MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie
BIOLOGICKÝ PŮVOD BUNĚK CHRONICKÉ LYMFOCYTÁRNÍ LEUKÉMIE.
Brno 2010
Petra Davidová
Prohlašuji, že jsem předloženou bakalářskou práci vypracovala samostatně za použití literatury uvedené v seznam literatury. Souhlasím s uložením této bakalářské práce v knihovně PřF MU v Brně, případně v jiné knihovně MU, s jejím veřejným půjčováním a využitím pro vědecké, vzdělávací nebo jiné veřejně prospěšné účely, a to za předpokladu, že převzaté informace budou řádně citovány a nebudou využívány komerčně.
V Brně 10. května 2010 ..........………………………… Petra Davidová
Bakalářskou práci jsem vypracovala v Centru molekulární biologie a genové terapie při Interní hematoonkologické klinice Fakultní nemocníce Brno. Ráda bych poděkovala své konzultantce RNDr. Jitce Malčíkové, PhD. za cenné a odborné rady a přívětivý přístup. Dále bych ráda poděkovala svému vedoucímu bakalářské práce RNDr. Lence Fajkusové, CSc. a dalším pracovníkům Centra za pomoc při zpracování.
Obsah Abstrakt .........................................................................................................................................8 Úvod ...............................................................................................................................................9 1. Imunitní systém .......................................................................................................................10 1. 1. Základní pojmy .................................................................................................................10 1. 2. Charakteristika imunitního systému .................................................................................10 1. 3. Druhy imunitního systému ................................................................................................11 1. 3. 1. Nespecifický imunitní systém ...............................................................................11 1. 3. 2. Specifický imunitní systém ...................................................................................11 1. 4. Hlavní složky imunitního systému ...................................................................................12 1. 4. 1. Molekuly imunitního systému ..............................................................................12 1. 4. 1. 1. CD molekuly přítomné na povrchu lymfocytů......................................12 1. 4. 2. Tkáně a orgány imunitního systému .....................................................................13 1. 4. 3. Buňky imunitního systému (imunocyty) ..............................................................16 1. 5. Imunitní reakce založené na protilátkách .........................................................................17 1. 5. 1. Protilátkové reakce vyvolané antigeny nezávislými na T lymfocytech ...............17 1. 5. 2. Protilátkové reakce vyvolané antigeny závislými na T lymfocytech ...................18 2. B lymfocyty .............................................................................................................................20 2. 1. Antigenně specifický receptor B lymfocytů .....................................................................20 2. 2. Struktura imunoglobulinových řetězců .............................................................................21 2. 3. Fyziologický vývoj B lymfocytů ......................................................................................22 2. 3. 1. Vývojová stádia B lymfocytu nezávislá na antigenu ............................................22 2. 3. 1. 1. Sekundární přeskupování genových segmentů .....................................25 2. 3. 2. Vývojová stádia B lymfocytu závislá na antigenu ................................................27 2. 4. Podskupiny B lymfocytů u člověka a inbredních kmenů myší .........................................28 2. 4. 1. Dělení B lymfocytů u člověka ...............................................................................29 2. 4. 2. Dělení B lymfocytů u inbredních kmenů myší .....................................................29 2. 4. 3. Charakteristika jednotlivých skupin B lymfocytů ................................................29 2. 4. 3. 1. B-1 lymfocyty .......................................................................................29 2. 4. 3. 2. B-2 lymfocyty .......................................................................................30 2. 4. 3. 3. B lymfocyty marginální zóny ................................................................30 2. 4. 3. 4. Cirkulující „paměťové“ IgM+ IgD+ CD27+ B lymfocyty .....................31 2. 4. 3. 5. Trazientní B lymfocyty .........................................................................32
3. Chronická lymfocytární leukémie .........................................................................................34 3. 1. Biologické podskupiny CLL ............................................................................................34 3. 2. Prognostické markery CLL ..............................................................................................35 3. 3. Statika versus dynamika CLL ...........................................................................................36 3. 4. Monoklonální B lymfocytóza ...........................................................................................37 3. 5. Léčba CLL ........................................................................................................................38 4. Buněčný původ CLL ..............................................................................................................39 4. 1. Historický pohled na identifikaci CLL buněk ..................................................................39 4. 2. Antigenně zkušené CLL buňky ........................................................................................40 4. 3. Interklonální a intraklonální rozmanitost CLL buněk ......................................................41 4. 4. B buněčný receptor CLL buněk ........................................................................................41 4. 5. Problém antigenní stimulace .............................................................................................42 4. 6. Úloha mikroprostředí ........................................................................................................43 4. 7. Fyziologický protějšek CLL .............................................................................................44 4. 7. 1. Fyziologický protějšek U-CLL .............................................................................44 4. 7. 1. 1. Lidský ekvivalent k B-1 lymfocytům inbredních kmenů myší ............45 4. 7. 1. 2. Tranzientní B lymfocyty .......................................................................45 4. 7. 2. Fyziologický protějšek M-CLL ............................................................................46 4. 7. 2. 1. Folikulární paměťové B lymfocyty .....................................................46 4. 7. 3. Společný fyziologický protějšek CLL ..................................................................46 4. 7. 3. 1. Cirkulující „paměťové“ IgM+ IgD+ CD27+ B lymfocyty a B lymfocyty marginální zóny .................................................47 Závěr ............................................................................................................................................49 Literatura ....................................................................................................................................50
Seznam zkratek
Ab
protilátka (antibody)
Ag
antigen
AID
aktivací indukovaná cytidin deamináza (activation-induced cytidine deaminase)
APC buňka
antigen prezentující buňka (antigen presenting cell)
ATM
gen ataxia telangiectasia mutated
BAFF
B-buněčný aktivační faktor (B-cell activating factor)
BCL-6
gen B-buněčného lymfomu (B-cell CLL/lymphoma 6)
BCR
B-buněčný receptor (B-cell receptor)
CD
povrchový diferenciální znak buněk (cluster of differentiation)
CDR
oblast určující komplementaritu imunoglobulinu (complementarity determining region)
CLL
chronická lymfocytární leukémie (chronic lymphocytic leukaemia)
CSR
izotypový přesmyk (class switch recombination)
FM
folikulární plášť (folicular mantle)
FR
základní úsek imunoglobulinu, kostrová oblast (framework region)
GC
germinální centrum (germinal center)
Ig
imunoglobulin (immuniglobulin)
IgVH
gen pro těžkéhý řetězec imunoglobulinu (immunoglobulin heavy variable region genes)
IS
imunitní systém (immune system)
MBL
monoklonální B lymfocytóza (monoclonal B-cell lymphocytosis)
MHC
hlavní histokompatibilní komplex (major histocompatibility complex)
MZ
marginální zóna (marginal zone)
RAG1/2
rekombinační aktivační geny 1/2 (recombination activating genes 1/2)
SHM
somatické hypermutace (somatic hypermutation)
Tc lymfocyt
cytotoxický T lymfocyt (cytotoxic T lymphocyte)
TD antigen
antigen závislý na T lymfocytech (thymus-dependent antigen)
Th lymfocyt
pomocný T lymfocyt (helper T lymphocyte)
TI antigen
antigen nezávislý na T lymfocytech (thymus-independent antigen)
TP53
gen regulující buněčný cyklus a apoptózu (tumor protein p53)
V, D, J, C
segmenty imunoglobulinových genů
ZAP-70
δ-asociovaný protein 70 (zeta-chain (TCR) associated protein kinase 70kDa)
Abstract Chronic lymphocytic leukaemia (CLL) is the most common leukaemia in the Western world. It is characterized by the monoclonal expansion of small mature-looking B cells that accumulate in the blood, bone marrow, and lymphoid organs, and have a remarkable phenotypic homogeneity. CLL can be subdivided into two groups with distinctive clinical and biological behaviour based on presence (M-CLL) or absence (U-CLL) of somatic mutations in the variable regions of the immunoglobulin heavy chain (IgVH) genes. Pathogenic mechanisms involve multiple external (for example, microenvironmental stimuli and antigen drive) and internal (genetic and epigenetic) events that are crucial for transformation, progression and evolution of CLL. The cellular origin of CLL is still debated. According to current knowledge, the normal B cell counterpart of CLL is deduced based on IgVH genes – mutated CLL cells derive from postGC memory B cells and unmutated CLLs most likely derive from antigen-activated B cells that acquire features of memory B cells without undergoing of somatic hypermutation process.
Abstrakt Chronická lymfocytární leukémie (CLL) je nejběžnější leukémií v západním světě. Je charakteristická monoklonální expanzí malých zralých B lymfocytů s pozoruhodně homogenním fenotypem, které se hromadí v krvi, kostní dřeni a lymfatických orgánech. CLL můžeme rozdělit na případy se somaticky mutovanými (M-CLL ) nebo nemutovanými (U-CLL) geny pro těžké řetězce imunoglobulinů (IgVH), které se liší v klinickém a biologickém chování. Do mechanismu patogeneze jsou zapojeny jak vnější faktory (podněty z mikroprostředí a setkání s antigenem), tak vnitřní faktory (genetické nebo epigenetické), které jsou klíčové pro transformaci, progresi a evoluci CLL. Buněčný prekurzor CLL buněk je stále diskutovaný. Podle současných poznatků se původ CLL buněk odvozuje na základě IgVH oblastí – mutované CLL buňky vychází z post-GC buněk a nemutované CLL buňky nejpravděpodobněji vychází z antigenně-aktivovaných B lymfocytů, které získaly vlastnosti paměťových buněk bez toho, aby prodělaly proces somatických hypermutací.
8
Úvod Leukémie představují skupinu nádorových onemocnění, které se projevují zhoubnou transformací krevních buněk. Obecně se rozlišují čtyři základní typy. Podle rychlosti průběhu nemoci se dělí na akutní, resp. chronické, podle typu krvetvorných buněk na lymfocytární, resp. myeloidní. Chronická lymfocytární leukémie (CLL) je nejčastěji diagnostikovanou leukémií dospělého věku v západním světě. Vyskytuje se zejména u starších osob ve věku nad 50 let, postihuje častěji muže než ženy. V současnosti je CLL považována za nevyléčitelnou chorobu, jejíž klinický průběh je značně heterogenní. Až donedávna se předpokládalo, že B lymfocyty CLL jsou funkčně inertní, imunologicky naivní, s minimální schopností proliferace a poruchou apoptózy, v důsledku čehož dochází k jejich pasivní akumulaci. Nicméně, tato představa je nyní minulostí, a studie ukazují, že CLL buňky vychází ze zralých, imunokompetentních B lymfocytů, které se již setkaly s antigenem. V současnosti je velmi kontroverzní otázkou fyziologický protějšek CLL buněk. Některé studie odkazují na přítomnost dvou alternativních prekurzorů, a to na základě různého stupně citlivosti CLL buněk k antigenu nebo přítomnosti specifických molekul na jejich povrchu. Naopak, expresní profilování překvapivě ukázalo, že obě skupiny leukemických buněk pochází ze společného protějšku. Podobně sporné otázky panují kolem subpopulací B lymfocytů u člověka. Mnoho živočišných experimentálních modelů slouží k lepšímu pochopení fyziologického vývoje a k potenciální funkční diferenciaci jednotlivých subpopulací B lymfocytů u člověka. Jak u inbredních kmenů myší, tak i u člověka jsou důležitými kritérii pro dělení B lymfocytů anatomické umístění, charakteristický imunofenotyp na povrchu buňky, profil genové exprese a funkční vlastnosti.
9
1. Imunitní systém Imunitní systém (IS) je jeden ze základních homeostatických mechanismů zajišťující integritu organismu. Představuje difúzní, nepřesně ohraničený orgán, který se skládá z mnoha tkání, různých druhů buněk a molekul. Je součástí neuro–endokrino–imunitního systému a u dospělého člověka váží přibližně 1 kilogram. Jedna z hlavních funkcí imunitního systému je získávání informací z vnějšího i vnitřního prostředí, jejich zpracování a adekvátní imunitní odpověď, jejímž výsledkem je zpravidla navození imunitní reakce, při imunopatologických reakcích však vede k poškození vlastních buněk a struktur (Ferenčík et al., 2004). 1. 1. Základní pojmy Antigen (Ag) je látka, která má schopnost vyvolat specifickou imunitní odpověď - tvorbu protilátek, výkonných a regulačních buněk - a specificky reagovat s produkty této odpovědi. Nejběžnějšími antigeny jsou cizorodé látky z vnějšího prostředí (exoantigeny) a antigeny pocházející ze samotného organismu (autoantigeny). Jako superantigen se označuje exoantigen, který „nespecificky“ vyvolá aktivaci velkého počtu lymfocytů bez ohledu na jejich antigenní specifitu. Protilátky (Ab) jsou rozpustné imunoglobuliny s vazebnou specifitou k určitému antigenu. Jsou produkovány B lymfocyty jako odpověď na stimulaci antigenem. Epitop je malá oblast antigenu, která je rozpoznávána imunitními receptory. Imunokomplexy jsou koplexy antigenu s protilátkami a komplementovými fragmenty. Antigen prezentující buňky (APC) mají schopnost pohltit antigen, rozložit ho na imunogenní fragmenty a ty prezentovat v komplexu s hlavními histokompatibilními molekulami II. třídy (MHC II. třídy) T lymfocytům. Mezi nejdůležitější APC buňky patří monocyty/makrofágy, dendritické buňky a B lymfocyty.
1. 2. Charakteristika imunitního systému Mezi základní charakteristiky imunitního systému patří především schopnost rozeznání cizích molekulárních struktur od struktur vlastních. Vlastní struktury na povrchu buněk jsou za fyziologických podmínek plně tolerovány, jen v případě vlastních, ale funkčně změněných struktur (nádorová transformace, buňky infikované viry), dochází k jejich rozložení (Ferenčík et al., 2004). Tolerance imunitního systému spočívá v odstranění nebo umlčení všech klonů z repertoáru antigenně specifických lymfocytů, které by rozeznávaly vlastní struktury. Naproti 10
tomu, cizí antigen je rozpoznán imunitním systémem a vyvolá imunitní reakci, dochází k aktivaci jednotlivých složek imunitního systému a k eliminaci antigenu. Schopnost organismu reagovat na opakované podání stejného antigenu efektivněji a rychleji, se nazývá imunologická paměť, která je význačnou vlastností antigenně-specifické části IS. Snížení zranitelnosti imunitního systému náhodnými malými poruchami je zajištěno redundancí. Neméně významné charakteristiky imunitního systému jsou amplifikace selektivní imunitní odpovědi, přesná kontrola imunitní odpovědi a také genetický polymorfismus, díky kterému je IS schopen reagovat na široké spektrum antigenů. 1. 3. Druhy imunitního systému Imunitní systém můžeme rozdělit do dvou základních skupin: nespecifická (vrozená, inátní) a specifická (získaná, adaptivní) imunita. Obě skupiny pak dále zahrnují složku humorální, která představuje různé sérové proteiny a sekretované molekuly, a buněčnou, tvořenou různými druhy buněk (Hořejší, Bartůňková, 2009). Společně, nespecifický a specifický imunitní systém poskytuje pozoruhodně efektivní obranný systém.
1. 3. 1. Nespecifický imunitní systém Nespecifické mechanismy imunitního systému jsou evolučně starší, vyskytují se v různé míře u všech mnohobuněčných organismů (Hořejší, Bartůňková, 2009). Jsou přítomny v organismu již od narození a jejich aktivita nezávisí na předchozím setkání s antigenem, mohou tedy působit ihned po styku organismu s antigenem. Jsou založeny na rozpoznání chemických struktur, které jsou přítomné na povrchu mnoha patogenů, ale nejsou přítomny na povrchu vlastních buněk. Buněčný nespecifický systém je reprezentován fagocytujícími buňkami (monocyty, makrofágy, eozinofilní a neutrofilní fagocyty), jež slouží k pohlcení, likvidaci a případně prezentaci patogenu, a buňkami NK (z angl. natural killers). Humorální nespecifický systém je tvořen komplementovým systémem, lektiny, interferony a dalšími sérovými proteiny.
