MASARYKOVA UNIVERZITA LÉKAŘSKÁ FAKULTA MIKROBIOLOGICKÝ ÚSTAV FAKULTNÍ NEMOCNICE U SVATÉ ANNY a CENTRUM KARDIOVASKULÁRNÍ A TRANSPLANTAČNÍ CHIRURGIE BRNO
VYUŽITÍ METODY REAL-TIME PCR V ŠIROKOSPEKTRÉ DETEKCI PATOGENŮ
Disertační práce v oboru Lékařská mikrobiologie a imunologie
Školitelé: Prof. MUDr. Miroslav Votava, CSc.
Autor:
MUDr. Tomáš Freiberger, Ph.D.
Mgr. Eva Němcová
Brno, 2014
Abstrakt Úvod: Narůstající počty infekcí způsobených jinými druhy kandid než C. albicans, lišící se rezistence k antimykotikům u jednotlivých druhů a nově se objevující druhy kandid v klinickém materiálu, to vše naznačuje potřebu rychlé a spolehlivé identifikace velkého počtu medicínsky významných druhů kandid. Diagnostika bakteriální infekční endokarditidy (IE) zůstává zatím stále náročnou z důvodu mnohdy nepřesvědčivého klinického obrazu nemoci nebo z důvodu limitací standardních laboratorních metod, kdy není možné patogena detekovat kvůli předchozí léčbě antibiotiky nebo přítomnosti kultivačně náročné nebo pomalu rostoucí bakterie. Metody: Byla vyvinuta metoda real-time PCR zacílená do oblasti ITS2 (UNF-qPCR) s následnou analýzou tání s vysokým rozlišením (High Resolution Melting Analysis, HRMA), testována byla na 25 sbírkových kmenech kandid a validována na 143 klinických izolátech. Všechny sbírkové kmeny i klinické izoláty, u kterých se lišila identifikace pomocí fenotypových metod a HRMA, byly sekvenovány. Pro rychlou a senzitivní detekci bakterií v klinickém materiálu (chlopních) byla vyvinuta metoda real-time PCR zacílená do genu 16S rRNA (UNB-qPCR) s následnou sekvenací pozitivních vzorků. Metoda byla testována na 21 sbírkových kmenech bakterií a validována na 28 chlopních od pacientů s podezřením na IE. Bylo analyzováno i 20 chlopní od pacientů s neinfekční diagnózou. K dekontaminaci UNB-qPCR byl použit 8-methoxypsoralen v kombinaci s ozářením UV světlem. Spolu s cílovou sekvencí byla amplifikována i nově navržená exogenní nekompetitivní interní amplifikační kontrola. Výsledky: Při zahrnutí všech sbírkových a klinických kmenů lze konstatovat, že pomocí UNF-qPCR a HRMA bylo odlišeno 23 z 27 druhů kandid a zbylé 4 druhy byly rozděleny do dvou párů. Analýza byla provedena pomocí hodnot tání (Tm ± 3 SD), tvaru derivovaných křivek tání (dMelt křivek) a v některých případech i pomocí křivek odlišností vzhledem k C. krusei. Efektivita navržené UNB-qPCR pro identifikaci bakterií byla vypočítána na 94,4 % s lineárním dynamickým rozsahem od 7 × 100 - 7 × 107 kopií/PCR. Všechny sbírkové kmeny byly určeny správně. Výsledky analýz klinických vzorků pomocí UNB-qPCR se shodovaly s výstupy z námi běžně používané širokospektré end-point PCR. Z porovnání obou metod vyplývá, že UNB-qPCR byla schopna přesněji identifikovat streptokoky na úroveň druhu. Závěr: HRMA je jednoduchá, rychlá a relativně dostupná metoda pro identifikaci širokého
spektra druhů medicínsky významných kandid. Mohla by doplnit stávající diagnostické postupy založené na komerčně dostupných biochemických kitech. Navržená UNB-qPCR s následným sekvenováním je vhodná pro identifikaci širokého spektra bakterií. Tato metoda je rychlejší a méně náročná než námi běžně využívaná širokospektrá end-point PCR.
Klíčová slova Candida sp., analýza tání s vysokým rozlišením, ITS2, širokospektrá detekce bakterií, PCR sledovaná v reálném čase, gen 16S rRNA, sekvenování
Abstract Objectives: An increasing trend in non-albicans infections, various susceptibility patterns to antifungal agents and uncommon species emerging in clinical samples implies a requirement for fast and reliable identification of a number of medically important Candida species. The diagnosis of bacterial infective endocarditis (IE) remains challenging due to frequently inconclusive clinical course of the disease and limitations of conventional laboratory tests in cases of previous antibiotic treatment or presence of fastidious or slow-growing bacteria. Molecular methods seem to be an efficient tool to improve a diagnostic power in both circumstances. Methods: Real-time PCR (UNF-qPCR) followed by high resolution melting analysis (HRMA) was developed, tested on 25 reference Candida collection strains and validated on an additional 143 clinical isolates in this study. All reference strains and clinical isolates inconclusive when using phenotypic methods and/or HRMA were analysed using ITS2 sequencing. Fast and sensitive real-time PCR targeting 16S rRNA gene (UNB-qPCR) followed by direct sequencing was developed for broad-range detection and identification of bacteria in the heart valves. The assay was tested on 21 reference bacterial strains and validated on 28 heart valve (HV) tissue samples from patients with suspicion of IE and additional control group of 20 HV samples
from patients
8-methoxypsoralen
without
IE.
in combination
To with
avoid UV
contamination radiation
was
of
the
used.
UNB-qPCR An exogenous
non-competitive internal amplification control was designed and co-amplified together
with the target sequence. Results: Considering reference and clinical strains together, 23 out of 27 Candida species could be clearly distinguished by HRMA, while the remaining 4 species were grouped in 2 pairs, when applying the mean Tm ± 3 SD values, shape of the derivative melting curve (dMelt curve) and, in some cases, the normalized and temperature - shifted difference plot against C. krusei. Efficiency of optimalized real-time broad-range UNB-qPCR was calculated 94.4 % with linear dynamic range 7 × 100 - 7 × 107 copies/PCR. All reference strains could be identified using this newly developed UNB-qPCR. Clinical sample results after UNB-qPCR were in concordance with those of our routinely used end-point broad-range (br) PCR. UNB-qPCR was able to identify streptococci more precisely and thus it showed better resolution than our end-point br PCR. Conclusion: HRMA as a simple, rapid and inexpensive tool was shown useful to identify a wide spectrum of clinically important Candida species. It may complement the current clinical diagnostic approach based on commercially available biochemical kits. The introduced UNB-qPCR followed by direct sequencing showed to be useful in detection of wide range of bacterial species. In addition, the method was faster and less laborious than conventional end-point br PCR.
Keywords Candida sp., High resolution melting, ITS2, Broad-range bacteria detection, Real-time PCR, 16S rRNA gene, Sequencing
Prohlašuji, že jsem disertační práci vypracovala samostatně pod vedením MUDr. Tomáše Freibergera, Ph.D. a prof. MUDr. Miroslava Votavy, CSc. s využitím zdrojů uvedených v soupisu literatury.
…………………………………… Mgr. Eva Němcová
Děkuji MUDr. Tomáši Freibergerovi, Ph.D. za odborné vedení mé práce, cenné konzultace a rady v průběhu celého studia. Za podnětné připomínky bych ráda poděkovala prof. MUDr. Miroslavu Votavovi, CSc. Za možnost studovat a pracovat v Genetické laboratoři CKTCH Brno děkuji doc. MUDr. Petru Němcovi, CSc, MBA. Mé díky patří i kolektivu Genetické laboratoře CKTCH Brno za výbornou spolupráci a příjemné pracovní prostředí. Za poskytnutí mikrobiologického materiálu a identifikaci konvenčními přístupy děkuji doc. Filipu Růžičkovi, Ph.D. Autorům a spoluautorům předkládaných publikací děkuji za spolupráci. Velké díky náleží mým rodičům, bratrovi Milanovi a příteli Petrovi za neustálou podporu a trpělivost v průběhu mého studia.
OBSAH 1
Úvod ................................................................................................................................. 10 1.1
Využití molekulárně-biologických metod pro detekci kandid................................... 10
1.1.1
Kandidová onemocnění ...................................................................................... 11
1.1.2
Izolace DNA z kandid ........................................................................................ 14
1.1.3
Cílová místa pro PCR detekci kandid ................................................................ 16
1.1.4
Přehled používaných molekulárně-biologických metod pro identifikaci kandid ... ............................................................................................................................ 16
1.1.5 1.2
Metoda analýzy teploty tání s vysokým rozlišením (HRMA)............................ 17
Využití molekulárně-biologických metod pro detekci bakterií ................................. 19
1.2.1
Izolace bakteriální DNA ..................................................................................... 19
1.2.2
Cílová místa pro PCR detekci bakterií ............................................................... 21
1.2.3
Přehled využívaných molekulárně-biologických metod pro detekci bakterií .... 22
1.2.4
PCR sledovaná v reálném čase (real-time PCR) ................................................ 22
1.2.5
Interní amplifikační kontrola pro PCR ............................................................... 24
2
Cíle práce .......................................................................................................................... 26
3
Materiál a metody ............................................................................................................. 27 3.1
Mikroorganismy......................................................................................................... 27
3.2
Klinický materiál ....................................................................................................... 28
3.3
Kultivace a fenotypová identifikace .......................................................................... 29
3.3.1
Kultivace sbírkových kmenů a klinických izolátů ............................................. 29
3.3.2
Hemokultivace a kultivace klinického materiálu ............................................... 29
3.4
Molekulárně – biologická detekce DNA ................................................................... 29
3.4.1
Izolace houbové DNA ........................................................................................ 29
3.4.2
Izolace bakteriální DNA ..................................................................................... 29
3.4.3
Analýza sekvencí ................................................................................................ 30
3.4.4
Širokospektrá detekce houbové DNA pomocí real-time PCR (UNF-qPCR) a HRMA ................................................................................................................ 30
3.4.5
Širokospektrá detekce bakteriální DNA pomocí real-time PCR (UNB-qPCR) a sekvenování ........................................................................................................ 31
4
3.4.6
End-point PCR.................................................................................................... 33
3.4.7
Sekvenování ....................................................................................................... 34
3.4.8
Příprava amplifikačních kontrol ......................................................................... 35
Výsledky ........................................................................................................................... 37 4.1
4.1.1
Analýza sekvencí ................................................................................................ 37
4.1.2
Sekvenování referenčních kmenů kandid ........................................................... 39
4.1.3
HRMA u referenčních kmenů kandid ................................................................ 39
4.1.4
HRMA u klinických izolátů kandid.................................................................... 45
4.1.5
Fenotypová identifikace klinických izolátů ........................................................ 48
4.2
5
UNF-qPCR a HRMA ................................................................................................. 37
UNB-qPCR a sekvenování ........................................................................................ 48
4.2.1
Dekontaminace UNB-qPCR ............................................................................... 48
4.2.2
Senzitivita a specificita UNB-qPCR................................................................... 50
4.2.3
Sekvenování referenčních kmenů bakterií ......................................................... 51
4.2.4
Detekce bakteriální DNA přímo z klinického materiálu .................................... 54
Diskuze ............................................................................................................................. 59 5.1
UNF-qPCR a HRMA ................................................................................................. 59
5.1.1
Heterogenity v klinických izolátech a obtížně rozlišitelné druhy ...................... 59
5.1.2
Odlišení fenotypově podobných kandid ............................................................. 60
5.1.3
Poly-fungální vzorky .......................................................................................... 61
5.1.4
Spolehlivost veřejně dostupných databází pro identifikaci kandid .................... 62
5.2
UNB-qPCR a sekvenování ........................................................................................ 62
5.2.1
Dekontaminace qPCR ........................................................................................ 62
5.2.2
Návrh exogenní nekompetitivní interní amplifikační kontroly pro UNB-qPCR 63
5.2.3
Spolehlivost veřejně dostupných databází pro identifikaci bakterií ................... 64
5.2.4
Detekce bakteriální DNA přímo z klinického materiálu .................................... 64
5.2.5
Širokospektrá PCR pro detekci bakterií ............................................................. 66
6
Závěr ................................................................................................................................. 68
7
Soupis literatury a pramenů .............................................................................................. 69
8
Seznam zkratek ................................................................................................................. 81
9
Seznam obrázků................................................................................................................ 84
10
Seznam tabulek ................................................................................................................. 86
11
Seznam příloh ................................................................................................................... 87
12
Seznam odborných publikací autora................................................................................. 88
13
12.1
Seznam publikací a spoluautorských prací ............................................................ 88
12.2
Seznam vybraných konferenčních abstrakt ............................................................ 88
Souhrn poznatků disertační práce ..................................................................................... 90
Přílohy ...................................................................................................................................... 91
1
ÚVOD
Předkládaná disertační práce je svými cíli rozdělena na dvě části, v první je optimalizována metoda pro identifikaci kandid a ve druhé části metoda pro detekci bakterií. Vzhledem k faktu, že práce byla realizovaná v Genetické laboratoři Centra kardiovaskulární a transplantační chirurgie Brno (CKTCH Brno), byla metodika zaměřena na detekci kandid, jako nejčastějšího detekovaného houbového agens u pacientů po transplantaci solidních orgánů a na detekci bakterií s důrazem na validaci metody pro záchyt patogenů v chlopních u pacientů
s infekční
endokarditidou
(IE).
Rychlá
diagnostika
patogenů
pomocí
molekulárně-biologických metod je přínosná hlavně u pacientů, kteří mají utlumenou imunitu po transplantaci orgánů, čímž se u nich zvyšuje riziko infekce, nebo se u nich projevily infekční komplikace po velkých chirurgických výkonech. U bakteriálních a mykotických infekcí může být účinná i v případech podávání antimikrobiální léčby, kdy klasické kultivační techniky často selhávají. Molekulárně-biologická diagnostika infekčních onemocnění má velké spektrum uplatnění od identifikace patogenů až po jejich genotypizaci. Umožňuje rychlou, citlivou a specifickou detekci patogena i jeho genů rezistence a i když tyto geny ne vždy odráží fenotypový projev, může informace o jejich přítomnosti ve specifických situacích (např. kriticky nemocní pacienti) přispět k optimalizaci léčby. Metody molekulární biologie jsou rozsáhle využívány pro detekci obvyklých i vzácných, kultivačně náročných i nekultivovatelných patogenů a je vyvíjen stále větší tlak na jejich validaci/standardizaci.
1.1 Využití molekulárně-biologických metod pro detekci kandid Byla publikována řada vědeckých článků o detekci kandid pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR), ale z důvodu chybějící standardizace, klinické validace a průkazu, že má aplikace této metody vliv na výsledek léčby pacienta1,2, nezařadily ji doposud odborné společnosti do svých doporučení. Evropská organizace pro výzkum a léčbu rakoviny - Skupina pro výzkum mykóz (EORTC/MSG) nezahrnula použití PCR do doporučení definic IMO3 a ani
Evropská společnost klinické mikrobiologie a infekčních nemocí (ESCMID) nedoporučila PCR pro diagnostiku jakéhokoli kandidového onemocnění (Tabulka 1)4. V posledních několika letech je tedy kladen velký důraz na standardizaci PCR pro detekci mykotických onemocnění.
10
1.1.1 Kandidová onemocnění Klinicky nejvýznamnější skupinou chorob jsou invazivní onemocnění. Rizikovými faktory invazivního kandidového onemocnění (IKO) u dospělých pacientů na odděleních intenzivní péče (JIP) jsou: dlouhodobý pobyt na nemocničním oddělení (≥ 4 dny), mechanická ventilace (˃ 2 dny), kritický stav pacienta, neutropenie, diabetes, selhání ledvin, hemodialýza, užívání širokospektrých antibiotik (≥ 4 dny), zavedený centrální venózní katetr, parenterální výživa, užívání imunosupresiv, nádorové onemocnění a chemoterapie, akutní pankreatitida, mnohočetná kolonizace kandidami (≥ 2 místa), chirurgický výkon (především v abdominální oblasti) a transplantace5,6. Revidovaná kritéria EORTC/MSG rozdělují invazivní mykotické onemocnění (IMO) na „prokázané“, „pravděpodobné“ a „možné“. Jako „prokázané“ lze označit onemocnění potvrzené histologickým, cytologickým nebo přímým mikroskopickým vyšetřením vzorku (získaného punkcí či biopsií) nebo kultivačním nálezem ve vzorku sterilně odebraného z primárně sterilního místa (vč. krve) postiženého infekcí. U Cryptococcus sp. stačí sérologický průkaz antigenu v likvoru. Při „pravděpodobném“ onemocnění je potřeba splnit alespoň jednu podmínku ze tří skupin kritérií: faktoru ma straně hostitele, klinického kritéria a mykologického kritéria. V případě, že je splněno pouze kriterium klinické a faktoru hostitele bez přítomnosti mykologického kritéria, jedná se o onemocnění „možné“3. Kategorie „prokázané“ IMO může být vztažena na jakéhokoli pacienta, ale kategorie „pravděpodobné“ a „možné“ IMO byly navrženy pouze pro imunokompromitované pacienty. Doposud u nich totiž nebylo nalezeno adekvátní východisko pro stanovení vhodných faktorů na straně hostitele3. Evropská společnost pro klinickou mikrobiologii a infekční nemoci (ESCMID) vypracovala doporučení pro diagnostiku IKO (Tabulka 1)4. Další doporučení ESCMID bylo zaměřeno na diagnostiku IMO způsobených vzácnými kvasinkovitými organismy (Tabulka 2)7.
