MASARYKOVA UNIVERZITA

___________________________________________________________________

MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Ústav biochemie

Charakterizace střevní mikroflóry drůbeže Bakalářská práce

Brno, 2011

Martina Vršanská

__________________________________________________________________

-1-

Prohlášení Prohlašuji, ţe jsem bakalářskou práci na téma Charakterizace střevní mikroflóry vypracovala samostatně pod vedením doc. RNDr. Ivana Rychlíka, Ph.D. a uvedla v seznamu literatury všechny pouţité literární a odborné zdroje.

V Brně dne 9. května 2011

Martina Vršanská

-2-

Poděkování Tímto bych ráda poděkovala doc. RNDr. Ivanu Rychlíkovi, Ph.D. za odborný dohled a vedení bakalářské práce, své odborné konzultantce Mgr. Heleně Hradecké, Ph.D za ochotu, cenné rady a poskytnutí studijních materiálů, své rodině a příteli za veškerou podporu a pochopení.

-3-

OBSAH 1. Úvod……………………………………………………………………………... 6 1.1. Obecná charakterizace střevní mikroflóry…………………………………..... 6 1.2. Funkce střevní mikroflóry……………………………………………………….. 6 1.3. Preparáty ovlivňující střevní mikroflóru……………………………………… 8 2. Trávicí trakt drůbeže…………………………………………………………… 10 2.1. Obecná charakterizace…………………………………………………………. 10 2.2. Onemocnění trávicího traktu drůbeže……………………………………......

10

2.2.1. Salmonelóza……………………………………………………………………………

11

2.2.2. Nekrotická enteritida…………………………………………………………………

11

2.2.3. Střevní spirochetóza……………………………………………………………….....

12

2.2.4. Parazitární onemocnění trávicího traktu drůbeže………………………………..

12

2.2.5. Plísňová onemocnění trávicího traktu drůbeže…………………………………..

13

3. Střevní mikroflóra u drůbeže………………………………………………….. 14 3.1. Chov drůbeže…………………………………………………………………….

14

3.2. Vývoj střevní mikroflóry u drůbeže……………………………………………

14

3.3. Fylogenetické postavení a nejdůležitější taxonomické skupiny osídlující trávicí drůbeže……………………………………………..

16

4. Metody detekce střevní mikroflóry…………………………………………….. 20 4.1. Kultivační techniky a mikroskopie…………………………………………….

20

4.2. Analýza sekvencí genů pro 16S rRNA…………………………………………

21

4.2.1. Charakteristika a uspořádání genů pro 16S rRNA…………………………………..

21

4.2.2. Elektroforetická metoda denaturační gradientové gelové elektroforézy (DGGE) a metoda terminálního polymorfismus délky restrikčních fragmentů (T-RFLP)…..

22

4.2.3. Kvantifikace specifických sekvencí pomocí Real-time PCR…………………………

24

5. Cíle práce……………………………………………………………………….

26

-4-

6. Materiál a metody………………………………………………………………

27

6.1. Experimentální zvířata…………………………………………………………. 27 6.2. Izolace DNA ze vzorků střevního obsahu…………………………………….

27

6.3. Real-time PCR…………………………………………………………………… 28 7. Výsledky………………………………………………………………………… 30 7.1. Izolace DNA……………………………………………………………………… 30 7.2. Metoda Real-time PCR…………………………………………………………

33

8. Diskuze…………………………………………………………………………. 38 9. Souhrn………………………………………………………………………….

41

10. Summary………………………………………………………………………

42

11. Použitá literatura……………………………………………………………... 43

-5-

1. Střevní mikroflóra 1.1. Obecná charakterizace střevní mikroflóry Mikroorganismy osídlují trávicí trakt ihned po narození a jsou jeho nezbytnou součástí po celý ţivot. Tvoří rovnováţný komplex mikrobiálního ekosystému tzv. střevní mikroflóru, která je zastoupena nejrůznějšími druhy eukaryot, bakterií, archeí, bakteriofágů, virů a v malém mnoţství i houbami a prvoky. Striktně anaerobní bakterie představují největší část tohoto dynamického systému. V zaţívacím ústrojí bylo detekováno přes 500 rozdílných bakteriálních druhů (Lupp a Finlay, 2005), které utvářejí stálé a přechodné společenstvo. V jednom gramu stolice se nachází asi 1010 bakterií, které lze zařadit do více neţ 300 druhů (Votava, 2005). Stanovit přesný počet je však velmi obtíţné (Zbořil a kol., 2005). Sloţení střevní mikroflóry závisí na aktuálním stavu jedince, je ovlivněno genotypem, imunitním systémem, věkem, stravováním, koncentrací kyslíku, vnějšími faktory a evolučními rozdíly mezi jednotlivými ţivočichy. Je rozdílné i v různých částech trávicího traktu. Střevní mikroflóru dělíme na obligátní a fakultativní. Obligátní mikroflóra se přizpůsobila ochranným reakcím organismu a je ovlivněna osídlováním, stravou a okolním prostředím. Fakultativní mikroflóra souvisí s aktuálním stavem jedince a její zástupci mohou být původci nejrůznějších onemocnění.

1.2 Funkce střevní mikroflóry Bakteriální mikroflóra, především v tlustém střevě, můţe podstatně ovlivnit zdravotní stav jedince. Má velkou metabolickou aktivitu a vyznačuje se řadou důleţitých funkcí. Podporuje trávicí procesy, díky kterým je zajištěna správná peristaltika a prokrvení střev. Aktivitou mikroorganismů se zlepšuje zaţívání, trávení, štěpení a vstřebávání důleţitých ţivin. Sloţité mnohočetné cukry nestravitelné v tenkém střevě slouţí jako strava pro mikroflóru, která obývá tlusté střevo, kde tyto cukry začínají fermentovat. Bakterie přeměňují sacharidy na mastné kyseliny, které prochází přes střevní sliznici. Tyto mastné kyseliny působí proti rozvoji karcinogenu aktivací různých drah pro metabolizmus léků, coţ vede ke sníţení počtu mutací a rizika rakoviny (Scharlau a kol., 2009). Další podíl těchto kyselin slouţí jako ţiviny pro mikroflóru, která je spotřebuje. -6-

Střevní mikroflóra také přispívá k odbourávání nestrávených látek, které obsahují dusík, nepřímo je také ovlivněn metabolismus cholesterolu a ţlučových solí, metabolizuje se bilirubin, který odbourává glykoproteiny. Velký význam mají ve střevě bakterie mléčného kvašení, které přispívají k udrţení rovnováhy, coţ je označováno také jako eubakterióza, eubióza. Laktobacily a bifidobakterie chrání sliznici tenkého střeva před patogeny přeměnou cukrů, především laktosy, na kyselinu mléčnou, coţ přispívá k posilování imunitního systému a obranyschopnosti. Mléčné bakterie sniţují pH a osmolaritu prostředí, čímţ je potlačen růst hnilobných bakterií a kvasinek. Vytváří se důleţité látky, jako jsou aminokyseliny a těkavé mastné kyseliny, které můţe tělo hostitele vstřebat. Mikroflóra má také nutriční význam. Anaerobní bakterie rodu Escherichia coli syntetizují v tlustém střevě fylochinon (vitamin K1), menachinon (vitamín K2) a kobalamin (vitamin B12). Tyto vitaminy jsou nezbytné pro správné fungování proteinů podílejících se na sráţení krve, mineralizaci kostí, buněčném růstu v metabolismu buněk cévní stěny a napomáhají retenci vápníku. Přátelské bakterie jsou navíc vybaveny mechanismy, kterými detoxikují škodlivé sloţky tráveniny. Další důleţitou funkci mají bakterie při tvorbě i jiných vitaminů. Jedná se zejména o: Vitamin B12 (kobalamin), který je důleţitý pro správnou funkci krvetvorby, mozku a nervového systému. Podílí se na metabolismu všech buněk, které souvisí se syntézou mastných kyselin, regulaci a tvorbě energie. Vitamin B9 (kyselina listová, folacin), který napomáhá správné funkci krvetvorby, syntéze nukleových kyselin, správnému růstu a vývoji plodu. Vitamin B8 (biotin) je důleţitý pro zdravý imunitní systém, kůţi a sliznice, podílí se na syntéze mastných kyselin, glukoneogenezi a výrobě energie. Vitamin B2 (riboflavin) je důleţitý pro dobrý stav očí, kůţe, srdce, ovlivňuje celkovou energickou přeměnu v organismu. Vitamin B5 (kyselina pantothenová) je důleţitý pro metabolismus sacharidů, tuků a bílkovin.

-7-

1.3. Preparáty ovlivňující střevní mikroflóru Řada faktorů ovlivňuje funkci střevního systému, coţ můţe vést k narušení rovnováhy mikroorganismů trávicího traktu a ke sníţení ochrany proti oportunistickým patogenům. Jedinec se tak lehce stává náchylnější k infekci. Faktory můţeme rozdělit na fyziologické, výţivové a iatrogenní. V chovech hospodářských zvířat se z různých příčin aplikují látky, které cíleně nebo svými vedlejšími účinky působí na mikroby obývající trávicí trakt. Tyto preparáty jsou obvykle produktem látkové výměny různých druhů mikroorganismů, také mohou být získány biosynteticky nebo polysynteticky. Mezi nejpouţívanější preparáty patří prebiotika, probiotika, antibiotika, chemoterapeutika a symbiotika. Prebiotika jsou nestrávené sloţky přijaté potravy, skládající se hlavně z oligosacharidů. Zlepšují růst prospěšné střevní mikroflóry, inhibují mnoţení patogenů a zlepšují celkový zdravotní stav jedince. V tlustém střevě napomáhají lepšímu prokvašení látek, jeţ přeměňují na odpadní produkty, jako jsou kyselina máselná, propionová nebo octová. Nemají ţádné toxické nebo karcinogenní vlastnosti. Jednou z moţností, jak předcházet a léčit infekce intestinálního traktu, aniţ by se vytvořila rezistence, je pouţití probiotik (Buenau a kol., 2005). Jsou to ţivé organismy, které příznivě ovlivňují funkci střevní mikroflóry. Záměrně se přidávají do potravy či krmiva. Příkladem probiotik je jogurt, acidofilní mléko a kefír. Probiotika zabraňují kolonizaci patogenních mikroorganismů tím, ţe spolupracují společně s mikroflórou a imunitním systémem hostitelského organismu. (Sullivan a Nord, 2005). Antibiotika jsou preparáty, které se podávají k léčbě infekčních nemocí. Jejich účinkem je buď selektivně zabíjet (baktericidní účinek) nebo alespoň inhibovat růst a mnoţení bakterií v hostiteli (bakteriostatický účinek). Jsou produktem látkové výměny různých druhů. Časté pouţívání antibiotik ve veterinární i humánní praxi vede v posledních letech k nárůstu rezistence u mnoha bakteriálních rodů. Primární (přirozená) rezistence k antibiotikům je dána druhem bakterie a jeho přirozenými vlastnostmi. V případě sekundární rezistence se bakterie přizpůsobí novým podmínkám a to získáním genů rezistence, díky nimţ je v prostředí s antibiotikem schopna i růst. Některé druhy antibiotik mají široké spektrum účinnosti. Svým působením neničí jen neţádoucí mikroby, ale i některé prospěšné bakterie. Po skončení léčby antibiotiky je proto vhodná zvýšená konzumace mléka a mléčných výrobků, čímţ se vrátí střevní mikroflóru do normálu a ustaví se opět rovnováţný stav. -8-

