MASARYKOVA UNIVERZITA

MASARYKOVA UNIVERZITA

Přírodovědecká fakulta Oddělení fyziologie a imunologie živočichů

Behaviorální a fyziologické aspekty exploračního chování myši domácí (Mus musculus)

Bakalářská práce

Brno 2010

Vedoucí BP:

prof. RNDr. Miloš Macholán, CSc.

Konzultantka:

RNDr. Barbora Vošlajerová, Ph.D.

Zpracovala:

Dominika Sýkorová

Velmi děkuji prof. RNDr. Miloši Macholánovi, CSc., a RNDr. Barboře Vošlajerové, Ph.D., za čas, vstřícnost a nekonečnou trpělivost, které mi věnovali při psaní práce. Dále děkuji Mgr. Zuzaně Hiadlovské za poskytnutí literatury k tématu a cenné rady, za přátelskou atmosféru jsem vděčná také všem pracovníkům z Ústavu biologie obratlovců ve Studenci. Můj dík patří také přátelům za podporu a především mé rodině.

Prohlašuji, že jsem tuto bakalářskou práci na téma: „Behaviorální a fyziologické aspekty exploračního chování myši domácí (Mus musculus)“ vypracovala samostatně na základě pokynů a rad vedoucího práce a že veškeré použité zdroje jsou v ní řádně citovány.

V Brně, 15. 5. 2010 Dominika Sýkorová

OBSAH

ABSTRAKT .......................................................................................................................................... 5 ABSTRACT ............................................................................................................................................ 5 ÚVOD ..................................................................................................................................................... 6 1.1.

ROLE DISPERZE A EXPLORACE V BIOLOGII OBRATLOVCŮ ........................................ 7

1.1.1 Definice pojmů ............................................................................................................................ 7 1.1.2 Příčiny disperze ........................................................................................................................... 8 1.1.3 Význam disperze ......................................................................................................................... 9 1.2.

DISPERZE A HYBRIDIZACE ................................................................................................. 11

1.2.1. Reprodukční bariéry mezi druhy ............................................................................................... 11 1.2.2. Hybridní zóny ............................................................................................................................ 12 1.3.

MYŠ JAKO EVOLUČNÍ MODEL ........................................................................................... 15

1.3.1. Systematické třídění myší .......................................................................................................... 15 1.3.2. Myší hybridní zóna v Evropě .................................................................................................... 19 1.3.3. Sociální struktura myší .............................................................................................................. 20 1.3.4. Explorace a disperze u myší ...................................................................................................... 22 1.4.

NEGATIVNÍ FYZIOLOGICKÉ DOPADY DISPERZE A EXPLORAČNÍHO CHOVÁNÍ... 25

1.5.

STRESOVÉ HORMONY A JEJICH METABOLIZMUS........................................................ 26

1.5.1. Stres ........................................................................................................................................... 26 1.5.2. Metabolizmus katecholaminů .................................................................................................... 27 1.5.3. Metabolizmus glukokortikoidů .................................................................................................. 28 2.1.

NEINVAZIVNÍ MĚŘENÍ STRESOVÝCH HORMONŮ ........................................................ 30

2.2.

BEHAVIORÁLNÍ METODY ................................................................................................... 33

2.2.1. Behaviorální arény k odhadu stresu ........................................................................................... 33 2.2.2. Metody studia exploračního a disperzního chování................................................................... 34 ZÁVĚR:

NÁVRH EXPERIMENTŮ ................................................................................................ 36

SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY ................................................................................................... 38

ABSTRAKT Dosavadní genetické výzkumy hybridní zóny mezi dvěma poddruhy myši domácí (Mus musculus musculus a Mus musculus domesticus) naznačují, že přestože její charakter je v souladu s predikcemi modelu tzv. tenzní zóny, nezávislé na vnějších podmínkách, na lokální úrovni mohou její charakter zásadním způsobem ovlivňovat vodní toky i jiné geografické bariéry. Tato bakalářská práce formou literární rešerše připravuje teoretický základ pro následnou sérii jednoduchých behaviorálních experimentů zaměřených na zhodnocení míry, charakteru a potenciálních mezi(pod)druhových rozdílů v exploračním chování a vztahu k vodě. Tyto behaviorální testy budou doplněny fyziologickou analýzou kortikosteroidních metabolitů s cílem odhadnout míru stresu při exploraci a kontaktu s vodou.

ABSTRACT The genetic research into the hybrid zone between two subspecies of house mouse (Mus musculus musculus and Mus musculus domesticus) has so far indicated that, whereas its characteristic corresponds to the model predictions of so called tension zone, independent on the outer conditions, on local level its nature can be significantly affected by watercourses and other geographic barriers. This bachelor thesis prepares a theoretical basis for subsequent series of simple behavioral experiments aimed to evaluate the extent, characteristics and potential inter(sub)specific differences in exploratory behavior and relation to water. These behavioral tests will be supplemented with physiological analysis of corticosteroid metabolites, aimed to assess the amount of stress during the exploration and contact with water.

5

ÚVOD

Disperze se podílí na toku genů mezi populacemi ale i druhy (Lidicker a Stenseth 1992). Může mít tedy význam při vzniku nových druhů (speciaci). Tok genů a vzájemná hybridizace mezi dvěma druhy, oddělenými neúplnou reprodukční bariérou, může totiž vést ke vzniku druhu nového, odlišného od obou rodičovských (Arnold 1997). Jak uvidíme dále, disperze však může hrát důležitou roli i v některých typech hybridních zón (Barton a Hewitt 1985). Jedna z nejlépe zkoumaných hybridních zón je evropská zóna mezi dvěma poddruhy či druhy myší domácích, na kterou zaměřím svou pozornost. Tato bakalářská práce je rešerší zabývající se významem disperze v přírodních populacích dvou poddruhů myší domácích, jejím vlivem na stresovou zátěž organizmu i relativním významem ve speciačním procesu u tohoto modelového objektu. Stres se projevuje velmi variabilně v závislosti na vnějších podmínkách i individualitě jedince a proto je velmi obtížné jeho měření (Moberg a Mench 2000). Míra stresové odpovědi se dá odhadnout z fyziologických parametrů zvířat (Palme et al. 2005), jejichž měření by mělo být náplní navazující diplomové práce. Na závěr této práce se zmíním o některých potenciálně vhodných behaviorálních metodách analýzy disperze spolu s neinvazivními metodami měření hormonů (Palme a Möstl 1997), indikujícími stresovou zátěž vyvolanou exploračními experimenty.

6

1.1.

ROLE DISPERZE A EXPLORACE V BIOLOGII OBRATLOVCŮ

Pohyb je základním projevem života mnoha organizmů. I když může být u některých (většina rostlin nebo přisedlé druhy) zahrnut jen v krátké fázi života, pomáhá řešit lokální problémy jako nedostatek potravy, úkrytů před predátory nebo zimou nebo nedostatek rozmnožovacích míst (Bowler a Benton 2005). V této práci se zaměřím na pohyb obratlovců, speciálně exploraci a disperzi, které mají významné důsledky zejména ekologické a evoluční, ale také fyziologické. Disperze pomáhá v pochopení mnoha dějů v populacích (Lidicker a Stenseth 1992). Hraje roli v utváření sociální struktury živočichů a ovlivňuje hustotu jejich populací, je zásadní pro šíření druhu včetně vlivu na vnitřní dynamiku některých hybridních zón a další procesy.

1.1.1 Definice pojmů Mezi jednoduché orientační pohyby obratlovců patří taxe neboli upřesňující pohyb, který je silně vázán na podnět. Taxe je vrozená přitažlivá (=pozitivní) nebo odpudivá (=negativní) odpověď na určitý faktor životního prostředí, kterým může být světlo, pach, zvuk, atd. Potom rozlišujeme fototaxi, fonotaxi a další. Tyto pohyby jsou určovány strukturou krajiny a mohou být významně modifikovány náklady na cestu i samotným rozhodováním živočichů (Bowler a Benton 2005). Disperze je speciální druh pohybu z jednoho místa na druhé (Lidicker a Stenseth 1992), který definuje Lidicker a Stenseth (1992) jako jednosměrné specifické pohyby zvířat s účelem nalezení prázdného, vhodného prostoru pro vytvoření vlastních teritorií. Při nich jedinci opouštějí původní teritorium nebo místo narození. Je nutno ji odlišit od migrace, což jsou sezónní nebo opakované, dlouhé směrované pohyby zvířat mezi dvěma nebo více habitaty (Bowler a Benton 2005). Jedinci se mohou vracet zpět do rodných míst. V tomhle smyslu migrace probíhá v rámci jedné generace a nezahrnuje tok genů. Pravá disperze zahrnuje fázi odchodu, vlastní cesty a příchod na nové území. Příchod může chybět, pokud zvíře během cesty zahyne (Lidicker a Stenseth 1992). Tento proces zahrnuje různé typy 7

behaviorálního rozhodování: k opuštění domácího okrsku a pak rozhodnutí usadit se na novém území, kde založí teritorium a kde se bude rozmnožovat (Bowler a Benton 2005). Lidicker a Stenseth (1992) rozlišují vedle disperze další velmi podobné pohyby. Nomadismus („nomadism“) se dá chápat jako kočovnání, kdy jedinec nemá stálé domovské teritorium a nepravidelně se potuluje. Předehrou k samotné disperzi může být explorace, kdy zvířata podnikají běžné krátkodobé výjezdy z domovských teritorií. Při nich pátrají po vhodných sexuálních partnerech, lepších zdrojích nebo životních podmínkách a zase se vracejí zpět. Dále je možné vyčlenit další pohyb velmi blízký disperzi, kdy někteří jedinci označovaní jako tzv. „shifters“ postupně připojují k jednomu okraji domovského okrsku sousedící nová území a zároveň část území opouštějí. Tím se posouvá celý okrsek. Disperze jako taková se dělí na disperzi za účelem rozmnožování („breeding dispersal“), neboli pohyb mezi dvěma reprodukčními místy, a disperzi mladých jedinců z místa narození do místa prvního spáření označovanou jako „natal dispersal“ (Bowler a Benton 2005; Greenwood 1980). Evoluce těchto dvou typů dispeze patrně probíhala různými selekčními tlaky (Bowler a Benton 2005).

1.1.2 Příčiny disperze Krátkodobý nedostatek zdrojů (především potravy) řeší některé organizmy stavem strnulosti nebo hibernací. Dále se dá překonat dvěma cestami: adaptací na tento nedostatek nebo nalezením jiných, úrodnějších míst. Kromě nedostatku potravy mohou být nepříznivými podmínkami prostředí vedoucími k disperzi jedinců například nedostatek úkrytů, zvýšený predační tlak či parazitární zátěž, popř. chlad (Bowler a Benton 2005). Nezanedbatelný význam má sociální kompetice mezi jedinci o dostupné zdroje (Lidicker a Stenseth 1992). Při přemnožení zvířat dochází k omezením v dostupnosti zdrojů. Disperze pak může být selekčně výhodná, zejména v oblastech, kde se rychle mění kvalita habitatu, jejíž pokles může v extrémním případě vést až k extinkci populace (Bowler a Benton 2005). Dalším důvodem, proč zvolit disperzi namísto filopatrie, je zabránění příbuzenského křížení neboli inbreedingu, vliv mají i demografické parametry jako věk, pohlaví, zmíněná hustota populace, ale také sociální vztahy mezi jedinci (Lidicker a Stenseth 1992; Bowler a Benton 2005). Někteří autoři totiž považují filopatrii za vítěznou strategii a disperzi za dostupnou alternativu pro jedince „nižší kvality“, která je pro ně nejlepší alternativou ze špatných. K disperzi jsou nuceni slabší, 8

podřadnější jedinci s nízkou reprodukční schopností, pro které to je často jediná možnost, jak přežít. Nátlak působí většinou starší dominantní samci postavení na vyšším stupni žebříčku hierarchie, ale ti úplně staří už nemají tolik sil a stávají se oběťmi spolu s mladými samci (Bowler a Benton 2005). Jedinec může opustit domovský okrsek také dobrovolně bez nátlaku okolí. V takovém případě je v relativně dobrém zdravotním stavu a opouští území s docela vhodnými životními podmínkami. Častěji ale dochází k nedobrovolné disperzi, kdy je jedinec nucen odejít, neboť by se rapidně snižovala jeho reprodukční zdatnost neboli fitness (Lidicker a Stenseth 1992). Jedno pohlaví většinou disperguje více než druhé, většinou to, které méně investuje do péče o mláďata (Greenwood 1980). Tímto pohlavím jsou u většiny savců samci, u ptáků tomu může být naopak. Samice ptáků dispergují a vybírají si samce především podle kvality jejich teritoria. Savci jsou většinou polygamní a dominantní samec ovládá své teritorium a samice, které se v něm nachází. Cena inbreedingu je nižší u pohlaví, které více disperguje a méně se stará o potomky, neboť těch mívá toto pohlaví více a tím se zvyšuje pravděpodobnost inbreedingu. Usedlejší pohlaví je navzájem příbuzné v populaci a proto se mezi nimi dá očekávat vyšší míra altruizmu.

