píku je přímo úměrná koncentraci analytu. Pro kvantifikaci složek jsou využívány dvě metody, kterými jsou metoda kalibrační přímky a metoda přídavku standardu.
Obrázek 1: Obecné schéma chromatogramu
10
V R = t r ⋅ Fm Kde:
t R = t ′R + t M
ris =
t ′R ( A) t ′R ( B)
VR je retenční objem
ris je retenční poměr dvou látek
tr je retenční čas
Fm je průtoková rychlost
t´R je redukovaný retenční čas tM je mrtvý retenční čas
Účinnost chromatografické kolony (schopnost separace složek směsi) roste s počtem tzv. teoretických pater. Každé patro je pomyslná část kolony, kde dochází k ustavení rovnováhy mezi fázemi [4]. ⎛t ⎞ n = 16⎜ r ⎟ ⎝Y ⎠
Kde:
2
n je počet teoretických pater kolony tr je retenční čas Y je šířka píku v základně
Existuje řada chromatografických metod využívajících nejrůznější fyzikálně-chemické vlastnosti stacionárních a mobilních fází. Vhodná separační chromatografická metoda (nebo jejich kombinace) je obvykle volena tak, aby separovaný protein co nejméně poškozovala či jinak degradovala. Mezi nejpoužívanější chromatografické metody v biologických oborech patří hydrofobní chromatografie, iontově výměnná chromatografie, afinitní chromatografie a gelová filtrace.
Afinitní chromatografie Při afinitní chromatografii se protein nesoucí specifickou kotvu váže na afinant spojený s nosičem. Kotvy lze dělit na oligopeptidové a proteinové. Nejčastějšími oligopeptidovými kotvami jsou: polyhistidin, polyarginin, FLAG-tag, strep-tag II, S-tag, HA-tag a C-myc. Na rozdíl od oligopeptidových kotev, využívané proteinové kotvy plní i další úlohu – zvyšují rozpustnost purifikovaného proteinu. Proteinovými kotvami jsou např. GST (glutathion-S-transferasa), MBP (maltose binding protein) a thioredoxin [5]. Kotvu je třeba zvolit na základě známých vlastností proteinu, druhu expresního systému, dle požadavků na čistotu a dalších faktorech [6]. 11
Jako nosič se při afinitní chromatografii nejvíce používá agarosa a její deriváty. Nejpoužívanějším derivátem agarosy je Sepharosa (6B, 4B a 2B – liší se koncentrací agarosy a velikostí nabobtnalých částic) a Bio-Gel A. Méně používanými nosiči jsou polyakrylamidové a hydroxyalkylmethakrylátové gely [7]. Jednou z nejčastěji používaných technik afinitní chromatografie je metalochelatační chromatografie (IMAC), při které dochází k interakci funkčních ligandů (kyselina nitrilotrioctová, nebo iminodioctová) matrice s bivalentním iontem nepřechodného kovu obsahující neobsazené d-orbitaly a proteinem nesoucího polyhistidinovou kotvu. Tyto orbitaly jsou schopny pomocí donor-akceptorové vazby sdílet volné elektronové páry dusíku a kyslíku funkční skupiny a zároveň volné elektronové páry dusíku imidazolových skupin histidinových reziduí polyhistidinové kotvy. Eluci navázaného proteinu lze provést imidazolem, silným chelatačním činidlem (EDTA) nebo změnou fyzikálních vlastností mobilní fáze (snížením pH). Metalochelatační chromatografie je velmi selektivní a používané kolony se vyznačují vysokou vazebnou kapacitou separovaných proteinů.
Obrázek 2: Specifická interakce proteinu opatřeným hexahistidinovou kotvou s afinantem aktivovaným nikelnatými ionty
Gelová filtrace Gelová filtrace separuje analyty na základě rozdílné molekulové hmotnosti proteinu. Matrice kolony je tvořena porézními částicemi gelu (nerozpustná a inertní polymerní látka), ve kterých se nachází kapalná stacionární fáze. Velikost částic a pórů ovlivňuje účinnost a
12
rychlost separace. V pórech gelu se více zachycují látky s menší molekulovou hmotností, zatímco látky s větší molekulovou hmotností jsou zadržovány méně, nebo vůbec a jsou dále unášeny mobilní fází. Tohoto efektu je v praxi využíváno při určování molekulové hmotnosti proteinů a při jejich odsolování. Matrici může představovat xerogel, aerogel nebo hybridní xerogel-aerogel. Xerogely (Superdex – křížově spojená agarosa a dextran, Sephadex – dextran, Bio-Gel P – polyakrylamid, agarosové gely aj.) jsou tvořené lineárními makromolekulami, jejichž poloha je fixována křížovými kovalentními vazbami. Jako mobilní fáze se pro xerogely zpravidla volí voda, ve které bobtnají na několikanásobek svého objemu. Použitím některých organických rozpouštědel dochází ke kolapsu gelu. Aerogely (pórovité sklo) jsou pevné, strukturně neměnné a obsahují póry určité velikosti. Výhodou je použití jakéhokoli rozpouštědla, protože gel nebobtná a nedochází ke kolapsu gelu při výměně mobilní fáze. Hybridní xerogely-aerogely (Spheron, Styragel) obsahují jak mikropóry xerogelů, tak markopóry aerogelu a jsou odolné vůči vyšším tlakům [6,7].
Chromatografie využívající hydrofobní interakce Tato chromatografie separuje proteiny s rozdílnou hydrofobicitou. Proteiny se reversibilně váží na povrch matrice (Sepharosa, polystyren), na kterou je vázán nepolární funkční ligand (felylové, butylové, oktylové zbytky atd.). Vyšší interakce lze dosáhnout vyšší iontovou silou mobilní fáze. Protein je nutné rozpustit v mobilní fázi s vysokou iontovou silou. Eluce probíhá nejčastěji obráceným gradientem koncentrace soli v mobilní fázi, méně se využívá snižování polarity, přídavek chaotropního činidla, detergentů nebo změna pH [6].
Iontově výměnná chromatografie Iontově výměnná chromatografie využívá rozdílu v náboji analytů. Protein nesoucí nenulový náboj se reverzibilně váže na matrici s opačným nábojem a následně probíhá zpravidla gradientová eluce roztokem o vyšší koncentraci soli (vyšší iontová síla) nebo posunem pH k hodnotě izoelektrického bodu (pI) proteinu [6]. Jako stacionární fáze se používají tzv. ionexy, což jsou látky, které při styku s vodou bobtnají a uvolňují ionty. Tyto ionty jsou reverzibilně nahrazeni jinými, které mají v mobilní fázi k ionexu větší afinitu. Ionexy, na kterých se vyměňují kationy, se nazývají katexy a ty, na kterých se vyměňují aniony anexy. Nejpoužívanějšími katexy jsou látky, které je možné
13
označit jako polymerní polyvalentní kyseliny, kdežto anexy jako polymerní polyvalentní báze. Ionexy jsou jak anorganické, tak i organické a to jak syntetické, tak přírodní (vhodně upravený polydextran, agar, celulosa) [7]. Podmínky pro chromatografii proteinů je třeba zvolit dle izoelektrického bodu, kdy je sorpce na stacionární fázi minimální, avšak změnou pH do zásaditější oblasti je možně protein separovat na anexu, nebo do kyselejší oblasti, kdy lze protein separovat na katexu. Katexy jsou všeobecně více využívané než anexy, neboť proteiny vykazují vyšší stabilitu v kyselejších oblastech pH [7].
Chromatofokusace Chromatofokusace je metoda, při které jsou proteiny separovány na základě odlišné hodnoty pI. Kolonu je třeba ekvilibrovat vhodnými pufry (Polypufr 74, Polypufr 96, Pharmalyte 8 – 10,5), a poté, kdy je na koloně vytvořen pH gradient, jsou proteiny eluovány dle svého izoelektrického bodu. Vzorek proteinu dávkovaný na kolonu ekvilibrovanou „polypufrem“ o nejnižším pH je stacionární fází zadržován v případě, že jeho pI je nižší než pH pufru. Naopak, protein migruje kolonou v případě, pokud je jeho pI vyšší než pH pufru. Chromatofokusace je vysoce selektivní a citlivá metoda sloužící k vysoce citlivé separaci proteinů. Separační rozsah kolony je udáván na 0,05 pI. Chromatofokusace se obvykle využívá při separaci proteinů o podobné molekulové velikosti, nebo k separaci isoenzymů, které se téměř neliší molekulovou hmotností, ale pI [6]. Teoretické titrační křivky proteinů
Chromatogram separace
+
A
náboj proteinu
pI proteinů
pH gradient pH gradient
pH
-
t [min]
Obrázek 3: Chromatofokusační separace proteinů za základě rozdílného pI
14
Gelová filtrace
Hydrofobní interakce
Iontové výměnná
Afinitní
Reverzní fáze
Obrázek 4: Separační principy chromatografických technik (GE Healthcare, 2007)
FPLC (fast protein liquid chromatography) FPLC je typ kapalinové chromatografie, která slouží pro separaci nebo čištění proteinů z komplexních směsí. Moderní FPLC stroje jsou složeny jako celek a obsahují velmi přesná čerpadla zajišťující konstantní průtok mobilní fáze, řídící jednotku, detektor (zpravidla UV nebo UV/vis), sběrač frakcí, kolony pro separace a další prvky. Pumpy Kolona
Detektor
Dávkovací smyčka
Odpad
Zásobníky mobilní fáze
Vyhodnocovací zařízení
Sběrač frakcí
Obrázek 5: Schéma instrumentace FPLC
15
Gelová elektroforéza Jedná se o separační metodu, při které je využívána rozdílná mobilita analytů ve stejnosměrném elektrickém poli. Separované látky musí nést elektrický náboj (musí se jednat o ionty). Mobilita látek závisí hlavně na molární hmotnosti a také na celkovém náboji molekuly v elektrickém poli. Při diskontinuální gelové elektroforéze probíhá separace ve dvou na sebe navazujících gelech, které mají jinou velikost pórů a jiné pH. Účelem zaostřovacího gelu je zkoncentrovat proteiny do úzkých zón na principu izotachoforézy, kde vedoucím elektrolytem jsou chloridové ionty a koncovým je glycin. Rozdělovací gel slouží k úplně separaci proteinů [8].
