MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV BIOCHEMIE
STANOVENÍ HOMOCYSTEINU V TĚLNÍCH TEKUTINÁCH METODOU HPLC A JEHO VLIV NA LIDSKOU REPRODUKCI Diplomová práce
Autor práce: Bc. Martina Vodová Vedoucí práce: Ing. Jitka Melounová, Ph.D.
Brno 2010
PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Stanovení homocysteinu v tělních tekutinách metodou HPLC a jeho vliv na lidskou reprodukci, vypracovala sama pod odborným vedením Ing. Jitky Melounové, Ph.D. a s použitím níže uvedené literatury.
V Brně dne 30. 4. 2010
______________________________
2
PODĚKOVÁNÍ Na tomto místě bych ráda poděkovala Ing. Jitce Melounové, Ph.D., MUDr. Michaele Králíkové a Mgr. Mileně Matejovičové, Ph.D. za jejich odborné vedení, cenné rady a připomínky, čas a především trpělivost, kterou mi poskytly při vypracovávání této diplomové práce. Děkuji také všem svým blízkým, především svým rodičům, prarodičům a svému příteli za podporu, trpělivost, pochopení a důvěru, kterou mi věnovali v průběhu celého studia.
3
OBSAH SEZNAM ZKRATEK .......................................................................................................... 7 ÚVOD .................................................................................................................................... 8 TEORETICKÁ ČÁST ......................................................................................................... 9 1 MOLEKULA HOMOCYSTEINU............................................................................. 9 1.1
HISTORIE ............................................................................................................ 9
1.2
VLASTNOSTI A FUNKCE ..................................................................................... 10
1.3
FORMY HOMOCYSTEINU V CIRKULACI .............................................................. 10
2 METABOLISMUS HOMOCYSTEINU ................................................................. 12 2.1
REMETHYLACE ................................................................................................. 12 2.1.1 Homocystein-methioninový cyklus ........................................................... 12 2.1.2 Folátový cyklus ...................................................................................... 13
2.2
TRANSSULFURACE ............................................................................................ 14
2.3
PORUCHY METABOLISMU .................................................................................. 16 2.3.1 Homocystinurie ...................................................................................... 16 2.3.2 Hyperhomocysteinemie ........................................................................... 16
3 TOXICITA HOMOCYSTEINU .............................................................................. 18 3.1
HOMOCYSTEIN THIOLAKTON (HTL) ................................................................. 18
3.2
N-HOMOCYSTEINYLACE .................................................................................... 18
3.3
S-HOMOCYSTEINYLACE .................................................................................... 19
3.4
HOMOCYSTEIN A KARDIOVASKULÁRNÍ SYSTÉM ................................................ 20
3.5
HOMOCYSTEIN A NERVOVÁ SOUSTAVA.............................................................. 20
4 HOMOCYSTEIN A LIDSKÁ REPRODUKCE..................................................... 22 4.1
MUŽSKÝ REPRODUKČNÍ SYSTÉM ....................................................................... 22 4.1.1 Spermatogeneze – tvorba pohlavních buněk ............................................. 22 4.1.2 Vliv oxidačního stresu ............................................................................ 23 4.1.3 Foláty v mužském reprodukčním systému ................................................. 25
4
4.1.4 Vliv vitamínu B6, B12 a folátu na mužský reprodukční systém ..................... 25 4.1.5 Polymorfismu MTHFR a mužská neplodnost ............................................ 26 4.2
ŽENSKÝ REPRODUKČNÍ SYSTÉM ........................................................................ 27 4.2.1 Tvorba pohlavních buněk – oogeneze ...................................................... 27 4.2.2 Sekrece pohlavních hormonů .................................................................. 27 4.2.3 Vliv estradiolu na hladinu homocysteinu .................................................. 27 4.2.4 Těhotenství a homocystein ...................................................................... 28 4.2.5 Metody asistované reprodukce ................................................................ 31 4.2.6 Syndrom polycystických ovarií (PCOS).................................................... 32
5 ANALYTICKÉ METODY STANOVENÍ HOMOCYSTEINU ........................... 34 5.1
IMUNOCHEMICKÉ METODY ............................................................................... 34
5.2
VYSOKOÚČINNÁ KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE (HPLC) .............................. 34 5.2.1 HPLC s fluorescenční detekcí ................................................................. 34 5.2.2 HPLC s tandemovou hmotnostní spektrometrií (LC-MS/MS) ..................... 35 5.2.3 HPLC s elektrochemickou detekcí ........................................................... 35 5.2.4 HPLC s fotometrickou detekcí ................................................................. 35
5.3
DALŠÍ METODY STANOVENÍ HOMOCYSTEINU..................................................... 35
6 KOMETOVÁ ANALÝZA ........................................................................................ 37 6.1
OBECNÝ POSTUP METODY ................................................................................. 37
6.2
VYUŽITÍ METODY.............................................................................................. 39
CÍLE PRÁCE...................................................................................................................... 40 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST ............................................................................................. 41 7 MATERIÁL A METODY ........................................................................................ 41 7.1
UCHOVÁVÁNÍ A ZPRACOVÁNÍ VZORKŮ .............................................................. 41
7.2
KOMETOVÁ ANALÝZA ....................................................................................... 41
7.3
ROZBÍJENÍ SPERMIÍ........................................................................................... 43
7.4
DERIVATIZACE VZORKŮ ................................................................................... 45
7.5
VYSOKOÚČINNÁ KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE S FLUORESCENČNÍ DETEKCÍ HPLC-FD ......................................................................................................... 46
5
8 VÝSLEDKY ............................................................................................................... 48 8.1
STANOVENÍ HOMOCYSTEINU A DALŠÍCH THIOLŮ V KREVNÍ PLAZMĚ ................. 48
8.2
STANOVENÍ HOMOCYSTEINU A DALŠÍCH THIOLŮ VE FOLIKULÁRNÍ TEKUTINĚ ... 48 8.2.1 Závislost věku a koncentrace thiolů ve folikulární tekutině ........................ 49 8.2.2 Rozdíly koncentrací thiolů v krvi ............................................................. 50 8.2.3 Rozdíly koncentrací thiolů ve folikulech s oocytem a bez oocytu ................ 50 8.2.4 Intraindividální rozdíly mezi jednotlivými folikuly .................................... 51
8.3
ROZBÍJENÍ SPERMIÍ........................................................................................... 52
8.4
STANOVENÍ HOMOCYSTEINU V SEMINÁLNÍ TEKUTINĚ A V INTRACELULÁRNÍM OBSAHU SPERMIÍ ............................................................................................... 59
8.4.1 Seminální tekutina .................................................................................. 59 8.4.2 Intracelulární obsah spermií ................................................................... 63 8.4.3 Koncentrace intracelulárního homocysteinu ve spermiích ......................... 66 8.5
KOMETOVÁ ANALÝZA ....................................................................................... 67 8.5.1 Vliv oxidačního stresu na poškození DNA spermií .................................... 67 8.5.2 Homocystein a poškození DNA spermií .................................................... 67
8.6
HOMOCYSTEIN A PÁRY ÚČASTNÍCÍ SE METOD ASISTOVANÉ REPRODUKCE ......... 69
9 DISKUZE ................................................................................................................... 70 SOUHRN ............................................................................................................................. 72 SUMMARY......................................................................................................................... 73 SEZNAM LITERATURY ................................................................................................. 74
6
SEZNAM ZKRATEK BHMT ............................................................................ betainhomocysteinmethyltransferasa 5-BMF ............................................................................. 5-bromomethylfluorescein CBS ................................................................................. cystathionin-β-syntasa Cysgly.............................................................................. cysteinylglycin CL.................................................................................... cystathioninlyasa DHFR .............................................................................. dihydrofolátreduktasa DMF ................................................................................ dimethylformamid dTMP............................................................................... deoxythymidinmonofosfát DTT ................................................................................. dithiothreitol dUMP .............................................................................. deoxyuridinmonofosfát FSH ................................................................................. folikuly stimulující hormon – folitropin GNPs ............................................................................... gold nanoparticles GnRH .............................................................................. gonadoliberin GPX................................................................................. glutathionperoxidasa GSH................................................................................. glutathion GTR................................................................................. glutathionreduktasa HTL ................................................................................. homocystein thiolakton ISCI ................................................................................. intracytoplasmatic spermia injection IVF .................................................................................. in vitro fertilizace LH ................................................................................... luteinizační hormon - lutropin LIF................................................................................... laserem indukovaná fluorescence LMPA.............................................................................. low melting point agarose MAT ................................................................................ methioninadenosyltransfera MTHFR ........................................................................... methylentetrahydrofolátreduktasa MTR ................................................................................ methyltransferasa NOX 5 ............................................................................. NADPH oxidasa PCOS............................................................................... syndrom polycystických ovarií SAH................................................................................. S-adenosylhomocystein SAHH .............................................................................. S-adenosylhomocysteinhydrolasa SAM ................................................................................ S-adenosylmethionin SBD-F.............................................................................. amonium-7-fluorobenzo-2-oxa-1,3-diazol-4-sulfonát SCGE............................................................................... single cell gel electrophoresis SHMT.............................................................................. serin-hydroxymethyltransferasa SOD................................................................................. superoxiddismutasa TBP ................................................................................. tri-N-butylfosfin TCEP ............................................................................... tris-(2-karboxylethyl)-fosfin tHcy ................................................................................. celkový homocystein THF ................................................................................. tetrahydrofolát TS .................................................................................... thymidylátsyntasa
7
ÚVOD Molekula homocysteinu je spojována s řadou patologických procesů, které jsou příčinou mnoha onemocnění a poruch. Jeho odbourávání v lidském organismu probíhá dvěma metabolickými drahami – remethylací a transsulfurací. Významné látky zapojené do metabolismu homocysteinu jsou vitamíny B6, B12 a kyselina listová. Je-li v těle těchto látek nedostatek, odbourávání homocysteinu je narušeno, dochází k jeho kumulaci v těle a vzniku hyperhomocysteinemie. Zvyšujicí se počet neplodných párů vede k intenzivnímu zájmu o problematiku etiopatogeneze lidské reprodukce. Vysoká hladina homocysteinu je jedním z klíčových faktorů, které ovlivňují funkci lidského reprodukčního systému. K patologii mužské neplodnosti přispívají v 30 – 80 % případů volné radikály, které vznikají mimo jiné, také při oxidaci homocysteinu a vyvolávají oxidační stres. Tento stres způsobuje poškození DNA spermií a negativně tak ovlivňuje jejich funkci. U žen působí vysoká hladina homocysteinu na zrání oocytů, velikost folikulů a kvalitu embryí. Dále je spojována s komplikacemi v průběhu těhotenství a vrozenými vývojovými vadami plodu. Negativně také ovlivňuje výsledky metod asistované reprodukce. Cílem této práce bylo posoudit vliv vysoké hladiny homocysteinu na poruchy lidské plodnosti stanovením jeho koncentrace v seminální a folikulární tekutině a také ve spermiích. Toto stanovení bylo prováděno metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie s fluorescenční detekcí. Dále byl zjišťován vztah mezi zvýšenou hladinou homocysteinu ve spermiích a mírou poškození jejich DNA. Pro určení míry poškození DNA spermií byla použita kometová analýza.
8
TEORETICKÁ ČÁST 1 MOLEKULA HOMOCYSTEINU 1.1
Historie Homocyst(e)in byl poprvé připraven a popsán v roce 1932 Butzem a du Vigneaudem jako
produkt demethylace a následné oxidace esenciální aminokyseliny methioninu. Pomocí různých důkazových reakcí vědci zjistili, že molekula nově vzniklé sloučeniny obsahuje atomy síry v disulfidické formě a atomy dusíku jsou přítomny jako aminodusíky. Na základě těchto poznatků a elementární analýzy určili empirický vzorec sloučeniny – C8H16O4N2S2 a její systematický název bis-(γ-amino-γ-karboxypropyl)disulfid, symetrický homolog cystinu. Tento vztah byl námětem pro pozdější název sloučeniny – homocystin (Butz and du Vigneaud, 1932). Jeho redukovaná forma, homocystein, se v dalších letech stala předmětem mnoha výzkumů v různých oblastech vědy. V roce 1962 byla provedena studie u mentálně retardovaných dětí, která popisovala zvýšenou koncentraci homocysteinu v moči – homocystinurii. O dva roky později Muld et al. (1964) popsali, že je tato metabolická porucha způsobena deficitem cystathionin-β-syntasy. V roce 1969 byly u pacientů s homocystinurií popsány patologické změny v cévním systému, např. proliferace hladkých svalů, postupné zužování cév a hemostatické změny (McCully, 1969). Dalším významným objevem přispěli v oblasti výzkumu kardiovaskulárních chorob Wilcken and Wilcken (1976), kteří popsali výrazný sklon k žilní i arteriální trombóze při nedostatečné funkci cystathionin-β-syntasy. Z počátku devadesátých let pochází obsáhlé publikace McCullyho, které se věnují dalším oblastem základního výzkumu homocysteinu: 1. Homocystein ve vztahu k ateroskleróze a kardiovaskulárním onemocněním, 2. Homocystein a nádory, 3. Homocystein a stárnutí. Dále McCully spolu s Olszewským položili základ pro zpochybnění cholesterolové teorie. V krvi mužů s hypercholesterolemií pozorovali vyšší koncentraci LDL (low density lipoproteins) částic a homocysteinu než u jedinců s normální hladinou cholesterolu (Olszewski et al., 1989; Olszewski and McCully, 1993; McCully, 1994a, 1994b). Během roku 2000 se podařilo sloučit poznatky ze dvou okruhů výzkumu a to výsledky studií základních
chemických
procesů
probíhajících
v lidských
buňkách
s poznatky
o
vzniku
kardiovaskulárních a dalších civilizačních onemocnění. Ukázalo se, že ke vzniku kardiovaskulárních chorob dochází v důsledku poruch biochemických procesů v buňkách – poruch v procesech, v nichž vzniká a metabolizuje se homocystein (Erben, 2005).
9
1.2
Vlastnosti a funkce Homocystein, 2-amino-4-merkaptomáselná kyselina, patří mezi esenciální aminokyseliny
obsahující síru v podobě volné thiolové skupiny (‒SH). Na rozdíl od svého nejbližšího homologa – cysteinu se nepodílí na výstavbě bílkovin (Refsum et al., 1998; Přistoupilová et al., 1999). Aminothioly (sloučeniny s volnou sulfhydrylovou skupinou a aminoskupinou) jsou prekurzory a meziprodukty mnoha metabolických drah a podílí se na udržování intra- a extracelulární redoxní homeostázy. Mezi nízkomolekulární biologické thioly patří také např. cystein, glutation a koenzym A. Glutation je tripeptid skládající se z kyseliny glutamové, cysteinu a glycinu. Hojně se vyskytuje v intracelulárním prostředí jako součást antioxidačních systémů, kde plní funkci ochrany proti volným radikálům kyslíku (Ebisch et al., 2006). Prekurzorem cysteinu a homocysteinu je esenciální aminokyselina methionin, která patří z hlediska struktury mezi sulfidy, jejichž obecné označení je R‒S‒R‘. Všechny tři sloučeniny mají podobnou strukturu (Jacobsen, 2001). CH3 S CH2 CH2 + H3N C COO H
SH CH2 CH2 + H3N C COO H
SH CH2 + H3N C COO H
methionin
homocystein
cystein
Obr. 1.1 Struktura aminothiolů
Hlavní chemickou vlastností aminothiolů je schopnost oxidovat se v přítomnosti elektronakceptorního prvku (např. molekulárního kyslíku) za vzniku disulfidů obecné struktury R‒S‒S‒R‘. Nové vazby, prostřednictvím kterých se homocystein váže na molekulu dalšího homocysteinu nebo ostatních thiolů, jsou vytvářeny mezi volnými sulfhydrylovými skupinami. Důležitou vlastností sulfhydrylových skupin je schopnost disociace vodíku a tvorba thiolátového aniontu (Jacobsen, 2001; Medina et al., 2001).
1.3
Formy homocysteinu v cirkulaci Homocystein se v plazmě vyskytuje ve formě oxidované a redukované. Redukovaný
homocystein (forma s volnou thiolovou skupinou) tvoří u zdravých jedinců méně než 2 % z celkového množství. Až 98 % homocysteinu je po transportu z buňky do plazmy během několika minut až hodin oxidováno (Chambers et al., 2001; Medina et al., 2001).
10
Oxidace a autooxidace homocysteinu v plazmě probíhá v přítomnosti molekulárního kyslíku a při fyziologickém pH podle obecné rovnice 2RSH + O2 ↔ RSSR + H2O2. Reakce je katalyzována přechodnými kovy, mědí a kobaltem, a produktem je disulfid, H2O2 a další kyslíkové radikály. Spojením dvou molekul homocysteinu, nebo-li autooxidací homocysteinu, vzniká disulfid homocystin. Homocystein může být oxidován dalšími sloučeninami, které obsahují sulfhydrylovou skupinu. Při této reakci vznikají tzv. smíšené disulfidy. Převažují především dvě formy – homocystein navázaný na cystein a homocystein vázaný na protein. Hlavním vazebným proteinem je albumin, který je tvořen 35 cysteinovými zbytky. V N-terminální části molekuly je přítomna volná sulfhydrylová skupina v pozici Cys34, s níž homocystein vytváří vazbu (Jacobsen, 2000; Jacobsen, 2001). V plazmě existuje mezi těmito formami dynamická redoxní rovnováha. Suma všech redukovaných a oxidovaných forem homocysteinu v plazmě je označována jako hladina celkového homocysteinu – tHcy. Koncentrace tHcy se s věkem postupně zvyšuje. Novorozenci a děti do 11 let mají koncentraci 3 – 6 µmol.l-1, adolescenti 5 – 8 µmol.l-1, dospělí nižšího a středního věku 5 – 13 µmol.l-1 a u osob vyššího věku koncentrace převyšuje 10 µmol.l-1. Francouzská studie u stoletých jedinců uvádí hodnoty koncentrace tHcy mezi 25 a 27 µmol.l-1 (Jacobsen, 2001; Medina et al., 2001). Redukované formy + NH3 homocystein < 2 %
- OOC
SH
Oxidované formy + NH3
+ NH3 homocystin 5 - 10 %
-
smíšené disulfidy cystein-homocystein 5 - 10 %
COO
S S
OOC
-
+ NH3 - OOC
S S
COO
-
+ NH3
protein-homocystein 80 - 90 %
protein
S S
COO
-
+ NH3
Obr. 1.2 Formy homocysteinu v plazmě (Jacobsen, 2000)
11
2 METABOLISMUS HOMOCYSTEINU Prekurzorem homocysteinu v buňkách je aminokyselina methionin, kterou organismus získává z potravy. Následně je molekula homocysteinu v těle metabolizována dvěma drahami – remethylací a transsulfurací (Medina et al., 2001; Forges et al. 2007).
2.1
Remethylace Metabolická dráha remethylace zahrnuje dva navzájem propojené cykly, homocystein-
methioninový a folátový cyklus, jejichž úkolem je přenos methylových skupin z vnějšího prostředí (Erben, 2005).
2.1.1
Homocystein-methioninový cyklus Hlavní reakcí tohoto cyklu je přeměna homocysteinu na methionin probíhající prostřednictvím
přenosu methylové skupiny z N-5-methyltetrahydrofolátu (N-5-methylTHF). Reakci katalyzuje methyltransferasa
[5-methyltetrahydrofolát-homocystein-S-methyltransferasa
(MTR)],
jejímž
kofaktorem je kobalamin – vitamín B12. Kobalamin přijímá methylovou skupinu z N-5-methylTHF, postupně ji přenáší na MTR a ta tuto skupinu předává homocysteinu. Remethylace
homocysteinu
může
probíhat
také
v játrech
působením
enzymu
betainhomocysteinmethyltransferasy (BHMT), který je nezávislý na folátech a vitamínu B12. Homocystein v tomto případě přijímá methylovou skupinu z betainu, který v organismu vzniká oxidací cholinu a lecitinu, a v průběhu reakce je přeměněn na dimethylglycin. Remethylací homocysteinu vzniká methionin, který může být dále včleněn do řetězce různých peptidů, nebo přeměněn na S-adenosylmethionin (SAM). Tato sloučenina funguje jako univerzální donor methylu při metylaci nukleových kyselin, bílkovin, polysacharidů, fosfolipidů, atd. a hraje tak klíčovou roli v buněčných procesech. SAM vzniká přenosem adenosylové skupiny z ATP na atom síry v molekule methioninu za katalýzy methioninadenosyltransferasy (MAT). Síra získá po navázání adenosylu kladný náboj a aktivuje tak sousední methylovou skupinu, tím se stává molekula reaktivnější (Medina et. al., 2001; Voet and Voet, 2004; Erben, 2005; Forges et al., 2007). +
NH3
-OOC
+
NH3
- OOC
H
H
NH2
MAT
+
ATP
N +S
S H3C
O
+ Pi + PPi N
H3C HO
methionin
N
N
OH
S-adenosylmethionin (SAM)
Obr. 2.1 Vznik SAM (Garrett and Grisham, 1995)
12
Aktivovaná
methylová
skupina
methyltransferasami
přenesena
na
je
akceptor
z molekuly
SAM
methylových
uvolněna
skupin.
a
Výsledkem
specifickými reakce
je
S-adenosylhomocystein (SAH) (Garrett and Grisham, 1995). Cyklus uzavírá reverzibilní reakce katalyzovaná S-adenosylhomocysteinhydrolasou (SAHH), při níž je SAH rozštěpen na homocystein a adenosin, který je využit při syntéze ATP. Homocystein je poté opět methylován a cyklus se opakuje (Forges et al., 2007). +
NH3
-OOC H
NH2 N +
S
+
NH3
-OOC
N
N
H2O
adenosin
R- CH3
R-H
N
S
O
N
H3C HO
-OOC
NH2
N
N
O
H
+
NH3
H
N
SH
OH
HO
S-adenosylmethionin (SAM)
OH
S-adenosylhomocystein (SAH)
homocystein
Obr. 2.2 Přeměna SAM (Garrett and Grisham, 1995)
2.1.2
Folátový cyklus Hlavní roli má v tomto sledu reakcí tetrahydrofolát (THF) – aktivní forma kyseliny listové.