Kaţdé antibiotikum působí pouze na specifické místo. Peniciliny, cefalosporiny, cykloserin, vankomycin a bacitracin inhibují syntézu buněčné stěny. Mechanizmus účinku je zaloţen na vazbě antibiotika beta-laktamovým kruhem na transpeptidasu, čímţ dojde k inhibici transpeptidasové reakce a poté k inhibici syntézy peptidoglykanu. Další skupinou jsou antibiotika, která inhibují funkci cytoplazmatické membrány. Patří sem gramicidin A, valinomycin a polymyxiny. Vyvolávají selektivní a nespecifickou propustnost pro K+ a tak nedovolují ustavení protonového gradientu. Velmi významná jsou antibiotika, která inhibují proteosyntézu. Příkladem je skupina aminoglykosidů, kam patří streptomycin, kanamycin, neomycin a gentamycin. Tyto látky se irreverzibilně váţou na S12 protein malé podjednotky ribozomu a způsobí její distorzi. Dále se sem řadí také makrolidy a linkosamidy, které se váţou na 23S rRNA 50S podjednotky ribozomu. Rifampicin, kyselina nalidixová, kyselina oxolinová a novobiocin jsou skupiny látek, které se řadí mezi antibiotika inhibující syntézu a funkci nukleových kyselin. Aktinomycin D vytváří zkříţené vazby alkylací guaninových zbytků protějšího řetězce DNA, čím je blokována transkripce i replikace. Mitomycin C spojuje navzájem oba řetězce DNA pevnou vazbou, čímţ je blokována transkripce, replikace, rekombinace i reparace (Němec, 1993). Chemoterapeutika v mnohém připomínají antibiotika, ale jsou připravena syntetickou cestou. Podávají se k usmrcení patogenů nebo k zastavení jejich růstu. Nejčastěji se pouţívají sulfonamidy, které se vyznačují vysokou selektivitou a pouţívají se především proti infekcím močových cest a k léčbě střevních potíţí. Bakteriostatický efekt je způsoben kompetitivní inhibicí syntézy kyseliny tetrahydrolistové. Symbiotika přispívají ke správné funkci mikroorganismů ve střevě a potlačují mnoţení patogenů kombinací probiotik a prebiotik. Tato kombinace potom přispívá k prodlouţení účinku probiotik, pro které je prebiotikum specifickým substrátem vhodným k fermentaci. Pro organismus mají prospěšný účinek.

-9-

2. Trávicí trakt drůbeže 2.1. Obecná charakterizace Trávicí soustava ptáků, stejně jako u vyšších obratlovců, je entodermální původu. Během vývoje se z entodermu vyvinul epitel trávicí soustavy a z ektodermu vznikla ústa, hltan, jícen, konečník a řiť. Oproti savcům má trávicí soustava ptáků určitá specifika. Trávicí trakt je rozdělen na část hlavatou a trávicí trubici. Hlavatá část představuje zrohovatělý zobák, ústní dutinu a hltan. Trávicí trubice začíná jícnem, který je ve spodní části rozšířen ve vole. Další částí je ţaludek, jenţ je rozdělen na dva oddíly, a to ţláznatý ţaludek, kde probíhá chemické trávení, sekrece HCl, pepsinogenu a mucinu, a svalnatý ţaludek, ve kterém je strava mechanicky zpracovávána. K lepšímu rozmělnění a drcení potravy slouţí ve svalnatém ţaludku gastrolity, coţ jsou drobné kaménky, které pták sezobává s potravou. Dalšími specifickými oddíly trávicí trubice ptáků je tenké střevo a dvě slepá střeva (céka), která se vychlipují těsně před poslední částí tlustého střeva. Obsahují specifickou bakteriální mikroflóru, která podporuje trávení celulosy. Posledním oddílem trávicího traktu ptáků je kloaka, která představuje společný vývod trávicího systému, párového močovodu a pohlavní soustavy. Délka trávicího traktu je u ptáků kratší neţ u savců, proto jejich metabolismus pracuje mnohem intenzivněji (Wikipedie).

2.2. Onemocnění trávicího traktu drůbeže Sloţení střevní mikroflóry má velký vliv na zdraví a imunitní systém organismu. Protoţe do trávicího traktu denně s potravou vstupuje velké mnoţství neţádoucích mikroorganismů, je velmi důleţité, aby osídlení prospěšnými bakteriemi bylo dostatečné a aby ve skladbě intestinální mikroflóry byl udrţován vyváţený stav (symbióza). Pokud nastane nerovnováha (dysbióza), dojde k nárůstu a pomnoţení patogenních bakterií a k propuknutí bakteriální infekce. Jedná se především o kandidy, pseudomonády, klostridia a stafylokoky (Zbořil a kol., 2005). Doprovodným jevem při infekci je produkce toxinů vyvolávajících onemocnění. Obvykle je infekce doprovázena průjmem, coţ vede ke sníţení počtu probiotických bakterií (laktobacily, bifidobakterie), jejichţ sníţené mnoţství vede k oslabení imunity a přispívá k rozvoji nemoci. Nesprávné sloţení střevní mikroflóry můţe - 10 -

být také ovlivněno podáním antibiotik. Většina patogenů získá velmi rychle rezistenci, zatímco prospěšné bakterie jsou na tyto látky citlivé. Některé patogenní bakterie mohou mít vliv i na tvorbu karcinomu díky produkci různých enzymů, které mění ve střevě prekarcinogeny na karcinogeny, např. zvýšením exprese beta-glukuronidasy, azoreduktasy nebo nitroreduktasy (Wollowski a kol., 2001). Nepřítomnost některé sloţky střevní mikroflóry nebo její nerovnováha je zejména u drůbeţe povaţována za hlavní důvod vysoké citlivosti k bakteriálním infekcím. Dysbiotická mikroflóra u drůbeţe můţe mít aţ letální účinky. 2.2.1. Salmonelóza Bakterie rodu Salmonella se řadí do čeledi Enterobacteriaceae. Jedná se o fakultativně anaerobní gram-negativní bakterie, bez schopnosti sporulace (Velge a kol., 2005). Převáţně průjmové onemocnění způsobují zoopatogenní kmeny salmonel, nejčastěji bakterie Salmonella enterica sérovar Enteritidis (S. Enteritidis) a Salmonella enterica sérovar Typhimurium (S. Typhimurium). Kmeny sérovaru S. Enteritidis mohou infikovat široký okruh hostitelů a drůbeţ je povaţována za hlavního přenašeče. U dospělých jedinců onemocnění zpravidla probíhá ve formě asymptomatické střevní infekce, ke které dochází tak, ţe se bakterie váţou na sliznici střeva pomocí adhezinů a poté salmonely pronikají do buněk a mnoţí se v nich. Na rozdíl od shigel a escherichií se však nemnoţí v cytoplazmě, nýbrţ setrvávají ve fagosomálních vakuolách (Votava a kol., 2005 ). Nákaza v pokročilém stádiu se však u drůbeţe můţe projevit i průjmem s velkou frekvencí stolic a následnou dehydratací nebo redukcí snůšky. Mezi zdroje infekce patří kontaminované krmivo, hlodavci, člověk a hmyz. Prevence je zaloţena na aplikaci aktivních a inaktivních vakcín, ale ţádnou vakcínou nelze docílit kompletní ochrany. Vůči antibiotikům a chemoterapeutikům se salmonela stává rychle rezistentní. Dalším problémem, který komplikuje průběh tlumení nákazy v chovech drůbeţe, je dlouhodobé vylučování salmonel trusem (Šišák a Havlíčková, 2007). 2.2.2. Nekrotická enteritida Clostridium perfringens produkuje celou řadu toxických enzymů a na základě spektra tvořených toxinů lze jednotlivé kmeny rozdělit do pěti toxických typů, označovaných A – E (Votava a kol., 2005). Původcem nekrotické enteritidy jsou bakterie druhu C. perfringens typu A a D. Jedná se o gram-pozitivní bakterie, které jsou vysoce odolné k vlivům vnějšího - 11 -

prostředí. Obsahují α-toxin (fosfolipasa C) vznikající při plynaté sněti. Vstupuje do plazmatické membrány buněk a tvoří v ní otvory, které narušují běţné procesy buňky. Tvorbu toxinu také podporuje nedostatečný enzymatický rozklad bílkovin a sníţení peristaltiky střev. Zabránit nemoci lze podáním látek podporujících trávení bílkovin, udrţováním optimálního pH v ţaludku a střevě. Z tohoto důvodu je také nezbytné udrţovat správné sloţení střevní mikroflóry, která ve střevě tvoří kyselinu mléčnou a organické kyseliny (octová, máselná, propionová), a tak přispívá k vytvoření nepříznivého prostředí pro patogenní bakterie druhu C. perfringens. V trávicím traktu zdravé drůbeţe jsou různé druhy klostridií běţně přítomny, nemoc propukne aţ při jejich přemnoţení, které můţe být zapříčiněno právě zvýšením pH střevního obsahu. Po aplikaci antibiotik se celkový počet mikroorganismů sniţuje a vytváří se tak ideální prostředí pro pomnoţení různých oportunistických patogenů, jako jsou kvasinky, bakterie rodu Pseudomonas a Proteus, a také klostridií. 2.2.3. Střevní spirochetóza Do řádu Spirochaetales patří spirálovitě stočené pohyblivé bakterie spirochety. Tyto gram-negativní bakterie jsou součástí normální střevní mikroflóry ptáků, kde se vyskytují ve slepém střevě. Vzácně mohou být původci boreliózy, která se přenáší nakaţeným hmyzem nebo hlodavci a je doprovázena průjmem, redukcí snůšky, změnou barvy ţloutku a zastavením růstu. Speciální vakcína pro ptáky nebyla zatím vyvinuta. 2.2.4. Parazitární onemocnění trávicího traktu drůbeže Kokcidióza Onemocnění vyvolávané parazitickým prvokem rodu Eimeria se nejčastěji vyvíjí ve střevní sliznici. Tito střevní cizopasníci se vyskytují zejména v chovech s vysokou koncentrací zvířat na malé ploše. Kokcidiózu je obtíţné odhalit pro svůj všeobecný projev nákazy. Nemoc se můţe jevit bez jakýchkoliv příznaků aţ po ochrnutí a celkový úpadek slepic. Nákaze se dá předejít dodrţováním hygienických pravidel, neboť se tato nemoc přenáší výhradně trusem (Wikipedie).