SDS-PAGE SDS-PAGE je elektroforetická metoda separace proteinů za denaturujících podmínek v přítomnosti dodecylsíranu sodného (SDS). Denaturace proteinu probíhá za teploty 95 °C. Separace probíhá na polyakrylamidovém gelu a závisí na molekulové velikosti, stupni denaturace proteinu, post-translačních modifikacích a dalších faktorech. Proteiny v SDS pufru mají jednotkový náboj v důsledku rovnoměrného pokrytí celého proteinu molekulami SDS (na 1 g proteinu se váže 1,4 g SDS), a proto při separaci nezáleží na náboji, který protein nese. K posouzení molekulové hmotnosti proteinu se používá směs proteinů o známých molekulových hmotnostech (marker). Po ukončení elektroforézy se proteiny mohou barvit Coomassie blue (kvantitativně) nebo stříbrem (není kvantitativní, ale naopak citlivější) přímo na gelu [9].
NATIV-PAGE NATIV-PAGE je metoda separace proteinů za nedenaturujících podmínek, kdy je zachována jejich biologická aktivita. O rychlosti migrace proteinů rozhoduje jejich hmotnost, tvar a velikost náboje při daném pH. Detekci separovaných proteinů na gelu lze provést např. aktivitním barvením (enzym na gelu reaguje se substrátem a vytváří se barevný produkt).
16
3. Popis cytokininového metabolismu Cytokininy hrají důležitou roli v různých oblastech rostlinného růstu, vývoje a také buněčného dělení, stárnutí a přenosu signálů výživy. První sloučeninou označenou za cytokinin je kinetin, který byl identifikován Millerem a Skoogem [10]. Nejrozšířenějším a nejaktivnějším cytokininem v přírodě je trans-zeatin objevený začátkem šedesátých let 20. století.
(b)
(a) HN N NH
O N
N
OH
HN N NH
N N
Obrázek 6: Struktura kinetinu (a) a trans-zeatinu (b)
Rostlinné cytokininy jsou adeniny substituované na N6 a jsou děleny na isoprenoidní a aromatické [11].
17
1: isopentenyltransferása (ITP) 2: 5'-nulkeotidása nebo fosfatása 3: adenosin nukleosidása 4: adenosin kinása 5: purin nukleosid fosfatása 6: mikrosomální hydroxylása 7: zeatin reduktása 8: adenin fostoryboxyltransferása 9: zeatin isomerása 10: cytokinn oxidása/dehydrogenása 11: tRNA-ITP
NH2
DMAPP O O
-
P O
ATP/ADP/AMP
+
O P
O -
O
O
N
O
P
HO
-
+ HMBDP
N
O N
O
n
OH
O
N
O
-
O OH
O
P
P
O -
O
O -
HO
OH
OH
1 HN
iPRPs N
P
N
O
n
OH
N
O
6
P
O
N
O
n
N
N
O
N
P
HO
N
O
N
O
OH
OH OH
2
N
O HO
HN
DZRMP
N
OH OH
HN
tZRPs
N
O HO
OH
1
OH
OH
4
OH
OH
OH
2 4
2 4
HN N
8
iPR N
HO
6
N
O
N
HO
O
7 OH
3 5
OH
N
OH
OH
3 5
OH
N
OH
3 5
Adenin
HN
N NH
N
DZR
10
10
OH
HN N
N
HO
Adenosin
iP
N
tZR
N
O
OH
HN
N
10 N
10 6
N
HN
tZ
DZ
N
7
N
NH
NH
N
HN
N
N N
9
cZ N NH
DMAPP HMBDP iPRPs tZRPs iPR DZRMP
OH
HN N
tRNA-iP
11
tRNA
+DMAPP
N
dimethylallyl difosfát 4-hydroxy-3-methyl-2-(E)-butenyl difosfát isopentenyladenin ribosid n-fosfát trans-zeatin ribosid n-fosfát isopentenyladenin ribosid dihydrozeatin ribosid monofosfát
iP DZR DZ tZ cZ tZR
isopentenyladenin dihydrozeatin ribosid dihydrozeatin trans-zeatin cis-zeatin trans-zeatin ribosid
Obrázek 7: Schéma cytokininového metabolismu
18
Kukuřičná β-glukosidasa Zm-p60.1 Dle Mezinárodní unie pro biochemii a molekulární biologii jsou β-glukosidasy (EC 3.2.1.21) spadající do rodiny glykosid hydrolás GH1 (EC 3.2.1.-) děleny na základě své substrátové specifity, případně mechanismu enzymové reakce. Jiné dělení enzymu přináší databáze CAZy (www.cazy.org), která vytváří systém řazení enzymů podle strukturní podobnosti, a proto byly zavedeny tzv. klany. β-glukosidasy spadají pod klan GH-A, které mají strukturu (β/α)8-barelu. β-glukosidasa Zm-p60.1 je složena z osmi jednotek α-helixů a osmi jednotek β-skládaných listu spojených variabilními smyčkami.
Obrázek 8: Struktura dimeru β-glukosidasy Zm-p60.1 (červené β-skládané listy, tyrkysové α-helixy, fialové variabilní smyčky), obraz vytvořen v programu PyMOL 1.1, autor obrázku: Pavel Mazura
β-glukosidasa uvolňuje biologicky aktivní cytokininy z O-glukosidů, které jsou hydrolyticky štěpeny na monosacharid a aglykon [12,13]. Substrátová specifita byla testována na několika přirozených i umělých substrátech. Z přirozených substrátů byly štěpeny trans-zeatin-O-glukopyranosid (ZOG) (in vitro, in vivo) [14], kinetin-N3-glukopyranosid (K3G) (in vitro) [12] a 2,4-dihydroxy-7-metoxy-1,4benzoxazin-3-on glukopyranosid (DIMBOAG) (in vitro) [15]. Hydrolýza N7 a N9-glukosidů nebyla prokázána. Z umělých substrátů byly štěpeny 4-metylumberliferyl-β-D-glukopyranosid (MUG), p-nitrofenyl-β-D-glukopyranosid (pNPG) [16], p-nitrofenyl-β-D-fukopyranosid. 19
Aktivní forma enzymu vykazuje dimerní kvarterní konformaci. Mutacemi může dojít k destabilizaci dimeru a ke ztrátě enzymové aktivity. Teoretické hodnoty molekulové hmotnosti β-glukosidasy Zm-p60.1 vypočtené z aminokyselinového složení enzymu jsou 118,5 kDa pro dimer a 59,2 kDa pro monomer [17]. CH3
tZ
OH
HN
β-glukosidasa
N
N N
zeatin O-glykosyltransferasa
NH
O-glukosid (tZOG)
zeatin cis-trans isomerasa OH
cZ CH3
HN N
N N
cZ tZ
NH
cis-zeatin trans-zeatin
β-glukosidasa
O-glukosid (cZOG)
cis-zeatin O-glykosyltransferasa
cZOG tZOG
cis-zeatin-O-glukosid trans-zeatin-O-glukosid
Obrázek 9: Schéma hydrolýzy tZOG a cZOG β-glukosidasou Zm-p60.1
Cíle Práce Cílem teoretické části této bakalářské práce byla literární rešerše purifikačních postupů využívaných při izolaci enzymů zapojených do cytokininového metabolismu rostlin exprimovaných jako rekombinantní proteiny. Cílem praktické části této práce byla exprese, purifikace a částečná charakterizace mutant SB1 a SB2 kukuřičné β-glukosidasy Zm-p60.1.
20
4. Literární rešerše purifikace rekombinantních proteinů zapojených do cytokininového metabolismu rostlin Zouhar J. a kol., 1999 [18] Purifikovaný enzym: β-glukosidasa Zm-p60.1 (EC 3.2.1.21) Expresní vektor: pRSET A Expresní systém: Escherichia coli BL21(DE3)pLysS Purifikace za nativních podmínek: Použité pufry: A: 50 mmol·l-1 Na2HPO4, 1 mol·l-1 NaCl, pH 7,0 B: 50 mmol·l-1 Na2HPO4, 1 mol·l-1 NaCl,, 50 mmol·l-1 imidazol, pH 6,1 E: 0,1 mol·l-1 EDTA, 1 mol·l-1 NaCl, pH 8,0 Afinitní POROS MC/M kolona byla ekvilibrována buď 50 mmol·l-1 roztokem síranu měďnatého, nebo síranu zinečnatého, nebo síranu kobaltnatého či síranu nikelnatého. Následně byla promyta vodou a ekvilibrována pufrem A. Nanesení supernatantu bakteriálního lysatu bylo provedeno rychlostí 2 ml·min-1. Kolona byla dále promyta 20 objemy kolony pufrem A, lineárním gradientem imidazolu pufru A a B, pufrem B a nakonec 5 objemy kolony vodou. Enzym opatřený hexahistidinovou kotvou byl eluován pufrem E při průtoku 3 ml·min-1. Frakce s enzymem byly naneseny při průtoku 1 ml·min-1 na afinitní kolonu Sepharose NTA-Ni2+ Superflow Matrix ekvilibrovanou pufrem A. Kolona byla promyta 20 objemy kolony pufrem A, 20 objemy kolony gradientem imidazolu pufru A a B, 20 objemy kolony pufrem B a 5 objemy kolony vodou. Enzym byl eluován pufrem E při průtoku 3 ml·min-1. Purifikace za denaturujících podmínek: Použité pufry: Lyzační pufr: 20 mmol·l-1 Tris/HCl, 6 mol·l-1 guanidin hydrochlorid, 5 mmol·l-1 imidazol, 10 % glycerol, pH 8,0 AD: 50 mmol·l-1 Tris, 1 mol·l-1 NaCl, 8 mol·l-1 močovina, 10 % glycerol, 5 mmol·l-1 imidazol, pH 8,0 BD: 50 mmol·l-1 Na2HPO4, 8 mol·l-1 močovina, 10 % glycerol, 1 mol·l-1 NaCl, 5 mmol·l-1 imidazol, pH 6,1 ED: 0,2 mol·l-1 EDTA, 8 mol·l-1 močovina, 10 % glycerol, 1 mol·l-1 NaCl, pH 8,0 21
Afinitní kolona Sepharose NTA-Ni2+ Superflow byla ekvilibrována roztokem síranu měďnatého, zinečnatého, kobaltnatého nebo nikelnatého, promyta vodou a ekvilibrována pufrem A. Supernatant bakteriálního lysatu byl nanesen rychlostí 1 ml·min-1. Kolona byla promyta rychlostí 3 ml·min-1 20 objemy kolony AD pufrem, 30 objemy krokovým gradientem AD – BD (po 25 %) pro výměnu mobilní fáze a 20 objemy BD pufrem. Protein byl eluován pufrem ED při průtoku 1 ml·min-1. Rotrekl V. a kol., 1999 [19] Purifikovaný enzym: β-glukosidasa Zm-p60.1 (EC 3.2.1.21) Expresní vektor: pRSET A Expresní systém: Escherichia coli BL21(DE3)pLysS Bakteriální pelet s exprimovaným proteinem opatřeným hexahistidinovou kotvou byl desintegrován, následně centrifugován a supernatant byl purifikován na Sepharose nitroacetic acid/Ni2+ Superflow afinitní koloně dle manuálu (autoři blíže nespecifikují postup purifikace). Po chromatografii byl protein dialyzován v 10 mmol·l-1 Tris/HCl (pH 8,0) a zkoncentrován. Cicek M., Esen A., 1999 [20] Purifikovaný enzym: β-glukosidasa Glu1, Glu2 (EC 3.2.1.21) Expresní vektor: pET-21a Expresní systém: Escherichia coli BL21-pLysS Enzym β-glukosidasa Glu1 byla precipitován síranem amonným, precipitát byl rozpuštěn v 25 mmol·l-1 midaziol/HCl pufru (pH 7,4) a odsolen na gelové koloně Sephadex G-25. Roztok s enzymem byl nanesen na chromatofokusační kolonu PBE-94 ekvilibrovanou 25 mmol·l-1 imidazol/HCl pufrem (pH 7,4) a purifikován dle manuálu. Eluce byla provedena promytím 10 objemy kolony Polypufrem-74 s upraveným pH na 4. Enzym β-glukosidasa Glu2 byla nanesena na iontově výměnnou kolonu Accell CM ekvilibrovanou 25 mmol·l-1 pufrem octanu sodného (pH 4,8). Eluce probíhala lineárním gradientem 0 – 1 mol·l-1 NaCl. Frakce s enzymem byly zkoncentrovány, odsoleny a naneseny na chromatofokusační kolonu PBE-94 ekvilibrovanou 25 mmol·l-1 histidin/HCl pufrem (pH 6,2). Protein byl eluován Polypufrem-74 s upraveným pH na 4,5.
