MASARYKOVA UNIVERZITA Fakulta přírodovědecká Ústav biochemie
Sledování stability enzymů a enzymových směsí pro stanovení sacharidů ve víně Bakalářská práce
Eliška Petulová
Brno 2010
Prohlášení: Prohlašuji, ţe jsem svou bakalářskou práci na téma Sledování stability enzymů a enzymových směsí pro stanovení sacharidů ve víně vypracovala samostatně pod vedením vedoucího práce Mgr. Jiřího Ţeravíka Ph.D. s pouţitím odborné literatury a dalších informačních zdrojů, které jsou v práci citovány a uvedeny v seznamu pouţité literatury.
Brno 13.5.2010
............................................................ Eliška Petulová 2
Poděkování: Ráda bych poděkovala Mgr. Jiřímu Ţeravíkovi, Ph.D. za odborné vedení, trpělivost a cenné rady, které mi poskytl při zpracování této bakalářské práce.
3
Obsah 1. Úvod………………………………………………………………………………………. 6 2. Teoretická část……………………………………………………………………………7 2.1.
Historie vína a vinné révy…………………………………………………...7
2.2.
Víno……………………………………………………………………………8
2.3.
Fermentace………………………………………………………………......9 2.3.1. Chlazení moštu………………. …. …. …. …. …. ………………...9 2.3.2. Kvasinky v procesu fermentace…………………………………….9 2.3.3. Doslazování………………………………………………………......9
2.4.
Sloţení vína….. .……………………………………………………………11 2.4.1. Sacharidy… …………………………………………………………12 2.4.2. Glukóza………………………………………………………………12 2.4.3. Fruktóza……………………………………………………………...13 2.4.4. Sacharóza………………………………………………….. …...….13
2.5.
Metody stanovení cukrů………………….. ……………………………….13 2.5.1. Tradiční metody….............................................................……..13 2.5.2. Fyzikálně – chemické metody… …………………….. …….…….15 2.5.3. Vyuţití biosenzorů…………………………………………………..16
2.6.
Biosenzor…………………………………………………………………….16 2.6.1. Rozdělení biosenzorů………………………………….......………17 2.6.2. Elektrochemické biosenzory……………………………………….17 2.6.3. Amperometrické biosenzory……………………………………….18 2.6.4. Enzymy vyuţívané pro amperometrické biosenzory……………19 2.6.5. Oxidázy………………………………………………………………20 2.6.6. Dehydrogenázy……………………………………………………..20 2.6.7. Elektropolymerace...………………………………………………..21
3. Experimentální část……………………………………………………………………..22 3.1.
Seznam pouţitých chemikálií……………………………………………...22
3.2.
Přístroje………………………………………………………………………22
3.3.
Měřící aparatura…………………………………………………………….22 3.3.1. Průtočný systém…………………………………………………….22
3.4.
Elektropolymerace elektrod………………………………………………..23
4
3.5.
Glukóza oxidázový biosenzor……………………………………………. 24 3.5.1. Příprava glukóza oxidázového biosenzoru………………………24 3.5.2. Kalibrace glukóza oxidázového biosenzoru……………………..24
3.6.
Pyranóza oxidázový biosenzor… ………………………………………...25 3.6.1. Příprava pyranóza oxidázového biosenzoru…………………….25 3.6.2. Kalibrace pyranóza oxidázového biosenzoru……………………26 3.6.3. Testování odezvy vybraných sacharidů na POX biosenzoru….27 3.6.4. Analýza vzorků vína………………………………………………..27
3.7.
Cíl práce… ………………………………………………………………….29
4. Výsledky a diskuze……………………………………………………………………...30 4.1.
Elektropolymerace………………………………………………………….30
4.2.
Kalibrace GOx biosenzoru………………………………………………...31
4.3.
Kalibrace POx biosenzoru…………………………………………………32
4.4.
Ověření účinnosti POx biosenzoru pomocí vybraných sacharidů…….33
4.5.
Analýza vzorků vína s vyuţitím POx biosenzoru.……………………….34 4.5.1. Detekce proudové odezvy…………………………………………34 4.5.2. Koncentrace glukózy ve vybraných vzorcích……………………35
5. Závěr……………………………………………………………………………………...37 6. Pouţitá literatura… ……………………………………………………………………..38
5
1. Úvod Víno je alkoholický nápoj, jehoţ znalectví bylo v dřívějších dobách povaţováno za odborné téma. Víno vyniká neomezenou schopností překvapovat, ţádná dvě vína nejsou stejná. Vše záleţí na okolnostech, na společnosti, na láhvi, na kaţdém z nás. [1] Vzniká díky alkoholovému kvašení a je sloţeno z vody, minerálních látek, vysokomolekulárních látek a také jednoduchých organických látek, mezi něţ patří sacharidy. Sacharidy jsou podstatným ukazatelem kvality vína. Jejich detekce je moţná různými tradičními nebo fyzikálně – chemickými metodami. V posledních letech se stále více dostávají ke slovu metody vyuţívající biosenzory. Tyto metody jsou předmětem intenzivního výzkumu. Pro stanovení sacharidů se vyuţívají především biosenzory elektrochemické, které jsou nejrozšířenějším typem biosenzorů. Vynikají jednoduchou konstrukcí měřícího systému, velmi dobrou citlivostí, rychlou odezvou. V neposlední řadě je důvodem jejich častého vyuţívání také nízká pořizovací cena.
6
2. Teoretická část 2.1. Historie vína Již člověk mladší doby kamenné sbíral plody plané révy, brzy na sobě poznal opojné účinky zkysané šťávy z bobulí a později se naučil víno vyrábět [2]. První nalezené víno je staré 7000 let, bylo objeveno jako usazenina v karafě na území Sumerů [3]. První vinice vznikly v Asii – na Blízkém východě, odtud se pěstování vinné révy přeneslo do Středomoří. V Egyptě bylo víno známo jiţ 3500 př. n. l., ve starém Řecku můţeme mluvit o vyspělém vinařství. Odtud se v 11. století př. n. l rozšířilo do severní a střední Itálie. Díky řeckým kolonizátorům se víno dostalo mimo jiné také na Sicílii, zásluhou Římanů se réva rozšířila do všech římských kolonií. Ve staletích našeho letopočtu došlo k rychlému šíření pěstování vinné révy po Evropě [2]. Do českých zemí přinesli révu ve 3. století n. l. Římané. Důkazem jsou vinařské noţe nalezené v budově vojenské stanice, kterou postavili římští vojáci [4]. Velký podíl na historii vína u nás je připisován církvi. Mniši v klášterech vysazovali vinice, stavěli vinné sklepy. Roku 1057 věnoval Spytihněv II. kostelu v Litoměřicích vinici, odtud máme první písemnou zmínku o víně u nás. Ve 14. století došlo na Jiţní Moravě k úpravě vztahů ve vinohradnictví ustanovením viničních řádů. Karel IV. přímo nařizoval svým poddaným vysazovat vinice na vhodných místech, na některá období zakázal dovoz cizích vín. V této době začali vinařit i šlechtici, měšťané a poddaní, plochy vinic se rapidně zvětšily [3]. Největšího rozmachu dosáhlo vinařství na našem území v 16. století, počet vinic narostl na 20 000 hektarů [2]. Toto období však netrvalo dlouho, obrovské ztráty s sebou přinesla třicetiletá válka. V 18. století došlo k rozdělení moravských vín do jakostních tříd. Tab.I: Rozdělení moravských vín do jakostních tříd
1. třída
Ledec, Mikulov, Popice, Dolní Dunajovice, Velké Pavlovice
2. třída
Rakvice, Zaječí, Pouzdřany, Věstonice, Velké Bílovice, Němčičky
3. třída
Křepice, Nosislav, Velké Němčice, Ţidlochovice, Dolní Bojanovice
7
Další
úpadek
zaznamenalo
vinařství
v 19.
století.