- 12 -

Askaridióza Askaridióza neboli škrkavčitost je onemocnění způsobené hlísticemi z rodu Ascaridia. Drůbeţ je nejčastějším hostitelem Ascaridii galli, který parazituje v tenkém střevě. Příznaky záleţí na tom, zda jsou larvy jiţ ve střevě, nebo migrují v těle, také závisí na mnoţství nakladených vajíček (Votava a kol., 2005). Diagnóza nákazy se prokáţe z trusu, ve kterém larvy a vajíčka škrkavky přeţívají. Léčba se provádí pomocí antihelmintik. Histomonóza Jednobuněčný parazit Histomonas meleagridis, vyskytující se hlavně ve slepém střevě a na sliznici, napadá nejčastěji cékum a játra a způsobuje nejčastěji onemocnění histomonózu. Nákaza se projevuje sníţenou pohyblivostí, ospalostí, únavou a průjmy. Prevence je zaloţena na pravidelném odčervování a zabránění kontaktu domácí drůbeţe s volně ţijícím ptactvem. Ţádný účinný lék neexistuje. 2.2.5. Plísňová onemocnění trávicího traktu drůbeže Megabakterióza (makrorhabidióza) Smrtelné onemocnění, typické progresivním hubnutím, vyvolávají vřeckovýtrusné houby Macrorhabdus ornithogaster, které způsobí změnu pH v ţaludku. Nákaza se přenášení kontaminovaným trusem a projevuje se postupnou ztrátou hmotnosti, průjmem, únavou, načepýřeným peřím a úhynem drůbeţe. Postiţení ptáci neustále hubnou i přes zdánlivě dobrou chuť k jídlu. Léčba se provádí antibiotiky a antimykotiky, někdy pomáhá okyselování vody. Kandidóza Kvasinka Candida albicans je přirozenou součástí střevní mikroflóry, ovšem pokud dojde k dysbióze, začne se nekontrolovatelně mnoţit a vyvolá plísňové onemocnění sliznice a trávicího traktu vyskytující se hlavně u mladých jedinců. Při rozvoji nemoci dochází k zánětu volete, dále se infekce projevuje zastavením růstu, slabostí, ospalostí a průjmem. Kandidózu je těţké odhalit, protoţe se u kaţdého jedince průběh nákazy zpravidla liší. Léčba se provádí podáním antimykotik.

- 13 -

3. Střevní mikroflóra u drůbeže 3.1. Chov drůbeže Drůbeţnictví je jedním z nejrychleji se rozvíjejících odvětví zemědělské výroby zabývající se chovem a šlechtěním drůbeţe, zatímco drůbeţářství je obor průmyslové výroby, který se stará o zpracovávání drůbeţe a jejích produktů (Wikipedie). Nejrozšířenější je chov slepic, krůt, hus, kachen či perliček a provozuje se buď pro produkci konzumních, nebo násadových vajec, masa a peří. Odchované slepice pohlavně dospívají mezi 18.-20. týdnem ţivota a stávají se z nich nosnice, kdy se chovají zejména pro vejce. Drůbeţ produkovaná rychlovýkrmem pro maso se označuje jako brojleři. Kromě významu z hlediska potravního zdroje nesmíme opomenout na velký hospodářský přínos. Chov kura domácího je typický nejen pro velkochovné stanice, ale je velmi oblíben i u malochovatelů, kde bývá vyuţit jako likvidátor zbytků potravy, ceněna je rychlá reprodukční schopnost, nenáročnost na chov a okolní podmínky, také jeho schopnost snadné a rychlé metabolické přeměny proteinů v krmivu na ţivočišné bílkoviny a v neposlední řadě moţnost spolupráce s průmyslovými odvětvími.

3.2. Vývoj střevní mikroflóry u drůbeže Na chovných stanicích jsou kuřata udrţována ve sterilním prostředí, nemají ţádný kontakt s matkou a přirozeným prostředím a sloţení jejich střevní mikroflóry je rozdílné od mikroflóry, která se vyskytuje u volně ţijící drůbeţe. Proto často dochází ke kolonizaci negativní mikroflórou, drůbeţ má oslabenou imunitu a je náchylnější k infekci. Tudíţ u drůbeţe, která se vyuţívá ve velkochovech a drůbeţárnách, má typ stravy rozhodující vliv na mikroflóru v trávicím systému. Krmivo je obohaceno o podporující látky a probiotika, která zlepšují růst a celkový vývoj kuřete. Sloţení střevní mikroflóry úzce souvisí se způsobem výţivy. U čerstvě vylíhlých kuřat je gastrointestinální trakt naprosto sterilní, kolonizace mikroorganismy začíná s první přijatou potravou. Mezi hlavní kolonizátory patří obligátní anaerobové. Ti jsou schopni metabolizovat zbytky kyslíku, které mohou do střev proniknout, a tak zajistit anaerobní prostředí.

- 14 -

Během prvních dvou aţ čtyř dnů osídlí streptokoky a enterobakterie tenké střevo a cékum. Po prvním týdnu ţivota kuřete mají v tenkém střevě převahu laktobacily a později je cékum kolonizováno hlavně anaeroby, jako jsou zástupci rodu Bacteroides a bifidobakterie, zatímco fakultativní bakterie se uţ vyskytují méně často (Barnes a kol., 1972). Mead a Adams se v roce 1975 zabývali rozdíly mezi dobou dokončení osídlování trávicího traktu a zjistili, ţe v tenkém střevě je běţně mikroflóra zaloţena během 2 týdnů, zatímco ve slepém střevě je bakteriální sloţení plně vyvinuto aţ ve 30 dnech. U dospělé drůbeţe je největší mnoţství střevních bakterií popsáno ve slepém střevě, kde se vyskytují hlavně klostridie, zástupci rodu Bacteroides, v menším počtu je zde zastoupení laktobacilů a enterokoků (Barnes a kol., 1972; Mead a Adams, 1975). Oproti tomu v tenkém střevě většina mikrobiálního ekosystému náleţí laktobacilům, enterokokům a enterobakteriím. Z hub se ve střevech vyskytuje v malém mnoţství Candida albicans, Saccharomyces, Aspergillus a Penicillium. Mnoţství mikroorganismů kolísá podél celé délky trávicího traktu. Příčinou toho jsou změny v kyselosti, ţivinách nebo dostupnosti kyslíku, které se v různých místech trávicího ústrojí liší. V ţaludku a ve dvanáctníku ţije přibliţně 101-103 bakterií/ml, lačník a kyčelník osídluje 104-107 bakterií/ml a v tračníku se přibliţně nachází 1011-1012 bakterií/ml (O´Hara a Shanahan, 2006). Další výzkumy ukázaly, ţe laktobacily a streptokoky lze nalézt ve dvanáctníku a kyčelníku, Clostridium, Bacteroides, enterokoky, anaerobní laktobacily a Escherichia coli se vyskytují hlavně v céku (Salanitro a kol, 1975). Některé bakterie jsou postupně vytlačeny a jejich místo zaujmou nové druhy.

3.3. Fylogenetické postavení a nejdůležitější taxonomické skupiny osídlující trávicí trakt drůbeže Kmen Firmicutes Třída Bacilli Řád Lactobacillales Čeleď Lactobacillaceae Rod Lactobacillus Laktobacily se řadí mezi gram-pozitivní, fakultativně anaerobní nesporulující mléčné bakterie, které fermentují glukosu a laktosu na laktát. Při tomto procesu vzniká kyselina mléčná, díky níţ se sniţuje pH a zastavuje mnoţení hnilobných bakterií, které mohou způsobovat aţ nádorová onemocnění. Proto jsou laktobacily nepostradatelnou součástí zaţívacího traktu ptáků a savců. - 15 -

Jejich probiotický účinek se uplatňuje především v tlustém střevě, kde přispívají ke správnému průběhu metabolických procesů a podporují růst zdravých bakterií. Pouze vzácně se stávají patogenními. Nejčastějším zástupcem je L. acidophilus, který se největší měrou podílí na vytváření kyselého prostředí v zaţívacím ústrojí. Dále trávicí trakt často obývá L. casei, který zlepšuje trávení, sniţuje riziko vzniku zácpy a doplňuje růst L. acidophilus. Kmen Firmicutes Třída Clostridia Řád Clostridiales Čeleď Clostridiaceae Rod Clostridium Rod Clostridium zahrnuje sporulující gram-pozitivní bakterie, rostoucí za anaerobních podmínek (Votava a kol., 2005). Buňky mají tvar pleomorfních tyček většinou se vyskytující po dvou nebo v řetízkách. Pohybují se peritrichálními bičíky. Klostridie se často účastní hnilobných procesů a běţně se vyskytují ve střevním traktu ţivočichů, půdě, výkalech nebo rozkládajícím se biologickém materiálu. C. botulinum zahrnuje širokou skupinu bakterií, které vytvářejí neurotoxin botulotoxin, jeden z nejsilnějších známých bakteriálních toxinů (Votava a kol., 2005). Tento zástupce je izolován z půdy, sedimentů, potravin a zaţívacího traktu ţivočichů. C. perfringens lze nalézt v půdě a trávicí soustavě obratlovců. Je původcem plynaté sněti, infekce měkkých tkání doprovázené tvorbou plynu, který tvoří díry ve svalové tkáni. Toxiny této bakterie také mohou vyvolat onemocnění trávicí soustavy. C. novyi se také vyskytuje v zaţívacím traktu zvířat. Tento striktní anaerob produkuje na rozdíl od C. perfringens v poškozené tkáni mnohem méně plynu, takto je přítomen typický mohutný tuhý edém (Votava a kol., 2005). Dalším zástupcem, který běţně osídluje trávicí trakt je C. difficile. Při přemnoţení ale uvolňuje škodlivé toxiny, způsobuje váţné infekce střeva, nadýmání či průjmy. Je také povaţován za nejčastějšího patogena tlustého střeva při narušení rovnováhy střevní mikroflóry podáním antibiotik. Dalšími zástupci, kteří také kolonizují zaţívací ústrojí obratlovců, jsou C. sporogenes a C. tetani.