Kyselina listová je pro organismus savců esenciální látkou. Je získávána především z potravy nebo působením střevních mikroorganismů. Kyselina listová je oproti THF dvojnásobně oxidovaná, proto musí
být
enzymově
redukována
na
aktivní
molekulu.
Tato
redukce
je
katalyzována
+
dihydrofolátreduktasou (DHFR) za spoluúčasti NADPH + H . Podstatou funkce THF je schopnost vázat C1 zbytky v různých oxidačních stavech a poskytovat je během dalších reakcí. Jednouhlíkaté zbytky vznikají převážně při přeměně serinu na glycin, která je katalyzována enzymem serinhydroxymethyltransferasou (SHMT). Navázáním C1 zbytků na THF vzniká N-5,N-10-methylentetrahydrofolát, který vnáší tyto jednouhlíkaté zbytky do dalších reakcí, kde jsou využity k různým účelům: •
při přeměně dUMP na dTMP katalyzované thymidylátsyntasou (TS)
•
při syntéze purinů
•
při přeměně homocysteinu na methionin (Voet a Voetová, 1990).
Pro
průběh
folátového
cyklu
je
významná
přeměna
N-5,N-10-methylenTHF
na
N-5-methylTHF katalyzovaná FAD-dependentní methylentetrahydrofolátreduktasou (MTHFR). Methylová skupina z N-5-methylTHF je prostřednictvím kobalaminu přenesena na MTR a donor tohoto uhlíkového zbytku je přeměněn na THF. Tato reakce folátový cyklus uzavírá a THF může opět vázat C1 zbytky (Forges et al., 2007).
13
Z výše popsaných metabolických drah je zřejmé, že homocystein-methioninový a folátový cyklus jsou propojeny remethylací homocysteinu a demethylací N-5-methylTHF. Jedná se o klíčovou reakci obou cyklů, při které je methylová skupina přenesena kobalaminem z N-5-methylTHF na MTR a odtud na homocystein (Forges et al., 2007). CH3
+
SH
S
CH2
CH2
CH2
CH2
+
H3N C COO H
H3N C COO H
-
methionin
homocystein
MTR B12
O
O
OH
HO HN
OH
HO HN
O
O N H
H2N
N CH3
O
O
N
N
O
O
N
N NH
N H
H2N
5-methyltetrahydrofolát
NH
N H
tetrahydrofolát
Obr. 2.3 Reakce spojující homocystein-methioninový a folátový cyklus (Forges et al., 2007) (methylová skupina přenášena kobalaminem a MTR je zvýrazněna)
2.2
Transsulfurace Prvním krokem této metabolické dráhy je kondenzace homocysteinu se serinem katalyzovaná
enzymem cystathionin-β-syntasou (CBS). Kofaktorem tohoto enzymu je pyridoxal-5-fosfát, aktivní forma vitamínu B6. Produktem této ireverzibilní reakce je cystathionin, který je v dalším kroku deaminován za účasti cystathioninlyasy (CL) na cystein a α-ketoglutarát. Kofaktorem je opět pyridoxal-5-fosfát (Forges et al., 2007). Cystein může být využit při proteosyntéze nebo je zapojen do metabolismu glutathionu, popřípadě je oxidován na taurin nebo anorganický síran. α-ketoglutarát je oxidační dekarboxylací přeměněn na propionyl-CoA a dále na sukcinyl-CoA (Garrett and Grisham, 1995; Medina et al., 2001). HO H
+
NH3
SH
COO -
+
H2O
+
+
H
NH3
homocystein
COO-
NH3
S
OOC
H
H
+
NH3
serin
H2O
COO
-
cystathionin
HS
O
+
NH4
H2O
+
-
OOC
CH3
alfa-ketoglutarát
+
H +
NH3
COO
-
cystein
Obr. 2.4 Transsulfurace (Garrett and Grisham, 1995)
14
Folát
POTRAVA
Dihydrofolát
ATP
Pi PPi
Methionin MAT
Tetrahydrofolát (THF)
Dimethylglycin
SAM
BHMT
X-H
Serin Betain
FOLÁTOVÝ SHMT
MTR B12
CYKLUS
X-CH3
CYKLUS SAH
Glycin 5-methylTHF
5,10-methylenTHF
TS
H2O
SAHH
MTHFR
Thymidin
Homocystein
FAD
Adenosin
dUMP
dTMP
DNA
MT
HOMOCYSTEINMETHIONINOVÝ
ATP
TRANSSULFURACE
5,10-methenylTHF
Serin Purin
10-formylTHF
CBS
B6
Cystathionin
CL
alfa-ketoglutarát
O2
Taurin
O2
Cystein
2-
SO4
Glutathion
Obr. 2.5 Schéma metabolismu homocysteinu (Ebisch et al., 2007, upraveno)
15
2.3
Poruchy metabolismu Vznikají narušením některé z metabolických drah homocysteinu. Hlavními příčinami jsou
deficity vitamínů, které fungují jako kofaktory enzymů účastnících se metabolismu homocysteinu. Nedostatek folátu a vitamínu B12 má za následek nedostatečnou remethylaci homocysteinu. Mutace CBS nebo deficit vitamínu B6 blokuje transsulfuraci. Následkem těchto poruch dochází ke kumulaci homocysteinu v organismu. K hlavním poruchám metabolismu homocysteinu patří homocystinurie a hyperhomocysteinemie (Forges et al., 2007).
2.3.1
Homocystinurie Homocystinurie je vzácně se vyskytující dědičné, metabolické onemocnění vzniklé mutací
genu pro enzym CBS. Dědičnost homocystinurie je autozomálně recesivní a výskyt tohoto onemocnění je v běžné populaci 1 : 340 000. Při tomto onemocnění dochází k hromadění homocysteinu v tkáních a tělesných tekutinách – krvi a moči. Na základě klinických příznaků a efektu léčby se rozlišují dvě formy homocystinurie: 1. vitamín B6 senzitivní (reagující) – u této formy je částečná zbytková aktivita enzymu CBS, podáváním vitamínu B6 společně s dodržováním diety se u pacientů daří snižovat hladinu homocysteinu 2. vitamín B6 rezistentní (nereagující) – u této formy je aktivita CBS prakticky nulová a pacienti na podávání vitamínu B6 nereagují. Neléčená homocystinurie může způsobovat celou řadu klinických příznaků, mezi nejčastější patří opoždění psychomotorického vývoje; obtíže s učením; těžká krátkozrakost přecházející do dislokace oční čočky v některých případech až s rozvojem glaukomu; osteoporóza, skolióza a větší délka dlouhých kostí v oblasti paží a nohou. Cílem léčby je snížení vysoké hladiny homocysteinu v organismu, které spočívá v podávání nadměrných dávek vitamínu B6 a dodržování nízkobílkovinné diety s limitovaným množstvím methioninu. Některým pacientům je podáván betain, aby byla podpořena remethylace homocysteinu probíhající v játrech (Ishida et al., 2001; Páterová et al., 2004).
2.3.2
Hyperhomocysteinemie Fyziologická hladina homocysteinu se pohybuje mezi 5 a 15 µmol.l-1 a je ovlivňována
především věkem a životním stylem. Koncentrace překračující hranici 15 µmol.l-1 je označována jako hyperhomocysteinemie, která se podle množství tHcy v plazmě rozděluje do tří skupin:
16
1. mírná hyperhomocysteinemie
15 – 30 µmol.l-1
2. střední hyperhomocysteinemie
31 – 100 µmol.l-1
3. těžká hyperhomocysteinemie
> 100 µmol.l-1
Avšak již koncentrace nad 10 µmol.l-1 zvyšuje riziko kardiovaskulárních onemocnění. Těžká hyperhomocysteinemie je nejčastěji způsobena vrozenými genetickými defekty enzymů, které se účastní metabolismu homocysteinu. Příčiny mírné a střední hyperhomocysteinemie jsou různé – např. nedostatek vitamínu B6, B12 nebo folátu, selhání ledvin, užívání některých léků, hypotyreóza nebo polymorfismus enzymu MTHFR. Hladina homocysteinu je také významně ovlivňována životním stylem – kouřením, konzumací kávy a alkoholu, stravovacími návyky a fyzickou aktivitou (Vollset et al., 2001; Carmel et al., 2003; Hillenbrand et al., 2008). Avšak výsledky norské studie NORVIT naznačily, že snižování zvýšené hladiny tHcy u mírné hyperhomocysteinemie podáváním vitamínů skupiny B nevede k efektivnímu snížení výskytu kardiovaskulárních onemocnění (Boonaa et al., 2006). Podobných výsledků dosáhla také skupina vědců HOPE 2 (2006), v jejichž studii dávky kyseliny listové a vitamínů B6 a B12 nesnížily riziko závažných kardiovaskulárních příhod u pacientů s cévním onemocněním. Nicméně i přes závěry těchto studií není možno prohlásit významně zvýšenou hladinu homocysteinu v krvi za neškodnou, bez patognomických účinků na methylační pochody v organismu. Proto by každé zvýšení homocysteinu nad 30 µmol.l-1 mělo být analyzováno a doplněno diferenciálními diagnostickými vyšetřeními (vitamíny skupiny B, foláty, hemokoagulační vyšetření, methylmalonát, tromboembolické mutace a další) (Hyánek et al., 2009). Polymorfismus MTHFR Polymorfismus MTHFR je jednobodová mutace genu pro MTHFR způsobená výměnou cytosinu za thymin v nukleotidu 677 (677C → T). Následkem této výměny dochází k záměně aminokyseliny alanin za valin v pozici 222. Konečným důsledkem mutace MTHFR je vznik termolabilní formy tohoto enzymu a tím snížení jeho aktivity o 50 %. Polymorfismus MTHFR je proto spojován s mírnou hyperhomocysteinemií, která se projevuje především u homozygotů (TT677). Procentuální výskyt homozygotů je demograficky závislý (Rozen, 2001; Lee et al., 2005; Forges et al., 2007; Ananth et al., 2007).
17
3 TOXICITA HOMOCYSTEINU Homocystein je spojen s řadou patologických procesů, přesto však neexistuje jednotná hypotéza o mechanismu jeho toxického působení. V současnosti je navrhováno několik možných mechanismů: hypomethylace, inkorporace homocysteinu do řetězce proteinů a především tvorba volných radikálů a následný oxidační stres. Volné radikály vznikající při oxidaci a autooxidaci homocysteinu (viz. kapitola 1.3) poškozují buněčné membrány, krevní destičky, lipoproteiny, leukocyty a mnoho dalších. Intracelulárně působí na endoplazmatické retikulum, Golgiho aparát a syntézu oxidu dusnatého (Jacobsen, 2001; Perła-Kaján et al., 2007; Sibrian-Vazquez et al., 2010). Bylo zjištěno, že v mnoha těchto patologických procesech je zapojena velmi reaktivní forma molekuly homocysteinu – homocystein thiolakton (HTL).
3.1
Homocystein thiolakton (HTL) Z chemického hlediska se jedná o intramolekulární thioester homocysteinu, který je
syntetizován methionyl-tRNA syntethasou a je přítomen ve všech typech buněk. Jeho koncentrace v plazmě se pohybuje mezi 0,1 – 22,6 nmol.l-1 ≈ 0,002 – 0,29 % tHcy. Avšak buňky, které mají porušený metabolismus homocysteinu, a rakovinné buňky produkují zvýšené množství HTL. V lidském těle existuje několik enzymů, které jsou schopny hydrolyzovat molekulu HTL. Patří mezi ně thiolaktonasa, paraoxonasa-1 (PON1), která je součástí HDL (high density lipoproteins), a také bleomycin hydrolasa (BLH), objevena v buňkách placenty. K eleminaci HTL dochází také močovými cestami. V moči byla stanovena koncentrace HTL 11 – 485 nmol.l-1 ≈ 2,5 – 28,3 % tHcy. Nižší koncentrace HTL v krevní plazmě může být vysvětlena přítomností enzymů hydrolyzujících tuto molekulu a dále také reakcí HTL s proteiny označována jako N-homocysteinylace (Zimny et al., 2006; Perła-Kaján et al., 2007). NH2 O S
Obr. 3.1 Homocystein thiolakton
3.2
N-homocysteinylace Jako N-homocysteinylace je označována inkorporace homocysteinu do řetězce intra a
extracelulárních proteinů, ke které dochází prostřednictvím molekuly HTL. Intramolekulární thioesterová vazba HTL je citlivá k reakci s nukleofily, konkrétně s volnými ε-aminoskupinami lysinových zbytků v proteinech. Mechanismus reakce je založen na acylaci ε-NH2 skupiny lysinu aktivovanou karboxylovou skupinou HTL. Rychlost N-homocysteinylace je úměrná počtu lysinových
18
zbytků v proteinu a mění náboj lysinu, protože ε-aminoskupina této aminokyseliny je bazičtější (pK = 10,5) než α-amino skupina homocysteinu (pK = 7,1). N-homocysteinylací se do řetězce proteinů včlení nové thiolové skupiny, které zvyšují citlivost proteinů k oxidaci, tvorbě intramolekulárních disulfidických vazeb a mutlimerizaci. N-Hcy-proteiny jsou imunogenní, vyvolávají v těle imunitní odpověď tvorbou specifických protilátek. V krvi byly objeveny autoprotilátky, které specificky rozpoznávají epitop Nε-Hcy-Lys na N-Hcy-proteinech. Hladina těchto imunoglobulinů v krvi pozitivně koreluje s koncentrací tHcy. Tyto protilátky mohou být využívány pro detekci N-Hcy-proteinů a sloužit jako diagnostický nástroj nemocí spojených s hyperhomocysteinemií (Perła-Kaján et al., 2007). Výrazně zvýšená hladina N-homcysteinylovaných proteinů (N-Hcy-proteiny) byla nalezena u pacientů se selháním ledvin a také u pacientů s ischemickou chorobou srdeční. Zvýšené podávání folátů hladinu těchto proteinů normalizovalo. Koncentrace N-Hcy-proteinů v krvi pozitivně koreluje s koncentrací homocysteinu. N-Hcy-proteiny tvoří 0,3 – 23 % tHcy v krevní plazmě. Mezi nejčastěji N-Hcy-proteiny patří hemoglobin, albumin, γ-globuliny, LDL, HDL, transferin, antitrypsin a fibrin. N-homocysteinylace tyto proteiny poškozuje a vede ke ztrátě jejich funkce (McDowell and Lang, 2000; Jakubowski, 2001; Perła-Kaján et al., 2007). Proteiny na povrchu HDL obsahují lysinové zbytky, které mohou být zapojeny do N-homocysteinylace. Následkem této reakce dochází ke konformačním změnám v molekule HDL, k modifikaci jejích fyzikálně-chemických vlastností a také ke snížení aktivity PON1. PON1 je syntetizována v játrech a následně uvolňována do krve, kde je asociována s HDL (high density lipoproteins). Bylo prokázáno, že PON1 inhibuje peroxidaci LDL (low density lipoproteins) a zabraňuje tak vzniku aterosklerózy (Flekač et al., 2006; Ferretti et al., 2010). Dále bylo také zjištěno, že v přítomnosti vysoké koncentrace homocysteinu jsou fibrinová vlákna sraženin silnější, hustší, rozvětvenější a v důsledku snížené permeability více odolávají fibrinolýze. Následkem toho dochází ke zvýšené tvorbě trombů (Perła-Kaján et al., 2007; Olas et al., 2009; Quintana et al., 2009).
3.3
S-homocysteinylace S-homocyteinylace označuje tvorbu kovalentních disulfidických vazeb homocysteinu
s převážně cysteinovými zbytky proteinů. Následkem tvorby těchto vazeb může docházet ke změnám nebo k poškození funkcí proteinů. Thiolové skupiny jsou zapojeny ve funkci mnoha enzymů, strukturních proteinů a receptorů. Interakcí homocysteinu s těmito skupinami může v buňce docházet k narušení syntézy mnoha látek (Perła-Kaján et al., 2007; Perna et al., 2007). Příkladem je
narušení
metabolismu
kolagenu.
Homocystein
ireverzibilně
inhibuje
lysyloxidasu (LOX), která katalyzuje poslední reakci tvorby kolagenu. Tento enzym je aktivní
19
především na povrchu kostí, kde dochází k aktivní tvorbě kostní tkáně, jejíž dobré mechanické vlastnosti jsou závislé na vytvoření správné struktury kolagenu. Výsledkem této inhibice jsou změny ve zrání kolagenu a v posttranslační modifikaci jeho síťovité struktury a následně také v mechanických vlastnostech kostí, které jsou určeny strukturou kolagenu. Se zvýšenou hladinou homocysteinu tedy narůstá riziko zlomenin. Dále bylo zjištěno, že polymorfismus MTHFR je spojen s nízkou minerální hustotou kostí, která vede k předčasnému vzniku osteoporózy a také zvyšuje riziko fraktur (Cagnacci et al., 2008; Blouin et al., 2009).
3.4
Homocystein a kardiovaskulární systém Zvýšená hladina homocysteinu v krvi silně ovlivňuje kardiovaskulární systém a je považována
za významný rizikový faktor a biomarker srdečních chorob, např. aterosklerózy, ischemické choroby srdeční, srdeční arytmie, vrozených srdečních vad, atd. Avšak detailní mechanismus není ještě dostatečně znám (Cai et al., 2009). Vysoká hladina homocysteinu způsobuje nerovnováhu transmembránového toku iontů a depolarizaci klidového membránového potenciálu v kardiomyocytech. Dochází tak ke ztrátě fyziologické funkce těchto buněk a následně ke vzniku srdeční arytmie (Cai et al., 2009). Dále homocystein narušuje funkci cévního endotelu změnou jeho povrchu z antikoagulačního na prokoagulační a modifikuje proteiny krevních destiček, čímž zvyšuje jejich shlukování. Zvyšuje také aktivitu koagulačních faktorů V, X a XII a zároveň snižuje aktivitu proteinu C a expresi trombodulinu. Následkem všech těchto dějů dochází k nárůstu rizika rozvoje trombózy. Narušením produkce endotelinu-1, oxidu dusnatého a prostacyklinu ovlivňuje homocystein také vasodilataci cév (Perla-Kaján et al., 2007; Karolczak and Olas, 2009).
3.5
Homocystein a nervová soustava Jedním z neurotoxických účinků homocysteinu je nadměrná stimulace N-methyl-D-
aspartátových (NMDA) receptorů. Tyto receptory patří do skupiny ionotropních glutamátových receptorů, které zprostředkovávají rychlý synaptický přenos na většině excitačních synapsí v centrální nervové soustavě. Zajišťují tak komplexní funkce nervové soustavy jako celku, včetně procesů učení a paměti, a podílí se také na regulaci hladiny vápníku v buňce. Následkem nadměrné aktivace těchto receptorů dochází k masivnímu vzestupu Ca2+ kationů a ROS uvnitř neuronů, a tím k aktivaci mnoha biochemických pochodů, které mohou vyústit až ve specifickou formu smrti neuronů. Zánik neuronů, charakteristický pro některé neurodegenerativní choroby, jako je např. Alzheimerova choroba, je s největší pravděpodobností způsoben mimo jiné právě nadměrnou aktivací NMDA receptorů na povrchu nervových buněk (Patočka and Höschl, 2004; Petrovič et al., 2004; Boldyrev, 2009). Dále bylo zjištěno, že homocystein způsobuje nadměrnou aktivaci mikroglií. Díky těmto jedinečným buňkám funguje speciální imunitní systém mozku. Avšak jejich nadměrná aktivace vede
20
k neurodegenerativním procesům, které také doprovází např. Alzheimerovu a Parkinsonovu chorobu. Nadměrně aktivované mikroglie mohou produkovat různé druhy prozánětlivých a neurotoxických látek, např. oxid dusnatý, kyselinu arachidonovou, cytokiny a ROS. Homocystein zvyšuje expresi povrchových antigenů CD11b, které jsou typickým markerem mikrogliální aktivace, a stimuluje aktivitu NAD(P)H oxidasy v membráně mikroglií, čímž zvyšuje tvorbu ROS (Zou et. al., 2009).
21
4 HOMOCYSTEIN A LIDSKÁ REPRODUKCE V posledních letech dochází k výraznému nárůstu počtu neplodných párů. Tato skutečnost vede k intenzivnímu zájmu o problematiku etiopatogeneze lidské reprodukce. Metabolismus homocysteinu je součástí mnoha fyziologických procesů probíhajících v lidském reprodukčním systému a může tedy ovlivňovat plodnost mužů i žen.
4.1
Mužský reprodukční systém Homocystein ovlivňuje mužskou reprodukci především tvorbou ROS a vznikem oxidačního
stresu. Dále má na plodnost mužů vliv koncentrace vitamínů B6, B12 a folát (Forges et al., 2007).