Prvním
faktorem
ovlivňujícím tuto skutečnost byl rozvoj průmyslu – zemědělci se začali více soustředit na pěstování řepy. Druhý důvod se jmenoval mšice révokaz - stejně jako do celé Evropy se i k nám rozšířila z Ameriky. Ve 20. století byly pro vinařství osudnými dvě světové války a komunismus, kdy prvořadou nebyla kvalita vína ale jeho mnoţství. Po revoluci však opět nastal obrat k lepšímu. Vinaři byli motivováni převáţně dovozem zahraničních vín. Dnes se obliba vína u nás zvyšuje stejně jako vinařská turistika, rozloha vinic stoupá [3]. Důkazem existence vinné révy jsou archeologické nálezy, kterých je u nás ovšem málo. Mezi ty nejdůleţitější řadíme vinařské noţe z Mikulčic a Starých Zámků u Líšně, středověké révové pecky z Brna, Mikulčic, Olomouce, Opavy, Chrudimy a Havlíčkova Brodu. Dále je známý nález terásek na jiţním svahu praţského hradního vrchu, kde zřejmě byla vinice. Ta je s největší pravděpodobností nejstarším dokladem o existenci vinařství na našem území [2].
2.2. Víno Víno, řecky nazývané oinos, latinsky vinium, [5] je přirozený produkt příznivě působící na lidský organismus. Jeho pití, v přiměřené míře, kladně ovlivňuje průchodnost cév, upravuje krevní tlak, má antiseptické a baktericidní účinky. V červeném
víně
se
vyskytuje
látka
resveratol,
1,3-benzendiol,5-[2-(4-
hydroxyfenyl)ethenyl], která hraje důleţitou roli právě v prevenci kardiovaskulárních onemocnění, ale také cukrovky. Fenoly obsaţené ve víně zase působí jako antioxidanty, čímţ zpomalují stárnutí buněk a vínu se díky nim připisují protirakovinné účinky [6]. Víno je alkoholický nápoj vzniklý kvašením moštu nebo rmutu z hroznů Vitis vinifera (réva vinná) z čeledi Vitaceae (révovité).
8
2.3. Fermentace Fermentace neboli kvašení je biotechnologický proces, kdy kvasinky přeměňují jednoduché cukry obsaţené v moštu na etanol, za vzniku oxidu uhličitého a tepla. Současně s tvorbou alkoholu se mošt pomalu mění na víno. Tato reakce je exotermická.
C6H12O6 → 2 C2H5OH + 2 CO2 Během fermentace vznikají také primární vedlejší produkty (glycerol, kyseliny octová, mléčná, citronová a jantarová) a sekundární vedlejší produkty (diacetyl, vyšší alkoholy, aceton, aldehydy, ketony, estery a aromatické látky) [7]. 2.3.1. Chlazení moštu Současným trendem (platí to především pro bílá vína) je chlazení kvasícího moštu tak, aby jeho teplota nepřekročila 18˚C. Důvod je ten, ţe při této teplotě se ve víně uchová mnohem více přírodních aromatických látek, neţ kdyţ se mošt nechá samovolně kvasit při vyšších teplotách. 2.3.2. Kvasinky v procesu fermentace Kvašení je zahájeno buď samovolně činností kvasinek obsaţených jiţ v moštu, nebo je způsobeno rychlé rozkvašení moštu zkvašením čistou kulturou vyšlechtěných kvasinek. V čerstvém moštu se vyskytuje malé mnoţství kvasinek rodů Candida, Pichia, Metschnikowia, Rhodotorula. Na začátku kvašení však odumírají. Na počátku kvašení jsou činné tzv. apikulátní kvasinky (např. Kloeckera apiculata), které jsou důleţité především pro tvorbu aroma ve víně a je jich přítomno aţ tisíckrát více neţ kvasinek rodu Saccharomyces. Činnost ušlechtilých kvasinek Saccharomyces vini (starší název Saccharomyces cerevisiae), důleţitých především pro tvorbu alkoholu ve víně, je zahájena teprve po ukončení činnosti kvasinek apikulátních. Spolu s vinnými kvasinkami jsou přítomny také kvasinky rodu
9
Saccharomyces oviformis, důleţité pro dokvašení moštu, odolné vůči vyššímu obsahu alkoholu. Při dokončení alkoholového kvašení se Saccharomyces vini ocitají ve fázi odumírání. Činnost kvasinek končí v okamţiku, kdy jsou metabolizovány všechny cukry. Hranice, po jejímţ překročení je jiţ prostředí pro kvasinky toxické, je objem alkoholu 16%. Po dokončení alkoholového kvašení se zvyšuje počet bakteríí rodu Oenococcus oeni podílících se na procesu zušlechťování vína. Jedná se o jablečno – mléčné kvašení, kdy se kyselina jablečná mění na kyselinu mléčnou a oxid uhličitý. Odbouráním kyseliny jablečné, jejíţ přítomnost je důvodem vyšší kyselosti vína, je víno zjemněno. Tento postup je běţný při výrobě červených vín, při výrobě bílých vín probíhá jen výjimečně [8, 9]. 2.3.3. Doslazování Hroznový mošt obsahuje jednoduché cukry: glukózu a fruktózu. V našich agro – klimatických podmínkách obvykle hrozny nedosahují dostatečné cukernatosti. Víno by tedy při kvašení neobsahovalo poţadované mnoţství alkoholu. Z tohoto důvodu jsou mošty ještě před začátkem kvašení doslazovány. Dříve se přidával cukr sacharóza. Dnes je rozšířeno pouţívání invertního cukru. Invertní cukr je označení pro ekvimolární směs D-glukózy a D-fruktózy. Název vznikl proto, ţe optická rotace této směsi je značně záporná, coţ je způsobeno vlivem D-fruktózy [10]. Oproti tomu rotace původní sacharózy je kladná. Invertní
cukr
je
připravován
enzymatickou
nebo
kyselou
hydrolýzou
sacharózy. Úplnou hydrolýzou dosáhneme invertního cukru skládajícího se z 47,5% glukózy, 47,5% fruktózy a 5% sacharózy. Předností tohoto invertu je vyšší sladkost neţ je sladkost původní sacharózy [10].
10
2.4. Sloţení vína Víno bylo popsáno jako druhá nejsložitější kapalina na světe, první místo náleží lidské krvi [11]. Přírodní nefortifikované víno, tzn. víno bez přidaných látek, obsahuje přibliţně 85% vody. Všechna tato voda je přírodní. Dále je sloţeno z jednoduchých organických látek jako jsou alkohol, jehoţ podíl ve víně činí asi 12%, sacharidy, aldehydy, aromatické látky (kolem 800 rozlišitelných substancí), barevné látky (červená a ţlutá barviva), estery, kyseliny, pektiny. Polyfenoly
(např. jiţ
zmíněný resveratrol), dusíkaté látky a třísloviny řadíme mezi látky vysokomolekulární. Nedílnou součástí vína jsou také minerální látky, z nichţ 50% tvoří draslík. Dále pak můţeme jmenovat např. vápník, hořčík, sodík, ţelezo, sulfáty, fosfáty a jiné [5].
3%
12%
85%
Voda
Alkohol
Ostatní
Obr. 1: Obecné sloţení vína. Upraveno dle [12].
acetaldehydy vázané kyseliny estery fenoly cukr
siřičitany aminokyseliny minerály nestále kyseliny
Obr. 2: Ostatní látky obsaţené ve víně. Upraveno dle [12].