- 16 -

Kmen Actinobacteria Třída Actinobacteria Řád Bifidobacteriales Čeleď Bifidobacteriaceae Rod Bifidobacterium Morfologicky se jedná o gram-pozitivní anaerobní nesporulující tyčky rozmanitého tvaru, obvykle mírně zakřivené. Tito chemoorganotrofové jsou jedním z hlavních rodů bakterií tvořících mikroflóru trávicího traktu obratlovců. Ţijí v největším počtu v dolní části tlustého střeva, kde metabolizují komplexní sacharidy. Jejich patogenita zatím nebyla prokázána. Některé kmeny bifidobakterií patří mezi probiotika a podávají se jako doplněk stravy, aby vyrovnaly střevní mikrobiální homeostázy, potlačily přemnoţené škodlivé bakterie a posílily imunitní systém tvorbou vitaminů. Bifidobacterium longum patří mezi nejvýznamnější obyvatele v tělech obratlovců. Podobně jako laktobacily sniţují pH tvorbou kyselinu mléčné a octové a tím se inhibuje růst C. albicans, E. coli a dalších patogenů. Dalším uţitečným zástupcem je B. bifidum, který výrazně zlepšuje peristaltiku střeva. B. breve při fermentaci produkuje kyselinu mléčnou a acetát, díky čemuţ je zajištěno kyselé prostředí a inhibován růst mnoha neţádoucích bakterií, jako jsou Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Clostridium difficile, Salmonela typhimurium a E. coli. Kmen Bacteroidetes Třída Bacteroidetes Řád Bacteroidales Čeleď Bacteroidaceae Rod Bacteroides Mezi nejvýznamnější skupinu tohoto rodu patří Bacteroides fragilis, jeţ zahrnuje gram-negativní nesporulující anaeroby. Tento typický zástupce běţné střevní mikroflóry obratlovců má ve střevě hlavní roli při trávení velkých sloţitých biomolekul. Jako hlavní zdroj energie vyuţívá polysacharidy z přijaté rostlinné stravy. Má velký význam při odbourávání nestrávených zbytků potravy a tvorbě cenných ţivin, také napomáhá při recirkulaci ţlučových kyselin a biotransformaci. Pokud se ale dostane do jiné části těla, stává se patogenním. Nepříjemnou vlastností je tvorba beta-laktamasy, čímţ se beta-laktamasová antibiotika stávají neúčinnými (Votava a kol., 2005). - 17 -

Kmen Proteobacteria Třída Gammaproteobacteria Řád Enterobacteriales Čeleď Enterobacteriaceae Enterobakterie se řadí mezi jedny z nejdůleţitějších a nejprozkoumanějších bakterií vůbec. Zahrnují gram-negativní, fakultativně anaerobní tyčinkovité mikroby, pro které je nejpřirozenějším ţivotním prostředím střevní trakt. S výkaly se dostávají do vnějšího prostředí a jsou proto povaţováni jako hlavní indikátor fekálního znečištění pitné vody. Ve střevě mohou působit jako komenzálové, kdy se dělí se svým hostitelem o potravu, jako saprofyté, kteří spotřebovávají organické zbytky, nebo jako patogeny vyvolávající chorobné příznaky, zvlášť pokud se dostanou mimo střevo (Votava a kol., 2005). U drůbeţe bývá nejzávaţnější infekce enterobakteriemi z rodů Escherichia, původce onemocnění kolibacilózy, Salmonella, která způsobuje salmonelózu a Yersinia, vyvolávající nemoc pseudotuberkulózu (Wikipedie). Escherichia coli, modelový organismus vyuţívaný v genetice a mikrobiologii ke studiu bakteriálních struktur a jejich funkcí, fyziologie, metabolismu, genetické regulace a přenosu signálů (Bhunia, 2008), je nezbytnou součástí trávicích procesů, vytváří vitamin K a inhibuje mnoţení škodlivých bakterií ve střevě. Mimo střevo je E. coli téměř vţdy patogenní a způsobuje i chronické stavy. Po E. coli jsou enterobaktery druhou nejpočetnější enterobakterií střevního traktu. Některé kmeny těchto bakterií jsou patogenní a původci onemocnění močové a dýchací soustavy. Mezi další enterobakterie, které osídlují střevo, patří rod Klebsiella, Proteus, Pantoea, Hafnia a Citrobacter.

Kmen Verrucomicrobia Třída Verrucomicrobieae Řád Verrucomicrobiales Čeleď Verrucomicrobiaceae Rod Verrucomicrobium Tento malý nedávno popsaný kmen gram-negativních striktně anaerobních bakterií nese jen několik druhů, které byly izolovány ze sladké vody, půdy a trusu (Hedlund a kol., 1997). Verukomikrobia se pouţívají v biotechnologických a medicínských odborech (Wagner a Horn, 2006). Zástupce Akkermansia muciniphila byl detekován jako normální součást - 18 -

střevní mikroflóry zaţívacího traktu ţivočichů (Derrien a kol., 2004; Ecburg a kol., 2005). Dalším zástupcem, podle kterého byl celý kmen pojmenován, je Verrucomicrobium spinosum, vyskytující se ve vodních tocích, v půdě a trávicím traktu obratlovců.

- 19 -

4. Metody detekce střevní mikroflóry 4.1. Kultivační techniky a mikroskopie Kultivace představuje základní postup slouţící k přímému průkazu a charakteru růstu mikroorganismů. Mikroby se v laboratořích kultivují na sterilních ţivných půdách, které musí obsahovat dostatek vody, ţivin a dalších faktorů pro správný růst a ţivotní pochody. Kaţdý druh má rozdílné nároky na svou výţivu i podmínky kultivace, proto je třeba vţdy pečlivě zváţit sloţení kultivačního média, teplotu, optimální pH, přítomnost kyslíku, vody, světla a další specifické poţadavky. Kultivační média se rozlišují podle původu na syntetická s přesně definovaným chemickým sloţením a přirozená, která obsahují ţivný bujon a nejsou připraveny chemicky. Při pouţívání ztuţených půd se k bujónovému základu přidává agar nebo ţelatina pro pozorování izolovaných kolonií. Ztuţená média se nejčastěji kultivují v termostatu s pravidelnou výměnou vzduchu. Média se také dělí na univerzální, která mají dostatek ţivin a umoţňují tak růst širokému spektru mikrobů, a selektivní, ve kterých se zvýhodněn růst pouze jednoho druhu nebo velmi mále skupině mikroorganismů. Pro detekci mikroorganismů se také pouţívají různé mikroskopické techniky, vyuţívající vlnění s vlnovou délkou kratší neţ jsou rozměry objektu. Optická mikroskopie vyuţívá struktur lišících se vzájemně absorpcí viditelného světla. Další varianty, které lze pouţít, je elektronová nebo akustická mikroskopie. Hojně vyuţívané jsou počítací komůrky, coţ je silné mikroskopické sklo s vyrytými čtverci a krycím sklem, které se pokládá na lišty. Mezi skly vzniká prostor se známým objemem a poté je moţno pod mikroskopem přepočítat počet buněk na jejich celkovou koncentraci. Mnoho kultivačních i mikroskopických metod se pouţívá pro detekci a izolaci mikroorganismů z povrchů, půdy, vody a z dalších prostředí, např. střevního obsahu. Mikroskopické studie však ukázaly, ţe přibliţně 60-90 % střevních bakterií nemůţe být kultivováno (Suau a kol., 1999; Lan a kol., 2002) z důvodu jejich způsobu ţivota ve striktně anaerobním prostředí, a proto také pro charakterizaci střevní mikroflóry kultivační techniky nejsou vhodné. Potřeba kultivačních technik se sice nevylučuje, ale díky neustálému zdokonalování a rozvoji molekulárně biologických metod se pro detekci anaerobů začaly vyuţívat bezkultivační metody zaloţené na molekulární analýze DNA.

- 20 -

4.2. Analýza sekvencí genů pro 16S rRNA 4.2.1. Charakteristika a uspořádání genů pro 16S rRNA Ribonukleová kyselina (RNA) patří spolu s deoxyribonukleovou kyselinou (DNA) a proteiny mezi nejdůleţitější makromolekuly pro ţivot všech organismů. RNA má v organismu mnoho funkcí a dělí se na mRNA, která se vytváří při transkripci DNA a slouţí k přenosu genetické informace do místa syntézy bílkovin, tRNA, která zajišťuje transport aminokyselin na ribozom a rRNA, která tvoří stavební sloţku ribozomů. Prokaryotický ribozom se skládá ze dvou podjednotek, 30S a 50S, jejichţ spojením vzniká ribozom se sedimentačním koeficientem 70S (Rosypal, 2006). U prokaryotických organismů se vyskytují tři různě velké rRNA, a to 23S, 16S a 5S. Geny, které jsou přepisovány do rRNA u prokaryot, se většinou vyskytují na chromozomu ve více kopiích. Na chromozomu se geny pro rRNA seřazují do skupin, které se přepisují jako jedna transkripční jednotka. U E. coli K12 jsou geny v transkripční jednotce seřazeny dle následujícího schématu (Obrázek 1).

Obr. 1: Transkripční jednotka genů pro rRNA (Rosypal, 2006).