22
Cicek M. a kol., 2000 [15] Purifikovaný enzym:
β-glukosidasa Glu1 (EC 3.2.1.21), kyanogenní β-glukosidasa (dhurrinasa 1) (EC 3.2.1.21)
Expresní vektor: pET-21a Expresní systém: Escherichia coli BL21(DE3)pLyS Supernatant z bakteriálního lysatu byl nanesen na hydrofobní kolonu ToyoPearl-butyl 650M, která byla následně promývána 0,5 mol·l-1 (NH4)2SO4. Protein byl eluován gradientem od 0,5 do 0,1 mol·l-1 (NH4)2SO4 v 50 mmol·l-1 octanu sodném, pH 5,0. Czjzek M. a kol., 2001 [21] Purifikovaný enzym: β-glukosidasa ZmGlu1 (EC 3.2.1.21) Expresní vektor: pET-21a Expresní systém: Escherichia coli pLysS Bakteriální lysat byl precipitován 35 – 65 % síranem amonným, precipitát byl rozpuštěn v 50 mmol·l-1 pufru octanu sodného (pH 5,0) a centrifugován 30 min při 18000 g. Supernatant tohoto roztoku byl nanesen na hydrofobní kolonu ToyoPearl-butyl 650 M. Kolona byla promývána 0,5 mol·l-1 síranem amonným do konstantní hodnoty absorbance. Enzym byl eluován pěti objemy kolony obráceným gradientem 0,5 – 0,1 mol·l-1 síranu amonného v 50 mmol·l-1 octanu sodném (pH 5,0). K frakcím s aktivním enzymem byl přidán síran amonný do finální koncentrace 0,5 mol·l-1. Tento roztok byl opět nanesen na hydrofobní kolonu ToyoPearl-butyl 650 M a purifikován stejným způsobem, jak již bylo popsáno. Aktivní enzym byl precipitován síranem amonným (konečná koncentrace 80 %) a následně rozpuštěn v 20 mmol·l-1 HEPES (pH 7,0). Verdoucq L. a kol., 2003 [22] Purifikovaný enzym: β-glukosidasa ZmGlu1 (EC 3.2.1.21) Expresní vektor: pET-28a Expresní systém: Escherichia coli BL21(DE3)pLys Supernatant bakteriálního lysatu byl nanesen na afinitní kolonu His-Bind a purifikován (autoři se odkazují na manuál). K enzymu byl přidán síran amonný do finální koncentrace 1,0 mol·l-1 a roztok byl centrifugován 15 min při 16500 g. Supernatant roztoku byl nanesen na hydrofobní kolonu HiTrap Phenyl-HP. Eluce proteinu probíhala obráceným gradientem síranu amonného (0,8 – 0,2 mol·l-1, pH 7,0)
23
Dopitová R. a kol., 2008 [16] Purifikovaný enzym: β-glukosidasa Zm-p60.1 (EC 3.2.1.21) Expresní vektor: pRSET A Expresní systém: Escherichia coli BL21(DE3)pLysS Supernatant bakteriálního lysatu s enzymem byl nanesen na afinitní Ni Sepharose kolonu ekvilibrovanou pufrem A (20 mmol·l-1 Na2HPO4, 0,5 mol·l-1 NaCl, pH 7,9). Balastní proteiny byly eluovány 15 objemy kolony pufrem B (50 mmol·l-1 Na2HPO4, 1 mol·l-1 NaCl, 20 mmol·l1
imidazol, pH 7,9) a 15 objemy pufrem C (50 mmol·l-1 Na2HPO4, 1 mol·l-1 NaCl, 50 mmol·l-1
imidazol, pH 7,9). β-glukosidasa byla eluována pufrem D (20 mmol·l-1 Na2HPO4, 1 mol·l-1 NaCl, 100 mmol·l-1 EDTA, 20 % glycerol, pH 7,9). K frakcím obsahující enzym byl přidán síran amonný (pH 7,0) na konečnou koncentraci 1 mol·l-1 a tento roztok byl centrifugován 15 min při 16500 g. Supernatant tohoto roztoku byl nanesen na hydrofobní kolonu HiTrap Phenyl-HP.
Protein
byl
eluován
obráceným
lineárním
gradientem
0,8 – 0,2 mol·l-1 síranem amonným (pH 7,0). Frakce s enzymem byly zkoncentrovány ultrafiltrací na výsledný objem 1,5 ml, který byl nanesen na kolonu HighLoad 16/60 Superdex 200 prep grade. Protein byl eluován 50 mmol·l-1 Tris/HCl, 0,5 mol·l-1 NaCl pufrem (pH 7,0). Takei K. a kol., 2001 [23] Purifikovaný enzym: adenin isopentenyltransferasa AtIPT1 (EC 2.5.1.8) Expresní vektor: pTrc99A Expresní systém: Escherichia coli (autoři neupřesňují) Resuspendovaný bakteriální pelet byl desintegrován a centrifugován. Proteiny byly precipitovány ze supernatantu 0,0625 % protaminsulfátem a centrifugovány. Supernatant byl zředěn stejným objemem pufru A o složení 1 mol·l-1 trimethylglycin, 20 mmol·l-1 HEPES, 5 mmol·l-1 MgCl2, 1 mmol·l-1 DTT (pH 7,5) a nanesen na iontově výměnnou kolonu Mono S ekvilibrovanou pufrem A. Proteiny byly eluovány lineárním gradientem 0 – 500 mmol·l-1 KCl. Frakce s aktivním enzymem byly naneseny na gelovou kolonu Superdex 200 prep grade ekvilibrovanou pufrem C (1 mol·l-1 trimethylglycin, 20 mmol·l-1 triethanolamin, 100 mmol·l-1 KCl, 10 mmol·l-1 MgCl2, 1 mmol·l-1 DTT (pH 8,0).