1.1.3 Význam disperze Disperze může zlepšit fitness jedince, jestliže se dostane do prostředí s lepšími zdroji i sociálními vztahy. Tento krok však s sebou nese mnoho rizik, například že se jedinec dostane do horších podmínek, nenalezne vhodného partnera, může být vystaven zvýšené parazitaci nebo predaci vedoucí k vyšší mortalitě (Lidicker a Stenseth 1992). Někdy je výhodnější opozdit vlastní reprodukci a nejprve získat kvalitní teritorium (Bowler a Benton 2005). Přírodní populace především z okrajů areálu zpravidla podléhají časté extinkci a rekolonizaci z okolních populací téže metapopulace. Bowler a Benton (2005) definují metapopulaci jako skupinu populací volně spojenou disperzí. Pokud se míra toku genů v důsledku disperze blíží k nule, je metapopulace, respektive celý druh odsouzen k vymření. Naopak pravděpodobnost přežití alespoň jednoho potomka se zvyšuje s rostoucí migrací do více populací v metapopulaci. Pozitivní efekt disperze vzrůstá se vzrůstem nezávislosti mezi pravděpodobnostmi vymření jednotlivých populací (Bowler a Benton 2005). Jedinci mohou při disperzi z domovských habitatů do nových teritorií využít přeběhové cesty neboli 9

koridory, které jsou závislé na biologii druhu a charakteru prostředí, ale mohou vést i přes habitaty, ve kterých se živočich normálně nevyskytuje (Szacki a Liro 1991). Disperze mění prostorové rozmístění jedinců. Může například docházet k většímu shlukování, nebo naopak ke zvýšení rozestupů mezi nimi (Stenseth a Lidicker 1992). Jedním z demografických modelů je systém „source-sink“, který předpokládá existenci přebytku jedinců ve „zdrojové“ populaci, ze které část jejich příslušníků migruje do populace se zápornou růstovou křivkou, označované jako „výlevka“ („sink“; Bowler a Benton 2005). Fretwell a Lucas (1970) navrhli model „ideální volné distribuce“ („ideal free distribution“), podle kterého optimální rozmístění jedinců na daném území jim zajistí rovnocennou fitness ve všech místech. Tento model předpokládá, že jedinci se soustřeďují v místech v množství úměrném množství tam dostupných zdrojů. Pojem „ideální“ se pak vztahuje na schopnost jedinců správně vyhodnotit kvalitu každého místa, zatímco „volný“ označuje jejich možnost volného pohybu z místa na místo. Oba tyto předpoklady však často bývají nesplněny, například jestliže se migrující jedinec zastaví hned na prvním místě, aniž by vyzkoušel místa následující, nebo jestliže v optimálním hledání a příjmu potravy brání přítomnost dominantnějších jedinců. Ústřední představu tohoto modelu, tj. volnou migraci jedinců do míst s optimální kvantitou i kvalitou zdrojů potravy pak Bowler a Benton (2005) přirovnávají k jízdě po několikaproudé dálnici, kdy řidiči se snaží přejíždět z jednoho pruhu do druhého v mylné představě, že tam je jízda rychlejší.

10

1.2.

DISPERZE A HYBRIDIZACE Jak bylo zmíněno v první kapitole, disperze má mnoho evolučních důsledků, z nichž

k nejdůležitějším patří tok genů. Ten může působit jako velmi silný nástroj genetické homogenizace populací, na druhé straně však může redukovat riziko inbreedingu a následného snížení fitness v lokálních populacích (Greenwood 1980; Lidicker a Stenseth 1992). Jestliže však genetické rozrůznění (divergence) mezi těmito populacemi dosáhlo vysokého stupně, tok genů mezi nimi by naopak vedl ke snížení životaschopnosti nebo fertility hybridů (Coyne a Orr 2004).

1.2.1. Reprodukční bariéry mezi druhy Existuje několik desítek definic druhu, z nichž k nejrozšířenějším patří koncepce tzv. biologického druhu, definovaného jako skupina jedinců, mezi kterými probíhá volný tok genů, která je reprodukčně izolována od jiných druhů (Mayr 1942; viz také Coyne a Orr 2004). Z tohoto hlediska je proto pro vznik nových druhů s pohlavním rozmnožováním nezbytný vznik reprodukční bariéry (Coyne a Orr 2004), naopak disperze a s ní spojený tok genů umožňuje překonání těchto reprodukčních bariér. Reprodukční bariéry můžeme rozdělit na prezygotické a postzygotické. Prezygotické, tj. ty, které brání vzniku zygoty, mohou být ekologické jako např. odlišné období páření, prostorová izolace nebo izolace způsobená opylovači. Mezi neekologické patří mechanické bariéry (např. nekompatibilita pohlavních orgánů), gametická inkompatibilita i behaviorální a také sexuální selekce (Coyne a Orr 2004). Behaviorální neboli etologické bariéry zahrnují všechny druhové rozdíly, které brání sexuální přitažlivosti mezi pohlavími v rozmnožovacím období. Jedno pohlaví vysílá signál, který preferentně stimuluje příslušníky opačného pohlaví jen stejného druhu. V těchto signálech se druhy liší. Mohou jimi být např. feromony, kdy jsou jedinci schopni rozeznat i poměrné zastoupení izoforem chemické látky, dále zrakové či zvukové vjemy (např. zpěv ptáků), dotyková komunikace nebo ritualizace páření. K izolaci mezi vznikajícími druhy může dojít i negenetickou změnou v rysu chování, která produkuje behaviorální izolace prostřednictvím učení nebo imprintingu (Kirkpatrick a Ryan 1991).

11

Postzygotické bariéry zamezují správnému vývoji zygoty nebo rozmnožení dospělého potomka. Evoluční síly způsobující postzygotickou izolaci mohou být způsobeny genetickým driftem, selekcí, epistatickými interakcemi mezi geny nebo se mohou vyvinout působením parazitů, kteří způsobují neživotnost hybridů jako hostitelů (Coyne a Orr 2004). Mezi problémy biologického druhu patří mimo jiné i existence přirozených hybridů, často (zejména u rostlin) mezi fylogeneticky vzdálenými druhy. Jak bylo zmíněno v Úvodu, hybridizace může dát vzniknout nové evoluční linii, nezávislé na obou rodičovských druzích (Stebbins 1959; Grant 1992; Arnold 1997). Dobzhansky (1970) považuje speciaci způsobenou hybridizací za nepravděpodobnou, protože z několika málo relativně infertilních kříženců je malá šance založení nové linie. Ovšem pokud budou opakovány podmínky příznivé pro hybridizaci, mohou vzniknout i další hybridní generace (Arnold a Hodges 1995). Prvním hybridním generacím může pomoci k vývoji nové linie například bottleneck. Vždy je pravděpodobnost, že pokročilé hybridní generace ovládnou relativně vhodné genotypy. Aby došlo ke speciaci, nová hybridní linie se reprodukčně izoluje od parentálních populací (Baack a Rieseberg 2007). Přestože se v poslední době množí doklady o vzniku nových druhů hybridizací (Arnold 1997; Arnold a Hodges 1995; Baack a Rieseberg 2007), u živočichů platí, že hybridizace je zpravidla omezena pouze na relativně úzkou hybridní zónu (Sage et al. 1993).

1.2.2. Hybridní zóny Hybridní zóna je definována jako oblast, kde se dvě geneticky odlišné populace setkávají, kříží a dávají vzniknout hybridnímu potomstvu (Barton a Hewitt 1985). Termín „hybrid“ může nabízet klamnou představu, že se jedná jen o jeden fenotyp, hybridní zóna však většinou obsahuje všechny přechodné formy mezi oběma parentálními taxony (Barton a Hewitt 1985). Přestože jsou hybridní jedinci většinou neživotaschopní nebo sterilní díky již zmiňovaným reprodukčním bariérám (Bigelow 1965; Barton a Hewitt 1985; Mayr 1992), jejich fitness nemusí být uniformně nižší než rodičovská, některé studie odhalily stejnou nebo dokonce vyšší fitness v porovnání s rodičovskými taxony (Arnold a Hodges 1995). Výzkumu hybridních zón je v posledních letech věnována značná pozornost, jak z teoretického hlediska, tak v podobě empirických studií (viz např. Macholán et al. 2007 a citace tam uvedené). Tyto zóny mohou být udržovány buď vnější selekcí („extrinsic 12

selection“) v podobě adaptace obou hybridizujících taxonů na odlišná prostředí, nebo vnitřní selekcí („intrinsic selection“) proti hybridům charakterizovaným sníženou fitness (Barton a Hewitt 1985). Typickým typem zóny ovlivňované vnitřní selekcí je tzv. „tenzní zóna“, udržovaná rovnováhou mezi dvěma protichůdnými evolučními mechanismy, selekcí, která má tendenci zónu zužovat, a tokem genů, který ji rozšiřuje. Když tyto dva vlivy působí v rovnováze, šířka hybridní zóny zůstává stabilní. Tenzní zóna není závislá na geografických podmínkách, a proto se může pohybovat z místa na místo, dokud se nezastaví v místě geografické bariéry nebo oblasti s minimální populační hustotou (tzv. populační brázda, „population trough“). Faktory způsobující pohyb tenzní zóny mohou být různá disperze jedinců nebo rozdílná fitness mezi jedinci v lokálních populacích, kdy se očekává pohyb zóny ve prospěch vhodnější alely, a další (Barton a Hewitt 1985). Existují však i případy tzv. superdominance („overdominance“), kdy heterozygotní genotypy mají selekční výhodu. Důsledkem toho je tzv. „omezená nadřazenost hybridů“ (Moore 1977). Hybridní zóny mohou být unimodální nebo bimodální. Unimodální hybridní zóny jsou charakterizovány převahou rekombinovaných genotypů a jsou výsledkem sekundárního kontaktu mezi taxony, mezi kterými existují nedostatečně silné prezygotické nebo postzygotické reprodukční bariéry (Jiggins a Mallet 2000). V evoluci patrně vedou k extinkci jednoho nebo obou druhů nebo k jejich fúzi (Paterson 1978; Liou a Price 1994). V bimodálních zónách převládají rodičovské formy nad hybridy. V těchto zónách se snadněji zkoumají prezygotické izolační mechanizmy (Jiggins a Mallet 2000). K tomuto zkoumání jsou unimodální zóny příliš složité nebo se výzkumy provádějí na okrajích zóny (Smadja et al. 2004). Postupná změna znaku přes geografickou oblast, v našem případě přechod znaku přes hybridní zónu, se označuje jako klina („cline“; Barton a Hewitt 1985). Podle teoretických předpokladů bude selekce proti hybridům bránit výraznějšímu průchodu daného znaku přes hybridní zónu, naopak znaky selekčně neutrální budou přes zónu procházet volně. Klina pro znak pod selekcí bude tedy užší než klina pro znak neutrální. Pokud bychom analyzovali dostatečně velké množství tzv. diagnostických molekulárních znaků (tj. většinou těch, které mají u obou taxonů fixované alternativní alely) rozmístěných víceméně pravidelně po celém genomu, mohli bychom detekovat oblasti nebo geny podílející se na reprodukční bariéře a proto potenciálně odpovědné za speciaci (Payseur et al. 2004). Tyto geny, většinoou označované jako „speciační“, byly dosud objeveny pouze v několika málo případech, většinou u octomilek rodu Drosophila (Coyne a Orr 2004; Orr 2005), u obratlovců pouze u myši 13

(Mihola et al. 2009). U obratlovců je výzkum speciačních genů komplikován mj. tím, že na reprodukční bariéře se u nich většinou podílí až několik desítek genů s menšími účinky (Macholán et al. 2007), navíc se ukazuje, že celková genomová architektura v oblastech genů tak či onak ovlivňujících reprodukční izolaci mezi taxony může být velmi komplikovaná (Macholán et al. 2008; M. Macholán, os. sdělení).