- 21 -

Geny pro 16S rRNA, stejně tak pro 23S rRNA mají univerzální distribuci v rámci prokaryotické říše a také mají vysoký informační obsah. Proto se ukázaly být nejlepším ukazatelem mikrobiální diverzity a evoluce (Van de Peer a kol., 1993). V jejich nukleotidové sekvenci se mohou rozlišit konzervativní úseky, které jsou shodné u všech bakteriálních druhů a variabilní úseky, které jsou u jednotlivých druhů nebo kmenů odlišné. Konzervativní úseky pak mohou slouţit k připojení univerzálních primerů specifických pro všechny bakterie a tedy k cílené amplifikaci pouze bakteriální DNA ze vzorku. Variabilní oblasti pak mohou slouţit k přesné bakteriální identifikaci po připojení druhově specifických primerů. Stanovením výskytu a mnoţství variant genů pro 16S rRNA lze proto jednoduše odlišit jednotlivé zástupce různých bakteriálních společenstev. Molekulárně biologické metody zaloţené na analýze genů pro 16S rRNA nahrazují či doplňují kultivační techniky a umoţňují tak lépe a přesněji analyzovat střevní mikroflóru. Jejich výhodou je detekce zástupců mikrobiálních společenstev bez předchozí kultivace a poskytnutí nových moţností studia diverzity mikroorganismů (Furrie, 2006). 4.2.2. Elektroforetická metoda denaturační gradientové gelové elektroforézy (DGGE) a metoda terminálního polymorfismus délky restrikčních fragmentů (T-RFLP) Molekulární techniky DGGE a T-RFLP jsou metody vhodné zejména pro určení dominantních druhů, dynamických změn ve sloţení bakteriálních společenstvech a např. pro stanovení vlivu antibiotik, probiotik a prebiotik na střevní mikroflóru. Jsou výhodné z důvodu přesnosti, časové nenáročnosti a snadné manipulace. Elektroforetická metoda denaturační gradientové gelové elektroforézy (DGGE) byla poprvé aplikována pro studium mikroorganismů vodního ekosystému (Muyzer a kol., 1993). Tato metoda umoţňuje analytickou separaci DNA molekul stejně dlouhých, ale lišících se nukleotidovou sekvencí. Při této metodě se amplifikují části genů pro 16S rRNA a vzniklé fragmenty DNA se následně separují na gelu, který obsahuje denaturační příměsi močoviny a formaldehydu. Dvouřetězcová DNA postupuje gelem aţ do místa, kde vysoká koncentrace denaturačních látek způsobí rozpad DNA na jednořetězcovou, čímţ se změní její pohyblivost. Analyzovaná DNA se denaturuje v různých oblastech gelu s gradientem denaturačního činidla v závislosti na nukleotidové sekvenci. Takto lze od sebe odlišit zástupce různých bakteriálních společenstev podle variability v nukleotidové sekvenci 16S rDNA. Metoda terminálního polymorfismus délky restrikčních fragmentů (T-RFLP) je zaloţena na PCR amplifikaci bakteriálních genů pro 16S rRNA za pouţití PCR primerů, z nich jsou jeden nebo oba fluorescenčně značeny. Po PCR amplifikaci následuje štěpení - 22 -

restrikční endonukleasou a vzniklé DNA fragmenty jsou separovány pomocí kapilární elektroforézy, přičemţ pouze koncově značený fragment je zaznamenán a slouţí k analýze daného vzorku bakteriální populace. Délka koncově značeného fragmentu je pro kaţdou skupinu bakterii specifická a na základě polymorfismu délky restrikčních fragmentů lze jednotlivé skupiny bakterií od sebe odlišit (Obrázek 2). Data T-RFLP se zaznamenávají do grafu nazývajícím se elektroferogram, ve kterém je na ose X znázorněna velikost fragmentů v párech bazí (bp), zatímco na ose Y je vynesena intenzita fluorescence kaţdého fragmentu. Intenzita fluorescence pak odráţí zastoupení (relativní četnost) dané skupiny bakterií ve vzorku.

1. izolace DNA 2. PCR amplifikace 16S rDNA

3. štěpení restriktázou cc gg

cc gg cc gg

cc gg cc gg cc gg

4. fragmentační analýza fl u or es ce nc e

50 100 150 200 250 300 350 velikost fragmentu (bp) velikost fragmentu (bp)

Obr. 2: Metoda terminálního polymorfismus délky restrikčních fragmentů (T-RFLP, Hradecká, osobní komunikace).

- 23 -

4.2.3. Kvantifikace specifických sekvencí pomocí Real-time PCR Metoda Real-time PCR se pouţívá k namnoţení (amplifikaci) a kvantifikaci cílené DNA na základě replikace nukleových kyselin s moţností sledování průběhu reakce během kaţdého cyklu díky světelnému signálu z fluoroforů. Pro syntézu nového vlákna se nejčastěji pouţívá termostabilní DNA polymerasa bakterie Thermus aquaticus, tzv. Taq-polymerasa. K amplifikaci sekvence DNA dochází v cyklické reakci, která probíhá ve třech teplotních fázích. Celý postup se provádí na přístrojích s moţností teplotního cyklování a následnou detekcí fluorescence v kaţdé jamce. V prvním kroku nejprve dojde k denaturaci templátové DNA zahřátím na 94-98 °C na 20-30 sekund, kdy vzniká jednořetězcová DNA. Poté se teplota sníţí na 55-60 °C a na specifická místa na DNA se připojí primery a v posledním kroku se teplota dostane na 72-80 °C, při které Taq-pomylerasa syntetizuje novou DNA. Primery, chemicky syntetizované oligonukleotidy o velikosti 10 - 30 nukleotidů, se připojí na začátek a konec dvoušroubovicové DNA, a tím vymezují úsek DNA, který se má namnoţit. Fluorescenční látky uvolňují záření v přítomnosti PCR produktu a výsledky detekované fluorescence pak ukáţou mnoţství nasyntetizované DNA. V současné době se nejčastěji vyuţívá specifické a nespecifické fluorescenční značení. V případě nespecifického značení se fluorofory (SYBR Green I) váţou na dvouřetězcový fragment amplifikačního produktu. Specifické značení umoţňují sondy, které mají ve své struktuře fluorofor. Pracují buď na principu 5´ exonukleasové aktivity DNA polymerasy (značené sondy TaqMan) nebo na principu hybridizace lineárních či vlásenkových sond FRET nebo také na principu fluoreskujících amplionů Amplifluor. Bez ohledu na pouţívané fluorescenční značení se kvantifikace templátové DNA provádí pomocí matematické analýzy amplifikačních křivek. Počátek křivky nemůţe být určen, protoţe detekční signál v prvních cyklech amplifikace je překryt fluoreskujícím pozadím. V okamţiku dostatečné koncentrace produktu je reakční proces akumulace monitorován jako logaritmicky-lineární fáze a koncentrace produktu roste rychlostí přibliţně jeden log10 kaţdý třetí cyklus. S následujícími cykly se primery postupně vyčerpávají a také se sniţuje působení DNA polymerasy, zatímco dochází k navýšení inhibičního efektu nahromaděného PCR produktu. Reakce se zpomaluje a amplifikační křivka se dostává do rovnováţné fáze. Čím rychleji fluorescence přeroste přes úroveň fluorescenčního pozadí, tím více bylo na začátku přítomno templátové DNA. Data se získávají v logaritmicky-lineární fázi křivky z hodnoty CT, která odpovídá cyklu, kdy fluorescence překročí fluorescenční pozadí

- 24 -

(Rychlík a kol., 2004). Z dosaţených výsledků lze poté určit relativní nebo absolutní kvantifikaci. Při relativní kvantifikaci se pozorují změny exprese jednoho genu vůči genu referenčnímu a při absolutní kvantifikaci se zjišťuje přesný počet kopií templátu ve vzorku s vyuţitím kalibračních křivek. Metoda Real-time PCR nachází stále více své uplatnění v molekulárně biologických a medicínských oborech a díky neustálému rozvoji a vytváření nových variant této metody se stává hojně vyuţívanou technikou.

- 25 -

5. Cíle práce Mezi hlavní cíle této bakalářské práce patřilo: 1) Objasnění základních pojmů, principů a poznatků k dané problematice v rámci literární rešerše. 2) V experimentální části bakalářské práce bylo cílem charakterizovat sloţení střevní mikroflóry u drůbeţe technikami nezávislými na kultivaci a kvantifikovat klíčové zástupce střevní mikroflóry metodou Real-time PCR pomocí primerů specifických pro průkaz jednotlivých bakteriálních skupin vyskytujících se v trávicím traktu drůbeţe. 3) Vyhodnocení zastoupení jednotlivých bakteriálních skupin ve střevní mikroflóře drůbeţe.

- 26 -

6. Materiál a metody 6.1. Experimentální zvířata Do dlouhodobého pokusu sledování vývoje střevní mikroflóry u drůbeţe byly zařazeny slepice nosného typu Lohmann Brown z české farmy Opatovice. Chov nosnic byl sledován v průběhu celého chovného období a trval od vylíhnutí nosnic (26. 3. 2009) aţ do jejich utracení (3. 6. 2010). Vzorky střevního obsahu se odebíraly v určených časových intervalech vţdy od 6 nosnic (3 zvířata z kaţdé pozorované chovné haly). Vzorky střevního obsahu se získaly po utracení zvířat ze dvou oddílů trávicí soustavy, z céka a z kloaky. V rámci této bakalářské práce byly zpracovány vzorky ze tří vybraných období, a to ze dne 14. 5. 2009, tj. v 8. týdnu ţivota (období před snůškou), 30. 7. 2009, tj. v 19. týdnu ţivota (vrchol snůšky) a ze dne 12. 1. 2010, tj. ve 43. týdnu ţivota (konec snůšky).

