MASARYKOVA UNIVERZITA

MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV BIOCHEMIE

HPLC analýza a antityrosinázová aktivita vybraných druhů rodu Agrimonia a Plectranthus Bakalářská práce

Barbora Waclawiková

Vedoucí práce: PharmDr. Renata Kubínová, Ph.D.

Brno 2014

Bibliografický záznam Autor:

Název práce:

Barbora Waclawiková Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav Biochemie HPLC analýza a antityrosinázová aktivita vybraných druhů rodu Agrimonia a Plectranthus

Studijní program:

Biochemie

Studijní obor:

Biochemie

Vedoucí práce:

PharmDr. Renata Kubínová, Ph.D.

Akademický rok:

2013/2014

Počet stran:

56

Klíčová slova:

Agrimonia, Plectranthus, Rosaceae, Lamiaceae, flavonoidy, taniny, polyfenoly, tyrosináza

Bibliographic Entry Author

Title of Thesis:

Barbora Waclawiková Faculty of Science, Masaryk University Department of Biochemistry HPLC analysis and tyrosinase inhibition studies of some Agrimonia and Plectranthus plants

Degree programme:

Biochemistry

Field of Study:

Biochemistry

Supervisor:

PharmDr. Renata Kubínová, Ph.D.

Academic Year:

2013/2014

Number of Pages:

56

Keywords:

Agrimonia, Plectranthus, Rosaceae, Lamiaceae, flavonoids, tannins, polyphenols, tyrosinase

Abstrakt V této bakalářské práci se zabývám HPLC analýzou methanolických extraktů a inhibičními účinky rostlin rodu Agrimonia a Plectranthus na enzym zvaný tyrosináza. Teoretická část je věnována popisu rostlin rodu Agrimonia a Plectranthus, jejich fytochemickému profilu a biologické aktivitě a popisu enzymu tyrosinázy. V praktické části je popsána extrakce pomocí mikrovlnného extraktoru, HPLC/DAD/ESI-MS analýza, stanovení antityrosinázové aktivity, stanovení celkového obsahu polyfenolů a flavonoidů a nakonec stanovení IC50.

Abstract The topic of my final bachelor’s thesis is the HPLC analysis of methanolic extracts and inhibitory effects of plants of Agrimonia and Plectranthus genus to enzyme called tyrosinase. The theoretical part is devoted to the description of plants of Agrimonia and Plectranthus genus, their fytochemical profile and biological activity and the description of tyrosinase. The practical part describes the extraction using microwave extractor, the HPLC/DAD/ESI-MS analysis, the determination of antityrosinase activity and the determination of total polyphenolic substances and flavonoids. In the end the determination of IC50 was made.

Poděkování Chtěla bych poděkovat paní doktorce Renatě Kubínové za vedení a pomoc při vypracovávání této bakalářské práce. Velké poděkování patří i mé rodině a příteli, kteří mě podporovali a povzbuzovali během mých studií.

Prohlášení Prohlašuji, že jsem svoji bakalářskou práci vypracovala samostatně a s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány.

Brno 14. května 2014

……………………………… Barbora Waclawiková

Obsah 1.

Úvod ................................................................................................................................ 9

2.

Čeleď Rosaceae (růžovité) ............................................................................................ 10 2.1.

Zástupci ..................................................................................................................... 10

2.2.

Rod Agrimonia .......................................................................................................... 11

2.2.1.

Agrimonia eupatoria (řepík lékařský) ................................................................ 11

2.2.2.

Agrimonia coreana (řepík korejský) .................................................................. 12

2.2.3.

Agrimonia japonica (řepík japonský) ................................................................ 12

2.2.4.

Agrimonia procera (řepík vonný) ...................................................................... 13

2.2.5.

Agrimonia leucantha .......................................................................................... 13

2.2.6.

Využití rodu Agrimonia v lidovém léčitelství .................................................... 13

Čeleď Lamiaceae (hluchavkovité) ................................................................................ 15

3. 3.1.

Zástupci ..................................................................................................................... 15

3.2.

Rod Plectranthus ....................................................................................................... 16

3.2.1.

Plectranthus forsteri 'Marginatus' (moud forsterův, molice) ............................. 16

3.2.2.

Plectranthus ciliatus ........................................................................................... 16

3.2.3.

Plectranthus neochilus ....................................................................................... 17

3.2.4.

Plectranthus amboinicus .................................................................................... 17

3.2.5.

Plectranthus scutellarioides ............................................................................... 17

3.2.6.

Využití rodu Plectranthus v lidovém léčitelství................................................. 18

Obsahové látky .............................................................................................................. 19

4. 4.1.

Fytochemický profil rostlin rodu Agrimonia ............................................................. 19

4.1.1.

Charakteristika flavonoidů ................................................................................. 19

4.1.2.

Biosyntéza flavonoidů ........................................................................................ 20

4.1.3.

Hlavní zástupci flavonoidů u rostlin rodu Agrimonia ........................................ 21

4.1.4.

Taniny (třísloviny) .............................................................................................. 22

4.2.

Fytochemický profil rostlin rodu Plectranthus ......................................................... 25

4.2.1.

Charakteristika izoprenoidů (terpenoidů) ........................................................... 25

4.2.2.

Kyselina kávová ................................................................................................. 27

4.2.3.

Kyselina rozmarýnová ........................................................................................ 27

Biologická aktivita ........................................................................................................ 28

5. 5.1.

Účinky hlavních sloučenin obsažených u rostlin rodu Agrimonia a Plectranthus .... 28

7

Tyrosináza ..................................................................................................................... 30

6. 6.1.

Význam ...................................................................................................................... 30

6.2.

Struktura .................................................................................................................... 30

6.3.

Inhibitory ................................................................................................................... 31

6.3.1.

Inhibitory přírodního původu ............................................................................. 31

6.3.2.

Inhibitory syntetického původu .......................................................................... 31

7.

Cíl práce ........................................................................................................................ 33

8.

Materiál a použité přístroje ........................................................................................... 34 8.1.

Rostlinný materiál...................................................................................................... 34

8.2.

Chemikálie ................................................................................................................. 34

8.3.

Použité přístroje ......................................................................................................... 35

9.

Metody .......................................................................................................................... 36 9.1.

Příprava rostlinného materiálu................................................................................... 36

9.2.

Extrakce ..................................................................................................................... 36

9.2.1.

Mikrovlnná extrakce (MAE) .............................................................................. 36

9.3.

HPLC analýza extraktů .............................................................................................. 37

9.4.

Hmotnostní spektrometrie (MS) ................................................................................ 37

9.5.

Stanovení antityrosinázové aktivity.......................................................................... 38

9.6.

Stanovení celkového obsahu polyfenolů a flavonoidů methanolických extraktů ..... 38

10.

Výsledky a diskuze........................................................................................................ 39

10.1.

Vyhodnocení HPLC-DAD a LC-MS analýz u rostlin rodu Agrimonia ................. 39

10.1.1. Porovnání jednotlivých extraktů rostlin rodu Agrimonia ................................... 39 10.2.

Vyhodnocení HPLC-DAD a LC-MS analýz u rostlin rodu Plectranthus ............. 43

10.2.1. Porovnání jednotlivých extraktů rostlin rodu Plectranthus ............................... 43 10.3.

Výsledná antityrosinázová aktivita ........................................................................ 48

10.4.

Celkový obsah polyfenolů a flavonoidů ................................................................ 49

11.

Závěr.............................................................................................................................. 51

12.

Summary ....................................................................................................................... 52

13.

Seznam použité literatury .............................................................................................. 53

8

1. ÚVOD Přírodní medicína, kde se léčivé látky izolují z léčivých bylin, byla po staletí využívána k léčbě různých onemocnění a chorob. S rozvojem chemie počátkem 20. století se začaly léčivé látky uměle syntetizovat a léčivé byliny byly po nějakou dobu opomíjeny. Avšak nikdy neupadly v úplné zapomnění. Již různá prehistorická společenství objevila, že některé rostliny mohou léčit určitá onemocnění a poranění a jiné mohou způsobit nevolnost, halucinace nebo dokonce i zabíjet. Znalost přírodních léčiv byla zprvu tajemstvím kouzelníků a šamanů, později se ale stala předmětem lékařských spisů a herbářů. Slavní řečtí a římští přírodopisci a lékaři, kteří se zasloužili o rozvoj evropské medicíny, sepsali mnoho užitečných poznatků, které byly následovány až do 16. století. Byli jimi například Hippokrates, Aristoteles, Paracelsus, Galénos z Pergama nebo Dioskúridés, autor významného díla o léčivech De materia medica. Dnes se moderní medicína a farmacie opět vrací k výzkumu účinných látek z léčivých bylin. Jsou ověřovány účinky po staletí známých a užívaných bylin v přírodní medicíně, jsou u nich zkoumány nové potenciální léčivé účinky a užití. Rostliny z rodu Agrimonia a Plectranthus přesně zapadají do této skupiny, u které jsou již některé účinky dlouhou dobu známé, avšak stále se u nich zkoumá další efektivní působení na rostlinné nebo lidské organismy. Paracelsus kdysi řekl: "Všechny kopce, pohoří, všechny louky a lesy jsou přirozené lékárny." Proto jsem se v této práci zaměřila na výzkum nových účinků těchto velice zajímavých a prospěšných bylin.

9

2. ČELEĎ ROSACEAE (RŮŽOVITÉ) Říše: Podříše: Oddělení: Třída: Řád:

Plantae (rostliny) Tracheobionta (cévnaté rostliny) Magnoliophyta (krytosemenné) Rosopsida (vyšší dvouděložné) Rosales (růžotvaré)

Růžovité jsou vyšší dvouděložné rostliny, které patří do řádu Rosales (růžotvaré). Tato čeleď je rozšířena kosmopolitně, avšak nejvíce druhů se vyskytuje v severním mírném pásu [1].

Obr. č. 1: Mapa výskytu rostlin z čeledi Rosaceae [2] Růžovité zahrnují víceméně dřeviny a byliny. Většinou jsou to víceleté rostliny, ale můžeme mezi nimi najít i tzv. jednoletky [3]. Listy čeledi Rosaceae jsou střídavé (jednoduché i složené) opatřené palisty. Květy mají obvykle oboupohlavné, pětičetné, s rozlišeným květním obalem. Plody jsou měchýřky (např. tavolník), nažky (jahodník), peckovice (ostružiník) nebo malvice (jabloň). Pletiva růžovitých mnohdy obsahují éterické oleje (silice), které mají za příčinu vůni jejich květů. Jde o velmi významnou čeleď, která má plno důležitých využití (ovoce, léčivky, okrasné rostliny) [4].

2.1. ZÁSTUPCI Čeleď Rosaceae obsahuje přes 2500 druhů v přibližně 90 rodech [1]. Mezi růžovité patří většina pěstovaných ovocných dřevin, např. Prunus (třešeň), Malus (jabloň), Pyrus (hrušeň), Fragaria (jahodník). Z planých lučních druhů jsou časté druhy rodu Alchemilla (kontryhel). Pro vlhké louky je typický výskyt Sanguisorba officinalis (krvavec toten) a Filipendula ulmaria (tužebník jilmový). Na křovinatých stráních a mezích roste hojně Prunus spinosa (trnka obecná). Důležitou léčivkou (zejména proti zánětlivým onemocněním) je Agrimonia eupatoria (řepík lékařský) [4].