1. 3. 2. Specifický imunitní systém Specifické mechanismy imunitního systému jsou evolučně mladší (známy až u obratlovců) a jsou založeny na klonálním anticipačním systému. Imunitní systém je schopen předvídat setkání s jakýmkoliv antigenem přítomností řádově desítek milionů individuálně odlišných B a T lymfocytů, které se navzájem liší v detailech svých vazebných míst antigenně specifických povrchových receptorů. Podstatou specifické imunitní reakce je vznik specifických protilátek, 11
výkonných lymfocytů a lymfocytů s imunologickou pamětí, které jsou schopné reagovat jen s antigenem, který vyvolal jejich tvorbu. Tyto reakce nepůsobí okamžitě po styku určitého antigenu s imunitním systémem, ale až v horizontu 3-4 dnů. Humorálně zprostředkovaný specifický systém zahrnuje protilátky produkované B lymfocyty. Buněčný specifický systém je založen hlavně na T lymfocytech.
1. 4. Hlavní složky imunitního systému Buňky imunitního systému vznikají v kostní dřeni, kde mnoho z nich také zraje. Poté emigrují a cirkulují volně v krvi a lymfě nebo jsou organizovány do lymfatických tkání a orgánů, které vytváří vhodné mikroprostředí pro jejich diferenciaci, stimulaci antigenem a spolupráci s různými typy buněk. Nic z toho by se neuskutečnilo bez vzájemné interakce těchto buněk s různými molekulami.
1. 4. 1. Molekuly imunitního systému Nejdůležitějšími molekulami imunitního systému jsou zejména antigenně specifické receptory na povrchu B lymfocytů (B-buněčný receptor, BCR) a T lymfocytů (T-buněčný receptor, TCR). Důležitou úlohu hrají MHC glykoproteiny I. a II. třídy (z angl. major histocompatibility complex), u člověka se označují jako HLA (z angl. human leukocyte antigens). Zatímco HLA I. třídy vystavují na buněčném povrchu peptidové fragmenty proteinů produkované buňkou, HLA II. třídy váží peptidové fragmenty exogenních antigenů pohlcených buňkou. Fc receptory (FcR) na povrchu leukocytů, případně i jiných buněk, nesou vazebná místa pro Fc domény molekul imunoglobulinů. Tyto domény představují C-koncovou část obou těžkých řetězců a vznikají jejich proteolytickým štěpením. Dalšími důležitými molekulami jsou adhezivní a kostimulační molekuly, protilátky, cytokiny a jejich receptory, složky komplementového systému a receptory nespecifického rozpoznávání (např. Toll receptor, TLR). Tyto molekuly jsou buď součástí buněčné membrány, nebo jsou secernovány různými typy buněk (Hořejší, Bartůňková, 2009). 1. 4. 1. 1. CD molekuly přítomné na povrchu leukocytů Většina molekul na povrchu leukocytů se označuje CD názvoslovným systémem. CD systém (z angl. cluster of differentiation) v současnosti definuje několik stovek CD molekul. Jedná se o soubor buněčných povrchových znaků (antigenů), podle kterých se buňky mohou zařadit do diferenciačního a vývojového stádia nebo určit typ či jinou charakteristiku (Ferenčík et al., 12
2004). Řadíme zde různorodé molekuly nebo komplexy molekul, např. receptory, signalizační a adhezivní molekuly, látky účastnící se transportních procesů nebo molekuly s enzymatickou aktivitou. 1. 4. 2. Tkáně a orgány imunitního systému Lymfatický systém je tvořen lymforetikulární tkání, která se skládá ze dvou složek. První složku představují fixní retikulární buňky (retikulocyty) hvězdicovitého tvaru, navzájem se spojující svými výběžky. Spolu s retikulárními vlákny vytváří prostorovou síť. Dalšími fixními buňkami jsou dendritické buňky a makrofágy. Druhá složka lymforetikulární tkáně vyplňuje prostory této trojrozměrné sítě. Do této skupiny řadíme volné buňky, mezi něž patří různá vývojová stádia lymfocytů, plazmatické buňky, granulocyty a volné makrofágy (histiocyty). Lymfatické (lymfoidní) orgány jsou organizované tkáně, kde vzájemné působení lymfocytů spolu s ostatními buňkami vytváří vhodné prostředí pro vývoj lymfocytu, zahájení specifických imunitních reakcí nebo pro poskytování pozitivních signálů k přežívání lymfocytů. Obecně se dělí na primární a sekundární lymfatické orgány (Janeway et al., 2001). Primární lymfatické orgány Primární (centrální) lymfatické orgány jsou představovány kostní dření a thymem. Jsou místem tvorby (hematopoézy) a dozrávání imunokompetentních buněk. Hematopoéza je proces tvorby, množení, diferenciace a uvolňování krevních elementů do periferie. Zajišťuje neustálou obnovu krevních buněk. Kostní dřeň se nachází v dřeňové dutině kostí. Je osídlena pluripotentními hematopoetickými buňkami, ze kterých regulovanou diferenciací vznikají různé typy krevních buněk. Vedle diferencujících buněk se zde nachází i imunokompetentní B a T lymfocyty, které zde vcestovaly krevním řečištěm. Kostní dřeň je nejen primárním lymfatickým orgánem ale i orgánem sekundárním. Brzlík (thymus) je endokrinní žláza produkující imunohormony, které jsou nepostradatelné při dozrávání T lymfocytů. Nachází za sternem (hrudní kostí) v dolní části krku. Velikost thymu je proměnlivá a závisí na věku, kolem puberty je největší, pak postupně dochází k involuci. Je tvořen dvěma laloky, na povrchu pokrytými vazivovým obalem. Každý lalok brzlíku je dále členěn dovnitř směřujícími přepážkami (septy) v menší laloky, které se skládají z vnější vrstvy korové (kortikální) a vnitřní vrstvy dřeňové (medulární). V kůře, která představuje přibližně 85 % hmotnosti žlázy, se nachází thymocyty, nezralé T lymfocyty v různých stádiích vývoje, dále epitelové buňky a makrofágy. 13
Dřeň se skládá hlavně z thymocytů, makrofágů a Hassalových tělísek, což jsou koncentrické vrstvy oploštělých elementů retikulárních buněk. Dochází zde k odstranění většiny autoreaktivních klonů T lymfocytů, jeden z nejdůležitějších mechanismů vzniku tolerance na vlastní antigeny. Jakmile se T lymfocyty stanou zralými, putují do sekundárních lymfoidních orgánů do oblastí závislých na thymu (parakortikální oblast lymfatických uzlin, periarteriální pochvy v bílé pulpě sleziny, Peyerovy plaky). Sekundární lymfatické orgány Sekundární (periferní) lymfatické orgány jsou místem, kde probíhají důležité fáze antigenně specifických imunitních reakcí. Poskytují signály pro nepřetržitou cirkulaci lymfocytů, vhodné mikroprostředí a probíhá zde setkání lymfocytu s antigenem. Lymfatická tkáň tvořící anatomické celky zahrnuje lymfatické uzliny a slezinu. Rozptýlené funkční celky jsou představovány slizniční lymfoidní tkání MALT (z angl. mucosal-associated lymphoid tissue), která je tvořena lymfoidními buňkami v epitelové vrstvě a v lamina propria sliznic (Ferenčík et al., 2004). Lymfatické (mízní) uzliny jsou vysoce organizované lymfoidní struktury lokalizované v místech, kde se sbíhají cévy lymfatického systému. Jejich funkcí je sběr extracelulární tekutiny (lymfy) z tkání spolu s případnými antigeny a antigen prezentujícími buňkami, čímž brání rozptýlení antigenu v těle. Lymfa se s částí lymfocytů vrací zpět do krevního řečiště. Na povrchu uzliny se nachází vazivové pouzdro, z něhož vybíhají směrem dovnitř septa. Vlastní tkáň lymfatické uzliny tvoří tři funkční oblasti: oblast kortikální, parakortikální a medulární. Na povrchu kůry se nachází marginální sinus. Nejdůležitější strukturou kortikální oblasti jsou lymfatické folikuly (uzlíky). Lymfatické folikuly jsou kulovité útvary husté lymforetikulární tkáně, které jsou přítomné nejen v lymfatických uzlinách, ale i ve slezině, Peyerových plátech a mandlích. Představují vysoce organizované mikroprostředí a pro jejich další rozvinutí je nutný antigenní stimul. Primární lymfatické uzlíky obsahují zejména zralé klidové B lymfocyty, které nebyly stimulovány antigenem. Sekundární lymfatické uzlíky charakterizují germinální (zárodečná) centra, jež vznikají po stimulaci B lymfocytu antigenem. Anatomie lymfatického folikulu je na obrázku 1. Aktivované B lymfocyty uvnitř germinálního centra proliferují a diferencují na plazmatické buňky, čímž se uzlina několikanásobně zvětší. V parakortikální oblasti se vyskytují četné postkapilární venuly s vysokým endotelem, které umožňují lymfocytům přejít přes cévní stěnu. Nachází se zde T lymfocyty a dendritické buňky. 14
Převládajícím typem buněk v medulární oblasti jsou makrofágy, dendritické buňky, plně diferencované plazmatické buňky a T lymfocyty.
Obr. 1. Anatomie lymfatického folikulu v lymfatických uzlinách (Chiorazzi et al., 2005, upraveno).
Slezina se nachází v břišní dutině a představuje u člověka největší lymfatický orgán. Z imunologického hlediska je funkce sleziny v podstatě stejná jako v případě lymfatických uzlin - imunitní odpověď na antigeny - jen s tím rozdílem, že lymfoidní tkáň sleziny reaguje na antigeny přicházející krevní cestou. Na povrchu sleziny se nachází vazivové pouzdro, ze kterého se do nitra orientují přepážky (trabekuly). Vnitřní část můžeme rozlišit podle dvou druhů retikulárních tkání: červená a bílá pulpa. Červená pulpa vyplňuje prostor mezi bílými pulpami a je místem erytrocytů, trombocytů, granulocytů, makrofágů, lymfocytů a plazmatických buněk. Její hlavní funkcí je likvidace starých nebo poškozených erytrocytů, slouží také jako rezervoár erytrocytů, trombocytů a granulocytů. V bílé pulpě se nachází kulatá pole lymfoidní tkáně. Kolem arteriol se vytváří periarteriolární lymfatický kruh (PALS), který představuje oblast závislou na thymu, neboť se zde vyskytují převážně T lymfocyty. Tato oblast je připojena k lymfoidním folikulům. Kolem periarteriální lymfoidní tkáně a folikulů je pás označovaný jako marginální sinus, který je obklopen marginální zónou (Janeway et al., 2001). Marginální zóna tvoří rozhraní mezi červenou a bílou pulpou a obsahuje všechny buňky nutné k zahájení imunitní reakce po rozpoznání antigenu. Peyerovy plaky jsou organizované shluky lymforetikulární tkáně nacházející se v submukóze tenkého střeva. Na povrchu jsou pokryty specializovanými epitelovými buňkami (M buňky), které umožňují transport patogenních mikroorganismů a makromolekulárních složek potravy ze 15
střevního lumen k APC buňkám a T lymfocytům, a následné stimulaci B lymfocytů. Stejně jako v případě sleziny nebo lymfatických uzlin obsahuje oblasti závislé na thymu.
1. 4. 3. Buňky imunitního systému (imunocyty) Významnou složkou imunitního systému jsou bílé krvinky (leukocyty). Všechny druhy leukocytů
vychází
z pluripotentních
hematopoetických
kmenových
buněk,
jejichž
charakteristickou adhezivní molekulou je CD34. Nachází se v kostní dřeni a zde jsou také v malém počtu udržovány po celý život dělením. Z pluripotentních buněk vznikají regulovanou diferenciací dvě základní linie: myeloidní a lymfoidní. Z myeloidní linie vznikají monocyty cirkulující v krvi, které po přestupu do tkání diferencují na makrofágy. Dále se tvoří dendritické buňky (DC), které jsou považovány za nejúčinnější buňky prezentující antigen, a tři druhy granulocytů - neutrofily, eozinofily a bazofily. Tkáňovou formou bazofilů jsou žirné buňky (mastocyty). Granulocyty mají poměrně krátkou životnost, jejich počet se zvyšuje v době zánětu nebo infekce. Většina myeloidních buněk má schopnost fagocytózy (makrofágy, monocyty, dendritické buňky a neutrofily) a řada z nich funguje jako buňky předkládající antigen T lymfocytům, čímž se uplatňují ve specifické části imunitního systému. Důležitými zástupci myeloidní linie jsou také červené krvinky (erytrocyty) a krevní destičky (trombocyty) (Hořejší, Bartůňková, 2009). Lymfoidní linie diferencuje tři důležité buňky imunitního systému, jsou to T a B lymfocyty (buňky) a NK buňky, které jsou vývojově bližší T lymfocytům než B lymfocytům (Hořejší, Bartůňková, 2009). T lymfocyty po svém vzniku v kostní dření migrují do thymu, kde získají imunokompetenci typické morfologické a funkční vlastnosti. Jejich základní charakteristikou je přítomnost TCR receptorů a diferenciační znaky, molekuly CD2 a CD3 na jejich povrchu. Jsou zodpovědné za specifickou buněčnou imunitu. T lymfocyty jsou heterogenní populací složenou ze dvou základních subpopulací: pomocných (Th) lymfocytů a cytotoxických (Tc) lymfocytů. Pomocné T lymfocyty rozpoznávají exogenní antigeny, naproti tomu cytotoxické T lymfocyty rozeznávají nejčastěji imunogenní peptidy z endogenního antigenu. Kromě pomocných a cytotoxických T lymfocytů existuje ještě skupina paměťových T lymfocytů (Tm). Subpopulace Th lymfocytů, jejichž charakteristickým znakem je povrchová molekula CD4, není jednotná. Rozlišují se na dvě základní podskupiny Th1 a Th2. Lymfocyty Th1 mají na svém povrchu receptor pro IL-1 a regulačně zasahují především do zánětlivých reakcí, do buňkami 16
zprostředkované imunity, usmrcují intracelulární parazity a aktivují mikrofágy. Lymfocyty Th2 secernují IL-4, IL-5, IL-6 a IL-10 a účastní se hlavně regulace protilátkové imunitní odpovědi aktivací B lymfocytů (Rosypal, 2002). Tc lymfocyty s typickou povrchovou molekulou CD8 jsou výkonné buňky specifické buněčné imunity, které mají za úkol usmrtit buňky infikované viry, buňky s nevlastními histokompatibilními antigeny a nádorově transformované buňky (Ferenčík et al., 2004). B lymfocyty představují populaci buněk, která vzniká a zároveň i získává imunokompetenci v kostní dřeni. Odpovídají za specifickou protilátkovou imunitní odpověď a patří do skupiny antigen prezentujících buněk (podrobněji viz kapitola 2). Třetí hlavní populací buněk vyvíjející se z lymfoidní linie jsou buňky NK (z angl. natural killers). Exprimují charakteristické povrchové molekuly CD16 a CD56, ale ve srovnání s předchozími dvěma skupinami nemají na svém povrchu receptor pro antigen. Uplatňují se v nespecifické buněčné imunitě (Ferenčík et al., 2004).