14

1.3.

MYŠ JAKO EVOLUČNÍ MODEL

Vhodným živočichem pro studia fyziologických reakcí na etologické projevy jako je disperze a explorace může být myš. Její výhodou je mj. nenáročný chov, kdy se zvířata rozmnožují během celého roku s krátkou generační dobou 10-12 týdnů (Guénet a Bonhomme 2003). Délka březosti myší trvá asi 19-20 dnů, s množstvím mláďat mírně vzrůstá (Berry a Bronson 1992). Divoké myši plodí 5-8 mláďat, laboratorní 6-10. Za přítomnosti samců mají samice v laboratoři estrus každých 4-5 dní. Nezanedbatelnou výhodou je i znalost sekvence myšího genomu (Mouse genome sequencing consortium 2002) a existence řady velmi podrobných genetických map různých molekulárních markerů (Macholán et al. 2007; Piálek et al. 2007).

1.3.1. Systematické třídění myší Rozčlenění myších taxonů je obtížné, neboť hlodavci obecně jsou velmi progresivní skupina, u které došlo k rozsáhlé přestavbě genomu (Sage et al. 1993; Guénet a Bonhomme 2003). Rychlou evoluci také podporuje r-strategie většiny druhů. Proto dokázali osídlit téměř celý svět a obsadit rozmanité ekologické niky od podzemních, zemních, polovodních až po stromové v rámci různých nadmořských výšek.

15

Obr. 1 Evoluční strom rodu Mus. (Guénet a Bonhomme 2003)

Rod Mus vznikl asi před 5 mil. let (She et al. 1990; Boursot et al. 1993). Zjednodušený fylogenetický strom je ukázán na Obr. 1 (Guénet a Bonhomme 2003). Z ekologického hlediska se myši dělí na komenzální (synantropní) a nekomenzální, žijící ve volné přírodě víceméně nezávisle na člověku (Sage 1981; Sage et al. 1993; Guénet a Bonhomme 2003). V evropském kontextu patří do nekomenzální skupiny 4 druhy: Mus spretus, M. spicilegus, M. macedonicus a M. cypriacus (Sage et al. 1993; Cucchi et al. 2006). M. spretus se vyskytuje v jižní části Španělska, jeho areál zasahuje i do jižní Francie a severní oblasti Maroka a Libye (Sage et al. 1993). Areál M. spicilegus se táhne od jihovýchodní části Rakouska přes Rumunsko až po sever Ukrajiny. M. macedonicus žije jižněji, od Makedonie po Izrael a východ Iránu. Do komenzální skupiny patří myš domácí (Mus musculus). Vyznačuje se velkou flexibilitou ve výběru různorodých stanovišť a může žít i mimo lidská obydlí. Populace žijící sekundárně permanentně nekomenzálním způsobem se označují jako ferální. Jednotlivé formy M. musculus jsou považovány za poddruhy (např. Boursot et al. 1993), nebo samostatné druhy 16

(např. Sage et al. 1993). M. m. batrianus se vyskytuje v oblasti od Íránu po Indii, její samostatný status je však nejistý (Boursot et al. 1993). M. m. castaneus žije v jihovýchodní oblasti Asie a na Srí Lance, v zadní Indii. M. m. musculus se vyskytuje v rozsáhlém areálu od východní a severní Evropy až po Dálný východ, zatímco M. m. domesticus obývá západní a jižní Evropu, Afriku, Austrálii a obě Ameriky (Obr. 2). V Číně a v Japonsku se areál M. m. musculus překrývá s areálem M. m. castaneus, se kterou se kříží za vzniku hybridního taxonu M. m. molossinus (Yonekawa et al. 1988). Vzhledem k výrazné odlišnosti mitochondriální DNA je někdy za samostatný poddruh považována linie obývající oblast Jemenu a Madagaskaru M. m. gentilulus (Harrison 1972). Evoluční původ myši je údajně v Indii (Guénet a Bonhomme 2003), odkud se postupně rozšiřovala explozivní radiací různými směry (Auffray et al. 1990). M. m. musculus táhl přes Rusko a severní Čínu do východní Evropy. Mus musculus domesticus (M. m. domesticus) postupoval na západ do Afriky a Blízký východ, kde se začal někdy v období Holocénu střetávat s příbuzným M. m. musculus kolonizující Evropu od Černého moře a křížit se s ním za vzniku hybridní zóny (Sage 1981; Boursot et al. 1993).

17

Obr. 2 Rozšíření některých komenzálních poddruhů myši domácí. (upraveno podle Boursot et al. 1993; Guénet a Bonhomme 2003).

Nyní se podrobněji zaměřím na dva komenzální poddruhy M. m. musculus a M. m. domesticus. M. m. musculus má světlejší hřbet a především břišní stranu těla, která je bílá nebo šedobílá, s jasně zřetelným rozhraním a ocasem většinou kratším než tělo a hlava. M. m. domesticus je co do zbarvení velice proměnlivá, v mírném pásmu však většinou tmavší, s nezřetelnou hranicí mezi hřbetní a břišní stranou těla a delším ocasem než tělo (Marshall a Sage 1981; Sage 1981). Je agresivnější a vždy vyhrává ve střetech se submisivnějším M. m. musculus (Munclinger a Frynta 2000; Piálek et al. 2007). Ačkoli se oba poddruhy řadí k synantropním formám vázaným na člověka, mohou se někteří jedinci občas vyskytnout i 18

mimo lidská obydlí (Rowe et al. 1987). Především M. m. musculus často obývá obilná pole, někdy i křoviny a traviny. Studie ukázaly, že část jedinců tohoto poddruhu se v mírném pásu na jaře vydává do volné přírody vzdálenějšího okolí, ale na podzim se vracejí zpět k ostatním do domů, stodol, kůlen, kde přečkávají zimu (Carlsen 1993). Živí se obilím nebo lidskými potravinami, které nakoušou a znehodnotí trusem. U M. m. domesticus je v Evropě výskyt mimo lidská sídla vzácnější, ale dokáže žít celoročně ve volné přírodě a to i v extrémnějších podmínkách, kde se může vyhnout kompetici se silnějšími exoantropními druhy. Mimo tento kontinent jsou nálezy v extrémních biotopech častější. Byly nalezeny v pouštích Arabského poloostrova a na ostrovech u jižního polárního kruhu (Berry 1981; Sage 1981).

1.3.2. Myší hybridní zóna v Evropě M. m. musculus a M. m. domesticus se spolu vzájemně kříží na pomezí svých areálů v Evropě a Asii a s jejich hybridy vytváří sekundární unimodální hybridní zónu (Auffray et al. 1990; Boursot et al. 1993; Sage et al. 1993). Přibližnou lokalizaci zóny můžete vidět na Obr. 3. Tato zóna je přibližně 2500 km dlouhá a táhne se napříč Jutským poloostrovem a dále od pobřeží Baltského moře přes střední Evropu a Balkán až k moři Černému (Boursot et al. 1993; Sage et al. 1993; Macholán et al. 2003). Na Balkáně vznikla dříve (asi před 6000 lety) než na severu (asi před 2800 lety: Auffray et al. 1990; Auffray 1993). Přes rozdílné stáří zóny v různých oblastech Evropy se zdá, že její šířka je na věku nezávislá (Macholán et al. 2007). Dosavadní výzkumy se shodují, že hybridní zóna domácích myší je tenzního typu, tzn. je udržována rovnováhou mezi disperzí a selekcí proti hybridům (Macholán et al. 2007). Nepřímé důkazy naznačují, že hybridní jedinci mají sníženou reprodukční zdatnost (Macholán et al. 2007, 2008). Ta se projevuje patrně nižší odolností hybridů ze středu zóny vůči parazitům (Sage et al. 1986). Šířka klin se mezi jednotlivými markery značně liší. Nejužší kliny jsou pro markery na pohlavních chromozomech, kde by se teoreticky mohly nacházet tzv. „speciační geny“ odpovědné za nedostatečně vytvořenou reprodukční bariéru mezi poddruhy (Payseur et al. 2004; Macholán et al. 2007). Přestože je tato hybridní zóna nezávislá na vnějším prostředí, místní podmínky můžou mít na její průběh a dynamiku významný vliv. Významnou roli mohou hrát například řeky či vodní plochy, neboť myši se vyhýbají vodě, i když plavat umí. V lokálním měřítku tak mohou i relativně malé vodní toky výrazně odchylovat tok genů, jak bylo ukázáno v dánské i české 19

části hybridní zóny (S.J.E. Baird a M. Macholám, nepublikované údaje). Například v oblasti, kde zóna protíná západní cíp České republiky, se nachází Ohře, a její dva levé přítoky křižují zónu a tvoří tak bariéru toku genů mezi oběma poddruhy (Macholán et al. 2007). Šířka zóny je skutečně v severní části zkoumaného území statisticky průkazně užší než v části střední a jižní (M. Macholán, os. sdělení).

Mus musculus domesticus

Mus musculus musculus

Obr. 3 Přibližný průběh hybridní zóny mezi dvěma poddruhy myši domácí v Evropě (podle Macholán et al. 2008).

1.3.3. Sociální struktura myší Zdá se, že míra synantropie má vliv na sociální systém myší (Crowcroft 1955; Gray et al. 2000). V přírodě tvoří většinou větší volnější skupinky, zato v budovách jen asi od 4 do 10 vzájemně příbuzných jedinců. Toto uspořádání se nazývá dém. Gray et al. (2000) popsali souvislost mezi hustotou myší populace a strukturou prostoru. Struktura prostředí hraje důležitou roli v uspořádání dému a v ovlivnění jeho podmínek. Jiná je např. ve stodolách s obilím a ve skladech. Komplexita habitatu, objekty a překážky určují velikost dému a jeho stabilitu, sociální chování a využití prostoru. Složitější struktura prostředí s překážkami poskytuje zvířatům určitou míru ochrany proti predátorům. Dém je hlídán jedním 20

dominantním samcem (Crowcroft a Rowe 1963, Singleton 1983), který ubrání proti cizím samcům hůř teritorium se složitější strukturou, protože vetřelec se snadněji skryje a vyhne přímému útoku (Gray et al. 2000). V teritoriu má hnízdo několik většinou příbuzných samic s mláďaty dominantního samce (Singleton 1983). Dém může obsahovat i několik podřízených samečků a nepříbuzných samiček (Gray et al. 2000). Dominantní samec udržuje strukturu dému a své postavení agresivitou (Crowcroft 1955), kterou může získat samice, ale hlavně je brání proti páření s jinými samci a podle konkrétní situace (stupni komenzalizmu, dostupnosti zdrojů potravy, agresivity své i ostatních samců a také uspořádání terénu teritoria) je často vyžene z dému. Postavení každého jedince v dému určuje především věk a dále mnoho podmínek, např. agresivita nebo míra sociální vazby, které mají do značné míry dědičný podklad a mění se s věkem (Gerlach 1998). Má na ně vliv sociální situace, potravní nebo teplotní i další. Ale ani přísnost ve stabilním dému není tak striktní, jak by se mohlo zdát. Samice obývají také své vlastní teritorium, které ale může zasahovat i na území teritoria jiného samce (Reimer a Petras 1967). Mláďata patří prakticky tomu samci, v jehož teritoriu se nachází hnízdo. Mimo samotný dém, samice často spolužijí s jinými, většinou příbuznými, samicemi a starají se společně o mláďata (Reimer a Petras 1967; Rusu et al. 2004). Vyšší míra příbuznosti snižuje agresi mezi nimi (Rusu et al. 2004). Ale starší sestry dominují mladším, dokonce i když mají nižší tělesnou váhu. Mají také přednost při páření s dominantním samcem. I přes to je pro podřadné samice výhodnější společné soužití s jinými samicemi než samostatné hnízdo (Reimer a Petras 1967; Rusu et al. 2004). Tuto reprodukční kooperaci mohou zakládat i nepříbuzné samice za účelem zvýšení vlastní fitness, v tom případě však byla mezi nimi pozorována vyšší míra agonismu a nižší hustota zvířat. Hnízdo většinou sdílí kolem osmi jedinců, kteří se sdruží před plozením mláďat (Rusu et al. 2004). Příslušníci dému jsou rozpoznáni pachovou signalizací z myší moči, kterou značkují teritorium a rozpoznávají jedince svého dému i cizince a migranty (Crowcroft a Rowe 1963; Hurst 1990). Dém ale nemá dlouhou trvanlivost, rozpadá se asi po 2-7 měsících (Singleton 1983, Hauffe et al. 2000). Mění se v závislosti na podmínkách uvnitř skupiny. Dochází k disperzi, která bývá popisována jako charakteristika exploračního chování.

