MASARYKOVA UNIVERZITA. Určování krevních skupin u historického kosterního materiálu

MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Katedra antropologie

Určování krevních skupin u historického  kosterního materiálu Bakalářská práce

Klára Parmová Vedoucí práce: doc. RNDr. Eva Drozdová, Ph. D.

Brno 2007 1

Prohlašuji, že jsem tuto bakalářskou práci vypracovala samostatně a s  použitím literatury uvedené v seznamu literatury.

V Brně, dne 15.5.2007

2

Děkuji doc. RNDr. Evě Drozdové, Ph. D. za vedení této bakalářské práce.  Dále bych chtěla poděkovat paní Mgr. Janě Benešové z Oddělení fyziologie a  imunologie živočichů Masarykovy univerzity za její ochotu a cenné  konzultace. V neposlední řadě patří můj dík také Bc. Janě Kamarýtové za  praktické ukázky laboratorních metod.

3

O b s a h Abstrakt.....................................................................................................................6 Klíčová slova..............................................................................................................6 1. Úvod....................................................................................................................... 7 2. Metody práce........................................................................................................ 8 3. Krevní skupiny u člověka.....................................................................................9 3.1. Krevní systém AB0.................................................................................. 9 3.1.1. Podskupiny systému AB0..........................................................11 3.1.2. Imunohematologie.................................................................... 12 3.1.3. Fenomén vylučovatelství...........................................................12 3.1.4. Genetika systému AB0..............................................................14 3.1.5. Fenotyp Bombay....................................................................... 16 3.2. Krevní systém Rh.................................................................................... 17 3.3. Fetální erytroblastóza.............................................................................. 18 3.4. Další krevní systémy................................................................................ 21 4. Antropologie krevních skupin............................................................................. 24 4.1. Počátky séroantropologie.........................................................................24 4.1.1. Hardyho­Weinbergova rovnice.................................................. 24 4.1.2. Biochemický index....................................................................25 4.2. Séroantropologie v Československu........................................................25 4.2.1. Vojtěch Suk a jeho dílo............................................................. 26 4.3. Geografické rozložení krevních skupin ve světě.....................................27 4.3.1. Systém AB0 ve světě................................................................ 28 4.3.1.1. Krevní skupina 0........................................................ 28 4.3.1.2. Krevní skupina A....................................................... 29 4.3.1.3. Krevní skupina B....................................................... 30 4.3.2. Systém AB0 v České republice................................................ 31 4.3.3. Systém Rh ve světě...................................................................31 4.3.4. Evoluce krevních skupin.......................................................... 32 5. Určování krevního systému AB0 u historického kosterního materiálu........... 33 5.1. Molekulárně genetické vyšetření krevních skupin...................................33 5.1.1. Molekulární genetika systému AB0.......................................... 33 5.1.2. Metoda PCR („polymerase chain reaction“).............................35 5.2. Serologické vyšetření krevních skupin....................................................36 5.2.1. Historie výzkumů......................................................................37 5.2.2. Biologický materiál.................................................................. 40 5.2.2.1. Kosti...........................................................................40 5.2.2.1.1. Původ kosterního materiálu.........................40 5.2.2.1.2. Příprava kostí.............................................. 40 4

5.2.2.1.3. Výběr kostí k analýze................................. 41 5.2.2.2. Anti­H sérum ............................................................42 5.2.3. Metody......................................................................................43 5.2.3.1. Metoda absorpčně inhibiční (AI)...............................43 5.2.3.1.1. Fáze extrakce ..............................................44 5.2.3.1.2. Fáze koncentrace ........................................44 5.2.3.1.3. Fáze aglutinačně inhibiční.......................... 44 5.2.3.2. Metoda absorpčně eluční (AE)..................................46 5.2.3.2.1. Přípravná fáze............................................. 46 5.2.3.2.2. Absorpční fáze............................................46 5.2.3.2.3. Eluční fáze..................................................47 5.2.3.2.4. Aglutinace.................................................. 47 5.2.3.3. Dvourozměrný absorpčně inhibiční test (2DAI)....... 47 5.2.3.4. Metoda dvoukruhového systému ve dvou fázích.......48 5.2.3.5. Metoda fluorescenčního značení antigenů ............... 48                                                  („Fluoreszenz–Antikörper–Methode“) 5.2.4. Narušení stálosti krevních vlastností........................................ 50 5.2.4.1. Kontaminace mikroorganismy................................... 51 5.2.4.2. Kontaminace rostlinnými a živočišnými zbytky........56 5.2.5. Výsledky a diskuze...................................................................58 6. Závěr......................................................................................................................74 Slovník důležitých pojmů.........................................................................................76 Seznam použité literatury........................................................................................83 Rejstřík...................................................................................................................... 88 O autorce................................................................................................................... 90

5

A b s t r a k t Krevní skupiny jsou vlastnosti organismu, které jsou spolehlivě zjistitelné již několik  měsíců po narození a za života se již nemění. Nemá na ně vliv ani okolní prostředí. Už jen z  tohoto   hlediska   jsou   vhodným  identifikačním  faktorem.  Znalosti   krevních   skupin   hojně  využívají mnohá profesní odvětví. První místo zaujímá bezpochyby medicína, pro kterou je  zásadní zvláště převod krve a transplantace orgánů. Určení krevní skupiny je dále významné  v kriminalistice, soudním lékařství a také v antropologii. Z tohoto hlediska je identifikace  jedince možná na základě antigenů přítomných na buněčných membránách. Krevní skupiny  lze vyšetřit sérologicky nebo pomocí metody analýzy DNA. Dnešní doba umožňuje určit  krevní skupinu nejen z krve, ale také z lidských sekretů a tkání, včetně tkáně kostní. Určení  krevní skupiny z kosterního materiálu je významné v paleosérologii a séroantropologii pro  objasnění původu lidstva a vymezení příbuzenských vztahů jedinců. Metody vypracované  pro kostní tkáň mají také své uplatnění ve forenzní antropologii.  

K l í č o v á  s l o v a Krevní skupiny –  Séroantropologie ­ Geografické rozšíření krevních skupin – DNA analýza  Sérologické metody – Paleosérologie 

6

1. Ú v o d Krev byla lidmi odpradávna vnímána jako symbol života i smrti. Krev je obecně  nositelem důležitých informací z pohledu medicíny, genetiky a biologických věd. Z krevních  vzorků   lze   vyšetřit   mnohá   onemocnění,  genetickou   výbavu   i   další   zajímavé   informace  vedoucí   k   identifikaci   jedince.   Zařazení   krve   do   jednotlivých   skupin   bylo   ustanoveno  počátkem 20. století. Autorem výzkumu byl vídeňský lékař Karl Landsteiner a nezávisle na  něm Jan Janský. Tyto poznatky vyvolaly ve světě medicíny nepředstavitelný objev. Od té  doby vědci objevili více než 50 krevních systémů. Za základní systém je považován krevní systém AB0, který má své největší uplatnění  zvláště při transfúzích krve. Je též nejdéle známý a nejvíce probádaný. Později se o téma  krevních   skupin   začali  zajímat  i   antropologové  a   soudní   znalci.  Vznikla  věda  nazývaná  séroantropologie   a  jejím   objektem  zkoumání  bylo   rozšíření   krevních   skupin   ve   světě   a  podrobný   rozbor   izolovaných   skupin   lidí   v   souvislosti   s   původem   obyvatelstva   i   jeho  migrací.  Krevní   skupiny   jsou   také   důležitým   identifikačním   faktorem.   Velký   přínos   mají  jednak v kriminalistice při určování totožnosti pachatele, v soudním lékařství při paternitních  sporech, ale i přírodních vědách. Dnes se dají běžně vyšetřit krevní skupiny nejen z čerstvé  krve, ale i krve tepelně degradované, z lidských tkání, slin a sekretů. Méně probádané a taktéž náročné je vyšetření skupinových vlastností krve z kostní  tkáně. Zde samozřejmě závisí úspěšnost metody na podmínkách prostředí a zachovalosti  materiálu. Vědci ale musí čelit dalším překážkám jako jsou mnohé nespecifické reakce a  nestabilita skupinových vlastností způsobená okolním prostředím. V návaznosti na toto téma  se hovoří o  paleosérologii,  tedy vědě zabývající se krevními vlastnostmi jedinců i celých  populací v pravěkých dobách. Informace o krevních skupinách hojně využívá i historická  antropologie, kde jsou často předmětem zkoumání vzájemné příbuzenské vztahy jednotlivců.  Pro určení krevní skupiny z kosterního materiálu se užívá metod sérologických i  molekulárně genetických.  V dnešní době jsou metody sérologické neprávem potlačovány  metodami  využívající   analýzy   DNA.   V   tomto   směru,   metody   zkoumající   DNA   výbavu  jedince   jsou   velice   přesné,   avšak   také   časově   náročné   a   finančně   nákladné.  Bylo   ale  prokázáno, že v některých případech je sérologický postup úspěšnější.

7

Pro kostní tkáň bylo dosud navrhnuto relativně málo účinných metod, které by vedly  k neomylnému výsledku s možností jeho opakování. Ačkoli historie prací na toto téma sahá  do 30. let minulého století, dalo by se říci, že celý výzkum je teprve na svém počátku. Cílem této bakalářské práce je přehledně shrnout a následně i vyhodnotit jednotlivé  sérologické metody, pomocí nichž lze z kostní tkáně vyšetřit krevní skupinu jedince. Dále  také analyzovat jednotlivé problémy a překážky vzniklé při samotném výzkumu a způsob,  jak jim předcházet. Praktickou částí na toto téma bych mohla navázat v pozdější magisterské  práci.

2. M e t o d y  p r á c e Jedná se o literární rešerši na dané téma, praktická část je tedy vynechána . Metody  mé  práce  zahrnovaly   studium   příslušné   literatury   a   sběr   časopiseckých   článků,  které  se  vztahují k tématu. Odborné články pocházejí z domácích i zahraničních časopisů, některé z  nich   byly   součástí   knižních   publikací.  K   sepsání  práce  jsem   využila   také   internetových  zdrojů, čerpala jsem především z internetových vědeckým portálů jakými jsou „Science  Direct“  a „Web of Science“. Dále jsem pracovala s internetovými  stránkami, které  jsou  uvedené v seznamu použité literatury.  Většina citovaných článků pochází z následujících časopisů: „American Journal of  Physical   Anthropology“,   „Journal   of   Human   Evolution“  a  „Forensic   Sciences“.  Časopisecké články jsem získala ze zdrojů jednotlivých vědeckých ústavů ČR a knihoven. K  získání článků zahraničních jsem využila meziknihovní služby Lékařské fakulty a MZK. K  jazykovým   překladům   jsem   použila   anglický   elektronický   slovník  „StarDict“  a  mnohojazyčný elektronický slovník „Winged“. S  laboratorními metodami jsem se prakticky  seznámila   v   laboratoři   fyziologie   a   imunologie   živočichů   Masarykovy   univerzity   pod  vedením Mgr. Jany Benešové. 

8

3. K r e v n í  s k u p i n y  u  č l o v ě k a Krevní skupiny jsou fenotypové vlastnosti organismu. Fetter a kol. (1967) je označuje  za nejstálejší z fyziologických vlastností, jsou také základem pro dělení lidstva dle krevních  skupin.   Na   světě   je   nyní   známo   přes   50   krevních   systémů   (s   nejméně   500   aktivními  antigeny),   v   rámci   kterých   existují   různá   značení   pro   vlastní   krevní   skupiny.   Většina  skupinových krevních systémů byla objevena náhodně při    reakcích na uměle vytvořená  antiséra. Mezi nejčastěji vyšetřované krevní systémy patří AB0, Rh, MNSs, P, Duffy, Levis a  Kidd, avšak pro praxi jsou důležité pouze první dva uvedené systémy. Ostatní krevní systémy  (viz kapitola 3.4. „Další krevní systémy“) využívají mnohé obory pro specializované vědecké  výzkumy. Krevní   systémy   jsou   na   sobě   nezávislé   a   vyskytují   se   na   odlišném   lokusu  chromozomu   (Vácha   a   kol.   2004).   Z   hlediska   variability   lidstva   jsou   krevní   skupiny  polymorfní znaky s diskontinuální proměnlivostí. Objevují se tedy v populacích ve dvou a  více formách, přičemž mají vymezený počet variant (Beneš 1979). Všechny   buňky   lidského   těla   mají   na   svém   povrchu   několik   desítek   antigenů.  Vyšetření těchto antigenů je významné při transplantacích a krevních transfúzích. Pokud  spolu  nesouhlasí  antigenní  struktury  dárce  a  příjemce,  dochází  potom  k  imunitní   neboli  antigenní   reakci.  Ta   vede   k   tvorbě   protilátek   proti   cizímu   antigenu,   což   může   vyvolat  poškození organismu anebo smrt. V klinické praxi patří antigeny na membránách červených  krvinek k nejčastěji vyšetřovaným (Vácha a kol. 2004; Trojan a kol. 2003).   

3.1. K r e v n í  s y s t é m  A B 0 Krevní systém AB0 byl poprvé objeven v roce 1900 Landsteinerem, kdy pozoroval  aglutinaci erytrocytů, jež vyvolalo sérum pocházející od odlišného jedince. Landsteiner svůj  objev uveřejnil v roce 1901 a popsal tak 3 možné krevní skupiny u člověka. V roce 1902 jeho  žáci, Decastello a Sturli, popsali i skupinu v pořadí čtvrtou (Race, Sanger 1954). Nezávisle  na nich zkoumal krevní vlastnosti lékař Janský, který v roce 1907 sám pojmenoval 4 krevní  skupiny. Dnešní označení krevních skupin vychází z návrhu Dungerna a Hirszfelda z roku  1927 (Fetter a kol. 1967) (viz Tab. 1).

9

    Obr. 1, 2  K. Landsteiner (vlevo). Zdroj: www.oeaz.at (14) a         

          J. Janský (vpravo). Zdroj: www.ceskatelevize.cz (12).

. Dungern  Hirszfeld

Landsteiner

Janský

Moss

0

1

I

IV

A

2

II

II

B

3

III

III

IV

I

AB    

       Tab. 1  Označení krevních skupin systému AB0 různými autory.                        Zdroj: Martin, Saller 1960. Převzato v plném znění.

V krevním systému AB0(H) rozlišujeme 4 krevní skupiny A, B, AB a 0 (H). Typ  krevní skupiny je dán na základě přítomnosti aglutinogenu A a B na povrchu membrány  erytrocytů (viz Tab. 2). Látky aglutinogeny jsou chemicky sacharidové povahy. V séru jsou  obsaženy protilátky aglutininy anti­A a anti­B. Aglutininy jsou bílkovinné struktury. Jsou to  přirozené protilátky (imunoglobuliny IgM) a jsou spolu s aglutinogeny geneticky podmíněny.  Přičemž  platí   známé  Landsteinerovo  pravidlo,  že   v  krevní   plazmě  nejsou  antigeny  proti  vlastním aglutinogenům. Tedy krevní skupina A nese aglutinogen A a vždy pouze aglutinin  anti­B (Trojan a kol. 2003).

10

Krevní skupina  Aglutinogen A Aglutinogen B AB0 systému

Aglutinin A

Aglutinin B

A

ano

ne

ne

ano

B

ne

ano

ano

ne

0

ne

ne

ano

ano

AB

ano

ano

ne

ne

        Tab. 2  Antigeny krevního systému AB0.    

                   

                       Zdroj: http://anthro.palomar.edu/blood/default.htm (3). Přepracováno.

Jak uvádí Vácha a kol. (2004) aglutininy se vyskytují přirozeně a je možné je vyšetřit  již pár měsíců po narození. Jejich tvorba je podpořena bakteriemi ve střevech a složkami  potravy.   Trojan   a   kol.   (2003)   dodává,   že   maximum   titru   antigenů   je   dosaženo   kolem  devátého roku věku dítěte, k poklesu titru dojde poté ve stáří. Přičemž antigenní schopnosti  se zvyšují až asi do 20 let věku. V této době je erytrocyt téměř 5 krát citlivější na specifický  aglutinin než při narození. Jinak je to u vrozených aglutininů. Ačkoli aglutinogen je možno  určit u každého novorozence, aglutinin jen asi u poloviny narozených dětí. Ostatní nemají při  narození v séru přítomné žádné aglutininy, ty se vytvoří do 5 až 10 let věku dítěte (Malaska  1957).

3.1.1. P o d s k u p i n y  s y s t é m u  A B 0 V rámci krevního systému AB0 rozlišujeme ještě několik možných podskupin. Jako  první v roce 1911 objevili Dungern a Hirszfeld podskupinu A1 a A2, také i A1B a A2B. Dále  byly popsány i další formy, od A1 až po A6 (Race, Sanger 1954).  Podskupiny se vzájemně liší především tím, že jejich krvinky mají různou rychlost a  sílu   shlukování   aglutininem   anti­A   (alfa).   Krvinky   s   aglutinogenem   A1  jsou   nejvíce  shlukovatelné, naproti tomu krvinky A5  nejméně (Malaska 1957). Podobné vlastnosti má i  skupina B. Toto způsobuje nízká aktivita enzymu  transferázy, která pojí monosacharidy k  prekurzorové molekule antigenu H za vzniku příslušné krevní skupiny. Beneš (1979) uvádí  ještě další popsané alely Am, Ax, Bm a Bx. Všechny alely jsou součástí mnohočetných  alelických sérií dvou genů. Tyto geny leží na dvou souhlasných lokusech párů chromozomů,  zde dochází k jednotlivému střídání alel.

11

Podskupina  A1  je  v  evropské  populaci  zastoupena asi  80%,  zatímco  A2  necelými   20%.  Ostatní jsou dosti vzácné. Spolu s antigeny se samozřejmě rozlišují i protilátky anti­A1, anti­  A2 atd. (Trojan a kol. 2003; Schreiber a kol. 1998).

3.1.2. I m u n o h e m a t o l o g i e „Imunohematologie je obor studující příčiny, průběh a následky obranných reakcí   organismu vyvolaných krevními antigeny a protilátkami. Studuje také problematiku krevních   transfúzí a imunitní reakce při krevních chorobách“ (Bičík 1992). Isohemaglutininy   jsou   látky   mající   schopnost   shlukovat   krvinky   daných   skupin.  Dělíme je na pravidelné a nepravidelné isohemaglutininy (viz Tab. 3). Pravidelné jsou vždy  přítomny v séru dané skupiny (např. aglutinin alfa, alfa1  v sérech krevních skupin B a 0).  Alfa1 shlukuje pouze krvinky A1 a A1B. Zatímco všechny krvinky A a AB jsou shlukovány  aglutininem alfa. Nepravidelné isohemaglutininy, jak název napovídá, se v sérech vyskytují  nepravidelně (např. aglutinin alfa1 v sérech krevních skupin A2 a A2B). Tyto dva aglutininy  alfa1 (pravidelný a nepravidelný) se od sebe liší chováním za různých teplot (Malaska 1957). Protilátky   (imunoglobuliny)   jsou   specifické   bílkoviny   obsažené   v   krevní   plazmě.  Rozeznáváme protilátky přirozené (vrozené) a získané (imunní). Přirozené protilátky jsou  přítomny v organismu hned po narození anebo se vytvářejí do jednoho roku věku dítěte, poté  jsou už v séru přítomny po celý život. Jsou to aglutininy anti­A a anti­B, které se vyskytují u  jedinců  skupiny   A,   B   a   0.  Dále  jsem  patří   také  anti­A1  a   anti­0,  ale  i   další   protilátky  přirozeně  (někdy)  se   vyskytující   u   dalších   krevních   systémů.   Více  reagují   při   teplotách  nižších než je teplota těla. Naproti tomu získané protilátky se vytvářejí na podnět cizího  krevního antigenu ­ imunizací. Ty mohou být buď charakteru aglutininu (shlukují krvinky ve  fyziologickém roztoku) anebo nekompletních protilátek, které aglutinují krvinky pouze v  prostředí bílkovinném. Tyto reagují nejsilněji při teplotě těla (Bičík 1992; Malaska 1957).

12

Skupina Aglutininy vyskytující  Vazba s aglutininy Možné iregulární aglutininy  a podskupina se v séru normálně 0

anti­0 (alfa2)

anti­A (alfa a alfa1) anti­B (beta)

žádné velmi vzácně anti­0 (alfa2),  reaguje se všemi krvinkami  0 a s 95% krvinek A2

A1

alfa1 a alfa

anti­B (beta)

A2

alfa, alfa2 (vždy) anti­0 (v 95%  případů)

anti­B (beta)

vzácně alfa1, reagující s  krvinkami A1 a A1B

A1B

alfa1, alfa a beta

žádné

velmi vzácně anti 0 (alfa2)

A2B

alfa, alfa2 a beta je sporné, zda s  anti­0

žádné

často (25%) alfa2, reagující  s krvinkami A1 a A1B

B

beta

anti­A (alfa a alfa1)

velmi vzácně s anti­0 (alfa2)

   Tab. 3  Přehled výskytu iregulárních aglutininů. Zdroj: Malaska (1957). Převzato v plném znění.

3.1.3. F e n o m é n  v y l u č o v a t e l s t v í Další významný objev související s krevními vlastnostmi je datován do roku 1925.  Jedná se o fenomén vylučovatelství, který má své uplatnění zvláště  v kriminalistice.  Na  tomto základě se lidé (na celém světě) dělí do dvou pomyslných skupin na tzv.  sekretory  (vylučovatelé) a non­sekretory (nevylučovatelé) (1). Sekretorů je v populaci kolem 80%. U  těchto osob jsou antigeny A, B, H přítomné nejen v krvi (na erytrocytech, v malém množství  i na leukocytech a trombocytech), ale kromě toho jsou také vylučovány do ostatních tělních  tekutin, jako jsou slzy, moč, sliny, sperma, mateřské mléko, pankreatické a žaludeční šťávy  atd. Přičemž všichni sekretoři vylučují antigen H a mimo to také antigen A nebo B, dle své  skupinové příslušnosti. Z toho vyplývá, že sekretor skupiny AB vylučuje antigen H, A i B,  zatímco u skupiny 0 sekretora, je to pouze antigen H, který je vylučován (Hrubiško a kol.  1983). Zbylých 20% lidí tuto vlastnost postrádá. Nonsekretoři mají  specifické skupinové  látky pouze v buňkách. Ty jsou na rozdíl od sekretorů nerozpustné ve vodě (v lipoidní formě)  (Malaska 1957). 

13

Antigeny lze vyšetřit i ze zaschlých vzorků tekutin. Jsou odolné i vůči vysokým a  nízkým teplotám (Bičík 1992). Sekrece těchto A, B a H substancí je podmíněna alelami Se a  se. Vylučovatelé mají genotyp SeSe anebo Sese, nevylučovatelé sese. S tímto je spojen i  skupinový systém Lewis. Vylučovatelé jsou Lea­, Leb  +, Leb  ­, zatímco nevylučovatelé mají  Lea+, Lea­, Leb ­ (Hrubiško 1983). Systém sekretorů je hojně využíván při vyšetřování trestných činů, pokud nejsou k  dispozici krevní stopy pachatele. U sekretorů lze v tělních tekutinách najít nejen specifické  typy antigenů, ale i bílkoviny, protilátky a enzymy, které jsou pro krev charakteristické (Bičík  1992).

3.1.4. G e n e t i k a  s y s t é m u  A B 0 „Dědičnost krevních skupin je dokonalý příklad dědičnosti lidských znaků. Krevní   skupina je znak se 100% dědivostí (heritabilitou); životní prostředí na ni nemá žádný vliv“  (Rosypal a kol. 2003). Krevní skupiny systému AB0 se řídí dle Mendlových zákonů dědičnosti. Většina  lidských genů jsou geny polymorfní. Obsahují tedy více než 2 alely. Typický lidský gen  kóduje enzym, který připojuje molekuly sacharidu k molekulám lipidu na povrch červených  krvinek. Tento sacharid je poté rozeznán imunitním systémem organismu. Je to právě antigen  aglutinogen   přítomný   na   membráně   erytrocytů.   Gen   kóduje   enzym,   který   označujeme  písmenem I. Gen I obsahuje 3 možné alely; alelu IA (připojuje modifikovanou formu cukru­ galaktosamin), alelu IB (připojuje disacharid galaktózu) a alelu I0, která k sobě nepojí žádný  sacharid (Raven, Johnson 1992). Alely   příslušného   genu   mohou   být   z   pohledu   expresivity   genu   dominantní,  kodominantní anebo recesivní. U systému AB0 platí, že alela A a alela B jsou dominantní  nad  alelou  0  (ta  je  tedy  vzhledem  k  nim  recesivní).  Avšak  alela  A  a  B  jsou  navzájem  kodominantní,   každá  působí  vlastním   efektem   na  organismus.  Krevní   skupina   AB  tudíž  produkuje 2 formy enzymu a pojí galaktózu i galaktosamin na povrch krevních buněk (Vácha  a kol. 2004; Raven, Johnson 1992)

14

Každý jedinec zdědí od každého z rodičů po jedné kopii chromozomu nesoucí gen I,  příslušný genotyp vzniká právě kombinací těchto genů. Jedinec může být pro tento znak  heterozygotní anebo homozygotní (viz Tab. 4, 5).  Jak dodává Hruban a Majzlík (2000), při určování biologického rodičovství se vždy  vychází z vyloučení otce. Při krevním testu systému AB0 dosáhneme pouze 20% vyloučení,  pokud   použijeme   i   jiných   10   znaků   (další   krevní   systémy,   krevní   bílkoviny)   úspěšnost  stoupne až na 85%. Nejpřesnější je v tomto ohledu vyšetření DNA genotypu jedince. Toto  vyšetření se v ČR provádí od roku 1992.                                                         Matka

Otec

Fenotyp

Genotyp

A1

A1 A1 A1 A2 A1 0 

Fenotyp

A2

A2

B

A2  0  A2  A2 A2  0 

B B B 0

B

B B B 0

B

B B B 0

A1 B

A1 B

Genotyp Genotyp Fenotyp

A1

A1 A1 A1 A2 A1 0 

A1 A1 A1 A2, A2  A2 A1 0, 0 0

A1 A2 0

A1

A1 A1 A1 A2 A1 0 

A1 A2 A1 0, A2  A2       0 0, A2  0

A1 A2 0

A2

A2  A2 A2  0 

A1 A2 A2 0, 0 0

A2 0

A1 B A2 B, A1  0       A2  0 B 0, 0 0

A1 B A2 B A1 A2 B, 0

 

 A2  A2

Dítě

A1 A1 A1 A2 A1 0 

A1

A2

A2  A2 A2  0 

A2 B       A2  0 B 0, 0 0

B

B B B 0

B B B 0, 0 0

A1

A1 A1 A1 A2 A1 0 

A1 A1,  A1  B A1 , A1 B A1 A2, A2  A2 B B B A1 0, B 0

                    Tab. 4  Příklady pro dědičnost krevních skupin systému AB0.                                      Zdroj: Malaska (1957). Převzato v plném znění.