1. 5. Imunitní reakce založené na protilátkách Tyto imunitní reakce jsou založené na rozpoznání antigenu povrchovým antigenně specifickým receptorem B lymfocytů. Jsou známy dvě základní skupiny antigenů, které se liší svou schopností aktivovat B lymfocyty: T-nezávislé (independentní) antigeny a T-závislé (dependentní) antigeny. 1. 5. 1. Protilátkové reakce vyvolané antigeny nezávislými na T lymfocytech Antigeny nezávislé na thymu (TI) aktivují B lymfocyty přímo, bez jejich zpracování APC buňkami. Charakteristickým znakem těchto reakcí je tvorba nízkoafinitních protilátek třídy IgM. Na základě způsobu aktivace B lymfocytů je dále dělíme do dvou podskupin. První skupinu TI-1 představují zejména bakteriální lipopolysacharidy (LPS), často nazývané mitogeny B buněk. Ve vyšších koncentracích se váží na receptor B lymfocytů pro LPS, dochází k nespecifické stimulaci velkého množství B lymfocytů a produkci polyreaktivních protilátek (Hořejší, Bartůňková, 2009). Důležitý rozdíl oproti dalším skupinám antigenů je, že mohou aktivovat nezralé i zralé B buňky (Janeway et al., 2001). Polyreaktivní protilátky se vyznačují heterogenitou, vytváří se populace několika typů molekul imunoglobulinů, jejichž vazebná místa mají různou afinitu a specifitu k jednotlivým epitopům kompletního antigenu (imunogenu). Každý epitop na molekule antigenu stimuluje jen určitý klon B lymfocytů k tvorbě protilátek.
17
Druhý typ TI-2 zahrnuje skupinu antigenů, které mají typickou strukturu. Jedná se o polymery, pro něž jsou charakteristické repetitivní základní jednotky. Příkladem jsou polysacharidové antigeny (mikrobiální povrchové sacharidy v obalu opouzdřených bakterií) nebo polymerní peptidy (flagelin tvořící bičíky některých bakterií). Antigeny se zkříženě váží na BCR receptor B lymfocytů, za spolupůsobení fragmentu C3d vážící se na molekulu CD21 na povrchu B buňky, vzniká dostatečně silný aktivační signál, který vyvolá buněčné dělení a diferenciaci. Tímto způsobem mohou být stimulovány jen zralé B lymfocyty, u nezralých B lymfocytů dochází k anergii. V případě TI-2 antigenů je nezávislost na Th lymfocytech neúplná. B lymfocyty sice nevyžadují přímý kontakt s pomocnými lymfocyty, ale potřebují některé cytokiny sekretující buď T lymfocyty nebo NK buňky či jiné zdroje (Hořejší, Bartůňková, 2009; Ferenčík et al., 2004). 1. 5. 2. Protilátkové reakce vyvolané antigeny závislými na T lymfocytech Protilátkové reakce závislé na thymu (TD) jsou charakteristické tím, že probíhají ve dvou fázích, které na sebe mohou (přirozená infekce) nebo nemusí (podávání opakovaných malých dávek antigenu s vhodným časovým odstupem-imunizace) bezprostředně navazovat. První fáze se označuje jako primární, druhá jako sekundární odpověď (Hořejší, Bartůňková, 2009). Proteinové antigeny nemohou přímo aktivovat B lymfocyty k tvorbě protilátek, musí být nejprve v buňkách prezentujících antigen rozloženy na imunogenní peptidy a až v této formě v komplexu s HLA II. třídy jsou rozeznány Th lymfocyty, které mohou aktivovat příslušné B buňky. Typickým znakem této odpovědi je vznik vysokoafinitních protilátek a paměťových lymfocytů (Ferenčík et al., 2004). První setkání s antigenem vede k primární imunitní reakci, během které se vytvoří protilátky schopné blokovat infekci. Antigeny jsou obvykle zachyceny APC buňkami (zejména dendritickými buňkami). Endocytózou antigenu a jeho rozštěpením uvnitř buňky vznikají imunogenní peptidy. Ty se váží do vazebného místa glykoproteinů HLA II. třídy. Takto vzniklý komplex se přesouvá na povrch APC buňky a tím účinně prezentuje antigen Th lymfocytům. Aktivované antigen prezentující buňky se lymfatickým systémem dostávají do lymfatických uzlin, krevním systémem pak do sleziny. Jakmile se zralá APC buňka setká se specifickým prekurzorem T lymfocytu, buňka Th rozpozná pomocí svého TCR receptoru fragment peptidu v komplexu s HLA II. třídy, což zaručí první signál potřebný k aktivaci Th lymfocytu.
18
Důležitý regulační signál, kterým se brání organismus proti snadné a potenciálně nebezpečné aktivaci lymfocytu, je princip druhého signálu. Přítomnost pouze prvního signálu obvykle vede k anergii a lymfocyt se stává funkčně neaktivní nebo dokonce dochází k jeho apoptóze. Až druhý (kostimulační) signál aktivuje lymfocyt k dělení a diferenciaci do příslušné efektorové populace. Kostimulační signál vzniká interakcí kostimulační molekuly CD28 na povrchu naivního T lymfocytu a jejího ligandu CD80 nebo CD86 na povrchu APC buňky v přítomnosti IL-4. Tato interakce má za následek opakovanou proliferaci a diferenciaci na klon efektorových zralých Th2 buněk (Hořejší, Bartůňková, 2009). V tutéž dobu i B lymfocyt rozpoznává stejný antigen a vystavuje antigenní peptidy v komplexu s HLA II. třídy. Také B lymfocyty potřebují k aktivaci druhý signál. Ten vzniká po rozpoznání stimulovaných B lymfocytů aktivovanými Th2 lymfocyty, které se vážou svým ligandem CD40L na kostimulační molekulu CD40 na povrchu B lymfocytu. Interakce CD40CD40L je klíčová. Aktivovaný B lymfocyt se množí a diferencuje na plazmatické buňky produkující protilátky, které jsou účinné především při blokování šíření infekce. Některé B lymfocyty se přemění v paměťové buňky, které buď v přímé návaznosti, nebo s časovým odstupem iniciují sekundární protilátkovou reakci. Velká část těchto buněk je roznesena oběhovým systémem do různých míst v organismu, hlavně do kostní dřeně (podrobněji viz kapitola 2). Sekretované protilátky se váží na antigeny a vytváří imunokomplexy, které jsou zachycovány na povrchu folikulárních dendritických buněk (FDC) v primárních lymfatických folikulech. FDC slouží jako antigen prezentující buňky hlavně primárně stimulovaným B lymfocytům. Imunokomplexy mohou na svém povrchu uchovávat až několik let. Sekundární fáze protilátkové reakce nastane, pokud paměťové buňky, které vznikly při primární odpovědi, rozeznají antigen na povrchu folikulárních dendritických buněk. Specifické Th lymfocyty opět poskytují pomocné signály, tím se paměťové buňky aktivují a nastává nový cyklus dělení, diferenciace a selekce. Sekundární protilátková odpověď vede k dalšímu zdokonalení afinity a efektorových vlastností B lymfocytů.
19
2. B lymfocyty Název rozmanité populace B lymfocytů byl odvozen od specifického prostředí, ve kterém se tato lymfocytární skupina buněk vyvíjí. U savců je tímto orgánem kostní dřeň, u ptáků je místem vývoje
Fabriciova
bursa
(lat.
Bursa
Fabricii),
odtud
pojmenování
B
lymfocyty.
Během embryonálního vývoje jsou však B buňky generovány v jiných orgánech, jsou jimi játra a slezina, až po narození je jejich vznik a vývoj omezen na kostní dřeň. Během svého vývoje prochází B lymfocyty několika vývojovými fázemi, které jsou spojeny s velkou mortalitou nepotřebných buněk. Jejich nadměrná tvorba umožňuje velmi přísný výběr v procesu negativní a pozitivní selekce, a tím i dohled nad nově generovanými B lymfocyty. Dlouhodobě přežívají jen buňky požadovaného fenotypu, které mají schopnost okamžitě uskutečnit svou specifickou funkci. Po migraci z kostní dřeně jsou B lymfocyty zaneseny krevní cestou do sekundárních lymfatických orgánů, kde osidlují B-dependentní oblasti nebo recirkulují mezi nimi a čekají na setkání se svým specifickým antigenem.
2. 1. Antigenně specifický receptor B lymfocytů B-buněčný receptor se řadí do imunoglobulinové rodiny. BCR představuje multiproteinový komplex, který se skládá z vlastního povrchového imunoglobulinu (Ig) a invariantních asociovaných signalizačních řetězců. Imunoglobulin lze rozlišit na dva těžké (H, heavy) a dva lehké (L, light) řetězce, obecně lze tuto strukturu zapsat (H2L2)n. Těžké řetězce se díky dvaceti hydrofobním aminokyselinám v C-terminální části zakotvují do membrány B buňky. Jako přídavné řetězce se uplatňují transmembránové proteiny Igα (CD79α) a Igβ (CD79β), které jsou nekovalentně spojeny s cytoplazmatickými protein-tyrosin kinázami (PTK) skupiny Src, jenž zabezpečují signalizaci. Jejich řetězce obsahují funkčně významné tyrozinové zbytky v ITAM sekvencích (z angl. immunoreceptor tyrosine-based activation motif). Po vazbě ligandu na BCR dochází k multimerizaci receptoru a vzájemné fosforylaci k sobě přiblížených asociovaných PTK v oblasti ITAM, čímž se kinázy aktivují. Aktivované kinázy následně fosforylují další cytoplazmatické proteiny a spustí složitou signalizační kaskádu. Pokud buňka dostane i ostatní potřebné signály, dochází k transkripci řady genů. Důležitou roli v signalizaci hrají membránové signalizační mikrodomény (angl. lipid rafts), které tvoří speciální oblasti v buněčné membráně bohaté na cholesterol, glykolipidy s dlouhými nasycenými zbytky mastných kyselin, fosfolipidy (PIP2) a proteinkinázy (skupiny Src, Gproteiny). Membránové mikrodomény jsou schopny dynamicky měnit složení a obsah proteinů. 20
Po navázání ligandu receptory migrují do oblastí mikrodomén a agregují zde, čímž se cytoplazmatické konce řetězců imunoreceptorových komplexů dostanou do prostředí bohatého na PTK skupiny Src, fosforylují je a spouští signalizační kaskádu (Janeway et al., 2001).
2. 2. Struktura imunoglobulinových řetězců Imunoglobuliny jsou glykoproteiny, ve kterých peptidická část tvoří většinovou složku a zabezpečuje nejdůležitější biologické vlastnosti. Těžké a lehké řetězce jsou navzájem spojeny disulfidovými můstky a nekovalentními vazbami, čímž vytváří dvoustranně symetrickou strukturu. Jednotlivé řetězce imunoglobulinů jsou tvořeny několika prostorovými doménami, jež obsahují přibližně 100-120 aminokyselinových zbytků a jsou stabilizovány disulfidovou vazbou. První doména od N-konce polypeptidového lehkého (VL) i těžkého (VC) řetězce je variabilní. Variabilní oblast polypeptidu každého z řetězců je složena ze tří hypervariabilních úseků nebo také oblastí určující komplementaritu (CDR, z angl. complementarity determining region) a čtyř kostrových oblastí (FR, z angl. framework region). Hypervariabilní úseky jsou v primární struktuře velmi proměnlivé a tím podmiňují specifitu vůči antigenu, zatímco FR oblasti jsou úseky základní struktury, které jsou poměrně konzervativní (Rosypal, 2002). Ostatní domény směrem k C-konci řetězce jsou konstantní. Lehké řetězce molekul imunoglobulinů se skládají ze dvou domén. Variabilní (VL) a konstantní (CL) domény. Celkově L řetězec obsahuje přibližně 215 aminokyselinových zbytků a jeho molekulová hmotnost je asi 25 kDa. Existují dva druhy lehkých řetězců: kappa κ a lambda λ, lišící se primární strukturou konstantních domén. Poměr výskytu řetězců κ: λ je pro konkrétní druh typický. Oba identické těžké řetězce jsou k sobě kovalentně připojeny pomocí disulfidových můstků v pantové oblasti imunoglobulinu. Těžké řetězce imunoglobulinu se skládají z jedné variabilní a 3-4 konstantních domén. Podle primární struktury jejich konstantních domén se dělí do pěti tříd (izotypů) – IgM, IgD, IgG, IgA a IgE. Těžké řetězce se buď skládají z celkového počtu čtyř domén (VH, CH1, CH2 a CH3) u tříd IgG, IgA a IgD nebo pěti domén (VH, CH1, CH2, CH3 a CH4) u tříd IgM a IgE. Přibližná molekulová hmotnost H řetězce je mezi 50-75 kDa, v závislosti na konkrétní izotypové třídě (Hořejší, Bartůňková, 2009). Struktura imunoglobulinu je schématicky zobrazena na obrázku 2.
21
Obr. 2. Schéma struktury imunoglobulinu.
2. 3. Fyziologický vývoj B lymfocytů Fyziologický vývoj B lymfocytů začíná u hematopoetické kmenové buňky v kostní dřeni, ze které regulovanou diferenciací vzniká celá populace B lymfocytů. Obecně lze rozdělit vývoj B lymfocytů na dvě hlavní fáze: první fáze je nezávislá na přítomnosti antigenu a dochází k tvorbě funkčního BCR, druhá fáze už je závislá na přítomnosti antigenu a B buňka podstupuje další vývojové změny, které vedou k tvorbě protilátek eliminujících antigen. Schématický přehled fyziologického vývoje B lymfocytu je na obrázku 4.
2. 3. 1. Vývojová stádia B lymfocytu nezávislá na antigenu Vývoj B lymfocytu je zahájen procesem primární přeskupování (rearrangement) genových segmentů (subgenů), který podle vývojového programu organismu vytváří strukturní geny kódující primární strukturu těžkého nebo lehkého řetězce imunoglobulinu. Konečná sestava genu je výsledkem kombinace genových segmentů a je základním zdrojem rozmanitosti BCR. U člověka jsou sestavy subgenů pro H řetězce imunoglobulinu umístěny na chromozomu 14, geny kódující L řetězci imunoglobulinů jsou lokalizovány v genovém komplexu na chromozomu 22 v případě řetězce λ a na chromozomu 2 pro řetězec κ (Rosypal, 2002). Komplex subgenů kódující těžký řetězec imuniglobulinů u člověka obsahuje na svém 5´ konci přibližně 51 sekvenčně podobných úseků V (variability), pak následuje skupina asi 27 úseků D (diversity), dále skupina 6 úseků J (joining) a na 3´ konci jsou v tandemu uspořádány C (constant) segmenty kódující celou konstantní část konkrétního typu imunoglobulinového 22
řetězce. Na koncích V, D a J segmentů se nachází rekombinační signální sekvence (RSS), nutné pro enzymy provádějící V(D)J rekombinaci. Mezi jednotlivými C segmenty – μ (kóduje izotyp IgM), δ (IgD), α (u člověka významné subtypy α1 a α2 kódující IgA), γ (subtypy γ1-γ4 kódující IgG) a ε (IgE) - jsou přesmykové (switch) sekvence, důležité pro enzymy uskutečňující izotypový přesmyk. Struktura genových komplexů, které kódují oba lehké řetězce je obdobná, ale jednodušší, protože se skládá z menšího počtu V a J segmentů a neobsahuje úseky D (Rosypal, 2002). Za proces přeskupování subgenů je zodpovědný rekombinázový komplex tvořený dvěma proteiny, RAG1/2 (z angl. Recombination Activating Genes). Jakmile komplex enzymů rozpozná signální rekombinační sekvence, štěpí DNA, což vede k deleci úseků mezi V a J segmenty u lehkého řetězce a D-J a V-D úseků u těžkého řetězce. Konce vzniklé štěpením při spojování vybraných segmentů VLJL, VHDH a DHJH se označují jako kódující konce. Po spojení kódujících konců se vytváří kódující spoj, jehož podstatou je nepřesnost tvorby. Nukleotidová sekvence spoje je výsledkem zařazování P a N-nukleotidů. P-nukleotidy vytváří palindromatické oblasti, zatímco enzym terminální deoxyribonukleotidyltransferázy (TdT) zařazuje do kódujících spojů N-nukleotidy zcela náhodně bez matrice. Důsledkem zařazování N-nukleotidů do spojů může být neproduktivní přeskupení subgenů, kdy dochází k přerušení čtecího rámce, což se projeví ve ztrátě funkce imunoglobulinu. Je-li přeskupení genových segmentů produktivní, pak kódující spoj tvoří souvislý čtecí rámec, Ig řetězec je zcela funkční a nastane alelická exkluze, jejímž výsledkem je zastavení přeskupování subgenů na druhém chromozomu. Tento děj později proběhne i v případě genů pro IgL. Jelikož Cμ subgen je nejblíže přeskupenému produktu, vzniká těžký řetězec μ. Jakmile započne první fáze přeskupování genových segmentů, nachází se B buňka ve stádiu raného progenitoru B lymfocytu (pro-B). Nejprve dochází k D-J přeskupení probíhající paralelně na obou chromozomech, jenž má za následek vyštěpení úseku genového komplexu IgH mezi některým D a J segmentem. Následně pokračuje V-DJ přeskupení za delece obsáhlého úseku mezi náhodným V a vzniklým DJ segmentem. V této fázi se B buňka nachází ve stádiu pozdního pro-B lymfocytu. V okamžiku, kdy je pro-B lymfocyt schopen vytvořit aktivní μ řetězec, stává se B buňka velkým pre-B (pre-BI) lymfocytem a aktivita TdT se vypíná. V této fázi se syntetizuje H řetězec μ spolu s náhradním lehkým řetězcem (ψL), který se skládá z proteinů VpreB a λ5. Komplex μ řetězce, ψL řetězce a heterodimeru Igα/Igβ je integrován do membránových signalizačních mikrodomén velkého pre-B lymfocytu a označuje se jako pre-B receptor. 23
Podstatné je, že signalizace prostřednictvím pre-BCR je nezbytná pro potlačení VDJ rekombinace a zavedení alelické exkluze do lokusu pro těžký řetězec. Vyhovující pre-BCR tak signaluje pozitivní selekci a buněčné dělení (Constantinescu, Schlissel, 1997). Přeskupování genových segmentů pro lehký řetězec nastává ve fázi malého pre-B (pre-BII) lymfocytu. Nejprve dochází k přeskupování genů pro κ řetězec na obou chromozomech. Pokud není VJ rekombinace tohoto řetězce úspěšná, zahájí se stejné přeskupování genů pro řetězec λ. Současně se tvoří i cytoplazmatický μ řetězec. Pokud vznikne kompatibilní L a H řetězec, na povrchu B buňky se vystaví funkční IgM a buňka se stává nezralým B lymfocytem. Mezi Cμ a Cδ subgeny není přesmyková sekvence, tyto subgeny končí na různých polyadenylačních signálech. Prodlouženou transkripcí a následným alternativním sestřihem vzniká těžký δ řetězec, který se sdružuje s L řetězcem κ nebo λ. Vytvoří se povrchový IgD a buňka se stává zralým B lymfocytem, pro něhož jsou charakteristické dva receptory pro stejný antigen. Mechanismus primární VDJ rekombinace je zobrazen na obrázku 3.