10

2.2. ROD AGRIMONIA Tento rod zahrnuje okolo 15 druhů vytrvalých bylin, které se vyskytují v mírném pásmu severní polokoule. Plodem je češule s prstencem háčkovitých osténků. Listy jsou zpeřené s tenkými zubatými lístky vyrůstajícími v přízemní růžici. Řepíky jsou rostlinami lesních lemů a luk. Nepovažují se za okrasné rostliny, naproti tomu mají dlouhou historii v lidovém léčitelství a farmakologii – výluh z listů a květů má pro obsah tříslovin adstringentní (stahující) a diuretické (močopudné) účinky [5].

2.2.1. AGRIMONIA EUPATORIA (ŘEPÍK LÉKAŘSKÝ) Agrimonia eupatoria je vytrvalá bylina. Jejím přirozeným prostředím je Evropa, avšak je rozšířená po celém mírném pásu severní polokoule [ 6 ]. Roste na suchých loukách a v lesních lemech, také na okraji cest, sadů, vinic a náspů. Tato bylina vyrůstá do výšky až 150 cm. Lodyhu má přímou, jednoduchou nebo chudě větvenou, se třemi typy chlupů. Listy jsou lichozpeřené. Květy mají žluté zbarvení. Plodem je češule [7].

Obr. č. 2: Agrimonia eupatoria (řepík lékařský)

11

2.2.2. AGRIMONIA COREANA (ŘEPÍK KOREJSKÝ) Agrimonia coreana je vytrvalá bylina 70 – 100 cm vysoká. Lodyha je u této byliny přímá, větvená a je pokryta jemnými chloupky. Listy jsou vejčité s hrubě vroubkovanými okraji. Květenství hroznovité. Kališní lístky jsou oválné. Okvětní lístky jsou podlouhlé a mají žluté zbarvení. Je to druh rostoucí především u lesních lemů a v houštinách na horských svazích. Je rozšířený hlavně v Asii (Japonsko, Korea, východní Rusko) [8].

Obr. č. 3: Agrimonia coreana (řepík korejský)

2.2.3. AGRIMONIA JAPONICA (ŘEPÍK JAPONSKÝ) Vytrvalá bylina dorůstající do výšky 20 – 70 cm. Lodyha je obvykle větvená v horní části rostliny, zřídka jednoduchá. Je pokryta krátkými i dlouhými jemnými chloupky. Listy jsou pěti- až sedmičetné, podlouhlé, oválné. Květenství hroznovité. Kališní lístky jsou kopinaté, okvětní lístky jsou malé se žlutým zbarvením. Druh rostoucí v listnatých lesích, na loukách a horských svazích. Je rozšířený zejména v oblastech Dálného východu (Čína – Mandžusko, Japonsko) [9].

Obr. č. 4: Agrimonia japonica (řepík japonský)

12

2.2.4. AGRIMONIA PROCERA (ŘEPÍK VONNÝ) Agrimonia procera je vytrvalá bylina 40 – 150 cm vysoká. Lodyha je přímá, vroubkovaná, pokrytá hladkými chloupky. Listy jsou střídavé, zpeřené, tří- až sedmičetné, většinou stejné velikosti. Rozdrcené listy mají intenzivní vůni. Okvětní lístky mají žluté zbarvení. Plodem je češule. Tato bylina roste převážně v evropských oblastech mírného pásu v lesích, na loukách a v houštinách [10].

Obr. č. 5: Agrimonia procera (řepík vonný)

2.2.5. AGRIMONIA LEUCANTHA Vytrvalá bylina se střídavými, lichozpeřenými listy s vroubkovanými okraji. Květenství je hroznovité a květy mají žluté zbarvení.

Obr. č. 6: Agrimonia leucantha

2.2.6. VYUŽITÍ RODU AGRIMONIA V LIDOVÉM LÉČITELSTVÍ Všechny zmíněné druhy řepíků se hojně využívají v lidovém léčitelství. Agrimonia eupatoria (řepík lékařský) obsahuje flavonoidy, esenciální oleje a třísloviny (taniny), kterým vděčí za většinu svých léčivých vlastností. Třísloviny (taniny) mají na kůži a sliznici adstringentní (stahující) účinky. Nálev z řepíku lékařského má výrazné protiprůjmové a diuretické účinky. Používá se také jako prostředek k vypuzování parazitujících červů ze střev. Nejvýraznějších léčivých účinků se však dosahuje, když se řepík lékařský aplikuje zevně. Poranění ústní dutiny: provádějí se výplachy. Krční onemocnění: s pomocí kloktadla se v některých případech dosahuje velmi dobrých výsledků (během 13

několika dnů mizí zánět a podráždění sliznice). Lehké a drobné poranění: na postižené místo se přiloží obklad namočený do odvaru z řepíku lékařského. Tímto způsobem se rána vysuší a začne se hojit [11]. Další druhy rodu Agrimonia, a to A. coreana, A. japonica, A. procera a A. leucantha, obsahují taktéž flavonoidy (např. kvercetin, apigenin) a fenolické sloučeniny (např. agrimofol, kyselina gallová a kávová). Poslední výzkumy zjistily i rutin a triterpenoidy. Zastavují různé typy krvácení, posilují funkci srdce, léčí úplavici a hubí parazity. Mají diuretické účinky, snižují krevní tlak. Poslední výzkumy dokazují, že taktéž regenerují sliznici žaludku, léčí choroby jater a některé druhy nádorového bujení. Semena řepíků mají značnou antioxidační aktivitu. Doporučená denní dávka je 6-12 g suché drogy, nejčastěji ve formě odvaru. Zevně se připravují obklady [12].

14

3. ČELEĎ LAMIACEAE (HLUCHAVKOVITÉ) Říše: Podříše: Oddělení: Třída: Řád:

Plantae (rostliny) Tracheobionta (cévnaté rostliny) Magnoliophyta (krytosemenné) Rosopsida (vyšší dvouděložné) Lamiales (hluchavkotvaré)

Hluchavkovité jsou vyšší dvouděložné rostliny, které patří do řádu Lamiales (hluchavkotvaré). Tato čeleď je rozšířena po celém světě.

Obr. č. 7: Mapa výskytu rostlin z čeledi Lamiaceae Hluchavkovité jsou jednoleté, dvouleté nebo vytrvalé byliny. Mají čtyřhrannou lodyhu, která je jednoduchá nebo větvená. Listy jsou u této čeledi vstřícné, většinou křižmostojné, jednoduché, řapíkaté nebo přisedlé. Palisty se u nich nevyskytují. Květy jsou uspořádány v lichopřeslenech. Jsou souměrné, oboupohlavné a dvoupyské. Plodem je tvrdka [13]. Pro obsah éterických olejů se mnoho druhů sbírá jako léčivky, pěstují se jako koření nebo jako zdroj vonných silic [4].

3.1. ZÁSTUPCI Čeleď Lamiaceae obsahuje přes 4000 druhů a okolo 220 rodů. U nás se vyskytuje přibližně 35 rodů a okolo 100 druhů [13]. Éterické oleje v sobě obsahují byliny, které se používají jako léčivky, např. Salvia officinalis (šalvěj lékařská) nebo Mentha piperita (máta peprná). Tyto rostliny se dnes využívají v tzv. aromaterapii. Aromaterapie je přírodní léčebná metoda, která využívá koncentrovaných éterických olejů. Tyto oleje se nejčastěji využívají ve formě inhalací, aromaterapeutických masáží a vonných koupelí. Z hluchavkovitých můžeme také připravit koření Majorana hortensis (majoránka zahradní) nebo z nich můžeme získat vonné silice Rosmarinus officinalis (rozmarýna lékařská). V křovinách a na rumištích je obvyklá Lamium album (hluchavka bílá). Mezi hojné plevele řadíme Lamium purpureum (hluchavka nachová). V teplejších oblastech je rozšířený druh Salvia pratensis (šalvěj luční) [4].

15

3.2. ROD PLECTRANTHUS Rod, který obsahuje přes 350 druhů jednoletých nebo vytrvalých bylin, polokeřů a keřů. Tento rod je rozšířený v Africe, Asii a Austrálii. Pěstují se jako pokojové nebo užitkové rostliny či okrasné keře. Zpravidla mají dužnaté stonky a často masité vejčité až srdčité listy [5].

3.2.1. PLECTRANTHUS FORSTERI 'MARGINATUS' (MOUD FORSTERŮV, MOLICE) Je to poléhavá až převislá vytrvalá bylina. Dorůstá do výšky 20 – 30 cm. Květy má světlé růžové. Listy jsou bělozeleně skvrnité. Tato bylina se vyjímá svou silnou vůni a ozdobným listem, proto se používá jako okrasná rostlina [14].

Obr. č. 8: Plectranthus forsteri 'Marginatus'

3.2.2. PLECTRANTHUS CILIATUS Stálezelená vytrvalá bylina s poléhavými až vystoupavými lodyhami. Tato rostlina dorůstá do výšky až 45 cm. Tento druh pochází z jižní Afriky, kde se rychle rozrůstá ve stínu stromů. Listy jsou na vrchní straně bronzově zelené, na spodní straně tmavě purpurové. V létě a na podzim kvete krátkými klasovitými květenstvími [5].

Obr. č. 9: Plectranthus ciliatus

16

3.2.3. PLECTRANTHUS NEOCHILUS Druh vyskytující se od jihozápadní Afriky až po jižní Arábii. Má světle levandulové květy se silnou pižmovou vůní. Roste v hustých kobercích, proto je ideální jako pokryvná rostlina, která dobře snáší sucho [5].

Obr. č. 10: Plectranthus neochilus

Obr. č. 11: Plectranthus neochilus

3.2.4. PLECTRANTHUS AMBOINICUS Tato vytrvalá bylina dorůstá do výšky až 90 cm. Její přirozené prostředí je v západní, východní a jižní Africe. Je to sukulentní rostlina, která se vyznačuje svou typickou vůní, která je spojována s vůní koření oregana. Její listy jsou jednoduché, široké, oválné a ztlustlé s jemnými chloupky na povrchu. Květy mají trubicovitý tvar. Jejich barva je od světle fialové po bílou [15].

Obr. č. 12: Plectranthus amboinicus

3.2.5. PLECTRANTHUS SCUTELLARIOIDES Vytrvalá stálezelená bylina dosahující výšky 20 – 40 cm. Listy jsou u této rostliny jednoduché, oválné, řapíkaté s vroubkovanými okraji. Květy jsou fialové barvy a kvetou od června do října. Její přirozené prostředí je v jihovýchodní Asii (Borneo, Filipíny). Tento druh má mnoho odrůd, které se pěstují pro jejich rozmanité zbarvení listů (od růžové po zelenou, žlutou, tmavě fialovou, červenou atd.) [16].

17

Známé jsou např. Plectranthus scutellarioides 'Black Dragon' nebo Plectranthus scutellarioides 'Scarlet Poncho'.

Obr. č. 13: Plectranthus scutellarioides 'Black Dragon'

Obr. č. 14: Plectranthus scutellarioides 'Scarlet Poncho'

3.2.6. VYUŽITÍ RODU PLECTRANTHUS V LIDOVÉM LÉČITELSTVÍ Lidové léčitelství využívá rostliny rodu Plectranthus zvláště k léčbě různých zranění, k léčbě zažívacích problémům, ke zmírnění dýchacích obtíží, jako antiseptikum a k léčbě malárie. Mimo jiné některé druhy těchto bylin mají schopnost potlačovat množení lidských lymfocytů a ukazují se jako dobré odpuzující prostředky proti hmyzu [17]. Tyto léčivé účinky mají tyto rostliny díky obsahu monoterpenů, seskviterpenů, diterpenů a různých fenolových sloučenin [18].