24
Sakano Y. a kol., 2004 [24] Purifikovaný enzym: adenin isopentenyltransferasa (EC 2.5.1.27) Expresní vektor: pQE-80L Expresní systém: Escherichia coli M15[pREP4] Purifikace supernatantu z bakteriálního lysatu obsahující enzym opatřený hexahistidinovou kotvou byla provedena za použití afinitní kolony Ni-NTA. Po promytí kolony 50 mmol·l-1 fosforečnanem draselným obsahující 0,3 mol·l-1 NaCl (pH 6,8) byl enzym eluován gradientem 0 – 0,5 mol·l-1 imidazolu v 50 mmol·l-1 fosforečnanu draselném obsahujícím 0,3 mol·l-1 NaCl (pH 6,8). Frakce obsahující enzym byly dialyzovány s 0,1 mol·l-1 fosforečnanem draselným obsahujícím 1 mmol·l-1 DTT. Frébortová J. a kol., 2007 [25] Purifikovaný enzym: Cytokinin dehydrogenasa AtCKX2 (EC 1.5.99.12) Expresní vektor: YIplac211 Expresní systém: Saccharomyces cerevisiae 23344c (MATα ura3) Zkoncentrovaný vzorek proteinu byl nanesen na iontově výměnnou kolonu Mono Q HR 5/5. Kolona byla promyta 2,7 ml 20 mmol·l-1 Tris/HCl pufru (pH 8,5), 2 ml 20 mmol·l-1 Tris/HCl pufru obsahujícího 5 % 1 mol·l-1 NaCl (pH 8,5) a protein byl eluován lineárním gradientem (5 – 25 %) NaCl v Tris/HCl pufru. Koncentrace NaCl byla lineárně zvyšována na 100 % (1 ml). Silně vázané proteiny byly eluovány 3 ml 100 % roztoku NaCl. Frakce s enzymem byly zkoncentrovány a naneseny na gelovou kolonu Superdex 200 HR 10/30 ekvilibrovanou 50 mmol·l-1 Tris/HCl pufrem obsahujícím 0,15 mol·l-1 NaCl (pH 7,5). Frakce s enzymem byly zkoncentrovány pomocí ultrafiltrace do 10 mmol·l-1 pufru fosforečnanu draselného (pH 7,5) a naneseny na iontově výměnnou kolonu Bio-Scale CHT5-I. Kolona byla promyta 8,7 cm3 pufru fosforečnanu draselného (pH 7,5) a protein byl eluován lineárním gradientem 10 mmol·l-1 a 500 mmol·l-1 pufrů fosforečnanu draselného (pH 7,5; objem 25 ml; gradient 0 – 50 %) následovaným krátkým gradientem na 100 % 500 mmol·l-1 pufr fosforečnanu draselného (pH 7,5; 2 ml) a isokratickou elucí 500 mmol·l-1 pufru fosforečnanu draselného (6 ml). Frakce s aktivním enzymem byly získány z isokratické eluce a také během první gradientové eluce. Každá frakce byla samostatně zkoncentrována ultracentrifugací. Frakce z gradientové eluce byla později nanesena na iontově výměnnou kolonu Red Sepharose CL-6B (před purifikací byl pufr pomocí ultracentrifugace vyměněn za 20 mmol·l-1 Tris/HCl, pH 7,5). Enzym byl eluován 20 mmol·l-1 Tris/HCl pufrem a frakce s enzymem byly zkoncentrovány a uchovány při -20 °C. 25
Šmehilová M. a kol., 2009 [26] Purifikovaný enzym: cytokinin dehydrogenasa ZmCKX10 (EC 1.5.99.12) Expresní vektor: pPICZA Expresní systém: Pichia pastoris X-33 Supernatant buněčného lysatu byl zkoncentrován v 0,05 mol·l-1 Tris/Hcl pufru (pH 8,0) a nanesen na hydrofobní kolonu Octyl-Sepharose CL-4B. Enzym byl eluován obráceným gradientem síranu amonného. Frakce s aktivním enzymem byly spojeny a zkoncentrovány. (autoři neuvádí podrobnosti k purifikaci) Kowalska M. a kol., 2010 [27] Purifikovaný enzym: cytokinin dehydrogenasa AtCKX1 (EC 1.5.99.12) Expresní vektor: pGAPZα Expresní systém: Pichia pastoris X-33 Protein AtCKX1 v 50 mmol·l-1 Tris/HCl pufru s 20 % síranem amonným (pH 8,0) byl nanesen na hydrofobní kolonu Octyl Sepharose 4 Fast Flow. Eluce proteinu probíhala lineárním gradientem síranu amonného (20 – 0 %). Zkoncentrované frakce s enzymem byly naneseny na iontově výměnou kolonu Bio-Gel Hydroxyapatite ekvilibrovanou 10 mmol·l-1 pufrem fosforečnanu draselného. Enzym byl eluován lineárním gradientem 10 – 250 mmol·l-1 pufru fosforečnanu draselného (pH 7,6; objem 200 ml) následovaným krátkým lineárním gradientem (250 – 500 mmol·l-1) pufru fosforečnanu draselného (pH 7,6; objem 100 ml) a isokratickou elucí 500 mmol·l-1 pufru fosforečnanu draselného (100 ml). Frakce byly zkoncentrovány a pufr byl vyměněn za 50 mmol·l-1 fosforečnan draselný (pH 7,4) obsahující 0,5 mol·l-1 NaCl pomocí ultracentrifugace. Tento roztok s proteinem značeným hexahistidinovou kotvou byl nanesen na afinitní kolonu Ni Sepharose HP ekvilibrovanou 50 mmol·l-1 pufrem fosforečnanu draselného obsahujícího 0,5 mol·l-1 NaCl (pH 7,4). Eluce proteinu probíhala gradientem imidazolu v koncentraci 10 – 50 mmol·l-1. Frakce s enzymem byly zkoncentrovány, pufr byl vyměněn ultracentrifugací za 50 mmol·l-1 Tris/HCl obsahujícího 20 % síran amonný (pH 8,0) a takto připravený roztok byl nanesen na hydrofobní kolonu HEMA-BIO 1000 Phenyl. Eluce probíhala obráceným gradientem síranu amonného (20 – 0 %).
26
Kopečný D. a kol., 2005 [28]
Purifikovaný enzym: cytokinin oxidasa ZmCKO1 (EC 1.5.99.12) Expresní vektor: pINA1267 Expresní systém: Escherichia coli DH10B Proteiny byly precipitovány 70 % síranem amonným, centrifugovány (10000 g, 2 hod) a pelet byl po důkladném promytí resuspendován v 3,5 ml 20 mmol·l-1 Tris/HCl pufru (pH 8,0). Roztok byl centrifugován (30000 g, 1 hod) a pelet byl resuspendován v 2 ml Tris/HCl pufru. Po další centrifugaci (30000 g, 30 min) byl roztok nanesen na gelovou kolonu Sephacryl S-200 ekvilibrovanou Tris/HCl pufrem. Frakce s aktivním enzymem byly naneseny na aniontově výměnnou kolonu Ressource Q ekvilobrovanou Tris/HCl pufrem. Kolona byla promyta 13,5 min Tris/HCl pufrem a enzym byl eluován při průtoku 2 ml·min-1 lineárním gradientem (0 – 100 %) Tris/HCl pufru obsahujícího 1 mol·l-1 NaCl. Martin R. C. a kol., 1999 [29] Purifikovaný enzym: zeatin O-glykosyltransferasa ZOG1 (EC 2.4.1.203) Expresní vektor: pGem-T Expresní systém: Escherichia coli BL21(DE3)pLysS Supernatant Bakteriálního lysatu byl nanesen na afinitní kolonu Blue Sepharose 6B ekvilibrovanou pufrem A o složení 55 mmol·l-1 Tris/HCl, 0,5 mmol·l-1 EDTA a 5 mmol·l-1 DTT (pH 7,2). Kolona byla promyta 2 objemy pufru A a enzym byl eluován 4 objemy kolony pufru obsahujícím 2,5 mmol·l-1 uridindifosfátglukosu. Frakce s enzymem byly zkoncentrovány a naneseny na aniontově výměnnou kolonu DEAE ekvilibrovanou pufrem A o složení 0,02 mol·l-1 Tris/HCl, 0,5 mol·l-1 EDTA (pH 7,5). Enzym byl eluován lineárním gradientem (0 – 50 %, 20 min) pufru B (0,02 mol·l-1 Tris/HCl, 0,5 mol·l-1 EDTA, 1,0 mol·l-1 NaCl (pH 7,5) rychlostí 1 ml·min-1.
27
5. Experimentální část Přístrojové a softwarové vybavení Äkta FPLC, Frac-950 (Amersham, Ge Health Care) Analytické váhy Mettler Toledo AG 285 (Mettler Toledo) Centrifuga Beckman Coulter Avanti centrifuge J-30I (Beckman Coulter) Centrifuga Eppendorf Cntriguge 5810R (Eppendorf) Denzitometr Bio-Rad GS-800 Calibrated (Bio-Rad Laboratories) Třepačka Eppendorf Thermomixer comgort (Eppendorf) Flowbox Jouan MSC 12 (Thermo elektron corporation) Innova 43 incubator shaker (New Brunswick Scientific) Kývačka Biometra Rocking platform (Biometra) Magnetická míchačka IKA RCT basic (IKA) pH metr Mettler Toledo Seven easy (Mettler Toledo) Předvážky Kern EG620-3NM (Kern) Sada na elektroforézu Bio-Rad powerpac HC (Bio-Rad Laboratories) Spektrofotometr Hélios β ThermoSpectronic (Thermo Spectronic Instruments) Spektrofotometr Tecan Rainbow (Tecan) Ultrazvukový desintegrátor (Bandelin)
Obrázek 10: Přístroj pro FPLC ÄKTA se sběračem frakcí
28
Chemsketch 10.00 Microsoft Office 2003 (MS Word. MS Excel) OriginPro 8 Quantity one 4.6.2 PyMOL (Schrödinger) Unicorn 5.20
Použité chemikálie a pufry 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-O-β-D-glukopyranosid (XGlcp), p.a. (Biosinth AG) Agar (Carl Roth) Ampicilin (Duchefa) Cellobiosa, C12H22O11, p.a. (SERVA) D-glukosa, C6H12O6, p.a. (Penta)
Disodná sůl kyseliny ethylendiamintetraoctové, C10H14N2O8Na2, p.a. (SERVA) Dodecylsíran sodný (SDS), C12H25NaO4S, (SERVA) Ethanol absolutní, C2H5OH, p.a. (Penta) Glycerol bezvodý, C3H8O3, p.a. (Onex) Glycin, C8H9NO3, p.a. (Penta) Hexahydrát chloridu vápenatého, CaCl2·6H2O, p.a. (Penta) Hexahydrát síranu nikelnatého, NiSO4·6H2O, p.a. (Penta) Hexakianoželezitan draselný, K3[Fe(CN)6], p.a. (Carl Roth) Hydrogengosforečnan sodný, Na2HPO4, p.a. (Penta) Hydroxid draselný, KOH, p.a. (Penta) Hydroxid sodný, NaOH, p.a. (Penta) Chloramfenikol (Duchefa) Chlorid draselný, KCl, p.a. (Penta) Chlorid hořečnatý, MgCl2, p.a. (Penta) Chlorid sodný, NaCl, p.a. (Penta) Imidazol, C3H4N2, p.a. (Carl Roth) Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid, IPTG (Duchefa) Kyselina citrónová, C6H8O7, p.a. (Penta) Kyselina chlorovodíková, HCl, p.a. (Penta) Luria Bentani (Duchefa)
29
N,N,N',N'-tetramethyl-1,2-diaminomethan (TEMED), C6H16N2, p.a. (SERVA) N,N´-dimethylformamid, C3H7NO, p.a. (Fluka) Peroxodisíran amonný (APS), (NH4)2S2O8, p.a. (Sigma, Sigma-Alrdich) p-nitrofenol, C6H5NO3, p.a. (SERVA) p-nitrofenyl-β-D-glukopyranosid (pNPG), (Sigma, Sigma-AlrdichSERVA) Precision Plus Protein Standards (Bio-Rad) Protein Assay (Bio-Rad) Rotiphorese 30, p.a. (Carl Roth) Trihydrát hexakianoželeznatanu draselného, K4[Fe(CN)6]·3H2O, p.a. (Carl Roth) Tris, C4H11NO3, p.a. (SERVA) Triton X-114 (Sigma, Sigma-Alrdich) Trypton p.a. (Duchefa) Uhličitan sodný, Na2CO3, p.a. (Penta) Bakterie Escherichia coli BL21(DE3)pLysS-T1R (Sigma, Sigma-Aldrich) Genotyp: F- ompT hsdSB(rB- mB-) gal dcm λ(DE3) tonA pLysS (CmR) Plasmid: pRSET A (Invitrogen) KCM (5x koncentrovaný) Látka
[ml]
koncentrace po naředění
KCl (2 mol·l )
5
0,5 mol·l-1
CaCl2 (0,3 mol·l-1)
10
0,15 mol·l-1
MgCl2 (2 mol·l-1)
2,5
0,25 mol·l-1
ddH2O
2,5
-1
Obohacené LB médium (450 ml) Látka
[ml]
složení po naředění
LB médium
397,6
Ampicilin (50 mg·ml-1)
0,9
0,1 mg·ml-1
Chloramfenikol (34 mg·ml-1)
0,45
0,034 mg·ml-1
D-glukosa (40 % m/m)
1,125
0,1 % m/m
Cellobiosa (10 % m/m)
4,5
0,1 % m/m
Fosfátový pufr (0,5 mol·l-1; pH 7)
45
0,05 mol·l-1
30
Zaostřovací (stacking) pufr (100 ml, 4× konc., 0,50 mol·l-1, pH 6,8) Tris
6g
pH se upravuje koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou Rozdělovací (resolving) pufr (100 ml, 4× konc., 0,50 mol·l-1, pH 8,8) Tris
18,15 g
pH se upravuje koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou Elektroforetický (running) pufr (1000 ml, 10× konc.) Látka
[g]
koncentrace po naředění
Glycin
144,2
192 mmol·l-1
Tris
30,3
25 mmol·l-1
SDS (jen SDS pufr) 10 Vše rozpustit a doplnit ddH2O na výsledný objem 1000 ml pH se neupravuje Vzorkový pufr pro SDS elektroforézu (loading buffer) (5× konc.) Látka
[ml]
složení po naředění
ddH2O
3,0
Tris·HCl (0,5 mol·l-1, pH 6,8)
1,0
59,5 mmol·l-1
Glycerol (100 %)
1,6
19 % m/m
SDS (10 % m/m v ddH2O)
1,6
1,9 % m/m
β-merkaptoethanol
0,6
5 % m/m
Bromfenolová modř (0,5 % m/m v ddH2O)
0,6
0,04 % m/m
Vzorkový pufr pro nativní elektroforézu (loading buffer) (5× konc.) Látka
množství
složení po naředění
ddH2O
4,0 ml
Tris·HCl (0,5 mol·l-1, pH 6,8)
2,5 ml
125 mmol·l-1
Glycerol (100 %)
3,5 ml
35 % m/m
Bromfenolová modř
4,0 mg
0,6 mmol·l-1
31
Rozdělovací (resolving) SDS-PAGE gel 10 % Látka
[μl]
ddH2O
2400
Rozdělovací pufr (4× konc.)