Obr. 3. Mechanismus primárního přeskupování genových segmentů pro těžký řetězec imunoglobinu probíhající v kostní dřeni u B lymfocytů. Nejprve v zárodečné sekvenci dochází k deleci rozsáhlého úseku mezi náhodně vybranými D a J genovými segmenty. Následuje V-DJ přeskupení, ve kterém se deletuje úsek mezi V a nově vzniklými DJ subgeny. Oba tyto procesy nastávají ve fázi pro-B lymfocytu. Jakmile B buňka syntetizuje μ těžký řetězec, který se spojí s náhradním lehkým řetězcem, B lymfocyt exprimuje se na svém povrchu pre-BCR a stává se pre-B lymfocytem. Pokud také úspěšně ukončí V-J přeskupení lehkého řetězce a vystaví na svém povrchu funkční BCR, stává se nezralým B lymfocytem (Chiorazzi et al., 2005, upraveno).
24
Jakmile B lymfocyt opustí mikroprostředí kostní dřeně, stává se tranzientním B lymfocytem. Takový lymfocyt migruje do periferních lymfoidních orgánů, kde jeho vývoj pokračuje přes další přechodná stádia charakterizovaná specifickými vývojovými markery. 2. 3. 1. 1. Sekundární přeskupování genových segmentů Přeskupování genových segmentů pro L i H řetězce je proces náhodný, a tak může docházet k tvorbě autoreaktivních receptorů. B lymfocyty musí při svém vývoji absolvovat několik pozitivních a negativních selekčních kontrolních bodů, aby se otestovala způsobilost nově vzniklého receptoru a zajistila se tvorba zralých B buněk s funkčně kompetentním neautoimunitním repertoárem. Nedávné imunologické modely udávají, že pokud se B buňce nepodaří naplnit oba tyto požadavky, přeruší svůj vývoj a podstoupí apoptózu v kostní dřeni. Naproti tomu, několik studií ukazuje, že pro B buňky exprimující na svém povrchu defektní a/nebo autoreaktivní receptor existuje alternativní záchranná cesta. Tímto mechanismem je úprava receptoru nebo také sekundární přeskupování genových segmentů (receptor editing). Sekundární V(D)J rekombinace mění zárodečnou sestavu a byla prokázána jak u subgenů pro H řetězec, tak u subgenů pro řetězec L, ačkoliv mechanismus je odlišný. V obou případech tento proces vyžaduje nepřetržitou expresi enzymů RAG1/2 a přispívá k pozitivní a negativní selekci během B lymfopoézy (Edry, Melamed, 2004). Úprava těžkého řetězce BCR při negativní selekci Jedním z mechanismů sekundárního přeskupování subgenů na lokusu pro H řetězec je výměna VH segmentů, studovaná na modelech myší. Sekundární přeskupení vyštěpí úsek stávajících VH segmentů a to jak na neproduktivní tak i na produktivní alele. Protože vystavení pre-B receptoru na povrchu buňky a jím zprostředkovaná signalizace jsou klíčové pro pozitivní selekci pozdního pro-B lymfocytu, musí tato výměna nastat ve fázi pro-B lymfocytu, kdy genové segmenty pro L řetězec jsou stále v zárodečné sestavě. Tato skutečnost je potvrzena i několika studiemi, které dokazují, že při sekundární rekombinaci mezi VH
a VDJ segmenty se zařazují nové N-
nukleotidy. Podnětem pro zahájení tohoto procesu je neschopnost vytvořeného μ řetězce párovat se s náhradním lehkým řetězcem (Edry, Melamed, 2004; ten Boekel et al., 1997). Alternativní možností je tvorba rozmanitějších pre-B receptorů, což přispívá k intraklonalní rozmanitosti B lymfocytů (Zhang et al., 2003). Jiným způsobem úpravy nevhodného primárního přeskupení D a J subgenů těžkého řetězce je sekundární přeskupení DHJH. Genový komplex DHJH kóduje Dμ protein, který se páruje s ψL řetězcem a přenáší signály nezbytné pro negativní selekci a zastavení vývoje B buňky. V případě 25
nefunkčnosti Dμ je pravděpodobné, že dojde k výměně přeskupeného segmentu kódující tento protein (Edry, Melamed, 2004). Úprava lehkého řetězce BCR při negativní selekci Ve stádiu nezralého BCR+ B lymfocytu reagují buňky s vlastními antigeny kostní dřeně (např. MHC I. třídy, DNA, erytrocyty) a čelí přísnému procesu negativní selekce eliminující škodlivé autoreaktivní klony. Existují tři mechanismy zamezující autoreaktivitě: úprava receptoru, apoptóza a anergie (Wang et al., 2007; Edry, Melamed, 2004). Podle současných studií je právě sekundární VLJL rekombinace převládajícím mechanismem negativní selekce (Wang et al., 2007). Ačkoliv exprese IgM na povrchu lymfocytu by měla být signálem pro alelickou exkluzi na homologním chromozomu kódující L řetězec, nedávné studie odhalily, že opak je pravdou. VLJL rekombinace může pokračovat a tím nahradit existující genový komplex VκJκ novým přeskupenímci na druhé κ alele nebo na λ lokusu (Constantinescu, Schlissel, 1997; Edry, Melamed, 2004). Důležitou úlohu hraje mikroprostředí kostní dřeně, které podporuje úpravu receptoru a tím chrání nezralé B lymfocyty od programované buněčné smrti, jak bylo demonstrováno na modelech myší (Sandel, Monroe, 1999; Sandel et al., 2001). Modely Ig-transgenních myší vystavující na svém povrchu autoreaktivní BCR, který váže s vysokou afinitou autoantigeny v primárních lymfoidních orgánech, spouští vysokoafinitní B buněčnou signalizaci, což vede k okamžité apoptóze autoreaktivní buňky (Melchers, 2006). Předpokládá se, že nízkoafinitní autoreaktivní B lymfocyty přítomné v Ig-transgenních myších, které nejsou schopné vyvolat okamžitou apoptózu, se dostávají do stavu anergie. Bylo prokázáno, že anergické B lymfocyty vyžadují permanentní přítomnost autoantigenů, pokud mají přetrvat v tomto stavu. Odstranění autoantigenních vlivů mění tyto buňky na naivní B lymfocyty (Melchers, 2006). Osud autoreaktivních buněk může být ovlivněn lokální hladinou BAFF (B cell activating factor), neboť zvýšená hladina BAFF podporuje přežití a diferenciaci autoreaktivních anergických buněk. Významná skupina slezinných anergických autoreaktivních klonů byla identifikována jako tranzientní T3 populace nezralých B lymfocytů (z angl. transitional) vyskytující se u Ig-transgenních myší (Allman, Pillai, 2008). Úprava BCR při pozitivní selekci Dozrávání B buněk je omezeno také procesem pozitivní selekce. Pozitivní selekční signály jsou přenášeny B buněčným receptorem a jeho signálními komponentami. Správné poskládání a exprese oligomerního BCR vyvolá určitou bazální fosforylaci, která je vyžadována pro pozitivní selekci. Výsledkem dynamické rovnováhy mezi pozitivními a negativními signálními regulačními molekulami jsou tonické signály. Signály, které jsou příliš silné nebo naopak příliš 26
slabé zablokují vývoj a aktivují úpravu receptoru, zatímco přiměřené signály podporují pozitivní selekci B buňky (Edry, Melamed, 2004).
2. 3. 2. Vývojová stádia B lymfocytu závislá na antigenu Klíčovou událostí ve vývoji B lymfocytu při humorální imunitní reakci závislé na T lymfocytech je setkání se specifickým antigenem, jenž vyvolá aktivaci naivních folikulárních B lymfocytů (B-2). Subpopulace B-2 buněk se nachází uvnitř folikulů sleziny, lymfatických uzlin, Peyerových plátů a mandlí. Další vývoj B lymfocytu je závislý na afinitě BCR receptoru a v nedávné době byl navržen model, podle nějž existují tři vývojové cesty, kterými se může oligoklonální skupina aktivovaných B buněk vydat (Benson et al., 2007) Okamžitou lokální produkci protilátek poskytují ty B lymfocyty vystavující na svém povrchu vysokoafinitní BCR. Osud buňky se vyvíjí extrafolikulární cestou vedoucí k tvorbě krátce žijících plazmatických buněk poskytující počáteční ochranu organismu (Benson et al., 2007). Pokud je vazba povrchového imunoglobulinu k antigenu nízkoafinitní nebo průměrná, dostává buňka signál pro tvorbu sekundárních lymfoidních folikulů se zárodečnými centry, kde dochází ke germinální (GC) reakci (Benson et al., 2007). Germinální reakce je charakteristická masivní klonální expanzí a dvěma důležitými mutačními a selekčními procesy: somatickou hypermutací (SHM, z angl. somatic hypermutation) a izotypovým přesmykem (CSR, z angl. class switched recombination). SHM a CSR vyžaduje přítomnost enzymu aktivací indukovaná cytidin deamináza (AID), jehož exprese je specifická pro B lymfocyty nacházející se v germinálních centrech. N-terminální doména proteinu AID je zodpovědná za SHM, zatímco C-terminální doména je klíčová pro CSR (Marantidou et al., 2010). Somatické hypermutace probíhají ve fázi centroblastu ve tmavé zóně germinálního centra a předchází izotopovému přesmyku. Selekcí hypermutovaných genů variabilní oblasti imunoglobulinového receptoru vzniká populace B buněk, která vykazuje vyšší afinitu k antigenu, jenž vyvolal aktivaci B lymfocytu. Mutované B lymfocyty vstupují do tmavé zóny GC a stávají se z nich centrocyty, které podstupují CSR. Izotypový přesmyk nevratně vyštěpuje konstantní segmenty v oblasti IgH lokusu, což vede k náhradě stávajících imunoglobulinových izotypů IgM a IgD za další Ig třídy (IgG, IgA, IgE) s odlišnými efektorovými vlastnostmi. Centrocyty soutěží o antigeny na povrchu folikulárních dendritických buněk (FDC) a o folikulární pomocné T lymfocyty (Tfh). B lymfocyty germinálního centra intenzivně migrují mezi tmavou a světlou zónou. Přežívají jen ty B buňky, jejíchž nově syntetizovaný receptor vykazuje zvýšenou specifitu ve srovnání s ostatními. Centrocyty s nežádoucími mutacemi obvykle postoupí apoptózu. Výsledkem neúspěšné 27
germinální reakce mohou být autoreaktivní B buňky (Tangye, Good, 2007; Schmidlin et al., 2009; Zenz et al., 2010). B lymfocyty, jejichž prvotní vazba k antigenu byla slabá, diferencují po úspěšné germinální reakci na klony buněk s vysokoafinitním BCR, které jsou směřovány do skupiny dlouho žijících plazmatických buněk, zatímco z nově vytvořených buněk s nižší afinitou k antigenu se diferencují dlouho žijící paměťové buňky (Benson et al., 2007). Průměrná vazba antigenu k BCR vyvolá tvorbu dlouho žijících plazmatických buněk, ale nedochází k produkci paměťových buněk (Benson et al., 2007). Tvorba efektivnějšího repertoáru v průběhu germinální reakce může být na druhé straně zhoubným procesem. Regulační mechanismus buňky je narušen, což se může projevit poruchou apoptózy nebo proliferací abnormálních klonů (Natkunam, 2007). Podle současných informací i aktivované extrafolikulární B buňky uplatňující se v T-nezávislé humorální reakci mohou exprimovat AID. Lidské slezinné B lymfocyty marginální zóny nesou mutace nukleotidů v oblastech vázajících antigen. Tato odlišná cesta vzniku SHM nezávislá na přítomnosti germinálních center není doposud zcela objasněná (Marantidou et al., 2010; Tangye, Good, 2007). 2. 4. Podskupiny B lymfocytů u člověka a inbredních kmenů myší V minulosti byla populace B lymfocytů považována za homogenní skupinu buněk, která se po specifickém antigenním setkání diferencuje na paměťové a plazmatické buňky. V posledních letech se však tento pohled výrazně změnil a B lymfocyty jsou chápány jako jednotlivé podskupiny buněk, z nichž každá vykonává specifické funkce. V současnosti jsou subpopulace B buněk děleny na základě několika kritérií, jež zahrnují umístění ve specifických oblastech lymfatických orgánů, funkční vlastnosti, expresi buněčných povrchových molekul a profil genové exprese (Chiorazzi, Ferrarini, 2008).
2. 4. 1. Dělení B lymfocytů u člověka Na základě anatomických kritérií jsou lidské zralé B lymfocyty rozlišovány na folikulární a extrafolikulární B buňky (Dono et al., 2003). Folikulární oblasti se dělí na zónu folikulárního pláště (FM, z angl. follicular mantle) a germinálního centra. Ve folikulárním plášti se vyskytují především panenské B buňky, které po stimulaci antigenem mohou být přijaty do germinálního centra, kde se tvoří paměťové a plazmatické buňky (Dono et al., 2003). 28
Za extrafolikulární oblast je považována marginální zóna (MZ, z angl. marginal zone) a jí ekvivalentní místa, např. subepiteliální oblast mandlí, subkapsulární oblast lymfatických uzlin a oblasti Peyerových plaků. B buňky MZ jsou většinou paměťové buňky (Dono et al., 2003).