18

4. OBSAHOVÉ LÁTKY Obsahové látky v rostlinách se označují jako fytochemické látky. Běžné stavební látky rostlinného těla jako jsou cukry, bílkoviny a tuky, které vznikají během základního metabolismu, se mezi fytochemické látky nezařazují. Termínem fytochemická látka neboli droga označujeme účinné látky, které jsou produkty sekundárního metabolismu rostlin. Můžeme je také nazývat jako sekundární metabolity [19].

4.1. FYTOCHEMICKÝ PROFIL ROSTLIN RODU AGRIMONIA Hlavní sekundární metabolity u rostlin rodu Agrimonia jsou flavonoidy, taniny (třísloviny), aromatické kyseliny a triterpeny [20].

4.1.1. CHARAKTERISTIKA FLAVONOIDŮ Flavonoidy se charakterizují jako různobarevné pigmenty rostlin. V průběhu let tyto sekundární metabolity získaly mnoho pozornosti. Od prvního popisu účinku kyselin a zásad na rostlinné pigmenty, který objasnil Robert Boyle v roce 1664, k popisu strukturních a regulačních genů na konci 20. století. Za tuto dobu se nasbíralo velmi mnoho informací o struktuře, chemické aktivitě a biosyntéze těchto sloučenin [21]. Flavonoidy představují relativně rozmanitou skupinu aromatických molekul, které jsou syntetizovány z aminokyseliny fenylalaninu a malonylu-koenzymu A [21]. Tyto sloučeniny se dělí do šesti hlavních podskupin, které byly identifikovány ve většině vyšších rostlin: chalkony, flavony, flavonoly, flavandioly, anthokyanidiny a kondenzované taniny (proanthokyanidiny). Sedmá podskupina aurony je rozšířená, ale není u rostlin vždy prokázána. Některé rostliny jsou schopny syntetizovat i další specifickou podskupinu flavonoidů a to isoflavonoidy, které byly dokázány u luštěnin a některých dalších bylin [21].

Obr. č. 15: Hlavní podskupiny flavonoidů

19

Obr. č. 16: Další podskupiny flavonoidů

4.1.2. BIOSYNTÉZA FLAVONOIDŮ

Obr. č. 17: Biosyntéza flavonoidů [21]

20

Schématické znázornění hlavních pochodů při biosyntéze flavonoidů, kde tato syntéza začíná obecným metabolismem fenylpropanoidů a vede k devíti hlavním podskupinám, bezbarvým chalkonům, auronům, isoflavonoidům, flavonům, flavonolům, flavandiolům a barevným pigmentům antokyanům, kondenzovaným taninům a flobafenům [21].

4.1.3. HLAVNÍ ZÁSTUPCI FLAVONOIDŮ U ROSTLIN RODU AGRIMONIA Hlavní aglykony zastoupené u rostlin rodu Agrimonia jsou kvercetin, kaempferol, apigenin, luteolin a jejich substituované deriváty. 4.1.3.1. KVERCETIN Flavonol, který je velmi často obsažen u mnoha vyšších rostlin. Glykosylované formy této sloučeniny jsou například rutin a kvercetrin [22]. Tabulka I: Přehled základních chemických informací o kvercetinu [22] Název Molekulová hmotnost Sumární vzorec

Kvercetin (sophoretin, meletin, kvercetol) 302,236 C15H10O7

Strukturní vzorec

Chemický název

2-(3,4-dihydroxyfenyl)-3,5,7-trihydroxychromen-4-on

4.1.3.2. KAEMPFEROL Tabulka II: Přehled základních chemických informací o kaempferolu [23] Název Molekulová hmotnost Sumární vzorec

Kaempferol (populnetin, robigenin, pelargidenolon) 286,236 C15H10O6

Strukturní vzorec

Chemický název

3,5,7-trihydroxy-2-(4-hydroxyfenyl)chromen-4-on 21

4.1.3.3. APIGENIN Tabulka III: Přehled základních chemických informací o apigeninu [24] Název Molekulová hmotnost Sumární vzorec

Apigenin (spigenin, versulin, apigenol) 270,237 C15H10O5

Strukturní vzorec

Chemický název

5,7-dihydroxy-2-(4-hydroxyfenyl)-4H-1-benzopyran-4-on

4.1.3.4. LUTEOLIN Tabulka IV: Přehled základních chemických informací o luteolinu [25] Název Molekulová hmotnost Sumární vzorec

Luteolin (luteolol, digitoflavon, flacitran) 286,236 C15H10O6

Strukturní vzorec

Chemický název

2-(3,4-dihydroxyfenyl)-5,7-dihydroxychromen-4-on

4.1.4. TANINY (TŘÍSLOVINY) Taniny jsou běžné sekundární metabolity u cévnatých rostlin a jsou obsaženy v listech, pupenech, semenech, kořenech a stoncích. Využitelné taniny byly identifikovány v kůře a ořeších stromů. Velké množství taninů bylo nalezeno u duběnek. Tento zdroj taninů sloužil v minulosti k výrobě tzv. duběnkového inkoustu, který byl více než po tisíciletí jedním z nejpoužívanějších inkoustů na světě [26]. Dnes jsou taniny používány pro fixování barvících substancí v látkách, dále k lisování a barvení papíru, k přípravě laků a inkoustů, k výrobě tmelů a k čiření vína [26]. Na základě jejich struktury jsou taniny děleny do dvou hlavních skupin. Hydrolyzovatelné taniny (HTs), u kterých je jejich sacharidová složka (nejčastěji o-glukóza) částečně nebo úplně esterifikována kyselinou gallovou (gallotaniny, GTs) nebo kyselinou ellagovou (ellagotaniny, ETs) [26]. 22

Obr. č. 18: Gallotaniny

Obr. č. 19: Ellagotaniny

23

4.1.4.1. KYSELINA TANINOVÁ Známou sloučeninou hydrolyzovatelných taninů je kyselina taninová, obvykle získávána z vodného extraktu kaštanovníku (Castanea sativa M.) Tabulka V: Přehled základních chemických informací o kyselině taninové [27] Název Molekulová hmotnost Sumární vzorec

Kyselina taninová (kyselina gallotaninová, kyselina digallová, kvercitanin) 1701,198 C76H52O46

Strukturní vzorec

Chemický název

2,3-dihydroxy-5-({[(2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5,6-tetrakis({3,4dihydroxy-5-[(3,4,5trihydroxyfenyl)karbonyloxy]fenyl}karbonyloxy)oxan-2yl]methoxy}karbonyl)fenyl-3,4,5-trihydroxybenzoát

24

Druhou skupinou jsou kondenzované taniny (CTs, proanthokyanidiny). Jsou to oligomerní nebo polymerní flavonoidy. Jejich základem jsou jednotky z flavan-3-olu (zpravidla katechin nebo epikatechin) spojeny uhlíkovou vazbou většinou mezi C8 uhlíkem jedné jednotky a C4 uhlíkem jednotky druhé. Tato skupina taninů má pozitivní účinky na trávení u člověka a další fyziologické funkce [26, 28].

Obr. č. 20: Kondenzované taniny (proanthokyanidiny)

4.2. FYTOCHEMICKÝ PROFIL ROSTLIN RODU PLECTRANTHUS Hlavní sekundární metabolity u rostlin rodu Plectranthus jsou monoterpeny, seskviterpeny, diterpeny (nejčastěji abietany) a různé substituované fenoly. Nejvýznamnější sloučeninou je kyselina rozmarýnová, která je běžnou sloučeninou u čeledi Lamiaceae a kyselina kávová. Další významné sloučeniny jsou deriváty flavonoidů a další deriváty kyseliny kávové (nepetoidin A a B) [18].

4.2.1. CHARAKTERISTIKA IZOPRENOIDŮ (TERPENOIDŮ) Izoprenoidy, také zvané terpenoidy, jsou patrně jednou z největších a nejvíce rozmanitých skupin přírodních produktů. Vznikají jak v rostlinných, tak v živočišných organismech. Jejich základní stavební jednotkou je izopren (2-methylbut-1,3-dien) [29].

Obr. č. 21: Izopren

25

Tabulka VI: Klasifikace izoprenoidů podle počtu izoprenových jednotek [29] Název podskupiny

Počet izoprenových jednotek

Počet uhlíkových atomů

Monoterpeny

2

C10

Seskviterpeny

3

C15

Diterpeny

4

C20

Sesterterpeny

5

C25

Triterpeny

6

C30

Tetraterpeny

8

C40

Polyterpeny

9 a více

C45 a více

4.2.1.1. MONOTERPENY Jsou to těkavé, vonné látky obsažené v silicích. Mezi hlavní zástupce patří geraniol, citronellol, citral, mentol, limonen a pinen [30]. 4.2.1.2. SESKVITERPENY Tyto sloučeniny jsou součástí éterických olejů. Jsou obsaženy v řadě rostlin. Mají acyklickou nebo cyklickou strukturu. Mezi acyklické seskviterpeny patří farnesol, nerolidol atd. Mezi cyklické seskviterpeny patří kyselina abscisová, kadalen, gossypol a další [30]. 4.2.1.3. DITERPENY Rostliny rodu Plectranthus obsahují velké množství různých podskupin diterpenů. Například jimi jsou abietany, kaurany, klerodany, labdany a další [31]. ABIETANY Abietany jsou nejpočetnější podskupina diterpenů v rodě Plectranthus. Abietany se vykazují antioxidační a antibakteriální aktivitou. V této skupině sekundárních metabolitů se nacházejí sloučeniny, jako jsou kyselina karnosová, kyselina royleanonová, karnosol a rosmanol [32].

26

4.2.2. KYSELINA KÁVOVÁ Tabulka VII: Přehled základních chemických informací o kyselině kávové [33] Kyselina kávová (3,4-dihydroxyskořicová kyselina) 180,157 C9H8O4

Název Molekulová hmotnost Sumární vzorec

Strukturní vzorec

Chemický název

(E)-3-(3,4-dihydroxyfenyl)propen-2-ová kyselina

4.2.3. KYSELINA ROZMARÝNOVÁ Kyselina rozmarýnová je esterem kyseliny kávové [34]. Tabulka VIII: Přehled základních chemických informací o kyselině rozmarýnové [35] Název Molekulová hmotnost Sumární vzorec

Kyselina rozmarýnová 360, 315 C18H16O8

Strukturní vzorec

Chemický název

3-(3,4-dihydroxyfenyl)-2-[(E)-3-(3,4-dihydroxyfenyl)prop-2enoyl]oxypropanová kyselina

27

5. BIOLOGICKÁ AKTIVITA Mezi výše popsanými skupinami sekundárních metabolitů (flavonoidy, taniny, terpeny) nalezneme velké množství látek, u kterých byla zkoumána a také potvrzena biologická aktivita. Flavonoidy jsou známy svými protizánětlivými, antivirovými a antibakteriálními účinky. Také se využívají k léčbě vředových onemocnění, k léčbě rakoviny, proti křečovým a trombotickým stavům [20]. Jejich antioxidační účinky záleží na hydroxylových skupinách přítomných v jejich struktuře. Je pravděpodobné, že čím víc hydroxylových skupin je obsaženo ve flavonoidech, tím lepšími jsou antioxidanty [36]. Taniny → jejich hlavní funkce spočívá v antibakteriální aktivitě, která se týká obrany rostlin před patogeny. Dodávají rostlině nepříjemnou chuť, tudíž jsou ochranou i proti býložravcům [26]. Terpeny, hlavně monoterpeny, seskviterpeny a diterpeny, jsou součástí esenciálních olejů, které jsou obsaženy u více než 2000 rostlinných druhů z 60 čeledí (Rutaceae, Pinaceae, Labiatae atd.). Esenciální oleje jsou významné antiseptika, diuretika, látky usnadňující vykašlávání, spasmolytika, sedativa apod. [37].