4.1.1
Spermatogeneze – tvorba pohlavních buněk Pohlavní buňky se tvoří v semenotvorných kanálcích varlat (testes). Opakovaným mitotickým
dělením spermatogonií (buňky zárodečného epitelu) vznikají primární spermatocyty, které podléhají redukčnímu dělení – meióze. Vytvořené sekundární spermatocyty, spermatidy a posléze spermie obsahují pouze poloviční počet chromosomů – 22 somatických a 1 pohlavní X nebo Y chromosom. Celý proces generace pohlavních buněk trvá asi 70 dnů. Díky prvnímu mitotickému dělení vznikají dvě nové spermatogonie – jedna se vyvíjí v 16 zralých spermií a druhá je základem nové spermatogeneze. Tím je zajištěna nevyčerpatelnost spermatogonií pro spermatogenezi. Vyvíjející se spermie jsou vyživovány Sertoliho buňkami, se kterými jsou v těsném kontaktu. Zralé spermie jsou zadržovány v nadvarleti (epididymis), kde se mísí s hlenovitým sekretem a získávají zde pohyblivost nutnou pro oplození vajíčka. Ve funkčním stavu jsou zde spermie uchovávány až 40 dní (Trojan et al., 2003). Vyzrálá spermie je tvořena hlavičkou, krčkem a bičíkem. V hlavičce spermie jsou nahromaděny chromosomy obklopené malým zbytkem cytoplazmy, jejíž větší část přešla do cytoplazmy Sertoliho buněk. Vnější 2/3 hlavičky jsou kryty akrosomem, ve kterém jsou obsaženy proteolytické enzymy, hlavním z nich je hyaluronidasa, umožňující vniknutí spermie do vajíčka. V krčku spermie jsou přítomny mitochondrie, které vytvářejí energii (ATP) nezbytnou pro pohyb spermií. Rychlost pohybu spermií závisí na vlastnostech prostředí (např. na pH). Udává se hodnota 1 – 4 mm za minutu (Trojan et al., 2003). Abnormální morfologie spermií je jednou z příčin neplodnosti. Na obrázku 4.2 vlevo je spermie s normální morfologií. Dále následují spermie abnormálního tvaru: s malým akrosomem, se dvěma hlavičkami, s vakuolou v hlavičce, s kulatou hlavičkou, s kulatou hlavičkou bez akrosomu, se zúženou hlavičkou, s hruškovitou hlavičkou a se dvěma bičíky (www.repromeda.cz).
22
Obr. 4.1 Stavba spermie (www.sci.muni.cz)
4.1.2
Obr. 4.2 Tvary spermií (www.repromeda.cz)
Vliv oxidačního stresu V organismu existuje oxidační rovnováha. Pokud dojde k jejímu porušení nadměrnou
produkcí volných radikálů (ROS), vzniká oxidační stres, který je zapojen v mnoha patologických procesech. Akumulací a následnou oxidací homocysteinu katalyzovanou přechodnými kovy dochází k produkci ROS a následnému narušení oxidační rovnováhy (Shen and Ong, 2000; Zarghami and Khosrowbeygi, 2005; Tremellen, 2008). ROS přispívají k patologii mužské neplodnosti v 30 – 80 % případech. Působí na spermie a tím i mužskou (ne)plodnost dvěma klíčovými mechanismy. Prvním z nich je oxidace nenasycených mastných kyselin v membráně spermií, čímž dochází k porušení fluidity membrány spermií, která má velký význam při splynutí spermie a vajíčka. Následkem je poškození mitochondrií, které vede ke snížení pohyblivosti spermií a narušení jejich schopnosti proniknout do vajíčka. Druhým mechanismem je přímé poškození DNA ve spermiích (napadení purinových a pyrimidinových bazí a cukerné páteře DNA). Normálně je DNA ve spermiích pevně obalena protaminy1, které ji chrání před atakem ROS. Ve spermiích neplodných mužů byla prokázána nedostatečná protaminace DNA. Následkem je zvýšená citlivost DNA k oxidativnímu poškození (Shen and Ong, 2000; Ebisch et al., 2006, 2007; Tremellen, 2008). Hlavními zdroji ROS ve spermatu jsou leukocyty (převládají neutrofily) a samy spermie. Rychlost produkce volných radikálů je u leukocytů 1000 x vyšší než u spermií při kapacitaci (Tremellen, 2008) . Na druhé straně produkce malého množství ROS spermiemi je nutná k zajištění jejich správné funkce. ROS mají pozitivní účinky při kapacitaci spermií. Peroxid vodíku stimuluje reakci akrosomu a aktivitu spermií a napomáha tak při oplodnění vajíčka. Posiluje vazbu membrány spermií na protein
1
silně zásadité proteiny s vysokým obsahem argininu, spojené s nukleovými kyselinami, které se vyskytují především ve spermiích
23
ZP-3 zóny pellucida2 a podporuje tím fúzi spermie-vajíčko. Tvorba ROS spermiemi nepřímo koreluje s jejich zráním – spermatogenezí. Během tohoto procesu zrání ztrácí spermie cytoplazmu, následkem toho dochází k silnému zhuštění DNA v hlavičce spermie, což umožňuje vytvářet kondenzovaný prodloužený tvar spermií. Nezralé teratozoospermie3 jsou charakteristické přítomností nadměrného množství cytoplazmatických zbytků. Tyto zbytky obsahují enzym glukóza-6-fosfátdehydrogenasu (G6PD), který kontroluje tok glukózy a intracelulární tvorbu NADPH. NADPH je využíváno jako zdroj při generaci ROS působením NADPH oxidasy, která je lokalizována v membráně spermií. Výsledkem je zvýšená produkce ROS teratozoospemiemi v porovnání s morfologicky normálními spermiemi (Zarghami and Khosrowbeygi, 2005; Ebisch et al., 2006; Forges et al., 2007; Tremellen, 2008). Avšak jak již bylo zmíněno výše, nadměrná tvorba ROS vede ke vzniku oxidačního stresu a patologických stavů s ním spojených. Lidské tělo proto vyvinulo mnoho různých antioxidačních mechanismů, kterými udržuje oxidační rovnováhu a zajišťuje tak ochranu buněk před poškozením. Seminální tekutina a samy spermie disponují řadou ochranných antioxidantů, které můžeme rozdělit na enzymatické a neenzymatické. Mezi enzymatické antioxidanty patří superoxiddismutasa (SOD) a katalasa, které rozkládají superoxidový anion O2•− a peroxid vodíku na vodu a kyslík. SOD je přítomna jak v seminální tekutině, tak ve spermiích. Bylo potvrzeno spojení mezi deficitem SOD a neplodností mužů. Dále patří mezi enzymatickou antioxidační obranu glutathionperoxidasa (GPX). Tento enzym se skládá z antioxidačních podjednotek GPX1-5, které jsou využívány jako zdroj elektronů při redukci hydroperoxidů a nachází se ve varlatech, prostatě, semenných váčcích, chámovodech, nadvarlatech, seminální tekutině a ve spermiích. Také u GPX byla prokázána spojitost s mužskou neplodností. Aktivita tohoto enzymu závisí na regeneraci glutationu, který je redukován glutathionreduktasou (GTR). Selektivní inhibice GTR snižuje dostupnost redukovaného glutationu udržujícího aktivitu GPX a spermie jsou tak vystaveny oxidačnímu stresu. Koordinace aktivity GPX, GTR a glutationu hraje nepochybně klíčovou roli v ochraně spermií před oxidativním poškozením (Shen and Ong, 2000; Zini et al., 2000; Giannattasio et al., 2002; Garrido et al., 2004a,b; Vernet et al., 2004; Williams and Ford, 2004; Valko et al., 2007; Tremellen, 2008). Neenzymatické antioxidanty ve spermatu zastupují především kyselina askorbová (vitamin C), α-tokoferol (vitamin E), aminokyseliny taurin a hypotaurin, albumin, karnitin, karotenoidy, flavonoidy, uráty a prostazomy4. Tyto látky chemicky neutralizují aktivitu ROS. Avšak ochranu mohou poskytovat také dalšími dvěma mechanismy – albumin vychytává ROS tím, že oxiduje sám sebe a tím že se prostazomy spojují s leukocyty, čímž redukují jejich produkci ROS. Mnoho studií 2
blanka pokrývající zralé vajíčko
3
spermie, které nemají normální tvar
4
membránové váčky uvolňované prostatou, obsahují velké množství cholesterolu, sfingomyelinu, vápníku a několik enzymů; regulují životaschopnost spermií
24
potvrdilo výrazně nízkou aktivitu neenzymatických antioxidantů u neplodných mužů v porovnání s muži plodnými (Shen and Ong, 2000; Gurbuz et al, 2003; Koca et al., 2003; Mostafa et al., 2006; Song et al., 2006; Tremellen, 2008). Významnou součástí neenzymatických antioxidantů jsou také thioly – především pak glutathion (GSH) a cystein. Vychytávají ROS a tím dochází k jejich oxidaci, která je důležitá pro stabilizaci struktury bičíku spermií, pohyblivost spermií a ochranu jejich DNA před fyzikálním a chemickým poškozením. Avšak nadměrné vychytávání ROS má negativní účinky na průběh oplodnění a potvrzuje tak, že fyziologická hladina ROS je v tomto procesu nezbytná (Ebisch et al., 2006).
4.1.3
Foláty v mužském reprodukčním systému Seminální plazma je směs sekretů tzv. pomocných pohlavních žláz. Je tedy těžké stanovit
odkud foláty v seminální plazmě pochází a kolik je jich každou žlázou sekretováno. Z tohoto důvodu je složité vysvětlit biochemickou roli folátů v seminální plazmě. Wallock et al. (2001) měřili koncentraci folátů v seminální a krevní plazmě zdravých mužů. Bylo zjištěno, že koncentrace folátů v seminální plazmě významně koreluje s koncentrací folátů v krevní plazmě. Střední hodnota koncentrace folátů v seminální plazmě byla 18 nmol.l-1, v krevní plazmě potom 10 nmol.l-1. Dále bylo zjištěno, že 74 % folátů v seminální tekutině tvoří 5-methylTHF a 26 % nemethylované THF. Právě koncentrace nemethylovaných THF v seminální plazmě má významnou úlohu při spermatogenezi a zrání spermií a také úzce souvisí s jejich počtem (Tamura and Picciano, 2006; Forges et al., 2007). Všeobecně známá je také antioxidační funkce folátů. Bylo zjištěno, že hladina ROS v seminální plazmě je výrazně vyšší u neplodných mužů a negativně koreluje s koncentrací folátu a kobalaminu (Forges et al., 2007).
4.1.4
Vliv vitamínu B6, B12 a folátu na mužský reprodukční systém Spermatogeneze je ovlivněna řadou faktorů. K nejvýznamnějším patří výživa a životní styl.
Vitamíny B6, B12 a foláty se aktivně účastní metabolismu homocysteinu (viz kapitola 2) a jejich nedostatečný příjem vede k narušení tohoto metabolismu a vzniku mírné hyperhomocysteinemie, která má negativní účinky na spermatogenezi (Wong et al., 2002). Králíková et al. (2005) provedli studii, jejíž cílem bylo stanovit koncentraci homocysteinu, vitamínu B12 a folátu v seminální tekutině normospermiků5 a azoospermiků6. Hladina homocysteinu a vitamínu B12 byla výrazně vyšší u normospermiků a tentýž vztah byl nalezen také u folátu, rozdíl však nebyl tak výrazný. Nižší koncentrace homocysteinu u azoospermiků svědčí o celkově snížené testikulární metabolické aktivitě u těchto mužů.
5
muži, kteří mají ejakulát dle předepsaných norem
6
muži s poruchou tvorby spermií – v ejakulátu nejsou přítomny zralé spermie
25
Boxmeer et al. (2007) provedli studii u mužů, kteří se účastnili IVF7 nebo ICSI8. Cílem studie bylo stanovit koncentraci folátu, kobalaminu, pyridoxinu a homocysteinu v krvi a seminální plazmě a dále určit souvislost mezi těmito biomarkery a parametry spermatu. Analýza spermatu zahrnovala koncentraci, pohyblivost a morfologii spermií dle kritérií Světové zdravotnické organizace (WHO) – viz tabulka I. Tabulka I
Normální spermiologické hodnoty dle WHO (WHO laboratory manual, 1999)
Objem ejakulátu
2,0 a více ml
pH
7,2 – 8,0
Koncentrace spermií
20 milionů v ml
Celkový počet spermií
40 milionů a více
Pohyblivost
50 % spermií s pohybem vpřed nebo rychle vpřed; nebo 25 % s pohybem rychle vpřed
Morfologie
30 % a více normálních forem
Vitalita
50 % a více živých spermií
Ve studii byl nalezen vztah mezi koncentrací vitamínů skupiny B a tHcy v krvi (v seminální tekutině tomu tak nebylo) a také mezi koncentrací folátu a kobalaminu v séru a v seminální tekutině. Dále byla stanovena nižší koncentrace kobalaminu u oligospermiků v porovnání s normospermiky. Toto zjištění potvrzuje, že koncentrace kobalaminu výrazně souvisí s počtem spermií. U ostatních vitamínů skupiny B a tHcy byla souvislost se spermiologickými hodnotami vyloučena. Výsledky studie tedy naznačují přenos folátu a kobalaminu z krve do mužských reprodukčních orgánů a zdůrazňují tak jejich roli při spermatogenezi (Boxmeer et al., 2007). Kubešová et al. (2007) stanovovali koncentraci homocysteinu, folátu a vitamínu B12 v seminální plazmě u oligoasthenoteratozoospermiků9, azoospermiků a normospermiků. Významně vyšší koncentrace stanovovaných látek byla naměřena u normospermiků v porovnání s ostatními skupinami. U normospermiků byla také prokázána negativní korelace mezi hladinou folátu a homocysteinu. Tyto výsledky potvrzují sníženou metabolickou aktivitu testikulární tkáně azoospermiků, která byla zjištěna ve studii Králíkové et al. (2005).
4.1.5
Polymorfismu MTHFR a mužská neplodnost Za významný rizikový faktor mužké neplodnosti je považována homozygotní varianta
polymorfismu MTHFR – 677TT. Nepříznivé reprodukční výsledky u homozygotů polymorfismu
7
in vitro fertilizace – mimotělní oplodnění probíhající ve zkumavce
8
intracytoplasmatic spermia injection – přímá injekce jedné spermie do cytoplazmy zralého oocytu
9
muži se smíšenou poruchou počtu, pohyblivosti a morfologie spermií
26
MTHFR mohou souviset s předčasnými aterosklerotickými změnami cév, které jsou vyvolány zvýšenou koncentrací homocysteinu a způsobují zhoršení průtoku krve v tepnách varlat. Dále byl výskyt genotypu 677CT pro MTHFR 19 % u neplodných mužů a 10 % u plodných mužů. Bylo zjištěno, že počet spermií u mužů se standardním genotypem 677CC se po dávkách kyseliny listové a zinku zvýšil. Muži s genotypy 677TT a 677CT na dávky těchto látek nereagovali. Zatím však nebyl potvrzen kauzální vztah mezi mužskou neplodností a různými fenotypy genu MTHFR (Bezold et al., 2001; Ebisch et al., 2003; Tamura and Picciano, 2006; Forges et al., 2007).
4.2
Ženský reprodukční systém Účast hyperhomocysteinemie na vzniku kardiovaskulárních onemocnění inspirovala
gynekology, porodníky a neonatology k ověření vlivu homocysteinu na různé oblasti ženské reprodukce (Erben, 2005).
4.2.1
Tvorba pohlavních buněk – oogeneze K tvorbě pohlavních buněk dochází v ovariích postupným vývojem z buněk zárodečného
epitelu – oogonií. Počet oogonií se mitotickým dělením zvyšuje a je definitivně určen mezi 20. – 24. týdnem prenatálně, kdy dosahuje 6 – 7 milionů buněk. Pak už jejich počet pouze klesá. Obnova, na rozdíl od spermatogonií, není možná (Trojan et al., 2003).
4.2.2
Sekrece pohlavních hormonů Na rozdíl od muže mají funkce reprodukčního systému ženy cyklický charakter, který je dán
hormonální souhrou mezi hypotalamem, adenohypofýzou, vaječníky a dělohou. Proto rozeznáváme u ženy tři synchronní spolu související cykly – hypotalamický (primární), ovariální (ovulační) a děložní (endometriální – menstruační). Hypotalamický cyklus zajišťuje tvorbu folitropinu – folikuly stimulujícího hormonu (FSH) a lutropinu – luteinizačního hormonu (LH). Vlivem FSH a LH se ve vaječnících tvoří pohlavní hormony – estrogeny, gestageny a androgeny10. Mezi nejúčinnější estrogeny patří estradiol a nejdůležitějším gestagenem je progesteron (Trojan et al., 2003).
4.2.3
Vliv estradiolu na hladinu homocysteinu Ve věku 25 – 55 let umírá v důsledku kardiovaskulárních onemocnění 5 – 8x více mužů ve
srovnání se ženami. Avšak po menopauze se tento rozdíl značně snižuje. Je tedy zřejmé, že do menopauzy mají ženy ochranné faktory endotelu cév, které se po menopauze ztrácí. Dřívější studie ukázala snížení rizika infarktu myokardu u žen po menopauze, které podstoupily estradiolovou 10
mužské pohlavní hormony – malé množství vzniká také u žen
27
substituční léčbu (Barrett-Connor and Bush, 1991). Ochrana cév byla tedy připsána právě ženskému hormonu estradiolu. Původně se předpokládalo, že ochranné učinky tohoto hormonu souvisí s jeho působením na metabolismus cholesterolů a lipidů. Nicméně výsledky studie, které se zabývaly vlivem estradiolové substituční léčby u žen s již diagnostikovanou aterosklerozou, tuto teorii vyvrátily. Ke zlepšení stavu žen nedošlo, přestože hladina cholesterolu a lipidů byla snížena (Hulley et al., 1998). V roce 2001 Dimitrova et al. sledovali in vitro a in vivo ochranu cév před poškozením. Hladina homocysteinu u experimentálně vyvolané hyperhomocysteinemie byla snížena estradiolem. Mijatovic a van der Mooren (2001) vytvořili přehled studií, které popisovaly vliv estradiolu na hladinu homocysteinu. Inhibiční účinek estradiolu na produkci homocysteinu potvrdila většina z nich. Následkem vysoké koncentrace homocysteinu je tvorba ROS, které poškozují cévní endotel. Estradiol zvyšuje hladinu glutathionu, který ROS vychytává a snižuje tak jejich hladinu. Dále estradiol pravděpodobně zvyšuje aktivitu cystathionin-β-syntasy, následkem toho převládne v metabolismu homocysteinu transsulfurace (Dimitrova et al., 2002; Ebisch et al., 2006; Forges et al., 2007). Hladina homocysteinu se vlivem estradiolu mění také v průběhu menstruačního cyklu. Tallová et al. (1999) měřili koncentraci homocysteinu u 15 žen před menopauzou během luteální a folikulární fáze menstruačního cyklu. Vyšší hladina tHcy byla stanovena během folikulární fáze oproti fázi luteální, kdy výrazně stoupá hladina steroidních hormonů. Při sledování vlivu estradiolu na tHcy byly zjištěny tři základní rozdíly: 1) koncentrace tHcy u žen byla významně nižší než u mužů stejného věku; 2) ženy před menopauzou měly nižší koncentraci tHcy v porovnání se ženami po menopauze a 3) u těhotných žen byla stanovena výrazně nízká hladina tHcy (Morris et al., 2000; Eskes, 2001).
4.2.4
Těhotenství a homocystein Pro těhotenství je charakteristická řada fyziologických změn, jako je zvýšení hladin prakticky
všech hormonů, krevního a srdečního objemu, periferní vazodilatace, ledvinové clearance a tělesné váhy. Díky těmto změnám je těhotenství unikátním „studijním modelem“. Tyto změny se týkají také hladiny homocysteinu, která je v plazmě těhotných žen o 50 – 60 % nižší než u žen netěhotných. Přesněji tHcy je nejnižší ve druhém trimestru těhotenství. Důvod snížení tHcy během těhotenství není znám. Možným vysvětlením může být naředění krve; změny endokrinních funkcí – zvýšená produkce estradiolu; zvýšená ledvinová clearance homocysteinu; snížení hladiny albuminu, na který se homocystein váže nebo zvýšené požadavky rostoucího plodu na dávky methioninu (Eskes, 2001; Calle et al., 2003; Powers et al., 2004; Holmes et al., 2005; Tamura and Pacciano, 2006). V průběhu těhotenství může vznikat mnoho komplikací a patofyziologických stavů. V řadě z nich hraje klíčovou roli také homocystein.
28
Preeklampsie Jedná se o složitý patologický stav zjednodušeně charakterizovaný hypertenzí (nad hodnoty 140/95 mmHg), proteinurií (více jak 300 mg/24 hodin) a případně edémy v posledním trimestru těhotných žen. I v dnešní době je hlavní příčinou mateřské a perinatální morbidity a postihuje až 7 % těhotenství. Na základě všech dosud známých hypotéz můžeme říci, že konečným patogenetickým mechanismem při preeklampsii je dysfunkce endotelu s následnou ischémií placenty, která neplní správně všechny fyziologické funkce, což přináší vážné komplikace pro matku i plod. Nejzávažnější klinický stav, ve který může vyústit těžká preeklampsie, je eklamptický záchvat – záchvat tonickoklonických křečí s následným stavem hlubokého bezvědomí (Arnoštová et al., 2007; Dostálová and Gerychová, 2008). Hoque et al. (2008) měřili hladinu homocysteinu v séru zdravých těhotných žen a těhotných žen s preeklampsií a eklampsií. U žen s preeklampsií stanovili významně vyšší koncentraci homocysteinu oproti zdravým ženám a dále závažnost nárůstu homocysteinu byla vyšší u žen s eklampsií v porovnání s preeklamptickými ženami. Stejných výsledků dosáhli ve svých studii také Makedos et al. (2007) a Hasanzadeh et al. (2008). Ti stanovili vyšší hladinu homocysteinu v plazmě těhotných žen s preeklampsií v porovnání s ženami, které zůstaly normotenzivní v průběhu celého těhotenství. Zdá se tedy, že hyperhomocysteinemie je jedním z faktorů, který způsobuje cévní dysfunkce u těhotných žen s preeklampsií a má tak kauzální roli v etiopatogenezi preeklampsie/eklampsie (Calle et al., 2003; Hoque et al., 2008). Dále Hoque et al. (2008) navrhují měření koncentrace homocysteinu v séru všech těhotných žen jako součást rutinní prenatální kontroly, což by mohlo pomoci výrazně snížit nepříznivé výsledky těhotenství. Abrupce placenty Jedná se o předčasné odlučování placenty, kdy se placenta stává úplně nebo částečně oddělenou před narozením dítěte a způsobuje masivní krvácení. Během tohoto akutního stavu je ohrožen život plodu i matky (Calle et al., 2003). Zvýšená hladina homocysteinu představuje hlavní rizikový faktor abrupce placenty u těhotných žen. Předpokládá se, že hyperhomocysteinemie u těchto žen způsobuje poškození cév placenty (Calle et al., 2003; Budde et al., 2007). S výskytem abrupce placenty jsou také spojeny změny v metabolismu folátu a následně jeho nedostatek. To naznačuje, že správná hladina kyseliny listové u těhotných žen během druhého a třetího trimestru by mohla být, v některých případech, prevencí výskytu abrupce placenty a úmrtí plodu. Spojení abrupce placenty a polymorfismů genů souvisejících s metabolismem folátu (např. gen MTHFR) není zcela jednoznačné a vyžaduje další studie (Calle et al., 2003; Tamura and Picciano, 2006).