15

A2 B A2  B, 0 B 0

Rodičovské 

A

B

0

A

AA (A)

AB (AB)

A0 (A)

B

AB (AB)

BB (B)

B0 (B)

0

A0 (A)

B0 (B)

00 (0)

alely 

                 Tab. 5  Genotypy a fenotypy potomstva.                                                   Zdroj: http://anthro.palomar.edu/blood/default.htm.                                                Přepracováno. Jako fenotyp označujeme z genetického hlediska krevní skupinu, kterou zjišťujeme  aglutinačním testem. Vzájemná kombinace genů vytváří v populaci 4 fenotypové skupiny  (Fetter a kol. 1967). Krevní skupina 0 se označuje jako univerzální dárce. Nemá na povrchu  žádný cizí antigen, proti kterému by se mohl bránit imunitní systém příjemce. Naproti tomu  skupina AB je univerzální příjemce. Buňky na membráně u této skupiny obsahují antigen A  a antigen B, tedy obě možné varianty, a proto pro ni není žádný antigen cizí. Krevní   skupiny   nikterak   nesouvisejí   s vlastnostmi   lidí,   a   to   jak   fyzickými,   tak  duševními.   V dnešní   době   jsou   také   studovány   možné   souvislosti   krevní   skupiny   s  onemocněním   pacienta.   Uvádí  se,   že   jedinci   skupiny   A   trpí   častěji   rakovinou  žaludku.  Příslušníci skupiny 0 mají zase častější výskyt vředů v oblasti břišní (Bičík 1992).

3.1.5. F e n o t y p  B o m b a y Fenomén (fenotyp) Bombay byl poprvé popsán v Indii a dle místa výskytu byl také  pojmenován. Jedná se o genetickou zvláštnost spojenou s krevními skupinami. U jedinců  takto  zatížených   se  odlišuje  jejich  fenotyp  od  genotypu.  V tomto  případě  jsou  narušena  základní pravidla dědičnosti krevních skupin, antigen H přítomný na povrchu červených  krvinek může zabránit projevu očekávané krevní skupiny. Mluvíme o recesivní epistázi alely  H. 

16

Tvorba antigenu H je dána geneticky. Pokud dojde ke vzácnému jevu, kdy jedinec je  recesivní homozygot (hh), pak se nevytváří ani antigen H. Ten je však prekurzorem pro  tvorbu  antigenu  A   i   B,   pro   jejich   tvorbu  je   nepostradatelný.  Alela  A   nebo  B   musí  být  přítomna, aby se vytvářel příslušný enzym (A nebo B) a přeměnil H antigen na A, popřípadě  na B antigen. Výsledkem je zdánlivý fenotyp 0, avšak jedinec může nést geny pro tvorbu  některého z antigenů A nebo B; genotyp mu neodpovídá (3, 4).  Z Obr. 3 je patrné, že dítě po obou rodičích zdědilo recesivní alelu pro antigen H,  tedy hh. Fenotypově se tedy jeví jako 0, avšak rodiče alelu pro 0 postrádají.     Matka                Předpokládaný otec               Matka               Předpokládaný otec 

Dítě                                                                       Dítě            Obr. 3  Fenotypový a genotypový projev fenoménu Bombay.               Zdroj: http://anthro.palomar.edu/blood/default.htm. Přepracováno.

3.2. K r e v n í  s y s t é m  R h Objev skupinového systém Rh je připisován Landsteinerovi spolu s Wienerem v roce  1940,  ačkoli k tomuto objevu významně přispěli i jiní badatelé jako například Levine  a  Sterson.  Ti   upozorňovali   ve  své  práci  na neobvyklé  případy  aglutinace  u   jedinců  stejné  skupiny již v roce 1939. Byl to bezesporu významný zlom v oboru sérologie a medicíny od  dob objevení krevního systému AB0 před 40 lety (Race, Sanger 1954). Zvláštní okolnosti porodů a transfúzí byly jednoznačně vysvětleny právě pokusem  Landsteinera a Wienera, kdy imunizovali králíky a morčata krví opice makaka  (Macaca  mulatta). Jejich záměr byl však studovat imunní protilátky anti­M a anti­N. Takto byl tedy  náhodou objeven další antigen přítomný taktéž na povrchu krevních buněk (společný pro  člověka a makaka, ale i jiné druhy opic).  17

U   asi   85%   lidí   docházelo  ke   shlukování   červených   krvinek  imunizovaným   sérem.  Tato  skupina je označena jako Rh pozitivní, v jejich krvi je obsažen Rh faktor. Naproti tomu lidé,  kteří jsou Rh negativní (okolo 15%) tento faktor postrádají a k aglutinaci nedochází (Vácha a  kol. 2004). R. A. Fisher později objasnil podstatu 3 základních antigenů, které přiřazují člověku  právě jeden z typů krevní skupiny Rh. Jsou to antigeny C, D a E a jejich alelomorfní varianty  c, d, e. Chromozom nemůže nést geny pro obě varianty, tedy například pouze C anebo malé  c. Jedinec dědí jednu alelu od matky a jednu od otce. Dostáváme pak různé genotypy vzniklé  kombinací příslušných alel (Race, Sanger 1954). Rozhodující v této věci je alela D. Pokud je  v genotypu přítomná jedinec je Rh pozitivní. Jak uvádí Fetter a kol (1967) existují i další  formy  alel. Vlastnost  D  může  být  ve  formě D,  Du anebo v krvi  není  (d).  Stejně  tak  u  vlastnosti C je možnost C, c, Cw, Cx, Cu, cv. Vlastnost E se také vyskytuje jako e, Eu a Ew.  Dále se vyskytují další vlastnosti Rh systému označované jako F a V pokud jsou přítomny a  jako f, v pokud chybí. Tímto teoreticky vzniká na 288 podskupin systému Rh. Některé se  vyskytují častěji, u 98% evropské populace se objevuje pouze 8 podskupin. Imunoglobuliny anti­D nejsou v plazmě Rh­ jedinců běžně přítomny. K této změně  dochází druhotně až po imunizaci. Stává se tak během nevhodné transfúze krve Rh+ jedinci s  fenotypem Rh­. Takto byla objasněna potransfúzní reakce vyvolávající horečky a třesavky.  Další případ imunizace je možný při těhotenství. Komplikace mohou nastat pouze v tom  případě,   kdy   matka   je   Rh­   a   její   plod   je   Rh   pozitivní   po   otci.   Zde   hrozí   nebezpečí  onemocnění, které se nazývá fetální erytroblastóza  neboli hemolytická nemoc novorozenců  (Vácha a kol. 2004).

3.3. F e t á l n í  e r y t r o b l a s t ó z a Fetální   erytroblastóza  je   těžká   choroba,   spojená   s   dalším   vážným   poškozením  organismu dítěte (např. vodnatelností mozku). Tato komplikace byla v minulosti častější,  dnes je podstata tohoto onemocnění dokonale známá a jsou zavedena preventivní opatření při  takto rizikových těhotenstvích. 

18

Jak   uvádí   Zahálková   (2002),   hlavní   příčiny   tohoto   onemocnění   tkví   v   krevní  inkompatibilitě mezi matkou a dítětem. Nejčastější projev má v systému AB0.  Zde je však průběh nemoci velmi mírný, prudké reakce spojené s tímto systémem jsou velmi  vzácné. Zásadní nebezpečí je spojeno se systémem Rh v případě, kdy je matka Rh negativní  a její plod Rh pozitivní po otci (viz Tab. 6, 7). Onemocnění se může projevit i v souvislosti s  jiným krevním systémem, avšak těchto případů bylo ve světě zaznamenáno opravdu velmi  málo. Možná komplikace tedy nastává, pokud si matka Rh­ (genotyp dd) vytváří protilátky  proti krvinkám Rh pozitivnímu plodu (genotyp Dd anebo DD). Matčin imunitní systém tento  antigen   nerozezná,   považuje   jej   za   cizorodý   a   „bojuje“   proti   krvinkám   plodu   tvorbou  protilátek. Za běžných okolností krevní oběh plodu a matky spolu přímo nesouvisí, krvinky  plodu se tedy během těhotenství nedostávají do oběhu matky a naopak. Ani v krvi matky  nejsou protilátky normálně přítomny (3).                  

O T E C D M d Dd A T Dd K d A                                   Děti 100% Rh+

D Dd Dd

      Tab. 6  Genotypový projev krevního systému Rh u potomstva a 

          výsledný fenotyp.           Zdroj:http://anthro.palomar.edu/blood/default.htm (3).                                                                 Přepracováno.

19

O T E C D

d

M d Dd A T Dd K d A                                   Děti 50% Rh+

dd dd

Tab. 7  Genotypový projev krevního systému Rh u potomstva a   výsledný fenotyp.                                                                       Zdroj: http://anthro.palomar.edu/blood/default.htm (3).                                                                       Přepracováno.

Může však dojít ke kontaktu a mísení krve během porodu při odlučování placenty  anebo při patologických stavech. V tomto případě matčin imunitní systém podněcuje růst  protilátek. Již velmi malé množství krve novorozence vyvolává bouřlivou reakci a tvorbu  velkého množství protilátek na straně matky. Tento stav je nebezpečný zvláště při dalším  těhotenství, protože tyto protilátky setrvávají v krvi matky a procházejí placentou k plodu. To  může ohrozit život Rh pozitivního plodu, jehož erytrocyty jsou protilátkami shlukovány a  rozrušovány (hemolýza). Výsledkem je životu nebezpečná anémie, krev plodu totiž postrádá  dostatek kyslíku (3). V tomto případě následuje neodkladná transfúze krve Rh+ dítěti. Již  během těhotenství může nastat situace, kdy dojde k shlukování krvinek v některých cévách  plodu.   Hrozí   nebezpečí   ucpání   cév   a   odumření   plodu.   Transfúzi   je   možno   provést   i  nitroděložně, za účelem odstranění odumřelých krvinek a množství bilirubinu (Vácha a kol.  2004). Nebezpečí  porušení   krvinek   plodu   se   zvyšuje   s   dalším   těhotenstvím.   Jak   uvádí  internetový zdroj (3), evropská populace je k tomuto onemocnění nejnáchylnější, kolem 13%  novorozenců je vystaveno tomuto riziku. Avšak v dnešní době asi 6% (polovina z těchto dětí)  má určité komplikace. Díky monitorování a včasné léčbě dnes onemocní těžkou žloutenkou  méně než 1% jedinců.

20

Vácha   a   kol  (2004)   uvádí,  že   tvorba  anti­D  protilátek  je   velmi   individuální  a   u  velkého  počtu  těhotenství   k  fetální   erytroblastóze  nedochází.  Preventivní   opatření   slouží  podávání imunoglobulinu  s anti­D protilátkami ohroženým ženám do 72 hodin po porodu  dítěte (i potratu). Uvádí se, že tato prevence je efektivní v 99% případů. Tímto se předejde  imunizaci matky. Krvinky, které stačily proniknout do matčina oběhu jsou navázány na anti­ D protilátky a následně pohlceny makrofágy.

3. 4. D a l š í  k r e v n í  s y s t é m y  Jsou známy mnohé další krevní systémy u člověka. Užití mají zvláště v aplikovaných  vědách, při transfúzi krve nehrají důležitou roli. Vyšetřují se výjimečně, jak uvádí Schreiber  a kol. (1998), pouze v případech opakované transfúze většího množství krve. Antigeny těchto  méně známých systémů působí velmi slabě a v séru se protilátky proti nim přirozeně ani  nevyskytují. Stává se tak až po případné násobné imunizaci daným antigenem. Mluvíme tak  o systémech MNSs, P, Lutheran, Kell­Cellano, Lewis, Duffy a Kidd a mnohých jiných (viz  Tab.   8,   9).   Race  a   Sanger   (1954)   uvádí  i   další   objevené   systémy,   nalezené  v   určitých  populacích. Ty nemají praktické uplatnění v genetice člověka, protože antigeny na základě  kterých byly identifikované, u jedinců buď téměř vždy chybí anebo jsou přítomny. Některé z  nich byly nalezeny v jednotlivých rodinách, jiné jsou typické pro určité populace. Pro shrnutí, antigenní systémy kromě AB0 a Rh mají uplatnění zvláště u výzkumu  etnogenetické analýzy populací, při hledání vývojových spojovacích článků mezi skupinami  lidstva, dále také při výkladu příbuznosti jedinců a při podrobném stanovování otcovství.  Sehrály také důležitou úlohu při objasnění dědičnosti člověka (Fetter a kol. 1967).

21

 Rok  Skupinový  objevu systém 1900

AB0 

Antigen

Fenotyp

A1, A2, A3, A4,  0, A1, A2, B, AB B

Objevitel Landsteiner  (1907 Janský)

1927

MNSs

M, (M2), N,  (N2) S s

1927

P

P1, P2

P1, P2 ,p 

Landsteiner Levine

1940

Rh

C, Cw, Cx,  (Cu), (cv), c D, Du, d E, Ew, (Eu), e (F) f 

Rh+ Rh­

Landsteiner Wiener 

1945

Lutheran

Lua, Lub

Lu (a+b­) Lu (a­b+)

Callender Race Coombs Mourant Race

M, N, MN, S, s,  Ss

Landsteinerovi Levine

1946

Kell

K

K+k­, k+k+ K­k+, (K­k­)

1946

Lewis

Lea, Leb

Le (a+b­)

Mourant

b

Fy , Fy

Fy (a+b­) Fy (a+b+) Fy (a­b+) Fy(a­b­)

Cutbush Mollison Parkin Allen Diamond Niedziela

1950

Duffy

a

1951

Kidd

Jka, Jkb

Jk (a+b­) Jk (a+b+) Jk (a­b+) Jk (a­b­)

1955

Diego

Dia

Di (a+) Di (a­)

1955

Sutter

Jsaa

Js (a+) Js (a­)

1961

Auberger

Aua

Au (a+) Au (a­)

1962

Xg

Xga

Xg (a+) Xg (a­)

              Tab. 8  Ostatní popsané krevní systémy. Zdroj: Molnar (1983); Malaska (1957);                               Race, Sanger (1954). Přepracováno.             

22

                              

Rok  objevu

Název 

Označení  vlastnosti

Objevitel

Příčniny vzniku protilátky

1934

Hunter 

Hu

Landsteiner a kol.

heteroaglutinin

1946

Levay

1946

Graydon 

1947

Jobbins

1951

Miltenberger 

1951

Becker

1951

Jay 

1952

Callender­Race Gr

transfuze

Graydon

přirozený

Gilbey

těhotenství

Levine a kol.

těhotenství

Elbel­Prokop

těhotenství

Levine a kol.

nádor

Vel

Sussman­Miller

transfúze

1952

Ven

Loghem­Hart

těhotenství

1953

Berrens 

Be

Davidsohn 

těhotenství

1953

Wright 

Wra

Holman

těhotenství

1953

Henshew

He

Nijenhuis

heteroaglutinin

1954

Batty 

Bya

Simmons

těhotenství

1954

Verwest 

Vw

Hart­Loghem

těhotenství

1954

Romunde 

Rm

Hart­Loghem

těhotenství

Mia

Tja

Další krevní vlastnosti: Cartwrigh (YT), Scianna (SC), Dombrock (DO), Colton (CO),  Landstener­Wiener (LW), Chido/Rogers (CH/RG), Hn (H), Kx (XK), Gerbich (GE),   Cromer (CROMER), Knops (KN), Indian (IN)     Tab. 9  Další popsané krevní vlastnosti. Zdroj: Race, Sanger (1954); Malaska (1957);                         http://www.bloodbook.com/type­sys.html (15).

23

4. A n t r o p o l o g i e  k r e v n í c h  s k u p i n

4.1. P o č á t k y  s é r o a n t r o p o l o g i e Věda séroantropologie je jedním z odvětví antropologického bádání. „Přišla na svět“  v době, kdy byly objeveny i další krevní systémy, které nesloužily už jen pouze medicíně.  Staly se tak velkým přínosem pro studium genetiky člověka. Za tento moment je považován  objev manželů Hirszfeldových, kteří upozornili na to, že jednotlivé „lidské rasy“ vykazují  rozdíly v distribuci krevních skupin  (...“there were racial differences in the distribution of  the groups“). Od té doby se krevní skupiny staly velmi důležitým nástrojem pro fyzické  antropology (Race a Sanger 1954).  Polští   vědci   Ludvík   a   Hana  Hirszfeldovi   v   roce  1918   uveřejnili   výsledky  svých  výzkumů z makedonské fronty. Zde zkoumali krevní skupiny u vojáků různého původu.  Jednoznačně dospěli k závěru, že krevní skupina A se geograficky projevuje na západě ve  velké míře, přičemž postupem na východ je potlačena skupinou B (Fetter a kol. 1967). Od té  doby výzkum pokročil k objevům mnoha dalších krevních systémů. Například v roce 1926  uveřejnili Landsteiner spolu s Levinem systém MN a systém P. Tyto a jiné objevené krevní  systémy   nikterak  neovlivňují   transfúzi  krve,   těší   se   však   velkému   zájmu   antropologů  a  genetiků.

4.1.1. H a r d y h o – W e i n b e r g o v a  r o v n i c e Hardyho­Weinbergův zákon neboli rovnice slouží pro populačně­genetický rozbor. Je  to vztah mezi frekvencemi alel a genotypem populace. Rovnovážný stav nastává, pokud je  distribuce alel a tedy i genotypů neměnná po několik generací. Toto platí však jen pro ideální  populace. Původním předpokladem je, aby organismy byly diploidní, pohlavně reproduktivní  a aby v populaci probíhalo náhodné páření (panmixie). Populace musí být v ideálním případě  dostatečně (nekonečně) veliké. Také zde musí být vyloučena mutace, migrace a výběr. Pokud  je   toto   zachováno,   Hardyho­Weinbergův   zákon   platí   pro   autosomy   a   v   populacích   s  odděleným pohlavím pouze za předpokladu shodných alelových četností. 

24

Představíme­li   si  populaci v nejjednodušším případě, vezmeme v  úvahu  lokus   (místo)  s  dvěma alelami A a s alelovými četnostmi p a q. Hardy­Weinbergův zákon tedy předpovídá  genotypové četnosti pro AA homozygota (p2), Aa heterozygota (2pq), aa homozygot (q2 ).   Populace, jež jsou v rovnováze, lze vyjádřit tedy následující rovnicí:  p2 + 2pq + q2 = 1  (Relichová 2000; 6; 7). 

4.1.2. B i o c h e m i c k ý  i n d e x Hirszfeldovi   zavedli   tkzv.   „biochemický   index   rasy“,   který   slouží   jako   podílový  ukazatel   výskytu   četností   aglutinogenu   A   a   aglutinogenu   B.   Posuzuje   populace   ze  sérologického hlediska a stanovuje jejich vzájemné pozice. Nevýhodné je to, že zde není  počítáno s četností skupiny 0 (Martin, Saller 1960). I = A + AB / B + AB Na základě výsledku tohoto indexu byly vyčleněny 3 hlavní skupiny: evropský typ („europaischer Typ“)

>2,5

přechodný typ („intermediarer Typ“)

1,3 ­ 1,8

afro­asijský typ („afro­asiatischer Typ“)

<1,0

       

Bylo vytvořeno i mnoho dalších indexů pro porovnávání populací (více viz Martin, 

Saller 1960, s. 1611).  Jakékoli členění lidstva do skupin, popřípadě tkzv. „ras“ na základě morfologických  znaků a metrických ukazatelů je již přežitek. Takovéto srovnávání a hodnocení nemá žádné  vědecké opodstatnění, stává se jen podkladem pro rasistické teorie.

4.2. S é r o a n t r o p o l o g i e  v  Č e s k o s l o v e n s k u O výzkum krevních skupin se zajímali i mnozí fyzičtí antropologové v tehdejším  Československu. Toto odvětví mělo u nás již zavedenou tradici od dob Janského, který na  základě svých výsledků pojmenoval 4 krevní skupiny u lidí. Právem se tak zařadil mezi  autory objevu krevního systému AB0. 

25

Objev manželů Hirszfeldových podnítil zájem mnoha dalších antropologů o téma  krevních   skupin.   Již   v   roce   1929   započal   Trokan   výzkum   krevního   systému   AB0.  Následovali  další, v roce 1932  Suk (viz níže), dále Raška, Dokládal a Vlček. Krevními  systémy se zabývali další vědečtí pracovníci, např. Kout, Hrubiško, Šmálik, Vacl, Ferák a  Kušíková (Dokládal 1976).

4.2.1. V o j t ě c h  S u k  a  j e h o  d í l o Profesor Vojtěch Suk (1879­1967) se řadí mezi významné české antropology pro svůj  velký přínos v tomto oboru. Zabýval se také dlouhodobě právě výzkumem krevních skupin  populací a dalších znaků, které souvisejí s těmito krevními vlastnostmi. Je   úzce   spjat   s   dnešní   Masarykovou   univerzitou,   založil  zde   na   Přírodovědecké  fakultě Antropologický ústav (dobudován v roce 1927). Vojtěch Suk byl vystudovaný lékař a  antropolog.  Svůj  výzkum   zaměřil  především   na  obor  sérologie,  „rasové“  antropologie  a  etnologie.  V oblasti sérologie působil v Brně i Praze, zkoumal populace na svých vědeckých  cestách   na   Labradoru   (1927)   i   v   Podkarpatské  Rusi.  Zabýval   se   krevními   skupinami   u  recentních populací, zaměřoval se na geografické rozšíření skupin, hledal také korelace mezi  nemocností obyvatelstva a typem krevní skupiny (Pilařová 2005). Zastoupení krevních skupin studoval u evropské populace, široké šetření provedl v  Brně  a okolí (kolem 3000 vzorků). Zde dospěl v roce 1930 k následujícímu zastoupení  krevních skupin (Zdroj: Suk 1930):  0

A

B

AB

28,8%

44%

18,2%

9%

Tyto  výsledky  jsou  téměř  shodné  v  porovnání  s   frekvencemi  krevních  skupin  ve  střední Evropě (Suk 1934). V rámci tohoto výzkumu se zaměřil taktéž na krevní skupiny lidí  narozených ve velkých   městech a na vesnicích. Zde našel prokazatelný rozdíl v rozložení  jednotlivých skupin. Skupina 0 měla u obou pohlaví o mnoho vyšší frekvence ve městech, na  rozdíl od vesnic, kde bylo zase větší zastoupení skupiny A. Na odebraných vzorcích však  vyvrátil myšlenku, která předpovídala vztah mezi krevní skupinou jedince a barvou pleti a  také krevní skupinou a věkem (Suk 1930).  

26

Suk se zabýval také možnou spojitostí krevních skupin s onemocněním. Ve své práci  „Faultless teeth and blood groups“ z roku 1930 uvádí, že děti „bělochů“ mají prokazatelně  více kazů než děti původem z Natalu a Zululandu. Zkoumal také stav chrupu u dalších  populací v Africe a severní Kanadě. Tato myšlenka ho přiměla k bližšímu prozkoumání  chrupu u již zmiňovaného souboru z Brna, u kterých byly krevní skupiny známy. Skupina 0  byla nejodolnější vůči zubnímu kazu, nejvyšší procento kazivosti zubů vykazovaly skupiny  A a B (Suk 1930).