5.1. ÚČINKY HLAVNÍCH SLOUČENIN OBSAŽENÝCH U ROSTLIN RODU AGRIMONIA A PLECTRANTHUS 1. Bioflavonoidy - kvercetin, rutin, kaempferol, luteolin a apigenin jsou látky, které byly identifikovány patrně u všech známých rostlin z rodu Agrimonia. a) Kvercetin Testy in vitro ukázaly, že tato látka brání imunitním buňkám uvolňovat chemickou látku histamin, která způsobuje alergické reakce. Na základě toho vědci věří, že kvercetin dokáže zmírnit symptomy způsobené alergiemi. Nicméně, tato skutečnost nebyla zatím u lidí prokázána. Další testy dokázaly, že kvercetin a další flavonoidy, mohou napomáhat ke zmenšení rizika aterosklerózy a tudíž k ukládání cholesterolu v tepnách. Dále potraviny bohaté na kvercetin mohou napomáhat k prevenci určitých typů rakovinového bujení, revmatoidní artritidy, hypertenze a intersticiální cystitidy [38]. b) Rutin Bioflavonoidy, mezi něž patří i rutin, zvyšují účinnost vitaminu C, proto se již dlouhé roky v přírodních léčivech spojují a vytvářejí tak léčivou substanci. Rutin má blahodárné antioxidační účinky, dále podporuje elasticitu cévních stěn, snižuje jejich lomivost a zpomaluje produkci destičkové zátky, ředí krev a zlepšuje její cirkulaci, čímž pomáhá k lepšímu prokrvení mozku a srdce. Další význačné užití této látky je k léčbě křečových žil [39]. c) Kaempferol Tento sekundární metabolit byl identifikován u spousty poživatelných rostlinných produktů (např. v čaji, brokolici, rajčatech, jahodách atd.) a dále u rostlin běžně používaných v tradiční medicíně (např. Ginkgo biloba, Sophora japonica, Agrimonia eupatoria atd.). Některé studie dokázaly pozitivní účinky této látky u léčby rakoviny a kardiovaskulárních onemocnění. Četné další studie ukázaly, že kaempferol a jeho glykosidy, mají širokou škálu 28

biologických aktivit. Například antioxidační, protizánětlivé, antimikrobiální, antidiabetické, analgetické a antialergenní účinky [40]. d) Luteolin Běžný flavonoid, který se nachází v mnoha druzích ovoce, zeleniny a léčivých bylin. Rostliny obsahující luteolin jsou používány v čínské tradiční medicíně k léčbě hypertenze, zánětů a rakoviny. Jednotlivé biologické účinky této látky spolu patrně souvisí. Například, jeho protizánětlivá aktivita, může být spojena s jeho antikancerogenními účinky [41]. e) Apigenin Jako jeden z flavonoidů má typickou biologickou aktivitu, jako jsou antioxidační, protizánětlivé a antikancerogenní účinky. Vedou se diskuze i o tom, že apigenin umí blokovat tvorbu kyseliny močové u dny (onemocnění kloubů) [42]. 2. Další sekundární metabolity, které byly prokázány u rostlin rodu Agrimonia, jsou taniny. Významným zástupcem této skupiny je kyselina taninová. a) Kyselina taninová Tato kyselina je významná pro své antimutagenní, protinádorové a antioxidační účinky. Nedávné studie spojují antioxidační aktivitu s její schopností tvořit komplexy s mědí [26]. 3. Kyselina rozmarýnová, kyselina kávová jsou látky, které byly identifikovány zřejmě u všech známých rostlin z rodu Plectranthus. a) Kyselina rozmarýnová Tato látka má široké uplatnění, které vedlo k jejímu uplatnění od konzervačních látek k využití v kosmetickém průmyslu. Samozřejmě kyselina rozmarýnová má také biologickou aktivitu, například některé studie ukázaly, že antioxidační aktivita je vyšší než u vitaminu E nebo Troloxu (analog vitaminu E). Dále se projevuje antivirální, antibakteriální a antialergenní aktivitou [43]. b) Kyselina kávová Sloučenina, která má antioxidační účinky. Pokusy in vitro dále prokázaly, že deriváty kyseliny kávové snižují systolický krevní tlak u krys, jsou schopny blokovat nitrobuněčné signály způsobeny oxidovanými LDL částicemi a blokovat tak jejich cytotoxický účinek [44].

29

6. TYROSINÁZA 6.1. VÝZNAM Tyrosináza, také známá pod názvem polyfenol oxidáza (EC 1.14.18.1), je měď obsahující enzym, který je velmi často přítomen jak u mikroorganismů, tak hub, rostlin a živočichů. U vyšších rostlin a hub se tyrosináza nachází v různých isoformách (nerozvinutá, rozvinutá a aktivní forma). Nicméně, vztah mezi těmito isoformami ještě nebyl nalezen. Tyrosináza je katalyzátor biochemických reakcí u biosyntézy melaninu. První dva kroky této syntézy jsou hydroxylace L-tyrosinu na L-dopa a oxidace L-dopa na dopachinon. Oba tyto kroky využívají molekulový kyslík. Následuje řada neenzymatických reakcí vedoucích ke konečnému produktu → melaninu, který hraje důležitou roli v ochraně kůže před UV zářením [45, 46].

Obr. č. 22: Reakce katalyzované tyrosinázou Naproti tomu, abnormální produkce melaninu způsobuje různá kožní onemocnění (např. melasmu, pihatost, stařecké skvrny apod.), které se staly značným estetickým problémem lidstva. U hub je role melaninu spojená s rozlišením reprodukčních orgánů, s tvorbou spor, s virulencí patogenních hub a s ochranou pletiv před poškozením. Navíc, tyrosináza je zodpovědná za nežádoucí hnědnutí ovoce a zeleniny, které probíhá během jejich stárnutí nebo během jejich posklizňové manipulace. Díky všem těmto nežádoucím účinkům tyrosinázy se nalézají stále nové inhibitory tohoto enzymu [45]. Samozřejmě tyrosináza má i své žádoucí účinky. Jsou jimi například tvoření organoleptických vlastností u rozinek, kakaa a fermentovaných čajových listů, dále napomáhá ke sklerotizaci kutikuly u hmyzu (ukládání minerálních látek) a využívá se k syntéze antibiotik [45, 46].

6.2. STRUKTURA Tyrosináza (izolována z Agaricus bisporus) je heterotetramer obsahující dva těžké řetězce (H) a dva lehké řetězce (L) s molekulovou hmotností 120 kDa. V zásadě má tento enzym tři domény. Hlavní doména obsahuje dvě vazebná místa obsahující měď, které se nazývají CuA a CuB. Šest histidinových zbytků se váže s ionty mědi v místě aktivního místa tohoto enzymu, které interaguje s molekulovým kyslíkem a fenolovým substrátem. Poloha aminokyselin cysteinu ve struktuře enzymu hraje důležitou roli ve tvorbě disulfidických můstků, které stabilizují strukturu proteinu. Počet cysteinových zbytků záleží na typu organismu [45].

30

6.3. INHIBITORY Inhibitory enzymu tyrosinázy jsou využívány v dermatologii, kosmetice a potravinářském průmyslu. Tyto inhibitory jsou dvojího typu. Buď jsou přírodního, nebo syntetického původu [46].

6.3.1. INHIBITORY PŘÍRODNÍHO PŮVODU Inhibitory přírodního původu jsou děleny do dvou podskupin [45]: a) Polyfenoly b) Aldehydy a jiné deriváty 6.3.1.1. POLYFENOLY Účinné inhibitory z této podskupiny se ukázaly být flavonoidy, jako je například kaempferol, kvercetin, kurarinon a kushnol F, které byly izolovány z různých rostlin. Jejich inhibice spočívá v chelataci mědi v aktivním místě enzymu, ovšem za předpokladu, že mají 3hydroxylovou skupinu přístupnou. Inhibitory, u kterých byla dokázána inhibice i bez přítomnosti této hydroxylové skupiny jsou luteolin 4'-O-glukosid a luteolin 7-Oglukosid. Dalšími důležitými inhibitory jsou kyselina gallová, která se vyskytuje jako ester s D-glukózou. Deriváty kyseliny gallové byly potvrzeny jako silné inhibitory enzymu tyrosinázy. Kyselina kumarová inhibuje tyrosinázu jak při hydroxylaci L-tyrosinu na L-dopa, tak při oxidaci L-dopa na dopachinon. Oxyresveratrol ukázal svoji silnou inhibiční aktivitu, díky jeho velkému počtu hydroxylových skupin [45]. 6.3.1.2. ALDEHYDY A JINÉ DERIVÁTY Je znám značný počet inhibitorů z této podskupiny. Jsou jimi například transcinnamaldehyd, 2-hydroxy-4-methoxybenzaldehyd, anisaldehyd, cuminaldehyd, kyselina 3,4dihydroxyskořicová a kyselina 4-hydroxy-3-methoxyskořicová. Aldehydy jsou známy tím, že interagují s biologicky významnými nukleofilními skupinami, jakou jsou sulfhydrylové, aminové a hydroxylové skupiny. Proto je jejich inhibiční aktivita přisuzována tvorbě Schiffových bazí s amino skupinami enzymu [45].

6.3.2. INHIBITORY SYNTETICKÉHO PŮVODU Kaptopril, lék k léčbě hypertenze, je schopen předcházet tvorbě melaninu tím, že inhibuje tyrosinázu v prvních dvou krocích syntézy melaninu. Lék k léčbě onemocnění štítné žlázy, methimazol, se projevuje stejnou inhibiční aktivitou. Chemikálie, jako například peroxid vodíku, hydroxylamin, Tiron, thioly a aromatické karboxylové kyseliny byly prokázány také jako jedny z inhibitorů s antityrosinázovou aktivitou. Další skupinou inhibitorů z této podskupiny jsou sloučeniny mající podobnou strukturu jako polyfenoly. Vyznačují se jako inhibitory s pomalejší vazbou na enzym. Jsou jimi například L-mimosin, kyselina kójová, tropolon a 4-substituované rezorcinoly [45].

31

Obr. č. 23: Struktura některých inhibitorů tyrosinázy

32

7. CÍL PRÁCE Cílem teoretické části bylo zpracování podrobné literární rešerše o rostlinách rodu Agrimonia a Plectranthus, o jejich užití v lidovém léčitelství, o jejich typických obsahových látkách a o jejich biologické aktivitě využitelné v moderní medicíně. Dále byla rešerše zpracována na téma – tyrosináza, její význam, struktura a inhibitory. Praktická část byla zaměřena na extrakce z pěti druhů rostliny Agrimonia a šesti druhů rostliny Plectranthus za pomocí mikrovlnného extraktoru. U získaných extraktů byla provedena HPLC/DAD/ESI-MS analýza a otestována inhibice enzymu tyrosinázy. IC50 byla stanovena u standardu kyseliny kójové.

33

8. MATERIÁL A POUŽITÉ PŘÍSTROJE 8.1. ROSTLINNÝ MATERIÁL Rostliny rodu Agrimonia a Plectranthus byly nasbírány ve skleníku Farmaceutické fakulty VFU Brno a v botanické zahradě na Kraví hoře v Brně. Následně byly usušeny při stanovené teplotě.

