Masarykova univerzita Přírodovědecká fakulta
Diplomová práce
2008
Bc. Aneta Šedrlová
Masarykova univerzita Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie Oddělení fyziologie a imunologie živočichů
Hmyzí biopesticidy Diplomová práce
Autor: Bc. Aneta Šedrlová Vedoucí práce: RNDr. Pavel Hyršl, Ph.D.
Prohlašuji, že jsem pracovala samostatně na základě pokynů a rad vedoucího DP, s využitím zázemí pracoviště a laboratoře a veškeré použité zdroje informací jsou v práci řádně citovány. Obrazové materiály (fotografie) použité v experimentální části, které jsem zhotovila, jsou uvedeny bez citací.
Ráda bych poděkovala vedoucímu DP RNDr. P. Hyršlovi, Ph. D. za ochotnou pomoc a přátelskou radu při zpracování této práce. Dále Mgr. Vladimíru Půžovi a RNDr. Zdeňku Mráčkovi, DrCs z AVČR, v.v.i. v Českých Budějovicích za ochotnou spolupráci při determinaci entomopatogenních hlístovek a všem kolegům, kteří mi ochotně poskytli vzorky půdy.
Obsah 1. SOUHRN ........................................................................................................................................................... 6 2. ABSTRACT....................................................................................................................................................... 7 3. ÚVOD................................................................................................................................................................. 8 4. CÍL PRÁCE..................................................................................................................................................... 10 5. BIOLOGICKÁ KONTROLA........................................................................................................................ 11 5.1. VÝHODY BIOLOGICKÉ KONTROLY PRO SPOTŘEBITELE:............................................................................... 12 5.2. DRUHY BIOLOGICKÉ OCHRANY .................................................................................................................. 13 5.2.1. Klasická biologická ochrana ............................................................................................................. 13 5.2.2. Augmentativní biologická ochrana.................................................................................................... 14 5.3. HISTORIE BIOLOGICKÉ OCHRANY ............................................................................................................... 15 5.4. INTEGROVANÁ OCHRANA PROTI ŠKŮDCŮM ................................................................................................ 16 5.4.1. Co je IPM? (Integrated Pest Management)....................................................................................... 16 5.4.2. Proč potřebujeme IPM? ................................................................................................................... 17 5.5. CHYBY A NEDOROZUMNĚNÍ O BIOLOGICKÉ OCHRANĚ ................................................................................ 18 5.6. HMYZÍ REZISTENCE A JEJÍ MANAGEMENT ................................................................................................... 20 5.7. HOSTITELSKÁ SPECIFICITA BIOINSEKTICIDŮ KE ŠKŮDCŮM ......................................................................... 22 6. PŘEHLED HMYZÍCH BIOPESTICIDŮ..................................................................................................... 23 6.1. ÚVOD ......................................................................................................................................................... 23 6.2. ENTOMOPATOGENNÍ VIRY .......................................................................................................................... 25 6.2.1. Cíloví škůdci ...................................................................................................................................... 26 6.2.2. Mechanismus působení...................................................................................................................... 26 6.2.3. Symptomy........................................................................................................................................... 26 6.2.4. Relativní účinnost .............................................................................................................................. 27 6.3. ENTOMOPATOGENNÍ BAKTERIE .................................................................................................................. 31 6.3.1. Cíloví škůdci ...................................................................................................................................... 31 6.3.2. Mechanismus působení...................................................................................................................... 32 6.3.3. Symptomy........................................................................................................................................... 33 6.3.4. Relativní účinnost .............................................................................................................................. 33 6.3.5. Bacillus popilliae a Bacillus lentimorbus.......................................................................................... 34 6.3.6. Používání Bt insekticidů .................................................................................................................... 36 6.4. ENTOMOPATOGENNÍ HOUBY....................................................................................................................... 37 6.4.1. Cíloví škůdci ...................................................................................................................................... 38 6.4.2. Mechanismus působení...................................................................................................................... 38 6.4.3. Symptomy........................................................................................................................................... 39 6.4.4. Relativní účinnost .............................................................................................................................. 39 6.4.5. Charakteristické rysy některých druhů .............................................................................................. 41 6.5. ENTOMOPATOGENNÍ HLÍSTOVKY (EPN)..................................................................................................... 44 6.5.1. Cíloví škůdci ...................................................................................................................................... 45 6.5.2. Životní cyklus a mechanismus účinku................................................................................................ 45 6.5.3. Relativní účinnost .............................................................................................................................. 47
4
6.5.4. Charakteristické rysy jednotlivých druhů .......................................................................................... 48 6.5.5. Citlivost na pesticidy ......................................................................................................................... 49 6.6. PRVOCI A MICROSPORIDIA ......................................................................................................................... 50 6.6.1. Mechanismus působení...................................................................................................................... 50 6.6.2. Symptomy........................................................................................................................................... 50 6.6.3. Charakteristické rysy jednotlivých druhů .......................................................................................... 50 6.7. KOMBINOVANÉ ALTERNATIVNÍ PROSTŘEDKY............................................................................................. 51 7. FIRMY A JEJICH PRODUKTY NA DNEŠNÍM TRHU ........................................................................... 52 7.1. ÚVOD ......................................................................................................................................................... 52 7.2. ANDERMATT BIOCONTROL AG.............................................................................................................. 54 7.3. E-NEMA ...................................................................................................................................................... 55 7.3.1. Okrasné a užitkové rostliny na poli ................................................................................................... 55 7.3.2. Okrasné a užitkové rostliny ve sklenících .......................................................................................... 55 7.3.3. Houbová kultivace ............................................................................................................................. 56 7.4. BECKER UNDERWOOD ................................................................................................................................ 57 7.5. KOPPERT .................................................................................................................................................... 58 8. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST:......................................................................................................................... 60 8.1. ÚVOD ......................................................................................................................................................... 61 8.2. MATERIÁL A METODY ................................................................................................................................ 62 8.2.1. Živočišný materiál ............................................................................................................................. 62 8.2.2. Stručná charakteristika...................................................................................................................... 62 8.2.3. Význam EPN...................................................................................................................................... 62 8.2.4. Způsob nákazy ................................................................................................................................... 63 8.2.5. Odběry půdních vzorků...................................................................................................................... 65 8.2.6. Laboratorní zpracování..................................................................................................................... 66 8.2.7. Determinace invazních larev ............................................................................................................. 67 9. VYHODNOCENÍ............................................................................................................................................ 68 9.1. DISKUSE A ZÁVĚR ...................................................................................................................................... 70 10. FOTODOKUMENTACE K EXPERIMENTÁLNÍ ČÁSTI ...................................................................... 74 11. ZÁVĚR PRÁCE............................................................................................................................................ 84 12. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY A ELEKTRONICKÝCH ZDROJŮ ............................................ 85
5
1. Souhrn Hmyzí biopesticidy jsou velmi aktuální a komerční záležitostí v oblasti ochrany plodin proti hmyzím škůdcům na celém světě. Mezi hmyzí insekticidy zahrnujeme biologické kontrolní činitele jako jsou např. entomopatogenní bakterie (Bacillus thuringiensis), viry (polyhedroviry, bakuloviry), houby (Bauwessia spp., Metarhysium spp.), entomopatogenní hlístovky (Steinernematidae, Heterorhabditidae) a prvoky (Microsporidia, Nosema locustae). Biologické insekticidy jsou výjimečné některými svými vlastnostmi, kterými nezatěžují životní prostředí, ve srovnání s chemickými dosud hojně používanými preparáty, protože se v prostředí vyskytují přirozeně. Mezi výhody spojené s jejich používáním patří: jsou šetrné k životnímu prostředí (nezanechávají rezidua jako chemické insekticidy), jsou bezpečné k necílovým organismům a pro člověka, jejich aplikace je jednoduchá, cena je srovnatelná s chemickými preparáty, jsou v prostředí stálé a nezpůsobují rezistenci škůdců. Velkého významu nabyly výjimečným mechanismem účinku, který je pro každou kategorii bioinsekticidů odlišný. Entomopatogenní bakterie a viry produkují po proniknutí do hostitele toxiny, které způsobují septicaemii. Entomopatogenní houby produkují spory, které klíčí a prorůstají tělem hostitele, čímž ho usmrtí a entomopatogenní hlístovky společně se svými symbiotickými bakteriemi (Xenorhabdus, Photorhabdus) rozkládají vnitřnosti hostitele a množí se v něm. Význam hmyzích biopesticidů je obrovský, ale jejich využívání v praxi potřebuje ještě některá zdokonalení. Důležité je získat si také důvěru spotřebitelů a pěstitelů, aby stále více docházelo k omezování používání jedovatých chemických preparátů. Na teoretickou část navazuje část experimentální, ve které jsem si vyzkoušela metodiku izolace entomopatogenních hlístovek z náhodně odebraných vzorků půdy.
6
2. Abstract Biopesticides are very actual and commercial matter in save area products against insect pest in the whole world. Among insecticides include biological control agent's as are e.g. entomopathogenic bacteria (Bacillus thuringiensis), viruses (polyhedroviruses, baculoviruses), fungi (Bauwessia spp., Metarhysium spp.), entomopathogenic nematodes (Steinernematidae, Heterorhabditidae) and protozoans (Microsporidia, Nosema locustae). Biological insecticides are rare some by features that the no burden environment, in comparison with chemical preparations till this time plentifully used, because it occur in environment naturally. Among benefits pair with their using belongs to: they are thrifty to environment (don't leave residue like chemical insecticides), be safe to non targed organisms and to humans, their application is simple, price is comparable with chemical preparations, they are in environment stable and don't cause resistance of insect. Big importance obtain rare
mechanism
effect,
that
is
for
any
caregory
of
bioinsecticides
different.
Entomopathogenic bacteria and viruses produce toxins after penetration into host, that the induce septicaemia. Entomopathogenic fungi produce spats that the conidias and intergrow body host, whereby kills him and entomopathogenic nematodes together with symbiotic bacteria (Xenorhabdus, Photorhabdus) gesticulate guts host and multiply there. Meaning of biobiocides is enormous, but their exploitation practically needs yet some improvement. Important is also gain confidence consumers and growers, to more and more happened to restraint using poisonous chemical preparations. On theoretic part tie together experimental part, in which I auditioned methods of isolation entomopathogenic nematodes from accidentally sample soil.
7
3. Úvod Bezpečnostní zájmy o zdraví veřejnosti a o dopadu chemických pesticidů na životní prostředí vedly k uznání biologického boje jako přirozeného přístupu k udržení zdravotní nezávadnosti plodin. Navzdory těmto bezpečnostním zájmům a velkému výzkumnému úsilí o komercializaci biokontroly byl vývoj velmi pomalý. Hybnost chemického průmyslu je obtížné změnit a fermentační procesy pro výrobu biopesticidů jsou dražší než syntetické chemické procesy. Nicméně existuje požadavek na produkty biologické kontroly, zvláště ve specializovaných oblastech zemědělského trhu, kde neexistuje žádný chemický konkurent. Nicméně, tato poptávka na trhu postrádá základní metody úsporné (ekonomické) velkovýroby a aplikace biologických regulačních médií. Komerční biopesticidy musí být ekonomicky produktivní, mít trvalou stabilitu při skladování, musí mít adekvátní trvanlivost při polní aplikaci, musí být snadno ovladatelné, musí se snadno namíchat, použít a poskytnout konzistentně efektivní kontrolu nad cílovým škůdcem nebo skupinami škodlivého hmyzu. Koneční cíl výzkumu a vývoje prostředků biologické kontroly
je dosažení biotechnologií potřebných k produkci biologických
prostředků, které budou efektivně konkurovat chemikáliím. Prozatím je tržní úspěch nejpravděpodobnější v případě kdy je biologický prostředek vyvinutý pro boj proti problémovým škůdcům, který neměl žádné řešení pomocí chemických pesticidů nebo v situacích, kde je aplikace pesticidů zakázaná. Úspěšná komercializace záleží na výsledku výzkumného procesu a je často omezená nedostatkem znalostí a zkušeností s produkcí prostředku biologické kontroly a formulací technik. Ve výzkumné fázi jsou první kroky vedeny k extrakci a identifikaci mikroorganismů, které jsou hospodářsky vyprodukovatelné, ty, kteří agresivně potlačují cílové populace škůdců a ty co nepoškozují plodiny nebo necílové organismy. V dalších krocích musí být vyvinuty mikrobiální kultivace a formulace techniky tak, aby minimalizovaly cenu produktu a maximalizovaly výnos a kvalitu. Faktory kvality zahrnují účinnost kontroly škodlivého hmyzu, stabilitu při sušení a skladování, hostitelskou kompatibilitu a adekvátní trvalost při aplikaci na pole. Jakmile jsou technologie ve fázi ekonomicky efektivní produkce mikrobiálních hubících prostředků, pak následují finální kroky jako je aplikace a registrace. A poté již můžeme sledovat povolení prodeje nového mikrobiálního hubícího prostředku. Budoucnost mikrobiálních biologických regulačních médií je jasně závislá na technologickém vzestupu a tržních příležitostech. Komerční zájem a přijetí uživatelů 8
biologických kontrolních médií jako nástroje pro kontrolu škůdců jsou závislé na vývoji levných, stabilních produktů, které poskytnou shodnou účinnost. Řešení klíčových technických problémů a implementace optimalizačních a návrhových strategií budou vyžadovat výzkumné
příspěvky různorodých
disciplín
včetně rostlinné
patologie,
fytopatologie, entomologie, hmyzí patologie, mikrobiologie, biochemického inženýrství a biochemie. Biologická kontrola byla jako jedna z metod „pest managementu“ zařazena do systémových metod působících proti prevenci a redukci škůdců, nemocí a plevelů. Rolníci před každoročním sázení plodin promýšlí jaké plodiny a kam vysází a pro ochranu těchto plodin volí často tři základní formy kontroly škůdců: střídání plodin, sadbu plodin vůči škůdcům rezistentních a biologickou kontrolu. Po roce 1945 byly všechny tyto tři typy základní kontroly zahrnuty do chemické kontroly, která byla v té době na svém vrcholu. Následkem toho došlo ke značné redukci experimentálního vývoje biologické kontroly a k úplné změně myšlení o prevenci škůdců v zemědělství. Dále nebyly rostliny vybírány podle odolnosti, ale podle masové produkce nebo podle okrasných vlastností a jejich kontrola tedy probíhala pouze pomocí pesticidů. To celosvětově vedlo k vytvoření rostlin, které nebyly schopné se ujmout bez pravidelné aplikace pesticidů a vznikaly tak agro-systémů s velmi zdevastovanými populacemi přirozeně se vyskytujících nepřátel. Abychom se jakoby vrátili do doby před používáním chemických pesticidů, kdy se přirozeně vyskytovali nepřátelé škůdců a kdy se pěstovaly rostliny s vyšší odolností vůči hmyzu a to bez podpory růstu chemickými pesticidy, potřebujeme značně investovat do vývoje nových kultivarů s rezistencí nebo odolností vůči škůdcům a nemocem. Podobně jako to udělali v jiných zemích. Aplikace těchto nových systémových metod není zcela jednoduchá pokud se jedná o pozemek, na kterém již dříve byla použitá jakákoli forma chemické kontroly. Není možné prostě vyměnit jeden hubící prostředek za jiný alternativní prostředek. Cílem je vytvořit systém, který je jednoznačně odolný vůči škůdcům, a proto není možné dále používat jiné konvenční metody kontroly. V zemědělských systémech pak může být minimalizováno znečištění životního prostředí jako je znečištění půdy a vody. Zároveň bude mít integrované zemědělství vliv na různé dopady ekosystémů (ochrana flóry a fauny, kvalitu a diverzitu krajiny a udržování energií a neobnovitelných zdrojů) stejně jako sociální ohledy (zaměstnání, veřejné zdraví) na rozdíl od současného zemědělství (Vereijken et al., 1986; Wijnands & Kroonen-Backbier, 1993). 9
4. Cíl práce Cílem této Diplomové práce je zpracování literární rešerše na zadané téma: Hmyzí bioinsekticidy. Zmínit některé problémy, které jsou spojené s používáním biopesticidů a přispět k lepší informovanosti veřejnosti v oblasti použití biologických alternativních metod, prosazovat výhody spojené s jejich použitím, pomoci lépe pochopit, jak tyto bioinsekticidy pracují a proti kterým škůdcům je vhodné je použít a seznámit se současnou nabídkou produktů, obsahujících mikrobiální činitele, na trhu. Základní rozdělení je na dvě části: teoretickou část poskytující souhrn informací o hmyzích bioinsekticidech a praktickou část, ve které jsem si vyzkoušela metodiku izolace entomopatogenních hlístovek z půdních vzorků. Teoretická část : je složena z kapitol pojednávajících o jednotlivých skupinách biopesticidů – viry, bakterie, houby, entomopatogenní hlístovky (EPN) aj.- součástí je stručný přehled firem a jejich produktů, obsahujících tyto insekticidní činitele, na trhu. Praktická část: Vyzkoušela jsem metodiku izolace EPN z půdních vzorků sebraných z různých lokalit ČR. Jako
hostitelský
organismus
byly
použity
larvy
Galleria
mellonella,které byly po infekci EPN umístěny dále z tzv. galleriové pasti na tzv. vodní past, kde došlo k uvolnění izolovaných infekčních juvenilních stadií (IJ). Jejich druhová determinace byla prováděna ve spolupráci s Etomologickým ústavem AVČR, v.v.i.
10
5. Biologická kontrola
Použití určitého druhu organismu k redukci hustoty populace jiného cílového organismu, je nejúspěšnější, cenově nejpříznivější a environmentálně nejbezpečnější způsob likvidace škodlivého hmyzu. Je to nejpřirozenější způsob jak udržet množství škodlivých organismů na co nejnižší úrovni. Určitá forma biologické kontroly je přítomná ve všech ekosystémech, přirozených i uměle vytvořených, a je vždy aktivní. Přirozená biologická kontrola snižující hustotu populací škodlivých organismů byla přítomna již u evolučně prvních ekosystémů (asi před 500mil. let se uskutečňovala bez jakýchkoli zásahů člověka). K přirozeným formám biologické kontroly člověk přispěl až kolem roku 300, tím, že použil dravé mravence (Arthropoda) pro kontrolu nad škodlivým hmyzem citrusů. K rozsáhlému využívání biologické kontroly došlo kolem roku 1888 a to použitím rodu Rodolia, Slunéčkovití (Coccinellidae, Coleoptera) pro kontrolu červců škodících opět na citrusech. Využití biologické kontroly přináší velké finanční zisky, díky tomu, že biologická ochrana je perzistentní na rozdíl od chemických preparátů, kde se může vyvinout rezistence hmyzu vůči těmto chemickým látkám. S ohledem na fakta blízké budoucnosti: 1. Země bude v blízké budoucnosti živit asi 11 miliard lidí, 2. dojde k vyčerpání fosilních zdrojů a 3. další používání tradičních syntetických pesticidů povede ke znečištění okolního prostředí. Již z těchto důvodů není dále možné stejným způsobem, jak tomu bylo v uplynulých 100 letech, znečišťovat životní prostředí a tím i redukovat přirozenou biodiverzitu. A je tedy nutné přesměrovat další výzkum kontroly na jiné systémové metody. Již z těchto důvodů se téma biologické kontroly stane hlavním a ne okrajovou záležitostí jak tomu bylo posledních 60. letech. Moderní „pest management“ bude naprosto závislý na použití vhodné biologické kontroly, protože je nejtrvalejší, nejlevnější a nejbezpečnější metodou pro životní prostředí. Dále má důležité výhody pro spotřebitele. Předpokládá se, že biologická kontrola bude kolem roku 2050 tvořit 35 – 40% metod ochrany plodin. Definice škůdce: (podle Mezinárodního biologického programu) •
Biologický škůdce – je organismus (rostlina, živočich nebo prvok) vyskytující se v takových množstvích, která způsobují poškození plodin.
11
Fakta: •
Biologická ochrana je stálá ve všech světových ekosystémech a to na 55,5 miliardách hektarů.