11
2.4.1. Sacharidy Přestoţe sacharidy tvoří pouze malou část vína, jsou to látky, díky nimţ můţe tento nápoj vůbec existovat. Během procesu fermentace jsou to právě sacharidy, jeţ jsou kvasinkami převáděny na etanol. Rostlina během fotosyntézy vytváří molekuly sacharózy, ty se hromadí v hroznech. Během zrání je sacharóza hydrolyzována pomocí enzymu invertáza na glukózu a fruktózu, monosacharidy s šesti-uhlíkovým cyklem. Zpočátku se vytváří více glukózy neţ fruktózy, v průběhu zrání se poměr těchto cukrů vyrovnává. Fruktóza se stává zdrojem pro kvasinky v průběhu alkoholového kvašení teprve po vyčerpání glukózy, hlavního substrátu. V hroznech jsou dále přítomny i cukry s cyklem tří-, čtyř-, pěti- i sedmi-uhlíků. Tyto sacharidy se vyskytují méně nebo jen ve stopovém mnoţství. Jsou to sacharóza, ribóza, xylóza, galaktóza, stachyóza, rhamnóza, arabinóza, maltóza a další [9]. Ne všechny tyto cukry jsou zkvasitelné, jako např. pěti-uhlíkatá arabinóza, rhamnóza a xylóza, které jsou ve víně přítomny i po vykvašení. To je důvod, proč víno není nikdy vykvašeno kompletně, to znamená bez zbytkového cukru. 2.4.2. Glukóza Glukóza, jinak nazývaná také hroznový či krevní cukr, patří mezi monosacharidy ze skupiny aldohexóz. Tento redukující sacharid, v čistém stavu bílá krystalická látka se sladkou chutí, je nejdůleţitější a ve formě polymerů nejrozšířenější cukr v přírodě. Vzniká při fotosyntéze a slouţí jako výchozí látka pro biosyntézu ostatních sacharidů. Volně se vyskytuje ve sladkém ovoci (1-5%), a medu (asi 30%). U člověka je volná glukóza obsaţena v krvi, lymfě a mozkomíšním moku. Po poţití se rychle vstřebává, proto se vyuţívá jako pohotovostní zdroj energie. Jsou známy dva anomery: L-glukóza a D-glukóza lišící se pouze tím, ţe jejich vodný roztok stáčí rovinu polarizovaného světla opačným směrem. Glukóza se vyrábí enzymovou nebo kyselou hydrolýzou škrobu a pouţívá se mimo jiné pro fermentační výrobu etanolu a alkoholických nápojů [13].
12
2.4.3. Fruktóza Fruktóza, jinak nazývaná také ovocný cukr, je nejrozšířenější ketohexózou. Tento monosacharid tvořící bílé krystaly se silně sladkou chutí byl objeven jako štěpný produkt sacharózy. Vyskytuje se v mnoha potravinách, hlavně v ovoci (3-6%) a medu (asi 40%). Stáčí rovinu polarizovaného světla doleva, proto byla dříve nazývaná „levulóza“. Je rychleji stravitelná neţ glukóza [13]. 2.4.4. Sacharóza Neredukující disacharid sacharóza, jinak nazývaný také třtinový nebo řepný cukr, je důleţitým metabolickým produktem všech zelených rostlin, kde slouţí jako transportní rozpustný sacharid. V kyselém
prostředí hydrolyzuje na ekvimolární
směs glukózy a fruktózy. Pouţívá se v potravinářství jako sladidlo. Můţe být zkvašen mikroorganismy, ale ve vyšších koncentracích inhibuje jejich růst. Díky této vlastnosti lze sacharózu vyuţít jako konzervační činidlo [13].
2.5. Metody stanovení cukrů 2.5.1. Tradiční metody Obsah cukru je zjišťován jiţ v moštu nebo hroznech na vinici v období sklizně. Toto stanovení slouţí k tomu, aby byl mošt v případě potřeby upraven a nedocházelo k problémům při kvašení moštu nebo po něm. Cukernatost lze měřit refraktometricky nebo moštoměry. Refraktometrické stanovení Refraktometrické stanovení není zcela přesné, avšak je dostačující. Ručním refraktometrem, optickým přístrojem se stupnicí 0,35 refraktometrických stupňů, je cukernatost měřena jiţ na vinici. Testují se bobule z různých částí vinohradu, různě zralé, z nichţ se udělá šťáva a ta se nanese na refraktometr. Světelný paprsek prochází opticky řidší hmotou (měřený vzorek, v našem případě šťáva z bobulí) do
13
opticky hustší hmoty (sklo), čímţ dochází k lomu světla, který závisí na hustotě roztoku, to znamená na obsahu cukerných látek. Úhel prostupujícího světla se zobrazuje na stupnici vloţené v okuláru přístroje. Pro vinařské účely se obvykle vyuţívá ruční refraktometr [14].
Obr. 3: Ruční refraktometr [14]
Měření moštoměry Měření moštoměry je rozšířené pro svoji praktičnost, jednoduchost, cenovou dostupnost moštoměrů a dostačující přesnost měření. Moštoměry se cukernatost měří po sklizni, z moštů. Probíhá tak, ţe nejprve se čistý mošt nalije do odměrného válce, poté je do něj ponořen čistý a suchý moštoměr. Nesmí se dotýkat stěn nádoby. Obsah cukru můţeme pozorovat přímo na stupnici moštoměru. Stupně v České republice pouţívaného normalizovaného moštoměru (°NM) udávají mnoţství cukru v kilogramech na 100 litrů moštu [14].
Obr. 4: Moštoměr [15]
14
2.5.2. Fyzikálně – chemické metody Vedle senzorického testování či tradičních metod, existují pro analýzu sloţení vína také fyzikálně – chemické metody. Co se detekce sacharidů týče, můţeme uvést metody následující. NIR – spektrometrie Metoda molekulové spektroskopie vyuţívá spektrální oblast
blízkého
infračerveného záření (tj. 800 – 2500 nanometrů). Funguje na principu měření odraţeného nebo prošlého záření vzorkem v této oblasti vlnových délek. Pouţití NIR – spektrometrie je vhodné pro sloţité směsi, mezi něţ patří i víno, protoţe při ní lze stanovit více sloţek vedle sebe, a to přímo ve výrobním procesu. Měření je obvykle nedestruktivní, rychlé a nevyţaduje ţádnou speciální úpravu vzorků. Mnohem pracnější a také časově náročnější je zpracování a vyhodnocení dat, které následuje po samotném měření spekter. Spektrometrie v blízké infračervené oblasti se zařazuje mezi tzv. procesní analytické metody. To znamená, ţe hlavní důraz je kladen na rychlost samotné analýzy ve výrobním procesu, nikoli na přesnost. Lze díky ní zjistit např. obsah sacharidů nejen v hotovém víně, ale jiţ během probíhajícího kvašení [16]. Polarimetrie Koncentraci sacharidů můţeme měřit na polarimetru analytickou metodou zvanou polarimetre. Obvykle se vyuţívá v případě, ţe se jedná o čisté cukry. Polarimetrie je zaloţena na měření optické otáčivosti, to znamená stočení roviny polarizovaného světla opticky aktivní látkou, kterou sacharidy jsou díky chirálnímu uhlíku obsaţenému ve své molekule. Úhel otočení roviny je přímo úměrný koncentraci opticky aktivní látky. Koncentraci můţeme tedy stanovit sestavením kalibrační křivky. Chromatografie Chromatografie je separační metoda zaloţená na tom, ţe molekuly analytu se dle rozdílné afinity rozdělují mezi mobilní a stacionární fázi chromatografického systému.
Pro stanovení sacharidů se vyuţívá chromatografie kapalinová nebo
gelová [17]. 15
2.5.3. Využití biosenzorů Metody vyuţívající biosenzory jsou v dnešní době oblíbené a těší se velkému rozvoji. Svými moţnostmi zasahují do sféry běţného ţivota člověka, veterinární medicíny, zemědělství, ţivotního prostředí, farmaceutického a potravinářského průmyslu. Lze jimi stanovovat jak anorganické látky, tak mnoţství látek organických a biologicky důleţitých, např. alkoholy, bílkoviny, aminokyseliny, biogenní aminy, pesticidy, herbicidy, hydraziny, fenoly, cholesterol a v neposlední řadě také sacharidy. Stanovení lze provádět i ve sloţitých matricích, mezi něţ se víno určitě řadí.