29
Samovolné potraty a jejich opakování Samovolný potrat je definován jako ztráta nebo ukončení těhotenství před 20 týdnem gravidity. Opakované (habituální) potrácení je charakterizováno 3 a více následnými samovolnými ztrátami plodu. Postihuje asi 1 % žen v reprodukčním věku (Krajčovičová et al., 2007). Úspěšné těhotenství je silně ovlivněno správným vývinem a funkcí placenty. Správná funkce placenty může být porušena zvýšeným rizikem trombózy v důsledku přítomnosti mikrotrombů v cévním řečišti placenty. Tyto mikrotromby mohou způsobovat četné placentální infarkty a následné komplikace v těhotenství. Několik studií prokázalo, že opakující se potraty jsou spojeny se zvýšeným rizikem
trombózy,
které
je
způsobeno
dědičnými
trombofilickými
poruchami
nebo
hyperhomocysteinemií, popřípadě kombinací obou. Hyperhomocysteinemie se tak stává rizikovým faktorem pro samovolné potraty a jejich opakování. Bylo zjištěno, že hyperhomocysteinemie zvyšuje riziko potratů až 3x a je spojena s poškozením DNA a expresí genů, které způsobuje porušení cévního zásobení obalu plodu a následnou smrt embrya. Hyperhomocysteinemie a s ní spojené cévní onemocnění jsou pravděpodobně způsobené interakcí nutričních a genetických faktorů – např. podvýživa a porucha vstřebávání folátu a vitamínu B12 nebo vrozené defekty enzymů. Zvýšená hladina homocysteinu může vést k poškození deciduálních11 nebo chorionických12 cév a bránit tak nidaci oplodněného vajíčka (Unfried et al., 2002; Azem et al., 2004; Qublan et al., 2006). Také polymorfismus MTHFR významně ovlivňuje výskyt samovolných potratů a jejich opakování. Rodriguez-Guillén et al. (2009) ve své studii zjišťovali spojitost mezi polymorfismem MTHFR a výskytem spontánních potratů. Výsledky této studie potvrdily výskyt polymorfismu jako rizikového faktoru samovolných potratů – ženy s genotypem 677TT měly zvýšené riziko samovolných potratů. Mechanismus, kterým polymorfismus MTHFR zvyšuje riziko samovolných potratů, není objasněn. Byla vyslovena hypotéza, že riziko těchto potratů může být spojeno se zvýšenou hladinou homocysteinu. Hyperhomocysteinemie snižuje dostupnost methylů v procesu methylace, který má důležitou roli při opravách DNA a stabilizaci genomu. Polymorfismus MTHFR je spojen se sníženou methylací DNA. Govindaiah et al. (2009) ve své studii zjistili, že nejen mateřská hyperhomocysteinemie, ale také hyperhomocysteinemie otce zvyšuje riziko opakovaných potratů. Dále také objevili, že polymorfismus MTHFR u otce a věk otce jsou rizikové faktory výskytu opakovaných potratů. Vrozené vývojové vady Uzavírání nervové trubice se odehrává mezi třetím a čtvrtým týdnem po početí. Nedostatek folátu je hlavní příčinou vrozených vývojových vad uzavírání neurální trubice v ranném stádiu 11 12
děložní sliznice v těhotenství chorion – vnější obal plodu
30
těhotenství. Defekty postihují buď mozkovou část neurální trubice, pak jsou většinou neslučitelné se životem, nebo postihují koncovou část a figurují jako spina bifida13. Tyto poruchy jsou ukázkou následků nedostatku stavebního materiálu pro syntézu bílkovin v místech intenzivního růstu tkání. Také byl nalezen vztah mezi polymorfismem MTHFR, konkrétně genotypem C677TT, a výskytem defektů nervové trubice (Eskes, 2001; van der Put et al., 2001; George et al., 2002; Erben, 2005; Tamura and Picciano, 2006). Hyperhomocysteinemie je zapojena v patofyziologii dalších vrozených vad. Homocystein působí přímo na buněčnou DNA, která interferuje s různými stupněmi organogeneze. Vyšší hladina homocysteinu byla stanovena u matek dětí s orofaciálními malformacemi – rozštěpy pater a rtů a dětí s vrozenými srdečními vadami. Prevencí všech těchto vrozených vad jsou adekvátní dávky kyseliny listové v průběhu těhotenství (Calle et al., 2003).
4.2.5
Metody asistované reprodukce Léčba neplodnosti pomocí metod asistované reprodukce je jednou z nejprogresivnějších
oblastí moderní medicíny. Od narození prvního dítěte ze zkumavky v roce 1978 (Louise Brownová, která se narodila ve Velké Británii díky péči slavných průkopníků Edwardse a Steptoea) došlo v oblasti výzkumu a diagnostiky neplodnosti a ve vývoji léčebných postupů k obrovským pokrokům (www.iscare.cz). Při dobrém spermiogramu probíhá konvenční IVF metoda, při které jsou vajíčka kultivována společně se spermiemi ve speciálním médiu a kontrolována, zda dochází k samovolnému oplození „ve zkumavce“. Pokud jsou parametry spermiogramu nedostačující, je nutné použít tzv. mikromanipulační techniku ICSI. Po oplodnění následuje tvz. embryotransfer - přenos embrya do dělohy (www.ivf-motol.cz; www.iscare.cz, www.ivfbrno.cz).
Obr. 4.3 Postup při IVF (www.ivf-motol.cz)
13
vrozený rozštěp páteře, při kterém nejsou uzavřeny obratlové oblouky a mícha se svými obaly vystupuje ven z páteřního kanálu
31
Vliv hyperhomocysteinemie na výsledky IVF Pacchiarotti et al. (2007) provedli studii založenou na hypotéze, že hyperhomocysteinemie může být významný rizikový faktor neúspěšné nidace oplodněného vajíčka u pacientů, kteří podstoupili IVF. Cílem studie bylo zhodnotit účinek hyperhomocysteinemie na výsledek IVF – podíl těhotenství, nidací a potratů. Studie se zúčastnilo 46 neplodných párů, které byly náhodně rozděleny do 2 skupin: studijní skupina A a kontrolní skupina B. Pacienti ve skupině A podstoupili léčbu spočívající v denních dávkách kyseliny listové (400 µg), týdenních dávkách cyanokobalaminu (5000 µg) a hydrochloridu pyridoxinu (600 µg). Léčba trvala až do normalizace hladiny homocysteinu < 17 µmol.l-1. Skupina B byla bez léčby. Počet nidací a těhotenství byl výrazně snížen u skupiny pacientů bez léčby. Statisticky významný rozdíl byl nalezen v počtu potratů, který byl nižší u pacientů se sníženou hladinou homocysteinu před IVF. Výsledky studie tedy potvrdily hypotézu o hyperhomocysteinemii jako rizikovém faktoru koagulačních dysfunkcí, které mohou být příčinou vzniku mikrotrombů v děložních cévách, následkem kterých může dojít k potratům nebo je bráněno nidaci oplodněného vajíčka. Boxmeer et al. (2008) studovali vliv ovariální stimulace gonadotropinem na hladinu biomarkerů metabolismu homocysteinu v krvi a ve folikulární tekutině zrajícího oocytu a určovali vztahy mezi hladinou těchto biomarkerů a velikostí folikulu. Bylo zjištěno, že ovariální stimulace výrazně snižuje hladinu homocysteinu a kobalaminu v krvi, avšak hladinu folátu a pyridoxinu neovlivňuje. Dále koncentrace homocysteinu ve folikulární tekutině negativně korelovala s velikostí folikulu. Tato korelace byla výrazně silnější u žen, které neužívaly dávky kyseliny listové. Avšak překvapivě u žen, které užívaly kyselinu listovou, koncentrace folátu ve folikulární tekutině také negativně korelovala s velikostí folikulu. To naznačuje, že vysoké koncentrace jak homocysteinu, tak folátu mohou mít škodlivý vliv na folikulární růst. Je tedy třeba nalézt optimální dávky kyseliny listové nejen pro prevenci výskytu defektů neurální trubice, ale také pro zlepšení kvality oogeneze.
4.2.6
Syndrom polycystických ovarií (PCOS) Jedná se o jednu z nejčastějších endokrinopatií žen ve fertilním věku (postihuje asi 5 – 10 %
žen v této věkové skupině). Nejedná se o jednu přesně vymezenou chorobu, ale o syndrom se širokým spektrem genotypických manifestací. Její etiologie a patofyziologie nejsou stále přesně objasněny. Za normálních okolností jsou folikuly uvnitř vaječníků působením hormonů z hypofýzy stimulované k růstu, zrají a stoupají k povrchu vaječníku, kde prasknou a uvolní vajíčko. Zbytky z roztrženého folikulu pak začnou produkovat progesteron, který stimuluje zbytnění výstelky dělohy (endometrium) k zesílení, pro případ, že bude potřeba pro podporu oplodněného vajíčka. Zvýšení produkce progesteronu je signálem pro hypofýzu k zastavení stimulace vývoje vajíček.
32
V případě PCOS se folikuly z vaječníku neuvolňují. Rostou pod povrchem vaječníku a jsou vytvářeny stále znovu, protože hypofýza nesignalizuje zastavení jejich produkce. Oba vaječníky se naplní malými cystami a dochází k jejich zvětšení. Zesílené pouzdro také roste aby obalilo vaječník. Symptomy u většiny žen s PCOS jsou nepravidelný menstruační cyklus, setkáváme se u nich obvykle s oligoamenoreou14 nebo sekundární amenoreou15, dále chronickou anovulací, která je důvodem sterility, a hyperandrogenémií. Ženy s PCOS mají také vyšší riziko potratů – zejména v rané graviditě, patologického průběhu těhotenství a porodních komplikací (Vrbíková, 2003; Cibula et al., 2004). Berker et al. (2009) měřili hladinu homocysteinu ve folikulární tekutině žen s PCOS, které podstoupily IVF. Koncentrace homocysteinu ve folikulární tekutině je u těchto žen výrazně vyšší oproti zdravým ženám. Zjistili negativní spojitost mezi hladinou homocysteinu a kvalitou oocytů, embryí a podílem fertilizace u těchto žen. Dále bylo zjištěno, že vyšší hladina homocysteinu ve folikulární tekutině může potlačovat produkci estrogenu a interferovat s rozvojem dominantního folikulu, zráním oocytu a s fertilizací u žen s PCOS podstupujících IVF. V této studii byla také vyslovena hypotéza, že vyšší koncentrace homocysteinu ve folikulární tekutině může způsobovat řadu vývojových defektů oocytu, které mohou bránit oplození těchto žen. Homocystein může tedy u žen s PCOS, které podstoupily IVF, představovat vhodný marker pro stanovení kvality oocytů, embryí a podílu fertilizace.
14
slabé krvácení při menstruaci
15
vynechání menstruačního krvácení
33
5 ANALYTICKÉ METODY STANOVENÍ HOMOCYSTEINU Vzhledem k příbuzné struktuře homocysteinu a cysteinu je kladen velký důraz na dostatečnou specifitu analytických metod pro homocystein. Další překážkou při stanovení homocysteinu je jeho vazba na proteiny. U většiny analytických metod se před vlastním měřením provádí redukce vzorků, která homocystein z těchto vazeb uvolní. K nejčastěji používaným redukčním činidlům patří tri-N-butylfosfin (TBP), tris-(2-karboxylethyl)-fosfin (TCEP), tetrahydroboritan sodný (NaBH4) a dithiothreitol (DTT). Některé metody zahrnují ve svém postupu také derivatizační reakce (Humplíková et al., 2007). Dříve byla koncentrace homocysteinu stanovována nejčastěji pomocí iontoměničového aminokyselinového analyzátoru nebo radioenzymové metody. V současné době se homocystein stanovuje především pomocí HPLC a imunochemickými metodami (Rasmussen and Møller, 2001; Amarnath et al., 2003; Sawula et al., 2008).
5.1
Imunochemické metody Tyto metody stanovují množství S-adenosylhomocysteinu, který vzniká z homocysteinu za
účasti SAHhydrolasy. Imunoenzymové metody (EIA) stanovují množství SAH na základě kompetitivní reakce s použitím monoklonální protilátky anti-SAH. Stejný princip využívají také fluorescenční polarizační imunometody (FPIA). SAH soutěží o vazebná místa monoklonální protilátky s analogem značeným fluoresceinem (Schipchandler and Moore, 1995; Frantzen et al., 1998; Tripodl et al., 2001; Badiou et al., 2006). V poslední době zaznamenává rychlý vývoj oblast mikrotechnologie, která umožňuje provádět imunoanalýzu pomocí mikročipů. Tato metoda má řadu výhod, např. vyšší reakční účinnost, jednoduchost provedení, kratší doba provedení, malá spotřeba vzorků a reagentů. Malé objemy vyžadují použití citlivých detektorů, které jsou založeny na fluorescenci, chemiluminiscenci nebo na elektrochemických principech (Suk et al., 2008).
5.2
Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) HPLC je dnes nejčastěji používaná metoda pro stanovení homocysteinu v krvi. Jednotlivé typy
HPLC se od sebe liší použitím různých druhů redukčních a deprivatizačních činidel a detekčními způsoby (Rasmussen and Møller, 2001). V následujícím přehledu jsou uvedeny nejpoužívanější způsoby stanovení homocysteinu pomocí HPLC metod.
5.2.1
HPLC s fluorescenční detekcí U této metody se provádí předkolonová derivatizace thiolů fluorogenními látkami, následuje
HPLC
s
fluorescenční
detekcí.
Mezi
nejčastěji
používané
fluorogenní
látky
patří
34
amonium-7-fluorobenzo-2-oxa-1,3-diazol-4-sulfonát (SBD-F). K výhodám metody patří stabilita sloučenin thiolů s SBD-F a jejich vysoká fluorescence (Rasmussen and Møller, 2001; Ashavaid et al., 2003).
5.2.2
HPLC s tandemovou hmotnostní spektrometrií (LC-MS/MS) Tato metoda byla vyvinuta pro analýzu tHcy v plazmě a v moči. Jako redukční činidla jsou
používána DTT nebo NaBH4 a konečná analýza je prováděna LC-MS/MS. Metoda patří mezi vysoce selektivní, specifické a časově nenáročné techniky a je vhodná pro rutinní stanovení hladiny tHcy v plazmě. Obchází časově náročné derivatizace, které jsou nezbytné při stanovení hladiny homocysteinu HPLC s fluorescenční detekcí a umožňuje tak analyzovat větší množství vzorků (Magera et al., 1999; Humplíková et al., 2007).
5.2.3
HPLC s elektrochemickou detekcí Přítomnost triolové skupiny v molekule homocysteinu umožňuje detekci založenou na
oxidačně-redukčních reakcích. Tato metoda nevyžaduje deprivatizaci vzorku. K nevýhodám patří možnost kontaminace průtokové kyvety a poškození Au/Hg elektrody (Rasmussen and Møller, 2001). Metoda používaná Melnykem et al. (1999) stanovuje zároveň oxidované a redukované formy aminothiolů použitím coulometrické elektrochemické detekce.
5.2.4
HPLC s fotometrickou detekcí V poslední době je využívána specifická postkolonální detekční metoda založená na
shlukování zlatých nanočástic (GNPs) s aktivním povrchem. Agregace zlatých nanočástic je indukována homocysteinem nebo cysteinem a má za následek snížení absorpce roztoku při 525 nm nebo naopak zvýšení absorpce při vyšších vlnových délkách 600 – 700 nm. GNPs jsou vysoce selektivní a nereagují s ostatními aminokyselinami a biomolekulami. Další výhodou těchto částic je jejich vysoká stabilita ve vodných roztocích (Lu et al., 2007).
5.3
Další metody stanovení homocysteinu Plynová chromatografie s hmotnostní spektrometrií (GC-MS) Vzorky plazmy nebo séra jsou redukovány DTT, deproteinovány ethanolem a derivatizovány
přídavkem methylchloromravenčnanu a toluenu. Výsledné produkty jsou analyzovány pomocí GC-MS. Metoda byla vyvinuta a ověřena Windelbergem et al. (2005) a k jejím výhodám patří rychlá a jednoduchá příprava vzorků ve vodném prostředí při pokojové teplotě.
35
Vysokoúčinná kapilární elektroforéza (HPCE) HPCE je vysoce selektivní, rychlá a přesná metoda vhodná pro běžná klinická stanovení. Homocystein po uvolnění z vazby na proteiny reaguje s 5-bromomethylfluoresceinem (5-BMF). K detekci produktu se využívá laserem indukovaná fluorescence (LIF). K výhodám metody patří jednoduchá instrumentace, stanovení ve velmi malých objemech vzorku (řádově nanolitrech) a minimální spotřeba roztoků. Metodou je možno stanovit i další nízkomolekulární sirné sloučeniny jako methionin, cystein a glutathion (Vecchione et al., 1999). Kolorimetrické metody Matsuyama et al. (2001) vyvinuli kolorimetrickou metodu využívající enzymové reakce. Vzorky jsou redukovány DTT. Následuje kaskáda reakcí, které jsou katalyzované specifickými enzymy. Konečným produktem je methylenová modř s absorpčním maximem 660 nm. Drobným nedostatkem metody je předběžná manuální úprava vzorků. Do této skupiny patří také vysoce selektivní a specifická metoda pro stanovení cysteinu a homocysteinu. Její podstatou je reakce aldehydických skupin azobarviv s cysteinem a homocysteinem. Reakce probíhá při neutrálním pH a dochází při ní k prostým okem pozorovatelné změně barvy z růžové na žlutou (Zhang et al., 2006).
Obr. 5.1 Souhrn metod pro stanovení koncentrace tHcy (Refsum et al., 2004, upraveno)
36
6 KOMETOVÁ ANALÝZA Kometová analýza (comet assay) neboli gelová elektroforéza jednotlivých buněk (SCGE – single cell gel electrophoresis) je vysoce citlivá mikroelektroforetická metoda, která slouží k detekci poškození DNA v jednotlivých buňkách. Výsledný obrazec vlivem migrace poškozené DNA připomíná kometu.
hlava
ohon
Obr. 6.1 Výsledný obrazec kometové analýzy (Dvořák and Matejovičová, 2008)
Tato metoda, která je atraktivní pro svou jednoduchost a rychlost provedení, byla poprvé publikována v roce 1984, ale své kořeny má již v 70. letech 20. století. Od té doby prošla mnoha úpravami a zdokonaleními. V současné době se používají dvě základní modifikace kometové analýzy – alkalická a neutrální SCGE. Při alkalické SCGE dochází k separaci obou vláken DNA, proto je využívána především k detekci jednořetězcových zlomů. Neutrální SCGE potom k detekci zlomů dvouřetězcových. K těmto zlomům dochází v důsledku přerušení fosfodiesterové vazby mezi dvěma sousedními deoxynukleotidy. Dvouřetězcové zlomy se dělí na posunuté, vznikající na obou řetězcích v různých, ale blízkých místech, a na zarovnané, které vznikají protilehle. Při vzniku zlomů v řetězcích DNA hrají roli tzv. apurinová/apyrimidinová místa (AP místa) – místa bez dusíkaté báze. Tato místa jsou alkalilabilní a při vysokém pH jsou přeměněna na zlomy v řetězcích (Lewis et al., 2008; Dvořák and Matejovičová, 2008).
6.1
Obecný postup metody Podložní mikroskopická sklíčka jsou potažena na jedné straně normální agarosou.
Po zpolymerování a vysušení této vrstvy agarosy jsou analyzované buňky smíchány s nízkotající agarosou (LMPA – low melting point agarose), která má oproti normální agarose sníženou teplotu tuhnutí. Normální agarosa vytváří gel při teplotě kolem 50 °C, avšak LMPA je za fyziologických teplot ještě tekutá. To umožňuje přidání zkoumaných buněk do prochladlého roztoku agarosy a nedochází tak k poškození buněk vysokou teplotou. Buňky s LMPA jsou naneseny na podložní sklíčko, přikryty krycím sklíčkem a uloženy do chladu, aby LMPA s buňkami ztuhla a spojila se s vrstvou normální agarosy (Dvořák and Matejovičová, 2008).