11
onemocnění
kandidémie
IKO
chronické diseminované KO
orofaryngeální a esofageální KO
vaginální KO
materiál krev
test hemokultivace mannan/antimannan beta-D-glukan sérum jiné protilátky septifast PCR Kit „in-house“ PCR krev hemokultivace mannan/antimannan beta-D-glukan sérum septifast PCR Kit „in-house“ PCR přímá MI a HI kultivace tkáň a sterilní imuno-histochemie tělní tekutiny PCR z tkáně in situ hybridizace krev hemokultivace mannan/antimannan beta-D-glukan sérum septifast PCR Kit „in-house“ PCR přímá MI a HI kultivace tkáň a sterilní imuno-histochemie tělní tekutiny PCR z tkáně in situ hybridizace kultivace stěr „in-house“ PCR přímá MI a HI biopsie kultivace přímá MI a HI kultivace stěr/vaginální sekret komerční testy „in-house“ PCR
doporučení základní vyšetření doporučeno doporučeno žádné - chybí informace žádné - chybí informace žádné - chybí informace základní vyšetření žádné - chybí informace doporučeno žádné - chybí informace žádné - chybí informace základní vyšetření základní vyšetření žádné - chybí informace žádné - chybí informace žádné - chybí informace základní vyšetření doporučeno doporučeno žádné - chybí informace žádné - chybí informace základní vyšetření základní vyšetření žádné - chybí informace žádné - chybí informace žádné - chybí informace základní vyšetření žádné - chybí informace základní vyšetření základní vyšetření základní vyšetření základní vyšetření používat pouze validované žádné - chybí informace
Tabulka 1: doporučení pro diagnostiku IKO dle ESCMID4 (upraveno), IKO – invazivní kandidové onemocnění, KO - kandidové onemocnění, MI - mikroskopie, HI – histopatologie.
12
Druh kandidy anamorfa teleomorfa
komentář relevantní ke klinickému kontextu
C. dubliniensis
nepopsána
blízká C. albicans, citlivost k antimykotikům podobná, ale potenciál stát se rezistentní k flukonazolu má větší8
C. fabianii
Cyberlindnera fabianii
klinický význam neurčitý; vzácně způsobuje fungémie9-11, MIC k flukonazolu vyšší než u C. albicans12 vzácně způsobuje fungémie, neroste při 37 °C - je tedy humánním patogenem?13; vzácně může způsobit fungémie14
C. guilliermondii
Debaromyces hansenii Meyerozyma guilliermondii
C. inconspicua
nepopsána
blízká C. norvegensis, citlivost k antimykotikům podobná C. krusei (rezistentní k flukonazolu)15
C. intermedia
nepopsána
orofaryngeální kolonizace, infekce krevního řečiště, peritonitidy. Citlivá k antimykotikům kromě flucitosinu13
C. kefyr
Kluyveromyces marxianus
zatím nepopsána rezistence k antimykotikům
C. lipolytica
Yarrowia lipolytica
C. lusitaniae
Clavispora lusitaniae
C. metapsilosis
nepopsána
blízká C. parapsilosis, citlivost k antimykotikům podobná (vyšší MIC k echinokandinům)17
C. norvegensis
Pichia norvegensis
blízká C. inconspicua, citlivost k antimykotikům podobná C. krusei (rezistentní k flukonazolu)15
C. orthopsilosis
nepopsána
blízká C. parapsilosis, citlivost k antimykotikům podobná (vyšší MIC k echinokandinům)17
C. famata
C. pelliculosa
C. pulcherrima C. rugosa C. zeylanoides
Wickerhamomyces anomalus (Pichia anomala, Hansenula anomala) Pichia kudriavzevii (Metschnikowia pulcherrima) nepopsána nepopsána
MIC k flukonazolu a echinokandinům vysoké13
klinický význam neurčitý, MIC k flukonazolu vyšší než u C. albicans nevhodné lečit amfotericinem B i v případě, kdy je MIC v oblasti citlivosti (≤ 1 mg/l)16
MIC k flukonazolu vyšší než u C. albicans 18
klinický význam neurčitý, vzácně může způsobit infekce19 MIC k flukonazolu vyšší než u C. albicans 18 klinický význam neurčitý
Tabulka 2: Výběr vzácně se vyskytujících kandid7 (upraveno)
Pacienti po transplantaci solidních orgánů (SOT) jsou nejčastěji ohroženi IMO způsobenými Candida sp. a Aspergillus sp. méně Cryptococcus sp. a jinými vláknitými houbami (Tabulka 3)20. Incidence mykotických onemocnění (MO) po SOT se pohybuje v rozmezí 5 - 10 % v závislosti na transplantovaném orgánu21. Riziko MO je nejvyšší u pacientů po transplantaci tenkého střeva a plic, poté jater, srdce, slinivky břišní a ledvin20. Významějšími faktory u vzniku IMO, než je počet dní po transplantaci, jsou imunosuprese, 13
antimykotická profylaxe a působení vnějšího prostředí na pacienta. Medián počátku IKO se pohybuje od několika týdnů až měsíců u pacientů po transplantaci plic a jater až po dobu dvou a více let u pacientů po transplantaci ledviny22. Hlavním zdrojem IKO bývá gastrointestinální trakt, intravaskulární katétry a močové cesty. Incidence IKO u pacientů po SOT je odhadovaná na 2 % a mortalita IKO po 12 měsících na 34 %20. Mezi preventivní opatření MO u SOT patří např. kontraindikace transplantace v případě, že má donor aktivní MO, a kontrolní kultivace média, v němž se orgány uchovávají23. Záchyt kandid ve stolici, na kůži, drénech, v respiračních sekretech a moči nemusí vždy indikovat infekci, ale může pro pacienta znamenat vyšší riziko pro rozvinutí KO. Naopak detekce kandid z primárně sterilního materiálu (krve, inta-abdominální tekutiny, abscesu) znamená přítomnost infekce. Druhová identifikace kandid je poté důležitá z důvodu mezidruhové variability kandid ve stupni patogenity a citlivosti k antimykotikům24.
Typ IMO Kandidy Aspergily Zygomycety Jiné vláknité houby Nespecifikované vláknité houby Kryptokoky Endemické mykózy Pneumocysty Jiné kvasinky Nespecifikované kvasinky
Plíce (n = 248)
Srdce (n = 99)
Tenké střevo (n = 22)
164 (49) 47 (14) 8 (2) 10 (3)
Slinivka břišní (n = 128) 97 (76) 6 (5) 0 (0) 4 (3,1)
56 (23) 109 (44) 8 (3) 49 (19,8)
48 (49) 23 (23) 3 (3) 7 (7,1)
19 (85) 0 (0) 0 (0) 0 (0)
8 (2,1)
7 (2,1)
0 (0)
7 (2,8)
2 (2)
0 (0)
24 (6) 17 (5) 0 (0) 9 (2,4) 5 (1,3)
49 (15) 33 (10) 5 (1) 6 (1,8) 3 (0,9)
6 (5) 8 (6) 1 (1) 5 (3,9) 1 (0,8)
6 (2) 3 (1) 4 (2) 0 (0) 6 (2,4)
10 (10) 3 (3) 3 (3) 0 (0) 0 (0)
1 (5) 0 (0) 0 (0) 1 (5) 1 (5)
Játra (n= 378)
Ledviny (n = 332)
255 (68) 42 (11) 9 (2) 9 (2,4)
Tabulka 3: Počet (%) případů IMO u pacientů po SOT (1063 pacientů s 1208 IMO)20 (upraveno)
1.1.2 Izolace DNA z kandid Efektivní proces izolace houbové DNA je jednou ze základních podmínek úspěchu molekulárně-biologických metod. Kritickými body jsou výběr vhodného klinického materiálu a s tím spojená senzitivita izolace. Jelikož jsou kandidy komenzály lidského těla (horní dýchací cesty, gastrointestinální trakt, vagína, kůže apod.), je vhodné vybrat pro jejich detekci pomocí PCR primárně sterilní materiál. Pro diagnostiku IKO pomocí PCR se jeví nejdostupnějším materiálem krev a její frakce1, tedy i nejvhodnějším z pohledu pacienta 14
na JIP, pro něhož není invazivní zákrok, jako je biopsie ložiska, vždy možný. Limitujícím faktorem senzitivity izolačního procesu je i původ houbové DNA přítomné v klinickém materiálu, tedy zda pochází z živých nebo mrtvých buněk1,25. Důležitý je výběr takové metody, aby bylo možné její pomocí rozrušit buňky kvasinek a zároveň bylo omezeno riziko kontaminace vzorku z prostředí, příp. z reagencií. Dle doporučení „minimální informace pro publikaci metod založených na kvantitativních PCR v reálném čase“ (MIQE)26 je nutné izolovat DNA v laminárním boxu v místnosti určené pouze pro izolaci DNA a používat reagencie, které neobsahují žádnou DNA. Maaroufi a kol. (2004)27 testovali pět protokolů izolace houbové DNA kandid ze séra. Pomocí PCR sledované v reálném čase (real-time PCR) zjistili, že je metoda, kdy sérum projde varem v alkalickém roztoku guanidin-fenol-Trisu a následně je DNA izolována pomocí chloroformu a isopropanolu, stejně citlivá jako izolace pomocí komerčně dostupného QIAamp DNA blood kitu (Qiagen) tj. 10 CFU/ml27. Metwally a kol. (2008)28 testovali sedm protokolů pro izolaci DNA hub z plné krve. Nejoptimálnějších výsledků (s ohledem na senzitivitu, cenu a délku izolace) bylo dosaženo použitím YeaStar genomic DNA kitu (Zymo Research), který je založen na enzymatické lyzi buněčné stěny hub a následném přečištění DNA pomocí kolonek. Jako referenční metodu použili QIAamp DNA mini kit (Qiagen) ve spojení s lytikázou pro rozrušení buněčné stěny hub a vynechali působení NaOH. Tento protokol byl stejně senzitivní jako kit YeaStar genomic DNA, ale byl finančně nákladnější a trval delší dobu28. Poté se Metwally a kol. (2008)29 zaměřili na výběr klinického materiálu – porovnali vhodnost séra a plné krve pro detekci kandid u kriticky nemocných pacientů (bez neutropenie). Z dat vyplynulo, že je sérum vhodným výchozím materiálem pro detekci kandid, ale studie byla omezena pouze na jedno centrum a nebylo možné z ní vyvozovat jasná doporučení pro další laboratoře29. Lau a kol. (2010)25 porovnali krev, sérum a plazmu pro včasnou detekci kandidémie. I přes malý počet vzorků doporučili pro izolaci DNA kandid sérum a plazmu místo krve, jelikož byla DNA kandid detekována častěji v séru (71 %) a plazmě (75 %) než v plné krvi (54 %). Důvodem mohl být fakt, že je v krvi přítomna DNA volná i vázaná na buňky (leukocyty, buňky hub) a při izolaci z krve je všechna volná DNA odstraněna při lyzi erytrocytů a při odstraňování inhibitorů25. V případě živých/neporušených fungálních buněk by tedy bylo vhodné izolovat DNA z plné krve, naopak volnou DNA z mrtvých buněk je možné izolovat i ze séra29. Ve své studii Lau a kol. (2010)25 zaznamenali i vliv skladování primárních
vzorků
pro detekci
DNA
pomocí
mnohočetné
vícekrokové
PCR
(multiplex-tandem PCR) (MT-PCR). Zjistili, že je výhodnější zamražení krve na -20°C než její uchovávání při 4°C nebo než izolace přímo z odebrané krve bez uskladnění. Detekční 15
limit MT-PCR byl pro většinu kandid 10 CFU/ml kromě C. krusei (100 CFU/ml) a senzitivita při izolaci z krve byla 75% a negativní prediktivní hodnota (NPV) 85%25. 1.1.3 Cílová místa pro PCR detekci kandid Bylo publikováno mnoho genů vhodných jako cíl pro detekci kandid pomocí PCR. Výhodnější se jeví geny, které jsou v buňce obsaženy ve více kopiích a zvýší tak senzitivitu záchytu oproti genům přítomným pouze v jedné kopii2. Nejčastěji jsou amplifikovány oblasti rRNA genů 5S, 18S, 28S (především méně konzervativní oblast D1 - D2) a dále variabilní oblasti ITS1 a ITS230,31. Dalšími cílovými geny využívanými pro detekci kandid jsou geny pro tvorbu aktinu (ACT1)32, proteinu teplotního šoku 90 (HSP)33, chitin syntázy (CHS1)34, aspartyl proteinázy (SAP 1 - 6)35, fragment genu EO336 a gen pro manoprotein o velikosti 65 kDa (MP65)37. 1.1.4 Přehled používaných molekulárně-biologických metod pro identifikaci kandid Avni a kol. (2011)38 publikovali meta-analýzu 54 studií (4694 pacientů, z nichž 963 mělo prokázané/pravděpodobné nebo možné IKO) založených na detekci IKO z krve pomocí PCR. Senzitivita a specificita byly velmi dobré (95 % a 92 %) v případě, že se jednalo o vzorky pacientů s prokázanou kandidémií. Pokud se do analýzy zařadily i vzorky pacientů s pravděpodobným a možným IKO, senzitivita PCR poklesla a specificita zůstala přibližně stejná (73 % a 91 %). Dále autoři zaznamenali proměnné, které měly vliv na vyšší senzitivitu: krev použita jako výchozí materiál místo séra, izolace DNA pomocí QIAamp kitu (Qiagen), PCR cílená na geny rRNA nebo P450, dále PCR specifická pro kandidy a detekční limit in vitro ≤10 CFU/ml. Pokud byla u pacienta provedena více než jedna PCR, přispěla k vyšší specificitě metody38. Žádná ze studií ale neumožnila stanovit vliv vyšší senzitivity a dřívější diagnostiky IKO pomocí PCR na klinické výsledky pacientů. Dle Ostrosky-Zeichner (2012)39 by měly být studie plánované na základě standardních definic IMO uvedených např. v publikaci De Pauw a kol. (2008)3. Techniky molekulární biologie používané pro detekci hub jsou založeny převážně na PCR, která je buď specifická, nebo širokospektrá. Následně je možné patogen dourčit pomocí délkového polymorfismu restrikčních fragmentů (RFLP)40,41 nebo sekvenování42,43 a v posledních letech i sekvenování nové generace44,45. Většina studií je zaměřena na real-time PCR s použitím specifických sond27,46-49. Další autoři publikovali studie s různými metodikami jako např. částečně dvoukrokovou PCR (semi-nested PCR)50, MT-PCR51, mnohočetnou PCR (multiplex PCR)52,53, fluorescenční in situ hybridizací založenou na uměle 16
syntetizovaných analozích nukleových kyselin (PNA-FISH)54,55, hmotnostní spektrometrií typu MALDI-TOF56-58, isotermální amplifikací spojenou s reverzní transkripcí umožňující detekci převážně RNA (NASBA)59 nebo spojení PCR s hmotnostní spektrometrií (PCR-ESI/MS)60-62. Neobvyklé postupy detekce popsali např. Muir a kol. (2011)63, kteří detekovali kandidy pomocí elektrochemicky značených DNA sond, nebo Bisha a kol. (2011)64, kteří upravili fluorescenční in situ hybridizaci založenou na DNA (DNA-FISH) pro detekci kandid pomocí průtokové cytometrie. Výše uvedené postupy jsou ale pracné nebo drahé (např. nákup přístroje pro hmotnostní spektrometrii), příp. nejsou schopny rozlišit větší množství druhů kandid v jednom experimentu nebo nemají dostatečně obsáhlou databázi zahrnující i nově se objevující či neobvyklé patogeny. 1.1.5 Metoda analýzy teploty tání s vysokým rozlišením (HRMA) HRMA byla vyvinuta roku 2003 jako jednoduchá metoda pro analýzu genotypů, vyhledávání mutací a porovnávání podobnosti sekvencí65,66. HRMA je jednoduchá a levná metoda, která závisí na kvalitní DNA i PCR67-69, vhodném přístroji70,71 a interkalační barvičce72, která musí dvouřetězcovou (dsDNA) plně saturovat (Obrázek 1) a zároveň nesmí inhibovat PCR73, vhodné jsou např. EvaGreen, LCGreen a SYTO 974.
Obrázek 1: Nesaturující a saturující barviva: A) při použití nesaturujícího barviva (např. SYBR Green I), se mohou molekuly barvičky během tání přemístit do částí dsDNA, které ještě „netály“, což zapříčiní malou nebo nehomogenní změnu teploty v křivce tání. B) při použití saturujícího barviva (např. SYTO 9) se nemohou molekuly barviva přemístit do plně saturované dsDNA, což se projeví na profilu tání, který přesněji odpovídá sekvenci DNA74 (http://www.bioradiations.com/focus-on-applications/35-article/75-hrm, upraveno).
Princip HRMA je založen na PCR v přítomnosti fluorescenční saturační barvičky a následném odečtu fluorescence uvolňované při denaturaci dsDNA tzn. „tání“ výsledného 17
produktu PCR66. Jakákoli dsDNA totiž v přítomnosti saturačního interkalačního barviva fluoreskuje při nízkých teplotách a jakmile se teplota postupně zvyšuje, dsDNA denaturuje a fluorescence se pomalu snižuje až do momentu, kdy prudce klesne, čímž kopíruje stav v reakci, kde dsDNA „roztála“ do dvou jednořetězcových vláken (ssDNA). Tato teplota tání (Tm) dsDNA a profil křivky tání závisí na délce sekvence, procentuálním obsahu GC a sekvenci a odpovídá 50 % dsDNA, která již denaturovala do formy ssDNA (Obrázek 2)65. Z výpočtu Tm = 81,5 + 16,69 × (log [Na+]) + 0,41 × (% G + C) – (500/délka sekvence), je možné odvodit, že se změna Tm (∆Tm) při jedné záměně G - C ↔ A - T rovná hodnotě (41/délka sekvence) v °C75.