4. 3. G e o g r a f i c k é  r o z l o ž e n í  k r e v n í c h  s k u p i n  v e  s v ě t ě Rozložení  krevních   skupin   není   ve   světě   jednotné.   V   některých   oblastech   světa  převládá v populaci určitý typ skupiny, zatímco druhý je značně potlačen. O tento jev se  „postarala“ evoluce. Lidské populace byly po dobu let ovlivňovány míšením, mutacemi a  přírodním výběrem, také posun genetické rovnováhy sehrál důležitou roli. Dle Vogela (1960,  1970), tento jev (způsob rozložení krevních skupin) zapříčinila epidemie moru a pravých  neštovic (in Kellermann 1971).  Frekvence krevních typů ve světě je jedno z témat, kterým se zabývají antropologové  a evoluční biologové. Na základě těchto údajů můžeme sledovat lidskou variabilitu a celkové  migrační chování obyvatelstva. Dále pak také směr, jakým se evoluce v dějinách ubírala.  Nejlépe   je   to   patrno   ze   studia   izolovaných   skupin   jedinců.   Dnes   prakticky   neexistuje  dokonale izolovaná skupina lidí, v průběhu času došlo k mezidruhovému křížení.  Krevní  skupiny  jsou  vhodné  pro   studium  lidské  variability,  protože  otázka  jejich  dědičnosti   je   dnes   už   vyřešena.   Wolf   (2000)   uvádí,   že   dědičnost   morfologických   a  deskriptivních znaků člověka je o mnoho složitější a její podstata zůstává nejasná. Výzkum  skupin za poslední roky značně pokročil a je významnou pomůckou v moderní antropologii. 

27

4.3.1. S y s t é m  A B 0  v e  s v ě t ě 4.3.1.1. K r e v n í  s k u p i n a  0 Skupinu 0 vlastní největší počet lidí na světě (viz Obr. 4). Krevní typ 0 má vysokou  četnost (přes 50%) u Basků, Irů a Islanďanů. Největší zastoupení má však u amerických  Indiánů, u některých kmenů dosahuje téměř 100% (Fetter a kol. 1967). Beneš (1979) uvádí,  že ačkoli je skupina 0 pro Indiány typická, stejně se tak nacházejí velké rozdíly v rámci  kmenů.   Například   u   západoamerických   Utesů   je   výskyt   této   skupiny   97%,   zatímco   u  Černonožců žijících v sousedství je to jen 23%. Vácha a kol. (2004) dodává, že právě u  Indiánů chybí skupina B. Ta vznikla nejspíš mutací ve starém světě. Další oblast poměrně  vysokého výskytu je Afrika. Kolem 75% obyvatelstva ve střední, západní a jihovýchodní  části mají tento fenotyp 0. Afričané osídlující území severně od Sahary, se se svou nižší  skupinovou četností 0 blíží některým západoevropským populacím (Beneš 1979). Lidstvo na zemi vlastní alelu 0 v 63%. Skupina 0 se také ve velkém měřítku objevuje  u   domorodých   Austrálců   a   v   západní  Evropě,   zvláště   u   populací  s   Keltskými   předky.  Nejnižší frekvence této skupiny je ve východní Evropě a Střední Asii, kde je častá skupina B  (3). Jih a sever asijského kontinentu je oproti centrální Asii ve výskytu skupiny B o dosti  bohatší (Beneš 1979).

28

                              Obr. 4  Rozložení skupiny 0 ve světě (%).                            Zdroj: http://anthro.palomar.edu.com (3). 

4.3.1.2. K r e v n í  s k u p i n a  A Skupina A je druhá nejčetnější krevní skupina ve světě (Beneš 1979). Své největší  zastoupení má v Evropě, zvláště pak na severu a západě. Směrem na východ a jih ustupuje  skupině B. Tento posun je patrný v Itálii, kde zastoupení skupiny A směrem od severu k jihu  slábne. Stejně tak v Německu, kde je tento úbytek od západu na východ. Do skupiny A spadá  více než 50% obyvatel Laponska, Norska a Portugalska. U Poláků, Rusů a Ukrajinců se  vyskytuje mezi 32­40% (Fetter  a kol. 1967; Wolf 2000). Eskymáci vykazují výskyt  této  skupiny přes 60% (Vácha a kol. 2004).  Celkově je alela A na světě u lidí přítomna v 21% (viz Obr. 5). Jak dále uvádí  internetový zdroj (3), nejvyšší frekvence alely A se nachází v malých populacích, jako jsou  Černonožci v Montaně (30­35%), u původního obyvatelstva Austrálie (40­53%) a v severní  Skandinávii (50­90%). Přičemž alela A zjevně vůbec není přítomna u Indiánů ve střední a  Jižní   Americe   a   nevyskytovala   se   vůbec   ani   v   minulosti.   Objevila   se   až   s   příchodem  Evropanů.   Tato   hypotéza   se   však   rozchází   s   objevem   skupiny   A   u   mumií   z  předkolumbijského   období.   Nízké   hodnoty   jsou   u   populací   paleomongoloidních   a  východoindických. Také v Africe není výskyt této skupiny nikterak vysoký (průměr  15­ 20%), v některých oblastech ojediněle 5­10%. Podtyp A2 se vyskytuje pouze u Evropanů a  Afričanů, u jiných skupin obyvatelstva nebyl dosud zjištěn (Beneš 1979). 29

                       Obr. 5  Rozložení alely A ve světě (%).                          Zdroj: http://anthro.palomar.edu.com (3).

4.3.1.3. K r e v n í  s k u p i n a  B Skupina B se v Evropě vyskytuje nejméně. Téměř skoro nikde na území Evropy  nepřekročí 20%. Jedinou výjimkou jsou Romové, u kterých byla zjištěna skupina B v 35%.  Tímto se svou distribucí blíží k asijským skupinám Burjatů, Kalmyků, Indů a Siamců (Fetter  a kol. 1967; Wolf 2000). Až 40% zaujímá v jihovýchodní Asii a v Koreji, také Indii  a  Indonésii (Vácha a kol. 2004).  Další   území   s   vysokým   výskytem   této   skupiny   je   Afrika,   kde   je   také   patrná  nerovnoměrnost na daných územích, někde je dosti vysoká, jinde nedosahuje frekvence ani  5%.   V   Austrálii   (zjištěna   jen   u   severoaustrálských   domorodců)   a   Americe   se   téměř  nevyskytuje. Velmi vzácná je v Melanésii a Polynésii (Beneš 1979). Právě na Polynésanech  lze dobře doložit jejich původ, který by bez studia krevních skupin zůstával nevyřešenou  otázkou.   Porovnáním   jejich   skupinových   frekvencí   bylo   prokázáno   jasné   zastoupení  „amerických genů“ (tomu odpovídá vysoké procento skupiny 0, velmi málo skupiny B a  úplná nepřítomnost podskupiny A2). Pozdější výzkum dalších systému potvrdil i částečné  geny z Asie (Beneš 1994).  Alela B je však ve světě svým výskytem nejvzácnější (viz Obr. 6). Tuto alelu nese  pouze 16% veškerého obyvatelstva na světě (3).

30

                    Obr. 6  Rozložení alely B ve světě (%).                           Zdroj: http://anthro.palomar.edu.com (3).

4.3.2. S y s t é m  A B 0  v  Č e s k é  r e p u b l i c e 0

A

B

AB

Suk (1932)

28,8%

44%

18,2%

9%

Wolf (2000)

30%

44%

18%

8%

Bičík (1992)

36%

41%

16,5%

6,5%

Vácha a kol. (2004)

37,8%

41,5%

14,1%

6,6%

Tab. 10  Zastoupení krevních skupin v České republice dle různých autorů.

4.3.3. S y s t é m  R h  v e  s v ě t ě Systém Rh slouží jako vhodná antropologická charakteristika. U Afroameričanů a  Asiatů je výskyt skupiny Rh+ velmi častý, téměř 100%. V evropské populaci tomu už tak  není, Rh pozitivních jedinců je okolo 80%, výjimku tvoří Baskové (pod 70%) a obyvatelé  švýcarských kantonů (ti zůstali po určitou dobu v izolaci). 

31

Podskupina systému Rh, cDe je u Evropanů přítomna okolo 2%, zatímco u Afroameričanů  dosahuje až 70% (Vácha a kol. 2004;  Fetter 1967; 3).

                                                   

S frekvencí výskytu této podskupiny je spojována také další krevní vlastnost. Jedná se  o tvar červených krvinek, které jsou ve tvaru srpu („sickle cell trait“). Tento znak je častý u  Afroamerické  populace.  Tímto  se   zabýval   ve  své  práci  i   Zoutendyk  a   kol.   (1953),   kdy  zkoumal   frekvence   krevních   skupin   u   lidí   v   jižní   Africe   („Bushmen   people“).   Zde  zaznamenal vysokou frekvenci cDe, avšak žádné srpkovité krvinky. Na základě Lehmana a  Cutbushe (1952) přistoupil Zoutendyk na teorii, že tento typ krvinek se přesunul na africký  kontinent z Asie a má odlišný původ od vysoké frekvence cDe. Poznatek spjatý s touto  vlastností   přispívá  k   objasnění  původu  lidstva.   Úzká  skupina   obyvatel  jižní   Afriky  jsou  nejspíše starověkého původu. V minulosti obsazovali daleko větší území, než na kterém žijí  nyní (Beneš 1979).

4.3.4. E v o l u c e  k r e v n í c h  s k u p i n

Evoluce krevních skupin je nesmírně zajímavé téma, kterým se zabývá především  věda evoluční biologie. Je velmi obtížné stanovit nějaký daný rámec, dle kterého se ve vývoji  utvářely krevní vlastnosti lidstva. Ostatně, na toto téma je publikováno mnoho různých teorií.  Jak uvádí Routil ve své práci o vztahu „rasy“ a krevních skupin, vysoké procento  skupiny 0 ve světě je předpoklad toho, že lidstvo se vyvíjelo monofyleticky (Suk 1934).  Původní člověk tedy vlastnil pouze skupinu 0. To znamená, že na povrchu červených krvinek  nebyl přítomen antigen A ani B (16). Krevní skupiny A a B jsou evolučními fázemi ve vývoji  krevních skupin („blood specificity“). Dle teorie Hirszfelda a Amzela, jsou A a B mutacemi  skupiny 0 (Martin, Saller 1960). Internetový zdroj (16) uvádí, že krevní skupina A vznikla  mutací   pravděpodobně  20   000  lety   p.   K.   Na   povrchu  erytrocytů   se   vyvinul  antigen  A.  Skupina B by měla být mladší ještě asi o 10 000 let. Její vznik je kladen do Asie. Není však  jasné, proč se tento krevní typ utvářel právě na tomto území. Jako poslední článek ve vývoji  vznikla   míšením   skupina   AB   asi   před   1500   lety.   Někteří   evoluční   biologové   se   však  domnívají,   že   první   ve   světě   vznikla  alela  Ia  a   až   poté   se   z   ní   vyvinula   alela  i  pouze  odstraněním její funkční části. Alela Ib je kladena do poslední fáze evolučního vývoje. 

32

5. U r č o v á n í  k r e v n í h o  s y s t é m u  A B 0   u  h i s t o r i c k é h o  k o s t e r n í h o  m a t e r i á l u 5. M o l e k u l á r n ě  g e n e t i c k é  v y š e t ř e n í k r e v n í c h  s k u p i n Vyšetření krevních skupin je dnes možno úspěšně provést metodou analýzy DNA. V  dvouřetězcové molekule DNA je uložena veškerá genetická informace jedince (část také v  mitochondriích).  Gen  je   úsek  chromozomu  se   specifickou   sekvencí  nukleotidu.  Geny   se  nacházejí  na  typických  místech chromozomu,  nazývaných  lokusy. Dnes  už  je velká  část  lidského genomu zmapována. Vědci znají konkrétní místa výskytu potřebné informace. Jsou  tedy   známa  i   místa   specifická   pro   rozluštění   genotypu   krevních   skupin.   Na   rozdíl   od  sérologických   metod   není  metoda  analýzy  DNA   ovlivněna  kontaminací  vlivem   vnějšího  prostředí a dochází podstatně méně k nespecifickým reakcím.  

5.1.1. M o l e k u l á r n í  g e n e t i k a  s y s t é m u  A B 0 Antigenní vlastnosti krevních skupin nejsou přesně předurčeny geny A, B nebo 0,  nýbrž  jsou  určeny   aktivitou  enzymů  glykosyltransferáz.   Jak  už   bylo   v   úvodu  řečeno,  A  transferáza  je odpovědná za přenos  N­acetylgalaktosaminu  a  B transferáza  za přenos  D  galaktózy, z toho také vyplývá určení krevní skupiny A a B. U skupiny AB jsou umístěné  obě transferázy, u skupiny 0 žádná. Jak uvádí Bennet a kol. (1995), geny pro tyto transferázy  jsou přítomny na dlouhém raménku 9. chromozomu (9q34). Tento lokus AB0 je složen ze 7  exonů s celkovou délkou 1062 párů bází (bp). Délka jednotlivých exonů je v rozsahu 27 až  690 bp.  Na exonech 6 a 7 se nacházejí nejvýznamnější delece a substituce (in Zelený 2006;  5).  Při zjišťování krevního systému AB0 jsou velmi důležitá místa 261 a 703 v sekvenci  DNA glykozyltransferázového genu. Pozice 261 je rozpoznávací a restrikční místo pro enzym  KpnI. Zde dochází u většiny alel 0 k deleci nukleotidu guaninu. Tímto lze alelu 0 odlišit od  alely A a B.  33

V místě 703 se nalézá typické místo pro restriktázu AluI, kde dochází k substituci nukleotidu  guaninu   za   alanin   v   sekvenci  transferázy   B.   K   odlišení   dalších   alel  se   používají   i   jiné  specifické restriktázy, tyto 2 jsou ale nejvyužívanější (Zelený 2006; Hummel 2003).  Lee a Chang (1992) při svém výzkumu „odhalili“ krevní skupiny pomocí restriktáz v  místě 258 a 700 sekvence DNA. Tento postup použili úspěšně i na vzorcích kostní tkáně,  která byla vystavena extrémním podmínkám. Zde dokazují, že postačí pouze rozbor pozice  nukleotidu  258   a   700  (za   použití   2   sad  specifických   primerů)  k   určení  krevní   skupiny.  Výsledný   genotyp   je   poté   jednoduše   určen   na   základě   projevu   štěpných   enzymů   dle  závazných pravidel (viz Tab. 11).

KpnI

AluI

00

BB

A0, B0

AB, B0

Nerozloženo

AA, AB, 

AA, A0, 

(„No digestion“)

BB

00

Celkový rozklad  („Complete digestion“) Poloviční rozklad („Half digestion“)

                              Tab. 11  Výsledné genotypy AB0 předurčené aktivitou enzymů KpnI a AluI.                                                            Zdroj: Lee, Chang (1992). Přepracováno. 

                                     Obr. 7  Výsledek metody PCR. Detekce krevních skupin.             

                                        Zdroj: www.dadamo.com (6).                

34

5.1.2. M e t o d a  P C R   ( „p o l y m e r a s e  c h a i n  r e a c t i o n“ ) Genotyp krevní skupiny jedince je téměř jednoduše rozluštitelný pomocí PCR metody  (polymerázová řetězová reakce). Jak dodává Dobisíková (1999), při analýze starých nálezů je  toto často jediná možná metoda. Metoda PCR byla zavedena v roce 1983 K. Mullisem, za  kterou  později  získal  Nobelovu   cenu.  Jedná   se   o   mnohonásobnou  replikaci  konkrétního  úseku DNA in vitro. PCR je také jedinečná v tom, že bez klonování získáme požadovanou  sekvenci molekuly DNA (Doškař 2006).  Proces replikace vyžaduje v přírodě přítomnost mnoha enzymů, pro průběh reakce in  vitro   postačí   použití   jen   jednoho   enzymu.   Pro   provedení   metody   PCR   potřebujeme  následující materiál: ­     templát (DNA nebo RNA; postačí již malé množství, asi 1molekula nukleové kyseliny) 

primery   (specifické  oligonukleotidy;   pro   krevní   skupiny   se   používají   AB01,   AB02,  AB07, AB010)



termostabilní enzym DNA polymerázu (získává se z termofilních mikroorganismů)



směs nukleotidů (dNTP)



hořečnaté ionty (Zelený 2006; Rosypal, Doškař 2000; Mazura a kol. 2001) Vlastní   metodě   PCR   předchází   izolace   DNA.   Základní   metoda   polymerázové 

řetězové reakce se skládá z následujících kroků, přičemž cyklus se opakuje 25 – 35 krát: ­     denaturace 

připojení primerů 



prodlužování primerů (Doškař 2006) Následuje   restrikční   štěpení   specifickými  enzymy   KpnI  a  AluI  a   poté   detekce 

zmnoženého  úseku   produktu   PCR  gelovou   elektroforézou   (agaróza,   polyakrylamid).  Pro  rozbor   výsledných   produktů  se   vystaví   gel   pod   UV   světlo   a   také   se   pořídí   fotografie.  Nakonec se hodnotí délky fragmentů a po porovnání se standardem se označí jako pozitivní  anebo negativní. Při práci se musí dávat pozor na jakoukoli možnou kontaminaci materiálu. 

35

Metoda   PCR  může   být   použita   v několika  variantách,   v závislosti   na  tom,  co   je  potřebné analyzovat. Toho lze dosáhnout změnou primerů, přidáním dalších enzymů anebo  odlišnou   detekcí   produktů.   Pro   učení   krevních   skupin   je   taktéž   vhodná  PCR­RFLP  (stanovení  polymorfizmu délky restrikčních fragmentů). Ta je  vhodná pro typizaci cílové  frekvence určitého genu (Šmarda a kol. 2005).

5.2. S é r o l o g i c k é  v y š e t ř e n í  k r e v n í c h  s k u p i n Mezi  metody  umožňující  identifikaci  jedince patří   i  sérologické  určení krevních skupin.  Využívá ho rovněž fyzická antropologie, která si při výzkumu klade za úkol identifikovat a  správně popsat kosterní materiál. Při výzkumu se nejdříve porovnávají jednotlivé kosti anebo  kostní fragmenty na základě morfologických znaků, poté přicházejí na řadu metrické metody.  V   mnoha   případech   se   stává,   že   materiál   je   v   dosti   špatném   stavu   a   je   tedy   téměř  nehodnotitelný.   Vědci   poté   přistupují   na   metody   chemické,   histologické   a   genetické  identifikace, při kterých využívají speciálních laboratorních technik. Tyto metody jsou  v  antropologii dnes již dobře rozpracovány a účinně ověřeny na konkrétních případech.  Jako   nejúčinnější   se   jeví   metody   studující   genetickou   informaci   uloženou   v  chromozomech   v   DNA.   Jsou   však   velmi   náročné   a   zdlouhavé.   Při   větším   množství  zkoumaného materiálu anebo jeho částí není možné běžně využít těchto metod. V mnoha  případech postačí k identifikaci použít nenáročné sérologické metody. Jednou z možných  typů   sérologické   identifikace   je   vyšetření   skupinových   vlastností   krve.   Kosti   poskytují  dostačující množství látek k vyvolání antigenní reakce. Tento typ vyšetření je nejspíše možný  pouze u skupiny sekretorů, což představuje v populaci kolem 80% jedinců. Pravdou je, že  tato „starost“ u molekulárně genetických postupů odpadá.  Kost   je   biologický   materiál   a   její   chemický   základ   se   značně   mění.   Jednak   s  přibývajícím věkem nebo onemocněním jedince, tak také s dobou uložením v zemi. Jak  uvádí Dobisíková (1999), probíhají v ní mnohé diagenetické procesy a také na ni působí  rozličné  fyzikální   a   chemické  faktory.  Záleží  samozřejmě   i   na  místě   uložení  kostí   a  na  celkovém stavu okolního prostředí. Samotné sérologické metody by neměly být ovlivněny  věkem jedince (i když například u dětí je určení krevních skupin úspěšnější, viz kapitola  5.2.5. „Výsledky a diskuze“), pohlavím a dokonce ani dobou uložení v hrobu, což se ukázalo  až po delší době bádání.  36

Jak dodává Kellerman (1971), ke snižování krevních komponentů v kostech dochází v  souvislosti   s   přirozeným   procesem   dekompozice.   Je   ale   nevhodné   spojovat   množství  skupinových  faktorů  v  kostech  s   dobou  jejich  uložení.  Pro  správný  průkaz  skupinových  vlastností není stáří materiálu rozhodující, v porovnání se situací, kdy jsou kosti přepáleny.  Dále  je  také  prokázáno  značné  zkreslení   výsledků  mikroorganismy  žijící   v   okolí  hrobu. Z toho plyne nutnost odebírat i vzorky půdy z okolí a pokusit se u nich vyšetřit možné  antigenní látky, které mohou svou přítomností ovlivnit zdárný průběh výzkumu. Následují i  další potíže, jako například nespecifické reakce materiálu.  Dobisíková (1999) také dokládá, že stabilita antigenů, které vyšetřujeme je značně  stálá.   Je   to   díky   sacharidové   struktuře   antigenů,   které   nepodléhají   tolik   degradaci  jako  struktury   bílkovinné.   Reakce   probíhá   mezi   antigenem   přítomným   v   kosti   a   dodanou  protilátkou. Výsledek hodnotíme jako pozitivní, pokud reakce proběhne a jsou patrné shluky.  Došlo   tedy   k   aglutinaci.   Negativní   výsledek   nám   napovídá,   že   v   kosti   se   nevyskytují  protilátky   proti   dodanému   antigenu.   Poté   vyhodnotíme   krevní   skupinu   z   výsledků  aglutinačních testů na základě znalosti vlastností krve. Aglutinace je pozorovatelná pouhým  okem, k ověření se používají i elektronické mikroskopy.

5.2.1. H i s t o r i e  v ý z k u m ů Historie   sérologických   výzkumů   kosterního   materiálu   sahá   do   30.   let   minulého  století.   Vědci,  zejména  antropologové   začali  zkoumat  skupinové  vlastnosti   na  rozličném  lidském   materiálu   a   lidských   pozůstatcích   z   hrobů.   Byl   to   další   posun   v   možnosti  identifikace nalezených kostí  a mumifikovaných tkání. Jak uvádí Kout a kol. (1965), úspěšné  stanovování krevních skupin ve forenzní medicíně podnítilo myšlenku využívat podobných  metod   u   paleosérologického  materiálu.  Ezra­Cohn  a   Cook  (1961)   pokládají   Candelu  za  průkopníka v této oblasti. Ten v roce 1935 zveřejnil možnosti vyšetření krevních skupin z  archeologického kosterního materiálu. Heglar (1972) spojuje s počátky paleosérologie také  další   autory,   jako   jsou   Boyd   a   Matson,   kteří   taktéž   významně  přispěli   k   vypracování  metodiky týkající se tohoto problému.  V 30. letech se používala metoda absorpce s usušeným a rozdrceným kostním anebo  tkáňovým  materiálem.  První  takovou  práci  publikovali   Boyd  a   Candela  v   roce  1939.  K  výzkumu použili materiál kostní drtě a metodu aglutinačně inhibiční, kterou si upravili pro  vlastní účel práce.  37

Tato metoda byla poté běžně používána dalšími vědci. Jak uvádí Kellerman (1971), od té  doby byla několikrát přepracována a vylepšena, například Salazarem v roce 1951 a Thiemem  v roce 1956. Italský vědec Borgognini ji značně přepracoval v roce 1969. Základní princip  metody však zůstal zachován. V 50. letech se paleosérologie dostávala do širšího podvědomí a začala se ve větší  míře užívat v rámci archeologicko­antropologických výzkumů. To bylo spojeno se studiem  lidské variability, populační genetiky, původem lidstva a samozřejmě také s identifikací. Tato  témata zaujala první místo v antropologickém bádání (Heglar 1972). V této době se však  stále více objevovaly pochybnosti a problémy spjaté s výzkumem. Thieme a Otten (1957)  publikovali práci „The unreability of blood typing aged bone“ o nespolehlivosti výsledků při  testování starých kostí. Výsledky, ke kterým se dobrali s použitím tohoto materiálu (použili  inhibiční   metodu),   zhodnotili   jako   nespolehlivé.   V   roce   1958   uveřejnil   Gray   článek   o  nespecifických  reakcích  materiálu.  Následovali  další   autoři,  kteří  upozorňovali   na  chyby  laboratoří a na nežádoucí ovlivnění okolním prostředím. V laboratořích se provádělo mnoho  pokusů s testovaným materiálem. Vědci vystavovali kosti extrémním podmínkám, testovali  zároveň recentní a fosilní kosti, porovnávali různé metody mezi sebou a následně vylepšovali  jednotlivé fáze metod.  V   60.   letech   se   okruh   zájmu   přesunul   k   biochemickým   analýzám   kostí   a  kontaminujících   látkách   v   okolí   pohřebiště.   Lengyel   zkoumal  obsah  dusíku   v  kostech   a  protein­polysacharidový komplex, který musí být v kosti přítomen v daném množství, jinak  kost nelze z hlediska antigenů testovat. Další poznatek z této oblasti zveřejnil Pardini (1968),  kdy   prokázal   souvislost   mezi   sílou   reakce   AI   metody   a   obsahem  hexosaminů  (  aminosacharidů N­acetyl­glukosaminu  a  N­acetyl­galaktosaminu) v kostech (in Kellerman  1971).   Erza­Cohn   a   Cook   (1961)   učinili   závěr   ohledně   typu   zkoumaného   materiálu,  kompaktu  kosti  nelze  na antigeny testovat. Této zásady se v  pozdějších pracích drželi  i  ostatní autoři, pro rozbory se upřednostňovaly spongiózní části kostí. V roce 1964 uveřejnil  Lengyel v časopise „Homo“ metodu fluorescenčního značení antigenů (původně ji vytvořil v  40. letech Coons). Ta byla svým způsobem převratná v tom, že byla citlivá na odhalení  antigenu.   Výsledky   vykazovaly   o   15­20%   větší   úspěšnost   než   u   prvotní   metodiky  vypracované  Candelou  a   Boydem.    Nevýhodou  však  bylo,  že   se   nepovedlo  snížit   počet  nespecifických reakcí a nebyla zde možnost provádět opakování testů.