•
Většina potenciálních hmyzích škůdců (95%, což činní 100 000 druhů členovců) jsou dnes již ošetřeny metodami biokontroly.
•
Klasické metody biokontroly jsou již aplikovány na 350 milionech hektarů, což činní 10% plochy Země, která je osázená plodinami. A poskytuje velmi vysoké procento ušetřených financí oproti použití chemické varianty.
5.1. Výhody biologické kontroly pro spotřebitele: Proč spotřebitelé využívají biologickou kontrolu? •
Nulové vystavení spotřebitelů škodlivým účinkům chemických pesticidů.
•
Žádná rezidua produktů v prostředí.
•
Žádný fytotoxický účinek na mladé sazenice, a žádný předčasný úhyn rostlin nebo plodů ovoce. Díky aplikaci biologické kontroly dochází často ke zvýšení výnosu.
•
Likvidace škůdců ve vlhkých a teplých sklenících je mnohem rychlejší. Použití biologických postřiků ve skleníku je bezpečnější než aplikace chemických látek.
•
Biologická kontrola je spolehlivá po dobu několika měsíců a jsou nutné pouze občasné kontroly případného nového výskytu škůdců, kdežto chemická kontrola vyžaduje permanentní kontroly.
•
Chemická kontrola některých druhů škůdců polních plodin je obtížná nebo nemožná, protože se vytváří rezistence škůdců na chemickou látku.
•
U biologické kontroly není nutná bezpečnostní perioda mezi aplikací a sklizní plodin, proto je sklizeň možná kdykoli je vhodná pro pěstitele.
•
Biologická ochrana je permanentní.
•
Biologická kontrola je hodnocena širokou veřejností a to z důvodů rychlejšího prodeje úrody vyprodukované pod biologickou ochranou a nižší cenou plodin na trhu (ušetření za chemické pesticidy).
12
Výrobci dále dodávají další důležité výhody: • Nízké riziko zamoření potravin, vody a životního prostředí chemikáliemi. • Příspěvek k vhodné produkci potravin. • Příspěvek k ochraně nebo dokonce zlepšení biologické diverzity. • Žádná rezidua pesticidů v potravě.
5.2. Druhy biologické ochrany Z různých zdrojů je možné najít mnoho definic druhů biologické ochrany. Rozlišujeme: - klasickou biologickou ochranu. - augmentativní biologickou ochranu.
5.2.1. Klasická biologická ochrana Klasická biologická ochrana používá přirozených nepřátel, kdy obvykle oba škůdce i přirozený nepřítel pochází z nepůvodních zemí. Klasická biologická ochrana může často být sumarizována tímto způsobem: 1. Jakmile škodlivý organismus napadne novou oblast, bude jeho populace růst do té doby než obsadí všechny zdroje škůdců. 2. Jakmile jsou uvolněni přirození nepřátelé, trvá asi 10 – 15 generací než začne docházet k redukci populací škůdců. 3. Populace škůdců jsou poté redukovány na velmi nízké úrovně, obvykle o 4 – 8 řádů nižší než před uvolněním nepřítele. Úroveň této kontroly zatím nebyla jinou metodou překonána. 4. Kontrola je permanentní, škůdce i nepřítel stále společně přežívají ve velmi nízkých hustotách, aniž by došlo k jejich vymizení nebo naopak přemnožení.
13
5.2.2. Augmentativní biologická ochrana Augmentativní biologická ochrana používá přirozených nepřátel v sezónních dávkách. Augmentativní biologická ochrana využívá k potlačení škůdců během sezóny nebo během růstového cyklu plodin jednu nebo několik aplikací přirozených nepřátel do prostředí (Obr. 1). Často jsou augmentativní (zvýšené) aplikace výsledkem neúspěšného nebo jen částečně úspěšného úsilí o permanentní ujmutí přirozených nepřátel, což je náplní biologických kontrolních programů (Smith a Armitage, 1931; Flandry, 1949). Jedná se o situace, kdy augmentativní uvolnění nepřátel doplňuje již ustavený komplex nepřátel, a to v kritických obdobích, kdy místní populace nepřátel nejsou schopné populace škůdců zlikvidovat sami. Augmentativní biologická ochrana tady zavádí jakýsi podpůrný systém pro již zavedené kontrolní systémy, tím, že periodicky uvolňuje nepřátele škůdců. Augmentativní biologická kontrola je strategie, která zajišťuje trvalost kontrolních metod proti škůdcům (Rabb et al., 1976; Flint a van den Bosch, 1981; Haney et al., 1992; Trumble a Morse, 1993; Luck et al., 1997; van Lenteren, 2000).
Obr. 1: Možný způsob aplikace.
Zdroj: URL 1
14
5.3. Historie biologické ochrany Historie biologické ochrany v Evropě (Greathead, 1976). První praktická demonstrace biologické ochrany byla provedena ve Francii v roce 1840: M. Boisgiraud použil střevlíka (Calosoma sycophanta) proti škůdci bekyni velkohlavé (Lymantria dispar (L.)) škodících na topolech. První neúspěšným pokusem o kolonizaci přirozeného nepřítele v Evropě byl import roztoče Rhizoglyphus phylloxerae (Riley & Planchon) v roce 1873 pro kontrolu nad révokazem Viteus vitifolii (Fitch). K rozsáhlému využívání biologické kontroly došlo kolem roku 1888 a to použitím rodu Rodolia, Slunéčkovití (Coccinellidae, Coleoptera) pro kontrolu červců škodících na citrusech. První úspěch v použití nepůvodních organismů se datuje od 1897, kdy byl z Portugalska importován brouk Rodolia cardinalis (Mulsant) působící proti Icerya purchasi (Mask) škodící na bavlně. Tento úspěch v Evropě silně stimuloval zájem o klasickou biologickou ochranu. Neúspěch programu na ochranu brambor proti mandelince bramborové (Leptinotarsa decemlineata) probíhající v letech 1926 – 1944 snížil opět zájem o biologickou kontrolu na nižší úroveň. Klasická biologická ochrana byla v Evropě poměrně neúspěšná. V té době byl důvodem nedostatečný import vhodných druhů parazitů. Výjimkou z mnohých selhání při používání nepůvodních nepřátel proti nepůvodním škůdcům bylo použití parazita Encarsia formosa (Gahan) pro kontrolu nad Trialeurodes vaporariorum (Westwood) ve sklenících (Speyer, 1927). Tento parazit je komerčně užíván ve velkém měřítku a tvoří hlavní téma v integrované ochraně proti hmyzím škůdcům (IPM), v programech pro biokontrolu ve sklenících (van Lenteren & Woets, 1988). Použití přirozených nepřátel pro biologickou ochranu během první poloviny 20. století shrnul Sachtleben (1941). Greathead (1976) aktualizoval. Po této aktualizaci bylo vybráno několik přirozených, domorodých druhů pro biologickou ochranu a ty jsou dodnes komerčně používány (van Lenteren et al., 1987; van Lenteren, 2003). Zájem o biologickou ochranu se kolem roku 1940 s objevením chemických pesticidů snížil. Ale pozdější rozvoj perzistence škůdců a projevy nechtěných účinků chemických látek znovu oživily zájem o biologickou ochranu, což vedlo ke vzniku Mezinárodní organizace pro biologickou ochranu (IOBC) v roce 1955. Evropská sekce této společnosti se stala hnací silou za změnu myšlení v problematice ochrany rostlin (van Lenteren et al., 1992; www.IOBCWPRS.org).
15
5.4. Integrovaná ochrana proti škůdcům Ačkoli je biologická ochrana první preferovaná metoda v hubení škůdců, často není možné udržet všechny druhy škodlivého hmyzu, nemoci a plevele pod únosnou hranicí pouze pomocí biologické kontroly. Z tohoto důvodu je potřeba používat společně i jiné typy metod redukujících výskyt škůdců. Dnes existuje mnoho možností jak integrovat další vhodné redukující metody společně s biologickou kontrolou.
5.4.1. Co je IPM? (Integrated Pest Management) Integrovaná ochrana proti škůdcům je trvalý, environmentálně a ekonomicky vhodný systém, který předchází poškozením způsobeným škodlivým hmyzem, nemocemi a plevely, použitím přirozených faktorů, které omezují přírůstek populací škodlivých organismů. Pokud je potřeba, pak je kombinována s jinými vhodnými opatřeními (van Lenteren, 1993) (Obr. 2, 3). Potravinová a zemědělská organizace (FAO- The Food and Agricultural Organization) vytvořila následující definici: „Systém ochrany proti škůdcům, který využívá všechny metody schopné vhodným způsobem redukovat populace škůdců a udržovat hustotu jejich populací na nízkých úrovních, které nezpůsobují ekonomické problémy“ (Smith a Reynolds, 1966). Program IPM dosáhl největších úspěchů v roce 1950 jako rozumný přístup poskytující dlouhodobé řešení problémů se škůdci (Wearing, 1988), ale přijetí nové metody mezi spotřebiteli bylo v té době velmi nízké.
Obr. 2, 3: Aplikace pomocných opatření – lepkavá tabulka
Zdroj: URL 2
Zdroj: URL 3
16
5.4.2. Proč potřebujeme IPM? Pro boj proti hmyzím škůdcům, nemocem a plevelům se používá asi 800 různých chemických přípravků. Insekticidy tvoří nejnebezpečnější kategorii pesticidů, protože na rozdíl od fungicidů nebo herbicidů, zabíjí všechny živé organismy. Většina insekticidů je charakteristická tím, že má široké spektrum aktivity s velmi dobře známými riziky pro výrobce, spotřebitele a hlavně pro okolní prostředí. Některé herbicidy i fungicidy mají stejně stinné stránky. Hlavním problémem současného chemického průmyslu je vývoj perzistence škůdců na chemické pesticidy. Exponenciální vzrůst rezistence hmyzu vede k závažným problémům působícím na lidi (př.: malárie, nelze vyhubit hmyzího přenašeče tohoto onemocnění) nebo dochází ke snižování výnosů plodin. Mimo to je vývoj nových pesticidů stále více obtížnější. Nové pesticidy musí uspět ve velmi přísných testech než budou legislativně povoleny, což zvyšuje celkové výrobní náklady. Chemické hubení škůdců mělo za následek vývoj perzistence u více než 500 druhů hmyzu. Téměř bez výjimky pokusy o vyhubení škůdců selhaly. Škodlivý hmyz přežil veškeré chemické taktiky, které byly nově vymyšleny.
Tabulka1. Metody jak předejít nebo redukovat vývoj škodlivého hmyzu (van Lenteren, 1993) ___________________________________________________________________________ Prevence: * předejít zavlečení nových druhů škodlivého hmyzu (kontroly a karantény) * pracovat s čistým semenem a rostlinným materiálem (tepelná dezinfekce) * pracovat s půdou neobsahující škůdce (parní sterilizace a solarizace) * předejít introdukci ze sousedních plodin Redukce: * použít ochranu kultur (střídání plodin) * použit sazenice, které jsou (částečně) odolné proti škodlivému hmyzu * použít jednu z následujících kontrolních metod: - mechanická ochrana (mechanické ničení škodlivých organismů) - fyzikální ochrana (teplo) - ochrana atraktanty, repelenty - ochrana feromony - ochrana hormony - genová ochrana - biologická ochrana (přirození nepřátelé a antagonisté) - (výběrový) chemický boj Ochrana založený na sběru a postřiku. Ochrana založený na integraci metod, které způsobí nejmenší porušení ekosystémů: integrovaná ochrana
Technicky není realizace IPM příliš odlišná od chemické kontroly. Při první aplikaci by měla být pozornost zaměřená hlavně na důkladné rozšíření po ploše. IPM metody jsou
17
metody nové a požadují také nový přístup ze strany spotřebitelů. Princip: vnášet přirozené nepřátele do prostředí s výskytem škůdců pouze pokud je tento škůdce přítomen. Velkým omylem je názor, že je lepší aplikovat prostředky vždy a v nadbytečných množstvích. A pouze jestli se bude tato metoda zdát lepší než konvenční metody, pak bude i snáze přijata mezi uživateli. Kombinace nejrůznějších taktik v metodách IPM s cílem redukovat nebo odstranit negativní vedlejší účinky chemické kontroly je nerealističtější formou řešení těchto problémů. Za účelem zlepšit stav životního prostředí začínají
vědci vyvíjet empirické
programy integrované ochrany plodin, které později bude možné používat v integrovaném zemědělství. Takový postup povede ke snížení obsahu pesticidů v prostředí (Wijnands et al., 1993).
5.5. Chyby a nedorozumnění o biologické ochraně (van Lenteren, 1992) 1. Biologická ochrana vytváří nové druhy škodlivého hmyzu Použití biologické ochrany proti jednomu specifickému druhu škůdce vede ke vzniku nových druhů škůdců, a to z důvodu omezení postřikování pesticidy se širokým spektrem. Tato kritika je většinou nesprávná a skutečnost je pravým opakem: aplikace chemické kontroly má za následek vývoj nových druhů škodlivého hmyzu. Výzkum biologické ochrany začal za účelem kontroly druhů škodlivého hmyzu, které byly odolné vůči chemickým pesticidům. Některé druhy již není možné ovládat chemickou kontrolou, a proto je jediným řešením biologická kontrola.
2. Biologická ochrana je nespolehlivá Názor, že biologická kontrola je méně účinná než chemická vznikl následkem silného tlaku trhu, který prosazoval, že druhy se kterým je v produktech biologické ochrany obchodováno nejsou plně testovány na účinnost. Tato kritika také vznikla díky některým amatérským výrobcům, kteří nekontrolovali, zda jsou agens obsažené v jejich výrobcích účinné pouze k cílovým organismům. Nicméně, filozofií dnešních odborníků je stále obhajovat používání jen těch přirozených činitelů, kteří prokázali svou účinnost v přirozených podmínkách a v programech zaměřených na likvidaci škůdců na určitých plodinách. Některé produkty prokázaly srovnatelnou nebo dokonce lepší účinnost než chemické pesticidy.
18
3. Výzkum biologické kontroly je drahý Rozbory nákladů ukázaly, že náklady na výzkum biologické kontroly je cenově příznivější než náklady na chemický výzkum (Tisdell, 1990; van Driesche a Bellows, 1995; Neuenschwander, 2001). Důvod, proč i navzdory této cenové výhodnosti biologické kontroly není používána v jednoznačné převaze je ten, že existuje produkční a distribuční problémy s parazity a jejich nepřáteli: celá metodologie produkce přirozených nepřátel je velmi odlišná od chemické výroby pesticidů a skladovatelnost produktů obsahujících živou složku je velmi omezená na dny nebo týdny. Tím se možná myslí, že hledání přirozených nepřátel je dražší a zabere více času než syntéza nových chemikálií. Opak je však obvykle pravdou: náklady na biologickou kontrolu jsou nižší než na chemickou. A kvůli nárokům trhu je délka vývoje a kontroly nových produktů srovnatelná pro obě varianty (10 let).
4. Aplikace komerční biologické ochrany je pro uživatele drahá
Důležitým podnětem používání přirozených nepřátel ve sklenících byly nižší náklady než v případě chemických pesticidů. Chemická kontrola nad molicemi byla dvakrát dražší než biologická kontrola pomocí druhu E. formosa. V dnešní době vychází analýzy finanční náročnosti velmi podobně. Biologická kontrola není rozhodně dražší než chemická. A navíc biologická kontrola je v dnešní době tak rozšířená pro běžné plodiny, že je již velmi obtížné udělat analýzu nákladů chemických pesticidů, neboť se v těchto případech používají sporadicky (Obr. 4). Měli bychom si uvědomit, že většina biologických agens je zdarma. Mnoho prospěšných druhů se vyskytuje v prostředí přirozeně a udržují populace škůdců pod ekonomickou hranicí ve všech místních a zemědělských ekosystémech celosvětově.
19
Obr. 4: Kukuřice poškozená housenkami.
Zdroj: URL 4
5. Praktické použití biologické ochrany se vyvíjí velmi pomalu Také tato kritika je nesprávná. Během minulých 120 let bylo introdukováno více než 2000 druhů hmyzu pro kontrolu nad hmyzími škůdci ve 196 zemích a ostrovech a více než 150 přirozených druhů se využívá komerčně (van Lenteren et al., 2006). Přiklad rychlého vývoje biologické ochrany: identifikace a masová produkce přirozených nepřátel byla v uplynulých 40 letech tak uspěná, že v Severozápadní Evropě je dostupných více přirozených nepřátel (150 druhů) než je zaregistrováno chemických insekticidů (méně než 100).
5.6. Hmyzí rezistence a její management Vývoj hmyzí rezistence je schopnost určitého druhu hmyzu a jeho populace tolerovat dávky toxických látek, které by pro většinu jedinců populací téhož druhu byly smrtící. Insekticidní rezistence přímo a hluboce ovlivňuje znovu objevení nemocí, které jsou přenášeny hmyzem (Krogstad, 1996). Kontrola vektorů je primární a základní prostředek proti šíření nemocí jako je malárie, filarióza, japonská encefalitida nebo horečka dengue v lidské společnosti. V posledních letech je stále více jasné, že je nutné výrazně omezit používání chemických pesticidů a vyvíjet a zdokonalovat alternativní metody. Nicméně pečlivé
20
zkoumání aktuálních informací o rezistenci přenašečů nemocí ukázalo, že ani plný účinek rezistence nemá vliv na kontrolní úsilí. Základními kroky managementu rezistence je sledování výskytu rezistence. Což vede k poskytnutí základních dat pro programové plánování a výběr insekticidního prostředku před začátkem aplikace kontrolních opatření. Dále je důležitá detekce rezistence již v ranných stadiích, kdy může být aplikován včasný zásah a může být spojitě sledován. Musí být objevovány nové mikrobiální toxiny s různými strukturami a mechanismy účinku, aby došlo k minimalizaci rizik spojených s vývojem rezistence. Studie by měly být vedeny směrem k vývoji efektivní a k životnímu prostředí přátelské tzv. „zelené technologii“. Obrázky (5,6,7,8) ukazují některé příklady poškození rostlin způsobené hmyzem nebo jejich larvami.
Obr. 5, 6: Poškození trávníku krtonožkami, poškození bobulí hroznového vína.
Zdroj: URL 5
Zdroj: URL 6
Obr. 7, 8: Housenky krmící se na listech rostlin.
Zdroj: URL 7
Zdroj: URL 8
21
5.7. Hostitelská specificita bioinsekticidů ke škůdcům Patogeny jsou důležitými přirozenými nepřáteli hmyzu a většina z tisíců druhů bakterií, virů, hub, hlístovek a prvoků, kteří nakazí hmyz jsou vysoce hostitelsky specifičtí a účinní v redukci populací svých hostitelů. Hostitelská specifika je důležitým aspektem pro patogeny, se kterými je manipulováno pro biologické kontrolní účely. Před tím než je patogen introdukován do nové oblasti jako kontrolní činitel, je nutné znát potenciální hostitelský okruh a možné účinky na jiné organismy. Vnímavost specifických druhů hmyzu k patogenu definuje hostitelský okruh tohoto patogenu. Počet druhů hostitelů, které mohou být infikovány jednotlivými druhy patogenu se mohou měnit. Patogeny, které jsou vysoce hostitelsky specifické mají úzký hostitelský okruh a nakazí jen jeden nebo několik blízce příbuzných druhů hostitele. Druhy se širokým hostitelským okruhem jsou považovány za mnohostranné, a proto nejsou příliš hostitelsky specifičtí. Některé testy však ukázaly zajímavá zjištění. Pokud byl přirozeně infikovaný hostitelský hmyz umístěn do klece s neinfikovanými hostiteli, došlo ke kontaktu mezi larvami a na většinu testovaných druhů byla infekce také přenesena pravděpodobně přes fekálie. Takže v několika případech mohl infikovaný hostitel nakazit i necílový hmyz. V laboratoři provedené další testy ukázaly, že pokud byl necílový hostitel infikován a umístěn k neinfikovanému necílovému hostiteli, pak k žádné další nákaze nedošlo. Jinými slovy mezi necílovými hostiteli k řetězové nákaze nedochází ani za optimálních podmínek pro patogen. Neobvyklé reakce necílových hostitelů k patogenům byly také zjištěny u hub. Ačkoli je velmi obtížné pozorovat neobvyklé reakce u virů, bylo uznáno, že se mohou vyskytovat atypické nebo subletální infekce i u necílových organismů. Na rozdíl od významných skupin patogenů, většina bakterií, které infikují hmyz, včetně přirozeně se vyskytujícího Bacillus thuringiensis, jsou obvykle oportunistickými bakteriemi, které infikují pouze hostitele, kteří jsou stresovaní nebo zranění.