1500
Rothiphorese 30
2000
SDS (10 % m/m)
60
APS (10 % m/m)
60
TEMED
3
Zaostřovací (stacking) SDS-PAGE gel Látka
[μl]
ddH2O
1000
Zaostřovací pufr (4× konc.)
500
Rothiphorese 30
270
SDS (10 % m/m)
20
APS (10 % m/m)
30
TEMED
1
Rozdělovací (resolving) nativní gel 10 % Látka
[μl]
ddH2O
2460
Rozdělovací pufr (4× konc.)
1500
Rothiphorese 30
2000
APS (10 % m/m)
60
TEMED
3
Zaostřovací (stacking) nativní gel Látka
[μl]
ddH2O
1020
Zaostřovací pufr (4× konc.)
500
Rothiphorese 30
270
APS (10 % m/m)
30
TEMED
1
32
Barvící roztok XGlcp pro zymogram Látka
množství
Citrát-fosfátový pufr
50 ml
XGlcp
12 mg
N,N´-dimethylformamid
400 μl
K4[Fe(CN)6] (0,5 mol·l-1)
50 μl
K3[Fe(CN)6] (0,5 mol·l-1)
50 μl
Do citrát-fosfátového pufru je třeba přidat roztoky K4[Fe(CN)6], K3[Fe(CN)6] a XGlcp rozpuštěný v N,N´-dithylformamidu S pufr Látka
koncentrace
Tris
20 mmol·l-1
NaCl
1 mol·l-1
Triton X-114
1%
SOC medium Látka
koncentrace
Trypton
0,5 % m/m
NaCl
8,6 mmol·l-1
KCl
2,5 mmol·l-1
MgSO4
20 mmol·l-1
D-glukosa
20 mmol·l-1
Citrát-fosfátový pufr Látka
koncentrace
Na2HPO4·2H2O
50 mmol·l-1
Kyselina citrónová
100 mmol·l-1 (přidává se k roztoku hydrogenfosforečnanu sodného do pH 5,5 a doplní se ddH2O do 1000 ml)
33
Pufry pro purifikaci na afinitní koloně HisTrap Ekvilibrační pufr Ni2+: 50 mmol·l-1 NiSO4·6H2O A1: 20 mmol·l-1 Tris, 1 mol·l-1 NaCl (pH 7,9) A2: 20 mmol·l-1 Tris, 1 mol·l-1 NaCl, 100 mmol·l-1 EDTA (pH 7,9) B: 20 mmol·l-1 Tris, 1 mol·l-1 NaCl, 50 mmol·l-1 imidazol (pH 7,9) Pufr pro gelovou filtraci na koloně Superdex 200 50 mmol·l-1 Tris, 1 mol·l-1 NaCl (pH 7,0)
Transformace bakterií Každý z konstruktů mutant SB1 a SB2 β-glukosidasy Zm-p60.1 byl sterilně transformován do E. coli BL21(DE3)pLysS-T1R. Do mikrozkumavky typu Eppendorf bylo napipetováno 20 μl KCM (5x koncentrovaný) a přidáno 80 μl roztoku obsahujícího konstrukt pRSET A::Zm.p60.r (1 μl konstruktu v 79 μl ddH2O). K roztoku bylo přidáno 100 μl na ledu rozmražených kompetentních buněk a mirkozkumavka byla dána na 20 minut do ledu. Po této době byl proveden teplotní šok (30 s, 42 °C) následovaný pětiminutovou temperancí na ledu. K tomuto roztoku bylo přidáno 1 ml SOC média a výsledná směs byla následně inkubována při teplotě 37 °C a 550 rpm po dobu 1 hodiny. Výsev byl proveden v množstvích 50 a 150 μl na Petriho misky obsahující LB médium s ampicilinem (100 mg·ml-1) a XGlcp (40 µg·ml-1). Bakterie byly inkubovány přes noc při 37 °C.
Mikroexpresní analýza Ze zatransformovaných buněk na Petriho miskách bylo vybráno 8 kolonií lišící se intenzitou modrozeleného zbarvení. Pro vytvoření nočních kultur bylo napipetováno do sterilních zkumavek 5 ml obohaceného LB média a sterilní špičkou, nebo párátkem byl přenesen střed kolonie do zkumavky s médiem. Zkumavky byly třepány při teplotě 37 °C a 300 rpm přes noc. Z každé noční kultury bylo do mikrozkumavky odebráno 1,3 ml bakteriální suspenze, která byla následně centrifugována při 4 °C a 6000 g po dobu 10 minut. Supernatant byl odlit a pelet jemně resuspendován ve 100 μl sterilního glycerolu (10 % m/m). Tyto roztoky byly šokově zamraženy v tekutém dusíku a uchovávány při -80 °C. Do každé Erlenmayerovy baňky (250 ml) bylo převedeno 50 ml obohaceného LB média a následné 1 ml noční kultury. Následná kultivace probíhala při 37 °C a 200 rpm 3,5 hodiny do
34
doby než zákal roztoku měřený při vlnové délce 600 nm dosahoval absorbance v rozmezí 0,45 – 0,65 proti blanku (obohacené LB médium). Exprese rekombinantního proteinu byla zahájena přídavkem 5 μl IPTG a roztoky s bakteriemi byly dále kultivovány při 22,5 °C a 200 rpm po dobu 3 hodin. Bakterie byly centrifugovány při 4 °C a 6000 rpm po 10 minut, supernatant byl odlit, pelet resuspendován v 2,5 ml S pufru zamražen na -20 °C. Zkumavky s resuspendovanými buňkami byly další den rozmraženy na ledu a následně čtyřikrát desintegrovány 20 sekund. Centrifugací při 4 °C a 30000 g po dobu 30 minut byl oddělen supernatant od peletu. Supernatant s rekombinantním proteinem byl převeden do mikrozkumavky a umístěna na led. Koncentrace proteinů v roztocích byla zjištěna fotometricky dle Bradfordové. Míra exprese mutant SB1 a SB2 β-glukosidasy Zm-p60.1 byla zjištěna denzitometrickou analysou SDS gelu, NATIV gelu a zymogramu obsahující vzorky lysatů.
Příprava bakteriálních lysatů Do dvou Erlenmaerových baněk (3000 ml) bylo nalito 1000 ml obohaceného LB média a přidáno 0,5 ml bakteriální konzervy. Následná kultivace při 37 °C a 200 rpm probíhala do doby než zákal roztoku měřený při vlnové délce 600 nm dosahoval absorbance v rozmezí 0,45 – 0,65 proti blanku (obohacené LB médium). Exprese rekombinantního proteinu byla zahájena přídavkem 100 μl sterilního IPTG (1 mol·l-1). Další kultivace probíhala 3 hod při 22,5 °C a 200 rpm. Kultury byly centrifugovány 10 min při 6000 rpm a pelet byl resuspendován v 100 ml S pufru. Takto připravený roztok byl skladován při -20 °C.
Purifikace rekombinantních proteinů Kultury v příslušném pufru byly desintegrovány v čtyřech cyklech po dobu 1 min při 50 % výkonu desintegrátoru. Roztok byl centrifugován 30 min při 30000 g a supernatant byl filtrován přes filtr Minisart 0,20 μm. Prvním krokem purifikace byla afinitní chromatografie. Kolona HisTrap HP (5 ml) byla ekvilibrována 25 ml roztoku 50 mmol·l-1 NiSO4 a následně promyta 25 ml ddH2O. Následná ekvilibrace kolony byla provedena 25 ml směsí roztoků A1 a B s výslednou koncentrací imidazolu 20 mmol·l-1. Filtrovaný roztok s rekombinantním proteinem byl na kolonu nanesen rychlostí 3 ml·min-1. Po nanesení vzorku byla kolona promyta 5 ml směsi pufru A1 a B
35
obsahující 20 mmol·l-1 imidazol a 15 ml směsi pufru A1 a B při použití lineárního gradientu imidazol 20 – 50 mmol·l-1. Eluce proteinu probíhala 30 ml pufru A2. Frakce obsahující rekombinantní protein byly spojeny a zkoncentrovány ultracentrifugací přes Amicon ultra 30 k MWCO (Millipore) a naneseny na gelovou kolonu HiLoad 16/60 Superdex 200 prep grade ekvilibrovanou pufrem o složení 50 mmol·l-1 Tris, 1 mol·l-1 NaCl (pH 7,0). Eluce probíhala přes noc stejným pufrem rychlostí 1 ml·min-1. Druhý den byly frakce s dimerní složkou enzymu zkoncentrovány ultracentrifugací přes Amicon ultra 10 k MWCO (Millipore), byla zjištěna koncentrace rekombinantního proteinu a provedena SDS-PAGE, Nativ-PAGE a zymogram.