6.2. Izolace DNA ze vzorků střevního obsahu Z kaţdého odebraného vzorku střevního obsahu se naváţilo přibliţně 240 – 260 mg do 2 ml zkumavek se závitem, po přidání zirkonových kuliček o průměru 0,1 mm (Biospec, USA) a 1,4 ml ASL pufru se směs promíchala na vortexu a následně se inkubovala 5 min. při 95 °C. Po inkubaci se provedla důkladná homogenizace na přístroji MagNA Lyser (Roche, Germany) po dobu 1min. Bakteriální DNA byla izolována pomocí QIAamp® DNA Stool Mini Kitu podle instrukcí výrobce (Qiagen, Německo). Zkrácený protokol zahrnoval tyto kroky: Nejprve proběhla centrifugace 1 min. při 14 500 rpm s vyuţitím centrifugy Sigma (Německo). Z kaţdého vzorku se odpipetovalo 1,5 ml roztoku do nové 2 ml Eppendorf zkumavky, do které se přidala inhibiční tableta InhibitEX. Směs se opět zcentrifugovala při 14 500 rpm 3 min. a vzniklý supernatant o objemu 600 μl se odpipetoval do nové 2 ml Eppendorf zkumavky. Po přidání 80 μl proteinázy K (20 mg/ml), 600 μl AL pufru a 1 μl RNásy se směs inkubovala 10 min. při 70 °C, dále bylo přidáno 600 μl 96% etanolu a poté se veškerý obsah zkumavek přenesl na QiaAmp kolonky a byl centrifugován při 14 500 rpm 1 min. DNA na koloně byla nejdříve promyta dvakrát 500 μl AW1 pufru, pak 500 μl AW2 pufru a v posledním kroku

- 27 -

izolace DNA se na kolonku naneslo 150 μl AE pufru. Po inkubaci 5 min. při 65 °C se izolovaná DNA vymyla AE pufrem. Po izolaci se spektrofotometricky stanovila koncentrace a čistota vyizolované bakteriální DNA pomocí přístroje NanoDrop 2000c (Thermo Scientific, UK). Kvalita izolované DNA se ověřila v 1,2% agarosovém gelu (Serva, Německo), který se připravil rozvařením 0,6 g agarosy v 50 ml TBE pufru a po ochlazení agarosy na 45 °C se roztok obarvil ethidium bromidem. Agarosa se nalila do nádoby a po zatuhnutí se přenesla do elektroforetické vany (Biorad, USA), kde probíhala elektroforéza při konstantním napětí 120 V po dobu 60 minut. Dokumentace oddělených fragmentů DNA se provedla pod UV světlem o vhodné vlnové délce a separovaná DNA byla vyfotografována CCD kamerou.

6.3. Real-time PCR Pro Real-time PCR se vyuţily devadesátišesti jamkové destičky (Roche, Německo), které jsou určené pro přístroj LightCycler® 480 II (Roche, Německo). Kaţdá PCR rekce probíhala v celkovém objemu 10,5 μl s pouţitím SYBR® Green Master Mixu (Qiagen, Německo). Sloţení PCR reakce je uvedeno v Tabulce 1. Primery pouţité pro detekci genů pro 16S rRNA jsou uvedeny v Tabulce 2.

Tab. I: Příprava sloţek PCR reakce.

Komponenty

Objem (µl)

H2O

4,4

MasterMix

5,0

Primer forward

0,1

Primer revers

0,1

DNA

1,0

- 28 -

Tab. II: Specifické primery pouţité pro metodu Real-time PCR. Sekvence 5´- 3´

Primer

úsek bakteriální DNA

cílová skupina

16S_universal-1F

GTG STG CAY GGY TGT CGT CA

16S_universal-1R

ACG TCR TCC MCA CCT TCC TC

16S_universal-2F

GAG GAA GGI GIG GAI GAC GT

16S_universal-2R

AGI CCC GIG AAC GTA TTC AC

16S_Bacteroid-F

CGC ACA AGC GGA GGA AC

16S_Bacteroid-R

CGA CAC CTC ACG GCA CG

16S_Bifido-F

GGT GTG AAA GTC CAT CG

16S_Bifido-R

ACC GGG AAT TCC AGT CT

16S_Clostrid-F

GCG TTA TCC GGA TTT AC

16S_Clostrid-R

ACA CCT AGT ATT CAT CG

16S_Enterobac-F

STG AGA CAG GTG CTG CA

16S_Enterobac-R

AAA GGA TAA GGG TTG CG

16S_Lactobac-F

CTT GAG TGC AGA AGA GG

16S_Lactobac-R

CAC TGG TGT TCT TCC AT

16S_Verruco-F

CAG TAT GGC CCT TAY GC

16S_Verruco-R

GAA CTG RGC CCA GTT TT

univerzální bakteriální primer univerzální bakteriální primer řád Bacteroidales řád Bifidobacteriales řád Clostridiales řád Enterobacteriales řád Lactobacillales řád Verrucomicrobiales

Samotná PCR reakce probíhala podle následujícího protokolu: 1. Hot Start. 95 °C, 15 min. - aktivizace DNA polymerasy 2. PCR. Celkem 40 cyklů podle schématu: a) 94 °C, 15 s - denaturace templátové DNA b) 58 °C, 30 s - připojení primerů c) 72 °C, 30 s – syntéza DNA d) Měření fluorescence 3. Křivka tání (Tm). Kontinuální měření fluorescence.

- 29 -

7. Výsledky 7.1. Izolace DNA V průběhu vypracování bakalářské práce byly zpracovány vzorky střevního obsahu z odběrů v 8., 19. a 43. týdnu ţivota slepic. Celkem bylo izolováno 36 vzorků bakteriální DNA. Naměřené hodnoty koncentrací izolované DNA se pohybovaly v rozmezí od 4,5 do 311,5 μg/ml s čistotou 1,59 aţ 2,43. Kontrolní gelová elektroforéza potvrdila izolaci neporušené chromozomální DNA (Obrázek 3 - 5). Koncentrace a absorbance izolované DNA a naměřená čistota jsou uvedeny v Tabulce 3 - 5. Tab. III: Koncentrace a absorbance izolované DNA a čistota DNA pocházející ze vzorků střevního obsahu odebraných v 8. týdnu ţivota slepic.

Nosnice - odběr (CE – cékum, K - kloaka)

Koncentrace (μg/ml)

Naměřené hodnoty A260/280

A260/230

1 CE

107,8

1,91

1,45

2 CE

78,6

1,97

1,30

3 CE

65,8

2,09

1,40

4 CE

47,0

1,97

1,11

5 CE

71,6

1,94

1,28

6 CE

54,9

2,02

1,28

1K

23,7

2,22

0,62

2K

27,2

1,90

0,56

3K

19,5

2,02

0,60

4K

77,0

1,76

0,91

5K

56,7

2,04

1,09

6K

39,2

2,02

0,88

- 30 -

1

2

3 4 5 6 M 7 8 9 10 11 12

Obr. 3: Kontrolní gelová elektroforéza DNA izolované ze vzorků střevního obsahu osmitýdenních slepic. Vzorky 1-6 jsou odběry z céka, vzorky 7-12 jsou odběry z kloaky. M je standard, 100bp DNA ladder.

Tab. IV: Koncentrace a absorbance izolované DNA a čistota DNA pocházející ze vzorků střevního obsahu odebraných v 19. týdnu ţivota slepic.

Nosnice - odběr (CE cékum, K - kloaka)

Naměřené hodnoty Koncentrace (μg/ml)

A260/280

A260/230

1 CE

234,9

1,87

1,57

2 CE

127,1

1,84

1,50

3 CE

266,1

1,90

1,75

4 CE

311,5

1,93

1,92

5 CE

130,0

1,81

1,42

6 CE

272,0

1,86

1,69

1K

14,7

2,00

0,55

2K

13,1

1,93

0,45

3K

8,0

1,94

0,37

4K

4,5

2,35

0,17

5K

6,2

2,43

0,24

6K

58,3

1,59

0,58

- 31 -

1 2

Obr.

IV:

Kontrolní

3

gelová

4

5

6 M 7 8 9 10 11 12

elektroforéza

DNA

izolované

ze

vzorků

trusu

devatenáctitýdenních slepic. Vzorky 1-6 jsou odběry z céka, vzorky 7-12 jsou odběry z kloaky. M je standard, 100bp DNA ladder.

Tab. V: Koncentrace a absorbance izolované DNA a čistota DNA pocházející ze vzorků trusu odebraných ve 43. týdnu ţivota slepic.

Nosnice - odběr (CE – cékum, K - kloaka)

Koncentrace (μg/ml)

Naměřené hodnoty A260/280

A260/230

1 CE

128,5

1,85

1,51

2 CE

133,7

1,83

1,44

3 CE

78,0

1,78

1,93

4 CE

130,5

1,82

1,43

5 CE

77,0

1,76

1,91

6 CE

109,8

1,84

1,18

1K

13,5

1,94

0,46

2K

29,8

1,93

0,58

3K

6,0

2,42

0,23

4K

14,8

2,01

0,56

5K

12,9

1,91

0,42

6K

7,0

2,35

0,28

- 32 -

1

Obr.

6:

2

Kontrolní

3

4 5

gelová

6

M

7 8

elektroforéza

9 10 11 12

DNA

izolované

ze

vzorků

trusu

čtyřicetitřítýdedenních slepic. Vzorky 1-6 jsou odběry z céka, vzorky 7-12 jsou odběry z kloaky. M je standard, 100bp DNA ladder.

7.2. Metoda Real-time PCR Data se získala matematickou analýzou amplifikačních křivek. V okamţiku dostatečné koncentrace produktu se křivka dostane do logaritmicky-lineární fáze a koncentrace produktu roste rychlostí přibliţně jeden log10 kaţdý třetí cyklus. S následujícími cykly se reakce zpomaluje a amplifikační křivka se dostává do rovnováţné fáze. Výsledky se získávají v logaritmicky-lineární fázi křivky z hodnoty CT (threshold cycle), která odpovídá cyklu, kdy fluorescence překročí fluorescenční pozadí. Hodnoty CT byly stanoveny pro 8x naředěné vzorky izolované DNA a pro kontrolu správnosti měření byly provedeny v duplikátech. Hodnoty CT jednotlivých variant genů pro 16S rRNA (specifické pro jednotlivé taxonomické jednotky) se vztáhly k průměrné hodnotě CT referenčních genů pro 16S rRNA (univerzální pro všechny bakterie) a to přepočtem podle vzorce 2CT 16S - CT GOI (GOI - gene of interest). Hodnoty 2CT

16S - C

T

GOI

(2∆CT) vyjadřují relativní počet kopií varianty genu

specifického pro danou taxonomickou jednotku, o které se liší oproti referenčnímu genu pro 16S rRNA všech bakterií, tj. vyjadřují, kolikrát méně je dané skupiny bakterií vůči celku.