2. 4. 2. Dělení B lymfocytů u inbredních kmenů myší Jiný přístup k dělení B lymfocytů se primárně používá u inbredních kmenů myší a je založen na členění B buněk na základě membránového fenotypu, anatomickém umístění, funkčních vlastností a struktuře BCR. Jsou rozlišovány dvě hlavní linie, B1 a B2 buňky (Dono et al., 2003; Chiorazzi, Ferrarini, 2008).
2. 4. 3. Charakteristika jednotlivých skupin B lymfocytů 2. 4. 3. 1. B-1 lymfocyty B-1 buňky jsou minoritní CD5+ subpopulace, která je doposud popsaná jen u inbredních kmenů myší, lidský protějšek nebyl doposud s jistotou identifikován. Jsou děleny na B-1a (CD5+) a B-1b (často CD5-) buňky, vyznačující se povrchovým fenotypem IgMhigh IgDlow CD23low. Osidlují peritoneální a pleurální dutinu, jež poskytuje specifické mikroprostředí ovlivňující jejich funkční vlastnosti. V periferních lymfoidních orgánech jsou zastoupeny jen slabě. B-1 buňky spontánně produkují přirozené/polyreaktivní převážně IgM autoprotilátky bez zjevné pomoci T lymfocytů. Jejich BCR repertoár je omezený a zárodečně kódovaný. Rozpoznávají především antigenní epitopy neproteinové povahy, hlavně sacharidy, lipidy a lipoproteiny. B-1a buňky představují důležitou složku vrozené imunity, B-1b buňky se uplatňují při adaptivních reakcích. Chrání organismus před počáteční infekcí různými mikroby a očišťují tělo od produktů katabolismu buněk a apoptózy. V současnosti je navrhováno, že B-1 lymfocyty migrují do sleziny, která jim poskytuje vhodné mikroprostředí pro jejich sebeobnovu (Chiorazzi, Ferrarini, 2008; Allman, Pillai, 2008; Rowley et al., 2007). Protože molekula CD5 může být exprimována na lidských CD5- buňkách po buněčné aktivaci bez přítomnosti T lymfocytů a naopak její exprese může být snížena po vystavení CD5+ B buněk exogenním cytokinům (např. IL-1, IL-2) stejně jako virům Epstein-Baarové (EBV) in vitro, je stabilita tohoto markeru in vivo nejasným ukazatelem lidské B-1 linie. Bylo zjištěno, že lidské folikulární plášťové buňky mandlí konstitutivně exprimují CD5, sdílí mnoho význačných rysů panenských B buněk a využívají nemutované imunoglobulinové geny pro těžký řetězec (IgVH), proto by mohly být považovány za ekvivalent myších B-1 lymfocytů (Dono et al., 2003; Chiorazzi, Ferrarini, 2008; Ghia et al., 2007). 29
Mimoto bylo zjištěno, že velká část lidských B buněk majících fenotyp folikulárních plášťových buněk se vyskytuje v krvi zdravých jedinců, nese nemutované geny pro variabilní oblast těžkých řetězců imunoglobulinů (IgVH), ale produkuje IgM protilátky, které nejsou polyreaktivní, což je základní vlastnost B-1 buněk myší (Chiorazzi, Ferrarini, 2008). 2. 4. 3. 2. B-2 lymfocyty Na rozdíl od B-1 buněk, konvenční B-2 lymfocyty vyskytující se u inbredních kmenů myší postrádají povrchovou molekulu CD5. Nachází se primárně v pevných lymfatických orgánech (slezina, lymfatické uzliny nebo Peyerovy plaky) mezi nimiž, prostřednictvím krve nebo lymfy, opakovaně recirkulují. Jedná se o typické B lymfocyty uplatňující se v protilátkové odpovědi na T-závislé antigeny. Skupina B-2 lymfocytů je charakterizována na základě svých funkcí, proto B-2 buňky mohou vykazovat odlišný imunofenotyp v závislosti na konkrétní vývojové fázi, ve které se B lymfocyt nachází (Allman, Pillai, 2008; Chiorazzi, Ferrarini, 2008). 2. 4. 3. 3. B lymfocyty marginální zóny B lymfocyty marginální zóny zahrnují skupinu buněk exprimující na svém povrchu charakteristický imunofenotyp IgMhigh IgDlow CD23- jak s mutovanými tak i s nemutovanými IgVH genovými segmenty. U lidí ani u myší nenesou molekulu CD5 (Chiorazzi, Ferrarini, 2008). U myší primárně slouží jako první linie obrany proti krví neseným patogenům, které obsahují lipopolysacharidy způsobem nezávislým na T lymfocytech, čímž dochází k terminální diferenciaci v krátce žijící plazmatické buňky (Chiorazzi, Ferrarini, 2008). Nicméně, v současné době se spekuluje, že buňky MZ po stimulaci sacharidy opouzdřených bakterií a virů mohou diferencovat v paměťové a plazmatické buňky mimo klasická GC. U těchto lymfocytů nemusí být vyvolány mutace v IgVH oblastech. B buňky MZ ani u lidí ani u myší nevyjadřují molekulu CD5 (Chiorazzi, Ferrarini, 2008; Allman, Pillai, 2008; Chiorazzi et al., 2005). Slezinné B lymfocyty marginální zóny u lidí i myší exprimují vysokou hladinu molekul nutných pro prezentaci antigenu a aktivaci T lymfocytů, a tak často zprostředkují také T-závislé imunitní reakce, kdy dochází k CSR a potenciálně i ke vzniku somaticky mutovaných protilátek (Allman, Pillai, 2008). Podle současného modelu, prekurzory pro vznik lymfocytů marginální zóny jsou recirkulující tranzientní a folikulární B buňky (Allman, Pillai, 2008). Protože B lymfocyty MZ vykazují poměrně nízký signalizační práh, může být infekčními činidly podpořena klonální expanze polyreaktivních B lymfocytů se zkříženou reaktivitou (Chiorazzi, Ferrarini, 2008). 30
2. 4. 3. 4. Cirkulující „paměťové“ IgM+ IgD+ CD27+ B lymfocyty Lidské B lymfocyty mohou být děleny do podskupin na základě exprese IgM, IgD a molekuly CD27. Protože molekula CD27 je obecně přijímána jako povrchový marker paměťových lidských B buněk, lze rozlišit zralé naivní B lymfocyty (IgD+ CD27-) od paměťových buněk (IgD- CD27+). Ještě jedna podskupina B buněk se vyskytuje v periferní krvi, a to IgMhigh IgDlow CD27+, která často nese mutované IgV geny ale neprodělala izotypový přesmyk. Tyto buňky jsou považovány za IgM paměťové buňky, které prodělaly proces somatické hypermutace extrafolikulární vývojovou cestou bez pomoci T lymfocytů (Klein, 2008; Tangye, Good, 2007). Tento závěr je podpořen studiemi pacientů s genetickými vadami v humorální imunitě, jako jsou hyper-IgM (HIGM) syndrom, X-vázaná lymfoproliferativní nemoc (XLP) nebo běžná variabilní imunodeficience (CVID). B lymfocyty pacientů s HIGM neprochází CSR a v důsledku toho nemohou produkovat IgG, IgA a IgE protilátky - pravděpodobně díky defektní tvorbě germinálních center. Mutační hladina variabilních Ig genů
IgMhigh IgDlow CD27+ buněk u
jedinců s HIGM, XLP a CVID je přibližně stejná s fenotypově shodnými B buňky izolovanými od zdravých dárců (Tangye, Good, 2007). Existuje však alternativní hypotéza, která je podpořena četnými studiemi. U velkého počtu pacientů s těmito imunodeficiencemi byla objevena ne úplně vyvinutá GC nebo jim podobné struktury. Také bylo zjištěno, že germinální centra se mohou tvořit i při odpovědí na TI antigeny, nicméně jsou jen krátkodobá a menší než GC vzniklá v TD reakcích. Protože SHM předchází CSR, může dojít k somatickým hypermutacím s nižší četností, ale nedochází již izotypovému přesmyku, neboť ve fázi centrocytu se germinální centrum prudce zmenší. V současnosti je tato podskupina B lymfocytů považována za cirkulující ekvivalent B lymfocytů marginální zóny (Chiorazzi, Ferrarini, 2008; Tangye, Good, 2007). 2. 4. 3. 5. Tranzientní B lymfocyty Subpopulace myších tranzientních (T, z angl. transitional) B lymfocytů je poměrně dobře charakterizována, lidský protějšek však už méně (Chiorazzi, Ferrarini, 2008). Jakmile B lymfocyty získají způsobilost opustit mikroprostředí kostní dřeně, stávají se tranzientními buňkami a vstupují do periferní cirkulace. Prostřednictvím krve směřují do sleziny, kde postupují červenou pulpou do míst marginální zóny až do vnější oblasti PALS a později do primárních lymfatických folikulů (Chung et al., 2003). Slezinné tranzientní B lymfocyty myší se rozlišují pomocí povrchového fenotypu, funkčních vlastností a také podle místa výskytu ve slezině, která jim poskytuje vhodné podmínky pro závěrečné fáze zrání. Existuje tedy tranzientní typ 1 (T1), typ T2 a nedělící se populace 31
označována jako T3 lymfocyty. T1 lymfocyty jsou situovány v zóně PALS, kdežto následné vývojové stádium - T2 - snadno migruje do primárních folikulů a nepřetržitě recirkuluje mezi všemi lymfoidními tkáněmi (Chung et al., 2003; Carsetti et al., 2004). U člověka je ekvivalent k myším T1 lymfocytům popsán fenotypem CD19+ CD24high CD38high CD27 a také exprimuje molekulu CD5 spolu s CD10. Buňky analogické k T2 populaci myší nebyly doposud zcela popsány (Chiorazzi, Ferrarini, 2008). Tranzientní lymfocyty u myší i lidí nesou nemutované IgVH genové segmenty, ale jen u myší byly prokázány různé stupně autoreaktivity (Chiorazzi, Ferrarini, 2008).
32
Obr. 4. Schéma fyziologického vývoje B lymfocytů.
33
3. Chronická lymfocytární leukémie Chronická lymfocytární leukémie je nejběžnější formou leukémie dospělých v Evropě a Severní Americe, kde představuje
20-30 % všech leukémií. Její incidence činí v Evropě
3/100 000 a v USA 3,5/100 000 (Dighiero, Hamblin, 2008; Adam et al., 2008). V Koreji a Číně se objevuje jen vzácně, v Japonsku se prakticky nevyskytuje (Ghia et al., 2007a). CLL se jen výjimečně projeví u osob mladších 50 let, ale po překročení tohoto věku její výskyt rapidně stoupá. Dvakrát častěji postihuje muže než ženy (Dighiero, Hamblin, 2008; Zenz et al., 2010). Medián věku stanovení diagnózy je 65 let, i když 5-10 % případů je diagnostikováno ve věku mladším než 50 let (Adam et al., 2008). U přibližně 5-10 % případů CLL existuje familiární náchylnost. Příbuzní pacientů s CLL vykazují dvakrát až sedmkrát vyšší riziko ve srovnání s ostatní populací (Ghia et al., 2007a). CLL je velmi heterogenní lymfoproliferativní onemocnění, jehož podstatou je vytrvalá monoklonální akumulace maligně transformovaných vyzrálých dlouhožijících CD5+ B lymfocytů s charakteristickým imunofenotypem (Adam et al., 2008; Caligaris-Cappio, Ghia, 2007). Hranice pro diagnózu CLL je založena na koncentraci lymfocytů, která musí přesáhnout hodnotu 5∙109/l (Dighiero, Hamblin, 2008; Ghia et al., 2007). 3. 1. Biologické podskupiny CLL Po provedení analýzy mutací imunoglobulinových genů, bylo zjištěno, že u více než 50 % případů CLL jsou přítomny mutace v genech pro variabilní těžké řetězce. Pacienti, jejichž podobnost IgVH genů se zárodečnou sekvencí je větší než 98 %, nesou nemutované Ig geny (UCLL). Naproti tomu pacienti se sekvenční homologií menší než 98 % mají mutované IgVH geny (M-CLL). Z hlediska klinického průběhu nemoci a dalších biologických parametrů tvoří pacienti s mutovanými a nemutovanými IgVH geny dvě biologicky zcela odlišné skupiny (Ghia et al., 2007a; Chiorazzi et al., 2005). Průběh U-CLL je agresivnější a medián přežití se pohybuje kolem 8 let, zatímco M-CLL vykazuje indolentní formu nemoci a medián přežití je 24 let. Výjimku mezi M-CLL představují pacienti se subgenem IgVH3-21+, jejichž prognóza je horší než u typických M-CLL případů
(Ghia et al., 2007a; Zenz et al., 2010). Srovnání délky přežití obou skupin CLL pacientů je na obrázku 5.
34
Obr. 5. Kaplan-Meierovy křivky přežití srovnávající CLL pacienty s mutovanými a nemutovanýmu IgVH geny. Medián přežití U-CLL pacientů je 117 měsíců, zatímco medián přežití pro pacienty s M-CLL je 293 měsíců. P = 0,001 (Hamblin et al., 1999, upraveno).
3. 2. Prognostické markery CLL Klinické stádium nemoci je důležité pro stanovení prognózy pacientů s CLL. Již 30 let se používají dva stážovací systémy, podle Raie a podle Bineta. Oba systémy umožňují rozdělit jedince s CLL do tří hlavních prognostických kategorií: nízké, střední a vysoké riziko. V současnosti však existují další prognosticky významné markery, které i v časných stádiích pomáhají odlišit pacienty s rychlým vývojem nemoci od pacientů pomalu progredujících. Kromě již zmíněného mutačního stavu IgVH genů jsou důležitou součástí prognostifikace CLL cytogenetické markery, jejichž použití přišlo až s technikou interfázní fluorescenční in situ hybridizace (I-FISH). Chromozomální odchylky lze nalézt až u 80 % případů s CLL (Ghia et al., 2007a; Ghia et al., 2008). Nejčastější genomové aberace a jejich prognostický význam jsou uvedeny v tabulce č. 1. Důležitým identifikačním znakem CLL je také imunofenotypová analýza monoklonálních buněk. Imunofenotyp CLL lymfocytů je typický expresí markeru CD19, nízkou hladinou molekuly CD20, vysokou expresí molekuly CD5 spolu s CD23. CLL B lymfocyty také nesou nízkou úroveň povrchových imunoglobulinů, zejména IgM a IgD, jen výjimečně IgG nebo IgA. Významnými
povrchovými
markery,
jenž 35
souvisí
s
prognózou
onemocnění,
jsou
transmembránový glykoprotein CD38 a cytoplazmatický protein ZAP-70 (δ-asociovaný protein 70). Přítomnost molekuly CD38 i intracelulární exprese ZAP-70 je u CLL pacientů asociována s U-CLL, a je chápána jako nepříznivý prognostický faktor (Ghia et al., 2007a). Pro prognózu CLL jsou také nepostradatelné klinické a biochemické markery. Tab.
1:
Četnost
výskytu
genetických
změn
a
jejich
prognóza
u
nemocných
s nově
diagnostikovanou CLL (detekce metodami molekulární cytogenetiky). Genetická změna
Lokalizace genů
Výskyt
Prognóza
del 13q14 del 11q22-23 del 17p13 +12
miR15, miR16, gen RB1 gen ATM gen TP53
>50% případů 10-20 % případů <10 % případů 10-20 % případů
dobrá špatná nejhorší střední
Delece 13q14 obsahuje 2 mikro-RNA geny, které regulují funkci řady genů. Také zde leží tumorsupresorový gen RB1 (gen retinoblastomu), který je deletován u 1/3 pacientů s CLL. Deletovaná oblast 11q22-23 obsahuje mnoho genů, nejdůležitějším z nich je ATM (ataxia teleangiectasia mutated). Delece 17p13 zasahuje úsek důležitého tumor-supresorového genu TP53. Trisomie chromozomu 12 duplikuje mnoho důležitých genů (Ghia et al., 2007; Papajík et al., 2006; upraveno podle Papajík et al., 2006).