8.2. CHEMIKÁLIE 1. Chemikálie pro extrakci: Methanol 2. Chemikálie pro HPLC: Acetonitril 0,2% kyselina mravenčí 3. Chemikálie pro stanovení inhibice tyrosinázy: Fosfátový pufr (pH 6,8) Methanolický extrakt Tyrosináza Tyrosin (substrát) Kyselina kójová (pozitivní inhibitor tyrosinázy) 4. Chemikálie pro stanovení celkového obsahu polyfenolů: Methanolický extrakt Folin-Ciocalteauovo činidlo 7,5 % uhličitan sodný 5. Chemikálie pro stanovení celkového obsahu flavonoidů: Methanolický extrakt Methanol 10 % chlorid hlinitý

34

8.3. POUŽITÉ PŘÍSTROJE Mlýnek: Concept Mikrovlnný extraktor: Start E (Milestone, Itálie) Ultrazvuková lázeň: Sonorex Digitec (Bandelin, Německo) HPLC chromatograf: HP Agilent 1100 Series DAD HPLC System (Agilent Technologies, USA), kolona SupelcosilTM ABZ+Plus, 15 cm x 4,6 mm, velikost částic 3 μm (SigmaAldrich, USA) Hmotnostní spektrometr: HP Agilent 1100 LC/MSD Trap VL Series, electrospray ionisation (Hewlett Packard, USA) Spektrofotometr: SynergyTM HT Microplate Reader (BioTek, USA)

35

9. METODY 9.1. PŘÍPRAVA ROSTLINNÉHO MATERIÁLU Usušené nadzemní části rostlin rodu Agrimonia a rodu Plectranthus byly podrobeny homogenizaci. Následně byly všechny zpracované vzorky naváženy v navážce 1 g.

9.2. EXTRAKCE Extrakce je separační (dělící) metoda, při které jsou v kontaktu dvě vzájemně nemísitelné fáze. Látky se při extrakci rozdělují na základě různé rozpustnosti v použitém rozpouštědle. Oddělení látek závisí na rozdílu rozpustností látek. Čím větší je tento rozdíl, tím ideálnější je jejich separace [47].

9.2.1. MIKROVLNNÁ EXTRAKCE (MAE) Princip mikrovlnné extrakce spočívá v zahřívání vzorků v uzavřené nádobě pomocí mikrovlnné energie za kontroly teploty i tlaku. Použití mikrovlnné energie pro zahřátí vzorků má za následek významnou redukci doby extrakce (obvykle méně než 30 minut). Naproti tomu doba běžné extrakce kapalinou (např. Soxhletova extrakce) se pohybuje v rozmezí 3-48 hodin. Další výhodou je redukce spotřeby organického rozpouštědla (většinou méně než 40 ml ve srovnání se 100 – 500 ml požadovaných pro Soxhletovu extrakci) [48]. Při extrakci bylo spotřebováno 30 ml organického rozpouštědla (methanolu) u každého vzorku. Celý proces probíhal v čase 25 minut. Samotná extrakce trvala 10 minut, kdy v 5 minutách byl výkon 500W a v 10 minutách 1000W. Extrakce probíhala při teplotě 90 °C. Tabulka IX: Výtěžky získaných extraktů Vzorek

Výtěžek [g]

Výtěžek [%]

A. eupatoria

0,04

3,80

A. coreana

0,19

19,30

A. japonica

0,19

19,40

A. procera

0,20

20,40

A. leucantha

0,16

16,40

P. forsteri ´Marginatus´

0,09

9,30

P. ciliatus

0,12

11,90

P. neochilus

0,09

9,40

P. amboinicus

0,05

4,70

P. scutellarioides ´Black Dragon´

0,13

12,50

P. scutellarioides ´Scarlet Poncho´

0,16

15,70

36

Pro následnou HPLC analýzu byly připraveny vzorky o koncentraci 10 mg/ml. Tyto vzorky byly následně filtrovány do 2 ml vialek. Pro testování biologické aktivity byly připraveny vzorky ve dvou koncentracích a to 10 mg/ml a 20 mg/ml.

9.3. HPLC ANALÝZA EXTRAKTŮ K detekci byl použit DAD detektor (diode-array detector), který patří mezi spektrofotometrické detektory. Jsou založeny na principu absorpce záření v oblasti vlnových délek od 190 nm do 800 nm [49] Tabulka X: Základní parametry analýzy HPLC Průtok

1 ml/min

Doba měření

40 minut

Post time

5 minut

Rozpouštědla

Limitní tlaky

A

0%

-

B

10 %

MeCN

C

90 %

0,2% HCOOH

D

0%

-

Maximum

400 Bar

Minimum

0 Bar

Nástřik

10 μl

Teplota kolony

40 °C Tabulka XI: Popis gradientu HPLC analýzy

1 2 3

Čas (min)

%B

%C

0,00 36,00 40,00

10,00 100,00 100,00

90,00 0,00 0,00

Průtok [ml/min] 1,00 1,00 1,00

Maximální tlak [Bar] 400 400 400

B = MeCN (acetonitril), C = 0,2% HCOOH

9.4. HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE (MS) Hmotnostní spektrometrie (MS, Mass spectrometry) je analytická separační metoda sloužící ke zjištění molekulové hmotnosti sloučeniny a k následné identifikaci struktury látky. Molekuly jsou převáděny na ionty, které se navzájem separují podle jejich podílu hmotnosti a náboje m/z. Při ionizaci molekuly dochází nejprve ke vzniku molekulárního iontu, ten se posléze rozpadá a vzniká fragmentový ion [ 50 ]. Hmotnostní spektra byla měřena v negativním módu. 37

9.5. STANOVENÍ ANTITYROSINÁZOVÉ AKTIVITY Antityrosinázová aktivita byla stanovena pomocí daného extraktu, enzymu tyrosinázy a L-tyrosinu jako substrátu. Do jedné jamky mikrodestičky bylo pipetováno 150 μl 0,1 M fosfátové pufru (pH 6,8), 10 μl extraktu, 10 μl 100 U/ml enzymu tyrosinázy, 5 minut byla směs ponechána beze změny a probíhala reakce jednotlivých složek. Poté bylo přidáno 50 μl 1,1 mM substrátu L-tyrosinu a nakonec byla mikrodestička vložena do spektrofotometru, kde byla absorbance změřena po 1 minutě při 492 nm. Jako standard byla použita kyselina kójová (prokázaný inhibitor tyrosinázy). Jako kontrola bylo použito dané rozpouštědlo methanol. Každý vzorek byl doprovázen vzorkem slepým, který neobsahoval enzym tyrosinázu. Procenta inhibice byla počítána podle následujícího vzorce: [1 – (Absorbancevzorku – Absorbanceslepého vzorku) / (Absorbancekontroly)] x 100. Výsledky tohoto stanovení jsou shrnuty v 10. kapitole – Výsledky a diskuze.

9.6. STANOVENÍ CELKOVÉHO OBSAHU POLYFENOLŮ A FLAVONOIDŮ METHANOLICKÝCH EXTRAKTŮ Celkový obsah polyfenolů byl stanoven pomocí daného extraktu, Folin-Ciocalteauova činidla a 7,5 % uhličitanu sodného. Každá jamka obsahovala 10 μl daného extraktu, 10 μl Folin-Ciocalteauova činidla a 300 μl 7,5 % uhličitanu sodného. Po 5 minutách, kdy probíhala reakce jednotlivých složek mezi sebou, byla následně měřena absorbance při 760 nm. Celkový obsah flavonoidů byl stanoven podobným způsobem, jen za použití odlišné reakční směsi. Bylo pipetováno 100 μl daného extraktu, 900 μl MeOH a 20 μl 10 % chloridu hlinitého. Chlorid hlinitý zde působil jako komplexotvorné činidlo, jelikož flavonoidy s hlinitými ionty vytváří komplexy, které pak vyzařují fluorescenční záření. Před měřením absorbance, která byla měřena při 425 nm, se reakční směs ponechala 30 minut beze změny, kdy mezi sebou jednotlivé složky reagovaly. Celkový obsah polyfenolů byl počítán podle rovnice kalibrační křivky (y = 0,1689x + 0,0215, R2 = 0,9867). Jako standard byla použita kyselina gallová. Celkový obsah polyfenolů byl uváděn jako ekvivalenty kyseliny gallové (GAE). Podobně byl počítán celkový obsah flavonoidů a to podle rovnice kalibrační křivky (y = 0,0465x + 0,0049, R2 = 0,9913). Zde byl jako standard použit kvercetin. Výsledky byly uváděny jako ekvivalenty kvercetinu (QUE). Výsledky těchto stanovení jsou taktéž shrnuty v 10. kapitole – Výsledky a diskuze.

38

10. VÝSLEDKY A DISKUZE Ze zkoumaných jedenácti druhů rostlin rodu Agrimonia a Plectranthus byly získány methanolické extrakty, které byly dále podrobeny HPLC-DAD analýze. Chromatogramy byly vyhodnoceny při vlnové délce 280 nm. Dále byla u zkoumaných extraktů provedena LC-MS analýza, stanovení antityrosinázové aktivity, stanovení celkového obsahu polyfenolů a flavonoidů a stanovení IC50 u standardu kyseliny kójové.

10.1. VYHODNOCENÍ HPLC-DAD A LC-MS ANALÝZ U ROSTLIN RODU AGRIMONIA První pětice chromatogramů z rostlin rodu Agrimonia ukázala tři majoritní látky u všech získaných extraktů. Látka č. 1 s retenčním časem 1,6 min, látka č. 2 s retenčním časem 8,3 – 8,6 min a látka č. 3 s retenčním časem 14,2 min. Na následujících stránkách jsou mezi sebou porovnány a shrnuty všechny obsahové látky jednotlivých extraktů z rostlin rodu Agrimonia.

10.1.1. POROVNÁNÍ JEDNOTLIVÝCH EXTRAKTŮ ROSTLIN RODU AGRIMONIA Jak už bylo zmíněno dříve, všechny získané extrakty obsahují tři majoritní obsahové látky. Látka č. 1 s retenčním časem 1,6 min, látka č. 2 s retenčním časem 8,3 – 8,6 min a látka č. 3 s retenčním časem 14,2 min. U asijských druhů A. japonica a A. coreana byly identifikovány další dvě různé obsahové látky. Látka č. 4 s retenčním časem 7,2 min a látka č. 5 s retenčním časem 13,3 min (tuto látku obsahovaly ve větší míře také A. procera a A. leucantha). A. eupatoria a A. leucantha měly společné dvě obsahové látky s retenčními časy 9,2 min a 16,7 min (látka č. 6 a látka č. 7). A. eupatoria navíc obsahovala látku č. 8 s retenčním časem 7,9 min. A. leucantha a A. procera se vyjímaly společnými látkami s retenčními časy 10,5 a 21,4 min (látka č. 9 a látka č. 10). Tabulka XII: Identifikované látky z methanolických extraktů rostlin rodu Agrimonia Rt (min)

λmax (nm)

[M-H]-

Identifikovaná sloučenina

Látka č. 1

1,6

210, 225, 275

577

Procyanidin dimer

Látka č. 2

8,3 – 8,6

200, 260, 360

609

Rutin

Látka č. 3

14,2

210,230, 270, 320

593

Kaempferol-O-rutinosid

Látka č. 4

7,2

205, 230, 295

467

-

Látka č. 5

13,3

210, 220, 270, 340

447

Kaempferol-hexosid

Látka č. 6

9,2

210, 260, 350

463

Látka č. 7

16,7

210, 230, 270, 320

635

Látka č. 8

7,9

220, 270, 340

431

Kvercetin-3-O-β-D-glukosid Kaempferol-O-hexosid-Odeoxypentosid acylovaný kyselinou kumarovou Apigenin-glukosid (vitexin)