- 33 -

Vypočítané hodnoty 2∆CT jednotlivých slepic (3 zvířata z jedné haly) byly zprůměrovány a tato průměrná hodnota 2∆CT byla vynesena do grafu s logaritmickým znázorněním osy Y. V grafech nejsou znázorněny údaje pro skupinu Verrucomicrobiales, jejíţ hodnoty CT hraničily s detekčním prahem reakce a tedy byly povaţovány za negativní.

Relativní četnost dané skupiny bakterií

Cékum - odběry z haly 23 10 1 0,1 0,01 0,001 0,0001 14.5.

30.7.

12.1.

Časová období odběru vzorků Bacteroidales Clostridiales Lactobacillales

Bifidobacteriales Enterobacteriales

Graf 1: Odběry z haly 23 (cékum). Z grafu 1 vyplývá, ţe v odběrech z céka u sledovaných nosnic v hale č. 23 má nejvyšší relativní zastoupení skupina Bacteroidales, jejíţ mnoţství se v průběhu pozorovaného období výrazně neliší. V pořadí druhou nejčetnější skupinou jsou zástupci Lactobacillales, jejichţ mnoţství se opět v pozorovaném čase nemění. Přibliţně 10x méně často neţ Bacteroidales byly v céku nosnic z haly 23 detekovány klostridie a bifidobakterie, jejichţ relativní mnoţství v pozorovaném období mírně klesá. Enterobakterie byly v případě nosnic z haly 23 pozorovány nejméně často, s přibliţně 100x menší četností neţ skupina Bacteroidales.

- 34 -

Relativní četnost dané skupiny bakterií

Kloaka - odběry z haly 23 10 1 0,1 0,01 0,001 0,0001 0,00001 14.5.

30.7.

12.1.

Časová období odběru vzorků Bacteroidales Clostridiales Lactobacillales

Bifidobacteriales Enterobacteriales

Graf 2: Odběry z haly 23 (kloaka). Graf 2 demonstruje, ţe ve vzorcích z kloaky u nosnic v hale 23 dominuje skupina Lactobacillales, jejíţ mnoţství se v průběhu sledovaného časového období nemění. Oproti tomu skupina klostridií je ve větší míře pouze při prvním odběru a poté její zastoupení prudce klesá. Enterobakterií je přibliţně 100x méně neţ Lactobacillales a v průběhu vybraného časového období zůstává jejich počet relativně neměnný. Bifidobakterií je asi 1000x méně neţ Lactobacillales a jejich mnoţství se opět v pozorovaném čase nemění. S nejmenší četností byly v kloace nosnic z haly 23 detekovány Bacteroidales, jejichţ mnoţství během času mírně vzrůstá.

- 35 -

Relativní četnost dané skupiny bakterií

Cékum - odběry z haly 24 1 0,1 0,01 0,001 0,0001 0,00001 14.5.

30.7.

12.1.

Časová období odběru vzorků Bacteroidales Clostridiales Lactobacillales

Bifidobacteriales Enterobacteriales

Graf 3: Odběry z haly 24 (cékum). Z grafu 3 lze vyčíst, ţe v odběrech z céka u sledovaných nosnic v hale č. 24 má nejvyšší relativní zastoupení skupina Bacteroidales, jejichţ četnost se v průběhu pozorovaného časového období výrazně neliší. Enterobakterie jsou druhou nejpočetnější skupinou v prvním sběrném období, ale jejich mnoţství postupně klesá. Přibliţně 10x méně neţ Bacteroidales bylo pozorováno zastoupení Lactobacillales, jejichţ mnoţství se v čase nemění. S velmi podobnou četností jako Lactobacillales byly v céku nosnic z haly 24 detekovány klostridie a bifidobakterie, jejichţ relativní mnoţství v pozorovaném období mírně klesá.

- 36 -

Relativní četnost dané skupiny bakterií

Kloaka - odběry z haly 24 1 0,1 0,01 0,001 0,0001 0,00001 14.5.

30.7.

12.1.

Časová období odběru vzorků Bacteroidales Clostridiales Lactobacillales

Bifidobacteriales Enterobacteriales

Graf 4: Odběry z haly 24 (kloaka). Z grafu 4 vyplývá, ţe v odběrech z kloaky u pozorovaných nosnic v hale č. 24 jsou nejpočetnější Lactobacillales a enterobakterie, druhá jmenovaná skupina však v průběhu sledovaného časového období výrazně klesá, zatímco skupina Lactobacillales stoupá. Asi 10x-100x méně neţ Lactobacillales je klostridií, jejichţ četnost se v pozorovaném čase nemění. Zástupci skupiny Bacteroidales a bifidobakterie byly v případě nosnic z haly 24 pozorovány nejméně často, s přibliţně 100x menší četností neţ skupina Lactobacillales, mnoţství skupiny Bacteroidales však s časem výrazně stoupá a v druhém a třetím odběru tvoří druhou nejpočetnější skupinu.

- 37 -

8. Diskuze Předmětem mé bakalářské práce bylo stanovit relativní zastoupení vybraných zástupců střevní mikroflóry analýzou bakteriální DNA izolované ze střevního obsahu slepic a sledovat změny v jejich počtu během určitých období ţivota slepic. Experiment byl prováděn během celého chovného období nosnic. V rámci této práce jsem v praktické části pracovala se 36 vzorky bakteriální DNA, které jsem izolovala ze střevního obsahu, jenţ byl odebrán v určitých časových intervalech, a to před snůškou v 8. týdnu ţivota, na vrcholu snůšky v 19. týdnu ţivota a na konci snůšky v 43. týdnu ţivota. V kaţdém časovém období byly odebírány vzorky vţdy od 6 slepic, a to od 3 zvířat z pozorované chovné haly 23 a od 3 zvířat z pozorované chovné haly 24. Odběry se prováděly z céka a z kloaky. V prvním kroku praktické části jsem izolovala celkovou bakteriální DNA ze vzorků obsahu céka a kloaky, následně jsem určila její koncentraci a čistotu. Mezi výslednými koncentracemi bakteriální DNA jsou i některé hodnoty výrazně se lišící od průměrného rozpětí koncentrací. Niţší výtěţnosti v izolaci DNA je zpravidla dosahováno v případě vzorků z kloaky, coţ můţe být vysvětleno přítomností látek z vnějšího prostředí, zbytků potravy či různými inhibičními látkami, které přispívají k degradaci izolované DNA. Bakteriální DNA získaná ze vzorků střevního obsahu byla vyuţita pro detekci vybraných bakteriálních skupin, o kterých je známo, ţe se vyskytují v trávicím traktu drůbeţe. Pro stanovení a relativní kvantifikaci vybraných skupin bakterií jsem pouţila metodu Realtime PCR. Tato metoda umoţňuje odlišit jak rozdílné zastoupení střevní mikroflóry, tak sledovat jejich četnost. V této práci jsem pomocí Real-time PCR analyzovala celkem šest typických bakteriálních

řádů,

a

to

řády

Bacteroidales,

Bifidobacteriales,

Clostridiales,

Enterobacteriales, Lactobacillales a Verrucomicrobiales. Na jedné destičce určené pro Realtime PCR jsem nanesla vţdy dvanáct neředěných vzorků izolované DNA v duplikátech. Výsledky porovnání hodnot u duplikátů mi slouţily jako kontroly pipetování. Samotná analýza probíhala v přístroji LightCycler® s předdefinovaným programem. Program byl nastaven na 45 cyklů a po jeho skončení jsem získala hodnoty CT jednotlivých variant genů pro 16S rRNA, specifických pro jednotlivé sledované skupiny bakterií. Získané hodnoty CT jsem následně porovnala s hodnotami CT referenčního genu pro 16S rRNA amplifikovaného pomocí univerzálních primerů. Hodnoty CT získané po analýze

- 38 -

pomocí Real-time PCR jsem přepočítala podle vzorce 2CT 16S - CT GOI a výsledné hodnoty byly vyneseny do grafů. Provedená Real-time PCR analýza ukázala změny v relativní četnosti bakteriálních populací obývající střevní trakt v závislosti na místě odběru (cékum nebo kloaka, hala 23 nebo 24) a na vybraném časovém období. Při porovnání zastoupení pozorovaných skupin bakterií v céku a kloace u nosnic z haly č. 23 (viz. graf 1 a 2) lze pozorovat, ţe vysoké relativní zastoupení má skupina Lactobacillales, která je nejčastější skupinou bakterií v kloace a druhou nejčastější skupinou bakterií v céku. Mnoţství laktobacilů se ve sledovaném období významně neliší a jejich zastoupení má v čase stejný průběh. Nejvíce četnou skupinou bakterií v případě odběrů z céka je skupina Bacteroidales, která je překvapivě 1000x méně početná u vzorků z kloaky, kde naopak tvoří jednu z nejméně četných skupin. Jejich relativní mnoţství je během všech tří sledovaných období u céka i kloaky obdobné. Klostridie mají velmi podobné relativní zastoupení i průběh, jak v případě z odběrů z céka, tak z kloaky, a jejich relativní mnoţství v pozorovaném období v obou případech klesá. Bifidobakterií bylo v případě prvního odběrů pozorováno přibliţně 10x méně u kloaky neţ v případě odběrů z céka, v pozdějších časech je jejich mnoţství v céku i kloace vyrovnané. U skupiny enterobakterií byla četnost z odběrů z céka přibliţně 10x menší neţ z odběrů z kloaky a jejich mnoţství během časových odběrů má v případě céka a kloaky obdobný průběh. Zastoupení pozorovaných skupin bakterií v céku a kloace u nosnic z haly č. 24 (viz. graf 3 a 4) má obdobný charakter jako u nosnic z haly 23. Z grafů vyplývá, ţe vysokou četnost má opět skupina Lactobacillales, která je nejčastější skupinou bakterií v kloace a druhou nejčastější skupinou bakterií v céku, kde je přítomna s 10x-100x menší četností. Nejvíce četnou skupinou bakterií v případě odběrů z céka je opět skupina Bacteroidales. Přítomnost těchto bakterií je přibliţně 100x méně četná u vzorků z kloaky. Třetí nejpočetnější skupinou v céku a čtvrtou v kloace jsou klostridie, jejichţ mnoţství v průběhu pozorovaného období se opět výrazně neliší. Bifidobakterie byly v případě odběrů z céka pozorovány se stejnou četností a průběhem jako klostridie, v případě odběrů z kloaky tvořily nejméně častou skupinu. Enterobakterie se v céku vyskytovaly s nejmenší četností a jejich průběh s časem výrazně klesal. Ve vzorcích s kloaky se však tato skupina bakterií vyskytovala s přibliţně 100x vyšší četností.