38

 

V letech 70. nastal velký rozmach v oblasti palesérologie. Autoři se zabývali jednak 

skupinami recentních populací (v této době již byly zjištěny skupinové frekvence téměř po  celém světě), dále to byly populace pravěké (a mladší). V těchto letech v paleosérologii  působili přední antropologové Paoli, Borgognini a Parenti. Tito autoři zavedli pro výzkum  metodu absorpčně eluční, která se dosud používala většinou ve forenzních vědách. Dále se  také  pracovalo na vylepšení purifikační fáze, která běžně předchází vlastnímu výzkumu.  Nedokonalé   čištění   kostí   bylo   jedním   ze   zdrojů   nespecifických   reakcí   materiálu.   V  Československu se v 70. letech zabývali historickou sérologií Vlček, Tesař spolu s Klírem.  Zkoumali kosti historických osobností z hlediska příbuznosti jedinců. Sérologické postupy  byly   také   výhodné   pro   identifikaci   a   roztřídění   kostí   nacházející   se   v   jednom   hrobě  pohromadě. Využívali techniky dvoufázového dvoukruhového systému vypracované Tesařem  a   Klírem   (1975).   Jedná   se   vlastně   o   kombinaci   metody   absorpčně   eluční   s   metodou  absorpčně inhibiční.  V 80. letech přišly na řadu moderní metody analýzy lidského genomu. Uplatňovaly se  zvláště v praktických odvětvích výzkumu. Sérologické metody byly zčásti potlačeny, zůstaly  však   doceněné   zvláště   díky   nenáročnosti   na   materiál   a   rychlému   a   levnému   provedení.  Sérologických   prací   ale   celkově   postupně   ubývalo.   Objevovali   se   práce   o   kontaminaci  mikroorganismy (Strejc,  Dobisíková 1989). Lee (1991) zkoumal vzorky po užití AE testu a  upraveného   AI   testu   („two   dimensional“,   tedy   dvourozměrného).   Paoli   v   roce   1992  publikoval spolu s českými antropology práci, kde vzájemně srovnávali různý materiál a  metody   AI  a   AE.  Sérologické  metody  dnes  nejsou  při   antropologickém   výzkumu  zcela  běžné. Plno zásadních problémů ještě není vyřešeno a výsledky jsou často nespolehlivé.  Dobrat se k věrohodným výsledkům s možnostmi jejich opakování se stále jeví jako dosti  složité.

39

5.2.2. B i o l o g i c k ý  m a t e r i á l 5.2.2.1. K o s t i 5.2.2.1.1. P ů v o d  k o s t e r n í h o  m a t e r i á l u Biologický materiál zahrnuje lidské kosti a jejich fragmenty, části lidských tkání,  vlasy, krev, ostatní tekutiny atd. Ačkoli lze krevní skupiny vyšetřit ze všech výše uvedených  složek lidského těla, zaměřuji se pouze na kosterní materiál, který se jako jediný vztahuje k  tématu práce. V sérologických pracích na toto téma je asi nejčastěji používán historický  kosterní   materiál.   Kosti   jsou   často   objeveny   během   archeologického   výzkumu   na  pohřebištích, hřbitovech anebo na různých lokalitách jako ojedinělé nálezy. Jiný případ jsou  již dávno nalezené kosti uložené na místech jako jsou kostnice anebo uložené v depozitářích.  Ty   se   také  dodatečně  podrobují   těmto   rozborům.  Dalším   objektem   výzkumu   může   být  paleolitický materiál. Sérologicky ho hojně zkoumal Ital Paoli v 70. letech a vytvořil na něm  úspěšnou metodiku, kterou přebírali i další  vědci. Dále se také testují krevní skupiny  u  recentního lidského materiálu, kterým se zabývá obor forenzní antropologie. 5.2.2.1.2. P ř í p r a v a  k o s t í Před začátkem vlastního výzkumu je nutné vhodně připravit kosterní materiál pro  další práci. Jak uvádí Stloukal (1999), nalezené kosti se po vyzvednutí ze země nejdříve  pečlivě usuší a až poté se přejde na vlastní čištění. Kosti jsou čištěny zubním kartáčkem  nejlépe pod tekoucí vodou (vhodnější je voda destilovaná). Kosti se nenechávají ležet ve  vodě, mohlo by dojít k jejich rozmočení. Při sérologické analýze se ještě kosterní materiál  dokonale čistí, aby se předešlo nespecifickým reakcím. Kostní drť se namáčí do fenolu a  závěrem do etanolu (Borgognini Tarli a kol. 1979). Nebo například Lee a kol. (1991) použil  ether a dusík (podrobněji viz kapitola 5.2.3. „Metody“). Stloukal (1999) varuje před používáním chemických přípravků, pokud je záměrem  výzkumu   podrobit   kosti   rozličným   chemickým   a   genetickým   analýzám.   Tím   autor  upozorňuje na nevhodnost konzervace kostí. Ta se provádí za účelem zpevnění kosti, kost se  poté také lépe rekonstruuje.  40

Často se používal ke konzervaci klih, později se přecházelo na vhodnější prostředky. To jsou  nitrolaky,   akryláty   anebo   polyvinylacetáty,   pod   kterými   kosti   tolik   neplesnivěly.   Od  konzervace se však již ustupuje, protože pozdější rozbory prováděné na kostech nemusí být  vůbec úspěšné. V roce 1979  uveřejnil Vlček s  Tesařem sérologický rozbor skupinových  vlastností   kostí   nejstarších   Přemyslovců.   Tyto   kosterní   pozůstatky   byly   již   dříve  konzervovány   postupným   prosycováním   roztoky   polyvinylacetátu.   V   tomto   případě   se  nakonec při vyšetření ukázalo, že výsledky nemohly být touto konzervací ovlivněny.   5.2.2.1.3. V ý b ě r  k o s t í  k  a n a l ý z e K vlastním sérologickým rozborům jsou využívány jednotlivé části skeletu. Závisí  samozřejmě na tom, jaký materiál a v jakém stavu je nám dostupný. Vědci ale upřednostňují  různé konkrétní části kostry, dle toho, které považují pro detekci antigenů za nejvhodnější.  Téměř vždy jsou používána malá množství spongiózní části kostí, které se následně rozmělní  na prach kladivem anebo pomocí hydraulického tlaku. Dle Paoliho a kol. (1986) je spongióza  vhodná jako výchozí materiál z toho důvodu, že je přirozeně chráněna kompaktní vrstvou  kosti.   Erza­Cohn  spolu   s   Cookem   (1961)   provedli   test   krevních   skupin,   kde   výchozím  materiálem byla právě kostní kompakta. Výzkumem bylo prokázáno, že kompakta kosti není  vůbec  vhodná  pro  detekci  antigenů.  Výsledné  krevní  skupiny  nevykazovaly  kosti,  nýbrž  okolní půda (podrobněji viz kapitola 5.2.5. „Výsledky a diskuze“). K rozboru se velmi často vybírají epifýzy dlouhých kostí. Paoli a kol. (1986) dal ve  výzkumu přednost epifýzám femuru, proximálním epifýzám humeru a tibie a těly obratlů. V  uveřejněné práci v roce 1992 zase úspěšně použil dobře zachovalá žebra a části tarzálních a  karpálních kostí. Někteří vědci využívají přednostně části lebky (například baze lební použil  Vlček   a   Klír   1979).   Dále   Thieme   a   kol.   (1956)   vyšetřoval   fragment   lebky   z   období  pleistocénu.   Kellerman   (1971)   si   pro   svůj   sérologický   výzkum   vybral  výhradně  hlavice  femurů, stejně tak jako Mickle a kol. (1977). Mickle však vybíral pouze ty femury, které byly  dokonale kryty kompaktou a testoval pouze vzorky femurů pocházející ze stejné strany (levé  nebo pravé). Takto se při větším množství materiálu předejde nechtěnému vícenásobnému  testování stejného jedince. Lengyel a Nemeskéri (1964) se domnívali, že při metodě fluorescenčního značení antigenů je nejvhodnější použít spongiózu z obratlů.

41

5.2.2.2. A n t i – H  s é r u m Další materiál biologického původu potřebný k reakcím je anti­H sérum, které se  užívá k průkazu skupinových vlastností. Může být součástí dodávaných komerčních antisér  od  příslušných   firem,  avšak  často  byl   připravován  přímo  v   laboratořích  ke  konkrétnímu  výzkumu. Nejběžnější anti­H sérum je  lektin  (rostlinný extrakt) ze semen Ulex europaeus  (hlodáš evropský)  (Heglar 1972) (viz Obr. 8, 9). Thieme a kol. (1956) popisuje přípravu  tohoto anti­H séra. K tomu je zapotřebí 25 gm semen z výše uvedené rostliny, jež  jsou  ustáleny ve fyziologickém roztoku. Posléze se střídavě zmrazují a rozmrazují, takto lze získat  největší   možné   množství   výtažku.   Po   vyčištění   se   roztok   konzervuje   a   zamrazí  se   do  zkumavek. Na základě prací Cazala a Lalaurie (1952) a Renkonena (1948), je tento anti­H  lektin taktéž nalezán v semenech rostlin Cytisus sessilifolus, Laburnum alpinum (štědřenec  horský) a Lotus tetragondobus (in Allison a kol. 1978).

 

     Obr. 8, 9  Keř Ulex europaneus (vlevo). Zdroj: http://flora.nikde.cz (17).                   Semena Ulex europaneus (vpravo). Zdroj: http://plants.usda.gov (18).

42

5.2.3. M e t o d y V sérologické praxi jsou popsány mnohé typy metod pro určení krevních skupin. Z  nich si pro výzkum vybíráme ty, které jsou nejvhodnější pro zpracování daného biologického  materiálu. Hrubiško (1983) uvádí, že pro rozbor krve se běžně používá imunohistochemické  vyšetření založené buď na metodě zkumavkové anebo metodě na mikrotitračních destičkách  typu U . Tesař a Klír (1990)a Klír (1999) popisují nejčastěji užívané metody pro určení  krevních skupin z kostí, vlasů, tkání a sekretů. Je to metoda absorpčně inhibiční, metoda  absorpčně eluční, metoda smíšené aglutinace, Lattesova metoda  a  Holzerova  metoda  (in  Zelený 2006). První dvě uvedené metody jsou typické pro vyšetření skupinových vlastností z kostní  tkáně. Jak dodává Dobisíková (1999) metoda smíšené aglutinace se používá velmi často pro  rozbory   vlasů,   imunofluorescenční  metoda   pro   měkké   tkáně   a   precipitační   metoda   pro  dekalcifikovaný kosterní materiál.  V následujících řádcích se zvláště zabývám podrobným popisem metod absorpčně  inhibiční a absorpčně eluční, které jsou pro analýzu kosterního materiálu nejvhodnější. Jsou  také podrobně   popsány v mnohých vědeckých pracích. Dále krátce zmiňuji další postupy,  které vycházejí z těchto 2 základních metod a jsou vlastně jejich kombinacemi. Jako poslední  v přehledu je uvedena metoda fluorescenčního značení antigenů přepracovaná Lengyelem a  Nemeskérim v roce 1964 speciálně pro kosterní materiál. 5.2.3.1. M e t o d a  a b s o r p č n ě  i n h i b i č n í  ( A I ) Základem této sérologické metody jsou 2 fáze; při absorpci se protilátka (vyjadřuje  se   titrem,   stupněm  zředění)  naváže  na  antigen   v   kostech.   Tím   se   vysytí   vazebná  místa  protilátky. V dalším kroku se k substrátu přidávají červené krvinky. Aglutinace je další fází  této metody. Pokud je antigen v kostech přítomen, k aglutinaci nedojde (protilátka nemá  volné vazby pro dodané krvinky), reakce je tedy inhibovaná. Množství nenavázané protilátky  hodnotíme na základě titru. Skupinovou příslušnost určujeme tím způsobem, že k protilátce  přidáváme antigen A, B a H (Dobisíková 1999).

43

Tuto metodu dokonale popisuje Paoli a kol. (1978) ve článku „Determinazione del  gruppo sanguigno del sistema AB0 negli inumati di Shakr­i Sokhta (Sistan, Iran).“ Na tuto  práci  se  odkazují  také  mnozí  další   autoři,  kteří   taktéž  sérologicky  zpracovávají   kosterní  materiál. Metodu   AI   lze   dále   podrobněji  rozdělit   do   3   fází;  fáze  extrakce,  koncentrace  a  aglutinačně  inhibiční  fáze.   Základním   potřebným   materiálem   je   kostní   drť,  fyziologický  roztok, séra anti­A, anti­B a anti­H (většinou komerčně dodávané) a erytrocyty (nejčastěji  3% náplav). 5.2.3.1.1. F á z e  e x t r a k c e   Připraví se výtažek z kostní drtě (2­3 gramy), jako rozpouštědlo se použije 5­8 ml  5% roztoku kyseliny ethylendiaminotetraacetyl (EDTA). Ta má za úkol odloučit anorganické  látky v kostech a ulehčit tak vstup roztoku antigenů. Fáze extrakce probíhá postupně, nechá  se odstát minimálně 6 hodin při pokojové teplotě. Tato fáze je prodloužena přes noc.

5.2.3.1.2. F á z e  k o n c e n t r a c e   Částečného vyčištění kostní drti lze dosáhnout s pomocí gelové filtrace procházející  kolonou Sephadex G 25. Celý proces slouží k vyloučení (eliminaci) solí suspenze. Ty mohou  narušit inhibiční reakci ve fázi aglutinace. Takto vyčištěný výtažek se podrobí vypařování za  studena. Vypařování probíhá do konečného objemu 2­2,5 ml.

5.2.3.1.3. F á z e  a g l u t i n a č n ě  i n h i b i č n í  Jednotlivá séra anti­A, anti­B a anti­H jsou přidána ke kostní drti. Jsou naředěna do  příslušného poměru s fyziologickým roztokem (např. 1:64). V této fázi by se měly navázat  dodané  protilátky  na  antigeny   přítomné  v  kostech.  Tato  fáze   probíhá  při  4°C  přes  noc.  Zároveň jsou s těmito kostními vzorky zavedeny i kontrolní sady zkumavek, kde se na místo  výtažku kosti doplní stejné množství fyziologického roztoku. Poté následuje centrifugace a  odsátí suspenze nad usazenou vrstvou kosti. 

44

Je   potřeba   vybrat   vhodné   sérum   ke   stanovení   skupiny   0.   Tímto   lze   předejít   omylu   v  diagnostice, kdy u vzorku stanovíme skupinu 0, avšak kost nemusí být schopná reagovat se  sérem anti­A a anti­B pro úbytek skupinové substance.  Mezitím jsou nachystány 2 sady zkumavek. Každá sada obsahuje 10 zkumavek pro  každou  krevní   skupinu (A,  B,  H).  Do každé  zkumavky  se   přidá  0,5   ml  fyziologického  roztoku.   Do   prvních   zkumavek   se   dodají   zreagovaná  antiséra  (tj.   zreagované   antisérum  označené jako anti­A se přidá do zkumavky v sérii označené skupinou A, totéž pro B a H). Z  první zkumavky se odebere 0,5 ml roztoku a přenese se do 2. zkumavky, promíchá se a opět  se nabere  0,5 ml  roztoku a přenese se do 3. zkumavky. Takto se pokračuje až k poslední  zkumavce, kde se 0,5 roztoku nakonec odstraní.  Tímto   postupem   docílíme   dvojnásobného   zředění   antisér,   která   se   vstřebají   s  výtažkem z kosti. Poté je do zkumavek v obou sadách dodán  3%  roztok erytrocytů lidské  čerstvé   krve   souhlasných   skupin   A,   B   a   0.   Následně   jsou  5   min  protřepávány   a  centrifugovány.   Výsledek  se   dostaví   v  sériích   ve  stupňovitém  stavu.  Roztoky  se   měří   v  kolorimetru. Měření stupně aglutinace v kolorimetru je více objektivní a navíc je tento proces  jednoduší a kvalitně hodnotitelný. V této fázi by mělo být patrno do jaké míry je který roztok  vysycen. Z toho lze určit množství reagujících složek v kosti a také jakou krevní skupinu kost  vykazuje (Paoli a kol. 1978; Borgognini a kol. 1979; Zelený 2006; Allison a kol. 1978;  Allison a kol. 1976). Ještě než přistoupíme k vlastní metodě je nutné zajistit dokonalou čistotu materiálu.  Borgognini a kol. (1979) popisuje fázi purifikace prováděnou běžně před výše popsanou fází  extrakce. Tento postup nám umožní snížení počtu výsledných nespecifických reakcí. Místo  běžného   použití   90%   roztoku   fenolu   autoři   použili   čistý   (100%)   fenol.   Ten   přidali   v  množství  10­15 ml  ke kostní drti. Teplota fenolu se pohybovala mezi  55­60°C. Následuje  míchání po dobu 30­60 min a centrifugace při teplotě 50°C (14­15000 ot/min) po dobu 10  minut. Poté se vyjme obsah a promyje se 10­12 ml 100% fenolem. Opět pokračuje míchání  asi  10   min  a  centrifugace   za   stejných   podmínek.   Nakonec   je   ještě   vzorek   promýván  etanolem.

45

Lee a kol. (1991) před sérologickým rozborem ponořil kosti do malého množství  etheru za účelem odstranění nečistot (tuku a mastnoty) na kostních fragmentech. Poté taktéž  použil promytí etanolem. 5.2.3.2 M e t o d a  a b s o r p č n ě  e l u č n í  ( A E ) 

Metoda absorpčně eluční je často užívána v oblasti soudní a lékařské analýzy, kde  jsou vyšetřovány krevní vzorky v různém stavu a také skvrny z lidských sekretů. Méně často  byla využívána antropology při svých výzkumech, převládala metoda AI. Metoda   absorpčně   eluční   je   založena   na   spojení   antigenu   a   protilátky   ve   fázi  absorpční,   následuje   odloučení  protilátek  navázaných   na  substrát  (odloučení  probíhá  za  tepla). Tato fáze se nazývá eluce (tepelná fáze). Nakonec se uvolnění příslušných protilátek  dokazuje shlukováním, neboli aglutinací (Dobisíková 1999; Paoli a kol. 1986). Podrobný postup AE metody uvádím na základě práce Paoliho a kol. 1986.

5.2.3.2.1. P ř í p r a v n á  f á z e Výchozím   materiálem  je   kost   rozdrcená  na  malé   části   (dále  substrát),  která   nám  postačí v množství 70­75 mg. Substrát je následně ustálen v 0,3 ml metanolu při pokojové  teplotě po dobu 15 minut. Po vyjmutí z metanolu je vzorek usušen bez přístupu vzduchu. 

5.2.3.2.2. A b s o r p č n í  f á z e Po přidání  0,2 ml  séra anti­A, anti­B a anti­H (titr 1:128) se obsah zkumavek na  okamžik zamíchá, aby došlo ke spojení. Reakce probíhá přes noc při teplotě  4°C.   Před  následující  eluční   fází  jsou  vzorky   promyty  10   ml  P.B.S.   („phosphate   buffered  saline“,  podobný  fyziologickému  roztoku)   při   teplotě  4°C  (většinou  6­7   krát  v  10  minutových  intervalech).   Promytím   se   odstraní   nadbytek   protilátek.   Také   se   vymyjí   ty,   které   se  nenavázaly na substrát. Následuje sedimentace, která je urychlena centrifugací za studena po  libovolný čas. Ten závisí na velikosti částic ve vzorku.  46

Ke kontrolnímu testu bylo použito  0,3 ml  1%  P.B.S. Ten se následně přidá k substrátu na  dobu  15   minut  při   teplotě  4°C.   Roztok   je   následně   odebrán   a   přenesen   k   suspenzi  souhlasných erytrocytů. Dokonalé promytí zajistí nepřítomnost shlukování. Případný projev  aglutinace znamená, že  neproběhl  úplný odsun nenavázaných protilátek.  Potom  je  nutné  opakovat další promytí. Autoři provedli tuto kontrolu, aby se vyhnuli falešné pozitivní reakci.  Kontrola je nezbytná pro správnou interpretaci výsledků.  5.2.3.2.3. E l u č n í  f á z e Eluční fáze probíhá ve vodní lázni při teplotě 56°C s 0,3 ml roztoku 1% P.B.S. po  dobu 15 minut, přičemž je míchána každých 5 minut. Výsledky eluce byly testovány s 0,08  ml roztoku souhlasných erytrocytů v P.B.S., sjednoceny v přístroji na propustnost stupeň 2.  Po 1 hodině při pokojové teplotě byly vzorky centrifugovány při 1000 otáčkách za minutu. 

5.2.3.2.4. A g l u t i n a c e Výsledek  aglutinace  přečteme   s   použitím   počítače.   Ten   vyhodnotí   přítomnost   či  nepřítomnost aglutinace i její intenzitu. Diagnóza skupiny 0 byla provedena za použití anti­H  séra připraveného z  Ulex europaeus  přímo v laboratoři. Lidská anti­A a anti­B séra byla  připravena komerčním Biotestem pro určení krevních skupin A, B a AB. 5.2.3.3. D v o u r o z m ě r n ý  a b s o r p č n ě   i n h i b i č n í  t e s t  ( 2 D A I ) Modifikací výše uvedeného AI testu je dvourozměrný absorpčně­inhibiční test („two­ dimensional absorption inhibition“) označovaný jako 2DAI test. Lee a kol. vypracovali tuto  metodiku testování a publikovali ji v roce 1988. Lee a kol. (1991) uvádí, že tato varianta testu  je citlivější a tedy užitečnější při vyšetřování materiálu chudého na ABH antigeny. Provádí  se na mikrotitračních destičkách a začíná se se séry titru 32, 8 a 2. Pokud není výsledek  průkazný po první titraci, provádíme druhou titraci a následuje zjišťování antigenu. Tento test má výhodu také v tom, že je použit více než 1 kontrolní vzorek (tedy  vzorek, kde nedošlo k inhibici) pro každý z testovaných antigenů. Kontrolní vzorky zajistily  sliny sekretorů skupiny A, B a 0, dále sliny nonsekretorů a také solný roztok.  47

Každému   vzorku   (i   kontrolnímu)   je   uděleno   titrační   hodnocení   („titration   score“).   U  kontrolních vzorků je hodnocení zprůměrováno. Pokud je pro náš vzorek sníženo hodnocení  o 25 a více, uvádí se přítomnost antigenu. Pro kosterní materiál autor doporučuje použít  tento test v kombinaci s absorpčně eluční metodou.   5.2.3.4. M e t o d a  d v o u k r u h o v é h o  s y s t é m u  v e  d v o u  f á z í c h Tesař a Klír (1975) ve svém výzkumu kosterních pozůstatků Přemyslovců použili  kombinaci metod vysycovací a absorpčně eluční (vysycování se provádí dvoufázově). Tuto  metodiku dvoukruhového systému (ve dvou fázích) vypracovali sami autoři. Následně ji s  úspěchem použili i Vlček a Tesař (1979) taktéž při výzkumu Přemyslovců. První fáze se  neliší od běžných postupů AI metody. Kostní drť je inkubována se séry anti­A, anti­B v  chladu. Pak se obsahy zkumavek centrifugují a odsaje se extrakt. Ten se následně titruje do  řady zkumavek a testuje se s příslušnými červenými krvinkami. Druhá fáze kopíruje fázi  první s použitím původních vzorků a čerstvých antisér. Následuje vyšetření druhého okruhu,  což je vlastně eluční fáze. Tytéž vzorky jsou opakovaně promyty fyziologickým roztokem.  Následuje   eluce  navázaných  antisér  ve  vodní  lázni.  Odebrané  eluáty  v  kladném  případě  shlukují příslušné erytrocyty. Výhodné je u této metody začlenění druhého okruhu, tedy  kontrolní testování s použitím téhož materiálu. Dvě fáze zabezpečí dokonalé vysycení, dále  je tento postup také vhodný k odlišení nespecifických reakcí.  5.2.3.5. M e t o d a  f l u o r e s c e n č n í h o  z n a č e n í  a n t i g e n ů  ( „ F l u o r e s z e n z – A n t i k ö r p e  r – M e t h o d e “ ) V roce 1964 publikovali   Lengyel s   Nemeskérim  metodu  fluorescenčního značení  uplatněnou na čerstvém kosterním materiálu. Jak bylo potvrzeno, slouží taktéž k potvrzení  skupinových vlastností u fosilních kostí. Tento postup byl původně vypracován Coonsem a  jeho spolupracovníky v roce 1941 a 1942. Metodika byla prvotně zpracována výlučně pro  měkké tkáně. Je založena na základním principu reakce antigenu a protilátky (právě ta je  značena   fluorochromem).   Vše   závisí   opět   na   sérologicky   aktivních   látkách   v   kostech,  označované jako protein­polysacharidový komplex. 