Obrázek 2: Křivka tání (po normalizaci dat) (https://www.dna.utah.edu/Image/Hi_Res%20Melting_Normalized.JPG, upraveno)
Při analýze jsou hrubá data po odstranění pozadí automaticky pomocí softwaru normalizována, tj. počátek i konec fluorescence křivek tání jsou zpracovány na stejnou výchozí a konečnou hodnotu, poté jsou data automaticky teplotně upravena a následnou zápornou derivací fluorescence a teploty jsou zobrazeny píky křivek tání a z nich odečtena hodnota Tm. Dále je možné dle potřeby vyhodnotit křivky odlišností (tzv. difference curve), které zobrazí normalizované křivky vzhledem k vybrané křivce66. Tm je vhodná veličina k odlišení změn v sekvenci, ale více informací poskytne spolu s křivkou tání, která je závislá na sekvenci65,75. Reed a Wittwer (2004)76 ve své práci doporučili pro nejlepší rozlišení jedno-nukleotidových heterozygotních změn amplifikovat úsek o délce do 300 bází, ale i 600 a 700 bází dlouhé sekvence bylo možné bezchybně odlišit. Chyby v rozlišení zaznamenali u 400, 800 a 1000 bází dlouhých sekvencí. Autoři vyhodnotili metodu HRMA jako stejně citlivou nebo i citlivější než jiné doposud používané metody, např. polymorfismus konformace jednořetězcové DNA (SSCP), vysokoúčinnou kapalinovou 18
chromatografii (HPLC), či elektroforézu v gradientovém denaturačním gelu (DGGE)76. Výhodou metody je provedení PCR i HRMA v jedné mikrozkumavce, čímž se minimalizuje jak riziko kontaminace, tak možnost chyb v procesu, dále není potřeba dalších separačních technik a urychlí se tedy celý proces detekce66. Oproti sekvenační reakci je HRMA mnohem levnější, není potřeba ani žádná fluorescenčně značená sonda jako pro real-time PCR, pouze kvalitní interkalační barvička. Nutností je mít přistroj určený pro HRMA nebo pro ni adaptovaný, i když adaptované nemají stejně dobré rozlišovací schopnosti71. Kromě humánní genetiky77 se HRMA rozšířila také do bakteriologie78-81, virologie82,83 a mykologie 84-92.
1.2 Využití molekulárně-biologických metod pro detekci bakterií Ačkoli byl v mnoha studiích prokázán přínos PCR pro detekci IE93-95, nebyla doposud tato metoda zařazena mezi hlavní ani vedlejší Duke kritéria96, dle nichž se diagnostika IE řídí a tedy ani do doporučení ESCMID97. Habib a kol. (2009)97 doporučili využít PCR z chlopně nebo embolu u pacientů s IE, kteří podstoupili operaci a měli negativní výsledek hemokultur. Dále bylo v doporučeních ESCMID zmíněno využití PCR z chirurgického materiálu (jako jedné z metod) pro detekci náročných bakterií jako je Bartonella sp., Brucella sp., Coxiella burnetii, Legionella sp., Mycoplasma sp., Tropheryma whipplei97. 1.2.1 Izolace bakteriální DNA Kritickým místem v aplikaci molekulárně-biologických metod je „pre-analytická“ příprava vzorku a extrakce DNA. Ideální metoda pro detekci IE by měla být schopna zachytit minimální množství DNA patogenu již z krve, v níž bývá množství bakterií velmi malé cca 1 – 10 CFU/ml98. Protokol pro izolaci bakteriální DNA se obvykle skládá z chemické, mechanické nebo enzymatické lyze buněk, což je důležitý krok, jelikož struktura bakteriální stěny může ovlivnit efektivitu izolace DNA99. Následuje odstranění všech inhibitorů PCR, extrakce DNA a její přečištění. Yang a kol. (2011)100 porovnali jeden manuální a šest automatických komerčně dostupných kitů pro izolaci DNA/RNA virů i bakterií (testováno pět patogenů) z nazálních výplachů. Použité kity se lišily vstupním objemem vzorku, délkou protokolu a kapacitou, což může vést k odlišnostem v lýze a schopnosti odstranit inhibitory reakce. Cílová DNA byla detekována pomocí specifických real-time PCR. Žádný z kitů nebyl výjimečný, ale MagNa Pure Compact (Roche, Švýcarsko) se ukázal vhodnějším pro izolaci
19
DNA
gram-pozitivní
bakterie
Streptococcus
pyogenes,
zatímco
KingFisher
mL
(ThermoFisher Scientific Inc., USA) a EasyMag (bioMérieux, Francie) pro izolaci RNA virů100. Hansen a kol. (2013)101 porovnali čtyři komerčně dostupné kity pro izolaci DNA z krve (QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen), MagNA Pure LC Microbiology Kit MGrade (Roche), MolYsis Complete5 Kit (MolZym), MagSi-DNA Isolation Kit for Blood (MagnaMedics)). DNA byla poté detekována pomocí „multiplex“ real-time PCR pro detekci Staphylococcus aureus a genu rezistence k methicilinu. U všech kitů byl použit pro „pre-analytickou“ přípravu vzorků kit MolYsis Basic (MolZym), který selektivně odstranil lidskou DNA. Pro porovnání byla souběžně izolována DNA dvěma kity bez použití tohoto ošetření. Nejlepším kitem pro izolaci DNA bakterií z krve byl MolYsis Complete5 Kit se senzitivitou 50 CFU/ml tzn. 4 CFU/PCR, pravděpodobně i díky většímu vstupnímu objemu a „pre-analytické“ přípravě vzorků. Autoři ale neprokázali, že by izolace DNA založená na magnetických kuličkách byla vhodnější než použití kolonek a centrifugace101. Gosiewski a kol. (2014)102 porovnali čtyři typy „pre-analytické“ přípravy vzorků krve: a) 0,17 M roztok chloridu amonného pro lyzi erytrocytů, b) mechanické rozrušení buněk pomocí skleněných kuliček a přístroje FastPrep, c) enzymatickou lyzi bakterií s použitím lysozymu, lysostaphinu a lytikázy při 37 °C, d) působení 50 mM hydroxidu sodného při 95 °C. DNA bakterií a hub byla dále izolována pomocí pěti komerčních kitů za účelem výběru nejvhodnějšího: GeneMATRIX Quick Blood DNA Purification Kit (EURx), GeneJET (Fermentas, Litva), QIAamp DNA Blood (Qiagen), Blood Mini (A&A Biotechnology), Genomic Mini (A&A Biotechnology). DNA byla detekována pomocí specifických PCR pro jednotlivé patogeny. Výsledkem optimalizace byla „pre-analytická“ příprava vzorku založená na kombinaci mechanické, chemické a teplotní lyze následovaná izolací DNA pomocí GeneMATRIX Quick Blood DNA Purification Kitu. Limity detekce metody pro jednotlivé patogeny byly 3 CFU/ml Escherichia coli, 30 CFU/ml S. aureus i Candida albicans a 300 CFU/ml Aspergillus fumigatus102. Výsledky se liší od komerčně dostupných certifikovaných (CE - IVD) kitů, u LightCycler SeptiFastu (Roche, Švýcarsko) udává výrobce limit detekce 3, resp. 30 - 100 CFU/ml podle druhu zachyceného mikroorganismu103. Při použití SepsiTestu (Molzym, Německo) byl popsán limit detekce pro gram-pozitivní bakterie 20 - 120 CFU/ml, pro gram-negativní bakterie 110 - 460 CFU/ml podle druhu zachyceného mikroorganismu v krvi104. Odlišnosti mohou být dány různými vstupními objemy krve, elučními objemy a objemy PCR. Izolaci DNA z tkání optimalizovali Mygind a kol. (2003)105. Aterosklerotické tkáně uměle očkovali C. pneumoniae a testovali pět postupů izolace: fenol/chloroform, fenol/chloroform 20
+ cetyltrimethylammonium bromide, DNeasy Tissue kit (Qiagen, Německo), Easy-DNA Kit (Invitrogen, Life Technologies, USA) a Magna Pure LC (Roche, Švýcarsko). DNA byla detekována pomocí specifické kvantitativní real-time PCR. Autoři dosáhli nejlepších výsledků pomocí DNeasy Tissue Kitu, který je založen na kolonkách a pomocí Magna Pure LC, který je automatický. Po extrakci oběma metodami bylo možné detekovat 10 kopií/µl. 1.2.2 Cílová místa pro PCR detekci bakterií Detekci bakterií pomocí PCR je možné zaměřit na konkrétního patogena (specifická PCR) nebo
na
současnou
detekci
více
patogenů
(širokospektrá/univerzální
PCR).
Pro širokospektrou detekci bakterií se nejčastěji využívá gen 16S rRNA, který je přítomen ve více kopiích. Tento gen obsahuje devět hypervariabilních úseků V1 – V9 ohraničených konzervativními oblastmi, do kterých je možné zacílit primery106. Chakravorty a kol. (2007)107 dospěli k závěru, že je vhodné amplifikovat hypervariabilní úseky V2, V3 a V6 pro zařazení všech vybraných 110 druhů bakterií do rodu, druhové zařazení bylo možné pro většinu bakterií (97/110), ale ne všechny. Problematické bylo zařazení do druhu u rodů: Salmonella spp. (typhimurium/enterica/typhi), Burkholderia mallei a B. pseudomallei., Bordetella parapertussis a B. pertussis, Enterococcus faecalis a E. faecium, Brucella spp. (melitensis/suis), Mycobacterium bovis a M. tuberculosis. Pomocí genu 16S rRNA jsou špatně rozlišitelné i některé druhy Streptococcus mitis a S. pneumoniae, Neisseria meningitidis a N. cinerea, Bacillus sp., Escherichia coli a Shigella sp.108. V těchto případech je vhodné použít jiné geny pro rozlišení druhů jako např. rpoB, sodA, recA, tuf, gyrA, gyrB a geny kódující proteiny teplotního šoku108. Produkt pozitivní širokospektré PCR reakce je nutné pro identifikaci bakterie podrobit např. RFLP109 nebo sekvenovat110,111. Důležitý je poté výběr databáze,
která
bude
použita
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), blast.de/en/index.html,
pro porovnání SepsiTest
Molzym,
BLAST
Německo),
sekvencí:
GenBank112
(http://www.sepsitest16SPath
DB113,114
(http://147.8.74.24/16SpathDB/main.php). Stanovení hranice podobnosti sekvencí, které umožní zařadit bakterie do rodu a druhu se mírně liší. Drancourt a kol. (2000)115 doporučují podobnost sekvencí ≥ 99% pro identifikaci do druhu a ≥ 97% do rodu. Janda a Abbott (2007)110 navrhují pro zařazení do druhu podobnost ≥ 99% a ideálně ≥ 99,5%. Institut pro klinické a laboratorní standardy (CLSI) vydal doporučení (MM18-A, Vol. 28, No. 12) pro interpretaci výsledků identifikace bakterií a hub pomocí sekvenační reakce, dle kterých by se měla tato identifikace řídit116,117. Bylo publikováno několik studií, kde autoři detekovali původce endokarditidy pomocí PCR 21
zacílené do genu 16S rRNA většinou z DNA získané ze srdeční tkáně93,94,118-133. 1.2.3 Přehled využívaných molekulárně-biologických metod pro detekci bakterií Techniky molekulární biologie používané pro detekci bakterií jsou založeny převážně na PCR, dále na enzymatické restrikci DNA a hybridizaci nukleových kyselin. Kromě specifické PCR, která je schopna detekovat pouze určitý druh patogena nebo skupinu patogenů, je využívána i širokospektrá PCR, po které je možné bakteriální patogen dourčit pomocí
RFLP109,
sekvenování110,111
nebo
sekvenování
nové
generace134.
Dalšími
molekulárními metodami, které byly využity pro detekci a identifikaci bakterií, jsou např. PNA-FISH135, real-time PCR136, dvoukroková PCR (nested-PCR)137, ligázová řetězová reakce (LCR)138 nebo NASBA139. Lze využít spojení PCR s detekcí produktu pomocí protilátek (PCR-ELISA)140 nebo technologie mikročipů141. Zajímavou je aplikace elektrochemické detekce142 či průtokové cytometrie143. V dnešní době je již rozšířená metoda MALDI-TOF/MS, která je zatím závislá na kultivaci mikroorganismu144 a nově je využíváno spojení PCR a hmotnostní spektrometrie (PCR-ESI/MS)60-62. Identifikovat bakterie je možné i pomocí již zmíněné HRMA78-81. 1.2.4 PCR sledovaná v reálném čase (real-time PCR) Metoda real-time PCR v sobě kombinuje amplifikaci, detekci a kvantifikaci cílové molekuly v jedné zkumavce. Fluorescenční signál z interkalačního barviva (nespecifické značení) nebo z fluoroforů značených primerů či sond (specifické značení) je detekován kontinuálně a je tak zaznamenáván i nárůst amplikonů, který dovoluje kvantifikovat počáteční množství templátu. Základním principem real-time PCR je určení hodnoty „Ct“ (treshold cycle) tj. cyklu PCR, ve kterém je fluorescence značky vyšší než hodnota fluorescence pozadí dané reakce, tj. vyšší než práh detekce (threshold). Kvantifikace se provádí pomocí Ct hodnot amplifikovaných desítkových ředění templátu o známé koncentraci tzv. standardu, ty slouží k vytvoření kalibrační křivky, dle které je možné vyhodnotit koncentrace neznámých vzorků (Obrázek 3). Jedná se o metodu absolutní kvantifikace. 145
22
Obrázek 3: Schéma real-time PCR pro kvantitativní detekci145 (http://www.genequantification.de/keer-qpcr-book-chapter-7.pdf, upraveno)
Pro nespecifickou detekci amplikonů se využívají interkalační barviva SYBR Green I, LCGreen, SYTO 9, aj.72, které po vazbě na dsDNA a následném ozáření světlem o vhodné vlnové délce fluoreskují. Nevýhodou je detekce jakýchkoli nespecifických PCR produktů, které mohou interferovat se specifickými produkty PCR a tím vést k chybám ve výsledcích. Zjistit přítomnost takovýchto produktů, např. dimerů primerů, lze pomocí křivky tání ve stejné zkumavce přímo po real-time PCR146. Naopak značené primery a sondy jsou založeny na sekvenci nukleové kyseliny nebo jejích syntetických analozích (LNA, PNA)146. Typů sond je několik – dle způsobu uvolňování fluorescence (Obrázek 4). Výhodou sond i značených primerů je jejich specificita k cílové sekvenci. Takových cílových sekvencí může být více a značené primery a sondy tak mohou být použity i v multiplexových reakcích. Přes svou specificitu mohou značené primery, na rozdíl od sond, vést ve formě dimerů primerů k nežádoucí fluorescenci, proto je nutné přítomnost dimerů ověřit gelovou elektroforézou146.
23
Obrázek 4: Mechanismus značek nejčastěji používaných pro real-time PCR: A) molekulární majáky, B) hydrolyzační sondy „Taqman“, C) hybridizační sondy, D) primer škorpión, E) nespecifické interkalační barvivo (SYBR Green apod.)146 (upraveno)
1.2.5 Interní amplifikační kontrola pro PCR Důvodem pro návrh interní amplifikační kontroly (IAC) je zamezení falešně negativních výsledků UNB-qPCR, které mohou nastat v případě inhibice reakce způsobné např. poruchou amplifikátoru, nevhodnou přípravou PCR reakce, malou aktivitou polymerázy nebo přítomností inhibitorů ve vzorku147. Základními přístupy k použití IAC je kompetitivní a nekompetitivní návrh PCR148. V kompetitivním uspořádání PCR je cílová DNA i IAC amplifikována za použití stejných primerů, za stejných podmínek a ve stejné mikrozkumavce. V takové situaci dochází v PCR vždy ke kompetici mezi oběma templáty a je potřeba, aby množství IAC bylo na mezi detekce a nemohlo dojít k vyrušení signálu cílové DNA a tím k falešně negativnímu výsledku. 24
Doporučuje se tedy IAC o malé koncentaci a výsledném PCR pruduktu delším než je cílová DNA148. Teoreticky lze totiž očekávat, že se při použití kratšího fragmentu IAC než je cílová DNA bude přednostně amplifikovat IAC149, což ale nemusí být vždy pravda150,151. V nekompetitivním uspořádání PCR je IAC amplifikována pomocí jiných primerů než cílová DNA. Amplifikace IAC ale přesně neodráží amplifikaci cílové DNA díky odlišným primerům, je proto potřeba pečlivě vybrat nukleotidové složení IAC a její délku, aby se zamezilo nežádoucímu ovlivnění amplifikace analyzovaného templátu. Amplifikaci IAC je nutné omezit pomocí snížené koncentrace primerů specifických pouze pro IAC, aby nedocházelo ke kompetici o oligonukleotidy a polymerázu s cílovou DNA (Obrázek 5)148.
Obrázek 5: Nekompetitivní uspořádání IAC a cílové DNA v PCR - IAC kontrolována pomocí koncentrace primerů specifických pouze pro IAC148 (upraveno)
V případě, že je IAC přidána do vzorku před izolací DNA (resp. do lyzačního pufru), je možné takto do určité míry kontrolovat i průběh izolačního procesu147,152. Jako IAC se využívají
úseky
genů
pro
glyceraldehyd-3-fosfát
dehydrogenázu
(GAPDH)
a
β-mikroglobulin152, které jsou běžně přítomné ve vzorcích z humánního klinického materiálu. Tyto endogenní sekvence ale nereflektují přesně amplifikaci cílové DNA hlavně díky různé efektivitě (výtěžnosti) amplifikaci DNA a neznámému množství této IAC vzhledem k cílové DNA147. Je ale možné využít i exogenní IAC (DNA z organismu, kterou neočekáváme v analyzovaném vzorku) o známé koncentraci a zajistit tak přesnější kontrolu IAC v reakci153.