22
6. Přehled hmyzích biopesticidů 6.1. Úvod Mezi činitele biologické ochrany (přirozené nepřátele) řadíme predátory, parazitický hmyz a patogeny. Predátory mohou být jiné druhy hmyzu nebo jiných hmyzožravců, kteří během svého života zkonzumují velká množství hmyzu. Predátoři jsou často větší, aktivní a často nápadní svým chováním a jsou proto snáze rozpoznatelní než parazité a patogeny. Za parazity hmyzu považujeme jiné druhy hmyzu, které požírají vajíčka škůdců nebo usmrcují přímo hostitele. Po vylíhnutí vajíček parazitů vznikají další stadia (larvální), která se živí přímo hostiteli a usmrcují je. Obvykle je pro parazita dostačující tělo jednoho hostitele, aby mu poskytl dostačující potravní zdroj než dozraje v dospělce. Mnoho parazitů je velmi hostitelsky specifických a jsou tedy pro necílové organismy bezpeční. Ačkoli jsou hmyzí patogeny v prostředí zcela běžné, nejsou příliš známí, neboť dosahují pouze malých velikostí a nejsou tedy viditelní. Hmyz, stejně jako jiní živočichové, podléhá nejrůznějším onemocněním. Mezi hmyzí patogeny zahrnujeme entomopatogenní houby (Obr. 9), viry, bakterie (Obr. 10), hlístovky (Obr. 11) a další mikropatogeny, které způsobují onemocnění hmyzu. Chorobné epidemie hmyzu nejsou v přírodě příliš běžné, pouze v případech jedná-li o velmi velké populace nebo pokud podmínky prostředí podporují růst patogenů. Nicméně hmyzí patogeny jsou velmi důležité pro snižování populací škůdců. Některé druhy patogenů byly v případech biokontroly velmi úspěšné. Mnoho hmyzích patogenů napadá pouze jeden druh hmyzu nebo skupinu hmyzu, a proto je nepravděpodobný atak necílových organismů včetně užitečného hmyzu, člověka, divoké zvěře nebo rostlinstva. Biopesticidy jsou určité druhy pesticidů, které obsahují živý organismus, části organismů nebo směs organismů pravidelně aplikovaných pro kontrolu nad škodlivými druhy hmyzu. Chemický průmysl vyvíjí nové aktivní přísady s nízkou toxicitou pro životní prostředí a s účinky zaměřenými pouze na cílové organismy. Tento pozitivní vývoj chemických pesticidů však omezí rozptyl mikrobiálních pesticidů kvůli snížení rozdílů v bezpečnosti obou typů preparátů. Takže výzvou by v dnešní době měl být vývoj levných mikrobiálních insekticidů s aktivitou srovnatelnou s chemickými preparáty a samozřejmě bezpečné pro životní prostředí.
23
Obr. 9: Moucha infikovaná Entomophora muscae.
Zdroj: URL 9
Obr. 10: Některé druhy bakterií.
B. thuringiensis, Zdroj: URL 10
Pseudomonas spp., Zdroj: URL 11
Micrococcus luteus, Zdroj: URL 12
EPN, Zdroj: URL 14
EPN v hostiteli, Zdroj: URL 15
Obr. 11: Některé druhy EPN.
Steinernema carpocapsae, Zdroj: URL 13
24
6.2. Entomopatogenní viry
(Obr. 12) Vlevo: Larva Píďalky usmrcená nukleopolahedrovirem. (J.Ogrodnick), Zdroj: URL 16 (Obr. 13) Uprostřed: Dospělec infikovaný nukleopolahedrovirem. (J.Ogrodnick), Zdroj: URL 16 (Obr. 14) Vpravo: Larva infikovaná granuloviry (nahoře) a zdravá (dole) (J.Ogrodnick), Zdroj: URL 16
Primární hostitel: housenky různých druhů škůdců. Klíčové charakteristiky: mrtvé larvy jsou oslabené, černé, rozkládají se napojené na listy jako váček. Hmyzí specifické viry mohou být vysoce efektivní přirozenou kontrolou některých housenek škůdců (Obr. 12, 13, 14). Různé druhy přirozeně se vyskytujících virů Baculoviridae (nukleopolyhedroviry = NPV, bakuloviry a granuloviry = GV) jsou v nízkých dávkách přítomny v mnoha populacích škůdců. Virová infekce může výrazně snížit počty škůdců, zvláště když jsou přemnožené. Virus musí být hostitelem pozřen, aby mohl způsobit infekci, ale může se také šířit při páření nebo během kladení vajíček. Hmyzí viry jsou bezpečné pro člověka i pro divoká zvířata. Virové choroby housenek škůdců mohou způsobit nepřímou úmrtnost larev prospěšných parazitů, jestliže hostitelský hmyz zemře dříve než parazit dokončí svůj vývoj. Predátoři a dospělci parazitů nejsou přímo ohroženi. Pro obnovení infekce v dalším období mohou viry přezimovat v prostředí nebo přímo v hostiteli. Úspěšná komercializace virových produktů je omezená, protože jejich produkce je poměrně drahá. A vývoj virových insekticidů je dále stěžován skutečností, že viry jsou specifické k určitým druhům škůdců a tak jsou vhodné pouze pro omezený trh.
25
6.2.1. Cíloví škůdci Přirozeně se vyskytující viry napadají housenky většiny nejzávažnějších škůdců. NPV napadají
housenky píďalek, kukuřičné housenky, housenky napadající hlávkovou
zeleninu, bavlnu, tabák, housenky zavíječe kukuřičného, housenky škodící na jehličnanech. Granuloviry byly izolovány z několika druhů housenek snovačů, komárů, housenek hlávkové zeleniny a mnoho dalších.
6.2.2. Mechanismus působení Viry vstupují do těla škůdce přes střevo. Je tedy nutné, aby byly cílovým hmyzem pozřeny. V mnoha tkáních se množí a narušují běžné fyziologické procesy hmyzu: přestanou se krmit, pohybovat a klást vajíčka. Virové partikule jsou sbalené do nukleokapsidu prutovitého tvaru, který obsahuje cirkulární nadšroubovicové vinutí dvouřetězcové DNA. Virové partikule (viriony) GV jsou jednotlivě uzavřené v bílkovinném obalu. U NPV jsou viriony sbaleny buď jednotlivě nebo po větších počtech. Po vstupu do hostitele jsou bílkovinné obaly virionů rozpuštěny v zásaditém prostředí střeva hostitele. Uvolněné virové částice vstupují do epiteliálních buněk a v jejich jádrech se množí. Již neobalené virové částice mohou ze střeva napadat ostatní tkáně hostitelského těla (tukovou tkáň, tracheální výstelku nebo hypodermis, apod.). Viry obalené v mnohostěnném bílkovinném obalu (polyhedra) jsou všeobecně infekční pro většinu hmyzích hostitelů. Přenos virionů bacolovirů může být usnadněn pomocí predátorů nebo při kladení vajíček (Evans, 1986; Gröner, 1990). Stejně jako u jiných biokontrolních medií existují i u virů tři základní pravidla: infekce, pomnožení a zachování.
6.2.3. Symptomy Různé druhy virů mají různé symptomy. Larvy infikované NPV se většinou zbarví bíle a mohou být i tmavě skvrnité. Některé housenky začnou šplhat na vrcholek rostliny, přestanou se krmit, zeslábnou a visí na horních listech nebo stoncích, jedná se o charakteristické vadnutí rostlin. Larvy napadené bakuloviry jsou mléčně zbarvené a přestávají se krmit. V obou případech se obsah těla larvy přemění na tekutinu, snadno dojde k ruptuře
26
kutikuly a virové částice jsou uvolněny do okolí. Smrt po virové nákaze nastává obvykle po 3 – 8 dnech.
6.2.4. Relativní účinnost Přirozeně se vyskytující virová onemocnění mohou zásadně zredukovat populace škůdců. Přenos virů mezi populacemi může trvat dny nebo týdny, a pokud jsou vhodné podmínky může se být zlikvidována i celá populace škůdců. Některé příklady jsou důkazem, že kombinace přirozeně se vyskytujících virů a jiných nepřátel bude udržovat populace škůdců v přijatelných úrovních. Například: viry zničí 28% populace housenek škodících na hlávkové zelenině a zbývajících 55% populace je infikováno parazitoidy. U píďalek ve stejné studii byla 40% infekčnost. Aplikace virů jako mikrobiálního insekticidu je úspěšná hlavně v oblastech, které jsou nějak omezeny. Bakuloviry prokázaly v některých testech srovnatelnou účinnost s Bacillus thuringiensis (Bt) a jsou svou účinností srovnatelné i s některými chemickými prostředky. Pomocí feromonů (hmyzích atraktantů) byli hmyzí škůdci nalákáni na virové pasti, pomocí, kterých se viry šíří a roznáší mezi škůdci a po okolí. Infikované housenky jsou rozmačkány a rozmíchány ve vodném roztoku
a
aplikovány jako postřik proti škůdcům. Viry nepříznivě ovlivňuje UV záření, a proto je jejich aplikace nejvhodnější později odpoledne. Hustot populace škůdců a její obecné fitness ovlivňuje citlivost vůči ataku virem a tím se efektivita různých druhů virů může měnit. Viry mohou být skladovány zamrazením několik let. Výzkumy zaměřené na zkrácení doby usmrcení viry jsou stále aktuální a pro zlepšení výkonu virových insekticidů je nutné zapojit do těchto výzkumů i genové inženýrství. Jak již bylo zmíněno, entomopatogenní viry jsou velmi citliví na UV záření. Z tohoto důvodu jsou vyvíjeny nejrůznější ochranné metody. Jednou z těchto metod je použití tzv. lekutvorných přísad. Optické leskutvorné přísady jsou chemické látky, které se používají v pracích prostředcích na projasnění tkanin. Hlavním principem je absorpce energie ultrafialového záření a jeho emise jako viditelné světlo. Jsou také používány jako UV ochrana entomopatogenů a jejich účinnosti jako mikrobiálních činitelů. Některé leskutvorné přísady byly demonstrovány nejen jako UV ochrana, ale prokázaly také potenciál zvýšit virovou účinnost. Zvýšení nakažlivosti mikrobiálních činitelů díky optickým leskutvorným přísadám obecně zvýšila mortalitu larev škůdců, ale také urychlily účinky entomopatogenů a urychlily
27
smrt larev. V některých případech byla také pozorována prodloužená účinnost i vůči starším larválním stadiím. V některých případech byly také rozšířeny okruhy hostitelů, tj., viry, které byly za standardních podmínek pro určité škůdce neinfekční, se po dodání leskutvorných přísad staly infekčními i pro dříve odolné škůdce. Leskutvorné přísady je možné využívat ke zvýšení virové produkce a jejich užitečnosti v boji proti hmyzím škůdců. Pokud jsou viry pečlivě aplikovány v obdobích, kdy jsou hladiny výskytu hmyzích škůdců ještě nízké, pak prokazují vynikající výsledky. Jejich nevýhodou je skutečnost, že potřebují delší čas než se projeví jimi způsobená infekce u cílového hmyzu a to může vést ke zničení plodin, kterými se škůdce živí. Dříve než viry dosáhnou komerčních úspěchů je nutné vyřešit ještě některé problémy jako je perzistence při skladování a UV ochrana. Je evidentní, že ještě existují překážky v rozvoji produktů obsahujících viry a budoucnost těchto produktů na komerčním trhu je zatím nejistá. Bylo také zjištěno, že rostlina může dokonce využívat entomopatogeny jako součást obranných strategií. Pokusy byly prováděny na Brassica oleraceae, která byla napadena mšicemi Myzus persicae
infikovanými
entomopatogenními parvoviry (M. persicae
densovirus). Nakažené mšice byly přenašečkami virů na rostlinu. Do těla rostliny byly transportovány přes lýko a rostlina je poté využívala jako obranou metodu proti nenakaženým mšicím, které parazitovaly na listech brukve. Existuje tedy důkaz, že rostliny mohou být vektory hmyzích virů a mohou tento virus využívat jako ochranu proti býložravcům. V dnešní době jsou velmi diskutované problémy spojené s používáním bakulovirů (introdukce, osídlení a hromadné uvolňování a aplikace jako insekticidů) jako klasické biologické kontroly. Charakter a intenzita nákazy způsobené bakuloviry je spojena s kriteriem označovaným jako „stupeň nákazy“. Toto kriterium bylo zhodnoceno na základě dvou faktorů. Prvním faktorem je virulence a účinky virů na tkáně, druhým faktorem pravděpodobnost kontaktu mezi larvami škůdců a infekčním virem v přirozeném prostředí. Tato pravděpodobnost závisí na bioekologických zvláštnostech každého druhu hmyzu. Kriterium „stupeň virové nákazy v ekosystému“ byl navržen pro výběr nejlepší metody pro použití bakulovirů proti hmyzím škůdcům. Teoretický základ metod pro použití virů pro kontrolu škodlivého hmyzu odpovídá hlavním cílům klasické biologické ochrany ( introdukce, osídlení a hromadné uvolnění). Otázky introdukce, kolonizace a přímého použití mikroorganismů jako insekticidu byly diskutované Hallem (1964). Je známo velmi málo případů o úspěšné introdukci virů. Zvláště významná byla například introdukce virů Pilatek z Evropy do USA a Kanady (Bird, 1953, Bird a Elgee, 1957). Zpočátku byl účinek poměrně
28
dramatický, ale v průběhu času se interakce mezi nukleopolyherdoviry (NPV) a jeho hostiteli vyvážily. Výsledky výzkumu interakce mezi bakuloviry a jejich hostiteli jsou zaneseny do tabulky 1. V tabulce je hmyz rozdělen do skupin podle zvláštností projevujících se při jejich napadení virem v přírodě. Stupeň nákazy je vyjádřen číslem podle charakteru viru a pravděpodobnosti kontaktu s citlivým stadiem hmyzího hostitele v přirozeném prostředí. V posledním sloupci tabulky jsou určité metody vhodné pro použití bakulovirů pro každou skupinu hmyzu a je navržen vhodný pár „hostitel-virus“. Tabulka 1. Vliv interakce bakulovirů s hmyzem na výskyt virových infekcí v přírodě a na metody jejich použití. (E. V. Orlovskaya, 1998)
29
Virové infekce hmyzích populací byly zkoumány hlavně ve vztahu s aktivními latentními viry za podmínek pro hmyz nevhodných (př.: stres) v období rozmnožování (Gershenson, 1959; Aruga, 1963). Další vývoj virových infekcí hmyzu v přírodě a mezi různými druhy byl spojen s hlavním faktorem odpovědným za virulenci, tedy stupněm nákazy. Výzkumy interakcí mezi baculoviry a jejich hostitelským hmyzem u jedinců a v ekosystémech ukázaly, že specifický NPV (nukleopolyhedrovirus) a GV (granulovirus) měli různé stupně aktivity u různých druhů, a že existují rozdíly mezi sukcesí infikovaných tkání u různých druhů hmyzu. Tento fakt má značný vliv na stupeň nákazy v ekosystému.
30
6.3. Entomopatogenní bakterie
(Obr. 15) Larvy zavíječe kukuřičného napadené B. thuringiensis, Zdroj: URL 16
Mezi bakteriální patogeny používané proti larvám škodlivého hmyzu patří také spory tvořící tyčinkovité bakterie rodu Bacillus. Nejčastěji se vyskytují přirozeně v půdách a i druhy s velmi vysokou patogenitou jsou izolovány z půdních vzorků. Bakteriální insekticidy musí být pro cílový hmyz poživatelné a efektivní, neboť nepatří mezi kontaktní jedy. Insekticidní produkty složené z jednotlivých druhů nebo poddruhů Bacillus jsou patogenní pro celé řády hmyzu nebo pro jeden nebo několik druhů hmyzu (Obr. 15). Například, produkty obsahují Bacillus thuringiensis var. kurstaki usmrcují larvální stadia široké škály motýlů, můr a molů. Na rozdíl od tohoto druhu, druh Bacillus popilliae var. popilliae usmrcuje pouze larvy určitých druhů brouků, ale není efektivní proti blízce příbuzným ponravám, které devastují parkové trávníky v různých oblastech celého světa. Nejpoužívanějšími mikrobiálními insekticidy jsou produkty obsahující Bt a požívají se v některých zemích již od roku 1960. Produkty obsahující Bt jsou vyráběny ve velkých průmyslových fermentačních nádobách.
6.3.1. Cíloví škůdci
Celá řada můr, molů, druhů brouků a larev much, které jsou vůči infekci citlivé. Bt je dostupný pro kontrolu nad: mnoha housenkami škůdců, včetně importovaných housenek ožírajících listy hlávkové zeleniny, housenkami píďalek (kapusta), housenkami lišaje, zavíječe kukuřičného, předivky polní, larvám brouků, vakonošům, bekyni velkohlavé a jiných lesních housenek. Menší účinky má na zavíječe jablečného a broskvového a na vrtáka révového. Varianta Bt tenebrionis zaznamenala účinky proti larvám mandelinky bramborové
31
a larvám brouka napadajícího listoví jilmů. Varianta izraelensis
je prodávaná proti
muchničkám a komárům, pakomárům ačkoli není-li použit na celou plochu výskytu je účinnější odstranění vodního zdroje larev a plevelů kolem vodní plochy. Bt varianta aizawai se používá pro kontrolu larev zavíječe voskového ve včelích úlech a jiným housenkám. Některé komerčně dostupné varianty Bt a cíloví hmyzí škůdci: Bacillus thuringiensis •
var. tenebrionis - mandelinka bramborová a larvy škodící na listoví jilmů.
•
var. kurstaki
•
var. israelensis - larvy komárů, muchniček a pakomárů.
•
var. aizawai
- housenky.
- larvy zavíječe voskového a různé housenky zvláště předivky polní.
6.3.2. Mechanismus působení
Bakteriální buňky obvykle produkují spory a krystalické proteinové toxiny zvané endotoxiny. Komerční produkty obsahují většinou bílkovinné toxiny a spory nebo pouze toxiny. Jakmile je Bt pozřen citlivým hmyzem je bílkovinný toxin aktivován zásaditým prostředím střeva škůdce a aktivními střevními enzymy. Poté se aktivovaný toxin napojí na specifické receptory, ochromí a ničí buňky střevní stěny a obsah střeva se vylije do tělní dutiny hmyzu. Otrávený hmyz vlivem toxinu rychle umírá nebo přestane přijímat potravu a umírá během 2 – 3 dnů na septicaemii (Obr. 16). Bt se nereprodukuje, ale v prostředí je perzistentní a zůstává v půdě v dostatečných množství pro poskytnutí kontinuální kontroly nad škůdci. Bakterie se mohou množit v infikovaném hostiteli, ale protože by se tvořilo pouze málo spor a proteinových toxinů a bylo by tedy po smrti hostitele uvolňováno pouze malé množství infekčních jednotek. Z tohoto důvodu jsou Bt produkty aplikovány stejným způsobem jako chemické pesticidy. Bt ošetřené plochy jsou během několika dní neaktivní, a proto je nutná opakovaná aplikace. Vlastnosti endotoxinů se mezi jednotlivými druhy a izoláty Bt liší a charakteristické rysy těchto endotoxinů určují proti kterému druhu škůdce bude jejich účinek nejefektivnější. Nestačí však pouze správná fyziologie hmyzu a vnímavé vývojové stadium, ale patogen musí být navíc pozřen v dostatečném množství.
32
Obr. 16: Působení B. thuringiensis var. kurstaky na housenky.