48

Z kosterního materiálu (v tomto případě obratel) se vytvoří 0,5 cm řez a následně se fixuje ve  formalinu.   Tím   se   sníží   riziko   narušení   protein­polysacharidového   komplexu  při  histologickém zpracování. K odvápnění kostí se užívá EDTA. Fosilní kosti jsou odvápněny  po 72 hodinách, kosti čerstvé po 240 hodinách. Původní struktura v kostech však zůstane  zachována. Jak uvádí Denz (1949), zda je materiál plně odvápněný se přesvědčíme pokusem  s Naphthochrome Green B (in Lengyel, Nemeskéri 1964).  Zhotoví   se   zmrzlý  řez   preparátu.  Ten   je   následně  inkubován  s   fluorescenční  látkou  navázané na anti­A a anti­B sérum. Jak uvádí Riggs a kol. (1958), nejvhodnější je pro tento  účel  Fluorescenční   Iso­Thyozyanát,   protože   odpovídá   nejvíce   svým   fyziko­chemickým  vlastnostem výzkumným požadavkům. Má stabilní chemické vazby a je dobře rozpustný ve  vodě. Také se lehce váže s bílkovinami antiséra (in Lengyel, Nemeskéri 1964). V poslední  době se často využívá místo antisér A a B lidský anti­gamma­globulin, který poskytuje lepší  možnosti kontroly. Preparáty jsou pozorovány pod UV světlem.  Jako   pozitivní   výsledek   je   označen  přesně   ohraničený  zelený  fluorescenční   jev   ve  vyprázdněných   prostorách   kostních   buněk.   Negativní   reakce   se   vyznačuje   rozptýlenou  bledou špinavě hnědou fluorescencí. Pokud se negativní výsledek prokáže u A i B antiséra,  předpokládáme skupinu 0. Jak dodávají autoři, tato metoda má úspěšnost 90,48%, což je asi  o 10% více než původní sérologická metoda Boyda a Candely. Oproti této metodě lze také  výsledek jednoduše přečíst pomocí mikroskopu.

5.2.4. N a r u š e n í  s t á l o s t i  k r e v n í c h  v l a s t n o s t í Antigenní vlastnosti systému AB0 v organismu jsou poměrně dosti stabilní. Důkazem  je to, že lze určit krevní skupinu i ze vzorků velmi starých (Dobisíková 1999). Při sérologické  analýze však musíme být obezřetní na mnohé vlivy z okolí, které nám mohou „vstoupit do  cesty“   a   přímo   tak  ovlivnit   skupinovou  stabilitu  a   charakter  vzorku.   Nežádoucími   vlivy  mohou být různé chemické prvky a sloučeniny, které znemožňují projev antigenů. Dále jsou  to   bakterie   a   mikroorganismy   v   okolní   půdě   přítomné   v   blízkosti   uložených   kostí.   Ty  prokazatelně mění typy krevních skupin anebo samy vlastní příslušné antigeny, které lze  omylem testovat. Různé antigenní struktury nenesou pouze bakterie, ale také některé rostliny  a živočichové. 

49

Kellerman   (1971)   dodává,   že   při   interpretaci   výsledků   nesmíme   opomenout  teoretickou skupinu nonsekretorů. Další příčiny negativního výsledku mohou být takové, že  kosterní materiál už vůbec nemusí obsahovat aktivní krevní substance. Nejpravděpodobněji  je to způsobeno zničením, dekompozicí anebo vymytím těchto příslušných látek.  Dále kromě ztráty aktivity můžeme při výzkumu narazit i na mnohé nespecifické  reakce,   které   nesouvisejí   přímo   se   skupinovými   vlastnostmi   krve.   Abychom   předešli  možným problémům, autoři těchto prací doporučují odebírat půdu z okolí nálezů, provádět  stěry   z   kostí   a   posléze   kultivovat   tyto   vzorky.   Nakonec   je   nutné   podrobit   případné  kontaminující organismy stejným aglutinačním testům jako výchozí materiál (Dobisíková  1999).                                    5.2.4.1. K o n t a m i n a c e  m i k r o o r g a n i s m y

Je   zcela  zřejmé,  že   aktivita   mikroorganismů   ovlivňuje   antigeny   systému   AB0   u  biologického   materiálu.   Tento   poznatek  byl   zjištěn   na   základě   šetření   mnoha   různých  případů  z   oblasti   medicíny   a   forenzních   věd.  Byl   také  popsán  v   souvislosti   s   lidskými  tkáněmi a kostmi v početných antropologických pracích (Lee a kol. 1991).   Mikroorganismy   mohou   ovlivnit   skupinovou   vlastnost   vzorku   dvěma   možnými  způsoby. Jednak některé z nich nesou antigeny, které jsou podobné antigenům A, B a H  (anebo také jejich kombinace). Ty jsou pak nesprávně určovány místo antigenů přítomných v  kostech.   Další   způsob   zkreslení  výsledků   je   ten,   kdy   jiné   typy   mikroorganismů   nesou  enzymy,  které  dokáží hydrolyzovat  koncový  sacharid a  změnit  tak konkrétní  skupinovou  vlastnost. Právě koncový sacharid předurčuje typ krevních skupin (Lee a kol. 1991). Thieme  a Otten (1957) uvádějí nejčastější typ přeměny skupin způsobené bakteriemi. Je to změna  skupinové   vlastnosti   A   (B)   na   O.     Toto   způsobují   enzymy  galaktosidáza  a  N­acetyl­ glukosaminidáza (Lee a kol. 1991). V dalším případě se také často stává, že skupina A (opět  platí   i   pro   B)   úplně   ztratí   svojí   specifickou   aktivitu   a   chová   se   netečně   k   dodaným  protilátkám (Kellerman 1971). Nepříznivými účinky mikroorganismů se zabývají ve své práci Strejc s Dobisíkovou  (1989). Předkládají zde vhodné postupy práce na konkrétních případech z forenzní praxe. Své  poznatky  z   oboru   sérologie   uplatňují   také   při   šetření   prehistorických   a   antropologicko­ historických nálezů. 

50

U jedince krevní skupiny 0 při skupinové analýze prováděné z žebra docházelo při přidání  známých   krvinek   B   k   aglutinaci.   Byly   tedy   odebrány   vzorky   okolní   půdy   a   uměle  vypěstovány kultury na krevním  agaru i Endově půdě. Vyrostlé mikroorganismy byly poté  podrobeny   stejnému   absorpčně   elučnímu   testu   a   následně   byla   prokázána   aglutinace   s  dodanými krvinkami skupiny B. V dalším případě testy provedené z různých částí těla téhož  jedince   vykazovaly   rozdílné   výsledky.   Tato   situace   vždy   napovídá   přítomnosti  mikroorganismů.  Tkáně  a   kost   shlukovaly   krvinky  A   i   B,   vypěstované   mikroorganismy  nalezené v bezprostřední blízkosti taktéž. Vlasy a zuby tohoto jedince vykazovaly krevní  skupinu 0. Závěr byl tedy s největší pravděpodobností skupina 0. Z práce tedy vyplývá, že je  nutné odebírat vzorky ze všech dostupných tkání a porovnat je mezi sebou. Důležité je také  shromažďovat materiál z okolí pozůstatků a kultivovat ho pro další vyšetření za použití stejné  metody.   Mnoho  bakterií   je   již   popsáno  a   přesně  se   ví,   které  změny   zapříčiňují.  Je   ale  potřebné nejen vyšetřit typy bakterií v okolí, ale také jejich antigenní vlastnosti.

                      Obr. 10  Kolonie v R fázi ­ Bacillus cereus na MPKA (masopeptonový krevní agar).                                   Zdroj: fvl.vfu.cz/sekce_ustavy/mikrobiologie/obrazova_priloha/mikrob (10).

  Na základě Kellermana (1971), bakterie a rostliny nejčastěji vlastní aktivní materiál  antigenu H. Výjimku tvoří například Escherichia coli, u které je přítomen antigen B (viz Obr.  11). Autor se potýkal ve své práci právě s problémem vysokého procentuálního zastoupení  skupiny B u testovaných kosterních pozůstatků. Avšak testy ukázaly na nepřítomnost bakterií  v  okolní půdě. V těchto případech je tedy těžké rozhodnout, zda vzorky jsou ovlivněny  vnějším prostředím či nikoliv. Okolní půda by se tedy měla podrobit dalším náročnějším  testům. 

51

 

           Obr. 11  Růst Escherichia coli na Endově agaru ­ laktóza pozitivní kultura s charakteristickým                           kovovým leskem. Zdroj: fvl.vfu.cz/sekce_ustavy/mikrobiologie/obrazova_priloha/mikrob                        

Na základě Iseki a kol. (1952) a Okady a kol. (1953), některé bakterie náležící do  skupiny  Shigella,  Salmonella  (viz Obr. 12) a  Proteus  taktéž vykazují vlastnosti krevních  skupin systému AB0 (in Kabat 1956). Tyto bakterie se řadí  do čeledi enterobakterií a pro  člověka jsou patogenní (7).

                                                                                           Obr. 12  Salmonella typhimurium v elektronovém mikroskopu.                                                                Zdroj: www.vectorlabs.com/Lectins/LDBA.html (8). 

Dobisíková   (1999)   uvádí   přehled   mikroorganismů   a   jejich   enzymů,  které   přímo  ovlivňují krevní vlastnosti biologického materiálu. Předkládá seznam uveřejněný Lengyelem,  který byl publikován již v roce 1975. Na základě textu jsem vytvořila přehlednou tabulku (viz  Tab. 12) mikroorganismů, doplněnou údaji od Shin­ichi­Kubo (1989) (taktéž  zmínila v textu  Dobisíková) a ostatních autorů.

52

Činitel kontaminace

Změna skupinové  vlastnosti

Odpovědný enzym

Autor

Bacillus cereus

B  0

a­D galaktosidáza

Lengyel

a­L fukopyranozidáza 

Lengyel

B  rozkládá

a­D galaktosidáza

Lengyel

A  rozkládá  selektivně

N­deacetyláza

Bacillus fulminans Clostridium  Maebashi

0  ∅

Clostridium tertium

N­acetyl­ galaktominidáza  

A  0

Lengyel

Clostridium Welshii

rozrušuje AB0  systém

Clostridium  perfringens

panaglutinace

např. neuroaminidáza

Lengyel

Lactobacilus bifidus

rozrušuje AB0  systém, redukce B

neznámý

Lengyel

Clostridium elegans

Lengyel

a­N­acetyl­D­ galaktozaminidáza

A  ∅

Penicillium simpl.  Aspergillus niger Pseudomonas

Trichomonas foetus

Kubo

a­D­galaktozidáza a­L­fukozidáza

B  ∅ A   ∅

* Lee a kol. B∅ A   ∅ B∅ 0∅

* * Watkins     (1953)

                 Tab. 12  Mikroorganismy a jejich enzymy měnící typy krevních skupin.       Zdroj: Dobisíková (1999). *Zdroj: Lee a kol. (1991).* * Zdroj: Kabat (1956).      Přepracováno z výchozího textu.

53

Enzym neuraminidáza uvedená v tabulce, uvolňuje kyselinu sialovou z membrány  krvinek. Tímto se uvolní latentní T­aglutinogeny na povrchu krvinek, které nejsou běžně  přístupné. Projevují se panaglutabilitou (Strejc, Dobisíková 1989). Panaglutabilita je vlastnost  červených krvinek shlukovat se (v přítomnosti všech běžných lidských sér) bez ohledu na  krevní   skupinu.   Tuto   vlastnost   (učinit   červené   krvinky   panaglutabilní)   mají   enzymy  produkované mnohými bakteriemi. Jako další příklad lze uvést organismus Vibrio cholerae a  Clostridium welschii (Kabat 1956). Podrobně uvádím i výsledky výzkumu Shin­ichi­Kubo (1989). Z Tab. 13 je patrné, že  příslušné mikroorganismy potlačují projev skupinových vlastností A a B, nemají však vliv na  aktivitu skupiny 0.

Sérum

krvinky

Clostridium elegans Penicillium simpl. 

Aspergillus  niger

kontrola

anti­A

anti­B

anti­H

A

­

­

+

B

­

­

++

A

­

­

+

B

­

­

+

0

­

­

++

A

­

­

+

B

­

­

+

0

­

­

++

A

+++

­

­

B

­

+++

­

0

­

­

+++

                                                                      Tab. 13  Výsledky pokusu Shin­ichi­Kubo (1989). Zdroj: Dobisíková (1999).                                                     Převzato v plném znění.

54

5.2.4.2. K o n t a m i n a c e  r o s t l i n n ý m i  a  ž i v o č i š n ý m i  z b y t k y Dalším   zdrojem   znečištění   je   tkzv.  „Forssmanova   antigenicita   skupiny   A“  („Forssman positive A­like antigenicity“) objevená v rostlinných a živočišných pozůstatcích  (Heglar   1972).   Dále   jsou   popsány   další   rostliny,   jejichž   semena   anebo   jiné   části   mají  schopnost aglutinovat erytrocyty. Bird (1952) uvádí, že rostlina Dolichos biflorus (viz Obr.  13) aglutinuje krvinky skupiny A1  (in Kabat 1956).   Jak uvádí internetový zdroj (8), tento  aglutinin je často využíván v sérologii k odlišení skupiny A1  od   A2  (s tou nereaguje tak  silně, asi 5000 krát slabší reakce).

                                                  Obr. 13  Dolichos biflorus v elektronickém mikoskopu.                                                                         Zdroj: www.vectorlabs.com/Lectins/LDBA.html (8).  

 

Dále   dle   Springera   (1955),   semena  Taxus   cuspidata  (tis   japonský)   potlačuje 

aglutinaci A – anti­A, B – anti­B, 0 ­ anti(H) (in Kabat 1956). V embryu semen jsou uloženy  rostlinné aglutininy (fytohemaglutininy neboli lektiny). Ti jsou povahy bílkovinné, konkrétně  se jedná o globuliny. Lektiny mají schopnost vázat specifické sacharidové zbytky nacházející  se na povrchu buněk. Nesou také volná vazebná místa a mezi sousedními buňkami vytvářejí  příčné vazby („cross­linkage“), dochází tedy k aglutinaci. Skupina rostlin patřících do čeledi  Febaceae mají charakteristické aglutininy a tudíž reagují jen s určitými krevními skupinami.  Například aglutininy A a aglutininy 0 jsou typické pro rostliny jako jsou Cytisus canariensis  (čilimník kanárský), C. ratisbonensis (čilimník řezenský), Genistella sagittalis (kručinečka   křídlatá), Laburnum alpinum (štědřenec horský), Tephrosia brevipes (kuželusk krátkonohý) a  Tetragónolobus purpureus. Pouze aglutininy A nese Phaseolus lunatus (fazol měsíční), Vicia  cracca (vikev ptačí) a již zmíněný Dolichos biflorus. Aglutininy B jsou přítomny v Coronilla  varia (čičorka pestrá) a Sophora japonica (jerlín japonský) (9). 

55

Oliver­Gonzales,  J.   (1944,   1953)   popisuje   také   přítomnost   krevních   skupin   A,   B   a   0  zjištěných  u zvířecích parazitů Ascaris lumbricoides (škrkavka dětská), Trichinella spiralis  (svalovec stočený) v larvách a u Taenia saginata (tasemnice) (in Kabat 1956). 

56

5.2.5.  V ý s l e d k y  a  d i s k u z e

První pokusy testování krevních skupin z kostní tkáně se objevily po roce 1935. Po  úspěchu metodiky vyvinuté pro měkké tkáně, přistoupil Candela k vypracování vhodných  metod i pro kosterní archeologický materiál (Ezra­Cohn a Cook 1961). Ačkoli sérologické  rozbory   kostí   nejsou  běžně   používané  v   postupech   lékařsko­soudních   laboratoří,  nynější  technika vypracovaná pro kostní tkáň je dosti podobná té, které se užívá pro staré krevní  skvrny. Kostní vzorky se projevují citlivěji než svalová tkáň, podrobněji tyto srovnávací testy  mezi kostí a svaly publikoval Candela v roce 1939 (Heglar 1972). Jedním z mnoha problémů je výběr kosterního materiálu. Borgognini Tarli a kol.  (1979) testovali přítomnost antigenů  u starověkého kosterního materiálu z Peru. K tomuto  výzkumu použili kosti lebky z oblasti okcipitální a mastoideální. Extrakty z těchto kostí  nezreagovaly ani u opakovaného kontrolního testu. To je nejspíše zapříčiněno výběrem typu  kosti   a   také  celkově   malým   množstvím   kostní   drtě   (0,7g  místo   2­3g,  což   je   průměrné  množství, které se používá v postupu u metody AI). Po provedení zkoušky s epifýzami  dlouhých kostí byly již výsledky hodnotitelné. Martin, Saller (1960) a Kabat (1956), dále  také mnozí jiní autoři se shodují v tom, že v nervových tkáních a cerebrospinálním moku je  velmi malé množství zjistitelných antigenů anebo zde dokonce vůbec žádné antigeny nejsou.  Již Hirszfeld rozdělil orgány do 3 skupin dle nalezených antigenů. Nervová tkáň spolu se  zubovinou, chrupem, oční čočkou a oční bulvou nejsou vůbec nositeli antigenů. Někteří  autoři do této skupiny přiřazují ještě moč a také slzy (Martin, Saller 1960). Při výzkumech  jsou obecně upřednostňovány epifýzy femuru a humeru, dále žebra a sternum.  Pro zdárné vyhodnocení antigenů je lepší se vyvarovat užití kompaktní složky kosti.  Nejvýhodnější   postup   je   odebírat  vzorky   ze   spongiózní   části   kosti,   tedy   ty,   které   byly  dokonale kryty kompaktou. Kompakta je vystavena přímému vlivu okolního prostředí, což  může narušit její chemickou stabilitu. Zásadním se stal výzkum Ezra­Cohna a Cooka (1961)  publikovaný v článku „Blood­typing compact human bone tissue“. Autoři vyšetřovali vzorky  kompaktní kosti, které byly uloženy v půdě po dobu asi 1000 let. Pro porovnání použili také  čerstvé kompakty kostí z pitvy. Testovali pouze AB0 antigeny. Vzorky kostí byly navlhčeny  solným roztokem a usušeny, poté připraveny k reakci se séry A a B dle běžného postupu.  Čerstvé kosti známých skupin neprokázaly žádnou antigenní reakci. 

57

Zatímco kosti z pohřebiště (celkově testováno v počtu 21) ukazovaly na následující skupiny:  skupina 0 (9 vzorků), skupina A (4 vzorky), skupina B (5 vzorků) a skupina AB (3 vzorky).  Autoři míní, že tyto získané krevní skupiny nejsou shodné s těmi, které by kosti vykazovaly  bezprostředně po smrti jedince. Podpořením tohoto závěru je jednak velký počet vzorků  vykazující skupinu B, avšak podle distribuční mapy světa je to u obyvatel severní Ameriky  dosti vzácné. Kosti byly také nalezeny na takových lokalitách, kde musely sehrát velkou roli  změny klimatu a růst bakterií. Frekvence zkoumaných vzorků se také ani neshodovaly s  výsledky dřívějších výzkumů provedených v této oblasti. K testování kostní kompakty se  také vyslovil Lee a kol. (1989), kdy neshledal žádné ovlivnění výsledků a ani rozdíly při  vyšetřování spongiózy a kompakty u vzorků. Vysvětlením by mohlo býti to, že použil kosti  zhruba  půl   roku   staré.  U   takto   zachovalých   kostí   ještě   nedochází  tolik   k   degradacím   a  změnám struktury zapříčiněné kontaktem s okolní půdou a bakteriemi. Jsou   objeveny   zajímavé   souvislosti   s   chemickou   stavbou   kosti   a   stanovením  přítomnosti ABH antigenů. Lengyel s Nemeskérim upozornili na důležitost obsahu dusíku a  protein­polysacharidového komplexu v kostech. Pokud jsou hodnoty tohoto komplexu nižší  než 0,02 mg/100g, určení krevní skupiny je nemožné. Pokud je toto množství v nadbytku, lze  předpokládat některý z antigenů A nebo B či oba. V případě negativních výsledků se jedná  buď o jedince skupiny 0 (pokud nepoužijeme anti­H sérum pro přímý průkaz skupiny 0),  non­sekretora (ještě není úplně vyjasněno, viz dále) anebo o technickou chybu. Pro výzkum  je zásadní studovat chemicko­histologické změny probíhající v kostní tkáni a změnu jejího  chemické složení v čase. Tyto proměny mají povahu úprav ve skladbě cukrů, které vyúsťují v  odlišné specifické vlastnosti. To pak může v závěru ukazovat na jiný typ krevní skupiny  (Heglar 1972).  Požadavky na materiál je možné shrnout do následujících bodů:  

používat spongiózu kosti, která byla kryta kompaktou; nejlépe epifýzy dlouhých kostí a  lumbální obratle, kostní prášek by měl být co nejjemnější



vybírat jen ty kosti, které nebyly konzervovány nevhodnými chemickými prostředky



testovat materiál, který nebyl vystaven rozsáhlým vymýváním způsobeným spodní vodou  a filtrací vody vrstvami půdy



testovat materiál, který viditelně nebyl vystaven extrémním podmínkám 



obsah dusíku v kosti by neměl klesnout pod hodnotu 0,02 mg/100g materiálu. (Kellerman 1971, Vlček a Tesař 1979, Heglar 1972, Kout a kol. 1965) 58

Před použitím vlastní  sérologické  metody  následuje  další  příprava kostní  tkáně  –  čištění, označovaná v literatuře jako fáze purifikace. O této fázi píší někteří autoři pozitivně,  ne vždy má prospěšný účinek. Podrobný popis purifikační fáze uveřejnil Paoli v článku  „Further biochemical and immunological investigations on Early Egyptian remains (1972)“.  Dle tohoto postupu se řídil i Borgognini Tarli a kol. (1979) při šetření starověkého materiálu  z Peru. Ve výsledcích bylo zaznamenáno mnoho nespecifických reakcí a také přednostní  absorpce séra anti­A. Purifikační fáze byla přepracována s použitím čistého (100%) fenolu.  Nedocházelo již v takové míře k přednostní absorpci. S tímto názorem se však rozchází Paoli  (1986). U metody AE popisuje slabší reakci antigenů, pokud je užit fenol jako purifikační  činidlo (dle návodu Tarliho a kol. 1979). Paoli a kol. (1992) shledává purifikační fázi jako  příčinu snížení citlivosti metody AI. Poukazuje na to, že takovéto zacházení může způsobit  ztrátu reagujících složek u kosterního materiálu. Sérologické   metody  se   vždy  zakládají   na   vzájemné  reakci  antigenu   a   protilátky.  Dodávanými protilátkami jsou antiséra A, B a H. Běžně se používají lidská polyklonální  antiséra A a B. Anti­H sérum je často původu rostlinného, případně zvířecího. Při zkoušce je  potřebné vhodně naředit antiséra. Pokud jsou příliš zředěná a vzorek má silné adsorpční  schopnosti, antigeny v kosti vysytí veškeré aglutininy séra. Naproti tomu v druhém případě,  pokud jsou séra velmi silná anebo vzorek příliš chudý na antigeny, nastane nedostatečná  adsorpce ze strany kosti a nastane aglutinace v celé sérii. Přičemž nejvhodnější zředění je  odlišné pro rozdílné skupiny vzorků. Rozsah adsorpce závisí také na délce pobytu v ledničce  (Candela 1936). Dříve bylo anti­H sérum nedostupné a tak skupina 0 nemohla být pozitivně  stanovovaná (Lee 1991). Pokud netestujeme s anti­H sérem můžeme chybně předpokládat  skupinu 0 (dle domněnky, když nevyjde testované A ani B, jedná se o skupinu 0). Daný  vzorek vlivem okolních faktorů už však nemusí vykazovat žádnou sérologickou aktivitu.  Anti­H sérum přednostně aglutinuje krvinky skupiny 0, ale v některých případech i krvinky  A2. To může způsobovat problémy, pokud testovaný jedinec má slabé antigeny A2 a A2B.  Tento jedinec může být nesprávně stanoven jako skupina 0, což samozřejmě zkreslí frekvenci  skupin v konečném výsledku (Masnicová, Hanulík 1999). K   sérologickému  vyšetření   kostní   tkáně   jsou   nejvíce  užívány   metody   absorpčně  inhibiční a absorpčně eluční. Těchto metod se užívá i ve vzájemné kombinaci. Není však  jednoduché   stanovit,   který   z   postupů   je   účinnější   a   vhodnější.   To   záleží   na   mnoha  okolnostech, nejvíce snad na typu a zachovalosti materiálu.  59

Metoda AI je původnější z těchto metod, byla vypracována pro obecnou praxi speciálně pro  suché staré krevní vzorky. Výsledky u archeologického materiálu nebyly příliš spolehlivé.  Později však autoři tuto metodu upravili a vzorky se tak staly více hodnotitelné. Pro detekci  antigenů   byla   o   mnoho  později   publikována   metoda   AE   a   stala   se   široce  rozšířenou  v  praktických odvětvích pro určování skupin z krevních skvrn. Od doby svého zavedení byla  upřednostňována pro použití i u kostní tkáně (Lee a kol. 1991). Na základě srovnání prací  více autorů, velká procenta úspěšnosti stanovení krevních skupin mají metody kombinované.  Dále   je   také   spolehlivé   použít   metodu   AI   a   AE   (odděleně)   a   následně   je   vzájemně  vyhodnotit. Jednoznačných   výsledků   je   dosaženo   užitím   kombinované   metodiky   při   rozboru  historických lidských pozůstatků. Jedná se o již zmíněnou metodu vysycovací v kombinaci s  absorpčně   eluční   metodou.   Tesař   s   Klírem   (1975)   zkoumali   pravděpodobné   pozůstatky  kněžny Ludmily a knížete Václava. Z tibie a radiu u Ludmily prokázali skupinu B. Později se  však ukázalo, že tyto kosti nepatřily Ludmile (Vlček, Tesař 1979). Až později se našla její  lebka  vykazující  skupinu   A.   U  většího  počtu   kostí     knížete   Václava   byla  taktéž  určena  skupina B, kromě levého femuru, který tuto skupinu jednoznačně nevykazoval. Podrobným  rozborem a srovnáním obou tibií antropologem, bylo prokázáno, že levá tibie patří zcela jistě  jinému jedinci. Studium dalších osob z rodu Přemyslovců dále pokračovalo. Vlček s Tesařem  (1979)   sestavili   rodokmen   vládnoucího   rodu   Přemyslovců   na   podkladě   sérologického   a  morfologického ohledání kostí a také vyloučili nepatřičné kosti nalezené v hrobech. Velkou  zásluhu  mají   dostupné  historické  prameny,  dle  kterých   je  možno  identifikovat  některé  z  jedinců   a   právě   tak   potvrdit   jejich   vzájemnou   příbuznost   sestavením   rodokmene.  Tato  kombinovaná metoda je založena na dvou základních sérologických metodách, které mohou  být bez větších problémů užity běžně v laboratořích. Autoři uvádějí potřebu 0,5 g částečky  kosti, což je tedy dosti velké množství. Emanuel Vlček se věnoval identifikaci historických  osobností   dlouhá   léta.   Mezi  posledními   sérologicky   zkoumanými   pozůstatky  byla   lebka  královny Judity Durynské (druhá manželka krále Vladislava II, 2. pol. 12. století, viz Obr.  14).   Zde   prokázal   skupinu   B   absorpčně   eluční   metodou.   Sérologické   výsledky  osob   z  Juditiny rodiny nejsou úplné, ale vcelku souhlasí s předpokládaným rodokmenem (Vlček  2002).