3. 3. Statika versus dynamika CLL Vzhledem k poměrně pomalému klinickému průběhu chronické lymfocytární leukémie bylo v minulosti obecně přijímáno dogma charakterizující CLL jako statickou chorobu vyplývající z akumulace dlouhožijících B lymfocytů s poruchou apoptózy (Messmer et al., 2005; Ghia, Calligaris-Cappio, 2006). Nicméně, v současnosti se na CLL pohlíží jako na velmi dynamický proces, ve kterém buňky jak proliferují tak podstupují apoptózu, a to v různém poměru u každého jednotlivého pacienta (Ghia, Calligaris-Cappio, 2006). S použitím techniky využívající těžkou vodu (D2O) pro označení DNA nově vzniklých buněk in vivo, bylo prokázáno, že u většiny pacientů s CLL probíhá relativně aktivní buněčná výměna. Tento buněčný obrat se odhaduje mezi 1-10 % za týden, z čehož vyplývá, že u CLL nedochází jen k buněčnému dělení, ale také ke spontánní apoptóze (Keating et al., 2003). Délka telomer může sloužit jako indikátor replikační aktivity každé buňky. Analýza délky telomer u zdravých jedinců a pacientů s CLL ukázala, že leukemické buňky mají mnohem kratší telomery, což svědčí o významném počtu buněčných dělení uvnitř leukemického klonu (Damle et al., 2004; Ghia, Caligaris-Cappio, 2006).
36
Jak analýza délky telomer, tak in vivo měření kinetiky buněk ukázalo, že případy s nemutovanými IgVH geny a pacienti s aktivní chorobou, vykazují rychlejší proliferaci, s čímž souvisí větší množství genetických poruch a vznik nových klonálních variant CLL buněk. Tato skutečnost také může vysvětlit agresivnější povahu nemoci a horší prognózu (Ghia, CaligarisCappio, 2006). Naproti tomu pacienti s mutovanými Ig variabilními geny mají sice proměnlivý ale celkově nižší počet dělení. Tato skutečnost pravděpodobně souvisí s menší citlivostí mutovaných CLL buněk k antigenu, což může vést k anergii a v důsledku toho také ke snížené schopnosti proliferace. Menší proliferační aktivita znamená menší poškození genomu, a tak tito pacienti mají převážně dobrou prognózu a delší medián přežití (Ghia, Caligaris-Cappio, 2006). 3. 4. Monoklonální B lymfocytóza Monoklonální B lymfocytóza (MBL) je charakterizována expanzí monoklonálních cirkulujících B lymfocytů s charakteristickým imunofenotypem (< 5∙109/l) u jinak zdravých jedinců (Nieto et al., 2009). Monoklonální CD5+ B lymfocyty s fenotypem blízce se podobajícím CLL buňkám byly nalezeny u významného počtu zdravých osob a dokonce s větší četností u příbuzných pacientů s CLL, což naznačuje společnou genetickou predispozici. Připadá proto v úvahu, že tato populace buněk může reprezentovat rané stádium chronické lymfocytární leukémie (Rawstron et al., 2002a; Rawstron et al., 2002). Ve většině případů nesou monoklonální B lymfocyty mutované BCR, které využívají stejné IgVH geny jako M-CLL, a často jsou vidět genetické poruchy typické pro CLL (např. delece 13q14). To ukazuje na skutečnost, že výskyt monoklonální expanze B lymfocytů nesouvisí jednoduše se zvyšujícím se věkem - běžný aspekt stárnoucího imunitního systému, jehož antigenní repertoár se zužuje - ale tyto klony mohou získat počáteční genetickou poruchu, která je známkou přednádorové prekurzorové buňky (Ghia et al., 2004; Zenz et al., 2010; Ghia, Caligaris-Cappio, 2006) Některé studie však udávají, že IgVH geny, které nesou MBL buňky, nejsou typické pro CLL (Zenz et al., 2010). V současnosti není jasné, zda opakovaná expozice antigenu může být zodpovědná za vznik MBL a predisponovat tyto buňky k následné leukemické transformaci, nebo zda tyto cirkulující klony již nesou určitý iniciační faktor, díky kterému se stanou náchylné k leukemické expanzi během odpovídající interakci s antigenem. Velmi významnou roli také hrají podněty z mikroprostředí (Ghia, Caligaris-Cappio, 2006). 37
3. 5. Léčba CLL U každého pacienta s CLL je nutno zhodnotit, kdy je nejvhodnější zahájit počátek terapie. Jak bylo prokázáno u řady pacientů, brzké zahájení léčby nepřináší prospěch a mnoho z těchto pacientů nebude potřebovat léčbu vůbec. Jejich forma CLL bude indolentní a zahájení terapie nebude mít vliv na délku života. Naopak existují pacienti, u nichž je nutné zahájit léčbu neprodleně, a to z důvodů velmi agresivní formy, která je provázena řadou komplikací. Podle očekávané odolnosti či senzitivitě pacienta se volí konkrétní látky pro léčbu. Nové účinné imunochemoterapeutické postupy pomáhají u pacientů s CLL dosáhnout hlavního cíle, kompletní remise. V současnosti lze terapií navodit dlouhotrvající kompletní remisi, a to i na molekulární úrovni (molekulární remise), s čímž souvisí poměrně dlouhá doba normálního kvalitního života. V pokročilé fázi nemoci se klíčovým faktorem pro správnou volbu terapeutického postupu stává odpověď pacienta na předchozí terapii a délka vyvolané remise (Kozák, 2008). CLL je stále nevyléčitelnou nemocí, potenciální možností kompletního vyléčení je alogenní transplantace krvetvorných kmenových buněk, ta je však zatížena vysokým věkem pacientů, posttransplantační mortalitou a omezenou dostupností dárců (Kozák, 2008).
38
4. Buněčný původ CLL Chronická lymfocytární leukémie je charakterizována monoklonální expanzí malých zrale vypadajících aktivovaných B lymfocytů s pozoruhodně homogenním fenotypem CD5+ CD23+ CD27+ smIglow, které se akumulují v krvi, kostní dření a lymfatických orgánech (CaligarisCappio, Ghia, 2007; Chiorazzi, Ferrarini, 2008). Většina CLL cirkulujících nádorových buněk je inertních a zastavených v G0/brzké G1 fázi buněčného cyklu (Zenz et al., 2010; Caligaris-Cappio, Ghia, 2007), nicméně každý den aktivně proliferuje 0,1-1 % klonů CLL buněk a tato aktivní obnova nádorové populace je předpokladem pro vznik a kumulaci nových cytogenetických poruch, které mají vliv na agresivitu klonální expanze a další klinický rozvoj nemoci (Chiorazzi et al., 2005; Papajík et al., 2006). Mezi další význačné vlastnosti CLL buněk se řadí pozoruhodně homogenní profil genové exprese a exprese AID (Caligaris-Cappio, Ghia, 2007; Keating et al., 2003). Do patogeneze CLL jsou zapojeny jak vnější faktory (podněty z mikroprostředí a setkání s antigenem), tak vnitřní faktory (genetické nebo epigenetické), které jsou klíčové pro transformaci, progresi a evoluci CLL (Zenz et al., 2010). 4. 1. Historický pohled na identifikaci CLL buněk Na počátku 90. let 20. století bylo pohlíženo na CLL buňky jako na jednotný celek skládající se z naivních antigenně nezkušených B lymfocytů, které cirkulují v periferii v klidovém stavu. Tento předpoklad byl v souladu s jejich vzhledem (malé lymfocyty s velkým jádrem) a membránovou expresí IgM a IgD, jenž jsou obvykle znakem naivních B buněk (Damle et al., 2002). V roce 1999 se tento pohled výrazně změnil díky analýze imunoglobulinových genů. Skupiny vedené Hamblinem, Stevensonem a Chiorazzim nezávisle na sobě prokázali, že CLL buňky lze rozlišovat na základě přítomnosti, resp. nepřítomnosti somatických mutací v oblasti IgVH genových segmentů. I když každá CLL nádorová populace buněk nesla jiné seskupení ve variabilní oblasti těžkých řetězců imunoglobulinů, uvnitř obou podskupin existovaly společné vlastnosti, které určovaly chování leukemické populace (Ghia et al., 2008; Stevenson, CaligarisCappio, 2004). Na základě této analýzy a porovnáním vývoje normálních B lymfocytů s maligními B lymfocyty mohou být CLL buňky s nemutovaným stavem odvozeny z naivních B lymfocytů, zatímco mutované CLL B lymfocyty mohou pocházet z paměťových buněk (Stevenson, Caligaris-Cappio, 2004). 39
Překvapující výsledky přinesla analýza expresního profilu
provedená Kleinem a
spolupracovníky v roce 2001. Tato skupina srovnávala profily genové exprese nejdůležitějších subpopulací lidských B lymfocytů (buňky nezávislé na GC - CD5+ B lymfoctyty, naivní B buňky, centroblasty, centrocyty a paměťové B lymfocyty) s oběma skupinami CLL buněk. Závěrem jejich práce bylo zjištění, že fenotyp obou skupin CLL lymfocytů je homogenní a blízce se podobá paměťovým buňkám. Společný fenotypový vzor byl identifikován na základě exprese 12 000 genů, kde jen 23 genů bylo exprimováno odlišně v závislosti na mutačním stavu (Klein et al., 2001). V současnosti jsou CLL buňky považovány za aktivované a antigenně zkušené B lymfocyty (Ghia, Caligaris-Cappio, 2006). 4. 2. Antigenně zkušené CLL buňky Na základě přítomnosti somatických hyperrmutací v oblastech Ig variabilních genů u poloviny pacientů se předpokládá, že se prekurzor leukemického CLL klonu musel setkat s antigenem, který spustil SHM uvnitř germinálního centra lymfatického folikulu. I přesto, že druhou polovinu pacientů představují případy s nemutovaným stavem IgVH genů, podle současných výsledků studií, se i tyto CLL buňky setkaly s antigenem (Ghia, Caligaris-Cappio, 2006). Existuje několik důkazů podporující hypotézu, že všechny CLL buňky, bez ohledu na mutační stav, jsou antigenně zkušené. Za prvé, protože nemutované případy vykazují náchylnost v použití IgVH segmentů (např. subgen IGHV1-69), je pravděpodobné, že i v tomto případě hraje selekce antigenem úlohu při vzniku CLL. Za druhé, obě skupiny CLL vyjadřují společný aktivovaný fenotyp, který je velmi podobný antigenně-zkušeným B lymfocytům. Typická je přítomnost aktivačních markerů – CD23, CD25, CD69 a CD71. Srovnání exprese těchto molekul na povrchu CLL buněk a normálních CD5+ B lymfocytů je na obrázku 6. A nakonec, vlastnosti BCR na povrchu CLL buněk se významně podobají běžným B lymfocytům po aktivaci antigenem (Ghia, Caligaris-Cappio, 2006; Damle et al., 2002; Stevenson, Caligaris-Cappio, 2004).
40
Obr. 6. Srovnání exprese povrchových membránových markerů u normálních CD5+ B lymfocytů a CLL buněk. CLL buňky exprimují významně vyšší hladiny membránových markerů CD27, CD39, CD23, CD25, CD69 a CD71 než zdravé CD5+ B lymfocyty. P < 0,0001 (Damle et al., 2002, upraveno).
4. 3. Interklonální a intraklonální rozmanitost CLL buněk Navzdory výrazně stejnorodému povrchovému fenotypu a skoro totožnému profilu genové exprese CLL buněk, maligní B lymfocyty vykazují výraznou interklonální rozmanitost. Tato různorodost se odráží v jejich molekulárních a funkčních vlastnostech (Caligaris-Cappio, Ghia, 2007). Na molekulární úrovni, nepřítomnost somatických mutací IgVH genů, exprese molekul CD38 a ZAP-70 přináší agresivnější průběh nemoci, kdežto výskyt somaticky mutovaných IgVH genů, absence molekul CD38 a ZAP-70 vede k méně agresivní formě choroby (Caligaris-Cappio, Ghia, 2007). CLL interklonální heterogenita byla prokázána také na funkční rovině, o čemž svědčí schopnost resp. neschopnost CLL buněk reagovat na podněty prostřednictvím různých buněčných povrchových molekul, např. BCR, CD5 a CD40 (Caligaris-Cappio, Ghia, 2007). Navíc, každý individuální CLL klon může do určité míry vykazovat intraklonální rozmanitost, založenou na expresi intracelulárních nebo membránových molekul v závislosti na anatomickém umístění, např. periferní leukemické buňky v krvi nebo buňky sídlící v kostní dřeni či lymfatických uzlinách (Caligaris-Cappio, Ghia, 2007). Přítomnost nebo nepřítomnost molekuly CD38 je jasným příkladem. Vedle maligních CD38+ a CD38- CLL buněk, existuje také populace, v rámci stejného klonu, která vykazuje variabilní poměr CD38+ a CD38- buněk. Zdá se, že CD38+ podskupina určitého klonu je častěji zastoupena v kostní dřeni ve srovnání s buňkami vyskytující se v periferní krvi. Prakticky jakékoliv množství molekuly CD38 na povrchu leukemických leukocytů vede k progresivnější nemoci a špatné prognóze (Caligaris-Cappio, Ghia, 2007; Ghia et al., 2003).
41
4. 4. B buněčný receptor CLL buněk Fyziologicky nese každý B lymfocyt na svém povrchu odlišný BCR. Pestrost kombinací genových segmentů imunoglobulinových řetězců je dále zvýšena díky zařazování náhodných nukleotidů do kódujících spojů a při procesu somatických hypermutací během germinální reakce (Zenz et al., 2010). Na rozdíl od zdravé B lymfocytární populace, všechny CLL buňky exprimují na svém povrchu monoklonální B buněčný receptor, a tak panuje názor, že BCR hraje klíčovou úlohu při výběru a přežití leukemických buněk (Stevenson, Caligaris-Cappio, 2004). Maligní B buňky přednostně využívají určité Ig variabilní oblasti jen těžkého řetězce nebo těžkého i lehkého řetězce. Více než 20 % CLL případů exprimuje vysoce homologní („stereotypní“) oblast určující komplementaritu imunoglobulinu 3 (CDR3) čítající téměř 50 různých „stereotypních“ skupin a přibližně 1 % nese prakticky identické Ig (Murio, CaligarisCappio, 2008; Ghia, Caligaris-Cappio, 2006; Zenz et al., 2010; Ghia et al., 2007). Tyto poznatky jsou velmi překvapující, neboť pravděpodobnost výskytu strukturně velmi podobných BCR u dvou CLL případů je 1/ více než 1 000 000 případů (Chiorazzi et al., 2005; Zenz et al., 2010). Jelikož podobnost v užívání specifických IgVH genů byla prokázána u obou podskupin CLL, předpokládá se, že antigenní selekce může nastat jak u nemutovaných, tak u mutovaných nádorových buněk. Některé případy pacientů s CLL exprimujících podobné Ig přeskupení subgenů trvale vykazují agresivní klinický průběh nemoci, a proto zřejmě antigenní stimulace může být nepříznivým faktorem v přirozeném vývoji nemoci (Ghia, Caligaris-Cappio, 2006). 4. 5. Problém antigenní stimulace Přestože všechny dostupné důkazy naznačují, že specifické rozpoznání antigenem a případná stimulace B lymfocytu je klíčová pro transformaci v leukemickou buňku, doposud nebyla povaha tohoto antigenu s jistotou určena (Stamatopoulos et al., 2007). Charakteristickou vlastností nemutované CLL buňky je produkce auto/polyreaktivních BCRs/mAbs vážící se na autoantigeny a mnoho nevlastních antigenů, které nesdílí zjevné strukturní podobnosti. Tato vazba je často nízkoafinitní. Naproti tomu, mutované CLL buňky, jejichž BCR má mnohem omezenější antigen vázající oblasti, syntetizují oligo/monoreaktivní BCRs/mAbs (Chiorazzi, Ferrarini, 2008). Vzhledem k tomu, že přibližně polovina případů CLL produkuje autoreaktivní protilátky, jedním z možných antigenů zapojených do leukemogeneze jsou autoantigeny. Leukemické buňky s mutovanými IgVH geny mohou prodělat proces somatické hypermutace mimo GC bez pomoci T lymfocytů, čímž se autoreaktivní a/nebo polyreaktivní BCR změní, a to buď ve 42
prospěch větší specifičnosti pro konkrétní autoantigen nebo směrem k vymizení autoreaktivního potenciálu (Hervé et al., 2005; Ghia et al., 2008; Chiorazzi et al., 2005). S tím také úzce souvisí výskyt mutovaných CLL buněk ve stavu necitlivosti, jež připomíná anergii vyskytující se u běžných B lymfocytů. Naproti tomu nemutované CLL lymfocyty jsou velmi citlivé k zapojení prostřednictvím BCR, kde převládající signály umožňují buď expanzi či přežití leukemické buňky. Tato skutečnost koreluje s průběhem nemoci (Stevenson, Caligaris-Cappio, 2004; Chiorazzi et al., 2005; Ghia, Caligaris-Cappio, 2006; Ghia et al., 2008). Nicméně, jak experimentální tak epidemiologická data ukazují spíše na působení nevlastních antigenů, a to zejména u IgVH3-21+ pacientů (Caligaris-Cappio, Ghia, 2007). Eventuálně, superantigeny (např. staphylococcal protein A) mohou být také zapojeny do stimulace B lymfocytů, jak ukazují některé případy pacientů s CLL s odlišnějším přeskupením IgVH genů (Caligaris-Cappio, Ghia, 2007).