Zdroj: URL 16
1. Housenky konzumují listy ošetřené Bt. 2. Během několika minut se uvolněné toxiny váží na specifické receptory střevní stěny a housenka zastavuje krmení. 3. Během několika hodin dojde k protržení střevní stěny, což způsobí uvolnění spor a střevních bakterií do tělní dutiny škůdce, toxiny se rozpouští. 4. Během 1-2- dnů housenky umírají na septicaemii, kterou způsobí spory a střevní bakterie uvolněné do tělní dutiny.
6.3.3. Symptomy Larvy nakažené Bt nejsou aktivní, zastavují krmení, mohou zvracet hemolymfu nebo mají vodnaté výkaly. Hlavová část se může zdát zvětšená v porovnání s velikostí těla. Larva je zesláblá a umírá během několika dnů. Po rozložení je jejich tělesný obsah nahnědlý až černý. Jiné bakterie změní barvu hostitele na červenou nebo žlutou.
6.3.4. Relativní účinnost Některé přirozeně se vyskytující bakterie mohou také způsobit nákazu, zvláště je-li populace škůdců stresována z nedostatku potravy nebo chladným počasím. Tyto nákazy nejsou tak běžné.
33
Úspěšné použití produktů obsahujících Bt je závislé na aplikaci vůči citlivým vývojovým stadiím škůdců, ve vhodné hustotě, teplotě a před tím než se škůdce dostane do rostliny nebo plodu, kde je chráněn. Nejvíce vnímavé jsou obvykle mladé larvy. Určení, kdy je většina škůdců ve vnímavém vývojovém stadiu je většinou klíčovým krokem aplikace. Ne všechny druhy housenek jsou náchylné k infekci Bt. Účinky Bt mohou být deaktivovány působením UV záření ze slunečního světla a zůstávají aktivní pouze po dobu 2 – 3 dnů. Vlivem deště nebo zavlažovacího zařízení může také dojít k omezení účinku Bt, neboť dojde k jeho smytí z listů. Takže budoucí práce vědců bude překonání těchto problémů.
6.3.5. Bacillus popilliae a Bacillus lentimorbus (Eubacteriales: Bacillaceae) Jsou příbuzné, přirozeně se vyskytující bakterie, které jsou vyráběny pro kontrolu nad larvami Japonských brouků (od roku 1940), larvy devastují kořeny travin a tím i porosty okrasných trávníků. Bakterie jsou obvykle aplikovány do půdy a jsou příčinou „mléčné nemoci“. Spory způsobující mléčnou chorobu jsou nejúčinnější pokud mají vhodné podmínky jako teplota a vlhkost. Takže přes období teplých letních měsíců působí jako velmi dobrá ochrana před těmito škůdci. Larvy infikované Bacillus popilliae a B. lentimorbus se zbarví do mléčně bílé barvy a z toho důvodu vzniklo pojmenování "mléčné onemocnění" (Obr. 17).
Obr. 17: Zdravá larva brouka (vlevo), larva nakažená B. popilliae
Zdroj: URL 16
Japonský brouk Popillia japonica byl v minulé století náhodně introdukován do USA. Ačkoli v zemi svého původu nezpůsobuje významné škody, ve Spojených státech způsoboval
34
vážné škody. Hlavní problémy jsou spojeny s dospělci tohoto druhu, kteří s živí širokou škálou okrasných rostlin, polních plodin, vyžírají tkáň mezi žilnatinou listů a hromadí ji na plodech, čímž snižují jejich kvalitu. Problémy, ale také způsobují larvální stadia, protože dospělci kladou svá vajíčka do drnů trávníků a vyvíjející se larvy se živí kořeny travin. V letech 1930 dosáhla invaze škůdců tak rozsáhlých škod, že bylo nutné vyhledat vhodné opatření pro jejich kontrolu. Byla izolovány spora bakterie, která způsobuje Mléčné onemocnění těchto brouků. Termín „Mléčné onemocnění“ vznikl na základě bílého zbarvení larev infikovaných Popillia japonica. Cílový škůdce: Japonský brouk (Obr. 18) je hostitelem B. popilliae. Nicméně i jiné druhy B. lentimorbus (jinými experty považován také za B. popilliae) jsou specifickými pro jiné zástupce čeledi Scarabaeidae, kam patří i japonský brouk a chrousti, kteří jsou označováni jednak jako škůdci, ale i užitečný hmyz. Obr. 18: Dospělec P. japonica.
Zdroj: URL 16
Životní cyklus Spory, které zůstávají uchované v půdě jsou pozřeny larvami a během asi 2 dnů začnou ve střevech larev klíčit. Během 3 – 5 dnů začnou vegetativní buňky prudce růst. Během této doby některé buňky proniknou přes střevní stěnu a prorůstají až do hemolymfy, kde po 5 – 10 dnech začne nová produkce buněk. Několik spor je tedy již vytvořeno v této
35
fázi, ale hlavní fáze sporulace nastane později a je dokončena 14 – 21 den , zatímco se u larvy projeví typické mléčné zbarvení. Výhody používání komerčních přípravků B. popilliae zahrnují velmi úzký hostitelský okruh (jsou účinní pouze proti Japonským broukům), jejich kompletní bezpečnost pro člověka a další obratlovce, jejich kompatibilita s ostatními regulačními medii včetně chemických insekticidů a entomopatogenních hlístovek, a jejich perzistence.
6.3.6. Používání Bt insekticidů Každý Bt insekticid kontroluje pouze určitou skupinu hmyzu. Proto je základem nejdříve identifikovat cílového škůdce a poté aplikovat vhodný přípravek. Jednotlivá stadia hmyzu se liší citlivostí vůči Bt a tedy izobáty, které jsou účinné proti larvám motýlů, molů nebo komárů obecně nezabíjí dospělá stadia hmyzu. Protože citlivý hmyz, aby byl otráven musí Bt pozřít, z toho důvodu být ošetření směřované na tu část rostliny, kterou se škůdce živí. Otrávený škůdce dál normálně setrvává na rostlině po dobu asi 1 – 2 dnů, ale již se nekrmí a brzy umírá. Jakmile je však Bt aplikovaný na povrch rostlin nebo na jiná místa vystaven slunečnímu záření, je velmi rychle deaktivován UV zářením. Pro maximální efekt Bt by měl být postřik aplikován důkladně na všechny plochy rostlin a to i na spodní strany listů. Ošetření rostlin v pozdním odpoledni nebo večer může tedy být užitečné, neboť insekticid zůstává aktivní po celou noc než je ráno vystaven slunečním paprskům. Aplikaci je také možné provést v dny, kdy je pod mrakem, ale nesmí být deštivo. Byly již však vyvinuty technologické postupy, které Bt obalí do speciálních granulí nebo do již mrtvých buněk a chrání je tak před působením slunečního světla.
36
6.4. Entomopatogenní houby
(Obr. 19) Vlevo: Škůdce napadený houbou často umírá ve vzpřímené poloze na větvičkách nebo travinách. Photo: A.Frodsham, Zdroj: URL 16 (Obr. 20) Uprostřed: Mšice usmrcená houbou. J.Ogrodnick, Zdroj: URL 16 (Obr. 21) Vpravo: Moucha infikovaná houbou Entomophthora. Photo: W. Johnson, Zdroj: URL 16
Některé druhy hmyzu, včetně mnoha škůdců jsou citlivý k infekci přirozeně se vyskytujících entomopatogenních hub (Obr. 19, 20, 21). Tyto houby jsou k hmyzím druhům velmi specifické a neinfikují necílové živočichy ani rostliny. Růst těchto hub je nejlepší ve vlhkém prostředí, ale houby tvoří i rezistentní stadia, která udrží infekční potenciál i za nevhodných suchých podmínek. Houby mají znační infekční potenciál a mohou se velmi rychle šířit populacemi hmyzu a redukovat je. Houby penetrují tělo hmyzu a mohou ochromit například sací ústrojí u mšic nebo molic, které nejsou citlivé vůči nákaze bakteriemi ani viry. Z přibližně 100 známých entomopatogenních druhů hub mají jen druhy rodů Beauveria, Metarhizium a Verticillium skromný komerční vývoj. Jejich zvláštní mechanismus působení (pro infekci vývojových stadií hmyzích škůdců požadují vlhké a teplé podmínky prostředí) způsobuje snížení rychlosti jejich působení, což reprezentuje hlavní překážky jejich vývoje. Entomopatogenní houby se stávají středem zájmu hlavně pro kontrolu nad mšicemi a molicemi, zvláště na plodinách jako je zelenina a okrasné rostliny, kde chemická ochrana selhává (rezistence a znečištění životného prostředí). Navíc prostředí zahradnických skleníků a fóliovníků poskytuje vynikající prostředí pro vývoj entomopatogenních hub. Značný pokrok v oblasti vývoje produktů obsahujících tyto houby udělala firma Koppert a Mycotech. Výsledky na polních plodinách díky nevyhovujícím podmínkám (teplo, vlhko) jsou mnohem horší. Hlavní mycosidy jsou uvedeny v tabulce 2.
37
Tabulka 2:
6.4.1. Cíloví škůdci Vůči houbovým patogenům je citlivá většina hmyzích škůdců. Některé houby jako Entomophthora a příbuzné druhy jsou zcela specifické k určitým skupinám hmyzu. A rod Beauveria má širší okruh hostitelů (viz kapitola 4.4.5.).
6.4.2. Mechanismus působení Houby vstupují do těl hostitelů penetrací jejich kutikuly nebo kůže. Uvnitř těla hostitele se houba mnohonásobně množí. Smrt hostitele je způsobena destrukcí tkání nebo příležitostně toxiny produkovanými houbou. Houba prorůstá tělem hostitele a produkuje spory, které se dále šíří větrem, deštěm nebo kontaktem s jiným škůdcem (Obr. 22, 23). Houbové onemocnění zpravidla iniciují vitální a virulentní konidie uchycené na těle hostitele. Klíčící konidie může na konci klíčku vytvářet různé penetrační struktury (např. zduřelá špička klíčku, apresorium nebo extraceluární pouzdro). Z těchto struktur se dále formuje penetrační hyfa, která proniká do těla hostitele. Po proniknutí invazní hyfy do těla hostitele patogen zpravidla rychle kolonizuje tělní dutinu, kde vytváří buď jedno nebo více buněčná hyfová tělíska (blastospory). Smrtí hostitele dochází k ukončení parazitické fáze patogenu a začíná fáze saprotrofní. Za vhodných podmínek dochází bezprostředně po usmrcení hostitele k prorůstání
38
houby na povrch těla usmrceného hostitele (tzv. proliferace) a na vzdušném myceliu se vytváří fruktifikační orgány. Saprotrofní fáze patogena končí úplnou sporulací. K šíření patogenu dochází pomocí konidií rozšiřovaných nejčastěji pasivně (voda, proudění vzduchu) nebo přímým kontaktem zdravých jedinců s jedinci infikovanými.
Obr. 22, 23: Nosatec infikovaný Beauveria bassiana.
Zdroj: URL 16
Zdroj: URL 17
6.4.3. Symptomy Infikovaný hmyz se přestává krmit a stává se letargickým. Hostitel umírá poměrně rychle, ještě připojený na listy nebo stonky rostliny, ve vzpřímené poloze v nejvyšších částech rostliny. Mrtvý hmyz zůstane tvrdý nebo jako prázdná skořápka, z níž vyrůstá krémová, zelená, červená nebo hnědá houbová rostlina, vyrůstající z kloubů nebo tělesných segmentů. Infikované mšice mohou být zduřené nebo pokryté skvrnami.
6.4.4. Relativní účinnost Entomopatogenní houby pro svou infekci a šíření infekce většinou potřebují teplé a vlhké prostředí. Účinnost těchto entomopatogenních hub je závislá na zvolení správného druhu houby a citlivého vývojového stadia škůdce, na vhodné vlhkosti, půdní textuře (pro vyhledání půdních škůdců) a na teplotě. Houbové spory jsou roznášeny větrem nebo vodou musí přijít do kontaktu se škůdcem, aby mohly způsobit jeho infekci. Přirozeně se šířící houbové nákazy se mohou rychle šířit a decimovat tak populace mšic, kořenových škůdců,
39
housenek, mer a třásněnek. Mnoho entomopatogenních hub se vyskytuje v půdě. A proto aplikace některých půdních insekticidů nebo fungicidů může snižovat nebo zabíjet přirozené populace těchto hub. Například i malá koncentrace některých herbicidů může omezit klíčivost a
růst
spor
Beauveria
environmentálních
nebo
bassiana
v půdě.
Existuje
komplexní
biotických,
které
zpomalují
vývoj
soubor
infekce
procesů, způsobené
entomopatogenní houbou. Mezi tyto faktory patří: citlivost na sluneční záření, přítomnost mikrobiálních antagonistů, chování hostitele, fyziologické podmínky a věk; síla patogenu, přítomnost pesticidů a vhodná teplota a vlhkost (Ferron et al., 1991; Hajek a St. Leger, 1994). Abychom mohli využít veškerý potenciál entomopatogenních hub nestačí pouze pochopit rozhodující faktory, které určují virulenci a infekci, ale také techniky, které souvisí s jejich používáním nebo použití vhodných kultivačních medií, jejich chování v prostředí, atd.. Úspěšné použití entomopatogenních hub jako mikrobiálního kontrolního media bude tedy záviset na použití správné rozmnožovací jednotky, použité správným způsobem a aplikované ve správném dávkování a správném čase. Časové nastavení volíme podle přítomnosti vnímavého hostitele, příznivých podmínek prostředí a na plánování ostatních zemědělských pracích (spojené např.: se zavlažováním nebo konec účinku dříve použitého fungicidu,..). Další zlepšení mikrobiálních kontrolních aktivit může nastat pokud houby použije společně s jinými vhodnými metodami nebo technikami biologické kontroly, např.: manipulace s prostředím pro podporu infekčních procesů nebo použití jiných druhů hmyzu jako přenašeče hub. Například použití vybraných chemických látek jako atraktantu pro hmyz, kterými je škůdce nalákán do připravené pasti, kde je infikován houbovými sporami. Neumožňuje pouze kontrolu nad přitahovaným hmyzem, ale také uvolnění spor do prostředí výskytu larev škůdců jako je půda (Klein a Lacey, 1999), kukuřičná pole (Vega et al., 1995), lány hlávkového zelí (Furlong et al., 1995) a ostatní prostředí (Vega et al., 2000).
40
6.4.5. Charakteristické rysy některých druhů Entomophthora muscae – infikuje mouchy. Mezi vnímavé hostitele patří dospělci škůdců cibule, hlávkové zeleniny nebo osiva. Houba se mnohonásobně množí uvnitř těla dospělce mouchy, čímž se zvětšuje objem jejího těla, na břiše se jim tvoří žlutý pruh vznikajících nových spor. Pandora neoaphidis – běžný, přirozeně se vyskytující patogen mšic, který je zvláště účinný během vlhkých měsíců v roce. Zoophthora radicans – je další běžnou houbou se širokým hostitelským okruhem. Druh byl izolován z několika housenek předivky polní, mer, mšic a nosatců. Jiné příbuzenské druhy také infikují třásněnky. Beauveria
bassiana
(Obr.
24)
–
entomopatogenní houba přirozeně se vyskytující na rostlinách a v půdě. Infekce je podporována teplým, vlhkým počasím. Infikované larvy se zbarví do šedé nebo šedo - bílé barvy. Beauveria je používána jako insekticid v mnoha zemích. Má rozsáhlý hostitelský okruh, který zahrnuje důležité škůdce jako
Obr. 24: Beauveria bassiana, Zdroj: URL 18
jsou molice, mšice, kobylky, termiti, mandelinka bramborová, japonský brouk, nosatec paličkový, štěnice, kůrovci, zavíječ jablečný, kukuřičný, atd.. Byla zjištěna i infekce plic některých hlodavců. A tento druh houby může negativně ovlivňovat také některé přirozené nepřátele škůdců jako je např: slunéčko. Existují však metody jak se vyhnout kontaminaci necílových organismů. Je možné použít návnady pomocí již infikovaných škůdců a pomocí atraktantů lákat pouze cílové organismy. Existuje mnoho různých druhů hub, které prokazují značnou změnu virulence, patogenity a hostitelského okruhu. Vyskytují se v půdě jako saprofyti.
41
Metarhizium spp. (Obr. 25) – byla testována
jako
přirozený
nepřítel
kukuřičných škůdců, ponrav brouků a kořenových škůdců. Má velmi široký hostitelský okruh.
Obr. 25: Metarhizium spp., Zdroj: URL 19
Neozygites floridana – úspěšně testována proti pavoukům, housenkám škodících na kukuřici, tabáku a hlávkové zelenině. Hirsutella thompsonii – infikuje hlavně roztoče. Verticillium lecanii (Obr. 26) – je v Evropě používaná proti skleníkový třásněnkám, molicím a mšicím.
Obr. 26: Verticillium lecanii,Zdroj: URL 20
Neozygites floridana – úspěšně testována proti pavoukům, housenkám škodících na kukuřici, tabáku a hlávkové zelenině. Hirsutella thompsonii – infikuje hlavně roztoče.
Životní cyklus parazitických hub, jako např.: rodu Coelomomyces může zahrnovat celou řadu mezihostitelů (Couch a Bland, 1985). Houby z řádu Imprfecti (Deuteromycotina: Hyphomycetes), na druhé straně mají jednoduchý životní cyklus, neboť se rozmnožují nepohlavně a mnoho z nich má široký okruh hostitelů. Většina druhů entomopatogenních hub se relativně obtížně reprodukuje, neboť jejich primární spory mají krátkou životnost a toto časové omezení značně komplikuje jejich aplikaci. Vývoj účinných metod pro reprodukci dormantních spor a mycelií jistě zvýší užití těchto druhů hub. Druhy řádu Hyphomycetes představují aktivní činitele biologické kontroly
42
pro široký okruh škůdců a jsou tedy hlavními kandidáty pro komerční produkci. Několik druhů má dobrý potenciál pro produkci na levných mediích s dobrými skladovacími vlastnostmi. Entomopatogenní houby z řádu Hyphomycetes jsou vhodné pro použití proti velké škále škůdců.
43
6.5. Entomopatogenní hlístovky (EPN) (Rhabditida: Steinernematidae a Heterorhabditidae)
(Obr. 27) Vlevo: IJ opouštějící mrtvou larvu hostitele. Všimněte si velké dospělé samice. Photo: A.Hara, Zdroj: URL 16 (Obr. 28) Uprostřed: Infekční juvenilní stadium. Photo: P.Timper, Zdroj: URL 16 (Obr. 29) Vpravo: Steinernema carpocapsae infekční juvenilní stadium. Photo: J.Ogrodnick, Zdroj: URL 16
Hlístovky jsou bezbarvé, jejich tělo není segmentované a nemá přívěsky a mohou být volně žijící, dravé nebo parazitické (Obr. 27, 28, 29). Mnoho parazitických druhů způsobuje onemocnění rostlin, živočichů i člověka. Jiné druhy jsou prospěšné v boji proti hmyzím škůdcům, většinou svého hostitele sterilizují nebo jinak omezí. Jediné EPN, které udržují rovnováhu biologických kontrolních atributů jsou hlístovky rodu Steinernema
a
Heterorhabditis. Jsou zařazeny mezi patogeny, protože obsahují symbiotické bakterie. Steinernematidae a heterorhaditidae jsou výlučně půdní živočichové. Jsou všudypřítomné, byly izolovány téměř ve všech kontinentech a zemích a ve všech půdních prostředích (lesy, pole, louky, pastviny a dokonce i oceánské pláže). EPN jsou výjimečně letální pro mnoho půdních škůdců a navíc jsou bezpečné pro rostliny a živočichy. Tento vysoký stupeň bezpečnosti znamená, že ne jako u chemických látek nebo dokonce u Bt, při aplikaci hlístovek není nutné používat ochranné pomůcky a další bezpečnostní vybavení není nutná opakovaná aplikace, nezůstávají rezidua, nehrozí znečištění podzemní vody a neškodí opylovačům. EPN ve spolupráci se svými symbiotickými bakteriemi hostitele zabíjí během 24 – 48 hodin. Mnoho škůdců je velmi citlivých vůči působení hlístovek a nebyl prokázán žádný negativní účinek na necílové organismy. Hlístovky nevyžadují speciální aplikační zařízení, je možné je aplikovat pomocí standardní zemědělských zařízení: tlakových, sprejových, elektrostatických i vzdušných rozprašovačů. Aplikace přes závlahové systémy mnohonásobně zvětší jejich uchycení v půdě. EPN jsou
44
prakticky bez konkurence co se týče kontroly nad půdními a rostlinnými škůdci. Hlístovky jsou prodávané v USA, Evropě, Japonsku a Číně pro kontrolu nad hmyzími škůdci v zahradnictví, zemědělství, domácnostech a zahradnických specializovaných trzích.