60

  

   Obr. 14  Rentgenogramy lebky královny Judity v boční a předozadní                                                         projekci. Patrná sekundární postmortální deformace, snímky                                                 Radiologická  klinika 3. LF UK v Praze (M. Jantač).                      Zdroj: http://www.vesmir.cz/clanek.php3?CID=2391 (13).           Vysoké úspěšnosti bylo dosaženo i u metody fluorescenčního značení antigenů. Autoři  výzkumu,   Lengyel   a   Nemeskéri,   pracovali   s   recentními   kostmi   z   pitevny   (o   známých  krevních skupinách) a  s těmi  srovnávali  své dosažené výsledky.  Metoda byla úspěšná  v  90,48% stanovení skupin, což je asi o 10% lepší výsledek než původní metoda založená na  absorpci dle Boyda a Candely (ti provedli tentýž pokus s recentními vzorky, výsledky byly  kladné v 80,95%). Jak se potvrdilo, tento postup lze užít i u archeologického materiálu. K  tomu byla vybrána populace z pozdního románského období. Podařilo se stanovit krevní  skupiny   u   všech   vzorků,   ty   také   odpovídaly   očekávaným   četnostem.   U   populace  „Tiszanána“  byla   na   sérologickém   a   morfologickém   podkladě   prokázána   i   vzájemná  příbuznost jedinců. Z 32 osob bylo 18 jedinců zahrnuto do vzájemných rodinných svazků  (Lengyel, Nemeskéri 1964). Naproti tomu Berg a kol. (1983) dosáhl nepatrných úspěchů  opakováním metody dle Lengyela a Nemeskériho (in Lee a kol. 1991).  Na   podobném   principu   úspěšně   funguje   i   stanovení   krevních   skupin   pomocí  Ouchterlonytestu   a   immunoforézního   testování.   Lze   ho   využít   i   pro   materiál   z  archeologických zdrojů, jak to provedl Kellerman (1971) u vzorků ze hřbitova z Oppenheimu  (15 ­17. století). Při testování 169 femurů, u 149 prokázal pozitivní reakci, zbylých 20 vzorků  neprokázalo reakci žádnou. Vzorky vykazovaly vysoké procento skupiny B v porovnání s  recentními údaji krevních skupin z blízkého okolí.

61

Postup byl proto zopakován, ale vyšel však stejný výsledek. To tedy neukazuje na technickou  chybu, ani na bakteriální znečištění. Může jít o náhodu anebo o odlišnou populaci. 11,8%  vzorků   se   nepodařilo   určit,   Kellerman   to   přisuzuje   skupině   nonsekretorů   (u   evropské  populace 10­20%). Tyto imunohistochemické postupy jsou úspěšně prováděny u stanovování antigenů  ABH a Levis u čerstvých i rozložených tkání, spálených tkání a tělních tekutin zvláště pro  forenzní účely (Lee a kol. 1991). Jsou sice relativně spolehlivé a jeví se jako úspěšné, zato  průběh samotného testování je náročný na čas i materiál (chemický i biologický). Například  požadavek na množství kosti je dle Kellermana (1971)  4­5 g.  Metoda   fluorescenčního  značení  antigenů   je   celkově   citlivá   na   detekci  antigenů.  Další výhodou je také to, že výsledek lze jednoduše přečíst s pomocí mikroskopu. Na druhou  stranu,  není   zde   možnost   opakovaného  kontrolního   testování,  dále   se   také   nedaří  snížit  procento nespecifických reakcí (což činí jasně potíže u všech sérologických metod).  Pokud hodnotíme „klasické“ sérologické metody, je možno říci, že dvourozměrný  absorpčně inhibiční test (2DAI) je citlivější než metoda základní (AI). Tato metoda (2DAI) je  také vhodná pro vzorky lidských tekutin a tkání s nízkým obsahem antigenů ABH (Lee a kol.  1991). Lee provedl s kolegy obsáhlou práci, která měla být celkovým porovnáním 3 postupů  (AE, 2DAI a kombinace těchto dvou odděleně proběhlých metod). Další srovnávání se týkalo  typu prostředí, jakým byly kosti vystaveny. Čerstvé kosti byly rozděleny na 10 částí (1. část  kontrolní,  bez  reakce),   ostatní   byly  ponechány1­9  měsíců   v   suchém/vlhkém  prostředí  za  teplot  37°C/56°C,  dále v   suché/vlhké  půdě/půdě  v  otevřeném  prostoru.  Tab.  14  ukazuje  výsledky pouze kontrolních vzorků (tedy těch, které nebyly vystavěny žádnému extrémnímu  vlivu).   AE

2D AI

Kombinace

N (%)

N (%)

N (%)

Správné

81 (92)

65 (73,8)

61 (69,3)

Nesprávné

7 (8)

13 (14,8)

0

Nehodnotitelný  výsledek

0

10 (11,4)

27 (30,7)

V ý s l e d k y

   Tab 14  Shrnutí testování krevních skupin u kontrolních vzorků. Zdroj: Lee (1991).                                              Převzato v plném znění. 62

Je až překvapivé, že v řádku správných výsledků jsou tak nízké hodnoty (a to jen u  vzorků   ihned testovaných kostí!), zvláště pak u metody kombinace (pouze 69%, to tedy  ukazuje, jak moc se AE a 2DAI rozcházejí). Jak je tedy patrno, velké množství nesprávných  výsledků je u obou metod, přičemž úspěšnější byla metoda AE (92%).  Nejvyšší procento nesprávných výsledků bylo u metody AE i 2DAI v závislosti na  podmínkách prostředí. To bylo jednak u vzorků ponechaných „ve vlhké půdě při pokojové  teplotě“ (nesprávných přes 50% AE, cca 35% 2DAI), následované vzorky „venku uložené v  půdě“ (cca 38% AE, 30% 2DAI). Na podkladě grafů zohledňující složku prostředí i času si  lze  všimnout,  že celkové  procento  nesprávných i  nesouhlasných  výsledků  více  vykazuje  postup 2DAI než AE. U kombinace vyplývá více nesouhlasných výsledků u vzorků závislých  na  prostředí  než  na  čase.  Všeobecně,  vzorky,   které  byly vystavěny  podmínkám   vlhkého  prostředí dosahují méně průkazných výsledků než vzorky v suché půdě. Nebyly nalezeny  žádné korelace mezi stavem vylučovatelství a souhlasnými výsledky jak u metody AE a  2DAI.   Ostatní   autoři   publikovali   jisté   souvislosti   mezi   tímto   stavem   vylučovatelství   a  schopností detekovat ABH antigeny v kostním extraktu, zvláště pak u inhibiční metody. Při  srovnávání rozložení skupin systému AB0 v testované sérii a u správně testovaných vzorků  (v závislosti na prostředí) jsou u metody AE jen nepatrné odchylky u skupin. Zato zřetelná je  odchylka u metody 2DAI u skupiny 0. Ta je nejvýznamnější u vzorků ponechaných v 37°C,  56°C,   uložené  v   suché   i   vlhké   půdě   a   ve   venkovní   půdě.   Tyto   očividné   odchylky   se  samozřejmě   odrážejí   i   v   metodě  kombinace.  Data   naznačují,  že   odchylky   skupiny   0   se  objevují ve výdeji skupin A, B a AB ve zhruba stejném rozložení. Vzorky kostí vykazující  krevní skupiny A, B, AB mají větší odolnost vůči nepříznivým podmínkám prostředí. Je  důležité  provést   podrobnější   šetření   pro   další   možná   vysvětlení  takovýchto   pozorování.  Objasněním pro nesouhlasné a neopodstatnělé výsledky ABH testů je často aktivita mikrobů.  Ta se zvláště projevuje u vzorků dlouho uložených v krajních podmínkách prostředí.

63

Celkem

Celkem – nezahrnuty  vzorky z vlhké  půdy

N (%)

N (%)

Celkem – nezahrnuty  vzorky z vlhké  půdy a  venkovního  uložení N (%)

Správně

1003 (65.4)

924 (69,5)

827 (71,4)

Nesprávně

471 (30,7)

356 (26,8)

293 (25,3)

Nehodnotitelné

60 (3,9)

49 (3,7)

38 (3,3)

Správně

675 (44,0)

618 (46,5)

568 (49,1)

Nesprávně

402 (26,2)

308 (23,2)

257 (22,2)

Nehodnotitelné

457 (29,8)

403 (30,3)

333 (28,8)

Správně

490 (31,9)

464 (34,9)

439 (37,9)

Nesprávně

9 (0,6)

3 (0,2)

2 (0,2)

Nehodnotitelné

1035 (67,5)

862 (64,9)

717 (61,9)

M e t o d a

AE

2DAI

Kombinace

              Tab. 15  Výsledné hodnoty testování všech vzorků kostí s použitím tří odlišných metod.                                  Zdroj: Lee a kol. (1991). Převzato v plném znění. 

Z ucelené tabulky (Tab. 15), lze jasně vyčíst prvenství AE metody u testování vzorků  recentních   kostí   pod   vlivem   různého   prostředí   a   délky   uložení   materiálu.   Správně  vyšetřených   vzorků   bylo   tedy   65,4%,  zatímco   o   dost   nižší   jsou   výsledky  u   zbylých   2  postupů. Je patrný také procentuální růst správně identifikovaných vzorků v tabulce směrem  zleva doprava, kdy byly postupně vylučovány nejvíce zátěžové faktory.  Velmi podobný výzkum proběhl také pod vedením Leeho a kol. (1989). Taktéž byly  testovány kosti staré (6 měsíců a více) a recentní pomocí metod AE i 2DAI. Při tomto šetření  byla lépe vyhodnocena metoda 2DAI, kde u čerstvých kostí plně souhlasily krevní skupiny se  skupinami předem známými. Metoda AE nabyla přesná ani u recentních kostí, nesprávné  výsledky vždy ukazovaly na skupinu 0. Dále byl u starých kostí zjištěn velký počet špatně  stanovených skupin a také relativně mnoho nespecifických výsledků.  64

Obě metody byly posléze použity u kostí mumií získané ze sbírek muzea. 19 z 26 vzorků  prokázalo souhlasný výsledek (výsledek, který je u metody AE a zároveň i u metody 2DAI  stejný). Samozřejmě není jisté, jestli jsou správné, avšak potvrzením 2 oddělených metod  použitých souběžně se nám dostává velké naděje na úspěch. Autoři taktéž uvedli požadované  množství kosti 10­15 mg pro výzkum, což je velmi příznivá hodnota. Metoda AE byla již dříve zkoumána Paolim a kol. (1986), ostatně, z jeho podrobného  a kvalitně zpracovaného postupu vycházejí všichni další autoři. Jedním z důvodu, proč se  rozhodnout pro metodu AE, je potřeba jen malých vzorků kostí. Tato metoda je dle autorů  také rychlejší a jednodušší než klasická AI. Výzkum měl prokázat možnosti opakování testů  použitím   AE   metody.   Výsledky   byly   zkontrolovány   dvěma   souběžnými   rozdílnými  technikami AE a AI. Vzorky 90 jedinců  byly nalezeny v hřbitovním prostoru St. Laurens v  Aostě. Pocházely z různých časových období, jsou datované od 600 do 1600 n. l. (viz Tab.  16).  Bylo provedeno 108 testů technikou AI. V 15 případech byl zopakován test stejnou  metodou. Nesouhlasný výsledek nebyl nikdy pozorován a pozitivní diagnóza byla získána v  53,3% případů. AE umožnila zopakovat testování téměř v každém případě. Na 53 vzorcích  bylo provedeno 120 testů, které zajistily vždy souhlasný výsledek. Pozitivní diagnóza byla  získána v 29 případech (54,7%). Celkem bylo pozitivně určeno 67,8% vzorků, 30% výsledků  bylo negativních anebo nespecifických. Pouze 3,8% případů se neshodovalo při obou metod. 

Dusík celkově O b d o b í

Kladný  Záporný  výsledek výsledek

Celkově

Drť průměr  mg/%

Výtažek průměr mg/ml

„Paleokřeskťanské“ (600­700 n. l.)

7

12

19

1,72

0,40

Karolinské (800­1000 n. l.)

15

6

21

2,00

0,58

Románské (1000­1200 n. l.)

7

1

8

­ (°)

0,42

Pozdně renesanční  (1400­1600 n. l.)

29

9

38

3,83

0,71

Neurčeno

3

1

4

­ (°)

0,39

  Tab. 16  Rozložení výsledků v různých časových obdobích a obsah dusíku.  65

                   Zdroj: Paoli a kol. (1986). Převzato v plném znění. 

Pokud   porovnáme   negativní   výsledky   v   daných   obdobích,   je   zřejmé,   že   jejich  rozložení není  jednotné. Největší počet negativních zjištění je u populace „paleokřesťanské“  („Paleochristian“).  Mimo   jiné   byl   vypracován   i   rozbor  týkající   se   množství   dusíku   v   kostní   drti   a  extraktu.  Frekvence  pozitivních  a  negativních  výsledků  má  souvislost   právě  s   celkovým  množstvím   dusíku.   Ten   ukazuje   na   stav   zachovalosti   organické   látky   ve   zkoumaném  materiálu. Dle tabulky, „paleokřesťanská“ populace vykázala průměrný obsah dusíku 1,72  mg% v drti a 0,4 mg/ml ve výtažku kosti. U 12 negativních výsledků byl prokázán průměrný  obsah dusíku menší (1,21 mg%) než běžně u této populace. Stejně tak u populace pozdně  renesanční, u 11 vzorků se silnější aglutinací byl naměřen vyšší průměrný obsah dusíku (4,13  mg%>3,83  mg%   průměr   celé   populace).   Na   základě   tohoto   výzkumu   byla   stanovena  nejpříhodnější   hodnota   pro   obsah   dusíku,   a   to   od   2   do   3,5   mg%   (spočítán   průměr   u  pozitivních výsledků) (Paoli a kol. 1986).  Metodu AE dle postupu Paoliho a kol. (1986) použili při výzkumu archeologických  vzorků   také  Masnicová   a   Hanulík.   Zkoumali  50  vzorků   nalezených   při   archeologickém  výzkumu na lokalitě hradu Děvín z 10. ­ 13. století. Mezi testovanými jedinci byli děti, ženy i  muži. Výsledky ukazují na úspěšné testování dětských pozůstatků (72% testovaných jedinců  vykázalo   pozitivní   výsledek).   Testování   proběhlo   dvakrát,   souhlasných   a   současně  pozitivních výsledků bylo 64%, což je relativně vysoké procento. Ve výsledcích byl vysoký  podíl skupiny AB (43,75%). V porovnání s recentní populací se tyto hodnoty značně lišily  (AB   u   recentní   8,2%).   Musíme   však   zohlednit   velikosti   vzorku,   které   navzájem  porovnáváme. Vysoké procento skupiny AB může být důsledek nepříznivých vlivů a bakterií  (Masnicová, Hanulík 1999). Stručně ke starším výzkumům kosterního materiálu z pohledu užitých metod. Thieme  a Otten (1957) použili pro výzkum 40 vzorků čerstvých kostí známých skupin, které uložili  do kamenných nádob do písečné půdy po dobu 2 až 3 let. Pro zkoušku byl vybrán absorpčně  inhibiční   test.   Po   dané   době,   kosti   vykazovaly   53%   správných   výsledků.   V   roce   1977  publikoval   Mickle   a   kol.   výsledky  své   práce  z   Izraele.   Aglutinačně   inhibiční   testování  provedl na 68 vyšetřovaných kostech (z lokality Jeruzalém a En Gendi, 1600­2000 let př. n.  l.). Metoda čítala na 81% kladných výsledků, zbytek patřil nespecifickým reakcím. Půda byla  také podrobena stejnému testu, nebyla prokázaná žádná reakce. 

66

Stejnou metodou určoval krevní skupiny Paoli a Cecchi­Parenti (1978) u kostí ze starověkého  pohřebiště  Shahr­i   Sokhta   v   Iránu   (2900­2200   př.   K.).   Výsledkem   bylo   17   koster  neidentifikovaných, zbylých 48 vykazovalo shodné rozložení jednotlivých skupin s recentní  íránskou  populací.  Úspěšně   testovaných   vzorků   je   možno  odhadnout  na  73,85%.   O   rok  později Borgognini Tarli a kol. (1979) provedli rozbor starověkého materiálu z Peru taktéž  metodou   AI.   19   vzorků   bylo   šetřeno   metodou   dle   Paoliho   (1972),   u   68%   vycházela  nespecifická reakce. U počtu 41 vzorků, které byly vyšetřovány modifikovanou technikou  (fixace   100%   fenolem),  bylo   pouze   24%   výsledků   nejasných.   Veškeré   kladně   reagující  vzorky byly přiřazeny ke skupině 0, což odpovídá i dalším výzkumům z této oblasti. Autoři  se však potýkali s velkým množstvím nespecifických reakcí.  Další větší práce týkající se srovnávání metod, laboratoří a materiálu byla provedena  italskými badateli v Pise a zároveň jejich českými kolegy v Praze. Srovnávány byly metody  AI a AE na vzorcích kostí (viz Tab. 17) a vlasů. Významně více bylo kladných výsledků  získáno metodou AE než AI. Nejspíše je to způsobeno rozdílnou citlivostí těchto metod;  metoda AI se projevuje méně citlivě, což je pravděpodobně zapříčiněno purifikační fází. V  laboratoři   v   Praze  získali   větší   procento   kladných   výsledků  (Praha­AE­58,9%,  Pisa­AE­ 50,5%, jako nejvyšší výsledek ze tří opakování), to bylo ale způsobeno nesystematickým  zacházením  s   anti­H  sérem.   Vedle   kladných   a   záporných   reakcí  byla   také   pozorována  hemolýza erytrocytů, a to u AI metody u kostí (9,3%) a u AE metody u vlasů (14,8%). U  metody AI je to nejspíše způsobeno velkým množstvím použitého substrátu (10 krát více než  u AE). Celkově však bylo dosaženo menšího počtu pozitivních výsledků oproti pokusům  jiných vědců. To autoři připisují materiálu, který nebyl až tolik vhodný k paleosérologickým  studiím (pozůstatky z Egypta, Sayala z 6. až 11. století). Souhlasné výsledky obou metod  (AE, AI) u kostí v Pise byly v 49,5%, souhlasné výsledky AE v Pise a Praze jen 39,7%. Pozit.  Negat. Ne Ne   V ý s l e d k y souhlas. souhlas. souhlas. souhlas. (+AE) (+AI) Sayala           N AE/AI kosti           (%)

Nesouhlasné  fenotypyu  obou metod

Celkem

17

31

26

17

6

97

(17,5)

(32)

(26,8)

(17,5)

(6,2)

(100)

    Tab. 17  Výsledky absolutní a procentuální u metod AE a AI získané opakovaným testováním                           pozůstatků z oblasti Sayala v Egyptě (Nesouhlasný výsledek znamená fenotyp prokázaný u                       jedné metody a neprůkazný/žádný výsledek u metody druhé).                       Zdroj: Paoli a kol. (1992). Převzato v plném znění.

67

Výsledky nejsou na první pohled nikterak povzbudivé. Dané hodnoty jsou spíše více  ovlivněny   rozdílnými   metodami   než   vlastností   šetřených   vzorků.   Pozitivní   souhlasné  výsledky mohou být spojeny se vzorky, jež obsahují jasné množství zachovalých substancí.  Nezáleží pak už na metodě ani její citlivosti, kterákoli metoda by byla schopná tyto substance  odhalit. Stejně tak by to mohlo fungovat i u negativních souhlasných výsledků, nízký obsah  antigenů   nedovolí   jakéhokoli   metodě   je   detekovat.   V   řádku   nesouhlasných   výsledků   se  nejspíše právě odráží citlivost jednotlivých metod. Poslední položka nesouhlasných fenotypů  může být způsobena chybou laboratoře (Paoli a kol. 1992). Srovnáním metod AI a AE z pohledu náročnosti na materiál, AE metoda je z tohoto  hlediska   výhodnější,   protože   ke   zkoušce   postačí   nižší   množství   kostního   vzorku.   Dle  základního postupu Paoliho a kol. (1986) je třeba k užití 70­75 mg kosti. Naproti tomu u  metody AI, Paoli a kol. (1978) udává 2­3 g. Na druhou stranu, metoda AI je zase o něco  jednodušší v postupu, včetně snažšího zacházení se vzorky. Výsledky   metody   AE   jasně   vykazují   větší   úspěšnost,   pokud   je   výzkum   pojat  srovnáváním AE s AI anebo 2DAI. Toto tvrzení je podpořeno jednak výzkumem Leeho a  kol. (1991) u recentních kostí, tak i u archeologického materiálu (viz Paoli a kol. 1992, Lee a  kol. 1991, Paoli a kol. 1986). Relativně dobrých výsledků bylo také dosaženo metodou AE u  výzkumu Masnicové, Hanulíka (1999) a Paoliho a kol. (1986). AE je však náchylnější k  přednostní absorpci H antigenu, což bylo vypozorováno na starých skvrnách i na vzorcích  kostí. Porovnáním 2DAI a AI, se předpokládá, že 2DAI je citlivější z těchto dvou metod (Lee  a kol. 1991). Také podrobnějším studiem a srovnáním obou postupů je patrné, že 2DAI užívá  více kontrolních procesů, které lépe vyhodnotí přítomnost antigenu.  Zdá se však, že ani samotná metoda AI není až tolik neúspěšná. Dobrých výsledků  dosáhl   Thieme   a   Otten   (1957),   kosti   však   byly   uložené   v   půdě   jen   2­3   roky.   U  archeologického materiálu zaznamenal úspěch Mickle a kol. (1977), Paoli spolu s Cecchi­ Parenti (1978) a Borgognini (1979). Jediný mně dostupný zdroj, kde selhala metoda AE na  úkor 2DAI, je u práce Leeho (1989). Vyšetření ale probíhalo u recentních kostí nejvíce 6  měsíců starých. 