25
2
CÍLE PRÁCE 1) Optimalizovat metodu analýzy teplotního tání s vysokým rozlišením (HRMA) pro identifikaci kandid a) Navrhnout a optimalizovat kvantitativní real-time PCR pro detekci kandid (UNF-qPCR) a následnou HRMA b) Ověřit možnosti využití HRMA pro identifikaci klinických kmenů kandid c) Porovnat výsledky identifikace kandid pomocí biochemických metod, sekvenování a HRMA
2) Optimalizovat metodu kvantitativní detekce bakterií pomocí širokospektré kvantitativní PCR v reálném čase a) Navrhnout a optimalizovat širokospektrou kvantitativní real-time PCR pro detekci bakterií (UNB-qPCR) s následným sekvenováním b) Optimalizovat dekontaminaci UNB-qPCR c) Navrhnout exogenní nekompetitivní interní amplifikační kontrolu d) Ověřit možnost využití UNB-qPCR pro detekci bakteriální DNA přímo z klinického materiálu u pacientů s podezřením na IE
26
3
MATERIÁL A METODY
3.1 Mikroorganismy Pro optimalizaci fungální real-time PCR a následnou HRMA bylo využito dvaceti pěti sbírkových kmenů kandid z České sbírky mikroorganismů (CCM), Belgické sbírky mikroorganismů (Belgian Co-ordinated Collections of Micro-organisms) (BCCM/MUCL) a Sbírky kvasinek ze Slovenské Republiky (CCY) (Tabulka 4). Dále bylo analyzováno 143 izolátů kandid z různých klinických materiálů z Mikrobiologického ústavu Fakultní nemocnice u svaté Anny (FNUSA) v Brně. Pro optimalizaci širokospektré real-time PCR pro detekci bakterií bylo využito 21 druhů (23 kmenů) sbírkových bakteriálních kmenů (Tabulka 5). Referenční kmeny kandid C. albicans C. tropicalis C. krusei C. glabrata C. parapsilosis C. utilis C. inconspicua C. saitoana C. lusitaniae C. fabianii C. norvegensis C. intermedia C. lambica C. guillermondii C. zeylanoides C. kefyr C. dubliniensis C. pelliculosa C. lipolytica C. rugosa C. californica C. catenulata C. pulcherrima C. orthopsilosis C. metapsilosis
Sbírkové označení CCM 8320 CCM 8264 CCY 29-9-17 CCM 8270 CCM 8260 CCY 29-38-74 CCY 26-26-11 CCY 26-9-9 CCY 29-59-1 CCY 38-20-1 CCY 29-47-2 CCY 29-12-10 CCY 29-97-12 CCY 39-23-6 MUCL 27735 MUCL 29857 CCY 29-177-1 CCY 29-6-7 CCY 29-26-42 CCY 29-15-1 CCY 29-93-4 CCY 29-17-3 CCY 29-2-128 MUCL 49939 MUCL 46179
Tabulka 4: Referenčních kmeny kandid 27
Referenční kmeny bakterií
Sbírkové označení
Bacteroides fragilis Enterococcus faecalis Enterococcus faecium Escherichia coli Fusobacterium necrophorum Klebsiella pneumoniae Lactobacillus crispatus Listeria monocytogenes Propionibacterium acnes Pseudomonas aeruginosa Salmonella enterica Serratia marcescens Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Staphylococcus haemolyticus Streptococcus agalactiae Streptococcus anginosus Streptococcus constellatus Streptococcus mitis Streptococcus pneumoniae Streptococcus pyogenes
CCM 4508 CCM 4224 CCM 2308 CCM 3954, CCM 3988 CCM 5981 CCM 4415 CCM 7010 CCM 7202 CCM 3343 CCM 1960 CCM 4420 CCM 303 CCM 4750, CCM 7111 CCM 6187 CCM 2729 CCM 6187 CCM 7437 CCM 7445 CCM 7411 CCM 4501 CCM 7418
Tabulka 5: Referenční bakteriální kmeny
3.2 Klinický materiál Pro detekci bakteriální DNA přímo z klinického materiálu byly použity vzorky prospektivně sbíraných srdečních tkání pacientů, kteří v období květen 2013 až květen 2014 podstoupili operační zákrok v CKTCH Brno. Analyzovaná skupina čítala 28 pacientů s podezřením na IE a kontrolní skupina 20 pacientů (prospektivní sběr ukončen dříve), kteří podstoupili kardiochirurgický zákrok pro neinfekční diagnózu. U analyzované skupiny byly zpětně v příslušných nemocničních zařízeních dohledány výsledky hemokultivací (HK) před započetím antibiotické terapie. U pacientů kontrolní skupiny nebylo vyšetření HK ani kultivační vyšetření chlopní provedeno.
28
3.3 Kultivace a fenotypová identifikace 3.3.1 Kultivace sbírkových kmenů a klinických izolátů Kultivace
sbírkových
kmenů
i
klinických
izolátů
kandid
byla
provedena
na Mikrobiologickém ústavu FNUSA v Brně. Kandidy byly očkovány na Sabouraudův agar (Sanofi Diagnostic Pasteur, Francie) a CHROMagar Candida (CHROMagar Microbiology, Francie) a kultivovány při 37 °C po dobu 48 hodin. Poté byly identifikovány dle morfologických
vlastností
a
pomocí
komerčně
dodávaných
kitů
API-ID32C®
(BioMérieux, Francie) a CANDIDAtest 21 (Erba-Lachema, Česká Republika). Sbírkové kmeny bakterií byly kultivovány na České sbírce mikroorganismů dle protokolů dostupných u jednotlivých druhů na http://www.sci.muni.cz/ccm/ a poté transportovány do Genetické laboratoře CKTCH Brno. 3.3.2 Hemokultivace a kultivace klinického materiálu HK byla provedena dle standardních operačních postupů (SOP) v nemocnicích, v nichž byli pacienti hospitalizováni před přijetím na CKTCH Brno. Části chlopní byly zaslány do Mikrobiologického ústavu FNUSA Brno, kde byly homogenizovány a vyšetřeny dle SOP.
3.4 Molekulárně – biologická detekce DNA 3.4.1 Izolace houbové DNA Kolonie referenčních kmenů kandid i klinických izolátů byly resuspendovány ve 100 µl sterilní vody (B. Braun Medical, Inc., Německo). Před izolací pomocí QIAamp DNA Blood Mini Kitu (Qiagen, Německo) byly suspenze kandid ošetřeny lytikázou (5 U/µl) (Sigma-Aldrich, Německo) a lyzačním pufrem (500 mM Na2EDTA, 1 M Tris, Triton X-100) a poté inkubovány při 37 °C 60 min. Dále bylo s lyzáty kandid postupováno dle doporučení výrobce kitu. Výsledná DNA byla eluována do 50 µl AE pufru z uvedeného kitu a zamražena na -20 °C pro následující analýzy. Koncentrace DNA byla měřena pomocí NanoDropu (NanoDrop Technologies, USA). 3.4.2 Izolace bakteriální DNA Kolonie referenčních kmenů bakterií byly resuspendovány ve 100 µl sterilní vody (B. Braun Medical, Inc., Německo). Před izolací pomocí QIAamp DNA Blood Mini Kitu (Qiagen, 29
Německo) byly suspenze bakterií ošetřeny lysozymem (180 mg/µl) (Sigma-Aldrich, Německo), lysostaphinem (1,8 mg/µl) (Sigma-Aldrich, Německo) a lyzačním pufrem (500 mM Na2EDTA, 1 M Tris, Triton X-100) a poté inkubovány při 37 °C 30 min. Dále bylo se vzorky postupováno dle doporučení výrobce kitu a výsledná DNA v 50 µl AE pufru z kitu byla zamražena na -20 °C. Vzorky srdeční tkáně (o vel. cca 5 × 5 × 2 mm) byla skalpelem mechanicky rozmělněna a přemístěna do mikrozkumavky, byl přidán lysozym (180 mg/µl), lysostaphin (1,8 mg/µl) a lytikáza (5 U/µl) a lyzační pufr (500 mM Na2EDTA, 1 M Tris, Triton X-100) a poté byla suspenze inkubována při 37 °C 30 min. Dále bylo se vzorky postupováno dle doporučení výrobce kitu QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Německo). Výsledná DNA byla eluována do 50 µl AE pufru z uvedeného kitu a zamražena na -20 °C pro následující analýzy. Koncentrace DNA byla měřena pomocí NanoDropu (NanoDrop Technologies, USA). K izolacím DNA byla zařazena i kontrola izolačního procesu (IK), která obsahovala místo výchozího vzorku 200 µl sterilní injekční vody (B. Braun Medical, Inc., Německo). 3.4.3 Analýza sekvencí Sekvence různých rodů houbových patogenů i různých druhů kandid z databáze GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)112 byly nejdříve teoreticky porovnány pomocí programu ClustalW154,155
v SDSC
Biology
Workbench
(http://workbench.sdsc.edu/).
Sekvence
referenčních kmenů kandid získané dle kapitoly 3.4.7 byly analyzovány v programu uMELT156. 3.4.4 Širokospektrá detekce houbové DNA pomocí real-time PCR (UNF-qPCR) a HRMA Byly testovány primery UNF1: 5´- GCA TCG ATG AAG AAC GCA GC - 3´ a UNF2: 5´-TTG ATA TGC TTA AGT TCA GCG G - 3´40,122 zacílené do oblasti ITS2. Do reakce bylo použito 20 ng vyizolované houbové DNA, 1 × SensiMixTM HRM Kitu (Bioline, Velká Británie), 3,5 mM MgCl2 (Fermentas, Litva), 1,5 × interkalační barvy EvaGreenTM (Biotium, USA), 350 nM každého primeru (výsledná koncentrace) a sterilní vody do objemu 25 µl (B. Braun Medical, Německo). Program pro UNF-qPCR v přístroji Rotor-GeneTM 6000 se skládal z denaturace při 95 °C po dobu 10 min, následovalo 40 cyklů při 95 °C 10 s, 58 °C 15 s a 72 °C 30 s zakončeno při 72 °C 4 min. Pro HRMA byl amplifikovaný úsek (229 - 422 párů bází o obsahu GC 39 – 58 %) ochlazen na 50 °C 1 min a poté zahříván od 70 °C do 98 °C za současného zaznamenávání fluorescence 30
každých 0,15 °C/2 s. Data z tání produktu PCR byla analyzována pomocí Rotor-GeneTM 6000 software verze 1.7 (Corbett Research, Rakousko). Oblasti pro normalizaci dat byly stanoveny na 71 – 73 °C a 95 - 97 °C. Pro ověření reprodukovatelnosti metody byly referenční kmeny kandid testovány v duplikátu ve třech nezávislých bězích. S každou sadou referenčních kmenů i klinických izolátů byly na UNF-qPCR a HRMA nasazeny i pozitivní kontroly tj. C. saitoana, C. krusei a C. norvegensis. Jako negativní kontrola byla místo DNA použita sterilní injekční voda (B. Braun Medical, Německo). 3.4.5 Širokospektrá detekce bakteriální DNA pomocí real-time PCR (UNB-qPCR) a sekvenování Při využití širokospektré real-time PCR pro detekci a identifikaci bakteriální DNA v klinické praxi je důležité, aby byla v dané reakci přítomna i vnitřní kontrola amplifikace, díky níž budou rozpoznatelné falešně negativní výsledky. Bylo přistoupeno k návrhu dvou single-plex real-time PCR a to pro detekci bakterií (kapitola 3.4.5.1) a pro detekci IAC (kapitola 3.4.5.3). Po optimalizaci dekontaminačních podmínek (kapitola 3.4.5.2) byly obě single-plex real-time PCR následně optimalizovány v jedné duplexní real-time PCR pro detekci bakterií (UNB-qPCR) viz kapitola 3.4.5.4. 3.4.5.1 Optimalizace single-plex real-time PCR pro detekci bakterií Primery a sonda pro detekci bakterií byly převzaty z publikace Nadkarni a kol. (2002)136 a jejich využitelnost byla prověřena i v práci Mohammadi a kol. (2003)157: B-F: 5´ - TCC TAC GGG AGG CAG CAG T – 3´ a B-R: 5´ - GGA CTA CCA GGG TAT CTA ATC ATG TT - 3´
a sonda B-S: (6FAM) – 5´ – CGT ATT ACC GCG GCT GCT GGC
AC - 3´ - (TAMRA). Případné interakce byly ověřeny pomocí programu OligoAnalyser 3.1 Intergrated DNA Technologies (http://eu.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/). Reakce byla optimalizována dle obecných pravidel, tj. teplota nasedání primerů a jejich koncentrace, koncentrace MgCl2 a počet cyklů real-time PCR. Výsledné podmínky optimalizované single-plex PCR byly následující: 50 °C 2 min, 95 °C 10 min a 45 cyklů 95 °C 15 s, 60 °C 1 min. Použit byl TaqMan Gene Expression Master Mix (Life Technologies, USA) o objemu 12,5 µl, primer B-F o výsledné koncentraci 700 nM, B-R 600 nM a sonda B-S 200 nM, 5 µl templátu a reakce byla doplněna sterilní injekční vodou (B. Braun Medical, Inc., Německo) do objemu 25 µl. PCR byla provedena v přístroji ABI 7300 (Applied Biosystems, USA) a analyzována pomocí Sequence Detection Software 1.4 31
(Applied Biosystems, USA). Výsledný produkt měl délku 466 bp. 3.4.5.2 Dekontaminace single-plex real-time PCR pro detekci bakterií Byly testovány čtyři způsoby dekontaminace výsledného master-mixu (MM) pomocí enzymů Alu I (Fermentas, Litva) o koncentraci 0,5 U/reakci a Bsp 143I (Fermentas, Litva) o koncentraci 0,5 U/reakci, dále ošetření MM pomocí 8-methoxypsoralenu (MOP) (Sigma-Aldrich, Německo) o výsledné koncentraci 8,4 µg/ml a mechanickou dekontaminaci použitím filtračních kolonek Microcon Ultracel YM 100 (Millipore Corporation, USA). Pro ověření vlivu teploty inkubace enzymů byl zařazen vzorek MM bez enzymu, který byl ošetřen stejně jako MM s enzymy, tj. ve výsledku 190 min při 37 °C a 25 min při 65 °C v amplifikátoru PTC 200 Engine (MJ Research, USA). Doby inkubace MM s enzymy i jejich koncentrace byly optimalizovány, stejně jako koncentrace MOP a doby inkubace při 4 °C a také čas a relativní odstředivé zrychlení (rpm) centrifugace u testování kolonek YM-100. V této kapitole jsou uvedeny již výsledné koncentrace a doby působení, které u jednotlivých přístupů vedly k nejlepším výsledkům. Při použití filtračních kolonek YM 100 byl MM centrifugován 3000 rpm 20 min v centrifuze Eppendorf 5418 (Eppendorf, Německo). MM s MOP byl jako výsledek optimalizace uložen na 60 min při 4 °C a poté ozářen UV 30 J po dobu 5 min v přístroji Bio-link BLX-365 (Vilber Lourmat, Francie). 3.4.5.3 Návrh interní amplifikační kontroly pro duplexní real-time PCR pro detekci bakterií (UNB-qPCR) Pro
odlišení
falešně
negativních
výsledků
UNB-qPCR
byla
navržena
exogenní
nekompetitivní IAC zacílená do genomu Silene latifolia (DNA i její sekvence laskavě darovány Mgr. Tomášem Čermákem, Ph.D.). Primery a sonda byly navrženy pomocí programu Primer 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/): IAC-F: 5´ - CTT GAT CGG GCT TAG TTC TGC T – 3´ a IAC-R: 5´ - TGG AGG ATC GCA ATA AGG TCA – 3´ a sonda IAC-S: (VIC) – 5´ - TTG CCA AAT TAC CGG AGG CCT ATG CTT - 3´ - (TAMRA). K vyloučení tvorby vlásenkových struktur a dimerů jak mezi sebou, tak s primery z Nadkarni a kol. (2002)136, byly všechny primery dále ověřeny pomocí programu NetPrimer (http://www.premierbiosoft.com/netprimer/,
Premier
Biosoft)
a
OligoAnalyser
3.1
(http://eu.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/, Intergrated DNA Technologies). Před optimalizací duplexní reakce UNB-qPCR bylo nutné stanovit minimální koncentraci IAC v reakci včetně co nejnižší koncentrace primerů pro IAC se sondou o výsledné koncentraci 200 nM za podmínek vhodných pro primery k detekci bakteriální DNA a 32