4. 6. Úloha mikroprostředí Ačkoliv genetické poruchy mohou být důležité pro predispozici leukemického B lymfocytu k prodloužení jeho životnosti in vivo, CLL buňky podstoupí apoptózu, jakmile jsou kultivovány in vitro. Proto, in vivo akumulace leukemických buněk musí být zvýhodněna dalšími faktory, které pravděpodobně pocházejí z mikroprostředí (Ghia et al., 2008). Buňky CLL si zachovávají schopnost reagovat na vybrané vnější podněty, které jim udělují růstovou výhodu a prodlužují přežití. Za potenciálně nejdůležitější buňky indukující proliferaci a chránící leukemické buňky od spontánní apoptózy, se jeví stromální buňky a T lymfocyty, ale i jiné druhotné buňky (Ghia et al., 2008). Lymfatické tkáně jsou považovány za skutečné místo antigenní stimulace leukemických buněk. Studium poškozených lymfatických tkání vedlo k objevení roztroušených seskupení velkých dělících se leukemických lymfocytů, které vytváří uzlíkovité oblasti v lymfatických uzlinách, kostní dřeni a bílé pulpě sleziny. Předpokládá se, že tato proliferační centra (PC) nebo také pseudofolikuly (PF) jsou proliferačním rezervoárem nemoci. Velké množství normálních aktivovaných CD3+ CD4+ CD40L+ T lymfocytů je přítomno v blízkosti proliferujících CLL buněk, které produkují chemoatraktanty přitahující tyto T buňky. Kromě krátkodobé antiapoptické pomoci (např. Survivin) může CD40 stimulace vyvolat proliferaci, selekci a aktivaci nádorových buněk, o čemž svědčí zvýšená exprese několika molekul na buněčném povrchu (např. CD80, CD95), stejně tak produkce chemokinů (např. CCL17, CCL22) nebo regulátorů apoptózy (Ghia, Caligaris-Cappio, 2006; Patten et al., 2008). Nakonec, 43
stromální buňky kostní dřeně nebo tzv. nurse-like buňky v periferní krvi interagují s CLL buňkami a tím jim poskytují signály pro postupnou akumulaci v periferii a prodloužení životnosti (Caligaris-Cappio, Ghia, 2007; Ghia et al., 2008). Proliferační centra jsou charakteristická jen pro CLL mezi všemi B buněčnými zhoubnými nádory a struktury podobné proliferačním centrům jsou pozorovány jen u chronicky zánětlivých onemocnění (roztroušená mozkomíšní skleróza nebo revmatoidní artritida), což posiluje myšlenku nepřetržité stimulace CLL buněk a interakce s antigeny (autoantigeny?) (CalligarisCappio, Ghia, 2007). V současnosti však panuje hypotéza, že úloha mikroprostředí je mnohem důležitější pro progresi M-CLL, kdežto u U-CLL je tento faktor méně podstatný a rozvoj onemocnění spíše závisí na přítomnosti a množství genetických změn vzniklých uvnitř nádorové populace (Papajík et al., 2006).
4. 7. Fyziologický protějšek CLL Na základě dostupných výsledků studií se předpokládá, že normální lidský B buněčný ekvivalent CLL buněk nese na svém povrchu transmembránový protein CD5, a to buď konstitutivně nebo následkem stimulace spolu s molekulami CD23 a CD27, což svědčí o in vivo aktivaci. Typická je nízká hladina imunoglobulinů IgM a IgD (Chiorazzi, Ferrarini, 2008). Zejména existence interklonální heterogenity CLL buněk odvolává na existenci dvou B buněčných prekurzorů. Nicméně, tento závěr nelze jednoznačně učinit pouze z fenotypové analýzy, a to v důsledku existence některých povrchových molekul, jejichž exprese se může výrazně měnit po aktivaci antigenem nebo v různých fázích zrání u normálního B lymfocytu (např. CD5 a CD38) (Chiorazzi, Ferrarini, 2008). Na druhé straně, výsledky analýzy profilů genové exprese obou podskupin CLL pacientů dává podnět k myšlence, že existuje společný buněčný prekurzor (Rosenwald et al., 2001; Klein et al., 2001). Přiřazení biologického protějšku CLL buněk není jednoduché, jelikož soubor membránových povrchových struktur CLL buněk neodpovídá žádné konkrétní normální lidské B buněčné podskupině. I přesto některé funkční vlastnosti mohou pomoci vymezit určitou subpopulaci zdravých B lymfocytů (Chiorazzi, Ferrarini, 2008). Schématický přehled potenciálních fyziologických protějšků CLL buněk je na obrázku 7.
44
4. 7. 1. Fyziologický protějšek U-CLL Buňky CLL s nemutovanými IgVH geny překvapivě nesou profil genové exprese, který se víc přibližuje post-GC paměťovým buňkám než naivním nebo CD5+ B lymfocytům, a proto mohou být odvozeny z antigenně-zkušenných B lymfocytů, které získaly vlastnosti paměťových buněk (Klein et al., 2001; Zenz et al., 2010). Zdá se, že antigenní specifita nemutovaných CLL buněk zahrnuje jak TI tak TD (auto) antigeny. V případě T-závislých antigenů existuje několik údajů, které říkají, že autoreaktivní B lymfocyty nemusí projít celou germinální reakcí. Tyto buňky jsou chronicky stimulovány díky jejich autoreaktivitě a mohou získat vlastnosti antigenně zkušených paměťových B lymfocytů bez podstoupení GC reakce. Ale mohou také předcházet apoptóze v důsledku získání primárních transformačních událostí. Konkrétní subpopulace normálních B lymfocytů je už méně jasná (Zenz et al., 2010) a v současnosti existuje několik teorií o původu U-CLL. 4. 7. 1. 1. Lidský ekvivalent k B-1 lymfocytům inbredních kmenů myší CLL buňky u pacientů s agresivnějším typem nemoci se blízce podobají skupině B-1 lymfocytů u myší, a to zejména konstantní expresí molekuly CD5, absencí somatických mutací v Ig variabilních oblastech a obvyklou produkcí polyreaktivních IgM protilátek. Problémem však je, které lidské buňky tvoří B-1 subpopulaci lymfocytů. Jak již bylo výše zmíněno, podstatným rozdílem mezi cirkulujícími lidskými CD5+ B lymfocyty a B-1 lymfocyty myší je ten fakt, že CD5+ B buňky nesyntetizují polyreaktivní protilátky. Jelikož část lidské CD5+ B buněčné subpopulace sídlí ve folikulárním plášti lymfatických folikulů, nemohou být právě tyto B lymfocyty opomenuty. Jenomže, na rozdíl od B-1 B buněk, lidské B lymfocyty folikulárního pláště nereagují na TI typ antigenů. I přesto, tato skupina buněk je lákavou možností stát buněčným protějškem U-CLL buněk (Chiorazzi, Ferrarini, 2008; Hervé et al., 2005). Nedávno byla v práci italské skupiny popsána nová lidská subpopulace B lymfocytů, která se nachází v subepiteliální oblasti mandlí, což je ekvivalent slezinné marginální zóny. Tato skupina buněk sdílí vlastnosti B-1 lymfocytů myší a lidských buněk marginální zóny a na svém povrchu exprimuje molekulu CD5+ a aktivační markery. Buňky mohou nést nemutované i mutované IgVH geny a reagují na TI-2 typ antigenů in vitro. I tato skupina buněk může představovat prekurzor CLL buněk (Dono et al., 2007). 4. 7. 1. 2. Tranzientní B lymfocyty I když subpopulace tranzientních B lymfocytů není tak dobře definována u lidí jako u myší, i tyto B buňky by mohly být prekurzory CLL buněk s nemutovanými IgVH geny. Jejich podobnost s CLL buňkami je především v expresi molekul CD5 a CD38, a také v přítomnost zárodečně 45
kódovaných variabilních genů pro těžké řetězce imunoglobilinů, které mohou být autoreaktivní. Naneštěstí, tranzientní B lymfocyty exprimují na svém povrchu markery, které nejsou obvykle viděny u CLL buněk (Chiorazzi, Ferrarini, 2008). Jednou z těchto molekul je CD10. Tento povrchový marker je exprimaván u CLL buněk jen za určitých okolností, a sice když maligní buňky podstupují apoptózu in vivo nebo in vitro (Morabito et al., 2003). Také reakce na cytokin BAFF je odlišná. BAFF neprodlouží život tranzientním buňkám ani nezabrání jejich buněčné smrti (Sims et al., 2005), ačkoliv je důležitým inhibitorem spontánní apoptózy CLL buněk. Navíc, typickým znakem leukemických lymfocytů je aktivační marker CD27, který není přítomen u tranzientních B buněk (Chiorazzi, Ferrarini, 2008). Snad lidský T2 ekvivalent, který doposud není dostatečně charakterizován, bude mít k nemutovaným maligním lymfocytům funkčně i fenotypově blíže (Chiorazzi, Ferrarini, 2008).
4. 7. 2. Fyziologický protějšek M-CLL Několik výsledků studií svědčí o tom, že CLL buňky s mutacemi v oblastech IgVH genů vychází z post-GC B lymfocytů a nejvíce se podobají paměťovými B lymfocytům (Klein et al., 2001). Proces SHM nemusí být omezen jen na Ig lokus, ale může proběhnout také v oblasti genu BCL-6 u normálního B lymfocytu, který byl přijat do germinálního centra (Pasqualucci et al., 1998). Mutace v lokusu BCL-6 jsou navrženy jako molekulární marker průchodu germinálním centrem. Proto CLL buňky, které nesou mutace v lokusu BCL-6, s největší pravděpodobností prodělaly proces somatické hypermutace uvnitř germinálního centra. Četnost mutací BCL-6 u M-CLL pacientů a normálních post-GC lymfocytů je stejná (30%), a tak většina, ne-li všechny CLL buňky s mutovanými IgVH geny mohou pocházet z prekurzoru, který podstoupil somatické hypermutace uvnitř GC (Pasqualucci et al., 2000; Zenz et al., 2010). Důležité je, že část M-CLL případů exprimuje protilátky izotypu IgG, což ukazuje na prekurzor, který prodělal izotypový přesmyk. Tyto CLL buňky nejčastěji nesou IgG1 a IgG3 izotypové podtřídy, typické pro běžné GC B lymfocyty, zatímco jen vzácně nesou IgG2, které jsou charakteristické pro CSR u TI imunitních reakcí (Zenz et al., 2010). 4. 7. 2. 1. Folikulární paměťové B lymfocyty Protože CLL buňky exprimují na svém povrchu imunoglobuliny typu IgM a IgD, nelze jednoduše vyvodit za prekurzor mutovaných CLL buněk folikulární post-GC B lymfocyty, protože v průběhu germinální reakce obvykle prodělaly izotypový přesmyk (Chiorazzi, Ferrarini, 2008; Zenz et al., 2010). 46
4. 7. 3. Společný fyziologický protějšek CLL Alternativní možností je jednotný buněčný prekurzor všech CLL buněk, což je v souladu s profily genové exprese obou podskupin CLL. Na druhou stranu, podobnost v exprimovaném fenotypu u U-CLL a M-CLL pacientů může také odrážet společný transformační proces, v tomto případě by obě skupiny CLL nemusely vycházet ze stejné linie B lymfocytů (Rosenwald et al., 2001; Hervé et al., 2005). 4. 7. 3. 1. Cirkulující „paměťové“ IgM+ IgD+ CD27+ B lymfocyty a B lymfocyty marginální zóny Tyto dvě subpopulace B lymfocytů jsou často pokládány za jednu a tutéž skupinu buněk, která se liší pouze v umístění, a tak jsou společně považovány za možný protějšek CLL lymfocytů. Přítomnost zárodečné sekvence v oblastech IgVH genů, citlivost na TI podněty in vitro a produkce polyreaktivních Ig jsou společnou vlastností lidských B lymfocytů marginální zóny a nemutovaných CLL buněk (Weller et al., 2004; Chiorazzi, Ferrarini, 2008). Podobně, buňky MZ mohou nést mutace v oblasti IgVH genů, které získaly T-nezávislým způsobem mimo klasická germinální centra (Zenz et al., 2010) Také cirkulující „paměťové“ IgM+ IgD+ CD27+ B buňky nesou mutovaný BCR. V jejich případě je získání mutací v IgVH oblastech velmi sporné. A tak mutované CLL buňky mohou vycházet z buněk marginální zóny/cirkulujících IgM+ IgD+ CD27+ B lymfocytů. Nicméně, ani u této subpopulace B lymfocytů není přítomna molekulu CD5 (Chiorazzi, Ferrarini, 2008).
47
Obr. 7 Schéma potenciálních fyziologických protějšků CLL buněk.