68

Dalo   by   se   říci,   že   metoda   AI   je   prospěšnější   spíše   v   praktických   odvětvích   u  čerstvých kostí a krevních skvrn, kde je zajištěno dostatečné množství antigenu a kde je  vynechán   vliv   okolí.   AE   metoda   prokazuje   částečně   dobré   výsledky   u   historického,  popřípadě staršího materiálu. Paoli (1986) uvádí, že absorpčně eluční postup je zdařilý u  kostní tkáně, stejně tak jako u skvrn a dokonce i zubů v lékařsko­soudním odvětví. V případě  narušených historických kostí by se mělo počítat s určitými nejistotami. Získání výsledků z rozborů však ještě nelze považovat za úplné vítězství. Zásadní je  jejich interpretace a schopnost potvrdit závěr vyloučením dalších možných situací, které  mohly nastat. Během testování je třeba také věnovat pozornost mnoha faktorům, které se  mohou nechtěně projevit v konečném výstupu. K otázce stáří a doby uložení vyšetřovaných kostí. Ačkoli se uvádí, že úspěšnost  sérologických   metod   u   kostní   tkáně   není   závislá   na   věku   jedince,   u   dětí   je   však  pravděpodobně větší šance na vysycení protilátek přítomnými antigeny. Masnicová a Hanulík  (1999) prokázali metodou AE u 72% dětí kladný výsledek, což bylo významně více než u  dospělých v daném souboru. To je zapřičiněno nejspíše vyšší hematopoézou v kostní dřeni u  dětí.  Na  pohlaví   však  nemá  výskyt   a  zachování   antigenů  v  kostech žádný  vliv  (to  bylo  potvrzeno již mnoha autory). Někteří autoři jsou dosti skeptičtí k sérologickému zkoumání  kostí z archeologických nalezišť. Bylo již prokázáno, že nezáleží ani tak na stáří materiálu,  ale hlavně na zachování antigenů v kostech. Dokladem je například výsledek sérologického  rozboru   fragmentu  lebky  z   období   pleistocénu.  Tkzv.   „Člověk  z   vnitrozemí“  („Midland  Man“) byl nalezen v Texasu v roce 1953. U tohoto fragmentu badatelé Thieme a Otten (1956)  potvrdili příslušnost ke skupině A. Po provedení mnoha zkoušek (zda jde o lidský fragment,  obsah   organické   složky,   kontaminace   bakteriemi   a   faunou)   byl   výsledek   prohlášen   za  spolehlivý. Předpokládá se, že kostní drť by neměla být před testováním ponechávána na přístupu  vzduchu. Jak se výzkumem ukázalo, tato situace není vůbec podstatná. Stejně tak nebyly  zaznamenány žádné rozdíly mezi dvěma postupy, v případě kdy kosti byly předem vlhčeny a  promývány fyziologickým roztokem anebo pokud tento postup nebyl proveden. Vymývání  neovlivní uvolňování aktivních látek, zůstávají stále navázány v kosti. Nebyly také nalezeny  prokazatelné rozdíly v délce inkubace kosti se séry (AI). Pokus byl proveden po 3 hodinách i  po 24 hodinách a ani v tomto případě odlišnost nebyla významná (Kout a kol. 1965).

69

Spolehlivost   průkazu  skupinových   vlastností   je   založena  na   obsahu  organického  materiálu v kostech. Obsah těchto látek je v kosti snižován vlivem diagenetických pochodů v  půdě.   Ukazatelem   zachování   činných   látek   v   kosti   je   množství   dusíku   a   protein­ polysacharidového komplexu, který lze bez větších problémů vyšetřit (viz Paoli 1986). Další  možnost vyšetření stavu kosti je provedení rentgenové difraktometrie. Ta slouží k ověření  průběhu znatelných diagenetických změn v anorganické složce kosti. Paoli a kol. (1986)  provedl rozbor na femuru z doby „paleokřesťanské“. Šetření ukázalo obsah následujících  látek: muskovit, chlorid, křemík, apatit a plagioklas. Přítomnost všech složek (kromě apatitu)  naznačuje znečištění hlínou a vápnem z okolí hrobů. Tento výsledek může být spojen s  nízkou aktivitou obecně prokázanou u studovaných kostí. Již u mnoha absorpčně elučních  testů   byly   nalezeny   falešné  pozitivní   reakce  způsobené  přednostní   absorpcí   anorganické  složky drti. Bylo použito stejných příměsí (jako u zkoumaného femuru) k testování. Nebyla  prokázaná žádná reakce, do té doby, kdy cementový prášek nezpůsobil hemolýzu. Candela  (1937)   zmiňuje  další  nevhodné  látky  jako   jsou  kaolin,   uhlí   a   benzonit.   Ty   prokazatelně  způsobují   snížení  titru  aglutininů  (in  Kout  1965).  Uvádí  se  také  uhličitan a   fosforečnan  vápenatý, které taktéž nejsou úplně lhostejné k absorpčnímu testování. V   některých   případech   (u   Paoliho  a   kol.   1989,   1992)  metoda  AE  vykazuje  více  fenotypů 0, než metoda AI prováděná na stejných vzorcích. Borgognini Tarli (1966, 1968)  toto přičítá rozdílnému chování lektinu (­H) v porovnání s neimunizovaným lidským sérem  (­A, ­B), pokud dojde ke kontaktu s kostí. Lektiny jsou více náchylné ke spojení koncové L­ fukózy  s krátkými úseky olisacharidů, zatímco lidská antiséra požadují spíše delší a více  charakteristické úseky (in Paoli 1992). Při výzkumu také dochází k mnohým nespecifickým reakcím materiálu. Ty bývají  někdy zapříčiněny rostlinnými či živočišnými zbytky, které mohou mít podobnou stavební  strukturu jako krevní skupiny. Právě pseudoreaktivitu u skupiny B zjistil u vzorků Lengyel a  Nemeskéri   (1964).   Ta   byla   způsobená  pravděpodobně   kořeny   rostlin.   Nelze   však   popřít  možné bakteriální ovlivnění vzorků. Thieme a Otten (1957) se s tímto problémem potýkali  při vlastním výzkumu. Nesprávně určené skupiny u vzorků (recentní kosti známých krevních  skupin) vykazovaly vždy skupinu 0. Není jasné, zda k tomu došlo z příčin destrukce A a B  antigenů nebo zda byly tyto antigeny přeměněny na skupinu 0. Springer (1958, 1960) však  uvádí, že přímé zničení aktivních látek A, B, H je o mnoho častější a pravděpodobnější než  přeměna jedné skupiny v druhou.  70

V   tomto   hraje   velkou   roli   i   povaha   půdy,   zda   je   kyselého   či   zásaditého   charakteru.  Glykosidové vazby jsou méně odolnější v kyselém prostředí, na druhou stranu hexosaminy  jsou dokonce citlivější v přítomnosti slabých zásad.  Dosažené frekvence fenotypů je vhodné srovnávat s předešlými výzkumy ze stejné  oblasti   a   také   s   údaji   recentními.   Dnes  jsou   k   dispozici  rozsáhlé  materiály   týkající   se  rozložení krevních skupin recentních populací. Velké zásluhy na tom mají vědci Matson a  Mourant, kteří zhruba od 60. let mapují tato skupinová rozložení ve světě. Dále je výhodné,  dle Hardyho­Weinbergovy rovnice, spočíst frekvenci alel v dané populaci a tyto hodnoty dále  srovnávat. Pokud ale máme málo početný vzorek populace, tato srovnávání nejsou až tak  vhodná a spíše zkreslují dané hodnoty. Zda srovnání mají smysl, lze jednoduše statisticky  ověřit.   Může   také   nastat   možnost,   že   vyšetřovaný   vzorek   není   původní,   a   proto   jeho  frekvence skupin nezapadá do dané oblasti (Kellerman 1971).  Interpretací negativních výsledků je mnoho. Teoreticky lze zahrnout možnou skupinu  nonsekretorů. Není však jednoznačně potvrzeno, že u nonsekretorů není možné zjišťovat  krevní   skupiny   z   kosterního   materiálu.  Dalšími   nepřejícími   jevy   jsou  ztráty  reagujících  antigenních složek, bakteriální (rostlinné, živočišné) vlivy, vymytí, vylouhování, přepálení a  další   jiné  destrukce.  U  vzorků  nastává  i  hemolýza,  to  zcela  jistě  způsobují   anorganické  příměsi (Paoli a kol. 1986). Požadavek je kladen na spolehlivost a možnost opakování dané  metody   (stejný   vzorek,   metoda,   laboratoř).   Kontrola   spolehlivosti   výsledků   je   účinná  provedením ještě další rozdílné metody na tomtéž vzorku. Pokud se i v tomto výsledky  rozcházejí,  výzkum   se   stává  absolutně  nespolehlivým   a   je   třeba  zhodnotit   celou   situaci  znovu. Je   také   na   místě   zmínit   se   o   možnostech   identifikace   s   využitím   molekulárně  genetických   metod,   které   jsou   dnes   velmi   často   užívané   a   v   určitých   případech   také  upřednostňované   před   sérologickými   postupy.   Zelený   (2006)   se   zabýval   ve   své   práci  srovnáváním obou typů metod, toho využil i v případech z forenzní praxe. Metoda absorpčně  inhibiční a smíšená aglutinace byla srovnávána s genetickým rozborem s použitím stejného  lidského materiálu. Byly hodnoceny krevní skvrny při různých teplotách (22°C, 36°C, 56°C)  po vzrůstající čas (1 den, 1 týden, 14 dní, 1 měsíc, 3 měsíce, 6 měsíců a 1 rok.) Molekulárně  genetickými  metodami  byly  určeny  krevní  skupiny  AB0  za  teploty 22°C (83,3%),  37°C  (83,3%), 56°C (71,4%). Do pokusu byl začleněn i materiál vystavený teplotě 200°C po dobu  10 minut.  71

Zde se genetickým metodám nedařilo, ani u jednoho vzorku nebyl prokázán výsledek. U  metody   absorpčně   eluční  se   vzorky   staly   nehodnotitelné  až   po  době   3   měsíců,   metoda  smíšené aglutinace si zachovala po celou dobu svojí účinnost. Překvapivé bylo stanovení  krevní skupiny u vzorku 200°C/10 min smíšenou aglutinací. Dále byla spolehlivě získána  krevní skupina z tepelně degradované tkáně (případ z praxe) pomocí imunohistochemické  metody.   Autor  hodnotí   velmi   pozitivně  sérologický  postup,  zvláště   pak  metodu  smíšené  aglutinace,   která  byla   celkově   úspěšnější   než   molekulární   genetické   metody.   Správných  výsledků lze dosáhnout taktéž začleněním metod imunohistochemických, na které se lze  bezpečně spolehnout v případě nastání hemolýzy u studovaného vzorku. Ačkoli bylo toto  srovnání provedeno na vzorcích krevních skvrn, není vyloučeno, že by sérologické metody  nebyly za těchto podmínek úspěšné i v případě dalších tkání, včetně kostí.

72

6 Z á v ě r Metody sérologické analýzy, užívané zvláště v praxi (medicína klinická i forenzní), se  dnes  přesouvají   i   k   dalším   odvětvím   vědy.   Významné   jsou   i   pro   fyzickou   antropologii  (aplikovanou, historickou), kde je kladen požadavek na identifikaci jedince na základě jeho  pozůstatků.  Sérologická   šetření   přispívají   také  k   odhalení   dalších   souvislostí,   které   jsou  spjaté s původem lidstva a příbuzenskými vztahy jedince. Vyvinuté metody jsou rozmanité a  umožňují   testování   téměř   veškeré   lidské  tkáně,   včetně   tkáně   kostní.   To   je   zásadní  pro  archeologické práce, protože při výzkumu dávných populací jsou k dispozici často právě jen  kosti. Toto téma je celkově velmi zajímavé a dosud ještě ne tolik probádané, poskytuje také  základ vhodný pro popularizaci vědy.  Pojednání o výsledcích a závěrech sérologické identifikace vypracované na kostech,  by  mělo probíhat na třech úrovních. Za prvé jsou to informace o chemickém základu  a  struktuře   zkoumané   kosti.   Informace   lze   získat   z   hlubšího   rozboru   obsahu   proteinů   v  jednotlivých vzorcích kostí. Hodnota dusíku je zásadní pro možnosti stanovování krevních  skupin z jednotlivých kostí a fragmentů. Pro dostatečné pochopení chemických procesů v  kostech se testují   kosti známých skupin po různých zkouškách zátěže (pohřbení, spálení,  vysušení, otevřené prostory). Druhou úrovní je vyšetřování specifických antigenů kostí a  půdních vzorků pomocí různých absorpčních testů, popřípadě histochemických metod. Tyto  údaje jsou úplné, pokud jsou doplněny kontrolními testy. Za poslední je to ucelený záznam  informací o zkoumaném vzorku  jedince či  populace. Získané  typy  krevních  skupin  jsou  procentuálně zhodnoceny a jsou z nich vypočítávány frekvence pro danou populaci. Ty by  měly přibližně odpovídat frekvencím dřívějších výzkumů a dokreslit tak představu o kdysi  zde žijící populaci (Heglar 1972). Pro výzkum mají vědci na výběr řadu metod a postupů. Jsou to jednak klasické  sérologické metody, původně vypracované pro forenzní účely a dále jejich různé kombinace.  Také se hojně užívají postupy imunohistochemické a metody molekulárně genetické. Pokud  vezmeme v úvahu pouze sérologické metody, nelze opravdu jednoznačně rozhodnout, jaký  postup   je   nejúčinnější.   Jak  uvádí  Lee  a   kol.   (1989),   největší   nadějí,   jak   získat  správné  výsledky, je použít alespoň dvě z metod (například AI a AE) a přiřadit jen tu krevní skupinu,  která souhlasí u obou. Imunohistochemické metody vykazují množství správných výsledků,  avšak postup je velmi náročný a zdlouhavý.  73

Genetická identifikace je často spolehlivá, avšak u degradovaných archeologických vzorků  jistota není vždy na místě. Molekulární metody se často provádějí k zúžení okruhu možných  jedinců, doplňování a podrobnému dokreslování jednotlivých případů. S ohledem na časovou  a finanční náročnost těchto metod se lze častěji přiklonit k sérologickým vyšetřením, které  jsou v některých případech dokonce účinnější (viz Zelený 2006). Ve výsledcích se také promítá negativní vliv okolního prostředí. Vyšlo najevo, že  kosterní rozbor je úspěšnější, pokud vzorky byly uloženy v suchých půdách. Nemožnost  zachycení antigenů ovlivňují zvláště extrémní podmínky (teploty, bakterie, vlhkost), ne až  tolik samotná délka uložení kostí v hrobu. Ačkoli sérologické výzkumy kosterní tkáně probíhají již desítky let, přesné návody  vědců  nepostačují  k   zopakování  stejného  výsledku.   To   je   patrno  i   u   odlišných   výstupů  laboratoří v Praze a Pise (viz Paoli a kol. 1992). Lze sice dodržovat přesná množství látek,  správnou technologii i postup, avšak přiblížit se předešlým výsledkům je velice obtížné.  Zde  hraje velkou roli přesnost, nastavení přístrojů, prostředí a chyba laboratoře. Je také časté to,  že   u   mnohých   prací   se   opakované   výsledky   (stejným   člověkem,   laboratoří   i   stejným  materiálem) neshodují. Nelze opomenout ani chyby vyplývající ze subjektivního hodnocení  autora. Proto je výhodné zapojit počítačovou techniku do vyhodnocování vzorků.  Sérologická  analýza  kostí   se   stále  nalézá   v  takové  situaci,  kdy  testování  nedosahuje  vysoké úrovně. Je proto třeba dále vylepšovat přípravu a zkvalitňovat postupy, užitečné jsou  taktéž různá porovnávání kostí recentních s kostmi archeologickými za různých podmínek  prostředí. Jen velká množství negativních i pozitivních výsledků laboratoří mohou přispět k  objasnění této problematiky.

74

S l o v n í k  d ů l e ž i t ý c h  p o j m ů Absorpce – pohlcení, vstřebání dané látky. Absorpce se využívá u sérologických metod při  detekci antigenu. Aglutinace – shlukování částic. Metoda užívaná v diagnostice krevních skupin. K aglutinaci  například dochází kontaktem krve skupiny A se sérem anti­A.  Alela – konkrétní forma genu. Vyskytuje se v páru na homologických místech chromozomu.  Analýza sérologická – rozbor krevního séra. Antigen  –   biochemická   látka,   v   cizím   organismu   vzbuzuje   imunologickou   odpověď.   Antigeny přítomné na membráně červených krvinek určují typ krevní skupiny. Bacillus  cereus  –   aerobní bakterie.  Jeho  enzym  alfa­D­galaktosidáza  mění  skupinovou   vlastnost B na  0. Běžně se nachází v půdě. Biochemický   index  –   index   zavedený   manželi   Hirszfeldovými,   udává  četnost   výskytu   aglutinogenu A a B v populaci. Slouží k porovnávání populací. Centrifugace – laboratorní postup prováděný v centrifuze. Slouží k urychlení sedimentace  dané látky. D­galaktóza  –   monosacharid.   Je   přenášen  enzymem  B­transferázou  za   vzniku   krevní   skupiny B. Dekompozice – rozklad, rozložení materiálu vlivem organismů anebo přírodních procesů. Delece  –   chromozomová   aberace.   Vzniká   v   důsledku   jednoho   či   více   zlomů   na   chromozomu. Dochází ke ztrátě koncové anebo prostřední části chromozomu. Denaturace – změna struktury látek vlivem extrémních podmínek. Dědičnost ­  schopnost předávat genetickou informaci uloženou v DNA dalšímu potomstvu.  Znaky  jsou děděny kvantitativně i kvalitativně. Děděny jsou i různé dispozice a   nadání.  Distribuce krevních skupin – rozložení jednotlivých typů krevních skupin na určitém  území, nebo v rámci určité populace. Dolichos biflorus – rostlina, která má schopnost aglutinovat krvinky skupiny A1. Užívá se v  sérologii k odlišení podskupiny A1 od A2  (s tou nereaguje tak silně). Eluce  – vylouhování, vymývání. U sérologického testování jako součást absorpčně eluční  metody. Zde eluce probíhá ve vodní lázni za teploty 56°C. 75

Enterobakterie – bakterie žijící ve vnitřním prostředí v těle, jsou často patogenní.  Enzym Alu I – specifická restriktáza. Dokáže rozeznat konkrétní sekvenci na chromozomu a  štěpit ho v tomto místě. Využívá se v genové analýze. Stejnou vlastnost má enzym  Kpn I. Enzym A transferáza  – patří do skupiny  glykosyltransferáz, je odpovědná za přenos  N­ acetylgalaktosaminu. A transferáza je produkována jedincem s krevní skupinou A. Enzym B transferáza  – patří spolu s  A transferázou  do skupiny  glykosyltransferáz. Tento   enzym předurčuje příslušnost ke skupině B. Pojí disacharid galaktózu k membráně  červených krvinek. Enzym DNA polymeráza – enzym, který je potřebný pro replikaci molekuly DNA in vitro.  Podílí se na syntéze nového řetězce DNA. Získává se z termofilních mikroorganismů. Escherichia  coli  –   enterobakterie,   anaerobní   bakterie.   Nachází   se   v   tlustém   střevě   u   teplokrevných živočichů, její přítomnost je důležitá pro správný průběh trávicích   procesů. Slouží jako  vhodný materiál pro výzkumy v genetice a mikrobiologii.  etanol – organická látka patřící do skupiny alkoholů. V sérologii se užívá k očištění kostí  od  mumifikované tkáně a mastnoty. Etnologie  –   vědecká  disciplína,  studuje  člověka,  dále  kulturní  jevy,  teorie  a  problémy.   Zabývá se také zázemím a sociálními strukturami populací, zkoumá procesy chování,  myšlení, zvyky a produkty spojované s člověkem. Je úzce spjatá s etnografií. Exon  – specifický úsek genu. Obsahuje kódující sekvence, které jsou dále přepisovány a   překládány do struktury produktu genu. Fenomén vylučovatelství – stav jedince, který buď má schopnost vylučovat substance A, B,  H   do   tekutin   a   tkání   těla   dle   své   skupinové   příslušnosti   (sekretor)   anebo  tuto   schopnost postrádá (non­sekretor). Fenotyp  – projev genotypu v interakci s prostředím. Znaky a vlastnosti jedince, které se   projeví navenek. Fenotyp Bombay  – poprvé nalezen v Indii. U jedince nesoucí tuto vlastnost se liší jeho   genotyp od fenotypu. Výsledkem je zdánlivý fenotyp 0, avšak jedinec může vlastnit  některý z antigenů A nebo B. 

76

Fetální erytroblastóza – onemocnění postihující novorozence. Je spojeno s inkompatibilitou  krve matky a plodu. Riziko nastává, pokud je matka Rh negativní a její plod je Rh  pozitivní (po otci). Při kontaktu a mísení krve (např. během porodu) dochází  k   vytváření protilátek ze strany  matky. Nebezpečí hrozí zvláště při dalším těhotenství. Fluorescenční Iso­Thyozyanát – fluorescenční látka. Váže se na antiséra, slouží k průkazu  antigenů. Má stabilní chemické vazby a je dobře rozpustný ve vodě. Gen  – specifický úsek chromozomu, geneticky aktivní struktura. Může obsahovat jednak  kódující sekvence (exony), tak i nekódující místa (introny). Genotyp – soubor genetické informace organismu, jeho projev v prostředí utváří fenotyp. Genom – soubor veškeré genetické informace, tvoří ho molekuly DNA, popřípadě RNA. Je  umístěný v chromozomech v jádře. Hardyho­Weinbergova rovnice  – udává četnosti alel v populaci. Slouží pro populačně­ genetický rozbor. Pokud se četnosti alel a genotypy nemění po několik generací,   nastává rovnovážný stav. Chromozom  – chromatinová struktura, vláknitý útvar v jádře buňky. Je tvořen kyselinou   deoxyribonukleovou a bílkovinami. Klonování  – tvorba klonů (např. nukleové kyseliny DNA). Vytváření totožných molekul,   fragmentů   anebo   úseků   DNA.   Toho   lze   docílit   pomocí   metody   PCR   anebo   zmnožením rekombinantních  molekul DNA v hostitelské buňce. Kontaminace – znečištění, zamoření. Často způsobená nepříznivými faktory (chemickými,  biologickými) z okolí.  Konzervace  – postup používaný také ve fyzické antropologii při zpracovávání kosterního   materiálu. Důvodem je zachování dobrého stavu kosti. Konzervace se provádí mnoha  prostředky, např. klihem nebo polyvinyalacetáty. Krevní skupiny  – fenotypové vlastnosti organismu. Jsou stálé a za života se již nemění.   Nejznámější krevní skupiny jsou A, B, 0 a AB (krevní systém AB0). Příslušnost ke  krevní   skupině   systému   AB0   se   vyšetřuje   zvláště   při   transfúzi   a   transplantaci   orgánů v medicíně. Krevní systém AB0  – nejdéle známý a nejdůležitější krevní systém z pohledu medicíny.   Největší využití má při transfúzi krve a transplantace orgánů. V rámci tohoto systému  rozlišujeme 4  fenotypy – A, B, AB, 0. 