s použitím stejného TaqMan Gene Expression Master Mixu i podmínek single-plex PCR viz kapitola 3.4.5.1. Výsledný produkt měl délku 383 bp. 3.4.5.4 Optimalizace duplexní reakce UNB-qPCR Pro kontrolu inhibice UNB-qPCR reakce byl zvolen postup duplexní reakce, kdy je v jedné zkumavce amplifikována cílová DNA spolu s IAC, ale obě mají v reakci vlastní primery. Reakce byla optimalizována dle obecných pravidel a výsledkem byla duplexní UNB-qPCR, při níž bylo použito 15 µl TaqMan Gene Expression Master Mixu, primery a sondy o výsledných koncentracích: B-F (800 nM), B-R (700 nM), B-S (200 nM), IAC-F (150 nM), IAC-R (100 nM), IAC-S (200 nM), a sterilní voda do objemu 35 µl. Výsledný MM byl dekontaminován použitím MOP o výsledné koncentraci 8,4 µg/ml (kapitola 3.4.5.2). Poté bylo do MM připipetováno 5 µl IAC o koncentraci 7 × 102 kopií/PCR a 5 µl cílové DNA, resp. templátu. Podmínky reakce byly zachovány jako u single-plex real-time PCR: 50 °C 2 min, 95° C 10 min a 45 cyklů 95 °C 15 s, 60 °C 1 min. Analýza výsledků byla provedena pomocí Sequence Detection Software 1.4 (Applied Biosystems, USA) v přístroji ABI 7500Fast (Applied Biosystems, USA) s mírou fluorescence pozadí „baseline“ odečítanou během Ct 3 – 15 a „treshold“ 0,1 pro odečet fluorescence FAM a 0,05 pro VIC. V každém běhu UNB-qPCR byla zařazena negativní (NK) a pozitivní kontrola (PK-SA). Při dekontaminaci nového MM byla zařazena i totálně negativní kontrola (TNK), u níž byl objem IAC a templátu nahrazen před inkubací při 4 °C sterilní vodou (B. Braun Medical, Inc., Německo) a mikrozkumavky se po ozáření UV již neotevíraly, TNK sloužila jako kontrola dekontaminace MM. 3.4.5.5 Analytický limit detekce UNB-qPCR Plazmid (PK-SA) byl kvantifikován a lineárně naředěn ve sterilní vodě (Qiagen, Německo) od 1,2 × 107 – 1,2 × 100 kopií/µl a jako templát spolu s IAC naředěným na koncentraci 1,2 × 102 kopií/µl využit v UNB-qPCR pro stanovení analytického limitu detekce. 3.4.6
End-point PCR
Pro porovnání výsledků UNB-qPCR byla využita end-point PCR s primery UNB1a: 5´ - AAC TGG AGG AAG GTG GGG AT - 3´ a UNB2b: 5´ - AGG AGG TGA TCC AGC CGC A - 3´ zacílenými do oblastí V8-V9 genu 16S rRNA95,122,158-162. Reakce se skládala z 20 µl HotStarTaq Master Mix Kitu (Qiagen, Německo), primerů o výsledných koncentracích UNB1a (500 mM) a UNB2b (500 mM), 0,5 mM výsledné koncentrace MgCl2, 25 µg/ml MOP 33
a byla doplněna do 30 µl sterilní injekční vodou (B. Braun Medical, Inc., Německo). Výsledný master mix byl uložen na 90 min při cca 4 °C a následně inkubován 7 min v přístroji Bio-link BLX-365 (Vilber Lourmat, Francie) při UV 30 J po dobu 7 min. Po přidání 5 µl vnitřního standardu122 a 5 µl templátu byla provedena amplifikace v přístroji PTC 200 Engine (MJ Research, USA): 96 °C 15 min, 35 cyklů 96 °C 10 s, 57 °C 10 s, 72 °C 30 s. Pro kontrolu izolačního postupu chlopní byla do end-point PCR zařazena IK, ke kontrole PCR NK a PK-UNB, při použití nového master mixu i kontrola dekontaminace (TNK). 3.4.7 Sekvenování Před sekvenační reakcí byly PCR produkty ze sbírkových kmenů kandid po UNF-qPCR, ze sbírkových bakteriálních kmenů a z klinického materiálu po UNB-qPCR přečištěny pomocí High Pure PCR Purification Kitu (Roche, Švýcarsko) dle doporučení výrobce. Produkty end-point PCR a slabě pozitivní UNB-qPCR produkty z klinického materiálu (hodnota Ct 33,51 - 35,84) byly naneseny na 2 % agarózový gel (Serva, Německo) barvený ethidium bromidem (Amresco, USA) k elektroforéze při 5,8 V/1 cm po dobu 30 min. Produkty byly dále přečištěny z gelu pomocí QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Německo). Sekvenační reakce se skládala z 1 min při 96 °C a poté 25 cyklů při 96 °C 10 s, 50 °C 5 s a 2 min při 60 °C s použitím komerční soupravy Abi Prism Big Dye Terminator 3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, USA) a příslušných primerů v závislosti na použité PCR. Produkt sekvenační reakce byl přečištěn pomocí komerční soupravy BigDye® XTerminatorTM Purification Kit (Applied Biosystems, USA). Sekvenování bylo provedeno v přístroji ABI Prism 3100 Avant (Applied Biosystems, USA). Výsledné sekvence kmenů kandid byly srovnány se sekvencemi ve veřejně dostupné databázi GenBank112 pomocí aplikace BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)163 a v databázi Centra biodiverzity hub CBS (http://www.cbs.knaw.nl/Collections/; The Fungal Biodiversity Centre, Nizozemí). Klinické kmeny kandid byly sekvenovány pouze v případě, že se fenotypová identifikace lišila od výsledku HRMA. Výsledné sekvence sbírkových kmenů bakterií po UNB-qPCR i bakteriální DNA izolované z klinického materiálu (chlopní) byly srovnány se sekvencemi v databázích platných v době analýzy
(leden
2013):
GenBank112
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)163, blast.de/en/index.html)
pomocí
SepsiTest
(Molzym,
BLAST
Německo),
(http://147.8.74.24/16SpathDB/main.php)113,114, 34
aplikace
BLAST
(http://www.sepsitest16SPath
DB
EzTaxon (http://eztaxon-e.ezbiocloud.net)164,165 (Tabulka 11). Pro zařazení kandid i bakterií do druhu byla požadována shoda 99 – 100 % ve všech databázích. 3.4.8 Příprava amplifikačních kontrol Z důvodu reprodukovatelnosti pozitivních kontrol a IAC pro UNB-qPCR, především při ověřování senzitivit metod, bylo přistoupeno k vytvoření plazmidových konstruktů. Pro zisk plazmidového konstruktu pro PK-UNF byla provedena UNF-PCR, která se skládala z 20 µl HotStarTaq Master Mixu (Qiagen, Německo), primerů UNF1 a UNF2 o výsledné koncentraci 500 nM a MgCl2 (Fermentas, Litva) o výsledné koncentraci 2,0 mM, templátem o objemu 5 µl byla DNA C. albicans (CCM 8320) získaná dle postupu v kapitole 3.4.1 a reakce byla doplněna sterilní injekční vodou (B. Braun Medical, Inc., Německo) do objemu 40 µl. Podmínky PCR v přístroji PTC 200 Engine (MJ Research, USA) byly následující: počáteční aktivace polymerázy 96 °C 10 min a poté 45 cyklů: 98 °C 10 s, 56 °C 10 s, 72 °C 30 s a konečná syntéza 72 °C 4 min. Amplikon byl dále využit pro klonování. Pro zisk plazmidového konstruktu pro PK-SA byla provedena 16S-PCR, která se skládala z 12,5 µl HotStarTaq Master Mixu (Qiagen, Německo), primerů B-F a B-R o výsledné koncentraci 400 nM a MgCl2 (Fermentas, Litva) o výsledné koncentraci 2,1 mM, templátem o objemu 5 µl byla DNA S. aureus (CCM 4750) získaná dle postupu v kapitole 3.4.2 a reakce byla doplněna sterilní injekční vodou (B. Braun Medical, Inc., Německo) do 25 µl. (Sekvence primerů jsou vlastnictvím spolupracující laboratoře a nebylo umožněno je zveřejnit, zacíleny jsou do genu 16S rRNA a amplifikován je úsek téměř celého genu 16S rRNA.) Podmínky PCR v přístroji PTC 200 Engine (MJ Research, USA) byly následující: počáteční aktivace polymerázy 95 °C 15 min a poté 35 cyklů: 95 °C 10 s, 62 °C 30 s, 72 °C 90 s a konečná syntéza 72 °C 10 min. Amplikon byl dále využit pro klonování. Pro zisk plazmidového konstruktu pro IAC byla provedena PCR, která se skládala z 20 µl HotStarTaq Master Mixu (Qiagen, Německo), 2,1 mM MgCl2, 500 nM obou primerů (IAC-F a IAC-R, 5 µl templátu Silene latifolia (DNA laskavě darována Mgr. Tomášem Čermákem, Ph.D.) a sterilní vody do objemu 40 µl (B. Braun Medical, Německo). Podmínky optimalizované reakce byly následující: 98° C 15 min a 40 cyklů 95 °C 15 s, 59 °C 1 min a konečná syntéza 72 °C 10 min. Výsledný produkt měl délku 383 bp. Jako IAC byl dále použit plazmid s inzertem IAC o známé koncentraci získaný dle níže popsaného postupu. Výsledné PCR produkty ze tří výše popsaných reakcí a z reakce popsané v kapitole 3.4.7 (kde templátem byla DNA izolovaná z kmene Str. pyogenes CCM 7418) byly naneseny na 2 % agarózový gel (Serva, Německo) barvený ethidium bromidem (Amresco, USA), elektroforéza 35
byla
provedena
v elektroforetické
vaně
HU13W
(Scie-Plast,
Velká
Británie)
v 0,5 × tris-borátovém pufru při 5,8 V/ 1 cm po dobu 30 min, vizualizovány byly v UV transluminátoru Gbox (Syngene, Velká Británie). Produkty byly přečištěny pomocí QIAquick Gel Extraction Kitu (Qiagen, Německo) dle pokynů výrobce. Získané PCR produkty byly začleněny, každý samostatně v odlišný týden, do vektoru z TOPO TA Cloning Kitu (Invitrogen, Life Technologies, USA) dle pokynů výrobce a poté byly plazmidové konstrukty PK-UNF PK-SA a PK-UNB transformovány do kompetentních buněk E. coli TOP10F dle pokynů výrobce a stejným postupem IAC do kompetentních buněk DH10B (Gen-Trend, Česká Republika). Kolonie E. coli i DH10B s plazmidovým konstruktem (pozitivní klony) byly identifikovány na LB agaru (Invitrogen, Life Technologies, USA) s ampicilinem (Amresco, USA) pomocí X-Gal (Qiagen, Německo) dle pokynů výrobce. Z pozitivních klonů E. coli TOP10F a DH10B kultivovaných v LB bujónu (Invitrogen, Life Technologies, USA) s ampicilinem (Amresco, USA) byly po 16 hodinách kultivace při 37 °C v rotační třepačce Inova 4000 (New Brunswick Scientific, USA) pomocí QIAprep Spin Miniprep Kitu (Qiagen, Německo) vyizolovány plazmidové konstrukty. Jejich koncentrace byla změřena pomocí spektrofotometru NanoDrop (NanoDrop Technologies, USA) a začleněná sekvence byla u všech čtyř konstruktů ověřena sekvenováním (kapitola 3.4.7). Takto získané plazmidové konstrukty (PK-UNF, PK-SA, IAC, PK-UNB) byly zamraženy při cca -20 °C pro další využití. Buňky E. coli TOP10F a DH10B s plazmidovými konstrukty byly zamraženy při -80 °C.
36
4
VÝSLEDKY
4.1 UNF-qPCR a HRMA 4.1.1 Analýza sekvencí Byly analyzovány sekvence 5,8S – ITS2 – 28S u různých rodů a druhů hub (Obrázek 6) a různých druhů kandid (Obrázek 7) z databáze GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/, prosinec 2013)112 pomocí aplikace ClustalW154,155.
Obrázek 6: Část in silico analýzy sekvencí různých rodů a druhů hub z databáze GenBank pomocí ClustalW, ID patogenů (směrem dolů): AM948960, AB369897, AB369896, AB248992, FJ379828, AB456576, AB470914, FM958530, AB034647, AB034643, AJ878776, AM117824, FM199962, zeleně - UNF1, červeně - neshody se sekvencemi testovaných primerů, * - shoda bází ve všech sekvencích.
37
Obrázek 7: Část in silico analýzy sekvencí různých druhů kandid z databáze GenBank pomocí ClustalW: zeleně - UNF1, červeně - neshody se sekvencemi testovaných primerů, * - shoda bází ve všech sekvencích.
Sekvence referenčních kmenů kandid byly ověřeny pomocí aplikace uMeltSM156 umožňující predikce křivky tání a výpočet procentuálního zastoupení guaninu (G) a cytosinu (C) v sekvenci (Obrázek 8, Tabulka 6). Tvar křivek tání se shodoval s reálným tvarem křivek tání (dMelt křivek) referenčních kmenů kandid po HRMA.
Obrázek
8:
Analýza
sekvence
C.
orthopsilosis
(https://www.dna.utah.edu/umelt/um.php, prosinec 2013) 38
pomocí
uMeltSM
v2.0.2
4.1.2 Sekvenování referenčních kmenů kandid U všech referenčních kmenů kandid potvrdilo sekvenování ITS2 oblasti druhové zařazení dodané sbírkami. Výjimkou byly kmeny C. famata (CCY 26-9-9) a C. valida (CCY 29-93-4), které byly dourčeny jako C. saitoana a C. californica (Tabulka 6). 4.1.3 HRMA u referenčních kmenů kandid Všech 25 referenčních kmenů kandid vykazovalo na HRMA reprodukovatelné křivky tání, z nichž byla většina s jediným píkem a u 9 druhů se křivka skládala ze dvou píků (Tabulka 6, Obrázek 9 a 10). C. saitoana, C. krusei a C. norvegensis byly dále v každém běhu používány jako pozitivní kontroly. Ihned po HRMA bylo možné identifikovat dle tvaru dMelt křivek a hodnot teplot tání (Tm) 21 z 25 druhů referenčních kmenů kandid včetně C. saitoana a C. californica. Průměrná hodnota Tm ± 3 SD spolu s tvarem dMelt křivky byly průkazné pro 16 druhů, u dalších 5 druhů (tří párů) (C. inconspicua/C. californica, C. krusei/C. norvegensis, C. utilis/C. fabianii) bylo potřeba analyzovat normalizované teplotně upravené křivky odlišností vztažené ke kontrolnímu vzorku C. krusei (Tabulka 6, Obrázek 11). C. fabianii ale nebylo možné odlišit od C. guilliermondii (viz níže).
39
průměrná Tm amplikonu (SD) (°C) druh
referenční kmen č.
vrchol tání 1
vrchol tání 2
C. albicans
CCM 8320
80,098 (0,048)
82,938 (0,085)
C. californica
CCY 29-93-4
85,170 (0,083)
C. catenulata
CCY 29-17-3
79,730 (0,067)
C. dubliniensis
CCY 29-177-1
80,200 (0,064)
C. fabianii
CCY 38-20-1
C. glabrata C. guilliermondii
cílová sekvence délka Obsah GenBank (bp) GC (%) (2013) č.
CBS (2013) č.
326
47
FJ662402.1
CBS 8758
288
53
AY684146.1
CBS 989
82,850 (0,028)
259
46
AY493436.1
CBS 565
82,090 (0,089)
331
46
HQ457429.1
CBS 7987
81,083 (0,051)
361
44
AF335967.1
CBS 5640
CCM 8270
81,705 (0,070)
408
46
AY939793.1
CBS 859
CCY 39-23-6
81,255 (0,039)
368
44
JQ425356.1
CBS 6021
C. inconspicua
CCY 26-26-11
84,603 (0,112)
295
52
AB179767.1
CBS 180
C. intermedia
CCY 29-12-10
81,968 (0,032)
247
47
AF218968.1
CBS 572
C. kefyr
MUCL 29857
82,658 (0,084)
422
46
HQ396523.1
CBS 834
C. krusei
CCY 29-9-17
86,605 (0,043)
336
55
L47113.1
CBS 2062
C. lambica
CCY 29-97-12
87,678 (0,039)
295
58
AY533549.1
CBS 4807
C. lipolytica
CCY 29-26-42
78,325 (0,139)
229
44
HQ718589.1
CBS 5699
C. lusitaniae
CCY 29-59-1
83,663 (0,079)
244
50
EU149777.1
CBS 1944
C. metapsilosis
MUCL 46179
79,333 (0,093)
304
42
FJ872019.1
CBS 10747
C. norvegensis
CCY 29-47-2
86,930 (0,087)
314
54
AB179768.1
CBS 1922
C. orthopsilosis
MUCL 49939
79,563 (0,037)
81,208 (0,034)
300
43
EU564208.1
CBS 10745
C. parapsilosis
CCM 8260
79,863 (0,071)
81,508 (0,061)
300
43
HQ263346.1
CBS 2211
C. pelliculosa
CCY 29-6-7
78,625 (0,060)
79,683 (0,065)
364
39
AF218991.1
CBS 605
C. pulcherrima
CCY 29-2-128
82,178 (0,062)
243
48
FJ172526.1
CBS 9701
C. rugosa
CCY 29-15-1
83,980 (0,079)
263
49
GU144663.1
CBS 613
C. saitoana
CCY 26-9-9
79,695 (0,052)
361
41
HQ652067.1
CBS 940
C. tropicalis
CCM 8264
79,433 (0,061)
317
40
EU589208 .1
CBS 94
C. utilis
CCY 29-38-74
80,720 (0,073)
352
45
AF218990.1
CBS 567
C. zeylanoides
MUCL 27735
79,328 (0,063)
363
40
AF218976.1
CBS 6409
81,710 (0,052) 81,213 (0,083)
80,738 (0,096)
Tabulka 6: Referenční kmeny pro HRMA
40
Obrázek 9: Zobrazení první derivace fluorescence na teplotě (dMelt křivky) u referenčních kmenů Candida sp. v duplikátech u kandid s jedním vrcholem tání (Tm vrchol): 1) C. zeylanoides, 2) C. saitoana, 3) C. utilis, 4) C. fabianii, 5) C. guilliermondii, 6) C. glabrata, 7) C. intermedia, 8) C. pulcherrima, 9) C. kefyr, 10) C. lusitaniae, 11) C. rugosa, 12) C. inconspicua, 13) C. californica, 14) C. krusei, 15) C. norvegensis, 16) C. lambica
41
Obrázek 10: Zobrazení první derivace fluorescence na teplotě (dMelt křivky) u referenčních kmenů Candida sp. v duplikátech u kandid se dvěma vrcholy tání, (použito stejné měřítko jako na obrázku 9): 1) C. pelliculosa, 2) C. tropicalis, 3) C. metapsilosis, 4) C. orthopsilosis, 5) C. parapsilosis, 6) C. lipolytica, 7) C. dubliniensis, 8) C. albicans, 9) C. catenulata
42
Obrázek 11: Normalizované teplotně upravené křivky odlišností vztažené ke kontrolnímu vzorku C. krusei u třech dvojic referenčních kmenů kandid: 2) C. krusei a 3) C. norvegensis, 4) C. utilis a 5) C. fabianii, 6) C. inconspicua a 7) C. californica, pozitivní kontrola 1) C. saitoana.