Látka č. 9

10,5

210, 275, 350

447

Látka č. 10

21,4

200, 290

477 39

Kaempferol-3-O-glukosid (astragalin) -

Všechny extrakty byly po analýze HPLC podrobeny MS analýze pro zjištění molekulových hmotností obsahových látek a jejich fragmentace. Hmotnostní spektra sloučenin, které byly získány touto analýzou, byly porovnány se spektry látek z knihovny spekter a s údaji v literatuře. Podle získaných výsledků se u měřených extraktů vyskytovaly různé majoritní látky. Avšak u všech extraktů se nacházely tři společné majoritní obsahové látky. Výsledky LC-MS ukazují, že látka č. 1 (Rt 1,6 min), jejíž fragment má molekulovou hmotnost 577, by mohla být ze skupiny proanthokyanidinů (tzv. kondenzovaných taninů). Mohlo by se jednat o látku např. epikatechin-(4β8)-katechin, nebo o katechin-(4β8)-katechin. Tyto látky byly již dříve identifikovány u druhu A eupatoria [20]. U látky č. 2 (Rt 8,3 – 8,6 min) by se mohlo s jistotou jednat o rutin (=rutoside, Mr 610,5). Tento bioflavonoidní glykosid byl izolován v druzích rodu Agrimonia (např. A. eupatoria [20], A. pilosa [51].) Látka č. 3 (Rt 14,2 min): tato obsahová látka by mohla být kaempferol-O-rutinosid (Mr 594,5), který byl již také dříve izolován z druhu A. eupatoria [20]. Látka č. 4 (Rt 7,2 min) je majoritní látkou obsaženou u asijských druhů A. coreana a A. japonica. Podle její fragmentace by se mohlo jednat o substituovaný kaempferol nebo luteolin. Avšak v literatuře nebyla nalezena žádná shoda. Látka č. 5 (13,3 min) by mohla být přiřazena kaempferol-O-hexosidu (Mr 448,3). Může se zde jednat o kaempferol-O-galaktosid či jiný hexosid. Přesné určení struktury látky jen podle MS spektra bohužel není možné. Látka č. 6 (Rt 9,2 min) by mohla být popsána jako kvercetin-3-β-D-glukosid (Mr 464,3), jehož strukturu potvrzuje i získané DAD-spektrum látky. Tato látka byla již dříve identifikována v rostlině druhu A. eupatoria [20]. Látka č. 7 (Rt 16,7 min), jejíž fragment má molekulovou hmotnost 635, by mohla být kaempferol-Ohexosid-O-deoxypentosid acylovaný kyselinou kumarovou. Přesnou strukturu látky není možné určit, jelikož nemáme srovnání s UV spektrem standardu. Látka č. 8 (Rt 7,9 min) byla určena jako apigenin-C-glukosid (=vitexin, Mr 432,3). Látka č. 9 (Rt 10,5 min) byla identifikována jako kaempferol-3-O-glukosidu (=astragalin, Mr 448,3). Tyto látky (č. 8 a č. 9) mohly být srovnány i s danými DAD-spektry, které potvrdily dané struktury. A v porovnání s literaturou byly tyto látky již identifikovány v rostlinách druhu A. eupatoria [20, 52 ]. U látky č. 10 (Rt 21,4 min) nebyla v literatuře nalezena shoda a ani její fragmentace nenapovídá, o jakou obsahovou látku by mohlo jít. Dále jsou uvedeny získané chromatogramy a DAD-spektra jednotlivých extraktů.

40

1. Agrimonia eupatoria Chromatogram a DAD-spektra jednotlivých píků:

2. Agrimonia coreana Chromatogram a DAD-spektra jednotlivých píků:

41

3. Agrimonia japonica Chromatogram a DAD-spektra jednotlivých píků:

4. Agrimonia procera Chromatogram a DAD-spektra jednotlivých píků:

42

5. Agrimonia leucantha Chromatogram a DAD-spektra jednotlivých píků:

10.2. VYHODNOCENÍ HPLC-DAD A LC-MS ANALÝZ U ROSTLIN RODU PLECTRANTHUS Na následujících stránkách jsou mezi sebou porovnány a shrnuty všechny obsahové látky jednotlivých extraktů z rostlin rodu Plectranthus.

10.2.1. POROVNÁNÍ JEDNOTLIVÝCH EXTRAKTŮ ROSTLIN RODU PLECTRANTHUS Všechny extrakty obsahovaly dvě společné majoritní látky. Látku č. 1 s retenčním časem 7,1 min a látku č. 2 s retenčním časem 12,8 – 13,3 min. U každého extraktu byly prokázány další obsahové látky. U druhu P. amboinicus to byla látka s retenčním časem 18,1 min (látka č. 3). U druhu P. ciliatus byla obsažena látka s retenčním časem 8,02 min (látka č. 4). Druh P. forsteri 'Marginatus' obsahoval látku s retenčním časem 20,9 min (látka č. 5) a látku s retenčním časem 24,5 min (látka č. 6). Druh P. neochilus prokázal další dvě obsahové látky s retenčními časy 17,05 min (látka č. 7) a 21,6 min (látka č. 8). Extrakt druhu P. scutellarioides 'Black Dragon' se vyznačoval třemi dalšími majoritními látkami s retenčními časy 9,5 min (látka č. 9), 13,1 min (látka č. 10) a 16,6 min (látka č. 11). Poslední druh P. scutellarioides 'Scarlet Poncho' obsahoval jednu další látku s retenčním časem 8,3 min (látka č. 12). 43

Tabulka XIII: Identifikované látky z methanolických extraktů rostlin rodu Plectranthus

Látka č. 1

Rt (min) 7,1

λmax (nm) 240, 320

[M-H]179

Identifikovaná sloučenina Kyselina kávová

Látka č. 2

12,8 – 13,3

330

359

Kyselina rozmarýnová

Látka č. 3

18,1

210, 285, 340

313

Cirsimaritin

Látka č. 4

8,02

210, 230, 290, 520

593

Cyanidin-rutinosid

Látka č. 5

20,9

210, 275

347

6,7-dihydroxyroyleanon

Látka č. 6

24,5

210, 275

389

6-hydroxy-7-acetoxyroyleanon

Látka č. 7

17,05

210, 235

447

-

Látka č. 8

21,6

210, 390

477

-

Látka č. 9

9,5

210, 230, 290, 520

755

Látka č. 10

13,1

200, 265, 340

445

Cyanidin-3,5-O-diglukosid acylovaný kyselinou p-kumarovou Apigenin-glukuronid

Látka č. 11

16,6

200, 265, 340

487

Apigenin-acetylglukuronid

Látka č. 12

8,3

210, 340

447

Luteolin-hexosid

Všechny extrakty byly po analýze HPLC podrobeny MS analýze pro zjištění molekulových hmotností obsahových látek a jejich fragmentace. Hmotnostní spektra sloučenin, byly porovnány s údaji v literatuře. Jak u pěti extraktů z rostlin rodu Agrimonia, tak u šesti získaných extraktů z rostlin rodu Plectranthus se vyskytovaly různé majoritní obsahové látky. U všech extraktů byly nalezeny dvě společné majoritní látky. Dále se obsahové látky extrakt od extraktu lišily. Výsledky LC-MS ukazují, že látka č. 1 (Rt 7,1 min) je kyselina kávová (Mr 180,1), která je běžně vyskytující se sloučeninou u rostlin rodu Plectranthus [18]. Látkou č. 2 (Rt 12,8 – 13,3 min) je kyselina rozmarýnová (Mr 360,3), která je další velice běžnou sloučeninou u rodu Plectranthus [18]. Látka č. 3 (Rt 18,1 min) by mohla být určena jako cirsimaritin (Mr 314,2), nicméně chybí srovnání se standardem. Tento flavonoid patřící do podskupiny flavonů byl identifikován v mnoha druzích rodu Plectranthus (např. P. hadiensis, P. crassus, P. barbatus, P. montanus atd.) [53]. Látka č. 4 (Rt 8,02 min) by se mohla řadit do skupiny anthokyanů, které jsou glukosidy anthokyanidinů. Mohlo by se jednat o cyanidin-O-rutinosid (Mr 594). Tato možnost byla usouzena díky HPLC-DAD spektru této látky, která má maximum v 520 nm a podle údajů v literatuře je toto maximum význačné právě pro tuto skupinu látek [54]. Látka č. 5 (Rt 20,9 min), jejíž molekulová hmotnost fragmentu je 347. Tato látka by mohla být identifikována jako 6,7-dihydroxyroyleanon (Mr 348,8). Látka č. 6 (Rt 24,5 min) by mohla být 6-hydroxy-7-acetoxyroyleanon. Tyto dvě látky již byly nalezeny u druhu P. forsteri 'Marginatus'[18]. Látka č. 7 (Rt 17,05 min) a látka č. 8 (Rt 21,6 min) mají molekulové hmotnosti fragmentů 447 a 477. U těchto látek nebyla v literatuře nalezena žádná shoda a ani jejich fragmentace příliš nenapovídá, o jaké látky by se v tomto případě mohlo jednat. Látka č. 9 (Rt 9,5 min) by mohla být určena jako anthokyan a to cyanidin-3,5-Odiglukosid acylovaný kyselinou p-kumarovou. Její HPLC-DAD spektrum má opět maximum v 520 nm. Látka č. 10 (Rt 13,1 min) byla určena jako apigenin-7-O-glukuronid (Mr 446). Její strukturu potvrzuje i dané DAD-spektrum látky. Tato látka byla také identifikována již dříve v rostlinách rodu Plectranthus [ 55 ]. Látkou č. 11 (Rt 16,6 min) by mohl s velkou 44

pravděpodobností být podle fragmentace apigenin s acetylovanou kyselinou glukuronovou (Mr 488) [56]. U látky č. 12 (Rt 8,3 min) by se mohlo jednat o luteolin-O-hexosid. Tuto skutečnost potvrzují i nalezené údaje v literatuře [57]. Dále jsou uvedeny získané chromatogramy a DAD-spektra jednotlivých extraktů.