2.6. Biosenzor Biosenzor je analytické zařízení, jehoţ součástí je citlivý prvek biologického původu. Tato biorekogniční sloţka můţe být součástí nebo v těsném kontaktu s fyzikálně-chemickým převodníkem. Poskytuje elektrický signál přímo úměrný koncentraci stanovovaných látek ve vzorku [18]. Biosenzor se skládá ze tří částí: 1. BIOREKOGNIČNÍ SLOŢKA rozpoznává stanovovanou látku. a) Biokatalytická
–
stanovovaná
látka
je
specificky
přeměňována
v průběhu chemické reakce, obvykle vystupuje jako substrát enzymové reakce; např. enzymy, organely, buňky, tkáně, orgány, organismy b) Bioafinitní – stanovovaná látka je specificky vázána ve vznikajícím afinitním komplexu; např. vazba ligandů na receptory, vazba protilátek s antigeny [18]. Biorekogniční část je povaţována za nejslabší prvek biosenzoru, limituje ţivotnost tohoto zařízení [18]. 2. FYZIKÁLNĚ – CHEMICKÝ PŘEVODNÍK přeměňuje signál z interakce stanovované látky (analytu) s biologickou sloţkou na lépe měřitelný signál [19]. 3. PROCESOR, který nám umoţní zobrazovat výsledky.
16
„Efektivní biosenzor vyžaduje těsné spojení jeho jednotlivých částí.“ [20]
Analyt
PŘEVODNÍK (fyzikálně-chemická část)
BIORECEPTOR (biologická část)
ELEKTRICKÝ SIGNÁL
Obr. 5: Schéma biosenzoru
2.6.1. Rozdělení biosenzorů Podle biologické sloţky dělíme biosenzory na: -
biokatalytické
-
imunosenzory
-
DNA
-
biomimetické
Podle typu fyzikálně – chemického převodníku dělíme biosenzory na: -
optické
-
piezoelektrické
-
akustické
-
elektromagnetické
-
kalorimetrické
-
elektrochemické
2.6.2. Elektrochemické biosenzory Elektrochemické
biosenzory
patří
mezi
nejrozšířenější
především
díky
jednoduchosti konstrukce měřícího systému, nízkým pořizovacím nákladům a velmi dobré citlivosti. Pro sestavení takového systému je třeba minimálně dvou elektrod – pracovní (měřící), zkonstruovanou z nejrůznějších materiálů vybíraných tak, aby nedošlo k elektrochemickému rozkladu tohoto materiálu, a srovnávací (referentní) 17
s přesně definovaným a stálým potenciálem. Můţe být vyuţita také třetí elektroda – pomocná [21]. Podle techniky měření jsou elektrochemické biosenzory dále rozdělovány na potenciometrické, konduktometrické a nejvíce rozšířené amperometrické. a) Potenciometrické biosenzory Potenciometrické
biosenzory
patří
k nejstarším
známým
biosenzorům.
„Základem potenciometrie je změna potenciálu vyvolaná akumulací náboje na rozhraní elektrody s roztokem.“ [18] Pro tento typ biosenzorů jsou obvykle vyuţívány enzymové elektrody. Fyzikálně – chemickým převodníkem je zde iontově selektivní elektroda pokrytá enzymovou vrstvou. Elektrochemickým článkem při měření potenciálu indikační elektrody, ponořené do roztoku, proti elektrodě referentní neprotéká elektrický proud. Pouţívají se procesory přístroje s velkým vstupním odporem. b) Konduktometrické biosenzory Konduktometrickým biosenzorem můţeme zachytit změnu elektrické vodivosti způsobenou biochemickou reakcí. Pouţity jsou dvě kovové elektrody v objemu roztoku. Pouţití tohoto typu biosenzorů je však omezeno především z důvodu jeho niţší citlivosti v porovnání s biosenzory potenciometrickými a amperometrickými [19]. c) Amperometrické biosenzory Amperometrické
biosenzory
jsou
nejrozšířenější
z elektrochemických
biosenzorů a byly vyuţity v experimentální části. Je jim proto věnována následující kapitola. 2.6.3. Amperometrické biosenzory Amperometrickými biosenzory je sledována aktuální změna proudu. Proud je úměrný koncentraci analytu ve vzorku a obvykle je měřen při konstantním napětí pracovní elektrody. Za určitý čas projde systémem dané mnoţství proudu udávající náboj, který je úměrný molárnímu mnoţství látky přeměněné na elektrodách. Amperometrické biosenzory jsou sestaveny ze dvou nebo tří elektrod. U dvouelektrodového systému se měří napětí pracovní elektrody vůči pomocné 18
elektrodě. Velikost procházejícího proudu je v tomto systému ovlivněna pracovním potenciálem. Tříelektrodové systémy navíc vyuţívají srovnávací elektrodu. Pracovní potenciál je nastaven právě vůči této srovnávací elektrodě, takţe velikost proudu nijak neovlivňuje. [18] „Amperometrické biosenzory hrají důležitou roli mezi biosenzory obecně a jsou předmětem intenzivní výzkumné činnosti, která vede k pokroku co se týče jak vlastností biosenzorů, tak designu elektrod.“ [20] Vynikají rychlou odezvou a vysokou citlivostí. Ukazují dobrou kompatibilitu s biokatalyzátory, kofaktory, redoxními mediátory. Mají dobré mechanické vlastnosti. Výhodou jsou v neposlední řadě také nízké pořizovací náklady měřící aparatury [19].
Obr. 6: Komerčně dodávaný tříelektrodový senzor. a – pracovní elektroda, b – refernční elektroda, c – pomocná elektroda, d – výstupní kontakty. Upraveno dle www.hzscr.cz/soubor/biosenzory- pdf.aspx
2.6.4. Enzymy využívané pro amperometrické biosenzory Biorekogniční sloţkou amperometrických biosenzorů jsou nejčastěji enzymy. Je-li reakce katalyzována dostatečným mnoţstvím enzymu, je rychlost reakce přímo úměrná analytu. Postupuje se tedy tak, ţe se zkonstruuje kalibrační křivka a z ní se stanovuje obsah analytu. Reakce bývají rychlé a velmi selektivní [18]. ENZYM + SUBSTRÁT
ENZYM – SUBSTRÁT
ENZYM + PRODUKT
Převládá pouţívání jednoho enzymu, ale mohou být pouţity enzymy dva, výjimečně i více vzájemně spolupracujících enzymů. Nejpouţívanějšími enzymy jsou oxidázy a dehydrogenázy [18]. Patří mezi oxidoreduktázy, které katalyzují intermolekulové oxidačně redukční reakce [22]. Jedná se o jednu z nejpočetnějších tříd enzymů.
19
2.6.5. Oxidázy Biosenzorové systémy zaloţené na oxidázách vyuţívají kyslík, který slouţí jako akceptor elektronů za současné tvorby peroxidu vodíku nebo vody. Takové enzymové reakce mohou být monitorovány měřením spotřeby kyslíku (O2) nebo produkcí peroxidu vodíku (H2O2) při pracovních potenciálech -650 mV (kyslík) a +650 mV (peroxid vodíku) [23]. Jednou z oxidáz je např. glukózaoxidáza, označovaná zkratkou GOx. Je vyuţívána pro stanovení glukózy a jejím kofaktorem je flavinadenindinukleotid (FAD). Existují však i alternativy, např. pyrochinolin chinon (PQQ). D – glukóza + GOx/FAD GOx/FADH2 +
O2
kyselina glukónová + GOx/FADH2 GOx/FAD +
H2O2
Sledujeme pokles koncentrace O2
Sledujeme nárůst koncentrace H2O2
v roztoku při E = -650mV vs. Ag/AgCl
v roztoku při E = + 650mV vs. Ag/AgCl
Upraveno dle [24].