Čtyři druhy kandid (dva páry) nebylo možné spolehlivě odlišit. U referenčních kmenů C. orthopsilosis a C. metapsilosis se hodnoty Tm ± 3SD překrývaly a nebylo možné je od sebe odlišit. Podobně tomu bylo u referenčních kmenů C. fabianii a C. guilliermondii. Přestože se jejich sekvence velmi liší, hodnoty Tm ± 3SD se nacházely opakovaně v překryvu (Obrázek 12) a ani analýza normalizovaných teplotně upravených křivek odlišností, vztáhnutých ke kontrolnímu vzorku C. krusei, nepomohla k odlišení těchto druhů. C. parapsilosis ale byla jasně odlišitelná od C. orthopsilosis a C. metapsilosis. Nasedání primerů bylo ověřeno na agarózovém gelu (Obrázek 13). Senzitivita reakce byla stanovena na základě desítkového ředění (100 ng/reakci - 100 fg/reakci) genomové DNA C. albicans (CCM 8320) v duplikátech. Koncentrace 100 fg/reakci byla spolehlivě reprodukovatelná, ale nižší koncentrace již ne. Pro analýzy UNF-qPCR a HRMA byla vybrána výsledná koncentrace 20 ng DNA/reakci. 43
Obrázek 12: Křivky první derivace fluorescence na teplotě (dMelt křivky) u dvou neodlišitelných dvojic referenčních kmenů kandid: 2) C. fabianii a 3) C. guilliermondii, 5) C. orthopsilosis a 4) C. metapsilosis, tři pozitivní kontroly: 1) C. saitoana, 6) C. krusei, 7) C. norvegensis
Obrázek 13: Sbírkové kmeny kandid po amplifikaci UNF-qPCR: 1) C. utilis, 2) C. inconspicua, 3) C. dubliniensis, 4) C. pelliculosa, 5) C. saitoana, 6) C. lusitaniae, 7) C. lipolytica, 8) C. parapsilosis, 9) C. glabrata, 10) C. albicans, 11) C. krusei, 12) C. tropicalis, 13) C. rugosa, 14) C. californica, 15) C. fabianii, 16) C. norvegensis, 17) C. catenulata, 18) C. intermedia, 19) C. lambica, 20) C. guilliermondii, 21) C. pulcherrima, 22) C. orthopsilosis, 23) C. metapsilosis, 24) C. zeylanoides, 25) C. kefyr; M100 – velikostní žebříček (Fermentas, Litva), PK – pozitivní kontrola (PK-UNF) 44
4.1.4 HRMA u klinických izolátů kandid Všechny klinické izoláty (n = 143) byly testovány zaslepeně. Jakmile se vzor HRMA jakéhokoli izolátu lišil od dat referenčního panelu, byl tento sekvenován. Jedenáct vzorků vykazovalo dle elektroforeogramu poly-fungální vzor a byly proto vyloučeny z primární analýzy. Dalších sedm klinických izolátů zastupující dva druhy nebylo možné identifikovat, jelikož nebyly zařazeny do referenčního panelu kandid (tři izoláty C. pararugosa a čtyři C. famata). Všech těchto sedm izolátů ale mělo na HRMA jedinečný obraz, ať už přímo (C. pararugosa) nebo po analýze s C. krusei (C. famata), a bylo možné je odlišit od všech druhů zařazených v referenčním panelu. Ve výsledku korespondovalo s referenčním panelem 125 klinických izolátů (21 druhů) (Tabulka 7).
45
HRMA Klinické izoláty (n) a)
Fenotypové metody
Správně Správně Neidentifi Správně Správně Neidentifi identifikován zařazeno kováno c) identifikován zařazeno kováno o b) do skupiny o do správněc) c) skupiny c)
Referenční kmeny C. albicans
13
C. catenulata
1
C. dubliniensis
5
9+4
d)
1 5
C. fabianii
20
-
C. glabrata
10
10
-
-
13
-
-
-
-
1
-
-
-
-
20
e)
6
e)
h)
-
5
-
-
-
20
-
10
-
-
-
6
-
-
-
1
-
-
C. guillermondii
6
-
C. inconspicua
1
1
C. intermedia
1
1
-
-
1
-
-
C. kefyr
6
6
-
-
6
-
-
C. krusei
7
7
-
-
7
-
-
3
-
-
d)
C. lambica
3
-
-
3
C. lipolytica
3
3
-
-
3
-
-
C. lusitaniae
5
5
-
5
-
-
-
-
9
-
4
-
-
-
-
-
5
-
15
-
-
C. metapsilosis
9
-
C. norvegensis
4
4
C. orthopsilosis
5
-
C. parapsilosis
15
15
f)
3 +4
f), d
)
f)
5 -
2
d)
g)
C. pelliculosa
3
3
-
-
-
3
C. pulcherrima
1
1
-
-
1
-
-
C. tropicalis
6
6
-
-
6
-
-
C. utilis Mezisoučet: izolátů Mezisoučet: druhů
1 125 (100 %) 21 (100 %)
Mimo referenční kmeny C. famata 4 C. pararugosa Cekem: izolátů Celkem: druhů
3 132 (100 %) 23 (100 %)
g)
i)
i)
-
g)
1 82 (65,6 %) 16 (76,2 %) j)
38 (30,4 %) 4 (19 %) j)
5 (4 %) 2 (9,5 %) j)
87 (69,6 %) 16 (76,2 %)
1 4 (3,2 %) 2 (9,5 %)
34 (27,2 %) 3 (14,3 %)
4
-
-
4
-
-
3 89 (28,8 %) 18 (78,3 %) j)
38 (28,8 %) 4 (17,4 %) j)
5 (3,8 %) 2 (8,7 %) j)
91 (69 %) 17 (73,9 %)
4 (3 %) 2 (8,7 %)
3 37 (28 %) 4 (17,4 %)
Tabulka 7: Klinické izoláty kandid identifikované pomocí fenotypových metod (CandidaTest21 a API ID 32C), HRMA a sekvenování: vyřazeny,
b)
a)
poly-fungální vzorky byly
použita rozmezí hodnot Tm ± 3SD (Tabulka 6) a tvar dMelt křivky, 46
c)
všechny
vzorky byly ověřeny pomocí sekvenační reakce,
d)
detekovány heterogenity (více viz text),
nebylo možné rozlišit druhy C. guilliermondii/C. fabianii, C. orthopsilosis/C. metapsilosis,
g)
f)
e)
nebylo možné rozlišit druhy
identifikovány jako C. utilis/C. pelliculosa,
h)
spolehlivě
odlišeny od C. albicans dodatečným použitím aglutinačního testu Bichro-Dubli Fumouze,
i)
identifikovány jako C. parapsilosis, j) celkové procentuální zastoupení přesáhlo 100%, jelikož bylo sedm izolátů C. metapsilosis zařazeno do kategorie “správně zařazeno do skupiny” a dva izoláty do “neidentifikováno”.
Osmdesát dva izolátů (65,6 %), zastupujících 16 druhů (76,2 %), bylo identifikováno správně pouze s využitím hodnot Tm ± 3 SD vypočítaných z korespondujících referenčních druhů nebo ve spojení s tvarem křivky tání. Přestože se okraje rozmezí hodnot Tm ± 3 SD u referečních kmenů druhů C. utilis/C. fabianii, C. inconspicua/C. californica a C. krusei/C. norvegensis překrývaly, u klinických izolátů těchto druhů nebylo nutné využít dodatečné dourčení pomocí zobrazení křivek odlišností vzhledem k C. krusei, jelikož se jejich hodnoty Tm nepřekrývaly. Sekvenační reakce odhalila intradruhové heterogenity u C. albicans (4/13 klinických izolátů se odlišovaly od referenčního kmenu v 1 bázi), C. norvegensis (ve 3 bázích u 4/4), C. intermedia (v 1 bázi u 1/1) a C. lipolytica (v 1 bázi u 1/3). V žádném z těchto případů ale neměla tato odlišnost za následek chybu v druhovém zařazení izolátu. U dalších 38 izolátů (30,4 %), zastupujících 4 druhy (19,0 %), nebylo možné rozlišení mezi dvěma
druhy
(C.
fabianii/C.
guilliermondii
u
26
vzorků
a
C. orthopsilosis/C. metapsilosis u 12 vzorků). Heterogenita v 1 bázi v sekvencích ITS2 klinických izolátů C. guillermondii (6/6) a C. metapsilosis (4/9) oproti ITS2 referenčních kmenů jejich druhové zařazení neovlivnila. Pět klinických izolátů (4,0 %), zastupující dva druhy (9,5 %), nebylo možné identifikovat (C. lambica ve 3/3 případech a C. metapsilosis ve 2/9). Tyto izoláty se totiž od referečních kmenů lišily ve 4, resp. v 1 bázi v takových místech, že způsobily posun hodnot Tm mimo rozsah Tm ± 3 SD referenčních kmenů a identifikace nebyla možná (Tabulka 7, Obrázek 14). Všech těchto pět izolátů ale mělo jedinečný tvar křivky, který nebyl zaměnitelný s tvarem křivky jiného druhu kandidy v našem seznamu. U klinických izolátů C. metapsilosis byly detekovány dvě různé heterogenity v jedné bázi vzhledem k referenčnímu kmeni (Obrázek 14). Zatímco heterogenita v pozici 218 amplikonu ITS2 výrazně neovlivnila hodnotu Tm ani tvar dMelt křivky, druhá na pozici 141 měla za následek vznik tří píků a 47
znemožnila identifikaci těchto izolátů. Z již zmíněných 11 poly-fungálních izolátů (dle sekvenační reakce) nebyla u dvou z nich možná identifikace. U zbylých devíti byla křivka tání odchýlena od referenční jen do té míry, že umožnila určení alespoň jednoho převažujícího druhu, který byl shodný s dodaným druhem dle fenotypové identifikace. Nicméně dané izoláty byly po identifikaci pomocí fenotypových metod dodány jako jednodruhové.
Obrázek 14: Heterogenity v devíti klinických izolátech C. metapsilosis oproti referenční sekvenci ozn. K24: oranžově pozice 141, zeleně pozice 218, (modře pozice 245 a 246 v ITS2 sekvenci, které byly použity Bormanem a kol. (2010)44 pro odlišení C. parapsilosis, C. orthopsilosis a C. metapsilosis je u všech našich izolátů C. metapsilosis stejná tzn. vhodná pro jejich identifikaci.) K zobrazení použit software MEGA4166.
4.1.5 Fenotypová identifikace klinických izolátů Na základě fenotypových metod bylo všech 5 izolátů C. orthopsilosis a 9 izolátů C. metapsilosis mylně identifikováno jako C. parapsilosis. Dalších 20 izolátů C. fabianii bylo mylně zařazeno jako C. utilis/C. pelliculosa a 4 izoláty (3 izoláty C. pelliculosa a 1 izolát C. utilis) od sebe nebylo možné rozlišit. Tři klinické izoláty dodané do naší laboratoře jako C. rugosa byly nakonec identifikovány pomocí sekvenační reakce jako C. pararugosa (Tabulka 7). Zbylé klinické izoláty byly do druhu zařazeny správně.
4.2 UNB-qPCR a sekvenování 4.2.1 Dekontaminace UNB-qPCR Širokospektrá real-time PCR pro detekci bakterií bývá zatížena falešně pozitivními výsledky díky kontaminaci přítomné v komerčně dostupných reagenciích104. Reakce pro testování 48
úspěšnosti dekontaminace byla provedena v „single-plex“ uspořádání, tj. pouze s primery pro detekci bakterií. Pro kontrolu dekontaminace byla k sadě desítkově ředěného plazmidu PK-SA zařazena i NK (místo templátu sterilní voda) a TNK (pouze MM doplněný do výsledného objemu již před dekontaminací, pokud to bylo technicky možné). Z tabulky 9 vyplývá, že Alu I, i přes negativní NK, nedekontaminovala uspokojivě TNK. Po filtraci MM přes kolonky YM-100 sice NK byla negativní, ale pravděpodobně jen díky snížené senzitivitě reakce, která (po porovnání s neošetřeným MM) po filtraci nastala. Dále nebylo možné při filtraci zařadit TNK, jelikož se MM musel filtrovat celý a až poté pipetovat do mikrozkumavek. Dekontaminace MM pomocí MOP a Bsp 143I měla nejlepší výsledky, i když byla detekována slabá pozitivita v NK (Ct 39,80 a 39,67), což byl záchyt na hranici teoretického detekčního limitu dané reakce (Y-Intercept: 39,56). NK byly detekovány pouze v jednom vzorku z duplikátu (reakce byly opakovány ve dvou nezávislých měřeních). Reakce ošetřená MOP vykazovala ze všech testovaných možností nejlepší parametry PCR v reálném čase: slope: -3,23, R2: 0,994 a efektivitu (výtěžnost) 103,82 % oproti reakci s Bsp 143I, která měla slope: -2,98, R2: 0,985 a efektivitu 116,74 %. Dle obecných doporučení by měla vyhovující PCR v reálném čase dosahovat efektivity 90 – 110 %, což koresponduje s hodnotou slope -3,58 až -3,10167. Dále byla optimalizována koncentrace MOP, následná doba inkubace při 4 °C a doba osvícení MM pomocí UV. Množství MOP o výsledné koncentraci 8,4 µg/ml na reakci (před přidáním templátu a IAC) s inkubací 60 min při 4 °C a osvícením 5 min UV (30 J/m2) bylo dostatečné pro dekontaminaci MM.
typ dekontaminace AluI 0,5U/r Bsp 143I 0,5U/r MOP (8,4 μg/ml) Kontrola: zahřátí 37 °C/ 190 min + 65 °C/25 min Neošetřený MM YM-100 20 min/ 3000 rpm
Ct hodnoty PK_SA (kopie/PCR) 7 × 104 7 × 103 7 × 102
7 × 101
NK
26,61 (0,11) 29,84 (0,36) 33,35 (0,08) 34,66 (1,11) -
TNK 39,37 (2,69)
27,91 (0,07) 31,49 (0,21) 33,58 (0,09) 38,11 (0,22) 39,80 (0,00) 27,76 (0,11) 31,35 (0,08) 34,31 (0,47) 37,37 (0,09) 39,76 (0,00) 26,94 (0,04) 30,19 (0,01) 33,44 (0,11) 33,63 (0,66) 30,86 (0,00) 36,19 (1,32) 26,68 (0,05) 30,21 (0,03) 33,27 (0,19) 32,96 (0,91) 36,85 (0,00) 38,38 (0,45) 32,96 (0,24) 36,38 (0,10) 39,72 (0,12) 41,96 (0,00) -
-
Tabulka 8: Výsledek dekontaminace TaqMan Gene Expression Master Mixu (Life Technologies, USA) pro detekci bakterií (zde single-plex PCR).
49
4.2.2 Senzitivita a specificita UNB-qPCR Analytická senzitivita UNB-qPCR byla testována za použití desítkově ředěné pozitivní kontroly PK-SA jako templátu (Obrázek 15, Tabulka 9). Analytický detekční limit UNB-qPCR byl vyhodnocen jako koncentrace 7 kopií plazmidu PK-SA/PCR při použití IAC o koncentraci 7 × 102 kopií/PCR. Efektivita UNB-qPCR byla 94,4 %, slope: -3,465, intercept: 40,284, r2: 0,998. Lineární dynamický rozsah duplexní UNB-qPCR: 7 × 100 - 7 × 107 kopií PK-SA/PCR, tj. Ct hodnoty PK-SA: 39,79 – 15,83. Reakce UNB-qPCR byla optimalizována tak, aby bylo možné detekovat IAC nejvýše do koncentrace cca 7 × 103 kopií cílové DNA/PCR, kdy je nejvyšší riziko, že nebude inhibice real-time PCR odhalena.
← PK-SA
← IAC
Obrázek 15: Analytická senzitivita duplexní reakce UNB-qPCR – zobrazeno na 2% agarózovém gelu barveném ethidium bromidem: M100 - velikostní žebříček (Fermentas, Litva), NK – negativní kontrola, číselné vyobrazení log kopií PK-SA/PCR, IAC o koncentraci 7 × 102 kopií/PCR
log kopií PK-SA/PCR 7,85 6,85 5,85 4,85 3,85 2,85 1,85 0,85 NK
Ct PK-SA (SD) 15,83 (0,08) 19,01 (0,02) 22,11 (0,32) 25,67 (0,13) 29,31 (0,13) 33,28 (0,57) 36,37 (0,19) 39,79 (0,48) -
Ct IAC (SD) 38,49 (0,26) 37,24 (0,32) 37,09 (0,19) 37,10 (0,20)
Tabulka 9: Analytická senzitivita duplexní reakce UNB-qPCR, Ct hodnoty PK-SA a IAC (o koncentraci 7 × 102 kopií/PCR), NK – negativní kontrola 50
DNA všech sbírkových bakteriálních kmenů (Tabulka 5) byla amplifikována a výsledný UNB-qPCR produkt se na 2 % agarózovém gelu barveném ethidium bromidem shodoval délkou s produktem PK-SA (Obrázek 16) Podobně tomu bylo s produkty amplifikovanými z DNA vyizolovanými přímo z klinického materiálu (data neuvedena). Při detekci DNA ze sbírkových bakteriálních kmenů a bakteriální DNA z klinického materiálu nebyly po UNB-qPCR detekovány nespecifické produkty.
↑ IAC
Obrázek 16: Příklad amplifikace CCM kmenů UNB-qPCR – ověření specifického nasedání primerů. 1) Str. pyogenes, 2) Str. agalactiae, 3) S. epidermidis, 4) S. enterica, 5) P. aeruginosa, 6) L. monocytogenes, 7) K. pneumoniae, 8) E. coli, 9) E. faecium, M100 - velikostní žebříček (Fermentas, Litva), NK – negativní kontrola, PK – (PK-SA) o koncentraci 7 × 104 kopií/PCR, IAC o koncentraci 7 × 102 kopií/PCR
4.2.3 Sekvenování referenčních kmenů bakterií U všech referenčních kmenů bakterií potvrdilo sekvenování druhové zařazení dodané sbírkami. Vybraná oblast genu 16S rRNA nebyla vhodná pro přesné rozlišení několika druhů bakterií v testovaných databázích (Tabulka 10). U E. coli (CCM 3954) identifikované jako Shigella flexneri/sonnei/Escherichia fergusonii/coli se ovšem nejedná o chybu, jelikož jsou Shigella flexneri a S. sonnei považovány za sérovary patogenních E. coli a z taxonomického hlediska by měly nést označení E. coli168. Všechny databáze správně zařadily referenční bakteriální kmeny do rodu, lišily se ale výsledkem druhové identifikace, kdy jednotlivé použité databáze vykazovaly shodu s dalšími druhy v rámci rodu nebo ukázaly odlišný výsledek od sbírkového zařazení (Tabulka 11).