77

Krevní systém Rh  – jeden z mnoha krevních systému popsaných u člověka. Objeven a   popsán v roce  1940 Landsteinerem a Wienerem. Fenotypový projev má dvě formy,  jedinci jsou označováni Rh+  (asi 80% evropské populace) anebo Rh­ (kolem 20% u  evropské populace). Tento systém je zohledňován při transfúzi krve. Má také velké  uplatnění v antropologii, při studiu genetiky a etnogeneze u člověka. Lektin – rostlinný aglutinin, neboli fytohemaglutinin. Jedná se o strukturu bílkovinou typu  globulinu, která je uložená především v embryu semen jako zásobní látka. Z těchto  látek   se   vyrábějí   specifická   séra,   vhodná   k   testování   typu   krevní   skupiny.   Nejznámější lektin je anti­H sérum,  původem z rostliny hlodáše evropského  (Ulex europaneus). Metoda absorpčně eluční  – sérologická metoda vhodná pro použití u kostní tkáně. Je   založena na absorpci (spojení antigenu a protilátky) a následné eluci. Eluční fáze   probíhá za tepla, dochází k odloučení protilátek navázaných na substrát. Následuje  aglutinace po přidání diagnostického séra. Metoda   absorpčně   inhibiční  –   sérologická   metoda,  lze   ji   úspěšně  použít  k   testování   antigenů kostní tkáně. Skládá se ze dvou fází, absorpce a aglutinace. Při absorpci se  protilátka naváže na  antigen, následně dojde k vysycení protilátky. Stupeň vysycení  se prokazuje aglutinací (po přidání náplavu erytrocytů). Metoda   dvoukruhového   systému   ve   dvou   fázích  –   kombinace   metody   aglutinačně   inhibiční a metody aglutinačně eluční. Vysycování se provádí dvoufázově. Po této   fázi probíhá testování druhého okruhu s použitím stejných vzorků (fáze eluční). Metoda   fluorescenčního   značení   antigenů   –  imunohistochemická   metoda   využívající   fluorescenční  látku   k   detekci   antigenů.   V   roce   1964   ji   upravil   Lengyel   s   Nemeskérim pro kostní tkáň. Metoda Holzerova ­ podobná metodě absorpčně inhibiční. Ke krevní skvrně se přidá směs  anti­A a anti­B. Po vysycení se sérum titruje proti krvinkám A a B. Metoda Lattesova  – sérologická metoda vhodná k průkazu aglutininů. Aglutininy jsou   prokazovány přímo přidáním erytrocytů k substrátu (například krevní skvrna). Pokud  jsou příslušné aglutininy přítomné, dojde k hemaglutinaci.  Metoda   PCR   (polymerase   chain   reaction)   –  reakce   probíhající   in   vitro,   slouží   k   mnohonásobné replikaci požadované sekvence DNA. Od roku 1983 často užívaná v  laboratořích. Zavedl ji K. Mullis, za tento objev získal Nobelovu cenu.  78

Metoda   PCR­RFLP  ­  polymerázová   řetězová   reakce   restrikčních   fragmentů.   Jde   o   mnohonásobnou replikaci konkrétního úseku DNA in vitro. Takto lze uměle získat  požadovanou část molekuly DNA, kterou lze následně dále studovat. Metoda je často  využívaná v molekulární biologii při analýze DNA. Metoda precipitační  ­ sérologická metoda vhodná pro dekalcifikovaný kosterní materiál.   Výsledkem  je precipitát,  neboli nerozpustná sraženina vzniklá  reakcí antigenu  a   protilátky.  Metoda   smíšené   aglutinace  –   sérologická   metoda,  často   se   užívá   pro   rozbory   vlasů,   popřípadě měkké tkáně. Metoda zkumavková – typická sérologická metoda uplatňující se v praxi při zjišťování typu  krevní  skupiny z plné krve. Migrace  – změna geografické polohy, přesun. O migraci se hovoří v souvislosti s lidmi   anebo zvířaty.  Důvodů migrace může být mnoho, např. migrace způsobená změnou  klimatu  a   přesun  do  místa   vhodnějšího   k   životu,   migrace   jako   důsledek  války,   genocidy anebo pracovní migrace. Mitochondrie  – buněčné organely. Jsou součástí většiny eukaryotických buněk, obsahují   vlastní  genetickou informaci uloženou v DNA. Podílí na buněčném dýchání. Mutace  – změny v sekvenci nukleotidů anebo v chromozomové struktuře DNA. Mutace   vznikají jednak náhodně, jsou také způsobeny chemickými či fyzikálními faktory. Non­sekretoři  – nevylučovatelé. Skupina jedinců v populaci (v Evropě asi 20%), kteří   nemají schopnost vylučovat antigeny do tělních tekutin a tkání. Antigeny příslušných  skupin jsou určitelné pouze z krve. Nukleotid – látka, která je složena z dusíkaté báze, monosacharidu a fosfátového zbytku. Je  to stavební kámen nukleových kyselin. Sekvence nukleotidů se překládá do struktury  proteinu vzniklého translací. Paleosérologie – odvětví historické antropologie. Věda se zabývá dávnými prehistorickými  populacemi z hlediska rozložení krevních skupin. Vypracovává metody k typizaci  krevních skupin u nalezeného materiálu. Panaglutabilita  –   vlastnost   červených   krvinek   shlukovat   se   v   přítomnosti   jakéhokoli   běžného lidského séra. To je způsobeno různými enzymy.

79

Populace – skupina lidí, kteří jsou si navzájem příbuzní a žijí na určitém území v určitém  časovém horizontu. Procesy diagenetické – geologické procesy, které probíhají v sedimentech v průběhu času. Protilátka – struktura tvořená proteinenem, je odpovědná za zneškodnění cizích látek, které  se dostanou do organismu. Dle svého typu reaguje buď specificky na určité antigeny  anebo  nespecificky (obecně) na cizí struktury. Přírodní výběr  – přirozený proces, který zvýhodňuje některé znaky jedinců v populaci,  zatímco jiné mohou být potlačeny. Charles Darwin tento proces označil za příčinu   evoluce. Přírodní výběr může probíhat na více úrovních. Restriktáza  – enzym schopný rozdělit sekvenci nukleotidů v daném konkrétním místě.   Výsledkem jsou úseky genů dále využívané v genetických analýzách a při klonování. Sedimentace  –   usazování,  je   způsobeno   rozdílnou   (molekulární)   hmotností   a   hustotou   daných složek.  Sekretoři – vylučovatelé. Skupina lidí v populaci, kteří mají schopnost vylučovat antigeny  příslušných   skupin   do   slin,   sekretů,   tkání   atd.   U   evropské   populace   je   80%   vylučovatelů. Séroantropologie – vědecká disciplína, zabývá se rozložením krevních typů v populacích  (recentních i historických) anebo v geografických oblastech. Dále zkoumá lidské   pozůstatky z hlediska  krevních vlastností. Sérum anti­A – sérum potřebné pro průkaz krevních skupin křížovou zkouškou. Může být  původu lidského, zvířecího, popřípadě rostlinného (stejně tak sérum anti­B). Sérum  anti­A aglutinuje krvinky skupiny A a AB. Sérum anti­H  – diagnostické sérum, které se přirozeně vyskytuje pouze u nonsekretorů   skupiny   0.   Často   je   přípravováno  z   rostlin   (např.  Ulex   europaneus),   nebo  také   imunizací zvířat. V sérologii se ho využívá pro průkaz skupiny 0. Skupina A  – označení pro jednu z krevních skupin systému AB0. U jedince této krevní   skupiny je na  povrchu erytrocytů přítomný aglutinogen A a v séru aglutinin anti­B.  Krevní skupina A je druhá nejrozšířenější ve světě. Skupina AB – označení pro jednu z krevních skupin systému AB0. Na povrchu erytrocytů se  nacházejí  aglutinogeny   A   a   B,  v   séru   nejsou  žádné  aglutininy.   Tato   skupina   je   nejméně častá a fylogeneticky nejmladší, vznikla asi před 1500 lety.

80

Skupina B – označení pro jednu z krevních skupin systému AB0. Na povrchu erytrocytů je  přítomen aglutinogen B a v séru je obsažen aglutinin anti­A. Krevní skupina B je v  České republice nejméně častá, ve světě je skupina B nejrozšířenější v Asii. Skupina 0 – označení pro jednu z krevních skupin systému AB0. Na povrchu erytrocytů není  žádný  aglutinogen, v séru je přítomen aglutinin anti­A a anti­B. Je to krevní skupina  s celkově největším rozložením ve světě. Jedinci skupiny 0 jsou označováni jako   univerzální dárci krve. Spongióza – typ kostní tkáně. Trámčitá struktura uložená uvnitř dlouhých kostí v epifýzách,  u kostí  plochých je vmezeřená mezi lamely kosti kompaktní. Test   dvourozměrný   absorpčně   inhibiční   (2   –   D   AI)   –  modifikace   testu   absorpčně   inhibičního.   Považuje   se   za   citlivější   na   detekci   antigenů.   Obsahuje   více   kontrolních postupů a promývání. Titr – přesné množství dané látky rozpuštěné v 1 ml roztoku. Ulex europaneus – hlodáš evropský. Žlutě kvetoucí rostlina, jejíž semena poskytují anti­H  sérum. Toto sérum se používá v laboratořích pro diagnostiku krevních skupin. Variabilita  – proměnlivost. Odlišnost jednotlivých znaků v rámci jedinců stejného druhu   anebo  populace.

81

S e z n a m  p o u ž i t é  l i t e r a t u r y Allison, J. Marvin ­ Hossaini, A. Ali ­ Astro, Nora a kol. (1976): AB0 blood groups in  Peruvian mummies. I. An evaluation of techniques. American Journal of Physical  Antropology, roč. 44,  s. 55­62.   Allison, J. Marvin ­ Hossaini, A. Ali ­ Munizaga, Juan ­ Fung, Rosa (1978): AB0 Blood  Groups in Chilean and Peruvian Mummies. II. Result of agglutination­inhibition technique. American Journal of Physical Anthropology, roč. 49, s. 139­142. Beneš, Jan (1979): Člověk se mění a přizpůsobuje. Brno: Krajský pedagogický ústav v Brně. Beneš, Jan (1994): Člověk. Praha: Nakladatelství Mladá Fronta, s. 264­265. Bičík, V. (1992): Základy hematologie a imunohematologie. Olomouc: Univerzita Palackého,  Přírodovědecká fakulta. Borgognini Tarli, S. M. ­ Paoli, G. ­ Parenti, R. (1979): Blood­Group Determination in  Ancient Peruvian Material. Journal of Human Evolution, sv. 8, s. 589­595.  Candela, P. B. (1936): Blood­group reactions in ancient human skeletons. American Journal  of Physical Anthropology, roč. 21, s. 429­432. Dobisíková, M. (1999): Antropologie. Příručka pro studium kostry. Praha: Národní muzeum, s. 343­353. Dokládal, Milan ed. (1976): Human growth and physical development. Brno: Univerzita J. E.  Purkyně v Brně, Lékařská fakulta. Doškař, Jiří (2006): Molekulární biologie. Přednášky v rámci předmětu Molekulární  biologie, jaro 2006. Brno: Masarykova univerzita, Přírodovědecká fakulta. Ezra­Cohn, H. E. ­ Cook, S. F. (1961): Blood typing compact bone tissue. Nature, roč. 191,  s. 1267­1268. Fetter, V. ­ Prokopec, M. ­ Suchý, J. ­ Titlbachová, S. a kol. (1967): Antropologie. Praha:  Academia, 

s. 450­467.

Gray, Margery P. (1958): A method for reducing non­specific reactions in the typing of  human skeletal material. American Journal of Physical Anthropology, roč. 16,  s. 135­139. Heglar, R. (1972): Paleoserology techniques applied to skeletal identification. Journal of  Forensic Sciences, roč. 17, č. 3, s. 358­363.

82

Hruban, Vojtěch ­ Majzlík, Ivan (2000): Obecná genetika. Praha: Česká zemědělská  univerzita v Praze.  Hrubiško a kol. (1983): Hematologie a krevní transfúze II. Krevní transfúze. Praha:  Avicenum, zdravotnické nakladatelství. Hummel, Susanne (2003): Ancient DNA Typing. Gottingen: Springer. Kabat, Elvin A. (1956): Blood group substances. Their Chemistry and Immunochemistry.  New York: ACADEMIC PRESS INC. Kellerman, G. (1971): Methodological investigation on the AB0­typing of ancient bones.  Humangenetik, roč. 14, s. 50­55. Kout, M. ­ Vacikova, A. ­ Stloukal, M. (1965): An attempt to asses blood groups in  paleoanthropological material. Antropologie, roč. 11, č. 3, s. 49­58. Lee, K. ­ Chang, L. J. (1992): AB0 genotyping by polymerase chain reaction. Journal of  Forensic sciences, roč. 37, s. 1269­1275. Lee, C. Henry ­ Berka, M. Karen ­ Folk, L. Nancy (1991): Genetic Markers in Human Bone:  Studies on AB0 (and IGH) Grouping. Journal of Forensic Sciences, roč. 36, č. 3,  s. 639­655. Lee, C. Henry ­ Gaensslen, R. E. ­ Carver, H. W. a kol. (1989): ABH antigen typing in bone  tissue. Journal of Forensic Sciences, roč. 34, č. 1, s. 7­14.  Lengyel, I. ­ Nemeskeri, J. (1964): Über die Blutgruppenbestimmung an Knochen mit Hilfe  der Fluoreszenz­Antikörper­Methode. Homo, roč. 15, s. 65­72. Malaska, Zdeněk (1957): Základy imunohematologie a krevní transfuze. Praha: Státní  zdravotnické nakladatelství, s. 20­29. Martin, Rudolf ­ Saller, Karl (1960): Lehrbuch der Anthropologie. Stuttgart: Gustav Fischer  Verlag, s. 1588­1636. Masnicová, S. ­ Hanulík, M. (1999): Paleoserological study of human bone remains from the  Devín­Castel Site (Slovakia). Anthropologie, roč. 37, č. 2, s. 191­194.  Mazura, Ivan a kol. (2001): Speciální metody molekulární biologie. Učební texty Karlovy  univerzity. Praha: Karolinum. Michle, S. ­ Kobilyansky, E. ­ Nathan, M. a kol. (1977): AB0­typing of ancient skeletons  from I zrael. American Journal of Physical Antropology, roč. 47, č. 1, s. 89­91. Molnar, S. (1983): Human variation. Races, Types and Ethnic Groups. Prentice – Hall, Inc.  New Jeresey. 83

Paoli, G. ­ Borognini, S.M. ­ Klír, P. ­ Strouhal, E. ­ Tofanelli, S. ­ Del Santo Valli,  M.T. ­  Pavelková,  B. (1992): Paleoserology of the Sahala Cemeteries: Comparisons among  techniques, Laboratories and Substrata. Preliminary Results. Antropologie, roč. 30,  č. 1, s. 89­93. Paoli, G. ­ Cecchi­Parenti, S. (1978): Determinazione del grupo sanguigno del sistema AB0  negli inumati di Shahr­i dokuta (Sistan, Iran). Archivio per l‘ Antropologie el‘  Etnologia, sv.  108, s. 315­321. Paoli, G. ­ Francalacci, P. ­ Del Santo, M.T. ­ Borognini Tarli, S.M. (1986): AB0 blood  typing in Italian Medieval skeletons: Absorption­Elution and Haemagglutation­ Inhibition techniques. Homo, roč. 36, č. 1­2, s. 88­96. Pilařová, Radka (2005): Vojtěch Suk: život a dílo v kontextu české a světové antropologie.  Disertační práce. Brno: Masarykova univerzita, Přírodovědecká fakulta. Race, R. R. ­ Sanger, Ruth (1954): Blood groups in man. Cambridge. Raven, H. Peter ­ Johnson B. Georgie (1992): Biology. Mosby­YearBook, s. 265­266.  Relichová, Jiřina (2000): Panoráma biologické a sociokulturní antropologie. Genetika. Brno:  Nadace Universitas Masarykiana.   Rosypal, Stanislav a kol. (2003): Nový přehled biologie. Praha: Scientia, s. 640­641. Rosypal, S. ­ Doškař, J (2000): Úvod do molekulární biologie. Díl 3. Brno: Katedra genetiky  a molekulární biologie. Schreiber, M. a kol. (1998): Funkční somatologie. Praha: nakladatelství a vydavatelství H H,  s. 84­85.  Stloukal, Milan a kol. (1999): Antropologie. Příručka pro studium kostry. Praha: Národní  muzeum, s. 343­353. Strejc, P. – Dobisíková, M. (1989): Průkaz skupinových vlastností a kontaminace  mikroorganismy. Soudní lékařství, roč. 34, č. 2, s. 22­25. Suk, V. (1934): Anthropological Aspects of Blood Grouping. Spisy přírodovědecké fakulty  MU v  Brně, č. 195. Brno: Masarykova univerzita v Brně.  Suk, V. (1930): Contribution to the study of blood groups in Czechoslovakia. Spisy      

přírodovědecké fakulty MU v Brně, č. 124. Brno: Masarykova univerzita v Brně.

 Suk, V. (1930): Faultless Teeth and Blood Groups (with Remarks on Decay and Care of  

Teeth in Whites). Spisy přírodovědecké fakulty MU v Brně, č. 125. Brno: Masarykova  univerzita v Brně. 84

 Šmarda, Jan ­ Doškař, Jiří ­ Pantůček, Roman a kol. (2005): Metody molekulární biologie.  Brno: Katedra genetiky a molekulární biologie Přírodovědecké fakulty. Tarli, S. M. Borgognini ­ Paoli, G. ­ Parenti, R. (1979): Blood­Group Determination in  Ancient Peruvian Materiál. Journal of Human Evolution, sv.8, s. 589­595.  Tesař, J. ­ Klír, P. (1975): Čím může soudní lékařství pomoci historickým nálezům. Soudní  lékařství, 20, č. 1, s. 10­12. Thieme, F. P. ­ Otten, C. M. ­ Sutton, H. E. (1956): A blood group typing of human skull  fragments from the pleistocene. American Journal of Physical Anthropology, roč. 14,  s. 437­443. Thieme, F. P. ­ Otten, C. M. (1957): The unreability of blood typing aged bone. American  Journal of Physical Anthropology, roč. 15, č. 3, s. 387­397. Trojan, Stanislav a kol. (2003): Lékařská fyziologie. Praha: Grada Publishing a.s., s. 111­155. Vácha, Martin a kol. (2004): Srovnávací fyziologie živočichů. Brno: Přírodovědecká fakulta  MU. Vlček, E. (2002): Judita Durynská – paní znamenité krásy a ducha neobyčejného. Vesmír,  roč. 81, č. 11, s. 561­565. Vlček, E. ­ Tesař, J (1979): Rodokmen historicky nejstarších Přemyslovců ve světle  sérologických skupinových vlastností stanovených z jejich kosterních pozůstatků.  Soudní lékařství, roč. 24, č. 1, s. 1­7. Wolf, Josef (2000): Lidské rasy a rasismus v dějinách a v současnosti. Praha: Nakladatelství  Karolinum, s. 20­32. Zahálková, Milada (2002): Pediatrie pro speciální pedagogy. Brno: Masarykova univerzita,  Pedagogická fakulta, s. 31­32. Zelený, Michal (2006): Možnosti určování krevních skupin na ÚSL v Brně (Porovnání  sérologických a molekulárně genetických metod). Disertační práce. Zoutendyk, A. ­ Kopeć, Ada C. ­ Mourant, A. E. (1953): The blood groups of the Bushmen.  American Journal of Physical Antropology,  roč. 15, č. 3, s. 387­397.

85

I n t e r n e t o v é  z d r o j e (1) www.crimelibrary.com/criminal_mind/forensics/serology/3.htm  staženo dne 20. 2. 2007 (2) www.zoologie.upol.cz/hemat2.htm, staženo dne 21. 2. 2007 (3) http://anthro.palomar.edu/blood/AB0_system.htm; staženo dne 28. 2. 2007 (4) http://genetika.wz.cz/skupiny.htm; staženo dne 4. 10. 2006 (5) www.bagmed.cz/?sub=katalog&tb=imuno&s=id_sub1&i=1; staženo dne 10. 3. 2007 (6) www.dadamo.com/wiki/wiki.pl?search=blood+group; staženo dne 20.2.2007 (7) http://cs.wikipedia.org/wiki/Krevn%C3%AD_skupina staženo 31.3.2007 (8) http://www.vectorlabs.com/Lectins/LDBA.html, staženo 31.3. 2007 (9) http://www.biotox.cz/toxikon/rostliny/peptidy.htm, staženo 31.3.2007 (10) fvl.vfu.cz/sekce_ustavy/mikrobiologie/obrazova_priloha/mikrob, staženo 6.4.2007 (11) http://cs.wikipedia.org/wiki/Escherichia_coli, staženo 8.4.2007 (12) www.ceskatelevize.cz/.../dokumenty_osobnosti_41, staženo dne 8.4.2007 (13) http://www.vesmir.cz/clanek.php3?CID=2391, staženo 30.4.2007 (14) www.oeaz.at/.../17/haupt/haupt17_2003tode.html, staženo dne 3.5. 2007 (15) http://www.bloodbook.com/type­sys.html, staženo dne 28.2.2007 (16) http://www.lisashea.com/lisabase/biology/art14442.html, staženo dne 3.3.2007 (17) http://flora.nikde.cz; staženo 8.4.2007 (18) http://plants.usda.gov; staženo 8.4.2007

86

R e j s t ř í k

absorpce, 38, 60 fluorescenční Iso­Thyozyanát, 50 agaróza, 36 fluorescenční značení, 49, 50, 62, 63 aglutinace, 38, 44­46, 48, 52, 60,  fluorochrom, 49 67, 72 fytohemaglutininy, 56 analýza sérologická, 75 genotyp, 14­20, 25, 34­36 anti­gamma­globulin, 50 genom, 34, 40 antigenní reakce, 37 guanin, 34, 35 antropologie fyzická, 37 Hardyho­Weinbergova rovnice, 24, 25, 72 Bacillus cereus, 52, 54 hematopoéza, 70 Bacillus fulminans, 54 humerus, 42, 58 bakterie, 11, 50­55 chromozom, 11, 15, 18, 34, 37 biochemický index, 26 ionty hořečnaté, 36 centrifugace, 45, 46 izolace DNA, 36 čeleď Febaceae, 56 kazivost zubů, 28 dekompozice, 38 klonování, 36 delece, 34 kompakta, 42, 58 denaturace, 36 kontaminace, 54, 70 detekce, 35, 36 konzervace, 41, 42, 59 dědičnost, 14, 15, 16, 21  kosti fosilní, 39, 49 difraktometrie, 71 krevní stabilita, 7, 38, 50, 58 distribuce, 25 krevní systém AB0, 7, 9, 34 Dolichos biflorus, 56 krevní systém Rh, 17 elektroforéza, 36 krvinky srpkovité, 33 eluce, 47, 49 kultivace vzorků, 51, 52 Endova půda, 52 kyselina EDTA, 45, 50 enzym Alu I, 35, 36 kyselina nukleová, 36 enzym A transferáza, 34 kyselina sialová, 55 enzym B transferáza, 34 látky anorganické, 45, 71, 72 enzym galaktosidáza, 51, 54 látky chemické, 37, 50 enzym Kpn I, 34, 35, 36 lektin, 43 enzym N­acetyl­glukosaminidáza,  lokus, 9, 11, 34 51 materiál archeologický, 58 enzym neuraminidáza, 55 materiál biologický, 41, 43 epifýza, 42, 58 materiál kosterní, 37, 41, 44, 45, 49, 51 Escherichia coli, 52, 53 metanol, 47 etanol, 41, 46, 47 metoda absorpčně eluční, 40, 47, 60­71, 74 ether, 41, 47 metoda absorpčně inhibiční, 44­46, 48, 60­ etnologie, 27 67, 72 evoluce, 28, 33 metoda dvoukruhového systému, ve dvou  exon, 34 fázích, 40, 49 extrakce, 45, 46 metoda fluorescenčního značení antigenů,  femur, 52, 58, 61, 62, 71 49, 62, 63 fenol, 41 metoda Holzerova, 44 fenomén vylučovatelství, 13, 64 metoda imunohistochemická, 44, 63, 73, 74 fenotyp metoda imunofluorescenční, 44 fenotyp Bombay, 16, 17 metoda Lattesova, 44 fetální erytroblastóza, 18, 21 metoda na mikrotitračních, 44 destičkách  formalin, 50 typu U, 44 Forssmanova antigenicita, 56 metoda PCR (polymerase chain reaction), 

87

35, 36, 37 metoda PCR­RFLP, 37 metoda precipitační, 44 metoda smíšené  aglutinace, 44 metoda zkumavková, 44 metody metrické, 37 metody molekulárně  genetické, 37, 72, 74 metody serologické, 7,  8, 37­41, 44, 50, 58, 60­ 64, 70, 73­75 migrace, 25 mikroorganismy, 38, 40,  50­55 mikroorganismy  termofilní, 36 mitochondrie, 34 míšení, 28 mutace, 25, 28, 33 N­acetylgalaktosamin,  34 Naphthochrome Green  B, 50 non­sekretoři, 13, 51, 59,  63 nukleotid, 34, 35, 36  oční bulva, 58 oční čočka, 58 oligonukleotid, 36 onemocnění, 7, 18, 20  paleosérologie, 6, 7, 38­ 40, 68 panaglutabilita, 54, 55 pleistocén, 42, 70 polyvinylacetát, 42 primer, 35 procesy diagenetické,  37, 71 Protein­polysacharidový  komplex, 39, 49, 50, 59,  71 protilátka, 12, 20, 21 přírodní výběr, 28 purifikace, 40, 46, 60,  68 replikace, 36 rodokmen, 61 sedimentace, 47 

sekretor, 13, 14, 59 sekvence DNA, 35 séroantropologie, 6, 7, 25 slzy, 13 spongióza, 39, 42, 58, 59 sternum, 58 substituce, 34 substance, 46, 51,69 suspenze, 45 štěpení restrikční, 36 substrát, 44, 47, 48 T­aglutinogeny, 55 templát, 36 test dvourozměrný absorpčně  inhibiční (2 – D AI), 48, 63­66, 69 titr, 43, 44, 47­48, 71 tkáň kostní, 6, 7, 35, 59­61, 70 tkáň nervová, 58 Ulex europaneus, 43, 48 UV světlo, 36 variabilita, 9, 28, 39 vlas, 41, 68  vypařování, 45 znaky morfologické, 26 zubovina, 58 žebra, 42 

88

O  a u t o r c e

Klára   Parmová   se   narodila   dne   17.  ledna 1985 v Českých Budějovicích. V  Dačicích ukončila v roce 2004 studium  Gymnázia Boženy Němcové maturitou  z češtiny, angličtiny, biologie a chemie.  Zájem   o  přírodní  vědy se   promítl   ve  výběru vysoké školy. Antropologie se  zdála   být     nejzajímavější   z   oborů   v  rámci Přírodovědecké fakulty, protože  poskytuje široký výběr témat ke studiu.  Ráda by bakalářským studiem navázala  na   obor   Fyzická   antropologie  magisterského   programu   taktéž   na  Masarykově univerzitě v Brně.

89