21

1.3.4. Explorace a disperze u myší Explorace souvisí s disperzí a tendence k disperzi je založena na dědičném základě (Krackow 2003). Motivací opustit svou domovskou populaci jsou, jako u všech dispergujících, nedostatek zdrojů, sociální vztahy, hustota populace, zachování polymorfizmu a jiné. Disperze myší je ovlivněna mnoha faktory, jako je pohlaví myší, míra komenzalizmu a další (Pocock et al. 2004). Emigrace může být silně závislá na sociálních faktorech (Gerlach 1996), dispergují často jedinci se slabšími sociálními vazbami (Gerlach 1998). V sociálních vazbách mláďat po odstavení od matky nejsou mezi pohlavími rozdíly. Tyto rozdíly se ukáží až po sexuálním dozrávání, kdy se u samců sociální vazby rapidně zmenšují. U samic nebyly nalezeny rozdíly v sociálních vztazích mezi usedlými a emigrujícími ani gravidními a negravidními stejného věku. Bardet et al. (2007) testovali, jestli silná sociální vazba pomůže jedincům Mus spicilegus překonat překážku, v tomto případě 40 cm dlouhý koridor naplněný vodou. Jelikož je tento exoantropní poddruh myši domácí monogamní a samice nezakládají užší vztahy s příbuznými jako jiné myši, tato hypotéza se nepotvrdila. Nicméně samci se více vyhýbali nepříbuzným protějškům. Ale zvířata byla více zaujata explorací než přítomností více či méně příbuzného jedince stejného pohlaví na opačném konci zařízení. Pozoruhodný byl postoj zvířat k vodě. Samci raději vstupovali do vodního prostředí než samice, ale zůstávali v něm kratší dobu než opačné pohlaví. Disperzi může podpořit změna nebo destrukce komenzálního habitatu, např. sezónním uskladněním obilí nebo ustájením dobytka (Carlsen 1993). To podporuje vystěhování myší na léto do polí a tam se často drží v blízkosti budov. Návrat na podzim pod střechu může souviset s vyšší konkurencí malých savců v polích (Carlsen 1993). Někteří ale neopouštějí budovy vůbec (Brown 1953). Disperze ve stabilních komenzálních habitatech má nižší rychlost a zahrnuje kratší výpravy než ve volné přírodě (Brown 1953; Reimer a Petras 1968; Rowe et al. 1987). Mnoho autorů uvádí vzdálenost pohybu myší několik desítek metrů (Berry 1981; Sage 1981; Haufe et al. 2000; Pocock et al. 2004, 2005), někteří jedinci jsou však schopni překonat i 1000 m (Berry 1968). Jedinci se mohou pohybovat na větší vzdálenosti (více než 50 m), aniž by dispergovali a vracejí se zpět do rodného místa (Pocock at al. 2003, 2004). Postupné připojování nových oblastí k domovskému okrsku nebylo u komenzálních myší zaznamenáno, pravděpodobně

22

proto, že je mnoho stálých krajinných rysů, které poskytují stabilní teritoriální hranice (Pocock et al. 2004). Více dispergují samci, a z nich pak nejčastěji mladí jedinci (Gerlach 1996; Krackow 2005). Vyšší tendenci k disperzi mají často také agresivnější samci (Krackow 2005). Ale Blair a Gariepy (2008), a v laboratorních podmínkách i Gerlach (1996), zaznamenali nižší explorační tendenci u agresivnějších samců. Submisivnější byli vyhnáni agresivnějšími samci, často otcem (Gerlach 1996). Pokud dispergovaly samice, tak to byly ty, které se narodily v pozdějším vrhu, než jejich konkurenční sestry, a tudíž se sníženou šancí na reprodukci. Frynta (1992) porovnával exploraci mezi několika zástupci čeledi Muridae. Z testovaných druhů některých myšic (Apodemus agrarius agrarius, A. microps, A. sylvaticus, A. flavicollis, A. mystacinus) a myší (M. m. musculus, M. m. domesticus a jejich kříženců) explorační aktivitou nejdéle času v průměru strávil druh A. mystacinus, který také vykonával nejdelší trasy. Na druhém konci žebříčku pořadí se umístil A. agrarius. O dva roky později publikoval Frynta (1994) ve svém článku další experimenty s trochu pozměněnými podmínkami (menší aréna) na zhodnocení rozdílů v exploraci u těchto a dalších druhů a opět první a poslední místo obhájily stejné druhy jako v předchozím případě. Přidanými druhy byly: A. peninsulae, Lemniscomys barbarus, Micromys minutus, Acomys cahirinus a M. macedonicus. Mezi favority na nejdelší čas explorační aktivity také patřila pražská populace M. m. musculus, ta také nejčastěji navštívila nejvzdálenější oblast arény a nejméně času strávila ve svém boxu. Myšici A. mantchuricus trvalo v průměru nejméně času, než se vydala na průzkum explorační arény, zatímco nejdéle se před explorací zdržoval M. macedonicus. Nejvzdálenějšího místa nejdříve dosáhla Acomys cahirinus oproti Apodemus peninsulae. Tyto výsledky naznačují, že explorace je druhově specifická a odlišná a souvisí s ekologickým uspořádáním daného druhu (Frynta 1994). Zvířata obývající suché a skalnaté oblasti (A. mystacinus) jsou více pohyblivá, což naznačují i dlouhé hmatové chlupy. Naopak druhy z hustě zarostlých, vlhkých a úrodných habitatů (A. agrarius) jsou stálejšími obyvateli svého doupěte. Napovídají tomu i výsledky Malygina (1983 in Frynta 1994) a Neva (1991 in Frynta 1994). Na chování zvířete má nezanedbatelný vliv stres, mimo jiné z nových podmínek, do kterých se živočich dostane. V laboratorních pokusech určitě hraje roli míra komenzalizmu testovaných jedinců (Frynta 1994). M. m. musculus v explorační aréně strávil méně času schován uvnitř boxu s hnízdem a byl pohyblivější než ferální M. m. macedonicus. Tomu odpovídají poznatky naměřených vyšších hladin kortikosteronu u volně žijících populací M. 23

m. domesticus než u stejného poddruhu komenzálů (Ganem 1991 – in Frynta, 1994). Důsledkem vyššího stresu v laboratorních podmínkách mohou ferální zvířata vykazovat nižší stupeň explorace. Ke zhodnocení těchto okolností by mohly pomoci výsledky pohybových aktivit živočichů v korelaci s měřenými hormony.

24

1.4.

NEGATIVNÍ FYZIOLOGICKÉ EXPLORAČNÍHO CHOVÁNÍ

DOPADY

DISPERZE

A

Disperze živočichů zahrnuje, kromě šance na zlepšení jejich fitness, řadu nepříznivých faktorů (Lidicker a Stenseth 1992). Jedinec se dostane do nových, jemu neznámých, podmínek, kde neví, co ho může čekat. Tyto podmínky pro něj mohou být nepříznivé – ať už se jedná o nedostatek potravy nebo o nedostatek vhodných míst pro úkryt. Na cestách často narazí na bariéry, které někdy nedokáže snadno překonat. V případě myší to mohou být např. silnice, pásy rodinných domů, orná pole nebo vodní překážky (Szacki a Liro 1991). Laboratorní pokusy naznačují, že voda působí pro malé hlodavce jako silný stresor, i když umí dobře plavat (Aguilar-Valles et al. 2005; Harrison et al. 2009). Lépe vodní prostředí snášejí potkani. O vztahu myší k vodě se ví málo. Bardet et al. (2007) pomocí laboratorních testů zjistili, že samice Mus spicilegus jen neochotně vstupovaly do koridoru s vodou, ale když už se tak stalo, tak samotný pohyb v tomto prostředí jim nečinil potíže a dokázaly tam vydržet i po relativně dlouhou dobu. Ovšem u samců tomu bylo obráceně. Další rizika disperze odhalili Lidicker a Stenseth (1992). Zjistili, že dispergující zvířata mají nejen díky zvýšené predaci zvýšenou mortalitu a také více parazitů než jedinci obývající své rodné území. Všechny tyto faktory - interakce s novým prostředím, novými jedinci, patogeny a parazity, zvyšují stres a energetické a fyziologické nároky na dispergujícího jedince. Vyrovnání se se stresory je velmi důležitý faktor ovlivňující výsledek disperze daného jedince a potažmo jeho fitness. Stres a zvládnutí zátěžových situací může být důležitým faktorem ovlivňujícím životaschopnost a reprodukční úspěšnost jedince, nejen dispergujícího (Moberg a Mench 2000).

25

1.5.

STRESOVÉ HORMONY A JEJICH METABOLIZMUS

1.5.1. Stres Živý organizmus je otevřený systém, který komunikuje s vnějším prostředím, vyměňuje látky, energii a informace. Navzdory této dynamičnosti si snaží udržet rovnovážný stav vnitřního prostředí – homeostázu. Při překročení individuálních hranic dochází ke smrti. Ale prostředí, ve kterém se živočich nachází, mu připravuje různé situace, s jejichž nepříznivými vlivy se vždy nemůže vyrovnat a reaguje na ně abnormálně. Vlivy vyvolávající stresovou reakci se označují jako stresory (Möstl a Palme 2002). Ačkoli je stres běžnou záležitostí každého tvora, neexistuje jeho přesná definice (Hofer a East 1998; Moberg a Mench 2000; Sapolsky et al. 2000; McEwen a Wingfield 2003; Wielebnowski 2003; Romero 2004), možná jen definice na míru v různých disciplínách. Disperze představuje pro zvíře velmi mnoho stresových faktorů, které ohrožují jeho homeostázu (Lidicker a Stenseth 1992). Habitaty nejsou stálé a na nepředvídatelné komponenty prostředí se živočich nemůže adaptovat (Möstl a Palme 2002). Projevy zvířete jsou velice individuální (von Holst 1998). Záleží na druhu stresoru, jeho intenzitě a době trvání, nepředvídatelnosti a liší se hlavně ve vnímání jednotlivcem. Moberg a Mench (2000) rozdělují tři stavy fyziologické odpovědi organizmu na působení stresoru. Nejdříve musí stresor rozpoznat centrální nervový systém (McEwen a Stellar 1993; Moberg a Mench 2000). Ve druhé fázi dochází k reakci organizmu, který se se stresem vyrovnává mnoha způsoby (behaviorálně, autonomní, neuroendokrinní nebo imunologickou odpovědí), které v důsledku snahy eliminovat stresor mohou reagovat abnormálně. Ve třetí fázi, ke které může i nemusí dojít, se vyvíjí z abnormálního fungování systému patologický stav. První odpovědí organizmu na stres je změna jeho chování (Moberg a Mench 2000). Zvířata se např. mohou stresoru vyhýbat pohybem od něj. To samozřejmě ve většině případů nestačí a do odpovědi se zapojuje autonomní nervový systém. Pokud stresor trvá krátkou dobu, vyvolá reakci tzv. „flight and fight syndrom“ (uteč nebo bojuj) způsobenou zvýšenou aktivitou autonomního sympatického systému, nezávislého na mozku (Cannon 1929). Ten stimuluje vyloučení katecholaminů, které ve zlomcích sekundy vyvolávají poplachovou reakci. Pokud stresor trvá déle – dny, týdny nebo i měsíce – dochází k další fázi stresové 26