6.5.1. Cíloví škůdci EPN jsou smrtící k široké škále škůdců, hlavně v laboratorních podmínkách. Polní hostitelský okruh je více vyhrazený a některé druhy mají velmi úzký hostitelský okruh (viz tabulka 3). Tabulka 3: Aktuální hlístovky používané v biokontrole (R. Gaugler).
Plodiny Artičoky
Škůdce
Druh EPN
Můry
S. carpocapsae
Bobulovité plody Nosatci
H. bacteriophora
Citrusy
Nosatci
S. riobravis
Brusinky
Nosatci
H. bacteriophora, S. carpocapsae
Houby
Komáři
S. feltiae
Okrasné rostliny Nosatci
Trávník
H. bacteriophora, H. megidis
Vrtající hmyz
S. carpocapsae, H. bacteriophora
Pakomáři
S. feltiae
Brouci
H. bacteriophora
Krtonožka obecná S. riobravis, S. scapterisci Kořenoví škůdci
H. bacteriophora, S. carpocapsae
Housenky
S. carpocapsae
6.5.2. Životní cyklus a mechanismus účinku Steinernematidae a heterorhabditidae mají podobný životní cyklus (obr. 30). Infekční juvenilní (IJ) stadia aktivně vyhledávají hmyzího hostitele a způsobují infekci. Jakmile je hostitel lokalizovaný, IJ proniká do jeho tělní dutiny. Většinou proniká přirozenými otvory 45
(ústa, anus, tracheální systém) nebo klasickou penetrací kutikuly. Jakmile se ocitne uvnitř tělní dutiny hostitele uvolňuje ze svého střeva symbiotické bakterie (Xenorhabdus jsou typické pro steinernematidy a Photorhabdus je typický pro heterorhabditidy), ty se rychle uvnitř hostitele pomnoží a způsobují jeho smrt. Hlístovky se živí potravou, kterou jim zprostředkovávají právě jejich symbiotické bakterie, které rozkládají vnitřnosti hostitele a v hostiteli se vyvíjí v dospělce. Steinernematidae jsou většinou gonochoristé, zatímco heterorhabditidae se vyvíjí v hermafrodity. Životní cyklus je dokončen během několika dnů a stovky tisíc nových IJ opouští tělo hostitele a začínají pátrat po nových hostitelích (Obr.31).
Obr. 30: Zjednodušený životní cyklus EPN, (H. Kaya, 2002)
Zdroj: URL 16
Takže hlístovky tvoří se svými symbionty komplex. Vztah těchto dvou organismů je typická symbióza. Hlístovky se vyvíjí a množí v závislosti na tom, jaké podmínky jim vytvoří bakterie. Bakterie dále přispívá svými antiinunitními proteiny k překonání hlístovkám obraných mechanismů škůdců a také brání produkcí antibiotik osídlení mrtvoly hostitele jinými patogeny. Bakterie je naopak na hlístovce závislá tím, že jí poskytuje útočiště a maximálně usnadňuje transport bakterií do hostitele.
46
6.5.3. Relativní účinnost Pěstitelé neradi přijímají biologické kontrolní prostředky, které neprokáží srovnatelné účinky jako chemické pesticidy. Nové technologie produkce, formulace, kontroly kvality, aplikační nastavení a dodej produktů obsahujících hlístovky stejně jako výběr optimálních cílových prostředí a cílových škůdců stále zužuje propast mezi používáním biologických nebo chemických insekticidů. Hlístovky již mnohokrát prokázaly svou účinnost v oblasti zemědělství, zahradnictví, skleníkových plodin apod. EPN jsou pozoruhodně všestranné co se týče jejich použití proti mnoha půdním a skrytým škůdcům v různých přirozených systémech. Jako jiná biologická kontrolní media jsou i hlístovky živé organismy, které pro svou účinnost vyžadují určité optimální podmínky. Jsou citlivé na vysušení a vliv UV záření. Stejně jsou EPN účinné pouze v určitém teplotním rozmezí na rozdíl od chemikálií a požadují optimální vlhkostní půdní podmínky EPN mohou ztratit svou účinnost jsou-li převáženy při velmi vysokých teplotách (nad 28°C) nebo jsou dlouho ponechány v postřikových tancích a jsou neslučitelné s některými průmyslovými hnojivy. Některé druhy nemohou být aplikovány vysokotlakými postřikovači. Chemické pesticidy jsou také některými vlastnostmi nebezpečné: savčí toxicita, rezistence, znečištění podzemních vod, atd.. Rychlá implementace EPN do IPM systémů však bude vyžadovat pěstitele, kteří budou dobře informovaní o jejich efektivním použití.
Vzhled: EPN jsou aplikované a formulované jako IJ, což jsou přirozená volně žijící stadia hlístovek. IJ jsou dlouhá asi 0,4 – 1,1 mm a po separaci z materiálu mohou být viditelné pouhým okem nebo lupou či mikroskopem. Podrážděné EPN se aktivně mrskavě pohybují, i když ve skutečnosti jsou stratégové a na hostitele čekají v úkrytu (například Steinernema carpocapsae, S. scapterisci). V roztoku se brzy vrací do své klidové polohy tvaru písmene „J“. Nízká teplota nebo nízká hladina kyslíku může omezit aktivní pohyb hlístovek (například. S. glaseri, Heterorhabditis bacteriophora), ale omezení pohybu není známkou smrti, pohyblivost může rychle vrátit kyselinou octovou nebo lépe jemným zahřátím). Dobrá kvality EPN se pozná podle úrovně hladiny lipidů, téměř průhledné hlístovky jsou sice aktivní, ale jejich účinnost je nižší. Larvy usmrcených EPN z čeledi Steinernematidae jsou zbarvené do jemně žluté barvy a larvy zabité heterorhabdity mají barvu tmavě červenou až hnědou. A matné světélkování
47
čerstvě zabitých larev je spolehlivý determinační znak (světélkování způsobují symbiotické bakterie). Pokud jsou mrtvoly černé a zároveň u nich probíhá hniloba je jasné, že nebyly usmrceny EPN.
Obr. 31: Detail mrtvé larvy s nově se objevujícími IJ (po 10 dnech).
Zdroj: URL 16
6.5.4. Charakteristické rysy jednotlivých druhů Steinernema carpocapsae: Nejvíce studovaná, dostupná a všestranná EPN. Zvláštní účinky proti larvám z čeledi Lepidoptera včetně různých housenek snovačů dřevních vrtalů apod.. Tento druh je klasickým stratégem využívajícím strategii „sedět a čekat“ nebo přímo napadnou hostitele. Ve vzpřímeném postoji na své zadní části těla číhají na přecházejícího hostitele. Z tohoto důvodu je Steinernema carpocapsae nejvíce infekčním druhem, který byl kdy použit na půdní škůdce. Jsou vysoce citlivé na oxid uhličitý, který produkuje hostitel a spirákula jsou jednou z klíčových vstupních bran do těla hostitele. Nejúčinněji pracují pře teplotě 22 – 28°C. Steinernema feltiae: Primárně útočí na larvy Dipter včetně pakomárů, komárů a tiplic. Tento druh EPN si udrží svou infekčnost i při teplotě půdy pod 10°C. Steinernema glaseri: Je největší EPN má dvojnásobnou délku a osminásobný objem. Atakuje larvy brouků zvláště z čeledi Scarabeidae. Je velmi mobilní a má široký okruh hostitelů. Tento druh je nejlépe přizpůsoben k infekci hostitelů, kteří jsou pomalí a pohybují se v půdním profilu. Polní testy prokázaly, že Steinernema glaseri je schopna nakazit několik druhů škůdců. Její velká tělní velikost snižuje její výnos, což činí tento druh poměrně drahým. Někdy také ztrácí své přirozené symbionty. Steinernema kushidai: Byla izolována pouze v Japonsku a je specifická vůči larvám brouků. Prokázala vysokou laboratorní stabilitu a polní perzistenci. 48
Steinernema riobravis: Tyto nové vysoce patogenní druhy byly zatím izolované pouze v Mexiku a mají několik nových vlastností. Její hostitelský okruh zahrnuje několik hmyzích řádů. Tato přizpůsobivost je schopnost využívat aspekty obou útočníka i prostředky hostitelů. Testy prokázaly účinnost proti kukuřičným housenkám a krtonožkám. V citrusových plantážích se využívá pro kontrolu nad nosatci. Tento druh je schopen tolerovat výkyvy teploty půdy nad 35°C. Toleruje i polovysušené podmínky. Její malá tělní velikost poskytuje velké výnosy při její in vivo i in vitro produkci. Tento druh hlístovky je aktuálně také používán pro kontrolu nad rostlinnými parazitickými hlístovkami ničícími trávníky. Existují tedy korelace, že EPN jsou schopné potlačovat jiné parazitické hlístovky. Steinernema scapterisci: Tento druh se používá v klasické biologické kontrole. Poprvé byla izolována v Uruguaji a používá se pro kontrolu krtonožek. Hlístovky se stávají stabilními a nyní značnou měrou přispívají ke kontrole. Hlístovky mají ideální přístup k hostitelům, kteří tvoří pod zemí tunely a okusují kořeny rostlin. Komerčně dostupný je tento druh od roku 1993 a tento druh se používá jako biologický insekticid díky svým schopnostem vytrvat a poskytovat dlouhodobou kontrolu nad škůdci. Heterorhabditis bacteriophora: Patří mezi nejdůležitější EPN, má značnou přizpůsobivost, útočí na larvy Lepidopter, Coleopter a dalšího hmyzu. Nejvyšší účinnost jeví proti kořenovým nosatcům zvláště proti černému nosatci révovému. Nejvyšší účinnost poskytuje při teplotách pod 20°C. Charakteristická je slabá stabilita, která omezuje její použitelnost, skladovatelnost je také problematická a IJ v polních podmínkách vydrží pouze několik dní. Heterorhabditis megidis: Poprvé byla izolována v Ohiu a prodává se v západní Evropě pro kontrolu nad Nosatcem révovým a různým dalším druhům půdního hmyzu. Je poměrně velká, mírně nestabilní, což opět omezuje její použitelnost.
6.5.5. Citlivost na pesticidy IJ jsou slučitelní s mnoha, ale ne všemi průmyslovými hnojivy. Heterorhabditis bacteriophora je nejcitlivější EPN k fyzickému stresu, je citlivá k 58 ze 75 testovaných fungicidů, herbicidů, insekticidů a nematicidů. Z toho plyne, že EPN by měla být účinkům těchto prostředků vystavena pouze po krátkou dobu. Chemikálie by měly být používané pouze opatrně nebo lépe se jim vyhnout.
49
6.6. Prvoci a Microsporidia Prvoci jsou jednobuněčné formy života. Některé druhy jsou odpovědné za závažná onemocnění člověka, jako je malárie přenášená komáry. Existuje 1200 druhů z 15 000 popsaných druhů, způsobujících onemocnění hmyzu. Skupina Microsporidia poskytuje slibnou biologickou kontrolu. Infekce hmyzu Microsporidii je považována za běžnou a přirozeně se vyskytující kontrolu hmyzu. Jejich účinky jsou však relativně pomalé, k usmrcení hostitele potřebují dny až týdny. Často spíše omezují hostitele sterilizací nebo nechutenstvím než by je usmrtily. Microsporidia mají široký hostitelský okruh. Některé druhy jsou studované jako vhodné bioinsekticidy a jeden je i komerčně k dispozici, ale je ještě potřeba zdokonalit technologii použití těchto organismů.
6.6.1. Mechanismus působení Aby mohlo dojít k infekci je nutné, aby hostitel prvoka pozřel. Existuje i vnitřní přenos v populaci škůdců nebo přes parazitoidy nebo predátory. Do tělní dutiny se patogen dostane přes střevní stěnu, šíří se k různým orgánům a tkáním, množí se a způsobuje tkáňová selhání nebo infekci krve.
6.6.2. Symptomy Infikovaný hmyz je vysílený, menší než normální, což je způsobeno redukcí krmení a reprodukce. Smrt nastane pouze je-li infekce vysoká. Výhodou infekce tohoto typu je, že oslabený hmyz je náchylnější k nepříznivým podmínkám a dalším úmrtnostním faktorům.
6.6.3. Charakteristické rysy jednotlivých druhů
Nosema pyrausta (=Perezia pyraustae) infikuje několik druhů hmyzu. Infekce se může šířit na zdravé larvy kontaminovanými výměšky larev a pohybem infikovaných larev po okolí. Nosema locustae je jediný komerčně dostupný druh, pro kontrolu nad kobylkami a krtonožkami. Aplikuje se s atraktantem, který působí jako hmyzí návnada. Kvůli jeho
50
pomalému mechanismu působení se více hodí k dlouhodobější kontrole než k intenzivní rychlé kontrole. Jiné druhy Nosema infikují pavouky, housenky snovačů. Vairimorpha necatrix je další mikrosporidium s komerčním potenciálem. Má široký hostitelský okruh housenek škůdců, včetně zavíječe kukuřičného atd.. Může být více virulentní než jiné druhy a nakažený hmyz umírá po šesti dnech po infekci.
6.7. Kombinované alternativní prostředky Jednou z biologických alternativ na cestě k integrovanému systému ochrany je užití přirozených nepřátel hmyzích škůdců a tím následně i podpora a rozšíření agro-biodiverzity. V boji proti půdnímu hmyzu je nutno využít bioagens přizpůsobených k půdním podmínkám. Jedinečné vlastnosti poskytují entomopatogenní houby a hlístovky, které se v půdě běžně vyskytují a jsou schopny působit na širokou škálu hmyzích řádů Coleoptera, Lepidoptera, Diptera, Orthoptera atd.. Koncept ochrany je založený na spolupůsobení entomopatogenních hlístovek a entomopatogenních hub a jeho snahou je vytvořit biointenzivní integrovanou ochranu proti významným škůdcům polních a skleníkových kultur. Případná kombinace entomopatogenních hlístovek s jinými organismy využívanými v biologické ochraně jako např. s entomopatogenními houbami (Deutoromycetes) by mohla vést k synergistickému účinku, který by zvýšil potenciál biologické ochrany proti hmyzím škůdcům. Jak houby tak hlístovky vlastní širokou navzájem se překrývající škálu potencionálních hostitelů (Poinar, 1979), vyskytují se přirozeně v půdě a způsobují u hmyzu epizoocie za vhodných podmínek. Jestliže budeme aplikovat obě agens současně, mohly by oba organismy svým nezávislým působením vytvořit aditivní efekt. Výsledkem jejich kombinace by mohl být více (synergistický efekt) či méně (antagonistický efekt) účinný než v případě aditivního vlivu. Příkladem aditivní (synergistické) kombinace jsou pokusy s hlístovkou Heterorhabditis bacteriophora (Poinar) a houby Bauveria bassiana (Vuill Balsamo) proti můře Spodoptera exigua (Hűbner) (Barbecker a Kaya, 1991) či Steinernemy carpocapsae (Weiser) s Bauverií brongniartii (Saccardo) proti larvám brouků Ectinohoplia rufipes (Motschulsky) a Exomala orientalis (Waterhause) z čeledi Scarabidae (Choo a kol., 2002) mortalita larev byla vyšší, než ta která byla způsobena pouze jedním z organismů.
51
7. Firmy a jejich produkty na dnešním trhu 7.1. Úvod Bezpečí, výhody a spolehlivost jsou důležité charakteristické rysy
nejmodernější
ochrany rostlin. Sofistikované systémy ochrany rostlin vyvinuté firmami, které jsou na dnešním trhu běžné zajišťují spolehlivý biologický přístup ve formě produktů, které obsahují pouze čistě biologické organismy. Výrobci nabízí široký sortiment produktů, který odpovídá mezinárodním jakostním normám. Postupy prověřené několikaletou praxí zabraňují nepříjemným problémům spojeným s působením škůdců na plodinách během období jejich růstu a tvoří základy pro minimální používání pesticidů. Škůdce si proto není schopen vyvinout rezistenci proti svým přirozeným nepřátelům. Produkty vyvinuté těmito firmami položily základ pro ekologické řešení otázky účinné a všestranně bezpečné ochrany rostlin a plodin nejrůznějších druhů. Dnešní trh se již pomale zaplňuje firmami, které zaměřují svou činnost právě na biologickou ochranu rostlin a podporují svou propagací rozšíření této metody mezi pěstitele a zemědělce. Formou různých bioseminářů a školení poskytují zájemcům základní důležité informace, které jsou nezbytné pro správné zacházení s jejich produkty. Cílem těchto bioseminářů je v první řadě důkladné seznámení účastníků s ukázkami a preparáty škůdců. Kromě toho jsou seznámeni i se vztahy mezi škůdci a užitečnými organismy, vztahy s rostlinami a vlivem prostředí na výskyt chorob a škůdců.
52
V následují tabulce je stručný přehled nejznámějších firem a jejich produktů: (více na: www.COST850.ch).
53
7.2. Andermatt BIOCONTROL AG Jedna z nejznámějších švýcarských firem, která pěstuje a distribuuje již mnoho let entomopatogenní hlístovky, které napadají jen určitého hmyzího hostitele. Hmyz má mnoho přirozených nepřátel a jedním z nich jsou i EPN. Tyto hlístovky jsou velmi malé a jakmile jsou aplikovány, zaútočí na larvy hmyzu, které se vyvíjejí v půdě. Hlístovky napadají pouze své hostitelské druh hmyzu, proto neexistuje žádné riziko pro uživatele, užitečný hmyz nebo domácí zvířata. (více na: www.biocontrol.ch). Názvy produktů se shodují s názvem hlístovky, kterou obsahují: Heterorhabditis megidis: Patří mezi přirozené nepřátele hmyzu, který škodí na kořenovém systému rostlin (např: Hepialus lupulinus). Čas aplikace: Duben/červen nebo koncem srpna do poloviny října. Teplota půdy by měla být > 10°C. Aplikační poměr: 0.5 milionu jedinců/m2.
Dospělé mušky druhu Delia radicum jsou pro kořeny rostlin neškodné, naopak jejich larvy mohou poškodit rostlinu požíráním jemných kořenů mladých sazenic. Larvy těchto mušek mohou být velmi efektivně kontrolovány entomopatogenními hlístovkami rodu Steinernema feltiae: Čas aplikace: V období, kdy je teplota půdy > 12°C. Aplikační poměr: 0.5 milionu jedinců/m2.
Pokud se populace krtonožek vyskytuje ve velkých množstvích, pak mohou být příčinou poškození zeleniny a dalších rostlinných kultur. Krtonožky přezimují v kultivačních nádobách a kompostech, kde jsou nejvhodnější podmínky pro jejich vývoj. Hlístovka druhu Steinernema carpocapsae je přirozeným nepřítelem krtonožek. Pomocí těchto hlístovek mohou být populace krtonožek redukovány na přijatelnou míru během několika dní. Čas aplikace: Duben – květen. Aplikační poměr: 0.5 milionu jedinců/m2.
54
7.3. e-nema S heslem: Produkty pro profesionály. Pro pohodlí svých zákazníků jsou jejich produkty rozčleněny do několika kategorií: Okrasné a užitkové rostliny na poli. Okrasné a užitkové rostliny ve sklenících. Houbové kultivace. Trávník. Detailní informace o produktech je možné získat na: www.e-nema.de.