37
Lýza a denaturace Poté jsou skla vložena do lyzačního roztoku, jehož působením jsou z buněk odstraněny membrány, cytoplasma a většina nukleárních proteinů. DNA zůstává ve formě tzv. nukleoidu, který má strukturu superhelixu. Při alkalické, nebo alkalicko-neutrální modifikaci se skla po inkubaci v lyzačním roztoku vloží do alkalického denaturačního roztoku. Denaturace probíhá při pokojové teplotě a za tmy. Dochází při ní k narušení struktury superhelixu a DNA je tak vysoce citlivá k poškození denním nebo bílým zářivkovým světlem – mohou způsobit zlomy a poškození bází denaturované DNA (Dvořák and Matejovičová, 2008). Elektroforéza Ihned po denaturaci následuje elektroforéza. Neporušená DNA je relativně pevně agregována a v elektrickém poli se příliš nepohybuje. Avšak jednořetěžcový zlom stačí na relaxaci superhelixového vinutí. S relaxovanými smyčkami se pohybují i malé fragmenty DNA vzniklé poškozením. Relaxovaná a fragmentovaná DNA má (jako celá molekula DNA) negativní náboj a v elektrickém poli se pohybuje směrem k anodě. Po obarvení, které následuje po skončení elektroforézy, a zafixování skel, jsou fragmenty DNA vidět jako ohon za hlavou komety. Větší množství DNA v ohonu komety tedy znamená větší poškození DNA buňky (Dvořák and Matejovičová, 2008). Barvení a hodnocení komet Detekci komet je možné provést fluorescenčními barvivy – např. ethidium bromid, propidium jodid, akridinová oranž, DAPI (4´,6-diamidino-2-fenylindol), nebo obarvením stříbrem. Barvení stříbrem je levnější, nevyžaduje speciální fluorescenční mikroskop a má trvalý charakter, který umožňuje kdykoli opakovat hodnocení. Nevýhodou je nespecifické barvení a občasné přebarvení pozadí. Fluorescenční barvení je selektivnější (snazší odlišení pozadí a komety), avšak může docházet k blednutí obarvení a to i po použití stabilizujících prostředků. Následné hodnocení komet lze provádět manuálně – tvz. „visual scoring“ nebo speciálním počítačovým softwarem. Scoring je rozdělení komet do několika kategorií podle míry poškození. Toto hodnocení je však obtížně reprodukovatelné a je ovlivněno řadou faktorů. Softwarové hodnocení tyto obtíže do jisté míry redukuje. Parametrů používaných v hodnocení komet je mnoho. Nejpoužívanější jsou dva: procentuální zastoupení DNA v ohonu (tail % DNA), které je vyjádřeno jako podíl celkové intenzity ohonu a celkové intenzity komety (hlavy i ohonu), celé násobené 100 a délka ohonu (tail lenght). Dalším hodnoceným parametrem může být % DNA v hlavě (head % DNA, podíl celkové intenzity hlavy a celkové intenzity komety), tail moment (podíl % DNA v ohonu a délky ohonu).
38
K výhodám metody patří především snadnost provedení bez potřeby speciálního vybavení, dále rychlost a citlivost metody, relativně nízké náklady a malé množství vzorku. Nevýhoda spočívá v nesnadné interpretaci výsledků, jelikož mezi poškozením DNA a biologickým dopadem tohoto poškození neexistuje přímý vztah (Dvořák and Matejovičová, 2008).
6.2
Využití metody Kometová analýza má široké využití v mnoha různých aplikacích a oborech. V ekologii se
s využitím biosenzorů provádí monitoring zamořeného prostředí. Dále se využívá při testování farmakologických a chemických látek, protektivních účinků antioxidantů a účinnost kosmetických přípravků. K velkému rozšíření této metody došlo v oblasti biomonitoringu pracovního prostředí (testování působení toxických látek a záření) a v neposlední řadě také v klinické diagnostice různých patologických stavů – např. výzkum spermií a karcinomů (Lewis et al., 2008; Dvořák and Matejovičová, 2008; Speit et al., 2009).
39
CÍLE PRÁCE
•
optimalizace metody HPLC pro stanovení homocysteinu v seminální tekutině
•
zavedení a optimalizace metody HPLC pro stanovení homocysteinu ve spermiích (jejich rozbití a následná analýza)
•
stanovení koncentrace homocysteinu ve folikulární tekutině žen a v seminální tekutině a spermiích mužů párů podstupujících IVF
•
optimalizace metody kometové analýzy DNA ve spermiích
•
posouzení vlivu homocysteinu na lidskou plodnost
40
EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 7 MATERIÁL A METODY 7.1
Uchovávání a zpracování vzorků Vzorky byly získávány z Centra asistované reprodukce CAR 01 Brno Gynekologicko-
porodnické kliniky FN Brno. Pacientům byla odebrána plná krev, z níž byla centrifugací 10 minut při 664 g oddělena krevní plazma. Odběr ejakulátu byl prováděn masturbací po 3 denní pohlavní abstinenci. Po odběru byl ponechán 1 hodinu při pokojové teplotě, aby došlo ke zkapalnění, a poté byly stanoveny hodnoty spermiogramu dle manuálu WHO (WHO laboratory manual, 1999). Folikulární tekutina byla odebírána pod ultrazvukovou kontrolou po ovariální stimulaci folikuly stimulujícím hormonem (FSH), který byl aplikován injekčně do podkoží nebo svalu. Vzorky kontaminované krví byly vyloučeny pomocí diagnostických proužků Hemophan (Lachema). Vzorky z CAR 01 byly přepravovány v tekutém dusíku a do vlastní analýzy uchovávány při – 80 °C. Pacienti, jejichž vzorky byly použity, podepsali souhlas se zařazením do výzkumu. Před analýzou byly vzorky krevní plazmy a folikulární tekutiny rozmrazeny a centrifugovány 10 minut při 2655 g (Centrifuge 5804R, Eppendorf). Poté z nich bylo odebráno 100 µl k derivatizaci. Vzorky ejakulátu byly před analýzou rozmrazeny, promíchány a bylo z nich odebráno 100 µl na kometovou analýzu. Zbylý objem ejakulátu byl rozdělen dle počtu spermií pacienta. Při vysokém počtu spermií (60 milionů v 1 ml a více) docházelo při dalším zpracování (rozbíjení) k jejich shlukování. Proto byl pro další práci stanoven objem ejakulátu na 200 µl o koncentraci 60 milionů spermií v 1 ml, což odpovídá 12 milionům spermií. U mužů s nízkým počtem spermií by byl potřeba ke splnění této podmínky velký objem ejakulátu, což bylo nerealizovatelné. Zbylý ejakulát byl tedy rozděl na dvě části o stejném objemu, aby byl získán duplikát vzorku. Poté byly vzorky centrifugovány 10 minut při 2655 g, oddělen supernatant (seminální tekutina) od peletu (spermie) a obě tyto části byly do samotné analýzy uloženy při – 80 °C. Před analýzou byly vzorky seminální plazmy po rozmrazení centrifugovány 10 minut při 2655 g a následně z nich bylo k derivatizaci odebráno 100 µl.
7.2
Kometová analýza Podložní sklíčka byla pokryta 1% agarosou (0,125 g agarosy rozpuštěno ve 12,5 ml
fosfátového pufru o složení: 135 mM NaCl; 2,7 mM KCl; 1,54 mM KH2PO4; 2,74 mM Na2HPO4 . 12H2O; pH 7,4; a sušena 40 minut při 60 °C (Ecocell 55).
41
V první sérii pokusů bylo ze vzorků plného ejakulátu bylo odebráno 100 µl a centrifugováno 10 minut při 664 g. Po oddělení supernatantu (seminální plazmy) byly spermie naředěny fosfátovým pufrem s přídavkem 10 mM EDTA (1 ml 0,5 M EDTA; 5 ml zásobního roztoku fosfátového pufru doplněno deionizovanou vodou do celkového objemu 50 ml) tak, aby byl počet spermií v 1 ml 1 x 106. 50 µl takto naředěných spermií bylo řádně rozsuspendováno v 200 µl 0,8% nízkotající agarosy (LMPA – low melting point agarose; Invitrogen, Spain; 80 mg rozpuštěno v 10 ml fosfátového pufru o složení 135 mM NaCl; 2,7 mM KCl; 1,54 mM KH2PO4; 2,74 mM Na2HPO4 . 12H2O; pH 7,4), která byla temperována v termostatu (BioTBD-100, Biosan) na 36 °C. Dále bylo pipetováno 70 µl vzorku spermií s LMPA na vrstvu agarosy na podložních sklíčkách, rychle překryto sklíčky krycími a ponecháno 15 minut při 4 °C ztuhnout. Na každém podložním sklíčku byla 2 pole s naředěnými spermiemi. V další sérii pokusů byly vzorky ejakulátu rozděleny na dvě části a naředěny na koncentraci spermií 1 x 106 v 1 ml. První část vzorků byla inkubována 10 minut při pokojové teplotě s H2O2 (29 µl 30% H2O2 naředěno 25 ml H2O) Druhá – kontrolní skupina byla inkubována ve fosfátovém pufru. Další postup metody byl stejný jako v první sérii pokusů. U těchto vzorků byl po provedení kometové analýzy hodnocen vliv oxidačního stresu na poškození DNA spermií. Lýza a denaturace Poté byla krycí sklíčka odstraněna a podložní sklíčka vložena do lyzačního roztoku (2,5 M NaCl; 100 mM Na2EDTA; 10 mM Tris-HCl; pH 10) s 1% Tritonem X-100 (Sigma Aldrich, Germany) a inkubována 1 hodinu při 4 °C. Následně bylo k lyzačnímu roztoku přidáno 2,5 ml 10 mM dithiothreitolu (DTT; Sigma Aldrich, Canada) a inkubováno 30 minut při 4 °C. Po 30 minutách bylo k roztoku přidáno 2,5 ml 4 mM lithium diodosalicylátu (LIS; Sigma Aldrich, Germany) a inkubováno 90 minut při pokojové teplotě ve tmě. Po inkubaci s LIS byla podložní sklíčka opláchnuta deionizovanou vodou (mili-Q vodou – 18 MΩ) a inkubována 20 minut při pokojové teplotě ve tmě v denaturačním roztoku (0,3 M NaOH; 5 mM EDTA). Elektroforéza Po inkubaci v denaturačním roztoku byla sklíčka opět opláchnuta deionizovanou vodou a ponechána neutralizovat 5 minut ve vychlazeném (4 °C) elektroforetickém pufru (89 mM Tris borátový pufr, 2 mM EDTA; pH 8,3). Následně byla sklíčka vystavena elektroforéze [PowerPac Universal, (500 V; 2,5 A; 500 W) Bio-Rad; USA)]. Na elektrody bylo vloženo napětí 30 V a elektroforéza probíhala 15 minut. Po zastavení elektroforézy byla sklíčka opláchnuta deionizovanou vodou, poté 70% a 98% ethanolem a vysušeny při pokojové teplotě – minimálně 1 hodinu, a následně zafixovány ponořením sklíček na 1 minutu do fixačního roztoku [15% kyselina trichloroctová (w/v), 5% síran zinečnatý a 5% glycerol]. Poté byly opět opláchnuty deionizovanou vodou a vysušeny při pokojové teplotě minimálně 1 hodinu. 42
Barvení stříbrem (dle Gregorio a Verschaeve) Zafixovaná a vysušená sklíčka byla nejprve rehydratována a poté barvena čerstvou barvicí směsí, která se skládala z 32 ml roztoku č. 1: 5% uhličitan sodný (w/v) 68 ml roztoku č. 2: míchán postupně v následujícím pořadí: 1. 0,02% dusičnan amonný 2. 0,02% dusičnan stříbrný 3. 0,1% kyselina wolframokřemičitá H4[Si(W3O10)4] 4. 0,05% formaldehyd (v/v) Čas barvení byl 15 minut. Po obarvení byla sklíčka opláchnuta H2O a reakce zastavena ponořením sklíček na 5 minut do 10% kyseliny octové. Poté byla krátce opláchnuta H2O a vysušena při pokojové teplotě. Hodnocení Focení obarvených komet bylo prováděno na mikroskopu (PrimoStar Zeiss, Germany) s kamerou (Vosskühler, CCD-1300B, Germany) v softwaru Lucia 4.82. Následně byly komety hodnoceny v softwaru Lucia comet assay 3.51. Hodnoceným parametrem bylo % DNA v ohonu komety, tedy % poškození DNA.
7.3
Rozbíjení spermií Jedním z cílů této práce bylo stanovit intracelulární koncentraci homocysteinu ve spermiích.
Bylo tedy třeba spermie rozbít a získat tak jejich intracelulární obsah. Nejprve byl použit postup opakovaného zmrazení a rozmrazení peletu spermií (Ebisch et al., 2006). Po centrifugaci 1 ml ejakulátu 10 minut při 2655 g byl pelet spermií 5x zmrazen a rozmrazen. Při mikroskopické kontrole (mikroskop PrimoStar Zeiss, Germany; kamera Vosskühler, CCD-1300B, Germany) však nebylo pozorováno žádné výrazné poškození spermií, proto byly navrženy a porovnávány další metody rozbíjení spermií: A) ultrazvuk B) cyklus střídání ultrazvuku a zmrazování C) methanol (Villas-Bôas et al., 2007) D) destilovaná voda E) Triton F) lyzační roztok + Triton
43
Spermie byly získány centrifugací 1 ml ejakulátu normospermika po dobu 10 minut při 2655 g, poté byly promyty fyziologickým roztokem, opět zcentrifugovány a následně rozbíjeny výše uvedenými metodami. Po procesu rozbíjení vždy následovala derivatizace vzorků. A) Ultrazvuk Ke spermiím bylo přidáno 50 µl destilované vody a spermie byly resuspendovány. Následně byl vzorek vložen na 20 s, 5 min, 45 min, 60 min a 90 min do ultrazvuku (PSO1000, Powersonic). B) Cyklus střídání ultrazvuku a zmrazování Spermie byly resuspendovány v 50 µl destilované vody. Následně byl vzorek vložen na 15 minut do ultrazvuku (PSO1000, Powersonic) a poté na 15 minut zmrazen při – 20 °C. Tento cyklus byl opakován 10x. C) Methanol Ke spermiím bylo přidáno 50 µl 30%, 50% a 80% methanolu (v/v) a spermie v něm byly resuspendovány. Následovala hodinová inkubace. D) Destilovaná voda Je všeobecně známo, že destilovaná voda způsobuje osmotický šok buněk, jehož následkem dochází k popraskání jejich membrán. Proto byl pelet spermií resuspendován v 50 µl destilované vody a inkubován hodinu a 24 hodin.
V kometové analýze byl k narušení buněčných membrán používán lyzační roztok (2,5 M NaCl; 100 mM Na2EDTA; 10 mM Tris-HCl; pH 10) s 1% Tritonem X-100. Proto byly tyto roztoky použity v dalších metodách rozbíjení spermií. E) Triton Pelet spermií byl resuspendován v 10% roztoku Tritonu X-100 a inkubován 1 hodinu. F) Lyzační roztok s Tritonem Spermie byly po centrifugaci resuspendovány v lyzačním roztoku (2,5 M NaCl; 100 mM Na2EDTA; 10 mM Tris-HCl; pH 10) s 1% Tritonem X-100 a inkubovány opět jednu hodinu.
44
7.4
Derivatizace vzorků Jak již bylo zmíněno v 5. kapitole teoretické části, překážkou při stanovení koncentrace
homocysteinu je jeho vazba na proteiny. Homocystein musí být tedy před analýzou biologických vzorků z těchto vazeb uvolněn redukcí. Krevní plazma, folikulární a seminální tekutina Ke 100 µl vzorků (zpracování viz kapitola 7.1) bylo přidáno 25 µl vnitřního standardu – 0,5 mM N-acetyl-L-cystein (Fluka, Switzerland). V dalším kroku bylo ke vzorkům přidáno 25 µl 10% roztoku tri-N-butylfosfinu (TBF; Sigma Aldrich, Canada) v N,N-dimethylformamidu (DMF; Sigma Aldrich, Germany) a vše dobře promícháno na vortexu (Minishaker MS2, IKA). V případě seminální tekutiny byl používán 20% TBF. Poté následovala 30-ti minutová redukce při 4 °C v chladové místnosti na stolní třepačce (IKA-VIBRAX, VX 2E; IKA Werke). Po redukci byla provedena deproteinizace vzorků přidáním 100 µl vychlazené (4 °C) 0,6 M HClO4 (PCA; Fluka, Switzerland) obsahující 1 mM EDTA.Na2.2H2O (Fluka, Switzerland), vše bylo řádně promícháno a ponecháno 10 minut při pokojové teplotě. Následovala centrifugace vzorků při 20 817 g po dobu 15 minut a poté derivatizace amonium-7-fluoro-2-oxa-1,3-diazol-4-sulfonátem (SBD-F; Fluka) – fluorescenční značkou, s následujícím postupem: k 25 µl vzorku bylo přidáno 50 µl borátového pufru č. 2, jehož složení bylo 125 mM Na2B4O7.10H2O (Fluka, Germany) a 4 mM EDTA.Na2.2H2O (Fluka, Switzerland), pH bylo upraveno 15,3 M roztokem NaOH na 10,1. Dále bylo ke vzorku přidáno 25 µl roztoku SBD-F, který byl připraven rozpuštěním 1 mg SBD-F v 1 ml borátového pufru č. 1, jehož složení bylo 125 mM Na2B4O7.10H2O (Fluka, Germany) a 4 mM EDTA.Na2.2H2O (Fluka, Switzerland), pH bylo upraveno pomocí 5 M roztoku NaOH na 9,5. Derivatizace probíhala 1 hodinu v termobloku (MC-01, Major Science) při teplotě 60 °C a byla zastavena ponořením vzorků do ledové lázně, ve které byly vzorky uchovávány při 4 °C ve tmě do provedení analýzy. Intracelulární obsah spermií Vzhledem k předpokládané nízké koncentraci homocysteinu ve spermiích, musel být vzorek rozbitých spermií co nejméně naředěn. Proto byl během derivatizace používán poloviční objem reagencií – k 50 µl suspenze rozbitých spermií bylo přidáno 12,5 µl N-acetyl-L-cysteinu, 12,5 µl 20% TBF a 50 µl 0,6 M HClO4 s 1 mM EDTA. V dalším postupu byly používány stejné objemy jako při derivatizaci krevní plazmy a folikulární a seminální tekutiny.
45
Spolu s biologickými vzorky byly derivatizovány také vzorky standardních roztoků homocysteinu a dalších thiolů – cysteinu, cysteinylglycinu a glutathionu. Tyto thioly úzce souvisí s metabolismem homocysteinu. Metabolismus cysteinu, který mimo jiné vzniká v transsulfurační dráze, je s metabolismem cysteinylglycinu a glutathionu spojován v gama-glutamylovém cyklu. Koncentrace standardních roztoků výše uvedených thiolů pro jednotlivé typy biologických vzorků jsou uvedeny tabulce II. Tabulka II
Koncentrace standardních roztoků thiolů
Typ biologického vzorku
Krevní plazma
Folikulární tekutina
Seminální tekutina a intracelulární obsah spermií
7.5
Koncentrace standardních roztoků thiolů (µmol.l-1) homocystein
cystein
cysteinylglycin
glutathion
6,25
25
12,5
3,125
12,5
50
25
6,25
25
100
50
12,5
50
200
100
25
100
400
200
50
3,125
12,5
6,25
1,5625
6,25
25
12,5
3,125
12,5
50
25
6,25
25
100
50
12,5
50
200
100
25
1,5625
6,25
3,125
0,78125
3,125
12,5
6,25
1,5625
6,25
25
12,5
3,125
12,5
50
25
6,25
25
100
50
12,5
Vysokoúčinná kapalinová chromatografie s fluorescenční detekcí – HPLC-FD Detekce homocysteinu ve výše uvedených biologických vzorcích byla provedena
vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií s fluorescenční detekcí. Analýza byla prováděna na kapalinovém chromatografu UFLC prominence liquid chromatograph LC-20AD (Shimadzu, USA) s fluorescenčním detektorem RF 10AXL (Shimadzu, USA) s excitační vlnovou délkou 385 nm a emisní vlnovou délkou 515 nm. Dále byla použita separační kolona Supelcosil LC-18, 15 cm x 4,6 mm x 5 µm (Supelco, USA) s předkolonou C18, 4 x 3 mm (Phenomenex, USA). Vzorky byly na kolonu dávkovány ručně pomocí stříkačky HAMILTON, šesticestného ventilu (Rheodyne 7722i, USA) a smyčky o objemu 20 µl.
46
Jako mobilní fáze byl použit 0,1 M fosfátový pufr (pH 3,0) s acetonitrilem (ACN; Scharlau, Spain). Pufr byl připravován z 85% H3PO4, a jeho pH bylo upravováno 5 M KOH. Před analýzou byl k fosfátovému pufru přidáván acetonitril – v poměru 100:3 a 100:7 (v/v). Byla použita gradientová eluce s průtokem mobilní fáze 1 ml.min-1, která byla před analýzou odplyněna v ultrazvuku (PSO1000, Powersonic),
a
v průběhu
analýzy
byla
odplyňována
také
prostřednictvím
průtokového
membránového odplyňovače DGU-20AG (Shimadzu, USA). Doba analýzy byla 10 minut pro krevní plazmu a folikulární tekutinu a 12 minut pro seminální tekutinu a intracelulární obsah spermií. Profil gradientu (časová změna koncentrace mobilní fáze v průběhu separace) je uveden v tabulce III. Tabulka III Profil gradientu v průběhu separace Typ biologického vzorku Krevní plazma a folikulární tekutina Seminální plazma a intracelulární obsah spermií
Poměr 0,1 M fosfátového pufru (pH 3) a acetonitrilu 100:3
100:7
100:3
0,1 min
7,9 min
2 min
2 min
8,35 min
3, 65 min
Koncentrace thiolů byly stanoveny pomocí kalibračních přímek, které byly sestrojeny použitím jejich standardních roztoků. Limit detekce byl 0,2 µmol.l-1. Všechny vzorky byly měřeny v duplikátech ve stejné analýze a získaná data byla vyhodnocena v softwaru Clarity (DataApex, Czech Republic).
47
8 VÝSLEDKY 8.1
Stanovení homocysteinu a dalších thiolů v krevní plazmě Koncentrace homocysteinu a dalších thiolů byla stanovována v krevní plazmě všech pacientů,
jejichž vzorky byly získány, metodou běžně používanou na Biochemickém ústavu LF MU.
[mV]
[%] Cysgly
250 80
200
60 Components
voltage
Cys 150 NACys
40
100
50
Hcy 20 GSH
0 0 0
2
4
6
8
Time
10 [min.]