2.6.6. Dehydrogenázy Oxidoredukční děj dehydrogenázy (DH) realizují přenosem atomů vodíku od jejich donorů k jejich akceptorům, jejichţ funkci plní redoxní kofaktory NAD+, NADP+. Tyto kofaktory mohou být recyklovány na povrchu elektrod s vysokým pracovním potenciálem [22]. Např.: Stanovení methanolu za pouţití methanoldehydrogenázy (MDH), vyuţívající kofaktor NAD+ : methanol + NAD+
MDH
formaldehyd +
NADH
+ H+
Sledujeme oxidaci NADH na NAD+ při E > 900mV vs. Ag/AgCl Upraveno dle [24].
20
Vzhledem k vysokému polarizačnímu potenciálu tato metoda není vhodná. Běţně se pro detekci NADH vyuţívá enzymu diafority (DP), který oxiduje NADH na NAD+ za současné redukce mediátoru s nízkým polarizačním potenciálem. Jako akceptor elektronů z NADH se obyčejně pouţívá ferrikyanid. Diaforáza napodobuje funkci peroxidázy v oxidasa-peroxidázové kaskádě (viz. detekce glukózy) [23].
Substrát
NAD+
DH
DP
[Fe(CN)6]3e-
Produkt
NADH + H+
[Fe(CN)6]4-
elektroda
2.6.7. Elektropolymerace Ve víně je obsaţena řada elektrochemicky aktivních látek, které při vysokých pracovních potenciálech způsobují interference. Proto je nutné volit takové postupy, které tyto interference sníţí [23]. K interferencím dochází právě i v případě přítomnosti H2O2. Abychom je odstranili, vyuţijeme tzv. molekulární síto. V našem případě jsme vyuţili polymeru tvořeného směsí resorcinolu a o – fenylendiaminu.
21
3. Experimentální část 3.1. Seznam pouţitých chemikálií Hydrogenfosforečnan sodný dodekahydrát, dihydrogenfosforečnan sodný dihydrát, chlorid draselný, kyselina askorbová, metanizol, peroxid vodíku. o-fenylendiamin, resorcinol, D-glukóza, D-fruktóza, sacharóza, D-ribóza, D-xylóza, maltóza, Dmannóza, D-galaktóza, L-arabinóza, L-rhamnóza monohydrát, D-mannitol, inositol, D-sorbitol, hovězí sérový albumin, glutaraldehyd, dextranaldehyd, ţelatina. Glukóza oxidáza, peroxidáza, pyranóza oxidáza.
3.2. Přístroje Tříelektrodový páskový sensor AC1.W2.R1 byl zakoupen od fy BVT Technologies (Brno, Česká republika, www.bvt.cz). Tento sensor je tvořen platinovou pracovní elektrodu, pomocnou elektrodu a referentní Ag/AgCl elektrodou. Dále byl pouţit potenciostat PalmSens od fy Palm Instruments (Houten, Nizozemí, www.palmsens.com), peristaltická pumpa Minipuls 3 od fy Gilson (Middleton, WI, USA) a elektronický osmikanálový ventil od fy Valco Instruments, Inc. (Huston, TX, USA). Průtočná cela byla navrţena a zkonstruována v laboratoři biosenzorů. Dále byl pouţit program PS Lite k ovládání PalmSens potenciostatu a program LabTools, který slouţí k ovládání multikanálového ventilu jehoţ. Jeho autorem je doc. RNDr. Petr Skládal, CSc. K vyhodnocení výsledků byl pouţit program Origin.
3.3. Měřící aparatura 3.3.1. Průtočný systém Pro amperometrické měření byla sestavena měřící aparatura – průtočný systém. Základem tohoto systému je průtočná cela sloţená ze dvou bloků plexiskla spojených šroubky, mezi nimiţ je umístěno pryţové těsnění, do něhoţ vkládáme 22
elektrodu. Objem této reakční oblasti je 7 μl. Do cely je přítokem nasávána kapalina pomocí peristaltické pumpy s průtokem 50 μl.min-1, která je umístněna za celou. Dávkování vzorku je umoţněno osmikanálovým ventilem, který je napojen na průtočnou celu. Elektroda upevněná v průtočné cele je přes výstupní kontakty zapojena do potenciostatu PalmSens, který je propojen s počítačem, zobrazujícím nám odezvu senzoru na kapalinu procházející přes elektrodu. odpad
Pumpa Osmi kanálový ventil
PC
Potenciostat
elektroda
Vzorky
Průtočná cela
Obr. 7: Schéma průtočného systému
3.4. Elektropolymerace elektrod Prvním krokem bylo ponoření senzoru na dvě hodiny do acetonu, aby z něj byly odstraněny organické nečistoty. Suchý byl vloţen do průtočné cely. Prvních 600 s průtočným systémem protékal 50 mmol.l-1 fosfátový pufr obsahující 100 mmol.l-1 KCl o pH 7 pro základní stabilizaci proudové odezvy. Poté byly postupně aplikovány 10 mmol.l-1 H2O2, 1 mmol.l-1 kyselina askorbová a
1
mmol.l-1 metamizol, kaţdý na 180 s při pracovním potenciálu 600 mV vs.Ag/AgCl. Po stabilizaci signálu byla započata samotná elektropolymerace přidáním polymerní
23
směsi skládající se z 2 mmol.l-1 o-phenylendiaminu a 2 mmol.l-1 resorcinolu. Polymerní směs proudila systémem po dobu 1 hodiny. Elektropolymerace byla samovolně ukončena, jakmile byl indikován pokles proudu korespondující s nárůstem vrstvy nevodivého kopolymeru vytvořeného na pracovní elektrodě. Poté byl znovu zopakován první cyklus, během kterého byly postupně aplikovány H2O2, kys. askorbová a metamizol. Propustnost kopolymeru tvořícího se na pracovní elektrodě byla vypočtena dle vzorce: %propustnost = (ipo / ipřed) * 100. Takto modifikovaný sensor byl pouţit pro enzymovou imobilizaci.
3.5. Glukóza oxidázový biosenzor 3.5.1. Příprava glukóza oxidázového biosenzoru Enzymová vrstva glukóza oxidázového biosenzoru byla připravena podle následujícího postupu: V 67,99 μl fosfátového pufru bylo rozpuštěno 0,23 mg enzymu GOx. Dále bylo přidáno 7,57 μl hovězího sérového albuminu (BSA). Následně bylo do směsi přidáno 1,3 μl 2% glutaraldehydu (GA), rozpuštěného ve vodě, z důvodu zesítění a 2 μl 5% glycerolu, aby nedošlo při skladovaní k vyschnutí membrány. Takto modifikovaný roztok byl důkladně promíchán a 2 μl byly naneseny na pracovní platinovou elektrodu. 3.5.2. Kalibrace glukóza oxidázového biosenzoru Pro kalibraci GOx biosenzoru byl vyuţit zásobní roztok glukózy o koncentraci 100 mmol.l-1. Z tohoto zásobního roztoku bylo připraveno sedm vzorků o koncentracích 0,05; 0,1; 0,2; 0,5; 0,8; 1,0; 2,0 a 3,0 mmol.l-1. Připravený biosenzor byl vloţen do průtočné cely. Po celou dobu práce byl vyuţíván 50 mmol.l-1 fosfátový pufr obsahující 100 mmol.l-1 KCl o pH 7. Pracovní potenciál byl nastaven na 650 mV vs. Ag/AgCl. V první fázi systémem po dobu 600 s protékal pufr z důvodu základní stabilizace. Následně proudil systémem 0,05 mmol.l-1 roztok glukózy po dobu 180 s. Proudová odezva roztoku glukózy o této koncentraci byla zaznamenávána celkem ve třech cyklech. Mezi kaţdým z nich byl
24
systém pročištěn pufrem po dobu 300 s. Stejným způsobem byla zachycena proudová odezva všech dalších roztoků o vzrůstajících koncentracích. Po třetím průtoku 3 mmol.l-1 roztoku glukózy byl systém promyt opět pufrem.