48
Závěr Chronická lymfocytární leukémie je nejběžnější hematoonkologické onemocnění dospělého věku v západním světě, které postihuje téměř výhradně bělochy. Medián stanovení diagnózy je 65 let, častěji jsou postiženi muži než ženy. Rodinní příslušníci pacientů jsou rizikovější skupinou než běžná populace. Průběh a prognóza nemoci je značně variabilní, přežití pacientů se pohybuje od měsíců až po desetiletí. Pro CLL je charakteristická monoklonální populace aktivovaných antigenně zkušených B lymfocytů s typickým imunofenotypem, které v nerovnoměrném poměru proliferují a podstupují apoptózu. Nádorové buňky se akumulují v krvi a sekundárních lymfatických orgánech. Distribuce CLL buněk s proliferační aktivitou není homogenní. Zejména v kostní dřeni, která poskytuje vhodné mikroprostředí, se vyskytují aktivně dělící CLL buňky potlačující krvetvorbu, zatímco v periferní krvi se nachází buňky mimo dělící cyklus. Analýza imunoglobulinových genů odhalila, že CLL představuje dvě biologicky odlišné podskupiny a každý pacient nese právě jeden typ CLL buněk. První typ je tvořen buňkami s nemutovanými geny pro IgVH. Tyto B buňky si zachovaly polyreaktivitu vůči antigenu, ale BCR repertoár je omezen, a tak se tyto buňky s největší pravděpodobností setkaly s antigenem, který je stimuloval, a jsou výsledkem určité selekce. V současnosti se k možným fyziologickým protějškům U-CLL řadí doposud s jistotou neurčený lidský ekvivalent k B-1 lymfocytů myší, tranzientní B lymfocyty nebo nemutované B buňky marginální zóny. Druhou skupinu tvoří buňky, jejichž povrchový imunoglobulin je kódován mutovanými geny. Předpokládá se, že mutované CLL buňky prošly germinálním centrem, kde prodělaly proces somatické hypermutace po antigenní stimulaci. I zde panuje mnoho otázek kolem buněčného prekurzoru. Nejpravděpodobněji tyto leukemické buňky vychází z mutovaných buněk marginální zóny/cirkulujících paměťových IgM+ IgD+ CD27+ B lymfocytů nebo z folikulárních post-GC B lymfocytů. Alternativní možností je společný ekvivalent obou podskupin CLL buněk, v tomto případě v současnosti existuje jediná možnost, a tou jsou B lymfocyty marginální zóny. Jelikož je kolem fyziologického vývoje a jednotlivých subpopulací B lymfocytů u člověka mnoho otazníků, zůstává také potenciální fyziologický protějšek CLL buněk nevyřešenou otázkou. Nové poznatky molekulární patogeneze CLL umožňují odhalit stěžejní místa regulace růstu a přežití nádorové buňky a tím otevírají prostor pro vývoj nových cílených léků a léčebných postupů. 49
Literatura
Adam Z., Šmardová, J., Krejčí M., Klabusay, M., Brychtová, Y., Mayer, J. 2008. Chronická B-lymfatická leukémie, 177-196. In: Hematologie – přehled maligních hematologických nemocí, 2. doplněné a zcela přepracované vydání. Grada Publishing, Praha. Allman, D., Pillai, S. 2008. Peripheral B cell subsets. Curr Opin Immunol. 20: 149-157. Benson, M. J., Erickson, L. D., Gleeson, M. W., Noelle, R. J. 2007. Affinity of antigen encounter and other early B-cell signals determine B-cell fate. Curr Opin Immunol. 19: 275280 Caligaris-Cappio, F., Ghia P. 2007. The normal counterpart to the chronic lymphocytic leukemia B cell. Best Pract Res Clin Haematol. 20: 385-397 Carsetti, R., Rosado, M. M., Wardemann, H. 2004. Peripheral development of B cells in mouse and man. Immunol Rev. 197: 179–191. Chiorazzi, N., Ferrarini, M. 2008. Origin and Nature of Chronic Lymphocytic Leukemia B Cells, Chronic Lymphocytic Leukemia, Edited by O'Brien, S., Gribben, J. str. 1-18. Chiorazzi, N., Rai, K. R., Ferrarini, M. 2005. Chronic Lymphocytic Leukemia. N Engl J Med. 352: 804-15. Chung, J. B., Silverman, M., Monroe, J. G. 2003. Transitional B cells: step by step towards immune competence. Trends Immunol. 24: 343-9. Constantinescu, A., Schlissel, M. S. 1997. Changes in locus-specific V(D)J recombinase activity induced by immunoglobulin gene products during B cell development. J Exp Med. 185: 609-620 Damle, R. N., Batliwalla, F. M., Ghiotto, F., Valetto, A., Albesiano, E., Sison, C., Allen, S. L., Kolitz, J., Vinciguerra, V. P., Kudalkar, P., Wasil, T., Rai, K. R., Ferrarini, M., Gregersen, P. K., Chiorazzi, N. 2004. Telomere length and telomerase activity delineate distinctive replicative features of the B-CLL subgroups defined by immunoglobulin V gene mutations. Blood. 103: 375-382. Damle, R. N., Ghiotto, F., Valetto, A., Albesiano, E., Fais, F., Yan, X. J., Sison, C. P., Allen, S. L., Kolitz, J., Schulman, P., Vinciguerra, V. P., Budde, P., Frey, J., Rai, K. R., 50
Ferrarini, M., Chiorazzi, N. 2002. B-cell chronic lymphocytic leukemia cells express a surface membrane phenotype of activated , antigen-experienced B lymphocytes. Blood. 99: 4087-4093. Dighiero, G., Hamblin, T. J. 2008. Chronic lymphocytic leukaemia. Lancet. 371: 1017-29. Dono, M., Burgio, V. L., Colombo, M., Sciacchitano, S., Reverberi, D., Tarantino, V., Cutrona, G., Chiorazzi, N., Ferrarini, M. 2007. CD5+ B cells with the features of subepithelial B cells found in human tonsils. Eur J Immunol. 37: 2138-2147. Dono, M., Zupo, S., Colombo, M., Massara, R., Gaidano, G., Taborelli, G., Ceppa, P., Burgio, V. L., Chiorazzi, N., Ferrarini, M. 2005. The Human Marginal Zone B Cells. Ann N Y Acad Sci. 987: 117-124. Edry, E., Melamed, D. 2004. Receptor Editing in Positive and Negative Selection of B Lymphopoiesis . J Immunol. 173: 4265-4271. Ferenčík, M., Rovenský, J., Maťha, V. 2004. Ilustrovaný imunologický slovník. 1. české vydání. Galén, Praha. Ghia, P., Caligaris-Cappio, F. 2006. The Origin of B-Cell Chronic Lymphocytic Leukemia. Semin Oncol. 33: 150-156. Ghia, P., Chiorazzi, N., Stamatopoulos, K. 2008. Microenvironmental influences in chronic lymphocytic leukaemia: the role of antigen stimulation. J Intern Med. 264: 549-562. Ghia, P., Ferreri, A. J. M., Caligaris-Cappio, F. 2007a. Chronic lymphocytic leukemia. Crit Rev Oncol Hematol. 64: 234-246. Ghia, P., Guida, G., Stella, S., Gottardi, D., Geuna, M., Strola, G., Scielzo, C., CaligarisCappio, F. 2003. The pattern of CD38 expression defines a distinct subset of chronic lymphocytic leukemia (CLL) patients at risk of disease progression. Blood. 101: 1262-1269. Ghia, P., Prato, G., Scielzo, C., Stella, S., Geuna, M., Guida, G., Caligaris-Cappio, F. 2004. Monoclonal CD5+ and CD5- B-lymphocyte expansions are frequent in the peripheral blood of the elderly. Blood. 103: 2337-2342. Ghia, P., Scielzo, C., Frenquelli, M., Muzio, M., Caligaris-Cappio, F. 2007. From normal to clonal B cells: Chronic lymphocytic leukemia (CLL) at the crossroad between neoplasia and autoimmunity. Autoimmun Rev. 7: 127-131. 51
Hamblin, T. J., Davis, Z., Gardiner, A., Oscier, D. G., Stevenson, F. K. 1999. Unmutated IgVH Genes Are Associated With a More Aggressive Form of Chronic Lymphocytic Leukemia. Blood. 94: 1848-1854. Hervé, M., Xu, K., Ng, Y. S., Wardemann, H., Albesiano, E., Messmer, B. T., Chiorazzi, N., Meffre, E. 2005. Unmutated and mutated chronic lymphocytic leukemias derive from selfreactive B cell precursors despite expressing different antibody reaktivity. J Clin Invest. 115: 1636–1643. Hořejší, V., Bartůňková, J. 2009. Základy imunologie. 4. vydání. Triton, Praha. Janeway, Ch. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. J. 2001. Immunobiology. 5. vydání. Garland Science. Keating, M. J., Chiorazzi, N., Messmer, B., Damle, R. N., Allen, S. L., Rai, K. R., Ferrarini, M., Kipps, T. J. 2003. Biology and Treatment of Chronic Lymphocytic Leukemia. Am Soc Hematol Educ Program. 153-75. Klein, U. 2008. Gene Expression Profiling in the Study of Chronic Lymphocytic Leukemia, Chronic Lymphocytic Leukemia, Edited by O'Brien, S., Gribben, J. str. 19-33. Klein, U., Tu, Y., Stolovitzky, G. A., Mattioli, M., Cattoretti, G., Husson, H., Freedman, A., Inghirami, G., Cro, L., Baldini, L., Neri, A., Califano, A., Dalla-Favera, R. 2001. Gene Expression Profiling of B Cell Chronic Lymphocytic Leukemia Reveals a Homogeneous Phenotype Related to Memory B Cells. J Exp Med. 194: 1625-1638. Kozák, T. 2008. Chronická lymfocytární leukémie. Onkologie. 2: 156-162 LeBien, T. W., Tedder, T. F. 2008. B lymphocytes: how they develop and function. Blood. 112: 1570-1580. Marantidou, F., Dagklis, A., Stalika, E., Korkolopoulou, P., Saetta, A., Anagnostopoulos, A., Laoutaris, N., Stamatopoulos, K., Belessi, Ch., Scouras, Z., Patsouris, E. 2010. Activation-induced cytidine deaminase splicing patterns in chronic lymphocytic leukemia. Blood Cells Mol Dis. 44: 262-7. Melchers, F. 2006. Anergic B cells caught in the act. Immunity. 25: 864-7. Messmer, B. T., Messmer, D., Allen, S. L., Kolitz, J. E., Kudalkar, P., Cesar, D., Murphy, E. J., Koduru, P., Ferrarini, M., Zupo, S., Cutrona, G., Damle, R. N., Wasil, T., Rai, K. 52
R., Hellerstein, M. K., Chiorazzi, N. 2005. In vivo measurements document the dynamic cellular kinetics of chronic lymphocytic leukemia B cells. J Clin Invest. 115: 755-764. Morabito, F., Mangiola, M., Rapezzi, D., Zupo, S., Oliva, B. M., Ferraris, A. M., Spriano, M., Rossi, E., Stelitano, C., Callea, V., Cutrona, G., Ferrarini, M. 2003. Expression of CD10 by B-chronic lymphocytic leukemia cells undergoing apoptosis in vivo and in vitro. Haematologica. 88: 864-873. Muzio, M., Caligaris-Cappio, F. 2008. Chronic Lymphocytic Leukemia and B-Cell Receptor, Chronic Lymphocytic Leukemia, Edited by O'Brien, S., Gribben, J. str. 45-67. Natkunam, Y. 2007. The biology of Terminal center. Am Soc Hematol Educ Program. 210-5. Nieto, W. G., Almeida, J., Romero, A., Teodosio, C., López, A., Henriques, A. F., Sánchez, M. L., Jara-Acevedo, M., Rasillo, A., González, M., Fernández-Navarro, P., Vega, T., Orfao, A., Primary Health Care Group of Salamanca for the Study of MBL. 2009. Increased frequency (12%) of circulating chronic lymphocytic leukemia–like B-cell clones in healthy subjects using a highly sensitive multicolor flow cytometry approach. Blood. 114: 3337. Papajík, T., Jarošová, M., Plachý, R., Indrák, K. 2006. Chronická B-lymfocytární leukemie Část I: Pohled na původ, biologii a genetické změny leukemických buněk. Trans Hemat dnes. 12: 53-61. Pasqualucci, L., Migliazza, L., Fracchiolla, N., William, Ch., Neri, A., Baldini, L., Chaganti, R. S. K., Klein, U., Küppers, R., Rajewsky, K., Dalla-Favera, R. 1998. BCL-6 mutations in normal germinal center B cells: Evidence of somatic hypermutation acting outside Ig loci. Proc Natl Acad Sci U S A. 95: 11816-11821. Pasqualucci, L., Neri, A., Baldini, L., Dalla-Favera, R., Migliazza, A. 2000. BCL-6 Mutations Are Associated with Immunoglobulin Variable Heavy Chain Mutations in B-Cell Chronic Lymphocytic Leukemia. Cancer Res. 60: 5644-5648. Patten, P. E. M., Buggins, A. G. S., Richards, J., Wotherspoon, A., Salisbury, J., Mufti, G. J., Hamblin, T. J., Devereux, S. 2008. CD38 expression in chronic lymphocytic leukemia is regulated by the tumor microenvironment. Blood. 111: 5173–5181. Rawstron, A. C., Green, M. J., Kuzmicki, A., Kennedy, B., Fenton, J. A. L., Evans, P. A. S., O’Connor, S. J. M., Richards, S. J., Morgan, G. J., Jack, A. S., Hillmen, P. 2002. 53
Monoclonal B lymphocytes with the characteristics of „indolent” chronic lymphocytic leukemia are present in 3.5% of adults with normal blood counts. Blood. 100: 635-639. Rawstron, A. C., Yuille, M. R., Fuller, J., Cullen, M., Kennedy, B., Richards, S. J., Jack, A. S., Matutes, E., Catovsky, D., Hillmen, P., Houlston, R. S. 2002a. Inherited predisposition to CLL is detectable as subclinical monoclonal B-lymphocyte expansit. Blood. 100: 22892291. Rosenwald, A., Alizadeh, A. A., Widhopf, G., Simon, R., Davis, R. E., Yu, X., Yang, L., Pickeral, O. K., Rassenti, L. Z., Powell, J., Botstein, D., Byrd, J. C., Grever, M. R., Cheson, B. D., Chiorazzi, N., Wilson, W. H., Kipps, T. J., Brown, P. O., Staudt, L. M. 2001. Relation of Gene Expression Phenotype to Immunoglobulin Mutation Genotype in B Cell Chronic Lymphocytic Leukemia. J Exp Med. 194: 1639-1647. Rosypal, S. 2002. Úvod do molekulární biologie II. 3. inovované vydání. Brno. Rowley, B., Tang, L., Shinton, S., Hayakawa, K., Hardy, R. R. 2007. Autoreactive B-1 B Cells: Constraints on Natural Autoantibody B Cell Antigen Receptors. J Autoimmun. 29: 236245. Sandel, P. C., Gendelman, M., Kelsoe, G., Monroe, J. G. 2001. Definition of a novel cellular constituent of the bone marrow that regulates the response of immature B cells to B cell antigen receptor engagement. J Immunol. 166: 5935-5944. Sandel, P. C., Monroe, J. G. 1999. Negative selection of immature B cells by receptor editing or deletion is determined by site of antigen encounter. Immunity. 10: 289-299. Schmidlin, H., Diehl, S. A., Blom, B. 2009. New insights in the regulation of human B cell differentiation. Trends Immunol. 30: 277-285. Sims, G. P., Ettinger, R., Shirota, Y., Yarboro, Ch. H., Illei, G. G., Lipsky, P. E. 2005. Identification and characterization of circulating human transitional B cells. Blood. 105: 4390-4398. Stamatopoulos, K., Chrysoula, B., Moreno, C., Boudjograh, Guida, G., Smilevska, T., Belhoul, L., Stella, S., Stavroyianni, N., Crespo, M., Hadzidimitriou, A., Sutton, L., Bosch, F., Laoutaris, N., Anagnostopoulos, A., Montserrat, E., Fassas,A., Dighiero, G., Caligaris-Cappio, F., Merle-Béral, H., Ghia, P., Davi, F. 2007. Over 20% of patients with
54
chronic lymphocytic leukemia carry stereotyped receptors: pathogenetic implications and clinical correlations. Blood. 109: 259-270. Stevenson, F. K., Caligaris-Cappio, F. 2004. Chronic lymphocytic leukemia: revelations from the B-cell receptor. Blood. 103: 4389–4395. Tangye, S. G., Good, K. L. 2007. Human IgM+ CD27+ B cells: Memory B cells or „Memory” B cells? J Immunol. 179: 13-19. ten Boekel, E., Melchers, F., Rolink, A. G. 1997. Changes in the VH gene repertoire of developing precursor B lymphocytes in mouse bone marrow mediated by the pre-B cell receptor. Immunity. 7: 357-368. Wang, H., Feng, J., Qi, Ch. F., Li, Z., Morse, H. C., Clarke, S. H. 2007. Transitional B cells lose their ability to receptor edit but retain their potential for positive and negative selection. J Immunol. 179: 7544-7552. Zenz, T., Mertens, D., Küppers, R., Döhner, H., Stingelbauer, S. 2010. From pathogenesis to treatment of chronic lymphocytic leukaemia. Nat Rev Cancer. 10: 37-50. Zhang, Z., Zemlin, M., Wang, Y. H., Munfus, D., Huye, L. E., Findley, H. W., Bridges, S. L., Roth, D. B., Burrows, P. D., Cooper, M. D. 2003. Contribution of VH gene replacement to the primary B cell repertoire. Immunity. 19: 21-31.
55