51
Referenční Sbírkové kmeny bakterií označení BLAST B. fragilis CCM 4508 B. fragilis Shigella sonnei/ Escherichia fergusonii/coli
E. coli
CCM 3954
E. faecalis
CCM 4224 E. faecalis
E. faecium
CCM 2308 E. durans/faecium
F. necrophorum CCM 5981 F. necrophorum Kl. pneumoniae CCM 4415 Kl. pneumoniae
SepsiTest BLAST 16DB B. fragilis/Weeksella virosa B. fragilis Shigella flexneri/sonnei/ Shigella flexneri/ Escherichia Escherichia fergusonii fergusonii/coli E. faecalis E. faecalis E. villorum/durans/ E. ratti/hirae/durans hirae/ratti F. necrophorum F. necrophorum Kl. pneumoniae Kl. granulomatis
EzTaxon B. fragilis E. coli group (E.coli, S. flexneri, S. sonnei, S. boydii, E. albertii, S. dysenteriae, E. fergusonii ) E. faecalis E. faecium F. necrophorum Kl. granulomatis
L. gallinarum/ crispatus/acidophilus
L. acidophilus
L. crispatus
L. L. monocytogenes/welshimeri/ monocytogenes CCM 7202 seeligeri/ivanovii/innocua
L. welshimeri/seeligeri/ ivanovii/innocua
Listeria monocytogenes
Listeria monocytogenes
P. acnes P. aeruginosa S. aureus S. enterica S. epidermidis
P. acnes P. aeruginosa S. aureus/simiae S.enterica S. epidermidis/capitis
P. acnes P. aeruginosa S. aureus S.enterica S. epidermidis/caprae
P. acnes P. aeruginosa S. simiae S.enterica S. epidermidis
S. haemolyticus CCM 2729 S. haemolyticus
S. hominis
S. haemolyticus/ hominis
S. petrasii group (S petrasii, S. jettensis)
S. marcescens
CCM 303
S. marcescens
S. marcescens
S. marcescens group (S. marcescens, S. nematodiphila)
Str. agalactiae
CCM 6187 Str. agalactiae
Str. agalactiae
Str. anginosus
CCM 7437 Str. anginosus
Str. intermedius
Str. agalactiae Str. intermedius/anginosus
L. crispatus
CCM 7010 L. crispatus/acidophilus/ helveticus
52
CCM 3343 CCM 1960 CCM 4750 CCM 4420 CCM 6187
P. acnes P. aeruginosa S. aureus S.enterica S. epidermidis
S. marcescens/nematodiphila
Str. constellatus CCM 7445 Str. constellatus
Str. constellatus
Str. constellatus
Str. agalactiae Str. anginosus Str. constellatus group (3 subsp. Str. constellatus)
Str. mitis
CCM 7411 Str. mitis/oralis
Str. pneumoniae
CCM 4501
Str. pyogenes
CCM 7418 Str. pyogenes
Str. pseudopneumoniae/ pneumoniae
Str. oralis/mitis/infantis
Str. oralis/mitis/infantis
Str. infantis
Str. pseudopneumoniae/ pneumoniae
Str. pseudopneumoniae/ pneumoniae
Str. pneumoniae
Str. pyogenes
Str. pyogenes
Str. pyogenes
Tabulka 10: Identifikace sbírkových kmenů bakterií pomocí čtyř veřejně dostupných databází sekvencí genu 16S rRNA s využitím sekvencí vymezených UNB-qPCR (databáze testovány v roce 2014)
53
databáze BLAST SepsiTest BLAST 16 DB EzTaxon
více druhů včetně právě 1 správný správného (%) druh (%) 100,0 61,9 81,0 47,6 85,7 57,1 81,0 71,4
odlišný/é druh/y (%) 0,0 19,0 14,3 19,0
Tabulka 11: Identifikace 21 sbírkových kmenů do druhu, vzhledem ke sbírkovému zařazení, pomocí čtyř databází
4.2.4 Detekce bakteriální DNA přímo z klinického materiálu Bylo analyzováno 28 prospektivně sbíraných vzorků srdečních tkání (chlopní) z období květen 2013 až květen 2014 od pacientů s podezřením na IE a kontrolní soubor 20 pacientů s jinou diagnózou než IE. V analyzovaném souboru bylo zahrnuto 20 mužů a 8 žen a skupina byla průměrného věku 56 let. Kontrolní skupina pacientů byla složena z 11 mužů a 9 žen a dosahovala průměrného věku 67 let. 4.2.4.1 Výsledky end-point PCR a UNB-qPCR Hodnoty Ct u pozitivních klinických vzorků byly detekovány v rozmezí 16,80 - 36,38, resp. 35,84 (vysvětlení viz níže) s průměrnou hodnotou 27,54, resp. 27,22. U většiny vzorků byla detekována i příslušná IK (od negativních až po Ct 34,34 s průměrnou hodnotou 37,83). Ke stanovení pozitivity bylo nutné využít rozdílu Ct klinického vzorku a jeho IK. Testovány byly hranice rozdílu 1,5 Ct, 2,0 Ct a 2,5 Ct. Dle senzitivity a specificity stanovené na základě klinické diagnózy pacientů (28 chlopní bylo považováno za pozitivní a 20 za negativní) byl za hranici, nad níž byl klinický vzorek považován za pozitivní, vyhodnocen rozdíl 2 Ct se senzitivitou 93 % a specificitou 95 % (Tabulka 12).
rozdíl Ct vzorku a IK senzitivita (%) specificita (%) 1,5 93 75 2,0 93 95 2,5 82 100
Tabulka 12: Senzitivita a specificita UNB-qPCR pro vybrané hodnoty hranic rozdílu Ct vzorku a přísulušné IK, založeno na klinické diagnóze
54
Pro porovnání výsledků identifikace UNB-qPCR byla použita metoda end-point PCR s následným sekvenováním patogenu. Výsledky sekvenace po UNB-qPCR se shodovaly s identifikací pomocí sekvenování po end-point PCR. Výjimkou byl opakovaný záchyt jednoho slabě pozitivního vzorku s hodnotou Ct 36,38 (rozdíl Ct IK a Ct vzorku byl 4,18) pomocí UNB-qPCR, který ale nebyl na agarózovém gelu zřetelný a nebylo jej možné identifikovat ani pomocí sekvenační reakce, zatímco při end-point PCR byl negativní. Za shodu při identifikaci streptokoků byla považována již identifikace do rodu nebo skupiny. Přidanou hodnotou UNB-qPCR oproti end-point PCR bylo lepší rozlišení streptokoků zejména
ve skupině
Streptococcus
sk.
anginosus
a
také
mezi Str. mitis/oralis
a
Str. pneumoniae (Tabulka 13). U pacienta č. 1 byl pomocí UNB-qPCR detekován Str. sanguinis a pomocí end-point PCR Str. sk. anginosus. Jelikož byla u tohoto vzorku (pacient č. 1) HK i kultivace chlopně negativní a histopatologie (HI) chopně nebyla provedena, byl osekvenován delší úsek genu 16S rRNA (1455 bp)12 a potvrzena identifikace Str. sanguinis. Při využití hranice rozdílu 2 Ct vzorku a jeho IK bylo z kontrolní skupiny 20 pacientů pomocí UNB-qPCR 19 chlopní negativních a 1 pozitivní. 4.2.4.2 Výsledky hemokultivace, kultivace chlopní a UNB-qPCR Z 28 pacientů jich 21 mělo pozitivní hemokultury (HK), 5/28 negativní a 2/28 pacientům nebyla odebrána krev na HK. Mikroorganismy detekované pomocí HK byly stafylokoky (14/28), z toho jeden ve smíšené kultuře s E. faecalis, streptotoky (5/28), E. faecalis (3/28), z toho jeden ve smíšené kultuře se stafylokokem. Ve třech případech se jednalo o koaguláza negativní stafylokoky (STKN) zachycené pouze v jedné HK. Z 28 per-operačně odebraných chlopní bylo 12 kultivačně pozitivních, ze zbylých 16 kultivačně negativních byla u 10 z nich zachycena pozitivita HK. Negativita kultivace chlopně mohla být zapříčiněna antibiotickou terapií. Z 10 pacientů, u nichž byla pozitivní HK i kultivace chlopně, se tyto dvě metody v druhové identifikaci patogena shodovaly v 5 případech a částečně ve zbylých 5 případech. Výsledky histopatologického vyšetření jsou shrnuty v Tabulce 14. U 12/28 pacientů nebyla tkáň na histopatologii (HI) odeslána. Chlopeň u pacienta č. 5 byla pozitivní na HI, ale HK i kultivace z chlopně byly negativní, ve výsledku byl pomocí UNB-qPCR detekován Streptococcus mitis/oralis. Naopak dva pacienti č. 6 a 7, u nichž byly kultivace chlopní i jejich HI negativní, měly výsledky HK pozitivní (Str. sanguinis a S. aureus), ale pouze S. aureus byl potvrzen i pomocí UNB-qPCR. Z 26 UNB-qPCR pozitivních vzorků mělo 5 negativní HK a 19 pozitivní, u zbylých 55
2 pacientů nebyla HK odebrána. Z 19 vzorků s pozitivním výsledkem dosaženým pomocí PCR i HK se výsledky identifikace patogenu shodovaly u 14 pacientů (pokud byli zahrnuti i pacienti č. 26 a 28 s identifikací streptokoků pouze do skupin a č. 25 s 2 patogeny v HK), zatímco u 5 pacientů se závěry oboud metod lišily (včetně pacienta č. 14, u něhož nebyla identifikace možná). Pomocí HK ani kultivace chlopně nebylo možné identifikovat růstově náročné bakterie H. parainfluenzae a A. urinae. Ale i běžně kultivovatelné mikroorganismy jako např. koaguláza-negativní stafylokok (1/28) nebo streptokoky (5/28) nebyly pomocí HK ani kultivace chlopně zachyceny a naopak end-point PCR i UNB-qPCR u nich bakteriální DNA detekovaly (Tabulka 13). Zajímavé bylo zjištění, že u šesti pacientů, u nichž byl dle obou PCR identifikován S. aureus, byl tento detekován i v HK, ale ne v kultivacích z chlopní (s výjimkou pacienta č. 9). Pomocí end-point PCR byly detekovány 3 negativní chlopně (pacienti č. 6, 14, 19), z nichž jedna (pacient č. 14) byla pomocí UNB-qPCR označena za slabě pozitivní, i když se ukázalo, že s největší pravděpodobností falešně (viz kapitola 4.2.4.1). U tohoto vzorku nebylo možné pomocí UNB-qPCR dourčit patogena, z HK byl vykultivován S. aureus a z chlopně STKN a E. faecalis. U dvou PCR negativních chlopní (pacienti č. 6, 19) byly negativní i kultivace chlopně, ale HK pozitivní (Str. sanguinis, E. faecalis). Na základě identifikace založené na sekvenaci vzorků od pacientů s IE, je možné konstatovat, že nejčastějšími původci IE v uvedeném souboru byly rody Staphylococcus sp. (10/28) a Streptococcus sp. (10/28). Dalšími patogeny byly E. faecalis (2/28), H. parainfluenzae (2/28) a A. urinae (1/28) (tabulka 13).
56
pacienti
č. 1 2 3
57
4 5 6 7 8
detekce patogenů PCR a sekvenování z chlopně (identifikace pomocí BLAST)
HK před antibiotickou terapií
pohlaví věk Z 21 M 60 α-hemolytický M 73 streptokok M 78 # M 42 Z 54 Str. sanguinis M 64 S. aureus M
57 1 × STKN
9 10 11 12 13
Z Z M M M
76 49 31 41 32
14
M
58 S. aureus
15 16 17 18 19 20 21 22
M M Z M M M M M
61 52 43 62 85 55 66 44
S. aureus S. aureus S. aureus 1 × STKN -
S. epidermidis S. epidermidis # 1 × STKN E. faecalis S. aureus E. faecalis S. aureus
kultivace chlopně -
HI end-point patogen detekovaný pomocí chlopně PCR end-point PCR # + Str. sk. anginosus + Str. epidermidis/hominis
UNB-qPCR¥ + +
patogen detekovaný pomocí UNB-qPCR Str. sanguinis Str. epidermidis
-
+
+
A. urinae
+
A. urinae
S. aureus STKN + Str. agalactiae S. aureus STKN STKN + E. cloacae STKN STKN STKN E. faecalis -
# + -
+ + +
Str. sk. anginosus Str. sk. mitis/Str. pneumoniae S. aureus
+ + +
Str. constellatus Str. mitis/oralis S. aureus
+
+
Str. agalactiae
+
Str. agalactiae
# # + # #
+ + + + +
S. aureus S. aureus S. aureus H. parainfluenzae Str. mutans
+ + + + +
S. aureus S. aureus S. aureus H. parainfluenzae Str. mutans
#
-
-
+
-
+ + # + # # + +
+ + + + + + +
S. epidermidis S. epidermidis Str. sk. sanguinis/australis H. parainfluenzae S. aureus E. faecalis S. aureus
+ + + + + + +
S. epidermidis S. epidermidis Str. sp./australis H. parainfluenzae S. aureus E. faecalis S. aureus
23 24
M Z
25
M
26
Z
27
M
28
Z
68 Str. constellatus 37 E. faecalis + 63 S. haemolyticus
-
+ -
+ +
Str. sk. anginosus Str. sk. anginosus
+ +
Str. anginosus Str. constellatus
E. faecalis
+
+
E. faecalis
+
E. faecalis
+
+
Str. sk. mitis/Str. pneumoniae
+
Str. mitis/oralis
#
+
S. epidermidis
+
S. epidermidis
#
+
Str. sk. anginosus
+
Str. anginosus
viridující streptokok STKN + Str. pneumoniae 44 S. epidermidis STKN α -hemolytický 79 streptokok 61
Tabulka 13: Porovnání výsledků HK před léčbou, kultivací chlopní po operaci a výsledků detekce bakteriální DNA v chlopních 28 pacientů
s podezřením na IE: HI histopatologie, ¥ výsledek na základě rozdílu Ct IK a vzorku s hranicí 2 Ct, Z žena, M muž, ATB antibiotika, + pozitivní, 58
- negativní, # neodebráno, STKN koaguláza-negativní stafylokok
5
DISKUZE
5.1 UNF-qPCR a HRMA V předkládané práci byla kombinována kultivace kandid s real-time PCR a HRMA pro rychlé druhové dourčení kandid. Bylo testováno 143 klinických izolátů a hodnoty z HRMA porovnali s hodnotami 25 referenčních kmenů kandid (průměrné Tm ± 3 SD a tvar křivky tání). Dvacet jedna z dvaceti pěti referenčních kmenů bylo identifikováno jednoznačně. U klinických izolátů bylo pomocí HRMA možné rozlišit a dourčit 18 z 23 dodaných druhů kandid. Klinické izoláty C. lambica bylo možné odlišit také, i když jasná identifikace nemohla být provedena díky odlišnosti sekvencí oproti referenčnímu kmeni. Pro druhy C. californica, C. saitoana, C. rugosa a C. zeylanoides nebyly klinické izoláty k dispozici, ale v rámci referenčních kmenů bylo možné tyto druhy jednoznačně rozlišit. Vezmeme-li v úvahu klinické i referenční kmeny, byla metoda HRMA schopna rozlišit 23 z 27 druhů kandid, přičemž zbylé 4 druhy byly zařazeny do dvou skupin (párů). Doposud nikdo netestoval a zároveň neodlišil takto široké spektrum druhů kandid pomocí HRMA, navíc s využitím 143 klinických izolátů pokrývajících 23 druhů kandid k validaci metody. Mandviwala a kol. (2010)86 odlišili 8 druhů kandid pomocí ITS1 a ITS2 oblastí s použitím relativně náročné analýzy v MS Excel. Arancia a kol. (2011)88 popsali postup pro identifikaci 5 druhů kandid na základě genu MP65 a analýzy založené pouze na tvaru křivky tání resp. další typ analýzy nebyl v dané publikaci popsán. Goldschmidt a kol. (2012)90 publikovali přístup založený na sekvenci 18S rDNA, díky němuž odlišili pomocí HRMA 5 kandid a 6 vláknitých hub, které zároveň byly v dané sadě vzorků pro analýzu a identifikaci kandid nezbytné. Somogyvari a kol. (2012)89 odlišili 10 druhů kandid s použitím ITS2 sekvence, ale všechny musely být v každém běhu použity jako pozitivní kontroly, aby je bylo možné pomocí HRMA spolehlivě identifikovat. Decat a kol. (2013)91 identifikovali 17 druhů a další jeden pár kandid pomocí HRMA analýzy sekvence ITS2 s využitím 5 kandid jako pozitivních kontrol v běhu a dvou srovnávacích schémat. Alnuaimi a kol. (2014)92 použili HRMA k odlišení 9 druhů kandid na základě ITS1, 5,8S a ITS2 sekvencí a osmi pozitivních kontrol (druhů kandid) v každém běhu. 5.1.1 Heterogenity v klinických izolátech a obtížně rozlišitelné druhy Přestože se HRMA ukázala být v této studii dobrou metodou pro odlišení kvasinek, nebylo možné jednoznačně identifikovat 4 referenční kmeny (C. orthopsilosis vs. C. metapsilosis,
59
C. fabianii vs. C. guillermondii) a 5 klinických izolátů (C. orthopsilosis vs. C. metapsilosis, C. fabianii vs. C. guillermondii, C. lambica). Hodnoty Tm ± 3SD pro referenční i klinické izoláty C. orthopsilosis a C. metapsilosis se opakovaně vyskytovaly v překryvech, a proto byly tyto dva druhy zahrnuty do jedné skupiny dvou neodlišitelných druhů. Nicméně rozlišení obou druhů není považováno za nutné a ani komerčně dostupné kity nejsou schopny rozlišit druhy v rámci komplexu C. parapsilosis169. Klinické izoláty C. metapsilosis odhalily tři různé typy heterogenit v sekvenci ITS2. Dvě varianty neovlivnily správné zařazení druhu do „skupiny“, ale další varianta způsobila, že se změnil tvar křivky tání ze dvou vrcholů na tři, což znemožnilo zařazení dvou izolátů, jejichž křivky tání ovšem nebylo možné zaměnit za křivky tání jiných druhů testovaných kandid. Bylo také zjištěno, že všechny klinické izoláty C. metapsilosis jsou v pozicích 245 a 246 v PCR produktu ITS2 sekvence shodné a C. metapsilosis by tedy mohly být identifikovány dle dříve publikovaného přístupu pro odlišení kandid skupiny *psilosis44. Další možností jejich identifikace by mohlo být využití kapilární elektromigrační techniky, jak jsme ukázali dříve170. Přestože mají C. fabianii a C. guilliermondii zcela odlišné sekvence oblasti ITS2, jejich hodnoty Tm ± 3SD se překrývaly a nebylo možné tyto dva druhy od sebe pomocí HRMA odlišit. Důvodem mohlo být stejné zastoupení GC bází v sekvencích referenčních i klinických izolátů. S využitím fenotypové identifikace může být C. guilliermondii v rámci těchto dvou druhů jednoznačně rozeznána, což byl také případ našich vzorků. Na druhé straně, C. guilliermondii může být pomocí biochemických testů mylně určena jako C. famata (D. hansenii)171. K jednoznačné identifikaci izolátů těchto tří druhů je tedy vhodné využít kombinaci obou přístupů. HRMA dále nebyla schopná zařadit do druhu tři klinické izoláty C. lambica, jelikož se v sekvenci ITS2 lišily o 4 nukleotidy oproti referenčnímu kmeni. Přestože nemohly být zmíněné izoláty identifikované, všechny měly jedinečný tvar křivky tání znemožňující tak jejich záměnu s jiným druhem testovaných kandid. HRMA je citlivá metoda schopná odlišit sekvence s minimálními odlišnostmi, což na druhou stranu může znesnadnit správnou druhovou identifikaci patogena v případech, kdy je založena na sekvenci, která je u patogena vnitrodruhově variabilní. Nicméně tato limitace se může stát i výhodou v případech, když je HRMA využita k určení genotypu klinických izolátů pro epidemiologické účely92. 5.1.2 Odlišení fenotypově podobných kandid Jak
již
bylo
zmíněno,
pomocí
HRMA
nebylo
možné
rozlišení
C. orthopsilosis/C. metapsilosis. Umožnila ale odlišit C. orthopsilosis/C. metapsilosis 60
od C. parapsilosis, což může být důležité, jelikož mohou být C. orthopsilosis a C. metapsilosis citlivé k antimykotikům více než C. parapsilosis172. V předkládané studii byly pomocí HRMA všechny izoláty C. parapsilosis, které jsou ze všech tří druhů *psilosis skupiny
klinicky
nejvýznamnějším
druhem,
jasně
identifikovány
a
odlišeny
od C. orthopsilosis/C. metapsilosis. Možnosti odlišení C. metapsilosis od zbylých druhů byly uvedeny v předchozí kapitole. Dále je pomocí fenotypových metod obtížné odlišit C. fabianii, C. pelliculosa a C. utilis, všechny mají totiž podobné znaky a mohou být mezi sebou zaměněny10, což se také u našich klinických izolátů stalo. C. fabianii navíc není zahrnuta v komerčním kitu CANDIDAtest 21 ani v API-ID32C®, i když je schopná tvořit biolfilm a způsobit vážné infekce9,10. Všechny izoláty C. pelliculosa, C. utilis a C. fabianii byly pomocí HRMA odlišeny jednoznačně. Rozlišení albicans a C. dubliniensis je většinou založeno na biochemických testech, v nichž C. dubliniensis není schopna, na rozdíl od C. albicans, asimilovat D-xylózu (XYL), methyl-α-D-glukozid (MDG) a D-trehalózu (TRE), ale tyto testy ani testy založené na formaci pseudohyf a pravých hyf na speciálních médiích, např. Staibův agar173 nebo testy na produkci chlamydospor, nejsou schopny docílit jednoznačných výsledků174-176. Spolehlivé dourčení poskytne komerčně dostupný latex-aglutinační test, např. Bichro-Dubli Fumouze177, jako tomu bylo i v této studii, a podobně i HRMA tyto druhy jednoznačně odlišila. V předkládané studii bylo již poukázáno na několik výhod identifikace kandid pomocí HRMA. Na rozdíl od HRMA neumožňuje API-ID32C® (obsahující 34 druhů kandid kromě C. pararugosa) rozlišení C. norvegensis a C. inconspicua. CANDIDAtest 21 ve svém seznamu 24 druhů kandid nezahrnuje C. pulcherrima ani C. zeylanoides a neumožňuje odlišení C. rugosa od C. pararugosa. Dokonce ani pyrosekvenování neuspělo v identifikaci C. pararugosa, C. lambica a C. lipolytica44,178, které HRMA spolehlivě určila. 5.1.3 Poly-fungální vzorky Devět klinických izolátů bylo dle výsledků sekvenační reakce poly-fungálních. Převažující sekvence odpovídala druhu identifikovanému pomocí HRMA, zatímco fenotypová analýza tyto vzorky identifikovala jako jedno-druhové. Druh zastoupený v menším množství v těchto vzorcích lehce ovlivnil tvar křivky tání, ale ne tolik, aby znemožnil identifikaci převažujícího druhu. HRMA detekovala i dva poly-fungální vzorky, které nebylo možné její pomocí blíže specifikovat.