Obr. 8.1 Vzorový chromatogram thiolů v krevní plazmě (Cys – cystein, Hcy – homocystein, Cysgly – cysteinylglycin, GSH – glutathion, NACys – N-acetyl-L-cystein)
8.2
Stanovení homocysteinu a dalších thiolů ve folikulární tekutině Při stanovení koncentrace homocysteinu ve folikulární tekutině bylo navázáno na metodu,
která byla zavedena na Biochemickém ústavu LF Masarykovy univerzity v roce 2007 (Crha et al., 2007) a byla publikována na 6. česko-slovenské konferenci Reprodukční gynekologie a 17. sympozium Asistované reprodukce. Ve folikulární tekutině byly stanovovány kromě homocysteinu také další thioly. Ke stanovení byly získány vzorky krevní plazmy a folikulární tekutiny 49 žen ve věku 24 – 44 let, které se účastnily metod asistované reprodukce.
48
[mV]
[%] Cysgly
400 80
300 Components
voltage
60
200 Cys
40 NACys
100 20 GSH
Hcy 0
0 0
2
4
6
8
10 [min.]
Time
Obr. 8.2 Vzorový chromatogram thiolů ve folikulární tekutině
8.2.1
Závislost věku a koncentrace thiolů ve folikulární tekutině Závislost koncentrace thiolů ve folikulární tekutině s oocytem a bez oocytu na věku byla
stanovena Spearmanovým korelačním koeficientem, na hladině významnosti p ≤ 0,05. Výsledky jsou shrnuty v následující tabulce. Tabulka IV Korelace věku s folikulární koncentrací thiolů Korelace s věkem
p
Cystein
- 0,004
0,980
Homocystein
- 0,160
0,293
0,200
0,187
- 0,004
0,977
0,132
0,422
- 0,321
0,046
Cysteinylglycin
0,139
0,399
Glutathion
0,150
0,362
FOLIKULY BEZ OOCYTU
Cysteinylglycin Glutathion FOLIKULY S OOCYTEM Cystein Homocystein
Závislost na věku byla prokázána u koncentrace homocysteinu ve folikulech s oocytem.
49
8.2.2
Rozdíly koncentrací thiolů v krvi Pro srovnání koncentrací thiolů mezi folikuly a v krvi byl použit Wilcoxonův párový test,
hladina významnosti p ≤ 0,001. Výsledky jsou shrnuty v tabulce V. Tabulka V
Rozdíly koncentrací thiolů v krvi před a po hormonální stimulaci žen Medián
Medián
Medián rozdílů
koncentrací
koncentrací po
koncentrací před
před stimulací
stimulaci
a po stimulaci
(µmol.l-1)
(µmol.l-1)
(µmol.l-1)
Cystein
242,6
221,0
- 27,4
˂ 0,001
Homocystein
10,4
8,1
- 2,1
˂ 0,001
Cysteinylglycin
51,8
40,7
- 10,1
˂ 0,001
Glutathion
8,2
7,4
- 1,1
0,251
Parametr
p
Po hormonální stimulaci žen FSH došlo v jejich krvi ke statisticky významnému snížení koncentrací cysteinu, homocysteinu a cysteinylglycinu.
8.2.3
Rozdíly koncentrací thiolů ve folikulech s oocytem a bez oocytu Pro srovnání koncetrací thiolů mezi folikuly s oocytem a bez oocytu byl použit také
Wilcoxonův párový test, hladina významnosti p ≤ 0,05. Výsledky jsou uvedeny v tabulce VI. Tabulka VI Rozdíly koncentrace thiolů ve folikulech s oocytem a bez oocytu Medián koncentrací ve
Medián koncentrací ve
folikulech bez oocytu
folikulech s oocytem
(µmol.l-1)
(µmol.l-1)
155,0
149,4
0,022
Homocystein
6,1
5,2
0,262
Cysteinylglycin
25,0
24,1
0,190
Glutathion
17,6
18,0
0,027
Parametr
Cystein
p
Nejprve byly stanoveny mediány z koncentrací thiolů naměřených v jednotlivých folikulech (s oocytem a bez oocytů). Poté byl z těchto hodnot mediánů stanoven celkový medián. Byl nalezen statisticky významný rozdíl v koncentraci cysteinu a glutathionu mezi folikuly s oocytem a bez oocytu.
50
8.2.4
Intraindividální rozdíly mezi jednotlivými folikuly Byla zjištěna vysoká intraindividuální variabilita koncentrací všech thiolů mezi jednotlivými
folikuly, která byla stanovena pomocí zobrazení rozdílu mezi střední hodnotou u folikulů s oocyty a bez oocytů oproti rozsahu hodnot získaných z jednotlivých meřených folikulů. Tabulka VII
Koncentrace thiolů ve folikulární tekutině a intraindividuální variabilita Průměr1
Medián1
(µmol.l-1)
(µmol.l-1)
Směrodatná odchylka
1
Rozsah hodnot1 (µmol.l-1)
-1
(µmol.l )
FOLIKULY BEZ OOCYTU Cystein Homocystein Cysteinylglycin Glutathion
157,9
155,0
26,8
56,8
(100,0; 214,1)
(95,6; 231,7)
(12,7; 79,6)
(20,1; 167,6)
6,0
6,1
0,9
1,9
(3,2; 9,1)
(2,8; 9,1)
(0,2; 2,8)
(0,5; 5,1)
25,4
25,0
4,6
9,6
(15,9; 43,3)
(15,4; 43,3)
(1,5; 12, 4)
(4,0; 27,0)
17,0
17, 6
5,3
12,0
(4,8; 31,5)
(4,7; 30,5)
(0,9; 11,5)
(1,5; 21,9)
147,6
149,4
22,2
46,2
(93,0; 211,9)
(91,2; 209,4)
(1,3; 63,1)
(1,9; 138,1)
5,2
5,2
0,8
1,8
(2,6; 9,1)
(2,5; 9,4)
(0,1; 2,8)
(0,2; 4,7)
24,1
24,1
3,4
6,4
(13,2; 38,7)
(13,2; 39,2)
(0,6; 9,7)
(0,9; 18,9)
18,0
18,0
4,2
7,9
(6,1; 33,9)
(6,1; 33,9)
(0,5; 10,6)
(0,8; 20,5)
FOLIKULY S OOCYTEM Cystein Homocystein Cysteinylglycin Glutathion
1
medián (5.; 95. percentil)
Výsledky těchto měření byly prezentovány na 8. česko-slovenské konferenci Reprodukční gynekologie a 19. sympoziu Asistované reprodukce a publikovány v Praktické gynekologii, 2009, 13 (S1): 211.
51
8.3
Rozbíjení spermií Jak je uvedeno v kapitole 7.3, bylo použito několik metod rozbíjení, které byly hodnoceny
mikroskopicky. Nejdříve byla provedena metoda opakovaného zmrazení a rozmrazení peletu spermií (Ebisch et al., 2006). Z obrázku 8.3 je patrné, že spermie nejsou výrazně poškozeny. Proto byly navrženy další metody rozbíjení spermií (viz kapitola 7.3 A‒F). Následovala derivatizace takto rozbitých spermií a stanovení intracelulárního homocysteinu pomocí HPLC-FD.
Obr. 8.3 Spermie 5x zmrazené a rozmrazené (objektiv: 40x)
52
A) Ultrazvuk Vzorky spermií byly vloženy do ultrazvuku na 20 sekund; 5, 45, 60 a 90 minut.
Obr. 8.4 Spermie po 20 sekundách v UTZ (objektiv: 40x)
Obr. 8.5 Spermie po 5 minutách v UTZ (objektiv: 40x)
53
Obr. 8.6 Spermie po 45 minutách v UTZ (objektiv: 40x)
Obr. 8.7 Spermie po 60 minutách v UTZ (objektiv: 40x)
54
Obr. 8.8 Spermie po 90 minutách v UTZ (objektiv: 40x)
Z obrázků je patrné, že různá délka působení ultrazvuku neovlivňovala míru poškození spermií. I po 90 minutách v ultrazvuku měla většina spermií stále bičík a na obrázku není vidět výraznější poškození jejich membrán. Proto bylo dále navrženo spojení metody zmrazování spermií s ultrazvukem.
55
B) Cyklus střídání ultrazvuku a zmrazování Při této metodě rozbíjení docházelo u spermií ke ztrátě bičíku a k výraznému narušení jejich membrán. Metoda rozbíjení spermií cyklem střídání ultrazvuku a zmrazování je dále v textu pro zjednodušení označována jako UTZ.
Obr. 8.9 Spermie po 10x opakovaném cyklu utz a zmrazování (objektiv: 100x + imerzní olej)
C) Methanol V této metodě rozbíjení byly použity různé koncentrace MeOH (30%, 50% a 80%)
Obr. 8.10 Spermie v 30% MeOH (objektiv: 100x + imerzní olej)
56
Obr. 8.11 Spermie v 50% MeOH (objektiv: 100x + imerzní olej)
Obr. 8.12 Spermie v 80% MeOH (objektiv: 100x + imerzní olej)
Z obrázků 8.10, 8.11 a 8.12 je patrné, že nejvíce poškozeny jsou spermie v 80% MeOH.
57
D) Destilovaná voda V této metodě docházelo k narušení permeability membrán spermií osmotickým šokem. Na obrázku 8.13 je vidět poškození membrán hlavičky spermií a uvolnění intracelulárního obsahu.
Obr. 8.13 Spermie v destilované vodě (objektiv: 100x + imerzní olej)
E) 10% Triton Při rozbíjení 10% Tritonem nedošlo k poškození membrán, dokonce ani ke ztrátě pohyblivosti spermií. S vyššími koncentracemi Tritonu se v malých objemech velmi špatně pracovalo, proto se od této metody upustilo.
Obr. 8.14 Spermie v roztoku 10% tritonu (objektiv: 40x)
58
F) Lyzační roztok s 1% Tritonem Při použití této metody rozbíjení také nedošlo k výraznému poškození spermií.
Obr. 8.15 Spermie v lyzačním roztoku s 1% Tritonem (objektiv: 100x + imerzní olej)
8.4 8.4.1
Stanovení homocysteinu v seminální tekutině a v intracelulárním obsahu spermií Seminální tekutina Vzhledem k tomu, že je u žen ve folikulární tekutině možné měřit všechny thioly, byla jedním
z cílů práce optimalizace metody zavedené v roce 2005 Králíkovou et al., kterým se však nepodařilo oddělit glutathion od ostatních thiolů v seminální tekutině. Bylo tedy zkoušeno různé pH mobilní fáze.
59
Zvýšení pH [mV]
[%]
200
pH 3,6
80
pH 3,5 150
60 Components
voltage
pH 3,4 100
pH 3,3 40 50
pH 3,2 20
pH 3 0 Cys
Cysgly
Hcy
NACys
GSH
0 0
2
4
6
8
10
12 [min.]
Time
Obr. 8.16 Chromatogram thiolů při postupném zvyšování pH
Z chromatogramů na výše uvedeném obrázku 8.16 je zřejmé, že při zvyšování pH nedochází k lepšímu oddělení glutathionu od ostatních sloučenin s ‒SH skupinou a dochází k rozmývání píků. Snížení pH [mV]
[%]
200
pH 2,0 80
150
pH 2,2
100
Components
voltage
60
pH 2,6 40
pH 2,8
50
20
pH 3 0 Hcy
Cys 0
2
4
Cysgly 6 Time
NACys
GSH 8
10
0 12 [min.]
Obr. 8.17 Chromatogram thiolů při postupném snižování pH
U chromatogramů na obrázku 8.17 je vidět, že nedochází k lepšímu rozdělení thiolových sloučenin okolo glutathionu ani při snižování pH. Naopak dochází ke spojování píku cysteinylglycinu s těmito sloučeninami.
60
Snížením ani zvýšením pH tedy nebylo dosaženo úplného rozdělení thiolů. Další optimalizace metody nemohla být z časových důvodů provedena. Proto byl u mužů dále stanovován pouze homocystein. Jeho koncentrace byly měřeny u 8 mužů, kteří se účastnili metod asistované reprodukce. Získané hodnoty jsou uvedeny v tabulce VIII. Tabulka VIII Koncentrace homocysteinu v seminální tekutině a krevní plazmě Koncentrace
Koncentrace
homocysteinu
homocysteinu
Počet milionů
v seminální plazmě
v krevní plazmě mužů
spermií v 1ml
(µmol.l-1)
(µmol.l-1)
1
2,77
9,75
83
2
3,38
13,46
13
3
1,15
12,96
2
4
2,93
10,80
23
5
1,87
11,29
26
6
2,44
14,50
8
7
0,99
13,02
16
8
9,32
16,58
16
Číslo vzorku
Korelační 0,619
koeficient (R)
Tabulka IX
Korelace koncentace homocysteinu v seminální plazmě se spermiologickými hodnotami Korelace koncentrace homocysteinu v seminální tekutině s
Korelační koeficient (R)
pohyblivostí spermií
počtem spermií
- 0,142
- 0,009
U mužů nebyla nalezena statisticky významná závislost koncentrace homocysteinu v seminální tekutině a krevní plazmě. Dále z hodnot korelačních koeficientů v tabulce IX vyplývá, že spermiologické hodnoty mužů nejsou koncentrací homocysteinu v seminální tekutině ovlivněny.
61
Na obr. 8.18 a 8.19 jsou znázorněny vzorové chromatogramy seminální plazmy pocházející od různých mužů. Je na nich dobře viditelná oblast thiolových látek okolo glutathionu, které se nepodařilo změnou pH rozdělit. Je zřejmé, že složení těchto látek je u jednotlivých mužů velmi individuální.
[mV]
[%] NACys
120
80 100
80 Components
voltage
60
60
40 40
GSH
Cysgly
Cys
20
20 Hcy
0 0 0
2
4
6
8
10
12 [min.]
Time
Obr. 8.18 Vzorový chromatogram seminální plazmy I
[mV]
[%] Cysgly
250
80 200
60 150 voltage
Components
NACys
100
Cys
40
50 20
GSH
Hcy 0
0 0
2
4
6
8 Time
10
12
14 [min.]
Obr. 8.19 Vzorový chromatogram seminální plazmy II
62
8.4.2
Intracelulární obsah spermií Z metod rozbíjení spermií uvedených v kapitole 7.3 byly vybrány jako nejvhodnější UTZ,
80% MeOH, destilovaná voda a lyzační roztok s 1% Tritonem. Po rozbití spermií těmito metodami následovala derivatizace vzorků a jejich analýza pomocí HPLC-FD. Výsledky těchto analýz jsou znázorněny na obr. 8.20 a 8.21.
[mV]
[%]
250
80
200
150
60
voltage
Components
100 40
50 20
0 0 0
2
4
6
8
10
Time
12
14 [min.]
Obr. 8.20 Chromatogram rozbíjení spermií lyzačním roztokem s 1% Tritonem
Z chromatogramu je zřetelná interakce lyzačního roztoku a Tritonu se stacionární fází uvnitř kolony. Nedochází tak k účinnému oddělení homocysteinu od ostatních sloučenin v analyzovaném vzorku a chromatogram nelze vyhodnotit. Z tohoto důvodu byla tato metoda rozbíjení spermií vyloučena. Dále byly tedy porovnávány zbylé tři metody rozbíjení spermií.
63
[mV]
[%] NACys MeOH
Cys
150
80
Components
voltage
60 100 GSH
Cysgly Hcy
40
UTZ
50
80% MeOH 20
destilovaná voda 0 0 0
2
4
6
8
10
12 [min.]
Time
Obr. 8.21 Chromatogramy rozbíjení spermií UTZ, 80% MeOH a destilovanou H2O
Z šesti měření byly získány velmi podobné průměrné hodnoty koncentrace intracelulárního homocysteinu, které jsou uvedeny v tabulce X a porovnány na obr. 8.22. Tabulka X
Intracelulární koncentrace homocysteinu po různých způsobech rozbíjení
Způsob rozbíjení
UTZ
80% MeOH
destilovaná H2O
4,79
4,66
4,94
Průměrná naměřená koncentrace
Koncentrace homocysteinu při různých způsobech rozbíjení
-1
koncentrace homocysteinu (µmol.l )
homocysteinu (µmol.l-1)
6 5 4 3 2 1 0
UTZ
H2O
80% MeOH
Obr. 8.22 Sloupcový graf koncentrací homocysteinu při různých způsobech rozbíjení
64
Avšak na chromatogramech z obr. 8.21 je vidět, že při rozbíjení spemií ultrazvukem dochází k výraznému nárůstu koncentrace cysteinu. S největší pravděpodobností ultrazvuk poškozuje membrány spermií natolik, že dochází k uvolňování cysteinu z jejich proteinů. Dále také dochází k uvolňování dalších sloučenin s ‒SH skupinami nebo disulfidickými můstky (ty jsou v průběhu derivatizace vzorku redukovány) a glutathion s cysteinylglycinem nelze od těchto sloučenin oddělit. Naopak při rozbíjení 80% MeOH dochází ke ztrátám cysteinu. Tyto ztráty mohou být vysvětleny možnou extrakcí cysteinu methanolem. Dále mají methanol a vnitřní standard (N-acetyl-L-cystein) velmi podobné retenční časy a dochází ke spojování jejich píků. Tento fakt negativně ovlivňuje stanovení koncentrace analyzovaných látek. Vzhledem k budoucím záměrům měřit ve spermiích intracelulární koncentraci i dalších thiolů (cysteinu, cysteinylglycinu a glutathionu), bylo třeba při výběru vhodné metody rozbíjení spermií zohlednit výše uvedené skutečnosti. Po vyhodnocení chromatogramů byla tedy jako nejvhodnější zvolena metoda rozbíjení spermií destilovanou vodou. Stanovení intracelulárního homocysteinu bylo dále optimalizováno zvýšením koncentrace TBF při derivatizaci vzorků rozbitých spermií. Porovnání různých koncentrací TBF je uvedeno v následující tabulce. Tabulka XI Naměřená koncentrace homocysteinu při různých koncentracích TBF Koncentrace TBF Naměřená koncentrace
10% TBF
20% TBF
50% TBF
1,84
2,86
2,80
-1
homocysteinu (µmol.l )
Při použití 20% TBF byla naměřena výrazně vyšší koncentrace homocysteinu oproti 10% TBF. Mezi 20% a 50% koncentrací byl již rozdíl minimální. Jako nejvhodnější byla tedy vybrána 20% koncentrace TBF, která byla následně používána také při derivatizaci seminální tekutiny.
65
[mV]
[%] NACys
100
80 80
60
60
voltage
Components
40 40
20
Cys Cysgly
GSH
20
Hcy 0
0 0
2
4
6
8
10
12 [min.]
Time
Obr. 8.23 Vzorový chromatogram intracelulárního obsahu spermií
8.4.3
Koncentrace intracelulárního homocysteinu ve spermiích Koncentrace intracelulárního homocysteinu byla měřena u mužů, kterým byl stanovován
homocystein i v seminální tekutině. Po rozbití jejich spermií destilovanou vodou a derivatizaci, byly naměřeny koncetrace homocysteinu uvedené v tabulce XII. Tabulka XII Intracelulární koncentrace homocysteinu Koncentrace
Počet
Objem ejakulátu, ze
Intracelulární
Číslo
milionů
kterého byly získány
vzorku
spermií
spermie
v 1 ml
na rozbíjení (µl)
1
83
150
1,31
104,8
2
13
285
1,21
326,6
3
2
490
0,44
443,9
4
23
465
3,02
281,9
5
26
440
2,12
184,9
6
8
480
0,64
166,7
7
16
375
0,52
85,8
8
16
110
0,93
528,4
homocysteinu
koncentrace
naměřená
homocysteinu
v rozbitých -1
spermiích (µmol.l )
nmol.l-1/106 spermií
66
8.5
Kometová analýza Ke stanovení míry poškození DNA ve spermiích byla použita kometová analýza (Lewis et al.,
2009). Tato metoda byla optimalizována pro spermie na Biochemickém ústavu LF Masarykovy univerzity ve spolupráci s Mgr. Milenou Matejovičovou, Ph.D.
8.5.1
Vliv oxidačního stresu na poškození DNA spermií Vliv oxidačního stresu na poškození DNA spermií byl stanovován u 15 mužů, kteří se
účastnili metod asistované reprodukce. Všechny vzorky byly rozděleny na dvě části, z nichž jedna byla vystavena působení peroxidu vodíku a druhá byla částí kontrolní. Poté bylo porovnáváno % poškození DNA u těchto dvou skupin vzorků.
Porovnání míry poškození DNA spermií vystavených oxidačnímu stresu s kontrolní skupinou spermií
% DNA v ohonu
85
80
Kontrolní vzorky spermií
75
Vzorky spermií vystavené oxidačnímu stresu
70
65
60
Obr. 8.24 Graf vlivu oxidačního stresu na poškození DNA spermií
Porovnání obou skupin vzorků bylo provedeno dvouvýběrovým párovým t-testem na hladině významnosti p ˂ 0,005. Byl nalezen statisticky významný rozdíl mezi % poškození DNA u spermií, které byly vystaveny oxidačnímu stresu a kontrolní skupinou spermií.
8.5.2
Homocystein a poškození DNA spermií U mužů, kterým byla stanovena intracelulární koncentrace homocysteinu ve spermiích, byla
provedena také kometová analýza spermií, aby mohl být posouzen vliv homocysteinu na poškození DNA spermií. Souhrn naměřených hodnot je uveden v tabulce XIII.