Gelová elektroforéza za denaturujících podmínek – SDS-PAGE Ke 20 μl vzorku bylo přidáno 5 μl vzorkového pufru (5× koncentrovaný). Takto připravený vzorek byl vystaven teplotě 95 °C po dobu 10 min. V případě vzorků z mikroexpresní analýzy bylo nanášeno do každé jamky 15 μg proteinů, v případě nově purifikovaných mutant enzymu Zm-p60.1 byly nanášeny 2 μg. Pro ověření pozice β-glukosidasy bylo na gel naneseno 2 μg purifikovaného enzymu Zm-p60.1-wild-type a 5 μl markeru. Elektroforéza probíhala 1:20 hod při napětí 140 V.
Gelová elektroforéza za nedenaturujících podmínek – NATIV-PAGE Ke 20 μl vzorku bylo přidáno 6,66 μl vzorkového pufru (4× koncentrovaný). V případě vzorků z mikroexpresní analýzy bylo nanášeno do každé jamky 15 μg proteinů, v případě purifikovaných mutant enzymu Zm-p60.1 byly nanášeny 2 μg. Pro ověření pozice dimeru β-glukosidasy bylo na gel naneseno 2 μg purifikovaného enzymu Zm-p60.1-wild-type, pro ověření pozice monomeru 2 μg enzymu Zm-p60.1-E401D. Elektroforéza probíhala 1:20 hod při napětí 140 V Aktivitní barvení – ZYMOGRAM Aktivitní barvení spočívá v reakci aktivního enzymu separovaného na polyakrylamidovém gelu za nedenaturujících podmínek se substrátem 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-O-β-Dglukopyranosidem (XGlcp). V redestilované vodě promytý gel se převrství 50 ml roztoku citrát-fosfátového pufru (50 mmol·l-1; pH 5,5) o teplotě asi 40 °C. Gel byl inkubován při teplotě 37 °C po dobu 20 min. Gel byl následně převrstven 50 ml barvícího roztoku o teplotě 37 °C a dále inkubován 36
při teplotě 37 °C. Po ukončení barvení byl barvící roztok slit a gel byl několikrát promýván ddH2O.
Stanovení koncentrace proteinů (dle Bradfordové) Příprava detekčního činidla probíhala dle manuálu. Příprava zásobních a kalibračních roztoků BSA: Kalibrační roztoky byly připraveny ze zásobního roztoku BSA (0,2 mg·ml-1) vhodným ředěním na koncentrace 0,01 – 0,06 mg·ml-1. Kalibrační roztoky lze uchovávat při -20 °C a znovu po důkladném promíchání použít. Standardizace detekčního činidla metodou kalibrační křivky: Do plastové kyvety bylo pipetováno 1000 μl detekčního činidla a následně 100 μl kalibračního roztoku (jako blank byla použita redestilovaná voda). Absorbance roztoku při vlnové délce 595 nm byla měřena po 5 min od smíchání obou komponent. Všechna měření byla provedena nejméně třikrát. Z naměřených hodnot byla sestrojena kalibrační přímka. Ze směrnice přímky byla vypočtena koncentrace vzorku proteinu. Stanovení koncentrace proteinů: K 1000 μl detekčního činidla bylo přidáno 100 μl vzorku proteinu. Po 5 minutách byla při vlnové délce 595 nm zjištěna absorbance roztoku. Vzorky proteinů bylo nutné naředit tak, aby absorbance po 5 minutách reakce byla nejlépe uprostřed kalibrační závislosti. Absorbance byla měřena v šesti opakováních. Koncentrace proteinů byla vypočtena podle kalibrační křivky dle vztahu:
c prot =
A ⋅ Fzř k
Kde: cprot je hledaná koncentrace proteinů ve vzorku A je absorbance vzorku při vlnové délce 595 nm Fzř je faktor zředění (kolikrát byl ředěn původní vzorek proteinu) k je směrnice kalibrační křivky
37
Enzymová kinetika Bylo připraveno 100 ml 0,2 mol·l-1 Na2CO3. Kalibrační koncentrace p-nitrofenolu v 50 mmol·l-1 citrát-fosfátovém pufru (pH 5,5): 0,05; 0,10; 0,15; 0,20; 0,25; 0,30; 0,35; 0,40 mmol·l-1 Kalibrační roztok: 120 μl roztoku Na2CO3 + 80 μl kalibračního roztoku p-nitrofenolu Blank: 120 μl roztoku Na2CO3 + 80 μl citrát-fosfátového pufru Enzymová kinetika probíhala na umělém substrátu pNPG (při teplotě 30 °C) v koncentracích 0,25; 0,50; 1,0; 1,25; 1,5; 3,0; 10,0; 20,0 a 40,0 mmol·l-1. Po smíchání enzymu s roztokem substrátu bylo v pravidelných časových intervalech odebráno 80 μl reakční směsi, která byla napipetována do 120 μl roztoku Na2CO3. Následně byla měřena absorbance roztoku při 405 nm na fotometru Tecan Rainbow. Každé stanovení bylo provedeno minimálně ve třech opakování a z naměřených absorbancí byly dle kalibrační přímky odvozeny počáteční rychlosti reakce, ze kterých byly vypočteny kinetické parametry Km a kcat daného enzymu.
38
Výsledky a diskuse Mikroexpresní analýza Mikroexpresní analýza byla provedena za účelem výběru vhodné kolonie, která byla schopna exprimovat rekombinantní protein ve velkém množství při zachování jeho enzymové aktivity. Každá kolonie se vyznačuje jinou mírou exprese rekombinantních proteinů. Transformační směsi byly vysety na Petriho misky s LB mediem, ampicilinem a XGlcp. XGlcp byl hydrolyzován rekombinantní β-glukosidasou za vzniku modrého indiga, které indikuje přítomnost enzymu v aktivní formě. Z Petriho misek bylo vybráno u každé mutanty 8 různě intenzivně zeleně zbarvených kolonií, které byly následně podrobeny mikroexpresní analyse. U jedné kolonie mutanty SB2 nebyla provedena mikroexprese z důvodu malého růstu buněk při kultivaci. Byla provedena denzitometrická analýza SDS-PAGE gelů, kde bylo zjištěno celkové množství exprimované β-glukosidasy v rozpustné formě. Důležitějším faktorem pro výběr vhodné kolonie pro expresi proteinu je jeho aktivita, která byla porovnávána denzitometrickou analýzou zymogramů. K přípravě expresního „štoku“ byla vybrána kolonie, která vykazovala co nejvyšší enzymovou aktivitu proteinu a zároveň jej produkovala ve vysokém množství. Na základě těchto kritérií byla vybrána kolonie 2 v případě mutanty SB1 a kolonie 3 v případě SB2.
39
SB1
SB2
a)
b)
c)
Obrázek 11: SB1 a) SDS-PAGE: : 1 – 8: proteiny z jednotlivých nočních kultur; 9: marker molární hmotností proteinů; 10: WT (marker dimeru) b) nativ-PAGE: 1 – 8: proteiny z jednotlivých nočních kultur; 10: WT (marker dimeru) (při přípravě gelu došlo k poškození skla) c) zymogram: 1 – 8: proteiny z jednotlivých nočních kultur; 10: WT (marker dimeru) (barveno 4 min 10 s)
SB2 a) SDS-PAGE: : 1 – 7: proteiny z jednotlivých nočních kultur; 9: WT (marker dimeru); 10: marker molární hmotností proteinů b) nativ-PAGE: 1 – 7: proteiny z jednotlivých nočních kultur; 9: WT (marker dimeru) c) zymogram: 1 – 7: proteiny z jednotlivých nočních kultur; 9: WT (marker dimeru) (barveno 4 min)
Purifikace mutanty SB1 a SB2 Prvním krokem purifikace byla afinitní chromatografie na koloně HisTrap HP (5 ml). Celkový objem roztoku proteinů nanášený na kolonu byl 100 ml v případě mutanty SB1 a
40
111 ml u mutanty SB2. Frakce obsahující aktivní enzym (testováno na 40 mmol·l-1 pNPG) byly spojeny a zkoncentrovány přes Amicon ultra 10 k MWCO (Millipore) na 1,3 ml (SB2). V případě mutanty SB1 enzym začal při zkoncentrování na 3 ml precipitovat, a proto byl centrifugován 10 min při 30000 g a supernatant byl následně opět zkoncentrován na 1,5 ml. Druhým krokem purifikace byla gelová filtrace, kdy byly zkoncentrované roztoky naneseny na gelovou kolonu HiLoad 16/60 Superdex 200 prep grade. Frakce obsahující dimerní složku enzymu byly spojeny a zkoncentrovány přes Amicon ultra 30 k MWCO (Millipore) na výsledný objem 400 μl u obou mutant. Koncentrace enzymů byla určena dle Bradfordové na 6,8325 mg·ml-1 (SB1) a 2,2048 mg·ml-1 (SB2). Z denzitometrické analýzy bylo zjištěno, že purifikované proteiny byly získány ve vysoké čistotě (> 95 %). D
mAU
73.14
mAU
113.56
150 500
400
300
100 200 73.14
-1.52
100
48.37
58.07
84.31 96.09
0
50
0
50
155.74
100
176.27
150
ml
84.31
M 0 1D8
1D9
1D10
1D11
1D12
70.0
1E1
1E2
1E3
1E4
75.0
1E5
1E6
1E7
1E8
80.0
1E9
1E10
1E11
85.0
90.0
1E12 ml
Obrázek 12: Purifikace mutanty SB1 β-glukosidasy Zm-p60.1 – gelová filtrace: D – dimer, M – monomer (chromatogram FPLC, výstup z programu Unicorn 5.20)
mAU
mAU
112.78
600
D
500
100 400
73.27 300
80
200
60
100
73.27
48.55 0
-1.17
84.50
58.07
96.04
6.32
0
50
155.69
100
178.59
150
ml
40
M 84.50
20
0
1D8
1D9
1D10 70.0
1D11
1D12
1E1 75.0
1E2
1E3
1E4
1E5 80.0
1E6
1E7
1E8 85.0
1E9
1E10
1E11 90.0
1E12 1F ml
Obrázek 13: Purifikace mutanty SB2 β-glukosidasy Zm-p60.1 – gelová filtrace: D – dimer, M – monomer (chromatogram FPLC, výstup z programu Unicorn 5.20)
41
mAU
600
500
400
300
D 200
M 100
0 0
50
100
150
ml
Obrázek 14: Přeložení elučních křivek z gelové filtrace mutant SB1 SB2, E401D β-glukosidasy Zm-p60.1 a β-glukosidasy Zm-p60.1-wild-type. D – dimer, M – monomer (chromatogram FPLC, výstup z programu Unicorn 5.20)
Určení molekulové hmotnosti dimeru a monomeru z gelové filtrace Z retenčního objemu proteinu separovaného gelovou filtrací lze přibližně určit jeho molekulovou hmotnost, pokud byly určeny retenční charakteristiky kalibračních proteinů o známých molekulových hmotnostech a stanoven mrtvý objem kolony. Ke kalibraci kolony byly použity standardy: ferritin (440 kDa), aldolasa (158 kDa), hovězí sérový albumin (67 kDa) a ovalbumin (43 kDa). Pro určení mrtvého retenčního objemu byl použit Blue dextran. Molekulová hmotnost WT (divoký typ β-glukosidasy Zm-p60.1) byla určena na 107 kDa u dimeru a 41 kDa u monomeru. Molekulová hmotnost mutanty E401D byla určena na 114 kDa u dimeru a 42 kDa u monomeru [17]. Molekulová hmotnost dimeru mutanty SB1 byla určena na 109,5 kDa a monomeru na 40,7 kDa, u mutanty SB2 byla hmotnost dimeru určena na 108,3 kDa a monomeru na 40,1 kDa. Hodnoty vypočtené z primární struktury enzymu jsou 118,5 kDa pro dimer a 59,2 kDa pro monomer. Zjištěné hodnoty se od teoretických liší u dimeru o 8 – 9 % a u monomeru o 31 – 32 %. Tyto rozdíly mohou být zapříčiněny zdánlivou změnou molekulové velikosti způsobenou různou solvatací proteinu v roztoku.