reakce označované jako „general adaptation syndrom“ (všeobecný adaptační syndrom), kdy se jedinec snaží přizpůsobit změněným podmínkám. Tato fáze má důležitý evoluční význam v adaptaci živočišných druhů (Hofer a East 1998). Je řízena účinky glukokortikoidů vyplavovaných z kůry nadledvin stimulací adrenokortikotropního hormonu z adenohypofýzy. Toto fyziologické řízení se uplatňuje také při dějích, které neoznačujeme jako stresové (von Holst 1998; Romero 2004). Jde obecně o stavy emočního vzrušení, do kterých jsou zahrnuty např. námluvy, sexuální chování, lov nebo u člověka adrenalinové sporty. U krátkodobého stresu mohou tyto hormony zlepšovat fitness energetickou mobilizací a změnou chování (Korte et al. 1993; Möstl a Palme 2002). Nicméně při déletrvajícím působení stresoru dochází k chronickému stresu, který má mnoho nepříznivých ůčinků na správné fyziologické funkce organizmu (Munck et al. 1984; Touma a Palme 2005). Zahrnuto je mnoho tělních systémů: imunitní řízení, chování, neuroendokrinní systém, autokrinní nervový systém (von Holst 1998; Moberg a Mench 2000; Romero 2004). Při stresu jsou blokovány činnosti, které nejsou životně nutné, např. sexuální chování, dochází k potlačení sekrece hormonů štítné žlázy a funkce pohlavního ústrojí a zpomaluje se růst (von Holst 1998; Moberg a Mench 2000). Při příliš dlouhém zatížení organizmu ve stresu až k vyčerpání fyziologických rezerv dochází k trvalému poškození. Chronický stres je jednou z příčin vývoje lidských chorob, jako jsou deprese, úzkost, rakoviny, asthma, kardiovaskulární choroby, diabetes nebo demence (von Holst 1998; Sapolsky et al. 2000).

1.5.2. Metabolizmus katecholaminů Zásadní úlohu v obraně organizmu proti stresu hrají nepochybně hormony. Mezi výše zmíněné „stresové“ hormony patří glukokortikoidy a katecholaminy. První obrannou linií je vylučování katecholaminů (derivátů aminokyseliny tyrozinu) z dřeně nadledvinek, které ve zlomcích sekundy vyvolávají poplachovou reakci (Moberg a Mench 2000). Dva hormony adrenalin/epinefrin a

noradrenalin/nonepinefrin působí na kardiovaskulární systém,

metabolizmus a hladké svalstvo. Oba mobilizují energetické rezervy lýzou tuků, glykogenu v játrech a svalech, stimulují přijímání glukózy do buněk. Zvyšují výkon srdce, krevní tlak (adrenalin systolický, noradrenalin systolický i diastolický), zásobování mozku a kosterního svalstva na úkor prokrvení trávicího traktu a pokožky. Mají vazodilatační účinek na koronární arterie a rozšiřují bronchy. Zvíře se začne více potit, zvýší se mu tepová frekvence a tlak, 27

prohloubí dýchání a tím příjem kyslíku. Svaly jsou napjaté - připravené k obraně, útoku nebo útěku. Podle von Holsta (1998) může mít noradrenalin původ jako neurotransmiter ze sympatického nervstva. Katecholaminy mají velmi krátkou životnost, rozkládají se během 10-30 sekund (von Holst 1998) účinkem monoamin oxidázy, katechol-O-methyl-transferázy (Eisenhofer et al. 2001), tyrozin hydroxylázy a dalších enzymů (von Holst 1998). Tyto enzymy štěpí katecholaminy na vanillylmandelic acid. U člověka se vylučují jako konjugáty především močí (Moleman et al. 1992). U myší a jiných živočichů zatím data chybí (Palme et al. 2005).

1.5.3. Metabolizmus glukokortikoidů U déletrvajícího stresoru začne hypotalamus stimulovat kortikoliberinem produkci adrenokortikotropního hormonu z adenohypofýzy. Ten stimuluje kůru nadledvin k tvorbě glukokortikoidů jako kortizolu a kortikosteronu. Ty zvyšují hladinu glykémie na úkor bílkovin, zesilují srdeční stah, mají vazokonstrikční účinky na periferní cévy. Zvyšují produkci žaludeční šťávy a v ledvinách stimulují retenci vody. Navíc mají protizánětlivý, protialergický a imunosupresivní účinek a potlačují strach. U některých druhů je sekretován kortizol, u jiných kortikosteron nebo oba hormony (von Holst 1998). Pokud jsou vylučovány oba, jejich vzájemný vztah se může měnit během období života nebo po stimulaci adrenokortikotropního hormonu (Palme et al. 2005), mohou však mít i rozdílné funkce. Pokud např. kortizol dominuje na periferiích, hlavním glukokortikoidem v mozku je kortikosteron. Glukokortikoidy jsou z kůry nadledvin vylučovány do krve, kde kolují vázány na proteiny plazmy. Ale pouze volné glukokortiokoidy jsou biologicky aktivní, schopné se navázat na cílové buňky (Romero 2004), současně jsou však méně stabilní, náchylné k metabolizaci. Glukokortikoidy jsou rozkládány především v játrech, kde vznikají jejich konjugáty – sulfáty nebo soli kyseliny glukuronové (Möstl a Palme 2002). Jsou vylučovány žlučí do dvanáctníku nebo přes ledviny močí ven z těla. Ve střevě dále mohou měnit svoji strukturu díky enzymům střevních bakterií, než se vyloučí se stolicí (Palme et al. 2005). Navíc se mohou ze střeva reabsorbovat zpátky do krve (enterohepatická cirkulace) nebo reagovat s jinými látkami v těle, takže v moči nebo trusu budou převažovat jen metabolity původních glukokortikoidů. V moči se objeví tedy dříve než v trusu o dobu, než projde trávenina střevem od dvanáctníku po konečník (Palme et al. 1996). Tato doba se liší u různých druhů, může být méně než 30 28

minut až více jak jeden den. Může se lišit i v rámci jednoho druhu mezi pohlavími (Palme et al. 2005). Také poměr vylučování glukokortikoidních metabolitů je druhově závislý. Např. u potkana (Bamberg et al. 2001) nebo kočky (Palme et al. 2001; Schatz a Palme 2001) je vysoký podíl metabolitů obsažen ve stolici, zatímco pes (Palme et al. 2001; Schatz a Palme 2001) nebo prase (Palme et al. 1996) je vylučuje převážně močí. Způsob nebo množství exkrece metabolitů hormonů se liší i u různých pohlaví (Palme et al. 2005). Druhové i pohlavní rozdíly jsou i v typech exkretovaných metabolitů glukokortikoidů (Palme et al. 2005). Kortizol se často rozkládá na androstanes (např. 11,17-dioxoandrostanes) (Lindner 1972). Myš vylučuje více metabolitů stresových hormonů stolicí než močí, mezi pohlavími však existují rozdíly: samci cca 73 % trusem a samice jen cca 53 % (Touma et al. 2003). Stresové hormony vyplavené do krve během pokusu se v moči projeví asi po dvou hodinách, v trusu v závislosti na cirkadiálním rytmu po 4-10 hodinách (Touma et al. 2003). Mohou existovat i rozdíly mezi synantropními a exoantropními populacemi téhož druhu – například v komenzálních populacích myši bodlinaté (Acomys cahirinus) byly zjištěny vyšší hladiny fekálních metabolitů glukokortikoidů než v populacích ferálních (Nováková et al. 2008). Na rozdíl od domácích myší však byly hladiny metabolitů v trusu komenzálních samců A. cahirinus nižší než u samic. Naopak koncentrace metabolitů nebyly závislé na sociálním postavení.

29

2.1.

NEINVAZIVNÍ MĚŘENÍ STRESOVÝCH HORMONŮ Jelikož se stres projevuje mnoha aspekty a velmi individuálně, jeho měření je velmi

obtížné (Moberg a Mench 2000). Míra stresu se dá odhadnout z množství stresových hormonů nebo jejich metabolitů. Využívá se především glukokortikoidů, protože měření katecholaminů je velmi složité kvůli rychlé sekreci i rozkladu (von Holst 1998). Ty jsou těžce měřitelné z krve i moči, která se musí ihned po odběru uchovávat při nízké teplotě. Proto se jejich sekrece stanovuje nepřímo – z krevního tlaku, tepu nebo měřením aktivity enzymů zapojených do jejich biosyntézy. Glukokortikoidy se izolují z různých tělních tkání, sekretů nebo exkretů: krve, slin, moči, trusu, popř. mléka (Palme a Möstl 2000). Díky denním a ročním rytmům mohou hladiny hormonů kolísat (von Holst 1998; Romero 2004), koncentrace glukokortikoidů se může v krvi měnit několikrát během několika minut (von Holst 1998). Odebírání slin také narušuje klid živočichů a odběr moči je technicky nákladný. Nejčastěji používaná metoda je stanovení koncentrací kortizolu z krve (von Holst 1998). Ale odběr krve je sám o sobě pro zvířata stresující (Palme a Möstl 2000; Palme et al. 2005), především u drobných druhů, jako jsou hlodavci nebo ptáci, u kterých se dá navíc odebrat jen omezené množství. U divokých zvířat nebo v některých zoologických zahradách může být odběr krve nebezpečný nebo nemožný. Použití katetru nebo mobilního zařízení na odběr krve není sice pro živočichy tak stresující, ale tyto metody jsou velmi náročné a pracné (Palme a Möstl 2000). Na druhé straně nové biochemické metody umožňují využít skutečnosti, že metabolické produkty většiny hormonů jsou i po několika hodinách vylučovány z těla v trusu či v moči (Palme a Möstl 2000). Odběr trusu není náročný a pro sledovaného jedince nepředstavuje žádné další stresující podmínky. Tyto metody se označují jako neinvazivní, protože nenarušují integritu zkoumaných objektů, a proto nalézají časté využití v ochranářské genetice nebo kriminalistice. K odhadu míry stresu z trusu byla navržena řada experimentálních protokolů (Palme a Möstl 2000; Möstl a Palme 2002; Palme et al. 2005). Trus se bez vyrušení zvířat může sbírat i opakovaně během delší časové periody – především tyto opakované sběry jsou vhodné ke stanovení přesného množství metabolitů stresových hormonů. Tato metoda už byla úspěšně použita u různých druhů domácích, divokých a laboratorních zvířat (Palme et al. 2005), například hlodavců (Bamberg et al. 2001; Touma et al. 2003), dobytka (Palme et al. 1996) a jiných hospodářských i domácích druhů savců i ptáků 30