67
Tabulka XIII Koncentrace homocysteinu a % poškození DNA spermií Intracelulární
Koncentrace
Koncentrace
homocysteinu
homocysteinu
v krevní plazmě
v seminální plazmě
(µmol.l-1)
(µmol.l-1)
1
9,75
2,77
104,8
76,0
2
13,5
3,38
326,6
78,4
3
13,0
1,15
443,9
87,0
4
10,8
2,93
281,9
82,3
5
11,3
1,87
184,9
82,3
6
14,5
2,44
166,7
82,4
7
13,0
0,97
85,80
82,5
8
16,6
9,32
528,4
75,1
Číslo vzorku
koncentrace homocysteinu ve
% poškození DNA spermií
spermiích (nmol.l-1/106spermií)
Tabulka XIV Míra korelace poškození DNA s koncentracemi homocysteinu Korelace poškození DNA s koncentrací
koncentrací
intracelulární
homocysteinu
homocysteinu
koncentrací
počtem
pohybli-
v krevní
v seminální
homocysteinu
spermií
vostí
plazmě
tekutině
ve spermiích
- 0,156
- 0,726
- 0,0726
- 0,461
- 0,521
Korelační koeficient (R)
Nebyla nalezena žádná závislost mezi % poškození DNA spermií a koncentrací homocysteinu v krevní plazmě, seminální tekutině a jeho intracelulární koncentrací ve spermiích. % poškození DNA u jednotlivých mužů významně nekorelovalo s počtem a pohyblivostí spermií. Tabulka XV
Korelace intracelulárního homocysteinu ve spermiích s dalšími parametry Korelace koncentrace intracelulárního homocysteinu ve spermiích s
Korelační koeficient (R)
koncentrací
koncentrací
homocystein
homocysteinu
počtem
pohyblivostí
u v krevní
v seminální
spermií
spermií
plazmě
tekutině
0,587
0,640
- 0,471
- 0,521
% spermií s patologickou formou krčku
0,818
68
Korelace koncentrace intracelulárního homocysteinu s % spermií s patologickou formou krčku byla statisticky výzmná na hladině p ≤ 0,05. Závislost dalších parametrů, které jsou uvedeny v tabulce XV, na koncetraci intracelulárního homocysteinu nebyla nalezena.
Obr. 8.25 Spermie po provedení kometové analýzy
8.6
Homocystein a páry účastnící se metod asistované reprodukce Nebylo získáno dostatečné množství vzorků od párů účastnících se metod asistované
reprodukce, proto nemohly být výsledky statisticky vyhodnoceny. Sbírání souboru vzorků od jednotlivých párů je velmi náročné. Od ženy je nutné získat krevní plazmu před a po hormonální stimulaci, dále pak folikulární tekutinu, která nesmí být znehodnocena krví. U muže je odebírán vzorek krevní plazmy a ejakulátu. Avšak pokud je muž azoospermik, nelze u něj provést kometovou analýzu a nemůže být stanovena intracelulární koncentrace homocysteinu ve spermiích. V případě že je folikulární tekutina kontaminována krví, nebo je muž azoospermik, nelze provést kompletní analýzu vzorků páru. Dalším problémem při získávání vzorků byl nesouhlas pacienta s výzkumem.
69
9 DISKUZE Molekula homocysteinu je součástí mnoha patofyziologických procesů probíhajících v lidském těle a ovlivňuje tak řadu oblastí lidského zdraví. Cílem této práce bylo stanovit koncentraci homocysteinu u mužů a žen, kteří se účastnili metod asistované reprodukce, a posoudit jeho vliv na poruchy spojené s lidskou neplodností. U žen byla měřena koncentrace homocysteinu a dalších thiolů v krevní plazmě před a po hormonální stimulaci a ve folikulární tekutině z jednotlivých folikulů (s oocytem a bez oocytu). Byl prokázán výrazný pokles hladiny homocysteinu, cysteinu a cysteinylglycinu v krvi žen po hormonální stimulaci. Snížení koncentrace homocysteinu v krvi po ovarialní stimulaci žen bylo prokázáno také v dřívějších studiích (Crha et al, 2007, Boxmeer et al., 2008). Tyto výsledky potvrzují významný vliv ženských steroidních hormonů na metabolismus homocysteinu, který byl popsán v mnoha studiích (Tallová et al., 1999; Moris et al., 2000; Eskes et al., 2001; Calle et al., 2003). Dále byla poprvé zjištěna velmi vysoká variabilita koncentrací všech thiolů, tedy i homocysteinu, mezi jednotlivými folikuly. Vzhledem k této velké variabilitě by bylo vhodné v dalším výzkumu sledovat stále tentýž folikul. Vysoká koncentrace homocysteinu ve folikulární tekutině negativně ovlivňuje vývoj a velikost folikulů (Boxmeer et al., 2008), kvalitu oocytů a embryí a může být tedy spojován s neúspěšnými výsledky umělého oplodnění (Ebisch et al., 2006). Dalším významným výsledkem byla korelace věku žen s koncentrací homocysteinu ve folikulech s oocytem. To potvrzuje nepříznivý vliv zvyšujícího se věku na plodnost ženy. Vzhledem k neúspěšné optimalizaci metody pro stanovení thiolů v seminální těkutině (nepodařilo se oddělit glutathion od ostatních thiolů) byla u mužů dále stanovována pouze koncentrace homocysteinu. Seminální tekutina je tvořena velkým množství proteinů a sacharidů, které ve své struktuře mohou obsahovat thiolové skupiny. Bylo zjištěno, že složení těchto látek v seminální plazmě jednotlivých mužů je individuální. Dle Vujkovice et al. (2009) je koncentrace těchto látek v seminální plazmě významně ovlivněna kvalitou stravy. Jedním
z měřených
parametrů
byla
také
intracelulární
koncentrace
homocysteinu
ve spermiích. Aby bylo možno tento parametr stanovit, bylo nutné zavést a optimalizovat vhodnou metodu rozbíjení spermií. Nejprve byly spermie rozbíjeny způsobem, který ve své studii publikoval Ebisch et al. (2006). Spermie byly 5x zmrazeny a rozmrazeny. Avšak při mikroskopické kontrole těchto spermií nebylo pozorováno žádné poškození jejich buněčných membrán. Byly tedy navrženy jiné metody rozbíjení spermií popsané v kapitole 7.3. Po vyhodnocení těchto metod byla jako nejvhodnější zvolena metoda rozbíjení destilovanou vodou, která u spermií způsobí osmotický šok, a dojde k potřebnému narušení jejich membrán. Použitím této metody byla stanovena intracelulární koncentrace homocysteinu ve spermiích 8 mužů. Průměrná hodnota naměřených koncentrací intracelulárního homocysteinu byla 265,4 nmol.l-1/106 spermií. Ebisch et al. (2006), kteří ve své studii použili k rozbíjení spermií jejich opakované zmrazovaní a rozmrazování, naměřili u 52 mužů
70
průměrnou koncentraci intracelulárního homocysteinu 58,8 pmol.l-1/106 spermií. Tato hodnota je výrazně nižší oproti koncentraci intracelulárního homocysteinu naměřené v této práci. Zdá se tedy, že metoda rozbíjení spermií destilovanou vodou je ve srovnání s metodou opakovaného zmrazování a rozmrazování účinnější. Z naměřených hodnot je patrný náznak závislosti koncentrace intraceluláního homocysteinu ve spermiích na zhoršujících se parametrech spermiogramu mužů a na koncentraci homocysteinu v seminální tekutině. Avšak vzhledem k velmi nízkému počtu vzorků nelze z těchto výsledků vyvozovat žádné závěry a vztahovat je na širší populaci. Souvislost koncentrace homocysteinu v seminální tekutině s hodnotami spermiogramů mužů nebyla potvrzena, stejně jako ve studii Boxmeer et al. (2007). Dále byla optimalizována metoda kometové analýzy pro stanovovení míry poškození DNA spermií u mužů, kteří se účastnili metod asistované reprodukce a posuzován tak vliv oxidačního stresu na poškození DNA spermií těchto mužů. Oxidační stres byl simulován inkubací spermií v peroxidu vodíku. Ačkoli byla DNA spermií těchto mužů již značně poškozená, vystavením jejich spermií působení peroxidu vodíku se toto poškození zvýšilo. Lze tedy říci, že oxidační stres působí na spermie velmi negativně a může být považován za jednu z příčin neplodnosti. Tyto výsledky se shodují se závěry dříve publikovaných studií (Shen and Ong, 2000; Ebisch et al., 2006, 2007; Tremellen 2008; Lewis et al., 2009). Souvislost koncentrace seminálního a intracelulárního homocysteinu ve spermiích s mírou poškození jejich DNA nebyla prokázána. Avšak byla nalezena korelace intracelulární koncentrace homocysteinu s % spermií s patologickou formou krčku. Ovšem opět musí být brán v úvahu fakt nízkého počtu vzroků. Závěrem této práce lze říci, že molekula homocysteinu bezpochyby patří k významným rizikovým faktorům lidské neplodnosti.
71
SOUHRN Zvýšená hladina homocysteinu, hyperhomocysteinemie, je všeobecně přijímána jako významný rizikový faktor kardiovaskulárních onemocnění. Ovlivňuje však negativně mnoho dalších oblastí lidského zdraví, včetně procesů, které úzce souvisí s plodností mužů a žen. V teoretické části diplomové práce byly popsány vlastnosti a metabolismus molekuly homocysteinu. Dále byly shrnuty dosavadní znalosti o toxických účincích homocysteinu, především pak jeho vliv na mužský a ženský reprodukční systém. V závěru této části jsou stručně popsány analytické metody pro stanovení koncentrace homocysteinu a v krátkosti je také představena kometová analýza. V experimentální části byla stanovována koncentrace homocysteinu pomocí HPLC-FD v krevní plazmě, folikulární a seminální tekutině a ve spermiích pacientů, kteří se učastnili metod asistované reprodukce. Pro stanovení koncentrace homocysteinu v intracelulárním obsahu spermií byla zavedena a optimalizována metoda rozbíjení spermií destilovanou vodou. Dále byla optimalizována metoda kometové analýzy pro stanovení míry poškození DNA ve spermiích. Pomocí této metody byl potvrzen negativní vliv oxidačního stresu na poškození DNA spermií. U žen byl potvrzen pokles hladiny homocysteinu v krvi po ovariální stimulaci FSH a zjištěná velká intraindividuální variabilita v koncentracích thiolů mezi jednotlivými folikuly jak s oocytem, tak bez oocytu. Souvislost koncentrace homocysteinu v seminální tekutině se spermiologickými hodnotami mužů nebyla potvrzena, stejně jako souvislost koncentrace intracelulárního homocysteinu ve spermiích s mírou poškození jejich DNA.
72
SUMMARY Increased concentration of homocysteine called hyperhomocysteinemia is commonly accepted as important risk factor for cardiovascular diseases. However, it negatively affects many other areas of human health, including processes that are closely related to fertility of men and women. The properties and metabolism of homocysteine molecule were described in the theoretical part of this work. The current knowledge about toxic effects of homocysteine, especially its impact on male and female reproductive system was summarized. Analytical methods for determination of homocysteine were described and also comet assay was introduced at the end of this part. Concentration of homocysteine in blood plasma, follicular and seminal fluid and intracellularly in sperm of patients was determined using HPLC-FD in the experimental part. A new method for breaking sperm using distilled water was introduced and optimalized for determination of homocysteine in intracellular fluid of sperm. Further, the method of comet assay for detection of DNA damage in sperm was optimalized. Using this method, the negative effect of oxidative stress on DNA damage of sperm was shown. Decrease of homocysteine level in blood plasma following ovarial stimulation with FSH was confirmed. High intraindividual variability in thiol concentrations between different follicules with as well as without oocyte was found. The relation between homocysteine concentration in seminal fluid with spermiogram values was not confirmed. Also concentration of intracellular homocysteine did not correlate with level of their DNA damage.
73
SEZNAM LITERATURY Amarnath, K., Amarnath, V., Amarnath, K., Valentine, H.L. and Valentine, W.A., A specific HPLC-UV Metod for the determination of cysteine and related aminothiols in biological samples. 2003, Talanta 60, 1229 – 1238. Ananth, C.V., Peltier, M.R., Marco, C.D., Elsasser, D., Getahun, D., Rozen, R. and Smulian, J.C., Associations between two polymorphisms in the methylenetetrahydrofolate reductase gene and placental abruption. 2007, Am. J. Obstet. Gynecol., 197(4): 385.el – 385.e7. Arnoštová, L., Fialová, L., Malbohan, I., Zima, T. and Springer, D., Preeklampsie a její diagnostika, 2007, Klin. Biochem. Metab., 15(36), no.4, 200 – 206. Ashavaid, T.F., Eghlim, F.F., Shalia, K.K. and Nair, K.G., Standardization of homocysteine on HPLC using DTT as reductant. 2003, Indian Journal of Clinical Biochemistry, 18(2): 106 – 110. Azem, F., Many, A., Yovel, I., Amit, A., Lessing, J.B. and Kupferminc, M.J., Increased rates of thrombophilia in women with repeated IVF failure. 2004, Human Reprod., 19: 368 – 370. Badiou, S., Terrier, N., Jaussent, I., Naudin, E., Maurice, F., Dupuy, A.M., Leray-Moragues, H., Rivory, J.P., Delcourt, C., Canaud, B. and Cristol, J.P., Association of aminothiols with the clinical outcome in hemodialysis patients: comparison of chromatography and immunoassay for homocysteine determination. 2006, Clin. Chem. Lab. Med., 44: 949 – 954. Barrett-Connor, E. and Bush, T.L., Estrogen and coronary heart disease in women. 1991, Clin. Cardiol., 265: 1861 – 1867. Berker, B., Kaya, C., Aytac, R. and Satiroglu, H., Homocysteine concentrations in follicular fluid are associated with poor oocyte and embryo qualities in polycystic ovary syndrome patients undergoing assisted reproduction. 2009, Human Reproduction, vol.24, no.9, 2293 – 2302. Bezold, G., Lange, M. and Peter, R.U., Homozygous methylenetetrahydrofolate reductase C677T mutation and male infertility. 2001, N. Engl. J. Med., 344: 1172 – 1173. Blouin, S., Thaler, H.W., Korninger, C., Schmid, R., Hofstaetter, J.G., Zoehrer, R., Phipps, R., Klaushofer, K., Roschger, P. and Paschalis, E.P., Bone matrix quality and plasma homocysteine levels, 2009, Bone, 44, 959 – 964. Boonaa, K.H., Njølstad, I., Ueland, P.M., Schirmer, H., Tverdal, A., Steigen, T., Wang, H., Nordrehaug, J.E., Arnesen, E. and Rasmussen, K. for the NORVIT Trial Investigators, Homocysteine lowering and cardiovascular events after acute myocardial infarction. 2006, The New England Joufnal of Medicine, Vol. 354, no.15, 1578 – 1588. Boldyrev, A.A., Molecular mechanisms of homocysteine toxicity. 2009, Biochemistry (Moscow), vol.74, no.6, 589 – 598.
74
Boxmeer, J.C., Smit, M., Weber, R.F., Lindemans, J., Romijn, J.C, Eijkemans, M.J., Macklon, N.S. and Steegers-Theunissen, R.P.M., Seminal plasma cobalamin significantly correlates with sperm concentration in males undergoing IVF or ICSI procedures. Journal of Andrology, 2007, Vol. 28, No.4. Boxmeer, J.C., Steegers-Theunissen, R.P.M., Lindemans, J., Wildhagen, M.F., Martini, E., Steegers, E.A.P. and Macklon, N.S., Homocysteine metabolism in the pre-ovulatory follicle during ovarian stimulation. 2008, Human Reproduction, vol.23, no.11, 2570 – 2576. Budde, M.P., De Lange, T.E., Dekker, G.A., Chan, A. and Nguyen, A.M., Risk factors for placental abruption in a socio-economically disadvantaged region. 2007, J. Matern. Fetal. Neonatal. Med.. 20(9): 687 – 693. Butz, L.W., du Vigneaud, V., The formation of a homologue of cystine by the decomposition of methionine with sulfuric acid. J. Biol. Chem., 1932, 99: 135 – 142. Cagnacci, A., Bagni, B., Zini, A., Cannoletta, M., Generali, M. and Volpe, A., Relation of folates, vitamin B12 and homocysteine to vertebral bone mineral density charge in postmenopausal women. A five-year longitudial evaluation. 2008, Bone, 42, 314 – 320. Cai, B., Shan, L., Gong, D., Pan, Z., Ai, J., Xu, Ch., Lu, Y. and Yang, B., Homocysteine modulates sodium channel currents in human atrial myocytes. 2009, Toxicology, 256, 201 – 206. Calle, M., Usandizaga, R., Sancha, M., Magdaleno, F., Herranz, A. and Cabrillo, E., Homocysteine, folic acid and B-group vitamins in obstetrics and gynaecology. 2003, European Journal of Obstetrics and Gynecology and Reproductive Biology, 107, 125 – 134. Carmel, R. and Jacobsen, D.W., Homocysteine in health and disease, 2001, 1. vydání, Cambridge University Press, Cambridge, 526 str. Carmel, R., Green, R., Rosenblatt, D.S. and Watkins, D., Update on cobalamin, folate and homocysteine. 2003, Hematology, 62 – 81. Cibula, D., Stárka, L., Vrbková, J. a kolektiv, Syndrom polycystických ovarií. 2004, 1. vydání, Maxdorf s.r.o., Praha, 121 str. Crha, I., Huser, M., Ventruba, P., Žáková, J., Jarkovský, J., Tallová, J. and Kubešová, J., Homocystein, cystein a glutathion ve folikulární tekutině a krvi při ovariální stimulaci FSH. 2007, Praktická gynekologie, 11, 6, 266-267. Dimitrova, K.R., DeGroot, K., Myers, A.K. et al., Estradiol and homocysteine-induced endothelial injury in vivo. 2001a, FASEB J, 15(5): A1132 – 1889. Dimitrova, K.R., DeGroot, K., Myers, A.K. et al., Estradiol prevents homocysteine-induced injury of endothelial cells in vitro. 2001b, FASEB J, 15(5): 1128 – 1887. Dimitrova, K.R., DeGroot, K., Myers, A.K. and Kim, Y.D., Estrogen and homocysteine. 2002, Cardiovascular Research, 53: 577 – 588. Dostálová, Z. and Gerychová, R., Rizika těhotenství a porodu. 2008, Interní Med., 10(9): 418 – 421.
75
Dvořák, M. and Matějovičová, M., Principy a využití kometové analýzy při detekci poškození DNA. 2008, Chemické listy 102, 11, 977 – 983. Ebisch, I.M.V., van Heerde, W.L., Thomas, C.M.G., van der Put, N., Wong, W.Y. and SteegersTheunissen, R.P.M., C677T methylenetetrahydrofolate reductase polymorphism interferes with the effects of folic acid and zinc sulfate on sperm concentration. 2003, Fertil. Steril., 80: 1190 – 1194. Ebisch, I.M.V., Peters, W.H.M., Thomas, C.M.G., Wetzels, A.M.M., Peer, P.G.M. and SteegersTheunissen, R.P.M., Homocysteine, glutathione and related thiols affect fertility prameters in the (sub)fertile couple. 2006, Human Reproduction, Vol.21, No7: 1725 – 1733. Ebisch, I.M.W., Thomas, C.M.G., Peters, W.H.M., Braat, D.D.M. and Steegers-Theunissen, R.P.M., The importance of folate, zinc and antioxidants in the pathogenesis and prevention of subfertility, Human reproductive update, 2007, Vol.13, No.2, 163 – 174. Erben, K., Homocystein Klíč ke zdraví. 2005, 1. vydání, Formát, Praha, 126 str. Eskes, T.K.A.B., Homocysteine and human reproduction. In: Killian, R. (eds.): Homocysteine and Vascular Disease. 2000, 1. vydání, Springer, New York, 447 str. Ferretti, G., Bacchetti, T., Masciangelo, S. and Bicchiega, V., Effect of homocysteinylation on high density lipoprotein physico-chemical properties. 2010, Chemistry and Physics of Lipids, 163, 228 – 235. Flekač, M., Škrha, J. and Novotný, Z., Faktory ovlivňující aktivitu a koncentraci antioxidačního enzymu paraoxonáza 1. 2006, Klin. Biochem. Metab., 14(35), No.1, 33 – 39. Forges, T., Monnier-Barbarino, P., Alberto, J.M., Guéant-Rodriguez, R.M., Daval, J.L. and Guéant, J.L., Impact of folate and homocysteine metabolism on human reproductive health. 2007, Human reproductive update, Vol.13, No.3, 225 – 238. Frantzen, F., Faaren, A.L., Alfheim, I. and Nordhei, A.K., Enzyme conversion immunoassay for determining total homocysteine in plasma or serum. Clinical Chemistry, 1998, 44:2, 311 – 316. Garrett, R.H. and Grisham, Ch.M., Biochemistry. 1995, 1. vydání, University of Virginia, Saunders college publishing, USA. Garrido, N., Meseguer, M., Simon, C., Pellicer, A. and Remohi, J., Pro-oxidative and anti-oxidative imbalance in human semen and its relation with male fertility. 2004a, Asian. J. Androl., 6: 59 – 65. Garrido, N., Meseguer, M., Alvarez, J., Simon, C., Pellicer, A. and Remohi, J., Relationship among standard semen parameters, glutathione peroxidase/glutathione reductase activity, and mRNA expression and reduced glutathione content in ejaculated spermatozoa from fertile and infertile men. 2004b, Fertil. Steril., 82 (Suppl 3): 1059 – 1066. George, L., Mills, J.L., Johansson, A.L. et al., Plasma folate levels and risk of spontaneous abortion. 2002, JAMA, 288: 1867 – 1873. Giannattasio, A., De Rosa, M., Smeraglia, R., Zarrilli, S., Cimmino, A., Di Rosario, B., Ruggiero, R., Colao, A. and Lombardi, G., Glutathione peroxidase (GPX) activity in seminal plasma of healthy and fertile males. 2002, J. Endocrinol. Invest., 25: 983 – 986.