3.6. Pyranóza oxidázový biosenzor 3.6.1. Příprava pyranóza oxidázových biosenzorů Pro další práci bylo připraveno celkem šest rozdílných pyranóza oxidázových biosenzorů. Pro tři byly vyuţity elektrody pokryté polymerem, další tři připravené senzory polymer neobsahují. 1 - POx/ BSA/ GA /polymer Enzymová vrstva prvního senzoru byla připravena podle následujícího postupu: V 42,40 μl fosfátového pufru bylo rozpuštěno 0,42 mg enzymu POx. Dále bylo přidáno 3,68 μl BSA. Následně bylo do směsi přidáno 3,93 μl 2% glutaraldehydu, rozpuštěného ve vodě, z důvodu zesítění a 4,5 μl 5% glycerolu, aby nedošlo při skladovaní k vyschnutí membrány. Takto modifikovaný roztok byl důkladně promíchán a 1 μl byl nanesen na polymerem potaţenou pracovní platinovou elektrodu. 2 - POx/ BSA/ GA Enzymová vrstva byla připravena dle stejného postupu jako v případě předchozího senzoru. Jediný rozdíl nastal v tom, ţe modifikovaný roztok byl nanesen na elektrodu, která nebyla předem potaţena polymerem. 3 - POx/ BSA/ GA/ ţelatina/ polymer Enzymová vrstva třetího senzoru byla připravena dle následujícího postupu: V 36,80 μl fosfátového pufru bylo rozpuštěno 0,42 mg enzymu POx. Dále byl přidán 1,0 μl BSA. Následně bylo do směsi přidáno 4,12 μl 2% glutaraldehydu, rozpuštěného ve vodě, z důvodu zesítění, 4,0 μl 5% glycerolu a 10 μl ţelatiny. Ţelatina ve směsi
25
tvořila 1%. Takto modifikovaný roztok byl důkladně promíchán a 1 μl byl nanesen na polymerem potaţenou pracovní platinovou elektrodu. 4 - POx/ BSA/ GA/ ţelatina Enzymová vrstva byla připravena dle stejného postupu jako v případě předchozího senzoru. Jediný rozdíl nastal v tom, ţe modifikovaný roztok byl nanesen na elektrodu, která nebyla předem potaţena polymerem. 5 - POx/ BSA/ GA/ dextranaldehyd/ ţelatina/ polymer Enzymová vrstva pátého senzoru byla připravena dle následujícího postupu: V 19,30 μl fosfátového pufru bylo rozpuštěno 0,42 mg enzymu POx. Dále byl přidán 1,0 μl BSA. Následně bylo do směsi přidáno 4,12 μl 2% glutaraldehydu a 17,50 μl dextranaldehydu z důvodu zesítění, 4,0 μl 5% glycerolu, a 10 μl ţelatiny. Ţelatina ve směsi opět tvořila 1%. Takto modifikovaný roztok byl důkladně promíchán a 1 μl byl nanesen na polymerem potaţenou pracovní platinovou elektrodu. 6 - POx/ BSA/ GA/ dextrandaldehyd/ ţelatina Enzymová vrstva byla připravena dle stejného postupu jako v případě předchozího senzoru. Jediný rozdíl nastal v tom, ţe modifikovaný roztok byl nanesen na elektrodu, která nebyla předem potaţena polymerem. Takto modifikované elektrody byly po dobu alespoň 24 hodin inkubovány ve vodou nasycené atmosféře při teplotě kolem 4˚C. Po opláchnutí destilovanou vodou byly enzymové elektrody připraveny k pouţití. 3.6.2. Kalibrace pyranóza oxidázových biosenzorů Pro kalibraci POx biosenzorů byl vyuţit 100 mmol.l-1 zásobní roztok glukózy. Z tohoto zásobního roztoku bylo připraveno sedm vzorků o koncentracích 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 5,0; 10,0 a 20,0 mmol.l-1 a provedena kalibrace prvních dvou biosenzorů. Pro další čtyři biosenzory byly pouţity zásobní roztoky o koncentracích 0,1; 0,5; 0,8; 1,0; 2,0; 3,0 a 5,0 mmol.l-1. Připravený biosenzor byl vloţen do průtočné cely. Po celou dobu práce byl vyuţíván 50 mmol.l-1 fosfátový pufr obsahující 100 mmol.l-1 KCl o pH 7. Pracovní 26
potenciál byl nastaven na 650 mV vs. Ag/AgCl. Program byl nastaven stejně jako při kalibraci GOx biosenzoru. V první fázi systémem po dobu 600 s protékal pufr z důvodu stabilizace signálu. Následně systémem třikrát proudil 0,5 mmol.l-1 roztok glukózy po dobu 180 s, vţdy na 300 s prostřídáno pufrem. Stejným způsobem byla zachycena proudová odezva všech dalších roztoků o vzrůstajících koncentracích. Po třetím průtoku roztoku glukózy s nejvyšší koncentrací byl opět do systému vpuštěn pufr. Kalibrace byla provedena pro všechny připravené pyranóza oxidázové biosenzory. Dle nejlepší odezvy byl vybrán jeden z nich a ten byl pouţit pro další měření. 3.6.3. Testování odezvy vybraných sacharidů na POx biosenzoru Z důvodu nejlepší odezvy byla k dalšímu měření vybrána elektroda číslo 3, čili elektroda pokrytá polymerem POx/ BSA/ GA/ ţelatina. Pracovní potenciál byl stejně jako při kalibračních měřeních nastaven na 650 mV vs. Ag/AgCl a opět byl pouţit 50 mmol.l-1 fosfátový pufr obsahující 100 mmol.l-1 KCl o pH 7. Testovány byly 1 mmol.l-1 roztoky D-glukózy, sacharózy, D-galaktózy, D-fruktózy, D-ribózy, D-mannózy, maltózy, D-sorbitolu, innositolu, D-mannitolu, L-rhamnózy, L-arabinózy a D-xylózy. Vybraný senzor byl vloţen do průtočné cely a program byl nastaven následovně: Prvních 600 s protékal systémem pufr z důvodu základní stabilizace. Následně byla třikrát změřena odezva 1 mmol.l-1 roztoku D-glukózy. Jednotlivé 180ti sekundové sekvence byly střídány 300 sekundovými sekvencemi pufru. Po Dglukóze proudily systémem jednotlivé další 1 mmol.l-1 roztoky cukrů dle stejného postupu. Na závěr byla znovu změřena odezva 1 mmol.l-1 roztoku D-glukózy. 3.6.4. Analýza vzorků vína Pro analýzu bylo vybráno sedm vzorků vín, všechny pocházejí z jiţní Moravy. Z bílých vín byly testovány následující: Vzorek č. 1: Muller Thurgau, pozdní sběr, ročník 2006, Vinium Velké Pavlovice Vzorek č. 2: Rulandské bílé, Bzenec Vzorek č. 3: Ryzlink Vlašský, Víno Mikulov
27
Z červených vín byly testovány následující: Vzorek č. 4: Modrý portugal, Vinium Velké Pavlovice Vzorek č. 5: Frankovka, Znovín Znojmo Vzorek č. 6: Frankovka, Templářské sklepy Čejkovice Vzorek č. 7: Frankovka, Vinium Velké Pavlovice Při analýze desetkrát ředěných vzorků vín byl stejně jako v předchozím případě pouţita elektroda pokrytá polymerem POx/BSA/GA/ţelatina. Pracovní potenciál byl opět nastaven na 600 mV vs. Ag/AgCl. Pouţívali jsme 50 mmol.l-1 fosfátový pufr obsahující 100 mmol.l-1 KCl o pH 7. Elektroda byla vloţena do průtočné cely a program byl nastaven dle stejného postupu jako v předchozím měření. Krok 1: 600 s pufr pro základní stabilizaci Krok 2: 180 s desetkrát naředěný vzorek č. 1 Krok 3: 300 s pufr Krok 4: 180 s desetkrát naředěný vzorek č. 1 Krok 5: 300 s pufr Krok 6: 180 s desetkrát naředěný vzorek č. 1 Krok 7: 300 s pufr Krok 8: 180 s desetkrát naředěný vzorek č. 2 … Na závěr průtočným systémem opět proudí pufr.