7.3.1. Okrasné a užitkové rostliny na poli Nematop ® Obsahuje entomopatogenní hlístovky druhu Heterorhabditis bacteriophora působí proti černému révovému nosatci Otiorhynchus sulcatus a Hepialus lupulinus (ghost moth) . Oblast použití: Rododendron, jahody, lesní školky. Nejlepší čas pro ošetření: Konec března až konec května a od srpna do začátku října (teplota půdy by měla převyšovat 11°C alespoň po několik hodin každý den).
Nemastar ® Obsahuje emtomopatogenní hlístovky druhu Steinernema carpocapsae působící
proti
krtonožce Gryllotalpa gryllotalpa a housenkám rodu Agrotis spp. Oblast použití: Zelenina a okrasné rostliny. Nejlepší čas pro ošetření: krtonožky: duben až červenec, housenky: červen až srpen (teplota půdy by měla převyšovat 12°C alespoň po několik hodin každých den).
7.3.2. Okrasné a užitkové rostliny ve sklenících
Nemaplus ® (Obr. 32) Obsahuje entomopatogenní hlístovky druhu Steinernema feltiae působící proti larvám čeledi Sciaridae a larvám Bibio hortulans.
55
Oblast použití: V množírnách, zimní zahrady a pokojové rostliny. Nejlepší čas pro ošetření: Celý rok (teplota půdy 8 až 28°C).
(Obr. 32) Ukázka obalu produktu. Zdroj: URL 21.
Nemaflor ®
Obsahuje entomopatogenní hlístovky druhu Steinernema feltiae působící proti třásněnkám rodu Frankliniella occidentalis. Oblast použití: Kdekoli v kombinaci se zavlažováním. Nejlepší čas pro ošetření: Po celý rok po výsadbě nových kultur (teplota ve skleníku 8 28°C).
7.3.3. Houbová kultivace Nemacel ® (Obr. 33)
Obsahuje entomopatogenní
hlístovky druhu Steinernema feltiae působící proti larvám
komárů napadajících houby. Oblast použití: V množírnách hub po zakrytí. Nejlepší čas pro ošetření: Po celý rok.
56
Ukázky obalů některých produktů:
(Obr. 33) Ukázka obalu produktu. Zdroj: URL 21.
7.4. Becker Underwood NEMASYS Nemasys® Kontrolní prostředek proti komárům, skleníkovým muškám, třásněnkám a larvám minujících v listech (leafminer) v rozsahu: od polních plodin, okrasných rostlin až po zeleninu. Produkt obsahuje patogenní hlístovky Steinernema feltiae. Nemasys rychle napadne a zničí škodlivý hmyz předtím, než zničí rostliny. Nemasys se snadno používá a je úplně bezpečný pro použití, nepředstavuje žádnou hrozbu pro lidi ani uživatele, pro rostliny nebo užitečný hmyz. Výhody: · rychle působí na škodlivé larvy v době aplikace. · předchází problémům dříve než se projeví. · trvalý v růstovém prostředí poskytujícím ochranu proti reinfekci škodlivými larvami. · snadná aplikace používající rozprašovačů, zavlažování postřikem. · slučitelný s velkou řadou chemických pesticidů. · žádné problémy s rezistencí hmyzu. · přirozený produkt, který je bezpečný uživatelům, spotřebitelům a prostředí . · slučitelný s dalšími biologickými systémy. · netoxický bez požadavků na ochranný oděv.
57
NEMATAC S Nematac S obsahuje entomopatogenní hlístovky Steinernema scapterisci, které biologicky hubí krtonožky. Nematac S rychle napadne a zničí dospělé krtonožky a pozdní larvální stádia předtím, než zničí trávník. Nematac S se snadno používá a je úplně bezpečný, nepředstavuje žádnou hrozbu k lidem, trávníku ani užitečnému hmyzu. Pracuje na stejném principu jako předešlý výrobek i se stejnými výhodami. Více informací na: (www.beckerunderwood.com).
7.5. Koppert Firma Koppert má svého zástupce i v České republice. Její distribuční partner BIOCONT laboratory má své sídlo v Brně ( více na: www.biocont.cz).
(Obr. 34) Ukázka obalů produktů. Zdroj: URL 22.
ENTONEM - Steinernema feltiae Balení: Steinernema feltiae ENTONEM: balení obsahuje: 50 milionů larev (třetí stadium) v intaktním materiálu. Cíl škůdce: Larvy mušek (Sciarid flies) (Sciaridae). Příprava: •
Obsah balení umístíme do vědra s obsahem 5 l vody (15 - 20°C).
•
Dobře promíchat a nechat roztok dobře rozpustit po dobu asi 20 - 30 sekund.
•
Znovu dobře promíchat a vlít do postřikovací nádoby.
•
Doplnit požadovaným množstvím vody.
•
Aplikovat ihned po přípravě.
58
•
Použijte celé balení najednou, distribuce hlístovek v balení není homogenní!
Podmínky prostředí · vlhkost půdy musí být vysoká. · teplota půdy mezi 13 - 25°C. Uskladnění a zacházení · skladovací teplota: 2 - 6°C. · ve tmě. Vizuální účinek Infikovaný hmyz zežloutne a stane se slizkým. Napadení škůdci jsou poté v půdě snadno rozpoznatelní.
SCIA - RID - Steinernema feltiae Balení: Steinernema spp., velikost balení: balení obsahuje: 8 x 50 milionů larev (třetí stadium) v netečném materiálu. Cíl: Larvy mušek napadajících houby (Sciarid flies). Podmínky prostředí: Obal by měl být vlhký a teplota by neměla přesahovat 28°C. Vizuální účinek: Stejný účinek.
CAPSANEM - Steinernema carpocapsae Balení: Steinernema carpocapsae, CAPSANEM balení obsahuje: 50 milionů larev (třetí stadium) v netečném materiálu. Cíl · Krtonožky. Příprava řešení · Stejný postup. Podmínky prostředí · Vysoká vlhkost půdy. · Teplota půdy 12 - 32°C. · Hlístovky jsou velmi náchylné k ultrafialovému světlu (UV). · Listové aplikace by měly být prováděna večer. Vizuální účinek: Stejný účinek.
59
8. Experimentální část: Izolace entomopatogenních hlístovek z půdy
60
8.1. Úvod Základní metodika práce zahrnuje všechny aspekty od nálezu entomopatogenních hlístovek (EPN, EPNs) v přírodě, přenesení do laboratoře, přes kultivaci až po přípravu trvalého preparátu. K nejvýznamnějším směrům výzkumu EPNs patří jejich využití proti hmyzím škůdcům. Proto je velmi důležitá znalost jejich rozšíření v určitém areálu, ale také úspěšná izolace EPNs buď z napadeného hostitele, nebo z půdy či vodního prostředí. Hlavní vztah EPNs k hostiteli je dán vztahem k prostředí, kterým parazit proniká za kořistí. Výskyt v přírodě poskytuje zhodnocení jejich potenciálu jako parazitů škůdců. Izolaci druhů EPNs je možné provádět nejrůznějšími metodami, od sběru napadených škůdců a to jak suchozemských tak i vodních, používání hmyzí návnady až po sběr půdních vzorků. Právě izolace druhů EPNs z různých půdních vzorků bylo náplní praktické části mé Diplomové práce. Při sběru suchozemských druhů škůdců jsou nacházeni již pouze mrtví hostitelé, protože průběh nákazy je velmi rychlý (několik dnů). V tělní dutině jsou poté nacházeny obří generace dospělých forem a velké množství pohyblivých invazních larev. Poznat v terénu zda jde o nákazu zrovna EPNs je však velmi obtížné. Housenky je možné poznat na základě několika znaků: housenky tmavnou a někdy se na kutikule objevují tmavé pigmentové skvrny. Mrtvé tělo se postupně svrašťuje, je měkké a poddajné, tak jak je postupně rozkládám tělní obsah, především tukové těleso. Jinou možností získání druhů EPNs v přírodě spočívá v nastražení hmyzího hostitele jako návnady pro invazní larvy EPNs přirozeně se vyskytujících v půdě. První aktivní přístup k této metodě publikovali Bedding a Akhurst (1975). Kladli na nejrůznějších lokalitách do jamek v zemi 5-10 housenek zavíječe voskového, Galleria mellonella, které jsou známé jako velice vnímavé k parazitaci EPNs. Pokud půda obsahovala EPNs pak většina housenek zahynula s typickými příznaky nákazy. Tuto metodu zjednodušil a prohloubil Prof. Weiser (1980) a popsal ji jako metodu Galleriových pastí. Postup metody viz- kapitola Materiál a metody.
61
8.2. Materiál a metody 8.2.1. Živočišný materiál V experimentální části jsem se pokusila izolovat různé druhy entomopatogenních hlístovek (EPN, EPNs). Všeobecně jsou EPN druhu Heterorhabditis a Steinernema efektivní biologické prostředky pro ochranu rostlinných plodin proti půdním hmyzím škůdcům. Jejich juvenilní stadia mají schopnost vyhledat a usmrtit svého hmyzího hostitele. Jejich výhodnými vlastnostmi je jejich možné použití v kombinaci s mnoha chemickými nebo biologickými ochrannými prostředky, jednoduchá aplikace pro použití v praxi dále široká škála hostitelů a vysoká bezpečnost pro obratlovce a necílové organismy.
8.2.2. Stručná charakteristika Hlístovky ( Nematoda) mají základní tvar těla válcovitý, protáhlý až nitkovitý. Délka těla EPNs nalezených v mrtvolách hmyzu je značně proměnlivá. Např. u čeledi Steinernematidae kolísá u dospělců od 1 do 10 mm. EPNs jsou bilaterálně souměrné. Povrch těla je bez segmentace a přívěsků. Smyslová ústrojí (papily a smyslové pysky) mají soustředěno kolem ústního otvoru. Třívrstevná kutikula, hypodermis a podélné svaly tvoří elastickou trubici, která uzavírá druhotnou tělní dutinu – pseudocoel. V dutině jsou uložené trubicovité párovité gonády a zbytek tvoří trávící trubice. Tělo EPNs je velmi ohebné, umožňuje provádět vlnivý a plazivý pohyb, kterým EPN proniká půdou a plave. Invazní larvy některých druhů jsou schopné vztyčit se na ocasní části a provádět mávavé pohyby, sloužící ke snadnějšímu vyhledání hostitele. (viz Parazitické hlístice hmyzu, Mráček, Weiser, 1988, Academia).
8.2.3. Význam EPN
EPNs, jakkoli jsou sami o sobě snadno zranitelné a křehké, mají jako skupina jedno společné – velice obratně se přizpůsobují podmínkám prostředí, při úsilí o přežití a o úspěšný přenos na svého hostitele. S velkým množstvím se setkáváme ve volné přírodě, a to ve vodě a v půdě. Rozšíření v půdě je velmi ovlivněno půdní vlhkostí, protože snadno vysychají a
62
hynou. Mnoho půdních EPNs se vyskytuje v březích vodních toků, protože vedle vlhkosti, která navíc umožňuje jejich pohyb v půdě, potřebují také kyslík pro dýchání. U škůdců, kteří napadají zemědělské monokultury se vyskytují EPNs, které početnost hmyzích populací snižují, žijí na jejich úkor a vytvořily si zcela specifický způsob přenosu od hostitele k hostiteli a adaptovaly se na život v těle hostitel. Každý živočich žijící na Zemi má svého přirozeného nepřítele a hmyzí škůdci nejsou výjimkou, právě EPNs jsou přirozenými parazity hmyzu. Tento fakt je právě podstatou boje proti škůdcům zemědělských plodin a to přirozenou cestou za vynechání různých chemických postřiků a insekticidů, které kontaminují životní prostředí kolem nás. Člověk porušil rovnováhu přírody změnou podmínek rozvoje krajiny. Vytváří rozsáhlé komplexy jediného druhu plodiny nebo stromů, a tím umožňuje nepřiměřený rozvoj škůdců. Výzkum EPNs je zaměřen hlavně na parazity zemědělských plodin a na parazity živočichů včetně člověka. EPN mají několik výhod, které byly označeny za komerčně hodnotné činitele využitelné v biologickém boji s hmyzími zástupci. Jsou vysoce efektivní a často předčí výsledky chemických prostředků. Na rozdíl od chemikálií, které jsou z půdy odplavené vodou nebo se během několika dní rozpadají, jsou EPNs pohyblivé a perzistentní (v půdě stálé). V půdě mohou za vhodných podmínek přežít i několik let. Obnovují se uvnitř hostitele, působí tedy dlouhodobými účinky na hmyzí populace (Peters, 1996). Používání EPN je bezpečné pro obě strany, pro uživatele i pro životní prostředí. Mají velmi nízké škodlivé účinky na necílové skupiny hmyzu a žádné EPNs, ani jejich symbiotické bakterie nezpůsobují škodlivé účinky proti savcům nebo rostlinám (Bathon, 1996; Ehlers a Hokannem, 1996). EPN mohou být po nějakou dobu uskladněny, což usnadňuje jejich prodej. Invazní larvy jsou odolné vůči aplikaci pomocí rozprašovače, proto je možná i aplikace sprejem. Dnes jsou EPNs používány hlavně v prostředích, kde chemické prostředky selhávají, tj. v půdě, v oblastech s obtížným hmyzem nebo tam, kde se rozvinula rezistence hmyzu vůči chemickým insekticidům (Ehlers, 2001).
8.2.4. Způsob nákazy EPNs jsou svými vývojovými cykly přizpůsobeny k tomu, aby se udržely ve svém hostiteli nebo v blízkém okruhu (obr. 35). K tomu se vytvořily specifické vývojové cykly, které přivádějí vždy invazní stádia nadosah jejich hostiteli. EPNs parazitující hmyz jsou
63
schopné aktivně vyhledat hostitele a pronikat do jeho tělní dutiny v larválním, pupálním i dospělém stádiu.
Obr. 35: Životní cyklus EPN rodu Steinernema a Heterorhabditis (upraveno podle Gaugler&Kaya, 1990).
64
Invazní larvy EPNs jsou přítomny v zemi, aktivně se pohybují a pokud naleznou vhodného hostitele, pronikají do jeho těla některým z jeho otvorů. Nejčastěji je vstupní branou ústní otvor, kam se invazní larvy dostávají s potravou, nebo řitní otvor. Přes střevní stěnu se EPNs dostávají do tělní dutiny, tady uvolňují ze svého střeva symbiotické bakterie (čeleď Steinernematidae - bakterie rodu Xenorhabdus, Heterorhabditidae - bakterie rodu Photorhabdus), během několika hodin zabíjejí svého hostitele a za 2 – 4 dny, podle teploty, dospívají do první generace. Wouts (1979) uvádí, že již za dvě hodiny po nákaze jsou EPNs v ústní dutině, přední části trávící trubice, v hlavě a v zadní části tukového tělesa. Z nakladených vajíček se líhnou larvičky, které se vyvíjejí již v mrtvém hostiteli. Po opuštění původního hostitele hledají ihned hostitele nového. K vyhledávání hostitele používají různé strategie.
8.2.5. Odběry půdních vzorků Základem praktické části Diplomové práce bylo shromáždit několik desítek vzorků půdy a pokusit se izolovat EPNs. Vzorky jsem shromažďovala za pomocí mých kolegů z nejrůznějších lokalit (tabulka) s cílem vyzkoušet si metodiku zpracování vzorků získaných z těchto lokalit, nejednalo se však o žádný cílený výzkum určitého území. Důležité bylo dodržení několika zásadních pravidel odběru vzorků. Optimální teplota pro správnou aktivitu EPNs je 18 – 20°C, proto je ideálním obdobím odběrů půdy podzim nebo jaro. Při vyšších teplotách EPNs zalézají níž do půdy. A naopak při podchlazeném stavu jsou méně aktivní. Ideální je také odebírat vlhkou půdu, případně po dešti nebo zrána, dokud není vysušená. Ve vysušené půdě EPNs nepřežívají, protože vysychají a navíc jim vlhké půdní prostředí usnadňuje pohyb půdním profilem. EPNs se nejčastěji vyskytují v hloubce asi 15 – 25 cm pod povrchem. Proto nemá smysl odebírat vzorky z povrchu půdy. Je nutné vykopat jamku a odtud odebrat asi 0,5 – 1 kg půdy (Obr. 36), zde je půda vlhčí. Vzorek půdy je možné skladovat i přepravovat např. v plastikových sáčcích apod. (Obr. 37). Při skladování delší dobu je nutné dbát opět na udržování optimální vlhkosti, aby půda nevyschla. Nutný je také přístup vzduchu, proto je potřeba nechat sáček otevřený, aby nedošlo k zapaření půdy. Poté dopravit do laboratoře k dalšímu zpracování.
65
Obr. 37: Půdní vzorek
Obr. 36: Odběr vzorku půdy
8.2.6. Laboratorní zpracování Nasbírané vzorky půdy se umístí zvlášť do jednotlivých boxů (objem 1-3 l), které je možné uzavřít víkem, tzv. galleriová past (Obr. 38). Boxy se naplní z větší části hlínou a přidají se larvy VII. instaru Galleria melonella. Přidávalo se asi 4 – 5 housenek. Poté se krabičky uzavřely víkem a otočily víkem dolů. Otočení provedeme z důvodu, aby larvy neunikly ven z krabičky. Takto připravené boxy se nechaly uzavřené při teplotě asi 20°C po dobu 3 – 5 dnů. K usmrcení housenek dochází již po 24 – 48 hodinách od nákazy EPNs. Po této inkubační době se jednotlivé boxy vysypaly na plato a vyhledávaly se vložené larvy. Pokud půda obsahovala např. EPNs, pak byly ve vzorku půdy nalezeny mrtvé larvy Galleria melonella, které byly do půdy vloženy před 3 – 5 dny. V půdě nalezené mrtvoly housenek se uložily na tzv. vodní past (Obr. 39). Vodní past je Petriho miska (průměr 9 cm), na jejímž dně je položené filtračním papírem obalené hodinové sklíčko. Filtrační papír i dno Petriho misky se zvlhčí 1% roztokem formaldehydu. Formaldehyd se do roztoku přidává z důvodu desinfekce, v dané koncentraci není pro EPN toxický. Důležité je, aby byl povrch filtračního papíru vlhký, nikoli mokrý, jinak podle získaných zkušeností dochází k brzkému hynutí invazních larev a kontaminaci již nakažených housenek nevhodnými bakteriemi. Na této vodní pasti jsou larvy uchovány po dobu 3 – 5 dnů s tím, že Petriho miska se musí kontrolovat, aby nedošlo k vyschnutí vnitřního prostředí, což by znamenalo pro případné EPNs smrt.
66
Obr. 38: Galleriová past
Obr. 39: Vodní past
Invazní larvy EPNs, které asi po 10 dnech vyputují z těla mrtvého hostitele, se rozlézají po filtračním papíře a nakonec se hromadí v tekutině na dně Petriho misky. Odtud je možné je po čase vyjmout a uskladnit, buď celou Petriho misku nebo slít do zásobní láhve, v lednici. Je vhodné vhodit do roztoku kousky porézního materiálu (molitan), který slouží jako simulace pórovitosti půdy a funguje tedy jako „útočiště“ pro larvy. Takto uskladněné invazní larvy vydrží živé několik měsíců.
8.2.7. Determinace invazních larev Invazní larvy je možné pozorovat a fotografovat pomocí preparačního mikroskopu. Vzorky, ve kterých se vyskytly invazní larvy byly odeslány na determinaci druhu EPN. Byly poslány na Oddělení experimentální ekologie Entomologického ústavu, Biologického centra AVČR, v.v.i. do Českých Budějovic, kde za velmi ochotné spolupráce, pan Mgr.Vladimíra Půža a RNDr. Zdeněk Mráček DrCs. determinovali jednotlivé druhy.