(Schatz a Palme 2001; Hirschenhauser et al. 2005), lesní zvěře (Monclús et al. 2006) nebo primátů (Bahr et al. 2000). Použít se dají vzorky čerstvé i po sušení, čerstvé jsou však vhodnější kvůli jednodušší manipulaci (Möstl a Palme 2002; Palme et al. 2005; Palme 2005). Uchovávání vzorků je možné i pomocí alkoholu nebo kyselin, ale alkohol má tendenci extrahovat steroidy, jejichž úbytek by pak ovlivňoval výsledky (Palme 2005). Proto je vhodné upravit množství alkoholu a fekálií a použít zapečetěné ampulky, aby nedocházelo k úniku látek. U malých vzorků se doporučuje jejich shromažďování po delší čas, aby se minimalizovala chyba měření (Palme 2005; Touma a Palme 2005). Metabolity jsou extrahovány z trusu nejlépe krátce po defekaci (nebo po lyofilizaci či sušení) alkoholem (Palme 2005). Nejúčinější je suspendovat poměr 0,5 g vzorku v 5 ml 80% metanolu (Schatz a Palme 2001; Möstl a Palme 2002; Touma et al. 2003; Palme 2005; Palme et al. 2005). Požadované steroidy nejsou ve vzorku distribuovány rovnoměrně, proto je třeba je homogenizovat (Palme 2005). Důležité je otestovat stabilitu fekálních steroidů v podmínkách, kde bude probíhat experiment. Nutno je také počítat se znečištěním (např. vodou nebo močí), které také může ovlivnit koncentrace. Koncentrace zjišťovaných látek se dá zjistit radioimunoanalýzami (Palme 2005), ale kvůli některým jejich nevýhodám jsou preferovanější neradioaktivní metody stanovování hladin a přítomnosti biologicky aktivních sloučenin, jako jsou enzymatické imunoanalýzy (ELISA) (Palme a Möstl 1997; Palme 2005. Palme et al. 2005). ELISA je založena na antigenních vlastnostech biogenních sloučenin. Jako indikátor umožňující detekci slouží enzymová rekce, která vede k barevné či jiné změně produktu. Princip této metody spočívá v navázání (imobilizaci) antigenu (Ag) nebo protilátky (Ab) (v závislosti na typu testu) na imunosorbční povrch, který má tuhou fázi ve formě mikrotitračních destiček, kuliček, hřebenů nebo pruhů. Na první vrstvu se dále navazuje zjišťovaná látka a pak protilátka s enzymem. Specifická Ab (mono- nebo polyklonální) vázaná na enzym je označovaná jako konjugát. Vazba s enzymem nesmí porušovat původní schopnost Ab vázat se na stanovovanou látku. Po imunitní kompexotvorné reakci se vzorkem a Ab (popř. Ag) vázající enzym se změří hladina zjišťované látky buď přímo nebo nepřímo z množství navázaného standardu. Po enzymu je požadováno, aby byl vysoce aktivní a stabilní, malé reaktivní hmotnosti a kovalentně vázal Ab nebo Ag. Po reakci se substrátem musí vytvářet dostatečně intenzivní změnu. Často vznikají barevné produkty detekovatelné spektrofotometrem. Speciálním přístrojem určeným k testu ELISA je ELISAreader, spektrofotometr k odečítání absorbance v reakčních jamkách.

31

V trusu se nachází směs mnoha steroidních metabolitů o různých polaritách, kortizol nebo kortikosteron tam téměř úplně chybí. Proto není ELISA vhodná pro měření glukokortikoidů. Doporučuje se ELISA specifická pro více steroidních metabolitů (Palme a Möstl 1997; Möstl a Palme 2002; Palme 2005), například kterou vyvinuli Palme a Möstl (1997). V současnosti existuje už celá řada takovýchto specifických enzymoimunoanalýz pro měření metabolitů z trusu i moči i jiných hormonů (Palme 2005). Ke správnému zvolení vhodného ELISA testu se identifikují steroidní látky vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií. Moje práce je přípravou na měření steroidních metabolitů myší, které díky tomu, že slouží jako modelový organizmus, mají výhodu, že pro ně existují komerčně dostupné kity designované na měření jednotlivých hormonů přímo pro tohoto živočicha. Při měření metabolitů stresových hormonů u myší použil Touma et al. (2003) test ELISA pro 5αpregnane-3β,11β,21-triol-20-one (Touma et al. 2003), Nováková et al. (2008) i pro 11oxoetiocholanolon. ELISA pro 5α-pregnane-3β,11β,21-triol-20-one je citlivá na metabolity kortikosteronu, které obsahují 5α-3β,11β-diol strukturu. Specifickou protilátkou je králičí imunoglobulin G proti 5α-pregnane-3β,11β,21-triol-20-one. Standard je označený biotinyl3,6,9-trioxaundecanediaminem, na který se váže enzym streptavidin křenová peroxidáza. Ten reaguje se substrátem tetramethylbenzidinem za současné změny zbarvení roztoku. Reakce je zastavena přídavkem kyseliny sírové. Filtry ELISAreaderu jsou nastavené na vlnovou délku 450 nm. Je nutné změřit bazální hodnoty hladin steroidů před stresovou zátěží, které budou sloužit jako standardy, a ty pak porovnávat s koncentracemi těchto látek po behaviorálním experimentu pomocí tzv. kalibrační křivky. Koncentrace vylučovaných látek je velice individuální a variabilní, k měření pomohou popsané tabulky, kdy a jak se vylučují po stresové situaci.

32

2.2.

BEHAVIORÁLNÍ METODY

2.2.1. Behaviorální arény k odhadu stresu Behaviorální část experimentů odhadu míry stresu mezi myšími poddruhy zahrnuje bludiště, které může být zdrojem stresu pro testovaného jedince. Stres však zpravidla nebývá jediným sledovaným parametrem, protože experiment je kombinován s aspektem učení a prostorové orientace. Ke studiu stresových procesů je více než suchozemské bludiště vhodné Morrisovo vodní bludiště („Morris water maze“; Morris 1984), neboť vodní prostředí působí jako silý stresor především pro myši (Aguilar-Valles et al. 2005; Harrison et al. 2009). Testovaní jedinci se učí hledat ukrytou plošinku jako útočiště před vodním prostředím. Morris navrhoval tuto metodu k behaviorálním studiím funkcí mozku a k testování farmak, kde se dnes nejvíce uplatňuje. Kromě laboratorních potkanů je tato metoda používána u myší (Klapdor a van der Stay 1996; Patil et al. 2009) a dalších hlodavců (např. Apodemus sylvaticus; Patil et al. 2009). Morrisovo vodní bludiště je kruhová aréna (průměr pro potkany většinou kolen 150 cm (Beiko et al. 2004); pro myši 122 cm (Patil et al. 2009)), naplněná vodou, pomyslně rozdělena na čtyři kvadranty. V jednom z nich se nachází záchranná kruhová plošinka (může vyčnívat nad povrh vody (Beiko et al. 2004) nebo skrytá pod hladinou (Patil et al. 2009)), kterou se učí pokusná zvířata hledat. Nikdy není umístěná u stěny bazénu. V některých experimentech se jedinci mohou orientovat podle vnějších značek (např. nábytku v místnosti) okolo arény. Dráha zvířat je monitorována od jejich vložení do vody do doby, než najdou ukrytou plošinku, popřípadě když vyprší maximální čas, kdy má jedinec dovoleno být v tomto bludišti. U suchozemských bludišť se jako stresoru může využít např. výška (File 2001). Ve vyvýšeném plus maze se přímo měří úzkost zvířat z výšky pomocí nekryté části umístěné výše. Barnesovo bludiště nevyužívá stresové faktory, které mohou individuálně ovlivňovat učení živočichů. V tomto případě se testovaný jedinec umístí doprostřed otevřené kruhové plošiny, okolo které se nacházejí otvory, přičemž jen jeden vede k úkrytu (Barnes 1979; Patil et al. 2009). Ke zvýšení motivace lze využít světlo, bzučák nebo větrák (Sunyer et al. 2007). Stres testovaných jedinců samozřejmě nepatrně vzrůstá samotným strachem z nových věcí a zkušeností. 33

2.2.2. Metody studia exploračního a disperzního chování Já bych se chtěla zaměřit na testování fyziologických stresových reakcí v kombinaci s explorací, která může nastiňovat situaci při disperzi zvířat v přírodě. V laboratoři se používají různá bludiště ke studiu explorace, ve kterých se sleduje chování zvířat, ale většinou neumožňují studovat disperzi, i když explorace s disperzí souvisí (Lidicker a Stenseth 1992). Navíc laboratorní arény poskytují velmi zjednodušenou situaci v přírodě, a proto je složité data interpretovat. V umělém bludišti se nikdy nemohou zajistit stejné podmínky a vlivy, jaké jsou v přírodě. Nejpřesnější metodou studia disperze ve volné přírodě je podle Lidickera a Stensetha (1992) radiotelemetrie. Jedinci se monitorují radiem nebo satelitem, ty navíc umožňují získat i fyziologické parametry, ale mohou ovlivnit chování zvířat (Bowler a Benton 2005). Jednoduchou identifikaci živočichů umožňuje značkování (capture-mark-recapture CMR), založené na zpětném odchytu označkovaného jedince, které ale také může ovlivnit jeho chování. Genetické metody zjišťují příbuznost jedinců díky přístupnosti velkého množství genetických markerů. Nicméně tyto metody ve volné přírodě jsou náročné, zejména u drobných hlodavců. Disperze se dá zkoumat také v polonaturálních podmínkách. Gerlach (1996, 1998) zkonstruoval pro myši design experimentu rozpoznávající disperzi od explorace. Experimentální zařízení sestávalo z komplexu boxů, z nichž dva byly od ostatních odděleny vodním koridorem (60 cm dlouhý, 8 cm hluboký). Do bludiště bylo puštěno několik párů myší (Mus musculus domesticus), které se volně rozmnožovaly po dobu kolem 5 měsíců a sledovaly se aspekty patrně související s disperzí: agresivita zvířat, tělesná váha, reprodukce, mortalita a emigrace. Aby mohli být jedinci označeni jako „emigranti“, museli překonat vodní bariéru a vydržet v boxu minimálně 4 dny. Podobné zařízení použili i Krackow (2003) a Rusu et al. (2004), kde cizí jedinec mohl dispergovat od rezidentní populace přes vodní koridor. V laboratoři se používají různá bludiště ke studiu explorace, ve kterých se sleduje chování zvířat. Explorační chování závisí na prostorovém uspořádání exploračního bludiště (Gray et al. 2000). Myši při exploraci vyhledávají území se členitějším uspořádáním, kde mohou lépe využít „přirozených“ úkrytů. Explorace je rovněž ovlivněna velikostí arény (Eilam 2003): v menších arénách podnikají méně delších průzkumných výletů, ve větších je 34

tomu naopak. Eilam (2003) ukazuje, že změnou podmínek explorační arény (konkrétně např. její velikosti) lze nejlépe studovat chování zvířat, aby bylo nezávislé na těchto podmínkách. Nejpoužívanějším experimentálním uspořádáním pro toto testování je volný prostor neboli „open filed arena“ (Walsh a Cummins 1976), kterou poprvé popsali Hall a Ballachey v roce 1932. Jedná se o prázdnou osvícenou arénu nevyvolávající exploraci (Genaro a Schmidek 2000). Jedinec je pozorován při průzkumu nového prostředí od jeho umístění do arény po dobu několika minut (Eilam 2003). Test se může během několika hodin opakovat. V aréně se však mohou nacházet i předměty, úkryty (Barnes 1979; Gray et al. 2000) nebo další jedinci (Bardet et al. 2007) a mohou mít různý tvar, například písmene T, Y, plus nebo kruhu (Sunyer et al. 2007), jak už o nich bylo psáno výše. Především se ale využívají ke studiu jiných etologických aspektů (úzkosti, učení) než samotné explorace. K mé práci bude asi nejvhodnější použít open-filed arenu, která bude mít kruhový tvar a myš ji může prozkoumávat z přilehlého habituačního boxu, do něhož bude mít volný průchod. K vyhodnocování může pomoci software Observer (Noldus et al. 2000). Ke zjišťování mezipoddruhových rozdílů ve vztahu myší k vodě a jejich ochotě do ní vstupovat se může použít vodní koridor, podobně jak ho popsal Bardet et al. (2007).