42
Zastoupení monomerní a dimerní konformace mutant SB1 a SB2 β-glukosidasy Zm-p60.1 po gelové filtraci Enzymaticky aktivní Zm-p60.1 se vyskytuje v dimerní konformaci a jakékoli dosud provedené mutace zapříčinily nižší stabilitu jeho kvarterní struktury a tím částečný nebo úplný rozpad enzymu na monomerní jednotky, což je doprovázeno ztrátou aktivity [16,18]. Z plochy píků chromatogramu z gelové filtrace byl spočítán poměr dimeru ku monomeru. U mutanty SB1 je dimeru 4,86 krát více než monomeru, kdežto u mutanty SB2 je dimeru jen 3,18 krát více než monomeru. U WT je dimeru 9,20 krát více než monomeru, což pravděpodobně potvrzuje vyšší stabilitu dimeru u WT, než u obou purifikovaných mutant. Mutanta E401D je naopak téměř čistý monomer a dá se soudit, že touto mutací dochází k destabilizaci kvarterního uspořádání. Vliv na poměr obou forem enzymu mohou mít také použité pufry, pH, iontová síla atd. Při uchovávání enzymu ve zředěných roztocích může docházet k jeho monomerizaci, naopak v koncentrovaných roztocích enzymu je tento rozpad velmi omezen [Filipi T., Osobní sdělení].
Denzitometrická analýza dimerního konformeru mutant SB1 a SB2 β-glukosidasy Zm-p60.1 Bylo zjištěno, že dimerní frakce enzymu může po určité době obsahovat i čistě monomerní konformery. Proto byla provedena denzitometrická analýza dimerních konformerů mutant SB1 a SB2. V původně čistě dimerní frakci byla detekována i monomerní konformace enzymu. U mutanty SB1 činil obsah monomeru po purifikaci 3 % a den poté (v době měření enzymové kinetiky) 4 %. U mutanty SB2 se obsah monomeru změnil z 4 % na 2 %. Tyto efekty mohou poukazovat na určitou dynamickou rovnováhu mezi oběma konformacemi. Domnívám se, že každá mutace má za následek posunutí této rovnováhy. V případě WT je rovnováha posunuta maximálně směrem k dimeru, kdežto v případě E401D k monomeru.
43
SB1
SB2
a)
b)
c)
d)
Obrázek 15: SB1 a) SDS-PAGE: : 2 – 5: purifikovaný enzym SB1; 7: E401D (marker monomeru); 9: WT (marker dimeru); 10: marker molární hmotností proteinů b) nativ-PAGE hned po purifikaci: 2 – 5: purifikovaný enzym SB1; 7: E401D (marker monomeru); 9: WT (marker dimeru) c) nativ-PAGE v den enzymové kinetiky: 2 – 5: purifikovaný enzym SB1; 7: E401D (marker monomeru); 9: WT (marker dimeru) d) zymogram: 2 – 5: purifikovaný enzym SB1; 7: E401D (marker monomeru); 9: WT (marker dimeru) (barveno 3 min 40 s)
SB2 a) SDS-PAGE: : 2 – 5: purifikovaný enzym SB2; 7: E401D (marker monomeru); 9: WT; 10: marker molární hmotností proteinů b) nativ-PAGE hned po purifikaci: 2 – 5: purifikovaný enzym SB2; 7: E401D (marker monomeru); 9: WT (marker dimeru) c) nativ-PAGE v den enzymové kinetiky: 2 – 5: purifikovaný enzym SB2; 7: E401D (marker monomeru); 9: WT (marker dimeru) d) zymogram: 2 – 5: purifikovaný enzym SB2; 7: E401D (marker monomeru); 9: WT (marker dimeru) (barveno 4 min)
44
Enzymová kinetika mutant SB1 a SB2 Určení kinetických parametrů obou mutant bylo provedeno na umělém substrátu pNPG při 30 °C den po purifikaci. Substrát je používán pro měření kinetických parametrů in vitro a po enzymové reakci poskytuje barevný produkt p-nitrofenol. Pro vyhodnocení byla použita kinetická rovnice Michaelis-Mentenové. Rovnice závislosti: y =
k cat ⋅ x Km + x
Z naměřených dat vyplývá, že obě mutanty sice vykazují nižší rychlost hydrolysy umělého substrátu pNPG než WT, avšak mají k němu vyšší afinitu. Zatímco mutanta SB1 vykazuje 3,3 krát menší kcat než WT, rychlost mutanty SB2 byla snížena jen 2,2 krát. Afinita obou mutant vůči substrátu byla téměř shodná a oproti WT vzrostla asi 1,4 krát. Z porovnání hydrolytických eficiencí vyplývá, že mutanta SB2 hydrolyzuje pNPG asi o 30 % efektivněji, než mutanta SB1 a dosahuje 60 % hydrolytické eficience WT.
14
12
-1
[s ]
v0/[E]
10
8
6
4 0
10
20
30
40
cpNpG -1
[mmol·l ] Obrázek 16: Závislost počáteční rychlosti reakce mutanty SB1 β-glukosidasy Zm-p60.1 na koncentraci substrátu pNPG (Výstup programu Origin Pro 8.0 dle kinetické rovnice Michaelis-Mentenové)
45
20 18 16
12 -1
[s ]
v0/[E]
14
10 8 6 4 0
10
20
30
cpNpG
40
-1
[mmol·l ]
Obrázek 17: Závislost počáteční rychlosti reakce mutanty SB2 β-glukosidasy Zm-p60.1 na koncentraci substrátu pNPG (Výstup programu Origin Pro 8.0 dle kinetické rovnice Michaelis-Mentenové)
Enzym
kcat
Km -1
WT SB1 SB2
(mmol·l ) 0,68 ± 0,03 0,48 ± 0,02 0,50 ± 0,02
kcat/Km
Relativní eficience
62,94 26,96 38,24
100,00 42,83 60,76
-1
(s ) 42,8 ± 0,1 12,9 ± 0,1 19,1 ± 0,2
Tabulka 1: Kinetické parametry mutant SB1, SB1 β-glukosidasy Zm-p60.1 a β-glukosidasy Zm-p60.1-wildtype získané z kinetické analýzy hydrolýzy substrátu pNPG Relativní eficience: (kcat/Km)mutant/(kcat/Km)WT × 100 (Výstup programu Origin Pro 8.0)
46
Obrázek 18: Srovnání závislostí mezi reakční rychlostí a koncentrací substrátu mutant SB1, SB2 β-glukosidasy Zm-p60.1 a β-glukosidasy Zm-p60.1-wild-type dle Michaelis-Mentenové
0,80
SB1 SB2 WT
0,75 0,70
Km
-1
[mmol·l ]
0,65 0,60 0,55 0,50 0,45 0,40 10
15
20
25
30
kcat
35
40
45
-1
[s ]
Obrázek 19: grafické znázornění kinetických parametrů mutant SB1, SB2 β-glukosidasy Zm-p60.1 a β-glukosidasy Zm-p60.1-wild-type získané z kinetické analýzy hydrolýzy substrátu pNPG (Výstup programu Origin Pro 8.0)
47
Závěr Tato bakalářská práce řeší problematiku produkce, isolace a charakterizace mutant SB1 a SB2 kukuřičné β-glukosidasy Zm-p60.1. Teoretická část práce je věnována literární rešerši purifikace rekombinantních proteinů zapojených do cytokininového metabolismu rostlin obsahující 14 článků. Nejčastěji používanou technikou pro purifikaci rekombinantních proteinů cytokininového metabolismu rostlin byla kombinace afinitní chromatografie s gelovou filtrací, iontově výměnnou chromatografií nebo chromatografií s hydrofobními interakcemi. Chromatofokusace byla využita pouze ve dvou případech. Nejpoužívanějším expresním systémem byly bakterie Escherichia coli. Ve dvou případech byly použity kvasinky Pichia pastoris a v jednom případě Saccharomyces cerevisiae. Praktická část práce je zaměřena na produkci, purifikaci a enzymovou kinetiku mutant SB1 a SB2 kukuřičné β-glukosidasy Zm-p60.1. Exprese proteinů probíhala v bakteriích Escherichia coli BL21(DE3)pLysS-T1R. Částečná purifikace byla realizována afinitní chromatografií za použití kolony HisTrap HP (5 ml). Vysoké homogenity proteinů (> 95 %) bylo docíleno purifikací gelovou filtrací na koloně HiLoad 16/60 Superdex 200 prep grade. Kinetické parametry obou mutant byly získány hydrolýzou umělého substrátu p-nitrofenyl-βD-glukopyranosidu: u mutanty SB1 byly zjištěny hodnoty Km = 0,48 ± 0,02 mmol·l
-1
a kcat =
12,9 ± 0,1 s-1; u mutanty SB2 byly hodnoty zjištěny vyšší, a to Km = 0,50 ± 0,02 mmol·l-1 a kcat = 19,1 ± 0,2 s-1. Obě mutace mají sice nižší rychlost hydrolýzy substrátu než WT, ale vyšší afinitu k tomutu substrátu. Hydrolytická eficience mutanty SB2 je asi o 30 % vyšší než u mutanty SB1 a představuje 60 % hydrolytické eficience WT. U mutantů SB1 a SB2 nebyl zaznamenán téměř žádný rozpad dimeru na monomerní jednotky enzymu. Lze proto očekávat, že zavedené mutace nemají výraznější vliv na stabilitu kvarterní struktury enzymu.