28
3.7. Cíl práce Cílem této bakalářské práce bylo seznámit se s problematikou biosenzorů, především biosenzorů amperometrických. Praktická část práce si kladla za cíl připravit biosenzory za pomoci enzymů glukóza oxidázy a pyranóza oxidázy, optimalizovat je pomocí kalibračních měření a otestovat jejich funkčnost na vzorcích vína. Vývoj biosenzorů je cílený pro budoucí konstrukci bioelektronického jazyka.
29
4. Výsledky a diskuze 4.1. Elektropolymerace Princip oxidázového senzoru spočívá ve sledování odezvy produkovaného peroxidu vodíku při vysoké pracovním potenciálu (650 mV vs Ag/AgCl). Při tomto pracovním potenciálu řada látek obsaţených ve vzorcích je elektrochemicky aktivní a interferuje se signálem stanovovaného peroxidu vodíku. Aby došlo k odstranění těchto interferencí, musel být pouţit takový postup, který by rušivé elektrochemické účinky sníţil. Jednou z moţností je zavedení nevodivé vrstvy polymeru, která slouţí jako molekulové síto, kterým mohou projít pouze malé molekuly jako jsou molekuly peroxidu vodíku. Ty projdou touto membránou a reagují na povrchu elektrody [25]. Pro tvorbu polymerní vrstvy byly vybrány monomery o – fenylendiamin a resorcinol. Během elektropolymeračního procesu se pracovní elektroda pokrývala vrstvou nevodivého polymeru, v čase tato vrstva rostla aţ do maximální tloušťky. Úměrně s jejím nárůstem klesal elektrický proud. Propustnost této membrány byla vyhodnocena pomocí amperometrické odpovědi 10 mmol.l-1 peroxidu vodíku jakoţto analytu. Jako příklad interferencí byla před a po vzniku nevodivé vrstvy polymeru sledována proudová odpověď 1 mmol.l-1
kyseliny askorbové a 1 mmol.l-1
metamizolu. V tabulce č. 1 je vyhodnocena odezva peroxidu vodíku, kyseliny askorbové a metamizolu před a po polymeraci. Propustnost pro kyselinu askorbovou i pro metamizol byla polymerem téměř zablokována. Pouţitá elektroda měla zrnitý povrch, proto se vrstva polymeru vytvořila značně silná, tedy méně propustná i pro malé molekuly. Z tohoto důvodu se i propustnost pro peroxid vodíku sníţila. Ze zjištěných výsledků lze vyčíst, ţe polymerní vrstva tvořená ekvimolární směsí 2 mmol.l-1
o – fenylendiaminu a 2 mmol.l-1
vlastnosti.
Na
následujícím
obrázku
resorcinolu
můţeme
má výborné selektivní
pozorovat
samotný
elektropolymeračního procesu. Tab. II: Propustnost polymerové vrstvy Před [%]
Po [%]
Peroxid vodíku
100
29
Kyselina askorbová
100
1,21
Metamizol
100
0,85
30
průběh
metamizol 8
H2O2
7
H2O2
6
elektropolymerizace
i/ A
5 4 3
H2O2
2
H2O2 metamizol
1 0
kyselina askorbová
-1 0
2000
4000
kyselina askorbová 6000
8000
10000
12000
Cas / s
Obr. 8: Průběh elektropolymerizace. Proudové odezvy odpovídají následujícím koncentracím: 10 mmol.l-1 H2O2; 1 mmol.l-1 kys. askorbová; 1 mmol.l-1metamizol. Průtok 50 μl.min-1.
4.2. Kalibrace GOx biosenzoru Glukóza oxidázový biosenzor slouţí k detekci glukózy. Aby byla otestována funkčnost námi vytvořeného GOx biosenzoru, byla provedena jeho kalibrace. Byly pouţity roztoky glukózy o koncentracích 0,05; 0,1; 0,2; 0,5; 1,0; 2,0 a 3 mmol.l-1. Na obrázku č. 9 můţeme sledovat lineární oblast v rozmezí koncentrací 0,1 – 2,0 mmol.l-1.
0.14 0.12
i/ A
0.10 0.08 0.06 0.04 0.02 0.00 0.0
0.5
1.0
1.5
2.0 -1
c / mmol.l
Obr. 9: Kalibrační křivka GOx biosenzoru.
31
2.5
3.0
4.3. Kalibrace POx biosenzoru Kalibrace byla provedena pro šest připravených biosenzorů. Pro kalibraci prvních dvou biosenzorů jsme zvolili roztoky glukózy o koncentracích 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 5,0; 10,0 a 20 mmol.l-1.
1 2 0.30
0.25
i/ A
0.20
0.15
0.10
0.05
0.00 0
5
10
c / mmol.l
15
20
-1
Obr. 10: Kalibrační křivky POx biosenzorů. 1-POx/BSA/GA/polymer; 2-POx/BSA/GA.
Z obr.10 je patrné, ţe lineární oblast se pohybuje v rozmezí koncentrací 0,5 – 2,0 mmol.l-1. Při vyšších koncentracích glukózy byl sledován jen nepatrný rozdíl mezi proudovými odezvami. Proto pro kalibraci následujících biosenzorů byly zvoleny koncentrace 0,1; 0,5; 0,8; 1,0; 2,0; 3,0 a 5,0 mmol.l-1.
32
3 4 5 6
0.35 0.30 0.25
i/ A
0.20 0.15 0.10 0.05 0.00 0
1
2
3
c / mmol.l
4
5
-1
Obr.11: Kalibrační křivky POx biosenzorů. 3-POx/BSA/GA/ţelatina/polymer; 4-POx/BSA/GA/ţelatina; 5-POx/BSA/GA/dextranaldehyd/ţelatina,polymer; 6-POx/BSA/GA/dextranaldehyd/ţelatina.
Obecně můţeme říct, ţe biosenzory, které prošly elektropolymeračním procesem, vykazují lepší proudovou odezvu neţ biosenzory bez polymeru. Nejlepší odezvu vykazoval biosenzor 3 - POx/BSA/GA/ţelatina/polymer, byl proto vybrán pro další měření.
4.4. Ověření účinnosti POx biosenzoru pomocí vybraných sacharidů Funkčnost POx biosenzoru byla ověřena sledováním proudové odezvy vybraných sacharidů. Byly pouţity sacharidy D-fruktóza, sacharóza, D-ribóza, Dmannóza, L-rhamóza a cukerné alkoholy D-sorbitol a D-mannitol, které však nevykazovaly ţádnou odezvu. Sacharidy D-glukóza, D-galaktóza, maltóza, Larabinóza, D-xylóza a cukerný alkohol inositol byly detekované POx biosenzorem. Procento odezvy těchto sacharidů bylo vztaţeno k procentu odezvy 1 mmol.l-1 glukózy. Nejvyšší odezva po glukóze byla zaznamenána u sacharidu xylózy.