35

ZÁVĚR:

NÁVRH EXPERIMENTŮ

Moje bakalářská práce se zaměřuje na dva evropské poddruhy myši domácí, Mus musculus musculus a Mus musculus domesticus, které se mezi sebou kříží na pomezí svých areálů v hybridní zóně. Pro objevování reprodukčních bariér mezi poddruhy a tzv. „speciačních genů“ je důležité znát dynamiku hybridní zóny a dějě v ní probíhající. Tato dynamika může být silně ovlivněna lokálními podmínkami prostředí, a proto je důležité zkoumat i případné rozdíly v ekologii mezi oběma taxony, především v jejich exploračním chování, míře disperze a schopnosti překonávat překážky, především vodní toky (Macholán et al. 2007). Jak bylo ukázáno, disperze souvisí s mírou agresivity (Krackow 2003), která vyvolává stres spolu s faktory působícími během explorace a disperze. Víme, že oba poddruhy se liší mírou agresivity (Munclinger a Frynta 2000), naopak o rozdílech v míře stresujících účinků exploračního a migračního chování není dosud nic známo. Tato práce má sloužit jako teoretický podklad k praktickému testování myší na exploraci a míru stresu při ní. V další práci bych chtěla sledovat explorační chování jako základní charakteristiku popisující tendenci jedinců k disperzi, zajímají mě rozdíly mezi oběma poddruhy (ve vztahu k jejich speciaci a dynamice hybridní zóny). Vzhledem k tomu, že popis chování u jedinců pocházejících z divokých populací je velmi náročný s ohledem na jejich variabilitu, budu používat jedince dvou inbredních kmenů odvozených z obou zmiňovaných poddruhů (Piálek et al. 2007), které představují unikátní nástroj pro podobné evolučně genetické studie. Ve své práci bych se mohla zaměřit nejen na rozdíly mezi oběma taxony, ale zároveň i na rozdíly mezi pohlavími (u samic např. na variabilitu sledovaného behaviorálního fenotypu v průběhu estrálního cyklu), dále na rozdíly v ontogenezi (jak se liší v exploračním chování juvenilové od dospělců), apod. Samotná disperze a pohyb jedinců ve volné přírodě, stejně tak jako překonávání nejrůznějších překážek v laboratorních experimentech, vyvolávají stres u sledovaného jedince a mohou pro něho představovat silnou zátěž ovlivňující jeho životaschopnost a následnou reprodukční zdatnost. Budu se proto soustředit také na popsání míry stresu v jednotlivých experimentech. Abychom opravdu sledovali míru stresu způsobenou pouze daným typem experimentu (setkání s určitou překážkou, jiným jedincem, atd.), zvolila jsem neinvazivní metody měření hormonů. Všechny behaviorální experimenty tedy budou doplněny o analýzu hormonálních změn před začátkem 36

experimentu (bazální hladina stresu ve standardních podmínkách) a po ukončení experimentu (stresová zátěž). Stresové hormony budou analyzovány pomocí biochemické metody využívající specifických protilátek (ELISA), designovaných přímo na detekci metabolitů stresových hormonů v trusu myši domácí.

37

SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY

Aguilar-Valles, A.; Sánchez, E.; de Gortari, P.; Balderas, I.; Ramírez-Amaya, V.; Bermúdez-Rattoni, F.; Joseph-Bravo, P. 2005. Analysis of the stress response in rats trained in the water-maze: differential expression of corticotropin-releasing hormone, CRH-R1, glucocorticoid receptors and brain-derived neurotrophic factor in limbic regions. Neuroendocrinology, 82: 306–319. Arnold, M. L. 1997. Natural hybridization and evolution. Oxford Series in Ecology and Evolution. Oxford University Press, Oxford. Arnold, M. L.; Hodges, S. A. 1995. Are natural hybrids fit or unfit relative to their parents? Trends in Ecology and Evolution, 10: 67–71. Auffray, J.-C. 1993. Chromosomal divergence in house mice in the light of palaeontology: A colonization-related event? Quaternary International, 19: 21–25. Auffray, J.-C.; Vanlerberghe, F.; Britton-Davidian, J. 1990. The house mouse progression in Eurasia: a palaeontological and archaeozoological approach. Biological Journal of the Linnean Society, 44: 13–25. Baack, E. J.; Rieseberg, L. H. 2007. A genomic view of introgression and hybrid speciation. Current Opinion in Genetics and Development, 17: 513–518. Bahr, N. I.; Palme, R.; Möhle, U.; Hodges, J. K.; Heistermann, M. 2000. Comparative Aspects of the Metabolism and Excretion of Cortisol in Three Individual Nonhuman Primates. General and Comparative Endocrinology, 117: 427–438. Bamberg, E.; Palme, R.; Meingassner, J. G. 2001. Excretion of corticosteroid metabolites in urine and faeces of rats. Laboratory Animals, 35: 307–314. Bardet, J.; Essen, D. K.; Féron, Ch.; Gouat, P. 2007. Evaluation of the social bond: A new method tested in Mus spicilegus. Comptes Rendus Biologies, 330: 837–843. Barnes, C. A. 1979. Memory deficits associated with senescence: A neurophysiological and behavioral study in the rat. Journal of Comparative and Physiological Psychology, 93: 74–104. Barton, N. H.; Hewitt, G. M. 1985. Analysis of hybrid zones. Annual Review of Ecology and Systematics, 16: 113–148. Beiko, J.; Landera, R.; Hampsona, E.; Boon, F.; Cain, D. P. 2004. Contribution of sex 38

differences in the acute stress response to sex differences in water maze performance in the rat. Behavioural Brain Research, 151: 239–253. Berry, R. J. 1968. The ecology of an island population of the house mouse. Journal of Animal Ecology, 37: 445–470. Berry, R. J. 1981. Town mouse, country mouse: adaptation and adaptability in Mus domesticus (M. musculus domesticus). Mammal Review, 11: 91–136. Berry, R. J.; Bronson, F. H. 1992. Life history and bioeconomy of the house mouse. Biological Reviews, 67: 519–550. Bigelow, R. S. 1965. Hybrid zones and reproductive isolation. Evolution, 19: 449–458. Blair, C.; Gariepy, J. L. 2008. Exploratory behavior in mice selectively bred for developmental differences in aggressive behavior. International Society for Developmental Psychobiology, 50: 32–47. Boursot, P.; Auffray, J. C.; Britton-Davidian, J.; Bonhomme, F. 1993. The evolution of house mice. Annual Review of Ecology and Systematics, 24: 119–152. Bowler, D. E.; Benton, T. G. 2005. Causes and consequences of animal dispersal strategies: relating individual behaviour to spatial dynamics. Biological Reviews, 80: 205–225. Brown, R. Z. 1953. Social behavior, reproduction, and population changes in the house mouse (Mus musculus L.). Ecological Monographs, 23: 217–240. Cannon, W. B. 1929. Pharmacological injections and physiological inferences. Science, 70: 500–501. Carlsen, M. 1993. Migrations of Mus musculus musculus in Danish farmland. Zeitschrift für Säugetierkunde, 58: 172–180. Coyne, J. A.; Orr, H. A. 2004. Speciation. Sinauer Associates, Inc. Publishers Sunderland, Massachusetts U.S.A. Crowcroft, P. 1955. Territoriality in wild house mice, Mus musculus L. Journal of Mammalogy, 36: 299–301. Crowcroft, P.; Rowe, F. P. 1963. Social organization and territorial behaviour in the wild house mouse (Mus musculus L.). Proceedings of the Zoological Society of London, 140: 517–531. Cucchi, T.; Orth, A.; Auffray, J.-C.; Renaud, S.; Fabre, L.; Catalan, J.; Hadjisterkotis, E.; Bonhomme, F.; Vigne, J.-D. 2006. A new endemic species of the subgenus Mus (Rodentia, Mammalia) on the island of Cyprus. Zootaxa, 1241: 1–36. Dobzhansky, T. 1970. Genetics of the evolutionary process. Columbia University Press, New 39

York. Eilam, D. 2003. Open-field behavior withstands drastic changes in arena size. Behavioural Brain Research, 142: 53–62. Eisenhofer, G.; Huynh, T. T.; Hiroi, M.; Pacak, K. 2001. Understanding catecholamine metabolism as a guide to the biochemical diagnosis of pheochromocytoma. Reviews in Endocrine and Metabolic Disorders, 2: 297–311. File, S. E. 2001. Factors controlling measures of anxiety and responses to novelty in the mouse. Behavioural Brain Research, 125: 151–157. Fretwell, S. D.; Lucas, H. L. 1970. On territorial behavior and other factors influencing habitat distribution in birds. Acta Biotheoretica, 19: 16–36. Frynta, D. 1992. „Open filed“ behaviour in seven mice species (Muridae: Apodemus, Mus). In Horáček, I.; Vorhalík, V. (eds.): Prague Studies in Mammalogy. Charles University Press: 31–38. Frynta, D. 1994. Exploratory behaviour in 12 Palaearctic mice species (Rodentia: Muridae): A komparative study using „free exploration“ tests. Acta Societas Zoologicae Bohemicae, 57: 173–182. Genaro, G.; Schmidek, W. R. 2000. Exploratory activity of rats in three different environments. Ethology, 106: 849–859. Gerlach, G. 1996. Emigration mechanisms in feral house mice – a laboratory investigation of the influence of social structure, population density, and aggression. Behavioral Ecology and Sociobiology, 39: 159–170. Gerlach, G. 1998. Impact of social ties on dispersal, reproduction and dominance in feral house mice (Mus musculus domesticus). Ethology, 104: 487–499. Grant, V. 1992. Floral isolation between ornithophilous and sphingophilous species of Ipomopsis and Aquilegia. The Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 89: 11828–11831. Gray, S. J.; Jensen, S. P.; Hurst, J. L. 2000. Structural complexity of territories: preference, use of space and defence in commensal house mice, Mus domesticus. Animal Behaviour, 60: 765–772. Greenwood, P. J. 1980. Mating systems, philopatry and dispersal in birds and mammals. Animal Behaviour, 7: 165–167. Guénet, J. L.; Bonhomme, F. 2003. Wild mice: an ever-increasing contribution to a popular mammalian model. Trends in Genetics, 19: 24–31. 40

Hall, C.; Ballachey, E. L. 1932. A study of the rat's behavior in a field. A contribution to method in comparative psychology. University of California Publications in Psychology, 6: 1–12. Harrison, D. L. 1972. The mammals of Arabia. Vol. III. Ernest Benn Ltd., London. Harrison, F. E.; Hosseini, A. H.; McDonald, M. P. 2009. Endogenous anxiety and stress responses in water maze and Barnes maze spatial memory tasks. Behavioural Brain Research, 198: 247–251. Hauffe, H. C.; Piálek, J.; Searle, J. B. 2000. The house mouse chromosomal hybrid zone in Valtellina (SO): a summary of past and present research. Hystrix, 11: 15–23. Hirschenhauser, K.; Kotrschal, K.; Möstl, E. 2005. Synthesis of measuring steroid metabolites in goose feces. Annals of the New York Academy of Sciences, 1046: 138– 153. Hofer, H.; East, M. L. 1998. Biological conservation and stress. Advances in the Study of Behavior, 27: 405–525. Holst, D. von 1998. The concept of stress and its relevance for animal behavior. Advances in the Study of Behavior, 27: 1–131. Hurst, J. L. 1990. Urine marking in populations of wild house mice Mus domesticus Rutty. I. Communication between males. Animal Behaviour, 40: 209–222. Jiggins, C. D.; Mallet, J. 2000. Bimodal hybrid zones and speciation. Trends in Ecology and Evolution, 15: 250–255. Kirkpatrick, M.; Ryan, M.J. 1991. The evolution of mating preferences and the paradox of the lek. Nature, 350: 33–38. Klapdor, K.; van der Staay, F. J. 1996. The morris water-escape task in mice : Strain differences and effects of intra-maze contrast and brightness. Physiology and Behavior, 60: 1247–1254. Korte, S. M.; Bouws, G. A. H.; Bohus, B. 1993. Central actions of corticotropin-releasing hormone (CRH) on behavioral, neuroendocrine, and cardiovascular regulation: brain corticoid receptor involvement. Hormones and Behavior, 27: 167–183. Krackow, S. 2003. Motivational and heritable determinants of dispersal latency in wild male house mice (Mus musculus musculus). Ethology, 109: 671–689. Krackow, S. 2005. Agonistic onset during development differentiates wild house mouse males (Mus domesticus). Naturwissenschaften, 92: 78–81. Lidicker, W. Z.; Stenseth, N. Ch. 1992. Animal dispersal: small mammals as a model. 41