48
Seznam použitých zkratek APS
peroxodisíran amonný
BSA
hovězí sérový albumin
BY-2
Bright Yellow-2
ddH2O
redestilovaná voda
DIMBOAG
2,4-dihydroxy-7-metoxy-1,4-benzoxazin-3-on glykopyranosid
DTT
1,4-dithiothreitol
E401D
neaktivní mutant β-glukosidasy používaný jako standard monomeru
GST
glutathion-S-transferasa
HEPES
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonová kyselina
IMAC
metalochelatační afinitní chromatografie
In vitro
mimo živý orzanismus
In vivo
v živém orzanismu
IPTG
isopropyl-β-D-thiogalaktopyranosid
K3G
kinetin-N3-glukopyranosid
LB medium
Luria-Bentani médium (růstové živné médium)
MBP
maltose-binding protein
MUG
4-metylumberliferyl-β-D-glukopyranosid
NATIV-PAGE
elektroforéza v polyakrylamidovém gelu za nedenaturujících podmínek
NUSA
transcription termination anti-termination factor
pI
izoelektrický bod
pNPG
p-nitrofenyl-β-D-glukopyranosid
S pufr
pufr používaný pro desintergaci buňek
SDS-PAGE
elektroforéza v polyakrylamidovém gelu v přítomnosti dodecylsíranu sodného
TEMED
N,N,N',N'-tetramethyl-1,2-diaminomethan
Tris
tris(hydroxymethyl)aminomethan
Triton X-100
polyethylenglycol(p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)phenyl)ether
TRXA
thioredoxin
UDPG
uridindifosfátglukosa
WT
divoký typ β-glukosidasy
XGlcp
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-O-β-D-glukopyranosid
ZOG
trans-zeatin-O-glukopyranosid
49
Seznam použité literatury [1] Watson J. D., Tooze J., Kurtz D. T. (1988): Rekombinantní DNA, Krátký kurz. Academica Praha, 296 s. [2] Brown T. A. (2007): Klonování genů a analýza DNA: úvod. Olomouc: UP, 389 s. [3] Weigl E., Raška M., Šíma P., Turánek J., Frömmer J., Kafková L. (2010): Škola molekulárních biotechnologií (Studijní texty k teoretickým modulům). Tribun EU s. r. o., 154 s. [4] Klouda P. (2003): Moderní analytické metody. Olomouc: Nakladatelství Pavel Klouda, 132 s. [5] Lichty J. J., Malecky J. L., Agnew H. D., Michaelson-Horowitz D. J. (2005): Comparison of affInity tags for protein purifIcation. Protein Expression and Purification 41, 98 – 105 [6] Ge Healhtcare (2010): Life Sciences Handbook Collection [7] Mikeš O., Hejtmánek M., Komers R., Krejčí M., Meloun B., Motl O., Novák J., Novotný L., Procházka Ž., Prusík Z., Šebesta K., Štamberg J., Tomášek V., Turková J. (1980): Laboratorní chromatografické metody. Praha: Nakladatelství technické literatury, 676 s. [8] Bartušková I., Ryšavý P. (2006): Bulletin 2006. Ústřední kontrolní a zkušební ústav zemědělský, 63 s. [9] Pazourek J. (2003): Moderní elektroforetické analytické metody (přednášky pro magisterské studium). 88 s. (staženo z http://faf.vfu.cz/export/sites/faf/strukturafakulty/sekce_ustavy/ustav_chemickych_leciv/vyuka/analyticka-chemie/elforeza.pdf 20. 5. 2011)
50
[10] Miller C. O., Skoog F., Okamura F. S. Von Saltza M. H., Strong F. M. (1956): Isolation, structure and synthesis of kinetin, a substance promoting cell division. Journal of the Američan Chemical Society 78, 1375 – 1380 [11] Sakakibara H. (2010): Cytokinin biosynthesis and metabolism. In: Davies PJ, ed. Plant hormones, biosynthesis, signal transduction, action!, Revised 3rd edition, Springer, Springer Science+Business Media, 95 – 114 [12] Brzobohatý B., Moore I., Kristoffersen P., Bako L., Campos N., Schell J., Palme K. (1993): Release of Active Cytokinin by a β-Glucosidase Localized to the Maize Root Meristem. Science 262, 1051 – 1054 [13] Cairns J. R. K., Esen A. (2010): β-Glucosidases. Cellular and Molecular Life Science 67, 3389 – 3405 [14] Kiran M. S., Polanská L., Fohlerová R., Mazura P., Válková M., Šmeral M., Zouhar J., Malbeck J., Dobrev P. I., Macháčková I., Brzobohatý B. (2006): Ectopic overexpression of the maize β-glucosidase Zm-p60.1 perturbs cytokinin homeostasis in transgenic tobacco. Journal of Experimental Botany 57, 985 – 996 [15] Cicek M., Blanchard D., Bevan D. R., Esen A. (2000): The Aglycone Specificitydetermining Sites Are Different in 2,4-Dihydroxy-7-methoxy-1,4-benzoxazin-3-one (DIMBOA)-glucosidase
(Maize
β-Glucosidase)
and
Dhurrinase
(Sorghum
b-
Glucosidase). The Journal of Biological Chemistry 275, 20002 – 20011 [16] Dopitova R., Mazura P., Janda L., Chaloupková R., Jeřábek P., Damborský J., Filipi T., Kiran N. S., Brzobohatý B. (2008): Functional analysis of the aglycone-binding site of the maize β-glucosidase Zm-p60.1. FEBS Journal 275, 6123 – 6135 [17] Dopitová R. (2009): Funkční architektura aktivního místa kukuřičné β-glukosidasy Zmp60.1. Brno, 84 s. Disertační práce. Masarykova univerzita.
51
[18] Zouhar J., Nanak E., Brzobohatý B. (1999): Expression, Single-Step Purification, and Matrix-Assisted Refolding of a Maize Cytokinin Glucoside-Specific β-Glucosidase. Protein Expression and Purification 17, 153 – 162 [19] Rotrekl V., Nejedlá E., Kučera I., Abdallah F., Palme K., Brzobohatý B. (1999): The role of cysteine residues in structure and enzyme activity of a maize β-glucosidase. Eur. J. Biochem 266, 1056 – 1065 [20] Cicek M., Esen A. (1999): Expression of Soluble and Catalytically Active Plant (Monocot) β-Glucosidases in E. coli. Biotechnology and bioengeneering 63, 392 – 400 [21] Czjzek M., Cicek M., Zamboni V., Burmeister W. P., Bevan D. R., Henrissat B., Esen A. (2001): Crystal structure of a monocotyledon (maize ZMGlu1) β-glucosidase and a model of its complex with p-nitrophenyl β-D-thioglucoside. Biochemical J. 354, 37 – 46 [22] Verdoucq L., Czjzek M., Moriniere J., Bevan D. R., Esen A. (2003): Mutational and Structural Analysis of Aglycone Specificity in Maize and Sorghum β-Glucosidases. The Journal of Biological Chemistry 278, 25055 – 25062 [23] Takei K., Sakakibara H., Sugiyama T. (2001): Identification of Genes Encoding Adenylate Isopentenyltransferase, a Cytokinin Biosynthesis Enzyme, in Arabidopsis thaliana. The Journal of Biological Chemistry 28, 26405 – 26410 [24] Sakano Y., Okada Y., Matsunaga A., Suwana T., Kaneko T., Ito K., Noguchi H., Abe I. (2004):
Molecular
cloning,
expression,
and
characterization
of
adenylate
isopentenyltransferase from hop (Humulus lupulus L.). Phytochemistry 65, 2439 – 2446 [25] Frébortová J., Galuszka P., Werner T., Schmülling T., Frébort I. (2007): Functional expression and purification of cytokinin dehydrogenace from Arabidopsis thaliana (AtCKX2) in Saccharomyces cerevisiae. Biologia Plantarium 51, 673 – 682 [26] Šmehilová M., Galuszka P., Bilyeu K. D., Jaworek P., Kowalska M., Šebela M., Sedlářová M., English J. T., Frébort I. (2009): Subcellular localization and biochemical
52
comparison of cytosolic and secreted cytokinin dehydrogenace enzyme from maize. Journal of Experimental Botany 60, 2701 – 2712 [27] Kowalska M., Galuszka P., Frébortová J., Šebela M., Béres T., Hluska T., Šmehilová M., Bilyeu K. D., Frébort I. (2010): Vacuolar and cytosolic cytokinin dehydrogenases of Arabidopsis
thaliana:
Heterologous
expression,
purification
and
properties.
Phytochemistry 71, 1970 – 1978 [28] Kopečný D., Pethe C., Šebela M., Houba-Hérin N., Madzak C., Majira A., Laloue M. (2005):
High-level
expression
and
characterization
of
Zea
mays
cytokinin
oxidase/dehydrogenase in Yarrowia lipolytica. Biochemie 87, 1011 – 1022 [29] Martin R. C., Mok M. C., Mok D. W. S. (1999): Isolation of a cytokinin gene, ZOG1, encoding zeatin O-glucosyltransferase from Phaseolus lunatus. Plant Biology 96, 284 – 289
53