33
Tab. III: Sacharidy, u nichţ byla sledována odezva
Název sacharidu
% odezvy / 1 mmol.l-1 glukóza
Glukóza
100
Fruktóza
0
Sacharóza
0
Galaktóza
3,66
Ribóza
0
Mannóza
0
Maltóza
1,59
Sorbitol
0
Inositol
0,54
Mannitol
0
Rhamóza
0
Arabinóza
0,38
Xylóza
16,96
4.5. Analýza vzorků vína pomocí POx biosenzoru 4.5.1. Detekce proudové odezvy Pomocí pyranóza oxidázového biosenzoru byla změřena proudová odezva sedmi vybraných vzorků vín. Z výsledku znázorněného na obr.12
je jasně vidět
rozdíl mezi víny bílými a červenými. Červená vína vykazují podstatně vyšší odezvu neţ vína bílá. U bílých vín je patrná téměř shodná odezva pro všechny členy této skupiny. U jednotlivých zástupců červených vín byly zaznamenány menší rozdíly.
34
0.115
bílá vína cervená vína
0.110 0.105
i/ A
0.100 0.095 0.090 0.085 0.080 0.075 0.070 0.065 0
1
2
3
4
Cislo vzorku
5
6
7
8
Obr.12: Odezva vzorků vín. 1. Muller Thurgau (Vinium Velké Pavlovice); 2. Rulandské bílé (Bzenec); 3. Ryzlink Vlašský (Víno Mikulov); 4. Modrý Portugal (Vinium Velké Pavlovice); 5. Frankovka (Zníván Znojmo; 6. Frankovka (Templářské sklepy Čejkovice); 7. Frankovka (Minium Velké Pavlovice).
4.5.2. Koncentrace glukózy ve vybraných vzorcích vína Přibliţná koncentrace cukrů v jednotlivých vzorcích vína byla odečtena z kalibračního grafu pro pyranóza oxidázový biosenzor. Koncentrace cukrů ve víně byla vztaţena na glukózu, protoţe ta byla pouţita ke kalibraci POx biosenzoru. Tab. IV: Koncentrace cukrů ve vybraných vzorcích vína vztaţena na koncentraci glukózy.
Číslo vzorku
c cukru [mmol.l-1]
1
3,05
2
4,88
3
4,91
4
10,05
5
12,03
6
12,28
7
12,60
35
Vzorky 1, 2 a 3 reprezentují bílá vína. Obsah cukru v těchto vzorcích se pohybuje v rozmezí 3 – 5 mmol.l-1. Vzorky 4 – 7 představují vína červená. Obsah cukru ve vzorcích 5, 6 a 7 se liší jen nepatrně, jedná se o stejnou odrůdu vína z různých lokalit. Obecně můţeme vidět, ţe bílá vína obsahují méně cukru a teoreticky tedy méně glukózy neţ vína červená.
36
5. Závěr V praktické části práce byly připraveny dva biosenzory, glukóza oxidázový a pyranóza oxidázový. Funkčnost glukóza oxidázového biosenzoru byla ověřena jeho kalibrací s vyuţitím zásobních roztoků glukózy o různých koncentracích. Proudová odezva glukóza oxidázového biosenzoru rostla úměrně se vzrůstající koncentrací glukózy. Tento biosenzor je vhodný pro stanovení glukózy v analyzované látce. Pyranóza oxidázových biosenzorů bylo připraveno šest typů. Kaţdý z nich byl podroben kalibračnímu měření, ke kterému byly pouţity zásobní roztoky glukózy o vzrůstající koncentraci stejně jako v případě GOx biosenzoru. Elektrody pokryté polymerem vykazovali vyšší odezvu neţ elektrody, na kterých polymer nebyl. Podle kalibračních grafů byl pro další měření vybrán biosenzor 3 - POX/BSA/GA/ţelatina/ polymer. Funkčnost vybraného POx biosenzoru byla ověřena na odezvě vybraných cukrů. Nejvyšší odezva byla zaznamenána u glukózy, druhé místo obsadila xylóza. Na závěr byla pomocí POX elektrody měřena odezva tří vybraných vzorků bílého vína a čtyř vzorků červeného vína. Červené víno vykazuje znatelně vyšší odezvu neţ víno bílé.
37
6. Použitá literatura 1. Walton, S.: Ilustrovaná encyklopedie vína, nakl. Svojtka a Co., Praha, 2002 2. Hauft, J.: Nový brevíř o víně, nakl. Svépomoc, Praha, 1989 3. Biosféra. Dostupný z www: http://www.biosfera.cz/cz/novinky/historie-vina-v-ceske-republice/ 4. Sklepy úvaly. Dostupné z www: http://www.sklepuvaly.cz/historie-vina.php 5. Encyklopedie: Znalec vín. Dostupný z www: http://www.znalecvin.cz/encyklopedie/ 6. French scout. Dostupný z www: http://www.frenchscout.com/ 7. Bezpečnost potravin: A – Z slovník pro spotřebitele. Dostupný z www: http://www.agronavigator.cz/az/vis.aspx?id=92242 8. Osborne, J. P., Edwards, CH. G.: Bacteria important during winemaking, Adv. Food Nutr. Res. 50 (2005) 139 – 177 9. Hloţková, J.: Bakalářská práce, PřF MU, Brno (2008) 10. Kodíček, M.: Biochemické pojmy: výkladový slovník, [online]. VŠCHT, Praha 2007. Dostupný z www: http://vydavatelstvi.vscht.cz/knihy/uid_es-002/ 11. Výroba vína. Dostupný z www: www.global-wines.cz/vyroba-vina 12. Waterhouse lab. Dostupný z www: http://waterhouse.ucdavis.edu 13. Dostál, J. a kolektiv: Lékařská chemie, skripta, LF MU, Brno 2005 14. Pěstitelské pálení Schimansky. Dostupný z www: http://www.schimansky.cz 15. Internetový obchod. Dostupný z www: http://eshop.bobr.cz/mostomer-p-117174.html 16. Matějka, P.: Spektrometrie v blízké červené oblasti Dostupné z www: www.vscht.cz/anl/lach2/NIR.pdf 17. Churáček, J. a spol.: Analytická separace látek, Praha: SNTL, 1990 18. Skládal, P.: Biosensory, skripta, PřF MU, Brno 1999
38
19. Trögl, J.: Biosenzory, Odborné časopisy [on line], (2006). Dostupný na WWW: http://www.odbornecasopisy.cz/index.php?id_document=31055 20. Miertuš, S., Katrlík, J., Pizzariello, A., Streďanský, M., Švitel, J., Švorc, J.: Amperometric biosensors based on solid binding matrice applied in food quality monitoring. Biosensors and Bioelectronics 13 (1998) 911 – 923 21. Kotzian, P.: Elektrochemické biosenzory, Univerzita Pardubice 2007 Dostupné z www: http://www.peta.unas.cz/biosenzory/index.htm 22. Vodráţka, Z.: Biochemie, Academia, Praha 2007 23. Ţeravík, J., Hlaváček, A., Lacina, K., Skládal, P.: State of the Art in the Field of Electronic and Bioelectronic Tongues – Towards the Analysis of Wines. Electroanalysis 21 (2009) 2509 – 2520 24. Tkáč, J., Švitel, J., Šturdík, E.: Stanovenie významných látok v nápojích biosenzormi. Chem. Listy 93 (1999) 518 – 526 25. Ţeravík, J., Lacina, K., Jílek, M., Vlček, J., Skládal, P.: Biosensor for determination of carboxylic acids in wines based on the inhibition of sarcosine oxidase. Microchim Acta (2010) publokováno on-line. 26. Mc Murry, J.: Organická chemie, překlad z originálu 6. vydání, 2004, vydáno VUT Brno-nakladatelství VUTIUM a VŠCHT Praha, listopad 2007
39