Chapman and Hall. Lindner, H. R. 1972. Enterohepatic circulation and patterns of urinary excretion of cortisol metabolites in the ewe. Journal of Endocrinology, 52: 19–20. Liou, L. W.; Price, T. D. 1994. Speciation by reinforcement of prezygotic isolation. Evolution, 48: 1451–1459. Macholán, M.; Baird, S. J. E.; Munclinger, P.; Dufková, P.; Bímová, B.; Piálek, J. 2008. Genetic conflict outweighs heterogametic incompatibility in the mouse hybrid zone? BMC Evolutionary Biology, 8: 271. doi:10.1186/1471-2148-8-271. Macholán M.; Kryštufek B.; Vohralík V. 2003. The location of the Mus musculus/M. domesticus hybrid zone in the Balkans: clues from morphology. Acta Theriologica, 48: 177-188. Macholán, M.; Munclinger, P.; Šugerková, M.; Dufková, P.; Bímová, B.; Božíková, E.; Zima, J.; Piálek, J. 2007. Genetic analysis of autosomal and X-linked markers across a mouse hybrid zone. Evolution, 61: 746–771. Marshall, J. T.; Sage, R. D. 1981. Taxonomy of the house mouse. Symposia of the Zoological Society of London, 47: 15–25. Mayr, E. 1942. Systematics and the origin of species. Columbia University Press, New York. Mayr, E. 1992. A local flora and the biological species concept. American Journal of Botany, 79: 222–238. McEwen, B. S.; Stellar, E. 1993. Stress and the individual: mechanism leading to disease. Archives of Internal Medicine, 153: 2093–2101. McEwen, B. S.; Wingfield, J. C. 2003. The concept of allostasis in biology and biomedicine. Hormones and Behavior, 43: 2–15. Mihola, O.; Trachtulec, Z.; Vlček, C.; Schimenti, J. C.; Forejt, J. 2009. A mouse speciation gene encodes a meiotic histone h3 methyltransferase. Science, 323: 373– 375. Moberg, G. P.; Mench, J. A. 2000. The biology of animal stress: basic principles and implications for animal welfare. CABI Publishing, Wallingford. Moleman, P.; Tulen, J. H. M.; Blankestijn, P. J. 1992. Urinary excretion of catecholamines and their metabolistes in relation to circulating catecholamines : six-hour infusion of epinephrine and norepinephrine in healthy volunteers. Archives of General Psychiatry, 49: 568–572. Monclús, R.; Heiko, G. R.; Palme, R.; von Holst, D.; de Miguel, J. 2006. Non-invasive 42

measurement of the physiological stress response of wild rabbits to the odour of a predator. Chemoecology, 16: 25–29. Moore, W. S. 1977. An evaluation of narrow hybrid zones in vertebrates. The Quarterly Review of Biology, 52: 263–278. Morris, R. 1984. Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat. Journal of Neuroscience Methods, 11: 47–60. Möstl, E.; Palme, R. 2002. Hormones as indicators of stress. Domestic Animal Endocrinology, 23: 67–74. Mouse genome sequencing consortium. 2002. Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome. Nature, 420: 520–562. Munck, A.; Guyre, P. M.; Holbrook N. J. 1984. Central actions of corticotropin-releasing hormone (CRH) on behavioral, neuroendocrine and cardiovascular regulation: brain corticoid receptor involvement. Endocrine Reviews, 5: 25–44. Munclinger, P.; Frynta, D. 2000. Social interactions within and between two distant populations of house mouse. Folia Zoologica, 49: 1–6. Noldus, J. P. J. J.; Trienes, R. J. H.; Hendriksen, A. H. M.; Jansen, H.; Jansen, R. G. 2000. The Observer Video-Pro: new software for the collection, management, and presentation of time-structured data from videotapes and digital media files. Behavior Research Methods, Instruments, and Computers, 32: 197-206. Nováková, M.; Palme, R., Kutalová, H.; Janský, L.; Frynta, D. 2008. The effects of sex, age and commensal way of life on levels of fecal glucocorticoid metabolites in spiny mice (Acomys cahirinus). Physiology and Behavior, 95: 187–193. Orr, H. A. 2005. The genetic basis of reproductive isolation: insights from Drosophila. The Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 102: 6522–6526. Palme, R. 2005. Measuring Fecal Steroids: Guidelines for Practical Application. Annals of the New York Academy of Sciences, 1046: 75–80. Palme, R.; Entenfellner, U.; Hoi, H.; Möstl, E. 2001. Faecal oestrogens and progesterone metabolites in mares of different breeds during the last trimester of pregnancy. Reproduction in Domestic Animals, 36: 273–277. Palme, R.; Fischer, P.; Schildorfer, H.; Ismail, M. N. 1996. Excretion of infused 14Csteroid hormones via faeces and urine in domestic livestock. Animal Reproduction Science, 43: 43–63. Palme, R.; Möstl, E. 1997. Measurement of cortisol metabolites in faeces of sheep as a 43

parameter of cortisol concentration in blood. International journal of Mammalian Biology, 62(suppl. II): 192–197. Palme, R.; Möstl, E. 2000. Bestimmung von Kortisolmetaboliten in Kot von Nutztieren zur nichtinvasiven Erfassung von Belastungen. Arbeiten zur artgem βen Tierhaltung KTBL-Schrift (Kuratorium für Technik und Bauwesen in der Landwirtschaft), 403: 817. Palme, R.; Rettenbacher, S.; Touma, C.; El-Bahr, S. M.; Möstl, E. 2005. Stress hormones in mammals and birds: comparative aspects regarding metabolism, excretion, and noninvasive measurement in fecal samples. Annals of the New York Academy of Sciences, 1040: 162–171. Paterson, H. E. H. 1978. More evidence against speciation by reinforcement. South African Journal of Science, 74: 369–371. Patil, S. S.; Sunyer, B.; Högerb, H.; Lubec, G. 2009. Evaluation of spatial memory of C57BL/6J and CD1 mice in the Barnes maze, the Multiple T-maze and in the Morris water maze. Behavioural Brain Research, 198: 58–68. Payseur, B. A.; Krenz, J. G.; Nachman M. W. 2004. Differential patterns of introgression across the X chromosome in a hybrid zone between two species of house mice. Evolution, 58: 2064–2078. Piálek, J.; Vyskočilová, M.; Bímová, B.; Havelková, D.; Piálková, J.; Dufková, P.; Bencová, V.; Dureje, L.; Albrecht, T.; Hauffe, H. C.; Macholán, M.; Munclinger, P.; Storchová, R.; Zajícová, A.; Holán, V.; Gregorová, S.; Forejt, J. 2007. Development of unique house mouse resources suitable for evolutionary studies of speciation. Journal of Heredity, 99: 34–44. Pocock, M. J. O.; Hauffe, H. G.; Searle, J. B. 2005. Dispersal in house mice. Biological Journal of the Linnean Society, 84: 565–583. Pocock, M. J. O.; Searle, J. B.; White, P. C. L. 2004. Adaptations of animals to commensal habitats: population dynamics of house mice Mus musculus domesticus on farms. Journal of Animal Ecology, 73: 878–888. Pocock, M. J. O.; White, P. C. L.; McClean, C. J.; Searle, J. B. 2003. The use of accessibility in defining sub-groups of small mammals from point sampled data. Computers, Environment and Urban Systems, 27: 71–83. Reimer, J. D.; Petras, M. L. 1967. Breeding structure of the house mouse, Mus musculus, in a population cage. Journal of Mammalogy, 48: 88–99. 44

Reimer, J. D.; Petras, M. L. 1968. Some aspects of commensal populations of Mus musculus in southwestern Ontario. Canadian Field-Naturalist, 82: 32–42. Romero, L. M. 2004. Physiological stress in ecology: lessons from biomedical research. Trends in Ecology and Evolution, 19: 249–255. Rowe, F. P.; Qui, R. J.; Swinney, T. 1987. Recolonization of the buildings on a farm by house mice. Acta Theriologica, 32: 3–19. Rusu, A. S.; König, B.; Krackow, S. 2004. Pre-reproductive alliance formation in female wild house mice (Mus domesticus): the effects of familiarity and age disparity. Acta ethologica, 6: 53–58. Sage, R. D. 1981. Wild mice. In Foster, H. L.; Small, J. D.; Fox J. G. (eds.) The mouse in biomedical research. Volume I. Academic Press, New York, NY: 39-90. Sage, R. D.; Atchley, W. R.; Capanna, E. 1993. House mice as models in systematic biology. Systematic Biology, 42: 523–561. Sage, R. D.; Whitney, J. B., III.; Wilson, A. C. 1986. Genetic analysis of a hybrid zone between domesticus and musculus mice (Mus musculus complex): hemoglobin polymorphisms. Current Topics in Microbiology and Immunology, 127: 75–85. Sapolsky, R. M., Romero, L. M.; Munck, A. U. 2000. How do glucocorticoids influence stress responses? Integrating permissive, suppressive, stimulatory, and preparative actions. Endocrine Reviews, 21: 55–89. Schatz, S.; Palme, R. 2001. Measurement of faecal cortisol metabolites in cats and dogs: a non-invasive method for evaluating adrenocortical function. Veterinary Research Communications, 25: 271–287. She, J. X.; Bonhomme, F.; Boursot, P.; Thaler, L.; Catzeflis, F. 1990. Molecular phylogenies in the genus Mus: Comparative analysis of electrophoretic, scnDNA hybridization, and mtDNA RFLP data. Biological Journal of the Linnean Society, 41: 83–103. Singleton, G. R. 1983. The Social and Genetic Structure of a Natural Colony of House Mice, Mus musculus, at Healesville Wildlife Sanctuary. Australian Journal of Zoology, 31: 155–166. Smadja, C.; Catalan, J.; Ganem, G. 2004. Strong premating divergence in a unimodal hybrid zone between two subspecies of the house mouse. Journal of Evolutionary Biology, 17: 165–176. Stebbins, G. L., Jr. 1959. The role of hybridization in evolution. Proceedings of the American 45

Philosophical Society, 103: 231–251. Sunyer B.; Patil, S.; Hoger, H.; Lubec, G. 2007. Barnes maze, a useful task to assess spatial reference memory in the mice. Nature Protocols. DOI 10.1038/nprot.2007.390. Szacki, J.; Liro, A. 1991. Movements of small mammals in the heterogeneous landscape. Landscape Ecology, 5: 219–224. Touma, C.; Palme, R. 2005. Measuring fecal glucocorticoid metabolites in mammals and birds: the importance of validation. Annals of the New York Academy of Sciences, 1046: 54–74. Touma, C.; Sachser, N.; Möstl, E.; Palme, R. 2003. Effects of sex and time of day on metabolism and excretion of corticosterone in urine and feces of mice. General and Comparative Endocrinology, 130: 267–278. Walsh, R. N.; Cummins, R. A. 1976. The open-field test: A critical review. Psychological Bulletin, 83: 482–504. Wielebnowski, N. 2003. Stress and distress: evaluating their impact for the well-being of zoo animals. Journal of the American Veterinary Medical Association, 223: 973–977. Yonekawa, H.; Moriwaki, K.; Gotoh, O.; Miyashita, N.; Matsushima, Y.; Shi, L. M.; Cho, W. S.; Zhen, X. L.; Tagashira, Y. 1988. Hybrid origin of Japanese mice "Mus musculus molossinus": evidence from restriction analysis of mitochondrial DNA. Molecular Biology and Evolution, 5: 63–78.

46