1. Plectranthus forsteri 'Marginatus' Chromatogram a DAD-spektra jednotlivých píků:

2. Plectranthus ciliatus Chromatogram a DAD-spektra jednotlivých píků:

45

3. Plectranthus neochilus Chromatogram a DAD-spektra jednotlivých píků:

4. Plectranthus amboinicus Chromatogram a DAD-spektra jednotlivých píků:

46

5. Plectranthus scutellarioides 'Black dragon' Chromatogram a DAD-spektra jednotlivých píků:

6. Plectranthus scutellarioides 'Scarlet Poncho' Chromatogram a DAD-spektra jednotlivých píků:

47

10.3. VÝSLEDNÁ ANTITYROSINÁZOVÁ AKTIVITA Tabulka XIV: Antityrosinázová aktivita Antityrosinázová aktivita (%)

Druh

500 μg/ml

1000 μg/ml

1

A. eupatoria

16,6 ± 0,6

69,3 ± 1,6

2

A. coreana

17,9 ± 1,1

66,1 ± 1,7

3

A. japonica

14,5 ± 3,7

54,8 ± 1,1

4

A. procera

16,5 ± 3,3

76,9 ± 1,4

5

A. leucantha

11,4 ± 2,8

70,8 ± 1,6

6

P. forsteri 'Marginatus'

24,3 ± 2,7

71,6 ± 1,6

7

P. ciliatus

22,6 ± 4,6

27,9 ± 1,9

8

P. neochilus

21,8 ± 3,7

45,8 ± 1,7

9

P. amboinicus

29,6 ± 2,1

60,0 ± 3,3

10

P. scutellarioides 'Black Dragon'

5,9 ± 0,4

25,3 ± 0,7

11

P. scutellarioides 'Scarlet Poncho'

21,9 ± 1,8

NA

12

Kyselina kójová (50 g/ml)

95,4 ± 1,00

-

Stanovení antityrosinázové aktivity ukázalo, že tyto rostliny jsou efektivními inhibitory tohoto enzymu. Tuto skutečnost potvrzují i dostupné údaje v literatuře, kde byla například zkoumána antityrosinázová aktivita u rostlin rodu Scutellaria (čeleď Lamiaceae). Nejvyšší naměřená inhibiční aktivita enzymu tyrosinázy se pohybovala kolem 52 % ve stejné koncentraci [ 58 ]. Naše měření dokázalo nejvyšší antityrosinázovou aktivitu u druhu A. procera a to 76 %. Dále to byly druhy A. eupatoria, A. leucantha a P. forsteri 'Marginatus', které prokázaly inhibiční aktivitu okolo 70 %. Jako standard u tohoto stanovení byla použita kyselina kójová, která se prokázala inhibici 95 % v koncentraci 50 g/ml.

48

10.4. CELKOVÝ OBSAH POLYFENOLŮ A FLAVONOIDŮ Tabulka XV: Celkový obsah polyfenolů Druh

Polyfenoly [mg/g extrakt GAE]

1

A. eupatoria

310,2 ± 2,9

2

A. coreana

136,2 ± 2,1

3

A. japonica

169,3 ± 2,1

4

A. procera

256,1 ± 2,9

5

A. leucantha

125,2 ± 1,6

6

P. forsteri 'Marginatus'

81,1 ± 1,3

7

P. ciliatus

242,2 ± 1,3

8

P. neochilus

71,5 ± 2,9

9

P. amboinicus

134,5 ± 2,7

10

P. scutellarioides 'Black Dragon'

56,2 ± 2,7

11

P. scutellarioides 'Scarlet Poncho'

231,5 ± 0,4

Tabulka XVI: Celkový obsah flavonoidů Druh

Flavonoidy [mg/g extrakt QUE]

1

A. eupatoria

45,9 ± 1,1

2

A. coreana

22,9 ± 0,3

3

A. japonica

17,8 ± 0,2

4

A. procera

34,4 ± 2,1

5

A. leucantha

19,1 ± 0,5

6

P. forsteri 'Marginatus'

13,5 ± 0,6

7

P. ciliatus

12,1 ± 0,4

8

P. neochilus

9,7 ± 0,3

9

P. amboinicus

13,3 ± 0,6

10

P. scutellarioides 'Black Dragon'

34,9 ± 0,02

11

P. scutellarioides 'Scarlet Poncho'

33,8 ± 1,7

49

Účinnými inhibitory ze skupiny polyfenolů se ukázaly být flavonoidy jako například kaempferol, kvercetin, luteolin-glukosid. Dalšími prokázanými inhibitory ze skupiny polyfenolů jsou kyselina kumarová, kyselina gallová a její deriváty [45]. Nejvyšší obsah polyfenolů i flavonoidů podle konečných výsledků obsahoval druh A. eupatoria (polyfenolů 310,2 mg/g extraktu a flavonoidů 45,9 mg/g extraktu). Právě díky obsahu těchto sloučenin je tato rostlina hojně využívána pro své antioxidační a další léčivé účinky již celá staletí. Tento druh se prokázal 69% inhibiční aktivitou. U tohoto druhu byly identifikovány deriváty kaempferolu a kvercetinu. S velkou pravděpodobností se právě díky těmto látkám u něj prokázala vysoká antityrosinázová aktivita. Dalšími druhy, které se vyznačovaly vysokou inhibiční aktivitou, byly druhy A. procera, A. leucantha a P. forsteri 'Marginatus'. U druhu A. procera byl stanoven druhý nejvyšší obsah polyfenolů a flavonoidů a byly u něj identifikovány různé deriváty kaempferolu, stejně tak byly identifikovány i u druhu A. leucantha, což se projevuje v jejich vysoké inhibiční aktivitě. U druhu P. forsteri 'Marginatus' nebylo dokázáno vysoké množství polyfenolů a flavonoidů, stejně tak u druhu P. amboinicus. Prokázaly však 71,6% a 60% inhibiční aktivitu Tyto druhy se tedy mohou považovat za nejperspektivnější, jelikož musí obsahovat i další zajímavé obsahové látky, které inhibují enzym tyrosinázu. Na druhou stranu další druhy z rodu Plectranthus, např. P. scutellarioides 'Scarlet Poncho' a P. ciliatus obsahovaly vyšší množství polyfenolů, ale jejich antityrosinázová aktivita byla jen 21 % a 27 %. Z toho můžeme usoudit, že tyto druhy obsahovaly zejména látky ze skupiny polyfenolů, které neinhibují enzym tyrozinázu, např. kyselinu kávovou a rozmarýnovou. U standardu kyseliny kójové byla stanovena hodnota IC50 dle kalibrační křivky 47,3 ± 1,6 μM. Tento výsledek odpovídá dostupným údajům v literatuře [59, 60].

50

11. ZÁVĚR Tato práce byla zaměřena na přípravu extraktů z rostlin rodu Agrimonia a Plectranthus a byla provedena jejich fytochemická analýza. Analýza byla realizována pomocí HPLC-DAD a LC-MS. Výsledky těchto analýz byly srovnány s knihovnou spekter a s údaji v literatuře. U rostlin rodu Agrimonia byly nalezeny deriváty kaempferolu, apigeninu, kvercetinu a luteolinu. Byly zjištěny majoritní látky jako rutin, kaempferol-O-rutinosid, kvercetin-3-Oglukosid. U druhé skupiny rostlin rodu Plectranthus byly obsaženy hlavně kyselina rozmarýnová a kyselina kávová. V rámci práce bylo také provedeno stanovení antityrosinázové aktivity. Byl zjištěn celkový obsah polyfenolů a flavonoidů v rostlinných extraktech. Z výsledků vyplývá, že zkoumané rostliny jsou efektivními inhibitory enzymu tyrosinázy. U rostlin druhu Agrimonia za tuto aktivitu odpovídají zejména flavonoidy. Některé rostliny rodu Plectranthus se však zdají být perspektivnější, zejména P. forsteri 'Marginatus' a P. amboinicus budou podrobeny dalšímu zkoumání s cílem zjistit, které látky jsou zodpovědné za inhibiční aktivitu.

51

12. SUMMARY This thesis was focussed on preparation of extracts from plants of Agrimonia and Plectranthus genus and also fytochemical analysis was made. The analysis was done using HPLC-DAD and LC-MS. Results were compared with spectral library and literature data. In extracts of plants of Agrimonia genus were detected derivatives of kaempferol, apigenin, quercetin and luteolin. Major substances like rutin, kaempferol-O-rutinoside, quercetin-3-O-glucoside were found in extracts. In the other group of plants, plants of Plectranthus genus, were contained substances especially rosmarinic acid and caffeic acid. Within this work also the determination of antityrosinase activity was determined. Further the determination of total polyphenolic substances and flavonoids was made. The results showed that researched plants are effective inhibitors of tyrosinase. In plants of Agrimonia genus flavonoids are responsible for this inhibitory activity. However some of plants of Plectranthus genus seem to be more perspective than plants from Agrimonia genus. Especially P. forsteri 'Marginatus' a P. amboinicus. These two species will be further examined to determine which substances are responsible for the inhibitory activity.

52

13. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY [1]

[2]

[3] [4]

[5]

[6]

[7]

[8]

[9]

[10]

[11]

[12] [13] [14]

[15]

SYTSMA, KENNETH, J.. Rosales. In: britannica.com [online]. c2014 [cit. 2014-01-28]. Dostupné z: http://www.britannica.com/EBchecked/topic/509631/Rosales/72916/Distributi on-and-abundance#ref595511 WLODZIMIERZ. Map-Rosaceae. PNG. In: wikimedia.org [online]. 2006 [cit. 2014-01-28]. Dostupné z: http://commons.wikimedia.org/wiki/File:MapRosaceae.PNG ROSACEAE – The Rose Family. In: theseedsite.co.uk [online]. 2013 [cit. 2014-01-29]. Dostupné z: http://theseedsite.co.uk/rosaceae.html KINCL, LUBOMÍR, MILOSLAV KINCL A JANA JAKRLOVÁ. Biologie rostlin: pro 1. ročník gymnázií. 4., přeprac. vyd. Praha: Fortuna, 2006, 304 s. ISBN 80-7168-947-5, s. 199. BURNIE, GEOFFREY et al. Botanika: ilustrovaný abecední atlas 10 000 zahradních rostlin s návodem, jak je pěstovat. 1. vyd. [Praha]: Slovart, 2007. 1020 s. ISBN 978-80-7209-936-8, s. 69. THE EDITORS OF ENCYCLOPÆDIA BRITANNICA. Agrimony. In: britannica.com [online]. c2014 [cit. 2014-01-29]. Dostupné z: http://www.britannica.com/EBchecked/topic/9772/agrimony KOVÁŘ, LADISLAV. AGRIMONIA EUPATORIA L. – řepík lékařský / repík lekársky. In: botany.cz [online]. 2007-2014 [cit. 2014-01-30]. Dostupné z: http://botany.cz/cs/agrimonia-eupatoria/ 3. Agrimonia coreana Nakai, Rep. Veg. Diamond Mount. 71. 1918. In: efloras.org [online]. Missouri Botanical Garden, St. Louis, MO & Harvard University Herbaria, Cambridge, MA [cit. 2014-01-30]. Dostupné z: http://www.efloras.org/florataxon.aspx?flora_id=2&taxon_id=200010595 Institut (Akademiia nauk SSSR)., B.; tirgume ha-mada ha Yisreeli., M. & Institution., S. Flora of the U.S.S.R. Springfield, Va.: Israel Program for Scientific Translations; 1968, v. 10, 560 s., s. 313, 314. Fragrant Agrimony. In: luontoportti.com [online]. c2014 [cit. 2014-01-30]. Dostupné z: http://www.luontoportti.com/suomi/en/kukkakasvit/fragrantagrimony PAMPLONA ROGER, JORGE D. Encyklopedie léčivých rostlin. Vyd. 1. Praha: Advent-Orion, 2008. 385 s. Zdraví pro třetí tisíciletí; 3. New start. ISBN 978-80-7172-119-2, s. 101. VALÍČEK, PAVEL. Léčivé rostliny Číny a Vietnamu. 1. vyd. Benešov: Start, 2009-2010. 2 sv. ISBN 978-80-86231-48-8, s. 39. KOCIÁN, P. Lamiaceae - Hluchavkovité. In: kvetenacr.cz [online]. 2003-2013 [cit. 2014-01-30]. Dostupné z: http://www.kvetenacr.cz/celed.asp?IDceled=6 WOLFF, JÜRGEN, ed. a THROLL-KELLER, ANGELIKA, ed. Encyklopedie zahradních rostlin: moje krásná zahrada. 1. vyd. Praha: Fortuna Libri, ©2008. 289 s. ISBN 978-80-7321-375-6, s. 268, 269. WIKIPEDIA CONTRIBUTORS. Plectranthus amboinicus. In: en.wikipedia.org [online]. 2013 [cit. 2014-02-03]. Dostupné z: http://en.wikipedia.org/wiki/Plectranthus_amboinicus