- 39 -

Při porovnání skupin bakterií u nosnic mezi různými halami (č. 23 a 24) a tedy odlišným lokálním prostředím není v případě céka pozorován ţádný významný rozdíl vyjma mnoţství enterobakterií, které je v prvním sběrném období vyšší u nosnic z haly č. 24. V případě kloaky také není znát velký vliv prostředí na sloţení střevní mikroflóry. Výjimku tvoří skupina Clostridiales, jejíţ průběh je během časových sběrů odlišný, a skupina Bacteroidales, která se vykytuje s přibliţně 10x-100x větší četností u nosnic z haly 24. Obecně lze shrnout, ţe vliv vnějšího prostředí (hala č. 23 a č. 24) při zachování stejných chovných podmínek (výţiva, druh krmiva) má na sloţení střevní mikroflóry pouze zanedbatelný vliv, i kdyţ drobné rozdíly mezi jednotlivými individuálními nosnicemi byly pozorovány. Naopak, sloţení střevní mikroflóry se významně liší v různých částech trávicího ústrojí. Příčinou těchto odlišností jsou změny v pH, dostupnosti ţivin a především obsahu kyslíku, které se v různých místech trávicího ústrojí liší (O´Hara a Shanahan, 2006). Ve striktně anaerobním prostředí, které se nachází v céku, převaţují výlučně anaerobní mikroorganismy, jako jsou Bacteroides, klostridie a bifidobakterie (Barnes a kol., 1972; Mead a Adams, 1975; Salanitro a kol, 1975). V souladu s tímto faktem jsem ve vzorcích cekálního obsahu detekovala nejčastěji zástupce řádu Bacteroidales. Klostridie a bifidobakterie byly rovněţ v cekálním obsahu zastoupeny, avšak s menší četností neţ bylo očekáváno. Naopak zástupci řádu Lactobacillales byly zaznamenány s relativně vyšší četností, která dokonce převýšila anaerobní klostridie a bifidobakterie. Ačkoli v literatuře není známo sloţení mikroflóry obývající spodní části trávicího traktu, jako je kloaka u drůbeţe, lze předpokládat, ţe tyto oddíly trávicí trubice budou osidlovány odlišnou bakteriální mikroflórou. Je však známo, ţe v tenkém střevě většina mikrobiálního ekosystému náleţí laktobacilům, enterokokům a enterobakteriím, tedy fakultativně anaerobním mikroorganismům (Barnes a kol., 1972; Mead a Adams, 1975; Salanitro a kol., 1975). V souladu s tímto tvrzením jsem ve vzorcích z kloaky nejčastěji detekovala laktobacily a relativně často také enterobakterie.

- 40 -

9. Souhrn Obsahem této bakalářské práce bylo na základě informací získaných vypracováním literární rešerše analyzovat sloţení střevní mikroflóry drůbeţe z bakteriální DNA izolované ze střevního obsahu chovných slepic. Ke srovnání změn výskytu vybraných zástupců bakteriálních skupin (řádu Bacteroidales, Bifidobacteriales, Clostridiales, Enterobacteriales a Lactobacillales) slouţila metoda Real-time PCR. Z dosaţených výsledků vyplývají následující závěry: 1) Nejpočetnější skupinou z odběrů z céka jsou zástupci Bacteroidales. Ve větší míře byl také detekován výskyt Lactobacillales. Oproti tomu klostridií a bifidobakterií je ve vzorcích méně, a jsou s velmi podobnou četností. 2.) Z odběrů z kloaky má nejvyšší relativní zastoupení skupina Lactobacillales. Další početnou skupinou jsou enterobakterie. Zastoupení bifidobakterií je ve vzorcích z kloaky velmi nízké. 3) V průběhu pozorovaného časového období bylo moţno sledovat úbytek klostridií a bifidobakterií, v případě haly 24 i enterobakterií. Relativní mnoţství nejpočetnějších skupin (Lactobacillales a Bacteroidales) zůstalo téměř neměnné nebo skupiny vykazovaly slabý vzestup.

- 41 -

10. Summary Based on the knowledge gathered during the writing of a literature review (theoretical part), this thesis was aimed to determine the intestinal microbiota content by the analysis of bacterial DNA isolated from intestinal content of rearing hens. For the comparison of the changes in the representatives of bacterial groups (orders Bacteroidales, Bifidobacteriales, Clostridiales, Enterobacteriaceae and Lactobacillales) Real-time PCR have been used. The results obtained should be concluded as follows: 1) The most numerous bacterial groups in chicken cecum are representatives of Bacteroidales. Also Lactobacillales have been detected in greater amounts. On the contrary, Clostridiales and Bifidobacteriales were detected in fewer amounts, and they reached very similar counts. 2) In cloaca, the strains of the Lactobacillales order reached the highest abundance. The members of the Enterobacteriales were also numerous. However, the amount of Bifidobacteriales is very low in the samples of cloaca. 3) During the observed time period, a considerable decrease of Clostridiales and Bifidobacteriales has been observed, in case of the hall no. 24 also Enterobacteriales decreased. The relative amounts of the most numerous groups of bacteria (Lactobacillales and Bacteroidales) remained either unchanged or slightly increased during whole experiment.

- 42 -

11. Seznam použité literatury Barnes E.M., Mead G.C., Barnum D.A., Harry E.G. 1972. The intestinal flora of the chicken in the period 2 to 6 weeks of age, with particular reference to the anaerobic bacteria. Br. Poult. Sci. 13:311-326. Bhunia A.K. 2008. Food microbial pathogens: Mechanisms and pathogenesis. Springer. 183-200. ISBN 978-0-387-74536-7.

Buenau R., Jeakel L., Shubotz E., Schwarz S., Stroff T., Krueger M. 2005. Escherichia coli Strain Nissle 1917: Significant Reduction of Neonatal Calf Diarrhea. J. Dairy Sci. 88: 317-323I.

Derrien et al. 2004, Ecburg et al. 2005. Akkermansia muciniphila gen. nov., a human intestinal mucin-degrading bakterium. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 54: 1469-1476. Hedlund B.P., Gosink, J.J., Staley J.T. 1997. Verrucomicrobia div. nov., a new division of the Bacteria containing three new species of Prosthecobacter. Antonie Leeuwenhoek. 72, 29±38. Lane D.J., Pace B., Olsen G.J., Stahl D.A., Sogin M.L., Pace N.R. 1985. Rapid determination of 16S ribosomal RNA sequences for phylogenetic analyses. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82(20): 6955-9. Lupp C., Finlay B.B. 2005. Intestinal microflora. Curr. Biol. 15(7): R235-6. Mead, G.C., Adams B.W. 1975. Some observations on the caecal microflora of the chick during the first two weeks of life. Br. Poult. Sci. 16:169-176.

- 43 -

Muyzer G., de Waal E.C., Uitterlinden G.A. 1993. Profilig of compex populations by denaturating gradient gel electrophoresis analysis of polymerace Chin reaction-amlified genes coding for 16S rRNA. Appl. Environ. Microbiol. 59: 697-700. Němec M. 2. vydání Brno 1993. Základy mikrobiologie. ISBN 80-210-0817-2. Norin, E., Jernberg, C., Nilsson, H., Engstrand L. 2009. Studies of the intestinal microflora by traditional, functional and molecular techniques. Lactobacillus Molecular Biology: From genomics to probiotics. Caister Academic press, Nortfolk.. 83-92. O´Hara A.M., Shanahan F. 2006. The gut flora as a forgotten organ. EMBO Rep. 7(7): 688-93. Rosypal S. 2006. Úvod do molekulární biologie. ISBN-10: 80-902562-5-2. Salanitro J.P., Blake I.G., Muirhead P.A., Maglio M., Goodman J.R. 1975. Bacterial Isolated from the Deudeum, Ileum and Cecum of Young Chicks. Amer.Sci for Mikrob. 782-790. Scharlau D., Borowicki A., Habermann N., Hofmann T., Klenow S., Miene C., Munjal U., Stein K., Glei M. 2009. Mechanisms of primary cancer prevention by butyrate and other products formed during gut flora-mediated fermentation of dietary fibre. Mutat. Res.-Rev Mutat. Res. 682: 39-53. Suau A., Bonnet R., Sutren M., Godon J.J., Gibson G.R., Collins M.D., Dore J. 1999. Direct analysis of genes encoding 16S rRNA from complex communities reveals many novel molecular species within the human gut. App.l Environ. Microbiol. 65. 4799–4807. Sullivan Å., Norn C.E. 2005. Probiotics and gastrointestinal diseases. J. Int. Med. 257. 78–92. - 44 -

Šišák F., Havlíčková H. 2007. Analýza rizik šíření salmonel v chovech nosnic a jejich přenosu na konzumní vejce. Vědecký výbor veterinární. Van de Peer Y., Neefs J.M., de Rijk P., de Wachter R. 1993. Evolution of Eukaryotes as deduced from small ribosomal subunit RNA sequences. Biochem. Syst. Ecol. 21: 43-55. Velge P., Cloackaert A., Barrow P. 2005. Emergence of Salmonella epidemics: The problems related to Salmonella enterica serotype Enteritidis and multiple antibiotic resistance in other major serotypes. Vet. Res. 36: 267-288. Votava M. 2001. Lékařská mikrobiologie obecná. ISBN 80-902896-2-2. Votava M. a kol. 2005. Lékařská mikrobiologie speciální. ISBN 80-902896-6-5. Wagner M., Horn M. 2006. The Planctomycetes, Verrucomicrobia, Chlamydiae and sister phyla comprise a superphylum with biotechnological and medical relevance. Curr. Opin. Biotechnol. 17: 241-249. Wikipedie Wollowski I., Rechkemmer G., Pool-Zobel. 2001. Protective role of probiotics in colon cancer. Am. J. Clin. Nutr. 2001. 73: 451S–455S. Yegani M., Korvet D. 2008. Factors affecting intestinal health in poultry. Poult. Sci. 87(10): 2052-63. Zbořil V., Prokopová L., Hertlová M. 2005. Mikroflóra trávicího traktu- klinické souvislosti. Grada Publishing, Praha. 153 p. - 45 -

- 46 -