67
9. Vyhodnocení Vzorky, které jsem získala jsou uvedeny v tabulce, pochází z nejrůznějších lokalit ČR. Převládá oblast Pouzdřanské stepi, kterou jsem zařadila na doporučení RNDr. Zdeňka Mráčka DrCs., který zde dříve zaznamenal výskyt EPN (viz Diskuse a závěr). Tuto oblast jsem důkladněji prozkoumávala i z důvodu možného výskytu druhu Steinernema bicornutum. Bohužel tento druh EPN se mi nepodařilo izolovat. Stejně tak se mi nepodařilo izolovat ani zástupce rodu Heterorhabditis.
Jedním z důvodů by mohlo být, že druhy rodu
Heterorhabditis jsou u nás poměrně vzácné. Další oblasti sběru vzorků jsou zcela náhodné. Oslovila jsem většinu kolegů, kteří byli ochotní a přispěli do mé sbírky vlastním vzorkem půdy z oblastí svého bydliště nebo okolí. Takže výběr lokalit pro sběr byl zcela náhodný. Součástí kolekce vzorků, které jsem získala z různých oblastí jsou i vzorky ze zahraničí, které jsem v tabulce neuváděla. Vzorky pocházely ze švédského Stockholmu, finského města Turku a z chorvatského pobřeží (Trogir), ale bohužel tyto vzorky byly na přítomnost EPN negativní. Všichni kdo přispívali vzorky půdy byli dobře informováni a vhodném způsobu odběru půdního vzorku. Veškeré příspěvky, které jsem obdržela splňovaly kritéria odběru, a proto jsem je dále zpracovávala podle postupu popsaného výše. Praktickou část své Diplomové práce, i když nemusí být povinnou součástí, jsem zpracovávala hlavně z důvodu vyzkoušet si metodiku odběru půdních vzorků a izolace různých druhů EPN. Metodika odběru a zpracování půdních vzorků není nijak obtížná jen je důležité dodržet základní podmínky, aby byla zachována kvalita vzorku. Zpracování není náročné na vybavení laboratoře ani na přístrojové vybavení laboratoře.
68
Přehled vzorků
Číslo vzorku 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29.
Lokalita Brno – Maloměřice I. - zahrada Brno – Maloměřice II. - zahrada Hradec Králové I. Hradec Králové II.- borový les Kamenice u Jihlavy - pole Kamenice u Jihlavy - zahrada Kunčice pod Ondřejníkem – bývalý kompost Martinice (Kroměříž) - zahrada Ostrožská Nová Ves Pouzdřany – cesta na step Pouzdřany – les Pouzdřany – lesní cesta Pouzdřany – step Pouzdřany – step Pouzdřany – step vrchol Pouzdřany – vinice Pouzdřany – vinice strom Stropešín I. (Třebíč) Stropešín II. (Třebíč) – zahrada vpravo Stropešín II. (Třebíč) – les Stropešín II. (Třebíč) – lesní rokle Stropešín II. (Třebíč) – před stodolou Stropešín II. (Třebíč) – zahrada vlevo Vedrovice (Znojmo) - les Vedrovice (Znojmo) - sad Vedrovice (Znojmo) - rybník Vedrovice (Znojmo) – lesní cesta Valašské Meziříčí - pařeniště Valašské Meziříčí - zahrada
Výsledek ------------------------------------Steinernema feltiae S. feltiae, S. silvaticum ------------------------------------Diplogasteridae ------------------------------------Steinernema feltiae ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Steinernema feltiae ------------------------------------Steinernema feltiae ------------------------------------Steinernema feltiae -------------------------------------------------------------------------------------------
Fotografie jednotlivých izolovaných druhů jsou přiloženy ve fotodokumentaci. Fotografování jednotlivých izolátů jsem prováděla na: • Optickém mikroskopu OLYMPUS, BX 40 (Digitální kamera JVS KY-F1030 U, software Quick photo micro), • Preparačním mikroskopu OLYMPUS SZX 9 s binokulárním osvětlením OLYMPUS KL1500ZCD • Fotoaparátu OLYMPUS C-765
69
9.1. Diskuse a závěr Celkem jsem zpracovávala 29 půdních vzorků z náhodně vybraných lokalit, neboť cílem této praktické části DP bylo vyzkoušet si metodiku izolace EPNs z půdních vzorků podle výše popsaného postupu (zpracovat půdních vzorků metodou galleriových pastí a dále pomocí tzv. vodní pasti). Šest půdních vzorků ze 29 vzorků (20,7%) získaných z různých lokalit ČR bylo pozitivních na přítomnost EPNs. Jedná se o lokality okolí Hradce Králové, kde ve vzorku I. byla izolována a následně determinována S. feltiae a ve vzorku II. z lokality borového lesa, zvané „Borovinka“ byla izolována dokonce směs dvou druhů EPNs S. feltiae a S. silvaticum. Vzorek byl odebírán několik desítek metrů od břehu písníku na okraji borového lesa. Další významnou lokalitou byla Pouzdřanská step. Tato oblast byla již dříve zkoumána RNDr. Zdeňkem Mráčkem DrCs. Na jeho doporučení jsem i já z této oblasti vzorky sbírala a úspěšně, byl zde izolován druh S. feltiae. Na EPNs pozitivní oblastí se ukázala být oblast obce Stropešín (Stropešín I.) v okrese Třebíč. Kde byl prokázán opět výskyt druhu S. feltiae. Tyto vzorky byly odebírány ze zahrady a místa bývalého kompostu. Ve vzorku Stropešín II. v lokalitě nazývané lesní rokle („Na hadance“) byl nalezen také druh
S. feltiae. Další pozitivní oblastí se ukázala být lokalita Vedrovice (okres Znojmo), kde byla z půdy odebrané v dubovém lese izolována opět S. felatiae. Z čeledi Heterorhabditidae se mi nepodařilo izolovat žádný druh. Druhy z této čeledi jsou všeobecně velmi málo rozšíření ve srovnání s druhy čeledi Steinernematidae. V některých vzorcích půdy byly přítomny saprofytické druhy čeledi Diplogasteridae, tyto se na zabití larev škůdců nepodílí. Zdeněk Mráček, Stanislav Bečvář a Pavel Kindlmann provádějí na území ČR mapování fauny EPNs. Z výsledků jejich průzkumů je velmi jasné jaké druhy se na našem území vyskytují nejčastěji a které patří mezi vzácné druhy. Půdní vzorky byly sbírány z celého území ČR a přítomnost EPNs čeledi
Steinernematidae a Heterorhabditidae byla zjišťována pomocí metody Galleriových pastí. Z celkového počtu 342 studovaných vzorků bylo 53,8% pozitivních na přítomnost EPNs s jedním pozitivním na přítomnost druhu z čeledi Heterorhabditidae, Heterorhabditis megidis (Poinar, Jackson et Klein, 1987). Z čeledi Steinernematidae byly zaznamenány druhy S.
kraussei (Steiner, 1923), S. feltiae (Filipjev, 1934), S. affine (Bovien, 1937), S. intermedium (Poinar, 1985), S. bicornutum (Tallosi, Peters et Ehlers, 1995) a Steinernema sp. náleží do skupiny „glaseri“. Kromě několika výjimek se EPNs vyskytují ve všech ekosystémech, subekosystémech a prostředích. Častěji se však vyskytují ve stromových porostech než na
70
otevřeném prostranství, spíše v lehčích půdách a jejich výskyt byl spíše všudypřítomný. Závislost EPNs na výskytu hmyzu se zdá být jednoduše na obojím, na jeho výskytu i na hustotě. Oblasti s průměrnou a vysokou hustotou hmyzu byly pozitivní na výskyt EPNs v 66,5%, zatímco oblasti s nepatrnou hustotou hmyzu jen v 15%. Projekt evropského mapování EPN poskytl mnoho dat o distribuci EPN hlavně na západě a severu Evropy (Ehlers et al., 1991, Hominick a Briscoe, 1990a, Steiner, 1996, Vänninen et al., 1989, Haukeland, 1993). Cílem tohoto programu je vytvořit evropskou síť distribuce EPNs k determinaci druhů a k hledání obecných vztahů mezi půdním typem a preferenci typu prostředí výskytu. Tyto EPNs jsou široce rozšířená v Evropě, ale do dnešní doby nebylo mnoho informací o rozšíření heterorhabditidů a steinernematidů ve střední (Mráček, 1980) a východní Evropě (Mráček a Jenser, 1988), stejně jako o významu hustoty hmyzích populací souvisejícím s výskytem EPNs. Studie je zaměřená na průzkum EPNs
čeledi Heterorhabditidae a Steinernematidae v ČR, k identifikaci druhů, preferenci ekosystému, prostředí a půdního typu a na možnost studovat vztahy mezi výskytem EPNs a hustotou hmyzu. Pouze jedna z oblastí sběru půdních vzorku byla obývána druhem Heterorhabditis
megidis (Poinar, Jackson a Klein, 1987). Ostatní získané izoláty patří k rodu Steinernema (Travassos, 1927). Z těchto druhů byly nejfrekventovanější S. kraussei (Steiner, 1923) – 16,8% převládající v zalesněném prostředí a S. feltiae (Filipjev, 1934) – 35,9% v polním a lesním prostředí. Zatímco druhy, S. intermedium (Poinar, 1985) 5,8%, S. affine (Bovien, 1937) 4,3%, S. bicornutum (Tallosi, Peters et Ehlers, 1995) 2,2% a Steinernema sp. náležící do skupiny „glaseri“ 0,5%, byly raritní. Nicméně poslední čtyři jmenované druhy byly zaznamenané jako nové druhy v ČR. 34,3% získaných izolátů patřilo k neurčeným druhům. Překvapivě, druh Steinernema carpocapsae (Weiser, 1955) v půdních vzorcích chyběla.
Jiných výsledků zase ve své studii dosáhli Zdeněk Mráček, Stanislav Bečvář, Pavel Kindelmann, Jana Jersáková. Entomopathogenní hlístovky (EPNs) z čeledi Steinernematidae a Heterorhabditidae jsou celosvětově rozšířené, zaznamenané na všech kontinentech kromě Antarktidy (Hominick et al., 1996). Některé druhy jsou považovány za endemické (původní) (např.: S. cubanum Mráček, Hernandez & Boemare; a Steinernema puertoricensis Roman & Figueroa), jiné mají celosvětové rozšíření S. carpocapsae (Weise), S. feltiae (Filipjev),
Heterorhabditis bacteriophora (Poinar). V případě endemických druhů se jedná o půdní organismy adaptované na extrémní klimaticko podmínky, na vysoké teploty a naopak chladné oblasti, rozšířené od nížin až po alpské nadmořské výšky (Steiner, 1996). 71
Ačkoli mnoho výzkumů poskytuje hodnotná data o rozšíření EPNs na světě, požadavky a preference jednotlivých druhů EPNs na prostředí zůstávají neustále nedostatečně objasněné. Nicméně, zvyšující se znalosti ve vztazích mezi EPNs a jejich prostředím a druhy hostitelského hmyzu by měly poskytnout vyšší potenciál ve biologickém boji proti hmyzím škůdcům. Hlavní nedostatek většiny výzkumů je nedostatečná identifikace druhů, které se omezují pouze na dobře známé druhy jako jsou S. kraussei, S. feltiae, a Heterorhabditis
bacteriophora. V minulých letech bylo ve fauně ČR popsáno šest druhů (Mráček et al., 1999; Mráček a Bečvář, 2000). Nedávno byly EPNs ze skupiny „glaseri“ identifikovány jako S. arenarium, dva dosud neznámé druhy byly popsány jako S. weiseri ( Mráček et al., 2003) a S. silvaticum (Sturhan et al., v tisku) a H. bacteriophora byla nacházena pouze v malém množství. Počty nalezených druhů jsou srovnatelné s oblastmi v Německu, kde bylo Sturhanem (1995) popsáno 11 druhů rodu Steinernema a dva druhy rodu Heterorhabditis a ve Velké Británii zaznamenal Hominick
et al. (1995) osm druhů rodu Steinernema a dva druhy rodu
Heterorhabditis. EPNs fauna ČR je bohatší než tři druhy rodu Steinernama a jeden druh rodu Heterorhabditis nalezených v západním Vlámsku v Belgii (Miduturi et al., 1996) a šest a jeden druh nalezený ve Švýcarsku Steinerem (1996). Jen málo zemí uvedlo výskyt EPNs vyšší nebo blížící se 50% kromě Velké Británie se 48,6% (Hominigk a Briscoe, 1990a) a ČR s 53,8% (Mráček et al., 1999). Česká republika se zdá být severozápadní hranicí distribuce panonských a mediteránních druhů
S. arenarium, který byl popsán na Ukrajině(
Artyukhovsky, 1967) a nedávno byly zaznamenán nízký výskyt tohoto druhu i na Slovensku (Sturhan a Lišková, 1999), Bulharsku (Shishiniova et al., 1997), Švýcarsku (Kamer et al., 2001) a ve Španělsku (Garsia del Pino a Palomo, 1996). Tyto druhy se sdají být evropskou variantou druhu S. glaseri, která byla popsána a je široce rozšířená v USA. Dva druhy S.
feltiae a S. carpocapsae jsou globálně rozšířené (Hominick et al., 1996; Hominick, 2002). Některé druhy vykazují zřetelné preference určitého typu prostředí. Otevřené a polootevřené prostředí jako jsou orná pole, louky a okraje silnic jsou vhodné pro S. affine a S.
feltiae. Hominck et al., (1995), Sturhan (1995) a Sturhan a Lišková (1999) zaznamenali stejné četnosti a typy výskytu. Nicméně, S. feltiae se vyskytuje spíše v opadavých lesích a nikdy nebyla zaznamenána v jehličnatých lesích. S. intermedium a S. kraussei dominují v zalesněných krajinách s výjimkou alpských nadmořských výšek (2000 – 2500m), zatímco
S. kraussei se častěji vyskytuje na loukách (Steiner, 1996). S. silvaticum (dříve Steinernema sp.) převažuje v lesních porostech Německa (Sturhan, 1995) a České Republiky, která je novou lokalitou tohoto druhu, její výskyt nebyl zaznamenán v jiných zemích. V ČR mají 72
listnaté lesy a keře mnoho defoliantů z čeledí Lepidoptera, Hymenoptera a Coleoptera, jejichž larvy se kuklí v půdě. Podobně, mnoho druhů larev much (Bibionidae, Sciaridae a
Tipulidae) se živí organickou hmotou a kořeny v půdě. Všechny tato druhy hmyzu tvoří ideální prostředí pro životní cyklus EPNs (Mráček a Sturhan, 2000). Frekvence výskytu EPNs (od 57 do 80%) byla zaznamenána v dubových, topolových, březových, lipových a olšových prostředích, které jsou speciálně bohaté na hmyzí hostitele, zatímco v javorových, broskvových a lískových prostředích, které mají nízkou hustotu hmyzích hostitelů, byla frekvence výskytu EPNs nižší než 25%. Z toho plyne, že se EPNs vyskytují v obou prostředích zalesněných i otevřených, ale mnohem vyšší výskyt je v oblastech bohatých na přítomnost hmyzích hostitelů, jako jsou lesy, obzvláště lesy opadavé. EPNs byly zaznamenány v 61% v oblastech s vysokou a průměrnou hustotou hmyzu a jen v 15% výskytu v oblastech s nízkou hustotou výskytu hmyzu (Mráček et al., 1999). Hustota výskytu hmyzu se zdá být rozhodujícím faktorem výskytu EPNs. Laboratorní teplota má velký vliv na účinnost galleriových pastí. Nedávno publikované výzkumy byly hlavně založeny pouze na jedné laboratorní teplotě. Mráček a Bečvář, (2000) vystavili galeriové pasti teplotám 15 a 22°C. Odvodili, že pokud použili pouze jednu z teplot buď 15 nebo 22°C, pak ztratili 7 – 23% izolátů. Jednotlivé druhy EPNs se liší svými teplotními optimy (Grewal
et al., 1994; Mráček et al., 1997). Proto se doporučuje provádět metody galeriových pastí nejméně při dvou teplotách. Nadmořská výška neměla vliv na výskyt EPNs. Na závěr, EPNs jsou pravděpodobně rozšířené po celém území ČR a jejich výskyt je považován spíše za všudypřítomný než nepravidelný. EPNs převažují v lehkých půdách a ve stromových ekosystémech, výskyt a množství IJ v biocenóze je jednoznačně ovlivněn hustotou výskytu hmyzích hostitelů.
73
10. Fotodokumentace k experimentální části
74
1.
2.
3.
Foto 1-3: Odběr půdních vzorků
Odběr vzorků z hloubky 20-25 cm, půda musí být vlhká, ale nepřemokřená (Foto: 1 – 3). Množství se pohybuje asi kolem 1-1,5 kg. Půdu uložíme do jakékoli přepravní nádoby nebo do polyethylenových sáčků a transportujeme do laboratoře. Sáčky by měli být prodyšné, aby nedošlo k zapaření půdy a v případě hrozícího vyschnutí je nutno půdu ovlhčit.
4.
5.
Foto 4, 5: Příprava „galleriové pasti“
75
Po transportu vzorku do laboratoře připravíme tzv. „galleriovou past“ (Foto: 4, 5). Půdu ze sáčku přeneseme do plastového boxu o vhodném objemu a do půdy umístíme 4 – 5 živých larev Galleria mellonella. Larvy vybíráme co největší, tedy nejstarší, ideálně larvy VII. instaru (Foto: 6, 7).
6.
7.
Foto 6, 7: Larvy Galleria mellonella
Takto připravené „galleriové pasti“ necháme inkubovat za laboratorní teploty asi po dobu 3 – 5 dnů. K nákaze larev dojde během 24 – 48 hodin. Pokud po uplynutí této doby dojde k usmrcení larev, pak je nutné zjistit jestli příčinou jejich smrti byly právě EPNs. Toto můžeme zjistit pouze pokud mrtvé larvy umístíme na tzv.: „vodní past“ (Foto: 8, 9). Mrtvé larvy před vložením na vodní past oplachujeme krátce etanolem, jako prevenci před výskytem jedinců rodu Diplogasteridae.
8.
9.
Foto 8-9: „Vodní past“
76
Na vodní pasti vystoupí IJ obsažené v larvě do okolního roztoku (Foto: 10). Tyto IJ jsou poté schopné znovu napadat larvy hostitelského hmyzu.
Foto 10: EPNs v okolním roztoku
Foto 11: Nákaza Heterorhabditis
Foto 12: Nákaza Steinernemou
Foto 13: Vodní past s přídavkem molitanu
Na fotografii č. 11 je vidět typické červenohnědé zbarvení larev usmrcených EPNs rodu
Heterorhabditis Způsobené bakteriemi rodu Photorhabdus. Fotografie č. 12 ukazuje usmrcené larvy, jejichž zabarvení (žluté) je typické pro nákazu EPNs rodu Steinernama a jejich symbiotickými bakteriemi rodu Xenorhabdus. Takto volně se pohybující IJ je možné poté skladovat v pórovitém materiálu, jako je např.: molitan. Ten poskytuje útočiště a zajišťuje vlhké prostředí, neboť nasaje okolní tekutinu (Foto: 13). IJ získané z mrtvých larev byli odesíláni na determinaci do Českých Budějovic na Oddělení experimentální ekologie Entomologického ústavu, Biologického centra AVČR, v.v.i., kde za velmi ochotné spolupráce, pan Mgr.Vladimíra Půža a RNDr. Zdeněk Mráček DrCs determinovali o jaké druhy se jedná. Pokud byl námi zaslaný izolát jednoznačně určen, pak byl v tamní laboratoři vyhotoven trvalý preparát a určený druh EPN byl zařazen do tamní sbírky. Vytvořené trvalé
77
preparáty druhů EPNs mi byly poslány zpět. Celkem bylo vyhotoveno devět trvalých preparátů. Byly zhotoveny jedinci první i druhé generace (jedinci druhé generace jsou velikostí těla větší než jedinci generace druhé), dále zvlášť preparáty samců a samic (samci mají spikuly na rozdíl od samic). Spikuly jsou jedním z nejdůležitějších determinačních znaků. Jednotlivé mnou izolované druhy jsem se pokusila nafotit, fotografie jsou k dispozici dále ve fotodokumentaci.