53

[16]

[17]

[18]

[19]

[20]

[21]

[22]

[23]

[24]

[25]

[26]

[27] [28]

[29] [30]

Plectranthus scutellarioides. In: en.hortipedia.com [online]. 2014 [cit. 2014-02-04]. Dostupné z: http://en.hortipedia.com/wiki/Plectranthus_scutellarioides SIMOẽS, M. F., RIJO, P., DUARTE, A., BARBOSA, D., MATIAS, D., DELGADO, J., CIRILO, N., RODRÍGUEZ, B. Two new diterpenoids from Plectranthus species. Phytochemistry Letters 2010, 3: 221-225. KUBÍNOVÁ, R., ŠVAJDLENKA E., SCHNEIDEROVÁ, K., HANÁKOVÁ, Z., DALL’ACQUA S., FARSA, O. Polyphenols and diterpenoids from Plectranthus forsteri 'Marginatus'. Biochemical Systematics and Ecology 2013, 49: 39-42. ŠAFARČÍKOVÁ, SIMONA. Obsahové látky léčivých rostlin. In: labyrint.ametyst21.cz [online]. c2014 [cit. 2014-02-10]. Dostupné z: http://labyrint.ametyst21.cz/index.php/inspirace/tematicke/136-obsahove-latkyleivych-rostlin CORREIA, H., GONZÁLEZ-PARAMÁS, A., AMARAL, M. T., SANTOSBUELGA, C., BATISTA, M. T. Polyphenolic profile characterization of Agrimonia eupatoria L. by HPLC with different detection devices. Biomed. Chromatog. 2006, 20: 88-94. WINKEL-SHIRLEY, B.. Flavonoid Biosynthesis. A Colorful Model for Genetics, Biochemistry, Cell Biology, and Biotechnology. Plant Physiol. 2001, 126: 485-493. Quercetin – Compound Summary. In: nih.gov [online]. [cit. 2014-03-09]. Dostupné z: http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/summary/summary.cgi?cid=5280343&loc=ec _rcs Kaempferol – Compound Summary. In: nih.gov [online]. [cit. 2014-03-09]. Dostupné z: http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/summary/summary.cgi?cid=5280863&loc=ec _rcs Apigenin – Compound Summary. In: nih.gov [online]. [cit. 2014-03-25]. Dostupné z: http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/summary/summary.cgi?cid=5280443 Luteolin – Compound Summary. In: nih.gov [online]. [cit. 2014-03-25]. Dostupné z: http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/summary/summary.cgi?cid=5280445 ROMANI, A., CAMPO, M., PINELLI, P. HPLC/DAD/ESI-MS analyses and anti-radical activity of hydrolyzable tannins from different vegetal species. Food Chemistry 2012, 130: 214-221. WIKIPEDIA CONTRIBUTORS. Tannic Acid. In: en.wikipedia.org [online]. 2014 [cit. 2014-03-25]. Dostupné z: http://en.wikipedia.org/wiki/Tannic_acid HAGERMAN, A. E. Condensed Tannin Structural Chemistry. In: users.muohio.edu [online]. 2002 [cit. 2014-03-11]. Dostupné z: http://www.users.muohio.edu/hagermae/Condensed%20Tannin%20Structural %20Chemistry.pdf BENEŠOVÁ, MARIKA A SATRAPOVÁ, HANA, ed. Odmaturuj! z chemie. Vyd. 1. Brno: Didaktis, 2002. 208 s. ISBN 80-86285-56-1, s. 177. SEIGLER, D. S. Plant secondary metabolism. New York: Kluwer Academic Publishers, 1998. 756 s. ISBN: 978-1-4615-4913-0. s. 345, 367, 370, 371, 372.

54

[31]

[32]

[33]

[34] [35]

[36] [37]

[38] [39] [40]

[41]

[42]

[43]

[44]

[45] [46] [47]

RIJO, P., GASPAR-MARQUES, C., SIMOẽS, M. F., JIMENO, M. L., RODRIGUÉZ, B. Further diterpenoids from Plectranthus ornatus and P. grandidentatus. Biochemical Systematics and Ecology, 2007, 35: 215-221. Kabouche, A., Kabouche, Z., Öztürk, M., Kolak, U., Topçu, G. Antioxidant abietane diterpenoids from Salvia barrelieri. Food chemistry, 2007, 102: 12811287. Caffeic acid – Compound Summary. In: nih.gov [online]. [cit. 2014-03-12]. Dostupné z: http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/summary/summary.cgi?cid=689043&loc=ec_ rcs PETERSEN, M., SIMMONDS, M. S. Rosmarinic acid. Phytochemistry, 2003, 62 (2): 121-125. Rosemarinic acid – Compound Summary. In: nih.gov [online]. [cit. 2014-0312]. Dostupné z: http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/summary/summary.cgi?cid=5315615 SYMONOWICZ, M., KOLANEK, M. Flavonoids and thein properties to form chelate complexes. Biotechnol. Food. Sci. 2012, 76 (1): 35-41. Terpenes and their Derivatives. In: vcampus.uom.ac.mu [online]. [cit. 2014-03-13]. Dostupné z: http://vcampus.uom.ac.mu/upload/public/2003122103128.pdf EHRLICH, S. D. Quercetin. In: umm.edu [online]. 2011 [cit. 2014-03-13]. Dostupné z: http://umm.edu/health/medical/altmed/supplement/quercetin ŠÁCHA, P., ŠÁCHOVÁ P. Rutin. In: celostnimedicina.cz [online]. 2012 [cit. 2014-03-13]. Dostupné z: http://www.celostnimedicina.cz/rutin.htm CALDERÓN-MONTANO, J. M., BURGOS-MORÓN, E., PÉREZGUERRERO, C., LÓPEZ-LÁZARO, M. A review on the dietary flavonoid kaempferol. Mini Rev. Med. Chem. 2011, 11 (4): 298-344. LIN, Y., SHI, R., WANG, X., SHEN, H. M. Luteolin, a flavonoid with potential for cancer prevention and therapy. Curr Cancer Drug Targets, 2008, 8 (7): 634-646. SAHELIAN, R. Apigenin flavonoid health benefit and research use in cancer and leukemia. In: raysahelian.com [online]. 2014 [cit. 2014-03-14]. Dostupné z: http://www.raysahelian.com/apigenin.html SHEKARCHI, M., HAJIMEHDIPOOR, H., SAEIDNIA, S., GOHARI, A. R., HAMEDANI, M. P. Comparative study of rosmarinic acid content in some plants of Labiatea family. Pharmacogn. Mag. 2012, 8 (29): 37-41. TRNA, J., TÁBORSKÁ, E. Přírodní polyfenolové antioxidanty. In: med.muni.cz [online]. [cit. 2014-03-14]. Dostupné z: http://www.med.muni.cz/biochem/seminare/prirantiox.rtf SEO, S. Y., SHARMA, V. K., SHARMA, N. Mushroom Tyrosinase: Recent Prospects. J. Agric. Food Chem., 2003, 51: 2837-2853. CHANG, T. M. Tyrosinase and Tyrosinase Inhibitors. J. Biocatal. Biotransformation, 2012, 1:2. MOTYKA, KAMIL A HLAVÁČ, JAN. Stručný přehled separačních metod. 1. vyd. Olomouc: Univerzita Palackého v Olomouci, 2009. 45 s. Studijní texty. ISBN 978-80-244-2304-3, s. 7

55

[48]

[49]

[50] [51]

[52]

[53]

[54]

[55]

[56]

[57]

[58]

[59]

[60]

LIU, E. H., QI, L. W., CAO, J., LI, C. Y., PENG, Y. B. Advances of Modern Chromatographic and Electrophoretic Methods in Separation and Analysis of Flavonoids. Molecules, 2008, 13 (10): 2521-2544. NOVÁKOVÁ, LUCIE A KOL. Moderní HPLC separace v teorii a praxi. 1. vyd. Praha [i.e. Hradec Králové]: Lucie Nováková, 2013. 2 sv. (299, 235 s.). ISBN 978-80-260-4243-3. s. 11, 12. KLOUDA, PAVEL. Moderní analytické metody. 2., upr. a dopl. vyd. Ostrava: Pavel Klouda, 2003. 132 s. ISBN 80-86369-07-2. s. 50. KIM, J.-J., JIANG, J., SHIM, D.-W., KWON S.-C., KIM, T.-J., YE, S.-K., KIM, M.-K., SHIN, Y.-K., KOPPULA, S., KANG, T.-B., CHOI, D.-K., LEE, K.-H. Anti-inflammatory and anti-allergic effects of Agrimonia pilosa Ledeb extract on murine cell lines and OVA-induced airway inflammation. Journal of Ethnopharmacology, 2012, 140: 213–221. LEE, K. Y., HWANG, L., JEONG, E. J., KIM, S. H., KIM, Y. C., SUNG, S. H. Effect of Neuroprotective Flavonoids of Agrimonia eupatoria on Glutamate-Induced Oxidative Injury to HT22 Hippocampal Cells. Biosci. Biotechnol. Biochem. 2010, 74 (8): 1704 – 1706. GRAYER, R. J., ECKERT, M. R., LEVER A., VEITCH N. C., KITE, G. C., PATON, A. J. Distribution of exudate flavonoids in the genus Plectranthus. Biochemical Systematics and Ecology, 2010, 38: 335 – 341. FUKUCHI-MIZUTANI, M., OKUHARA, H., FUKUI, Y., NAKAO, M., KATSUMOTO, Y.,YONEKURA-SAKAKIBARA, K., KUSUMI, T., HASE, T., TANAKA, Y. Biochemical and Molecular Characterization of a Novel UDP-Glucose:Anthocyanin 3'-O-Glucosyltransferase, a Key Enzyme for Blue Anthocyanin Biosynthesis, from Gentian. Plant Physiology, 2003, 132 (3): 1652 – 1663. PORFÍRIO, S., FALÉ, P. L. V., MADEIRA, P. J. A., FLORĘNCIO, M, H., ASCENSĂO, L., SERRALHEIRO, M. L. M. Antiacetylcholinesterase and antioxidant activities of Plectranthus barbatus tea, after in vitro gastrointestinal metabolism. Food Chemistry, 2010, 122: 179-187. CUDRÁKOVÁ, MIROSLAVA. Fytochemický profil, biologická aktivita a izolácia obsahových látok Plectranthus scutellarioides. Diplomová práce, 2014, VFU Brno. THOMAS S. C. LI, PH.D. Taiwanese Native Medicinal Plants. Phytopharmacology and Therapeutic Values. Taylor & Francis Group, s. 334, 2006. s. 27. ŞENOL, F. S., ORHAN, I., YILMAZ, G., ÇIÇEK, M., ŞENER, B. Acetylcholinesterase, butylcholinesterase, and tyrosinase inhibition studies and antioxidant activities of 33 Scutellaria L. taxa from Turkey. Food and Chemical Toxicology, 2010, 48: 781 – 788. KANG, S. S., KIM, H. J., JIN, C., LEE, Y. S. Synthesis of tyrosinase inhibitory (4-oxo-4H-pyran-2-yl)acrylic acid ester derivatives. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2009, 19: 188 – 191. KOBAYASHI, Y., KAYAHARA, H., TADASA, K., TANAKA, H. Synthesis of N-kojic-amino acid and N-kojic-amino acid-kojiate and their tyrosinase inhibitory activity. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 1996, 6 (12): 1303 – 1308.

56