76
Govindaiah, V., Naushad, M.S., Prabhakara, K., Krishna, P.Ch. and Devi, A.R.R., Association of parental hyperhomocysteinemia and C677T methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) polymorphism with recurrent pregnancy loss. 2009, Clinical Biochemistry, 42, 380 – 386. Gurbuz, B., Yalti, S., Ficicioglu, C. and Zehir, K., Relationship between semen quality and seminal plasma total carnitine in infertile men. 2003, J. Obstet. Gynaecol., 23: 653 – 656. Hasanzadeh, M., Ayatollahi, H., Farzadnia, M., Ayati, S., and Khoob, M.K., Elevated plasma total homocysteine in preeclampsia. 2008, 29(6): 875 – 878. Hillenbrand, R., Hillenbrand, A., Liewald, F. and Zimmermann, J., Hyperhomocysteinemia and recurrent carotid stenosis. 2008, BMC Cardiovascular Disorders, 8:1. Holmes, V.A., Wallace, J.M.W., Alexander, H.D., Gilmore, W.S., Bradbury, I., Ward, M., Scott, J.M., McFaul, P. and McNulty, H., Homocysteine is lower in the third trimester of pregnancy in women with enhaced folate status from continued folic acid supplementation. 2005, Clinical Chemistry, 51:3, 629 – 634. HOPE 2 – The Heart Outcomes Prevention Evaluation Investigators, Homocysteine lowering with folic acid and B vitamins in vascular disease, 2006, The New England Journal of Medicine, 354: 1 – 11. Hoque, M.., Bulbul, T., Mahal, M., Islam, N.F. and Ferdausi, M., Serum homocysteine in pre-eclampsia and eclampsia., 2008, Bangladesh Med. Res. Counc. Bull., 34, 16 – 20. Hulley, S., Grady, D., Bush, T. et al., Randomized trial of estrogen plus progestin for secondary prevention of coronary heart disease in postmenopausal women. 1998, J. Am. Med. Assoc., 280: 605 – 613. Humplíková, S., Minář, J., Kučerová, M., Radina, M. a Valík, D., Stanovení hladiny celkového homocysteinu v plazmě kapalinovou chromatografií s tandemovou hmotnostní spektrometrií. Klin. Biochem. Metab., 2007, 15(36): 31 – 34. Hyánek, J., Dubská, L., Pejznochová, H., Pehal, F., Vaingátová, S. and Martiníková, V., Hyperhomocysteinémie – nepoznané, nepoznatelné a zanedbané (homocystein – užitečný marker methylačních poruch z deficitu holotranskobalaminu a folátu). 2009, Klin. Biochem. Metab., 17(38), No.2, 83 – 92. Chambers, J.C., Ueland, P.M., Wright, M., Doré, C.J., Refsum, H. and Kliner, J.S., Investigation of relationship between reduced, oxidized and protein-bound homocysteine and vascular endotheliala function in healthy human subjects. 2001, Circulation Research, 89: 187 – 192. Ishida, S., Isotani, H., Furukawa, K. and Kuhara, T., Homocystinuria due to cystathionine-β-synthase deficiency associated with megaloblastic anaemia. 2001, Journal of Internal Medicine, 250: 453 – 456. Jacobsen, D.W., Biochemistry and metabolism. In: Killian, R. (eds.): Homocysteine and Vascular Disease. 2000, 1. vydání, Springer, New York, 447 str. Jacobsen, D.W., Practical chemistry of homocysteine and other thiols. In: Carmel, R. and Jacobsen, D.W. (eds.): Homocysteine in health and disease, 2001, 1. vydání, Cambridge University Press, Cambridge, 526 str.
77
Jakubowski, H., Biosynthesis and reactions of homocysteine thiolactone. In: Carmel, R. and Jacobsen, D.W. (eds.): Homocysteine in health and disease, 2001, 1. vydání, Cambridge University Press, Cambridge, 526 str. Karolczak, K. and Olas, B., Mechanism of action of homocysteine and its thiolactone in hemostasis system. 2009, Physiol. Res., 58: 623 – 633. Koca, Y., Ozdal, O.L., Celik, M., Unal, S. and Balaban, N., Antioxidant activity of seminal plasma in fertile and infertile men. 2003, Arch. Androl., 49: 355 – 359. Krajčovičová, R., Hudeček, R. and Kalvodová, J., Diferenciální diagnostika a terapie opakovaných těhotenských ztrát – 1. část. 2007, Prakt. Gyn., 11(4), 164 – 169. Králíková, M., Tallová, J., Crha, I. and Hill, M., Homocysteine, folate, and vitamin B12 in seminal plasma. 2005, Pavia Italy: Ferrat-Storti Foundation, s. 71 – 71. ISSN1824-9337. Kubešová, J., Tallová, J., Králíková, M., Crha, I. a Jarkovský, J., Homocysteine, folate and vitamin B12 in seminal plasma of males with oligoasthenoteratozoospermia and azoospermia. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, 2007, ročník 45, číslo 5, s. A46 – A46. Lewis, S.E.M., Agbaje, I. and Alvarez, J., Sperm DNA tests as useful adjuncts to semen analysis. 2008, Systems Biology in Reproductive Medicine, 0:1 – 15. Lee, CH-N., Su, Y-N., Cheng, W-F., Lin, M-T., Wang, J-K., Wu, M-H. and Hsieh, F-J., Association of the C677T methylenetetrahydrofolate reductase mutation with congenital heart diseases. 2005, Acta. Obstet. Gynecol. Scand., 84: 1134 – 1140. Lu, Ch., Zu, Y. and Yam, V.W., Specific postcolumn detection method for HPLC assay of homocysteine based on aggregation of fluorosurfactant-capped gold nanoparticles. Anal. Chem., 2007, 79: 666 – 672. Magera, M.J., Lacey, J.M., Casetta, B. and Rinaldino, P., Method for the determination of total homocysteine in plasma and urine by stable isotope dilution and electrospray tandem mass spectrometry. Clinical Chemistry, 1999, 45:9, 1517 – 1522. Makedos, G., Papanicolaou, A., Hitoglou, A., Kalagiannidis, I., Makedos, A., Vrazioti, V. and Goutzioulis, M., Homocysteine, folic acid and B12 serum levels in pregnancy complicated with preeclampsia. 2007, Arch. Gynecol. Obstet., 275(2): 121 – 124. Matsuyama, N., Yamaguchi, M., Toyosato, M., Takayama, M. and Mizuno, K., New enzymatic colorimetric assay for total homocystein., 2001, Clinical Chemistry, 47, No.12, 2155 – 2156. McCully, K.S., Vascular patology of homocysteinemia: Implications for the pathogenesis of arteriosclerosis. 1969, Am J Pathol., 56(1): 111 – 128. McCully, K.S., Chemical patology of homocysteine. II. Carcinogenesis and homocysteine thiolactone metabolism. 1994a, Annals of Clinical and Laboratory Science, vol. 24(1): 27 – 59. McCully, K.S., Chemical patology of homocysteine. III. Cellular fiction and aging. 1994b, Annals of Clinical and Laboratory Science, vol. 24(2): 134 – 152.
78
McDowell, I.F. and Lang, D., Homocysteine and endothelial dysfunction: a link with cardiovascular disease. 2000, J. Nutr., 130: 369S – 372S. Medina, M.A., Urdiales, J.L. and Amores-Sánchez, M.I., Roles of homocysteine in cell metabolism Old and new functions. 2001, Eur. J. Biochem., 268: 3871 – 3882. Melnyk, S., Pogribna, M., Pogribna, I., Hine, R.J. and James, S.J., A new HPLC method for the simultaneous determination of oxidized and reduced plasma aminothiols using coulometric electrochemical detection, J. Nutr. Biochem., 1999, 10: 490 – 497. Mijatovic, V. and van der Mooren, M.J., Homocysteine in postmenopausal women and the importance of hormone replacement therapy. 2001, Clin. Chem. Lab. Med., 39: 764 – 767. Morris, M.S., Jacques, P.F., Selhub, J. and Rosenberg, I.H., Total homocysteine and estrogen status indicators in the third national health and nutrition examination survey. 2000, American Journal of Epidemiology, Vol.152, No.2. Mostafa, T., Tawadrous, G., Roaia, M.M., Amer, M.K., Kader, R.A. and Aziz, A., Effect of smoking on seminal plasma ascorbic acid in infertile and fertile males. 2006, Andrologia, 38: 221 – 224. Mudd, S.H., Finkelstein, J.D., Irreverre, F. and Laster L., Homocystinuria: An enzymatic defekt. 1964, Science, vol. 143, no. 3613, 1443 – 1445. Olas, B., Kołodziejczyk, J., Kedzierska, M., Rywaniak, J. and Wachowicz, B., Modification of human blood platelet proteins induced by homocysteine and its thiolactone in vitro. 2009, Thrombosis Research, 124, 689 - 694 Olszewski, A.J. and McCully, K.S., Homocysteine metabolism and the oxidative modification of proteins and lipids. 1993, Free Radiál Biology and Medicine, vol. 14, 683 – 693. Olszewski, A.J., Szostak, W.B., Bialkow, M., Rudnicki, S. and McCully, K.S., Reduction of plasma lipid and homocysteine levels by pyridoxine, folate, kobalamin, choline, riboflavin and troxerutin in atherosclerosis. 1989, Atherosclerosis, vol. 75(1): 1 – 6. Pacchiarotti, A., Mohamed, M.A., Micara, G., Linari, A., Tranquilli, D., Espinola, S.B. and Aragona, C., The possible role of hyperhomocysteinemia on IVF outcome. 2007, J. Assist. Reprod. Genet., 24: 459 – 462. Páterová T., Zeman, J. a Kožich, V., Homocystinurie z deficitu CBS. 2004, 1. vydání, VFN a 1. LF UK Ústav DMP, SHS-Nutricia a. s., Praha, 19 str. Patočka, J. and Höschl, C., D-serin: Bílá vrána mezi aminokyselinami, 2004, Psychiatrie, ročník 8, číslo 3, 51 – 52. Perła-Kaján, J, Twardowski, T and Jakubowski, H., Mechanisms of homocysteine toxicity in humans. 2007, Amino Acids, 32: 561 – 572. Perna, A.F., Satta, E., Acanfora, F., Lombardi, C., Ingrosso, D. and De Santo, N.G., Increased plasma protein homocysteinylation in hemodialysis patients. 2007, Kidney International, 69, 869 – 876.
79
Petrovič, M., Sedláček, M., Horák, M. and Vyklický, L., Neurofarmakologická podstata působení memantinu v léčbě Alzheimerovy demence. 2004, Klin. Farmakol. Farm., 18: 81 – 89. Powers, R.W., Majors, A.K., Kerchner, L.J. and Conrad, K.P., Renal handling of homocysteine during normal pregnancy and preeclampsia. 2004, J. Soc.Gynecol. Invest., 11: 45 – 50. Přistoupilová, K., Přistoupil, T.I. a Heyrovský, M., Homocystein – molekula těšící se rostoucí pozornosti. 2001, Chemické Listy, 93: 365 – 374. Put, N.M.J., van Straaten, H.W.M., Trijbels, F.J.M. and Blom, H.J., Folate, homocysteine and neural tube defects: An overview. 2001, Exp. Biol. Med., Vol.226(4): 243 – 270. Quablan, H.S., Eid, S.S., Ababneh, H.A., Amarin, Z.O., Smadi, A.Z., Al-Khafaji, F.F. et al., Acquired and inherited thrombophilia: implication in recurrent IVF and embryo transfer failure. 2006, Human Reprod., 21: 2694 – 2698. Quintana, I.L., Oberholzer, M.V., Kordich, L. and Lauricella, A.M., Impaired fibrin gel permeability by high homocysteine levels, 2009, Thrombosis Research, doi:10.1016/j.thromres.2009.08.013. Rasmussen, K. and Møller, J., Methodologies of testing. In: Carmel, R. and Jacobsen, D.W. (eds.): Homocysteine in health and disease, 2001, 1. vydání, Cambridge University Press, Cambridge, 526 str. Refsum, H., Guttormsen, A.B., Fiskerstrand, T. and Ueland, P.M., Hyperhomocysteinemia in terms of steady-state kinetics. 1998, Eur. J. Pediatr., 157[Suppl 2]: S45 – S49. Refsum, H., Smith, A.D., Ueland, P.M., Nexo, E., Clarke, R., McPartlin, J., Johnston, C., Engbaek, F., Schneede, J., McPartlin, C. and Scott, J.M., Facts and recommendations about total homocysteine determinations: An expert opinion, Clinical Chemistry, 2004, 50:1, 3 – 32. Rodríguez-Guillén, M.R., Torres-Sánchez, L., Chen, J., Galván-Portillo, M., Blanco-Muňoz, J., Anaya, M.A., Silva-Zolezzi, I., Hernández-Valero, M. and López-Carrillo, L., Maternal MTHFR polymorphisms and risk of spontaneous abortion. 2009, Salud pública de México, vol.51, no.1, 19 - 25 Rozen, R., Polymorphisms of folate and cobalamin metabolism. In: Carmel, R. and Jacobsen, D.W. (eds.): Homocysteine in health and disease, 2001, 1. vydání, Cambridge University Press, Cambridge, 526 str. Sawula, W., Banecka-Majkutewicz, Z., Kasziński, L., Jakóbkiewicz-Banecka, J., Węgrzyn, G., Nyka, W. and Banecki, B., Improved HPLC method for total plasma homocysteine detection and quantification. Acta Biochimica Polonica, 2008, Vol. 55, 119 – 125. Shen, H.M. and Ong, Ch.N., Detection of oxidative DNA damage in human sperm and its association with sperm function and male infertility. 2000, Free Radical Biology and Medicine, vol.28, no.4, 529 – 536. Schipchandler, M.T. and Moore, E.G., Rapid, fully automated measurement of plasma homocysteine with the Abbott IMX analyser. Clinical Chemistry, 1995, 41: 991 – 994. Sibrian-Vazquez, M., Escobedo, J.O., Lim, S., Samoei, G.K. and Strongin, R.M., Homocystamides promote free-radical and oxidative damage to proteins. 2010, PNAS, vol. 107, no. 2, 551 – 554.
80
Song, G.J., Norkus, E.P. and Lewis, V., Relationship between seminal ascorbic acid and sperm DNA integrity in infertile men. 2006, Int. J. Androl., 29: 569 – 575. Speit, G. Vasquez, M. and Hartmann, A., The comet assay as an indicator test for germ cell genotoxicity. 2009, Mutation Research, 681, 3 - 12 Suk, J.W., Jang, J.-Y. and Cho, J.-H., Reagent-loaded plastic mikrofluidic chips for detecting homocysteine. Journal of Micromechanics and microengineering, 2008, 18, 055024. Tallová, J., Tomandl, J., Bičíková, M and Hill, M., Changes of plasma total homocysteine levels dutiny the menstrual cycle. 1999, European Journal of Clinical Investigation, 29: 1041 – 1044. Tamura, T. and Picciano, M.F., Folate and human reproduction. 2006, Am. J. Clin. Nutr., 83: 993 – 1016. Tremellen, K., Oxidative stress and male infertility – a clinical perspective. Human reproduction Update, 2008, 1 – 16. Tripodl, A., Chantarangkul, V., Lombardi, R., Lecchl, A., Mannucci, P.M. and Cattaneo, M., Multicenter study of homocysteine measurement – performance characteristics of different methods, influence of standards on interlaboratory agreement of results. Tromb. Haemost., 2001, 85: 291 – 295. Trojan, S., Langmeier, M. a autorský kolektiv, Lékařská fyziologie. 2003, 4. vydání, Grada Publishing, a.s., Praha, 772 str. Unfried, G., Greismacher, A., Weismuller, W., Huber, J.C. and Temper, C.B., The C677T polymorphism of the methylenetetrahydrofolate reduktase gene and idiopathic recurrent miscarriage. 2002, Obstet. Gyn., 99: 614 – 619. Valko, M., Leibfritz, D., Moncol, J., Cronin, M.T., Mazur, M. and Telser, J., Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. 2007, Int. J. Biochem. Cell. Biol., 39: 44 – 84. Vecchione, G., Margaglione, M., Grandone, E., Colaizzo, D., Cappucci, G., Fermo, I., D’Angelo, A. and Di Minno, G., Determining sulfur-containing amino acids by capillary electrophoresis: A fast novel method for total homocyst(e)ine human plasma. Electrophoresis, 1999, 20: 569 – 574. Vernet, P. Aitken, R.J. and Drevet, J.R., Antioxidant strategies in the epididymis. 2004, Mol. Cell. Endocrinol., 216: 31 – 39. Villas-Bôas, S.G., Roessner, U., Hansen, M.A.E., Smedsgaard, J. and Nielsen, J., Metabolome Analysis: An Introduction. 2007, 1. vydání, A John Wiley and Sons, Inc., Publication, 319 str., ISBN: 978-0-47174344-6 Voet, D. a Voetová, J.G., Biochemie. 1990, 1. vydání, Praha, Voet, D. and Voet, J.G., Biochemistry. 2004, 3. vydání, Wiley international edition, USA, 1591 str. Vollset, S.E., Refusm, H., Nygard, O. and Ueland, P.M., Lifestyle factors associated with hyperhomocysteinemia. In: Carmel, R. and Jacobsen, D.W. (eds.): Homocysteine in health and disease, 2001, 1. vydání, Cambridge University Press, Cambridge, 526 str.
81
Vrbíková, J., Tallová, J., Bičíková, M., Dvořáková, K., Hill, M. and Stárka, L., Plasma thiols and androgen levels in polycystic ovary syndrome. 2003, Clin. Chem. Lab. Med., 41(2): 216 – 221. Vujkovic, M., de Vries, J.H., Dohle, G.R., Bonsel, G.J., Lindemans, J., van der Spek, N.S.P.J., Steegers, E.A.P. and Steegers-Theunissen, R.P.M. Associations between dietary patterns and semen quality in men undergoing IVF/ICSI treatment. 2009, Human Reproduction, 24(6):1304-1312. Wallock, L.M., Tamura, T., Mayr, C.A., Johnston, K.E., Ames, B.N. and Jacob, R.A., Low seminal plasma folate concentrations are associated with low sperm density and count in male smokers and nonsmokers. 2001, Fertil. Steril., 75: 252 – 259. WHO laboratory manual, 1999, 4. vydání, Cambridge University Press, 128 str., ISBN: 0-521-64-599-9 Wilcken, D.E.L. and Wilcken, B., The pathogenesis of coronary artery dinase. 1976, The Journal of Clinical Investigation, volume 57, 1079 – 1082. Williams, A.C. and Ford, W.C., Functional significance of the pentose phosphate pathway and glutathione reductase in the antioxidant defense of human sperm. 2004, Biol. Reprod., 71: 1309 – 1316. Windelberg, A., Arseth, O., Kvalheim, G. and Ueland, P.M., Automated assay for the determination of methylmalonic acid, total homocysteine and related amino acids in human serum or plasma by means of methylchloroformate derivatization and gas chromatography-mass spectrometry. Clinical Chemistry, 2005, 51:11, 2103 – 2109. Wong, W.Y., Merkus, H.M., Thomas, C.M., Menkveld, R., Zielhuis, G.A. and Steegers-Theunissen, R.P.M., Effects of folic acid and zinc sulfate on male factor subfertility: a doubleblind,randomized, placebocontrolled trial. 2002, Fertil. Steril., 77:491 – 498. Zarghami, N. and Khosrowbeygi, A., Seminal plasma levels of 15-F2α-isoprostane, malondialdehyde and total homocysteine in normozoospermic and asthenozoospermic males. 2005, Indian Journal of Clinical Biochemistry, 20 (2): 86 – 91. Zhang, D., Zhang, M., Liu, Z., Yu, M., Li, F, Yi, T. and Huang, Ch., Highly selective colorimetric sensor for cysteine and homocysteine based on azo derivatives. 2006, Tetrahedron Letters, 47: 7093 – 7096. Zimny, J., Sikora, M., Guranowski, A. and Jakubowski, H., Protective mechanisms against homocysteine toxicity: the role of bleomycin hydrolase. 2006, The Journal of Biological Chemistry, vol. 281, no. 32, 22485 – 22492. Zini, A., Garrels, K. and Phang, D., Antioxidant activity in the semen of fertile and infertile men. 2000, Urology, 55: 922 – 926. Zou, Ch.G., Zhao, Y.S., Gao, S.Y., Li, S.D., Cao, X.Z., Zhang, M. and Zhang, K.Q., Homocysteine promotes proliferation
and
activation
of
microglia.
2009,
Neurobiology
of
Aging,
doi:10.1016/j.neurobiolaging.2008.11.007.
82
Internetové zdroje www.ivf-motol.cz – IVF FNM, Obecně o IVF [online] © 2006 - 2010 Blackmedia s.r.o. [cit. 28. 3. 2010] Dostupné na ˂http://www.ivf-motol.cz/ivf.aspx˃
www.ivfbrno.cz – Centrum asistované reproducke CAR 01 Brno, Průvodce léčbou poruch plodnosti (Ventruba, 2009) [online] [cit. 28. 3. 2010] Dostupné na ˂http://www.ivfbrno.cz/materialy/brozuraCAR2009.pdf˃
www.repromeda.cz – Sanatorium Repromeda, Poskytovaná péče, Vyšetření spermiogramu [online] [cit. 4. 3. 2010] Dostupné na ˂http://www.repromeda.cz/vysetreni-spermiogramu.html˃
www.sci.muni.cz – Embryologie a reprodukce živočichů, [online] [cit. 15. 3. 2010] Dostupné na ˂http://www.sci.muni.cz/ptacek/REPRODUKCE2.htm˃
www.iscare.cz – ISCARE – Klinické centrum, IVF – Centrum asistované reprodukce, O nás [online] 2009 © [cit. 28. 3. 2010] Dostupné na ˂http://www.iscare.cz/ivf-o-nas.html˃; Informace o výkonech, IVF – in vitro fertilizace
(umělé
oplození)
[online]
2009
©
[cit.
28.
3.
2010]
Dostupné
na
http://www.iscare.cz/informace_o_vykonech.html#IVF
83