78
Fotografie trvalých preparátů Galerie I.: Lokalita Pouzdřanská step:
Foto: Samec S. feltiae, II. generace (40x)
Foto: Samec S. feltiae, spikuly (400x)
Foto: Samec S. feltiae, II. generace, spikuly (400x)
79
Foto: Samec S. feltiae, I. generace, spikuly (400x)
Foto: Samice S. feltiae, bez spikul (200x)
Foto: Samice S. feltiae, bez spikul (200x)
Foto: Samice S. feltiae, detail vajíček (200x)
Foto: Samice S. feltiae, detail vajíček (200x)
Foto: Samice S. feltiae, exoporus (200x)
Foto: Samice S. feltiae, exoporus (400x)
80
Galerie II.: Lokalita Stropešín I., II.:
Foto: Samec S,feltiae, (40x)
Foto: Samec S,feltiae, (100x)
Foto: Samec S,feltiae, (40x)
Foto: S. feltiae, spikuly (400x)
Foto: S. feltiae, spikuly (400x)
Foto: S. feltiae, spikuly (400x)
81
Galerie III: Lokalita Hradec Králové I.:
Foto: Samec S. silvaticum, (40x)
Foto: Samec S. silvaticum, (40x)
Foto: Samec S. silvaticum, (100x )
Foto: Samec S. silvaticum, (100x)
Foto: Samec S. silvaticum, spikuly (400x)
Foto: Samec S. silvaticum, spikuly (400x)
82
Galerie IV.: Lokalita Hradec Králové II.:
Foto: Samec S. silvaticum (40x)
Foto: Samec S. silvaticum (40x)
Foto: Samec S. silvaticum (100x)
Foto: Samec S. silvaticum (400x)
Foto: Samec S. silvaticum , spikuly (400x)
Foto: Samec S. silvaticum , spikuly
83
11. Závěr práce Ve své DP jsem z literárních zdrojů zpracovala problematiku biopesticidů a jejich využití v boji proti hmyzím škůdcům. Zaměřila jsem se na jednotlivé skupiny biopesticidů – viry, bakterie, houby, entomopatogenní hlístovky a prvoky. Vypracovala jsem přehled současně používaných preparátů obsahujících obsahující tyto bioinsekticidy. Literární rešerši jsem doplnila i experimentální částí, ve které jsem izolovala EPN z půdních vzorků a seznámila jsem se s jejich životním cyklem a dále jsem chovala modelové druhy EPN (S. feltiae, S. glaseri, H. bacteriophora) na larvách G. mellonella. Izoláty EPN získané ve volné přírodě (S. feltiae a S. silvaticum) byly zařazeny do sbírky v Entomologickém ústavu AVČR, v.v.i..
84
12. Seznam použité literatury a elektronických zdrojů Elektronické zdroje: •
URL 1: www.mistsprayers.com/sprayers/rowcrop.php
•
URL 2: progressivegardening.com/gardenpestcontrol.html
•
URL 3: www.extension.umn.edu/.../DG8232.html
•
URL 4: www.vegedge.umn.edu/mnvegnew/vol5/vol5n9.htm
•
URL 5: www.aces.edu/pubs/docs/A/ANR-0176/ANR-0176.html
•
URL 6: www.extension.umn.edu/.../DG8232.html
•
URL 7: www.extension.iastate.edu/.../jul03/jul0328.html
•
URL 8: www.bugwood.org/PAT/11entomology.html
•
URL 9: botit.botany.wisc.edu/toms_fungi/mar2000.html
•
URL 10: www.bact.wisc.edu/themicrobialworld/anthrax.html
•
URL 11: www.scienceclarified.com/As-Bi/Bacteria.html
•
URL 12: www.educa.aragob.es/iescarin/depart/biogeo/va...
•
URL 13: plantdiagnostics.umd.edu/level2.cfm?categoryID=15
•
URL 14: soils.usda.gov/.../soil_biology/nematodes.html
•
URL 15: www.ag.ndsu.edu/pubs/plantsci/pests/e1229w.html
•
URL 16: www.nysaes.cornell.edu/ent/biocontrol/bio_logo.map
•
URL 17: www.inta.gov.ar/imyza/info/gal/picudo.html
•
URL 18: www.mycology.adelaide.edu.au/.../beauveria1.html
•
URL 19: edoc.hu-berlin.de/.../HTML/bischoff-ch5.html
•
URL 20: www.apsnet.org/.../Verticillium/text/fig10.html
•
URL 21: www.e-nema.de
•
URL 22: www.koppert.com
85
Citace literárních zdrojů: •
Hoffmann, M.P. and Frodsham, A.C.: Natural enemies of vegetable insect pests. cooperative extension, Cornell University, Ithaca, NY. 63 pp, 1993.
•
Lacey L.A., Fruktos R., Kaya H.K. and Vail P.: Insect pathogens as biological control agents: Do they have a future? Biological Control 21, 230–248 (2001)
•
Lenteren, J.C. van: IOBC Internet Book of Biological Control. IOBC, 2006.
•
Mahr, D.L. and Ridgway N.M.: Biological control of insects and mites: An introduction to beneficial natural enemies and their use in pest management. NCR Publ. No. 481, 91 pp., 1993.
•
van Munster M., Janesen A., Clérivet A. and van den Heuvel J.: Can plants use an entomopathogenic virus as a defense against herbivores? Published on line: 2005.
•
Monobrullah M.: Optical brighteners – Pathogenicity enhancers of entomopathogenic viruses.Current Science Vol.84 (5), 2003
•
Mráček, Z. and Bečvář, S.: Insect aggregations and entomopathogenic nemarode occurrence. Nematology, Vol. 2 (3), 297-301, 2000.
•
Mráček, Z., Bečvář, S. and Kindlmann, P.: Survey of entomopatogenic nematodes from the families Steinernematidae and Heterorhabditidae (Nematoda: Rhabditida) in the Czech Republic.Folia Parasitol. Vol. 46: 145- 148, 1999.
•
Mráček, Z., Bečvář, S., Kindlmann, P., Jersáková J.: Habitat preference for entomopathogenic nematodes, their insect hosts and new faunistic records for the Czech Republic.Biological Control 34, 27-37, 2005.
•
Orlovskaya V. E.: The theoretical basis for using baculoviruses to control forest pests. Pages 206-212 in M.L. McManus and Liebhold A.M., editors. 1998. Proceedings: Population dynamics, impacts, and integrated management of forest defoliating insects. USDA Forest Serive General Technical Report NE-247.
•
Sturhan, D., Lišková, M.: Occurrence and distribution of entomopathogenic neatodes in the Slovak Republic.Nematology, Vol. 1(3), 273-277, 1999.
•
Poopathi S. and Tyagi B.K.: The challenge of mosquito control strategies: from primordial to molecular approa. Biotechnology and Molecular Biology Review Vol. 1 (2), pp. 51-65, 2006.
86
•
Tanada, Y., and Kaya, H.K.: Insect pathology. Academic Press, Inc., San Diego. 666 pp., 1993.
•
Weinzerl, R. and Henn T.: Alternatives in insect management: biological and biorational approaches. North Central Regional Extension Publication 401. Rick Weinzerl and Lee Solter, University of Illinois.
Sekundární citace: •
Artyukhovski, A.K.: Neoaplectana arenaria sp.n. (Steinernematidae)-vozbuditel nematodoza majskogo zhuka v voronezhskoi oblasti. Trudy Voronezh. Gos. Zap. 15, 94-100, 1967.
•
Aruga, H.: Induction of virus infection. Insect Pathol. 1: 499-530, 1963.
•
Barbercheck, M.E., Kaya, H.K.: Competitive interaction between entomopathogenic nematodes and Bauveria bassiana (Deuteromycotina: Hyphomycetes) in soil born larvae of Spodoptera exigua (Lepidoptera: Noctuidae). Enviromental Entomology, 20: 707-712, 1991.
•
Bird, J.T. and Elgee D.E.: A virus disease and introduced parasites as factors controlling the European spruce sawfly, Diprion hercyniae Htd. In central New Brunswick. Can. Entom. 89: 371-378, 1957.
•
Bird, J.T.: The use of a virus disease in the biological control of the European pine sawfly, Neodiprion sertifer (Geoffr). Can. Entom. 85: 437-446, 1953.
•
Driesche, R.G. van and Bellows T.S.: Biological control. Chapman & Hall, New York: 539 pp., 1995.
•
Ehlers, R.-U., Deseö, K.V., Stackebrandt, E.: Identification of Steinernema sp. (Nematoda) and their symbiotic bakteria Xenothabdus sp. from Italian and German soils. Nematologica 37: 360-364, 1991.
•
Ferron, P., Fargues, J., Riba, G.: Fungi as microbial insecticides against pests. In: Arora D.K., Ajello L., Mukerji K.G. editors. Handbook of Applied Mycology. Volume 2: Humans, Animals, and Insects, 18: 665-706, 1991.
•
Flint, M. L. and van den Bosch R.: Introduction to integrated pest management plenum Press. N. Y. 240 pp., 1981.
87
•
Furlong, M. J., Pell, J. K., Choo, O. P., and Rahman, S. A.: Field and laboratory evaluation of a sex pheromone trap for the autodissemination of the fungal entomopathogen Zoophthora radicans (Entomophthorales) by the diamond-back moth,
Plutella xylostella (Lepidoptera: Yponomeutidae.) Bull. Entomol. Res. 85, 331–337, 1995.
•
Garcia del Pino, F., Palomo, A.: Natural occurrence of entomopathogenic nematodes (Rhabditida: Steinernematidae and Heterorhabditidadae) in Spanish soil. J. Invertebr. Pathol. 68, 84-90, 1996.
•
Gershenson, S.M.: The role of some ecological factors in the initiation of virus epizootics of Lepidoptera. Voprosy Ecologii 3: 20-24, 1959.
•
Greathead, D.J.: A review of biological control in western and southern Europe. CAB, Farnham Royal: 182 pp., 1976.
•
Grewal, P.S., Sekvan, S., Gaugler, R.: Thermal adaptation nematodes: niche breadth for infection, astablishment, and reproduction.J. Therm. Biol. 19,245-253, 1994.
•
Hajek, A.E., St. Leger, R.J.: Interactions between fungal pathogens and insect hosts. Annu Rev Entomol. 39: 293- 322, 1994.
•
Hall, I..M.: Use of microorganisms in biological kontrol. In: P. De Bach, (ed.) Biological control of insect pests and weeds, 1964.
•
Haney, P.B., Morse J.G., Luck R.F., Griffths H.E.E., Grafton-Cardwell, N.V., O’Connell: Reducing insecticide use and energy costs in citrus pest management. UC IPM Publ. 15. Univ. Calif. Div. Agric. Nat.Res. 62 pp.,1992.
•
Haukeland, S.: Entomopathogenic nematodes found in Norway. Norw. J. Agri. Sci. 7: 17-27, 1993.
•
Hominic, W.M., Briscoe, B.R.: Occurrence of entomopathogenic nematodes (Rhabditida: Steinernematidae and Heterorhabditidae) in British Soil. Parasitology 100: 295-302, 1990a.
•
Hominick, W.M., Reid, A.P., Briscoe, B.R.: Prevalence and habitat specifiky of steinernematid and heterorhabditid nematodes isolates during surveys of the UK and the Netherlands. J. Helminthol, 69, 27-32, 1995.
•
Hominick, W.M., Reid, A.P., Bohan, D.A., Briscoe, B.R.: Entomopathogenic nematodes: biodiversity, geographical distribution and the convention on biological diversity. Biocontrol Sci. Technik. 6, 317-331, 1996.
88
•
Choo, H.Y., Kaya, H.K., Huh, J., Lee, D.W., Kimm, H.H., Lee, S.M., Choo, Y.M.: Entomopathogenic nematodes (Steinernema spp. and Heterorhabditis bacteriophora) and fungus Bauveria brongniartii for biological control of white grubs, Ectinopholia
rufipes and Exomala orientalis (Coleoptera: Scarabidae), in Korean golf course. Biological Control, 47:177-192, 2002.
•
Kamer, I., Hirschy, O., Trunděr, J.M.: Survey of baited insect parasitic nematodes from the Weiss lowland. In: Griffin, C.T., Burnell, A.M., Downes, M.J., Mulder, R. (Eds), COST 819: Developments in Entomopathogenic nemarodes (bacterial Research. European Commission, Luxemburg, pp. 178-182, 2001.
•
Klein, M.G., and Lacey, L.A.: An attractant trap for autodissemination of entomopathogenic fungi into populations of Japanese beetle, Popillia japonica (Coleoptera: Scarabaeidae). Biocontr. Sci. Technol. 9, 151–158, 1999.
•
Krogstad, D.: Malaria as a re-emerging disease. Epidemiol. Rev. 18: 77-89, 1996.
•
Lenteren, J.C. van and Woets J.: Biological and integrated pest control in greenhouses. Annu. Rev. Entomol. 33: 239-269, 1988.
•
Lenteren, J.C. van (ed.): Quality control and production of biological control agents: theory and testing procedures. CABI Publishing, Wallingford, UK: 327 pp., 2003.
•
Lenteren, J.C. van, Minks A.K. and de Ponti O.M.B., eds.: Biological control and integrated crop protection: towards environmentally safer agriculture. Pudoc, Wageningen: 239 pp., 1992.
•
Lenteren, J.C. van, Bale, J., Bigler, F., Hokkanen, H.M.T., Loomans, A.J.M.: Assessing risks of releasing exotic biological control agents of arthropod pests. Annu Rev Entomol, 51: 609-634, 2006.
•
Lenteren, J.C. van, Woets J., Grijpma P., Ulenberg S.A. and Minkenberg O.P.J.M.: Invasions of pest and beneficial insects in the Netherlands. Proceedings Royal Dutch Academy of Sciences, Ser. C. 90: 51-58, 1987.
•
Lenteren, J.C. van: Integrated pest management: the inescapable future. In „Modern crop protection: developments and perspectives“, J.C. Zadoks ed. Wageningen Pers: 217-225, 1993.
•
Lenteren, J.C. van: Measures of success in biological control of arthropods by augmentation of natural enemies. In: measures of success in biological control, Gurr G. and Wratten S. (eds.). Kluwer Academic Publishers, Dordrecht: 77-103, 2000.
89
•
Luck, R.F. , Foerster L.D., and Morse J.G.: An ecologically based IPM program for citrus in California’s San Joaquin Valley using augmentative biological control. Proc. Proceedings of the international society of citriculture VIII international citrus congress, 1996, Sun City, South Africa. 1:504-507, 1997.
•
Miduturi, J.S., Moens, M., Hominick, W.M., Briscoe, B.R., Reid, A.P.:Naturally occurring
entomopathogenic
nematodes
in
the
province
of
West-Flanders,
Belgium.J.Helminthol. 70, 319-327, 1996.
•
Mráček, Z., Bečvář, S., Kindlmann, P.: Survey of entomopathogenic nematodes from the families Steinernematidae and Heterorhabditidae (Nematoda:Rhabditida) in the Czech Republic. Folia Parasitol. 46, 145-148, 1999.
•
Mráček, Z., Bečvář, S.: Insect aggregations and entomopathogenic nemarode occurrence. Nematology 2, 297-301, 2000.
•
Mráček, Z., Jenser, G.: First report of entomogenous nematodes of the Steinernematidae and Heterorhabditidae from Hungary. Acta Phytol. Entomol. Hung. 23: 153-156, 1988.
•
Mráček,
Z.,
Sturhan,
D.,
Reid,
A.:
Steinernema
weiseri
sp.n.
(Rhabditida:Steinernematidae), a new entomopathogenic nemarode from Europe. Syst. Parasitol. 56, 37-47, 2003.
•
Mráček, Z., Sturhan, D.: Epizootic of the entomopathogenic nemarode, Steinernema intermedium (Poinar) in a nest of the bibionid fly, Bibio marci (L). J. Invertebr. Pathol. 76, 149-150, 2000.
•
Neuenschwander, P.: Biological control of the cassava mealybug in Africa: a review. Biological Control 21: 214-229, 2001.
•
Poinar, G.O.: „Nematodes for biological control of insects“. CRC Press, Boca Raton, FL: 165-176, 1979.
•
Rabb, R.L., Stinner R.E., and van den Bosch R.: Conservation and augmentation of natural enemies. Pp. 233-254, 1976.
•
Ramakers, P.M.J.: Biological control in Dutch glasshouses: practical applications and progress in research.Proc. Symp. Integrated Crop Protection. CEC, Valence, France: 265-270, 1992.
•
Sachtleben,
H.:
Biologische
Bekaempfungsmassnahmen.
In:
Handbuch
Pflanzenkranheiten. Ed. P. Sorauer. Paul Parey, Berlin 6 (2): 1-120, 1941.
90
der
•
Shishiniova, M., Budurova, I., Gradinarov, D.: Contribution to fauna of entomopathogenic nematodes (Rhabditida: Steinernematidae, Heterorhabditidae) from Bulgaria. Biotechnic. Eq. 11, 45-52, 1997.
•
Smith, H. S. and Armitage H.M.: The biological control of mealybugs attacking citrus. Calif Agric Exp. Sta. Bull. 509, 1931.
•
Smith, R.F. and Reynolds H.T.: Principles, definitions and scope of integrated pest control. Proceedings FAO Symposium on Integrated Pest Control, Rome, 1965, FAO 1: 11-17, 1966.
•
Speyer, E.R.: An important parasite of the greenhouse white-fly (Trialeurodes vaporariorum, Westwood). Bull. Entomol. Res. 17: 301-308, 1927.
•
Steiner, W.A.: Distribution of entomopathogenic nematodes in the Weiss Alps. Rev. Suisse Zool. 103: 439-452, 1996.
•
Sturhan, D.: Prevalence and habitat specificity of entomopathogenic nematodes in Germany. Proc. Workshop held at Todi, Perugia, Italy, 1995. European Commission, COST 819, Luxemburg,pp. 123-132.
•
Tallosi, B., Peters, A. and Ehlers, R.-U.: Steinernema bicornutum sp. n. (Rhabditida: Steinernematidae) from Vojvodina, Yugoslavia. Russian Journal of Nematology 3, 7180, 1995.
•
Tisdell, C.A.: Economic impact of biological control of weeds and insects. In „Critical issues in biological control“. Mackauer M., Ehler L.E. and Roland J. (eds.). Intercept, Andover: 301-316, 1990.
•
Trumble, J. T. and Morse J.G.: Economics of integrating the predaceous mite, Phytoseiulus persimilis (Acari: Phytoseiidae) with pesticides in strawberries. J. Econ. Entomol. 86: 879-885, 1993.
•
Vänninen I., Husberg G.B., Hokkanen H.M.T.: Occurrence of entomopathogenic fungi and nematodes in cultivated soils in Finland. Acta Entomol. Fenn. 53: 65-71, 1989.
•
Vega F.E., Dowd P.F., and Bartelt R.J.: Dissemination of microbial agents using an autoinoculating device and several insect species as vectors. Biological Control 5, 545– 552, 1995.
91
•
Vega F.E., Dowd P.F., Lacey L.A., Pell J.K., Jackson D.M., and Klein M.G.: Dissemination of beneficial microbial agents by insects. In “Field manual of techniques in invertebrate pathology: Application and Evaluation of Pathogens for Control of Insects and Other Invertebrate Pests” (Lacey L.A. and Kaya H.K., Eds.), pp. 152–177, 2000.
•
Vereijken, P.,Edwards C.,El Titi A.,Fougeroux A., and Way M.: Proceedings of workshop on integrated farming, Bulletin I.O.B.C./W.P.R.S. 1986/IX/2, 34 pp.
•
Wearing, C.H.: Evaluating the IPM implementation process. Annu Rev Entomol, 33: 17-38, 1988.
•
Wijnands, F.G., and Kroonen-Backbier B.M.A.: Management of farming systems to reduce pesticide inputs: the integrated approach. In modern crop protection developments and perspectives, J.C. Zadoks (ed.). Wageningen Pers, Wageningen, pp. 227-234, 1993.
92