61
5.1.4 Spolehlivost veřejně dostupných databází pro identifikaci kandid Aplikace metody HRMA pro detekci a identifikaci kandid byla plánována již od roku 2009, kdy byly také ověřovány sekvence referenčních kmenů v uvedených databázích. V roce 2009 byla sekvence ITS2 kmene dodaného a označeného sbírkou jako D. hansenii (C. famata) (CCY 26-9-9) analyzována pomocí BLAST163 a vykazovala 100% shodu s D. hansenii (CBS 940, GenBank DQ249204). Při kontrole homologie sekvencí v roce 2011 byla v databázi GeneBank (Benson a kol. 2013)112 zjištěna nově vložená sekvence C. saitoana (ATCC 36584, Acc. No. HQ652067), která se se sekvencí (CCY 26-9-9) shodovala ve 100 % a s vyšším skóre než dříve D. hansenii (CBS 940, GenBank DQ249204). Byla proto porovnána sekvence
kmene
CCY
26-9-9
v Databázi
genomů
kandid
(CGD)
(http://www.candidagenome.org) se sekvencí genomu D. hansenii CBS767 a nebyla nalezena žádná shoda. Bylo tedy přistoupeno k rešerži publikací zabývajících se identifikací D. hansenii a byly potvrzeny závěry autorů Desnos-Olivier a kol. (2008)171, kteří navíc doporučují používání spolehlivé databáze (např. CBS) při identifikaci nejen tohoto druhu. Podobně byla pomocí BLAST163 analyzována i sekvence referenčního kmene označeného sbírkou jako C. valida (CCY 29-93-4) a byla odhalena nejlepší shoda se sekvencí P. membranifaciens (GenBank AY684146.1) (teleomorfa C. valida), která byla do GenBank vložena
roku
2005.
Databáze
Centra
pro
biodiverzitu
hub
(CBS)
(http://www.cbs.knaw.nl/Collections) ale vyhodnotila shodu se sekvencí C. californica (CBS 989, GenBank DQ104728), která byla do GenBank vložena roku 2006 pouze jako Candida sp. Wu a kol. (2006)179 poté navrhli pro CBS 989 označení C. californica. Jiné sekvence C. valida z database GenBank (DQ104724.1, JN214503.1, JN835451.1, JQ026345.1) a z databáze CBS (CBS 636, CBS 635, CBS 638, CBS 2150) se se sekvencí referenčního kmene C. valida (CCY 29-93-4) neshodovaly. Jen P. membranifaciens (GenBank AY684146.1) se shodovala se sekvencí (CCY 29-93-4) i s C. californica (CBS 989). Tato zjištění zdůrazňují potřebu používání spolehlivých ověřených databází jako např. CGD doporučovanou autory Boyanton a kol. (2008)180 a Costanzo a kol. (2006)181 nebo databázi CBS a nespoléhat pouze na veřejné databáze171,182.
5.2 UNB-qPCR a sekvenování 5.2.1 Dekontaminace qPCR Kontaminace způsobené bakteriální DNA jsou pro rutinní využití širokospektré PCR, zacílené 62
do genu 16S rRNA, problémem. Pokud pomineme kontaminace způsobené v pre-analytické fázi, tak zdrojem kontaminací mohou být reagencie používané pro izolaci, např. enzymy, které jsou získávány z bakterií, voda, lyzační roztok. Dalším rizikovým faktorem může být použitý plastik (mikrozkumavky a špičky) nebo přístroje (centrifugy, třepačky) a pipety v boxech183. Bylo publikováno několik postupů pro dekontaminaci nebo zamezení kontaminace PCR120,157,184,185. Běžně se v MM využívá enzym uracil-N-glykosyláza (UNG), který štěpí uracilové báze. TaqMan Gene Expression Master Mix (Life Technologies, USA), použitý v této reakci, UNG také obsahuje. K dekontaminaci jeho pomocí dojde za předpokladu, že jsou
v reakci
nahrazeny
thyminové
báze
za uracilové
s využitím
např.
2´-deoxyuridin-5´-trifosfátu (dUTP). Odstraněním uracilových bází působením UNG dojde k tvorbě nestabilních řetězců, které se během denaturace rozpadnou186. V popisované reakci ale zmíněné ošetření nebylo dostačující a byla proto testována dekontaminace pomocí enzymů (Alu I, Bsp 143I), MOP a filtračních kolonek YM 100. Vybrány byly enzymy, které ke své inaktivaci nepotřebují teplotu 95 °C, což by mohlo snížit aktivitu Taq-polymerázy. Výsledky byly hodnoceny pomocí Ct jednotlivých metod dekontaminace vzhledem k reakci, která nebyla ošetřena. Po dekontaminaci pomocí filtrace přes kolonky YM 100 došlo ke snížení senzitivity UNB-qPCR, podobné závěry publikovali i Corless a kol. (2000)184. Jako nejvýhodnější pro naši reakci byl vyhodnocen postup s použitím MOP, který se včlení do dvouřetězcové DNA a po ozáření UV světlem s ní utvoří kovalentní vazbu. MOP využili pro dekontaminaci master mixu úspěšně i Jinno a kol. (1990)187 nebo Hughes a kol. (1994)188 a méně úspěšně Corless a kol. (2000)184. Ošetření MM pomocí enzymů může mít za následek navýšení kontaminující DNA, která v nich může být přítomna nebo může selhat kvůli špatnému výběru enzymu, který nebude schopen štěpit kontaminující DNA184,189. Enzym může být také nedostatečně inaktivován před PCR a tím způsobit snížení její senzitivity, např. při použití Dnázy I184. Výsledky předkládané studie poukázaly na odlišnou míru dekontaminace pomocí enzymů v závislosti na jejich typu a koncentraci, kdy byl nejúspěšnější Bsp 143I (0,5 U/reakci). Ve srovnání s MOP, jehož výsledky byly podobné, je dekontaminace pomocí Bsp 143I dražší, z provozních důvodů byl tedy pro další optimalizace duplexní UNB-qPCR použit již pouze MOP v koncentraci 8,4 µg/ml. 5.2.2 Návrh exogenní nekompetitivní interní amplifikační kontroly pro UNB-qPCR Z důvodu předpokládaného využití metody UNB-qPCR v klinické praxi bylo přistoupeno 63
k navržení exogenní IAC zacílené do genomu S. latifolia. V popsaném přístupu náleží reakci pro cílovou DNA i IAC jejich vlastní pár primerů a reakce UNB-qPCR byla navržena a optimalizována jako duplexní. IAC pro duplexní reakci je přidávána zvlášť o výsledné koncentraci 7 × 102 kopií IAC/PCR. Optimalizovaná byla tak, aby byla detekovatelná nejvýše do koncentrace cílové sekvence 7 × 103 kopií PK-SA/PCR, kdy je dle našich zkušeností nejvyšší riziko, že nebude rozeznán falešně negativní vzorek. 5.2.3 Spolehlivost veřejně dostupných databází pro identifikaci bakterií Pomocí sekvencí získaných po UNB-qPCR u 21 sbírkových kmenů bakterií byla ověřena spolehlivost identifikace bakterií s využitím čtyř různých databází. Všechny zařadily sbírkové kmeny správně do rodu. Vzhledem ke klinické relevanci výstupů (příp. následné antibiotické terapii), byla jako nejvýhodnější vybrána databáze GenBank112, jelikož vydala správné druhové zařazení u 100 % kmenů, i když v 61,9 % vykázala zároveň i jiné druhy, žádný sbírkový kmen ale nezařadila chybně. Jako nejpřesnější byla vyhodnocena databáze EzTaxon164,165, která 71,4 % druhů zařadila pouze do jediného správného druhu, ale podobně jako SepsiTest BLAST (Molzym, Německo) zařadila 19,0 % kmenů druhově chybně. 5.2.4 Detekce bakteriální DNA přímo z klinického materiálu I když byla analytická senzitivita UNB-qPCR byla stanovena na 7 × 100 kopií PK-SA/PCR, klinická senzitivita může být ovlivněna kontaminacemi. Pro budoucí využití UNB-qPCR je stěžejní, aby byl postup izolace DNA optimalizován a v IK nebyla detekována žádná kontaminující DNA. Tato může být přítomna např. v enzymech používaných při izolaci k rozrušení buněčné stěny bakterií, v roztocích dodávaných výrobci kitů nebo ve vodě, která je sice sterilní, ale může obsahovat zbytky DNA, dokonce i spotřební materiál (mikrozkumavky a špičky) nemusí být prostý DNA120,157,183-185. Důležité je i zajištění správné laboratorní praxe dle doporučení pro MIQE26. Metoda UNB-qPCR se přesto ukázala být přínosnou pro detekci DNA přímo z per-operačně odebraného materiálu (chlopní) u pacientů s podezřením na IE. Výhodou UNB-qPCR oproti end-point PCR byla kvantifikace nálože DNA jak ve tkáni, tak i v IK, což umožnilo odlišit kontaminující DNA získanou v průběhu izolačního procesu. Na rozdíl od sekvenování sbírkových bakteriálních kmenů, kdy pro úspěšné sekvenování produktu po UNB-qPCR stačilo přečištění PCR produktu, slabě pozitivní PCR produkty z klinického materiálu bylo nutné nanést na agarózový gel a následně je před sekvenační reakcí přečistit z gelu. Možnou příčinou mohla být nižší koncentrace pruduktu, kdy pouze 64
po jeho přečištění mohla v následné sekvenační reakci interferovat IAC i přesto, že je navržena se zcela jinými primery a primery pro cílovou DNA do sekvence IAC nenasedají. Dalším možným důvodem mohlo být nedostatečně účinné přečištění PCR produktů z klinických vzorků. Ke stanovení, zda je UNB-qPCR vhodná pro detekci bakteriální DNA přímo z klinického materiálu bylo analyzováno 28 chlopní od pacientů s podezřením na IE a 20 pacientů s jinou než infekční diagnózou. Výsledky UNB-qPCR byly srovnány s identifikací pomocí end-point PCR, HK a kultivací chlopní. Za shodu při identifikaci streptokoků byla považována již identifikace do rodu nebo skupiny. Detekce UNB-qPCR se shodovala s výsledky end-point PCR kromě jednoho slabě pozitivního vzorku (pacient č. 14), kdy se s velkou pravděpodobností jednalo o falešnou pozitivitu, která mohla být způsobena kontaminací vzorků v průběhu pre-analytické fáze nebo v izolačním postupu. Případ však nebylo možné definitivně rozhodnout, protože sekvenace slabého PCR produktu nebyla proveditelná, HK se u tohoto pacienta lišila od výsledků kultivace chlopně a tkáň na HI nebyla odebrána. Kontaminaci v průběhu nasazení UNB-qPCR byla vyloučena opakováním této reakce se stejným výsledkem. Dále byl u pacienta č. 1 pomocí UNB-qPCR detekován Str. sanguinis a pomocí end-point PCR Str. sk. anginosus. Problematickou byla i skupina Str. mitis/oralis, což je v souladu s publikovanými
výsledky133,
ale
oba
druhy
byly
pomocí
UNB-qPCR
odlišeny
od Str. pneumoniae, na rozdíl od výsledku end-point PCR. Všeobecně je možno konstatovat, že díky UNB-qPCR bylo možné dourčit většinu streptokoků ze skupin do jednotlivých druhů. Důvodem je výběr oblastí s větší sekvenční variabilitou V3 a V4 16S rRNA (UNB-qPCR) místo V8 a V9 (end-point PCR)107. Pouze pomocí PCR bylo v našem souboru možné identifikovat H. influenzae (2/28) a A. urinae (1/28). H. influenzae je kultivačně náročná bakterie patřící do skupiny méně obvyklých patogenů HACEK, kteří způsobují IE. A. urinae vzácně způsobuje IE a je v jeho spojitosti popisován rychlý postup onemocnění s vysokou mortalitou190. Identifikace A. urinae je pomocí standardních metod obtížná, patogen může být zaměněn za streptokoka, enterokoka nebo stafylokoka191. Vzhledem k malému počtu analyzovaného klinického materiálu (chlopní), nelze prokázat statistickou významnost přínosu UNB-qPCR pro detekci patogenů přímo z chlopně u pacientů s IE, ale vzhledem k předešlým publikacím95,125,130 ji lze předpokládat a výsledky předkládané pilotní studie toto předběžně potvrzují. Je nutné ověřit aplikaci UNB-qPCR na větším počtu pacientů a porovnat výsledky s hemokultivacemi před a po léčbě pacientů, s kultivacemi 65
chlopní a histopatologickými výsledky a výsledky Duke kritérií. UNB-qPCR byt tak mohla být vhodnou doplňující metodou ke klasickým kultivačním postupům. Výsledky kultivace chlopní málo korelují s výsledky HK a popisovaných PCR (Tabulka 13), což je ve shodě s publikovanými výsledky94,125. Ve většině případů se pravděpodobně jednalo o kontaminace (převážně STKN) nebo byly výsledky negativní z důvodu antibiotické léčby. Popsaná univerzální UNB-qPCR je rychlejší a citlivější metoda pro průkaz patogenů v srdeční tkáni u pacientů s podezřením na IE než standardní kultivace tkáně. Výhodou je také detekce kultivačně náročných nebo z již zmíněných důvodů nekultivovatelných bakterií. Na základě výsledků předkládané práce, je možné tuto metodu doporučit k doplnění diagnostických postupů IE především u pacientů, u nichž není známa etiolgie IE a HK přetrvávají negativní. 5.2.5 Širokospektrá PCR pro detekci bakterií Pomocí širokospektré PCR s následným sekvenováním je možné detekovat DNA jakékoli bakterie nezávisle na jejich nárocích na kultivaci nebo viabilitu. V rámci doktorského studia jsem měla možnost podílet se na čtyřech publikacích, které popisují přínos PCR pro klinickou praxi95,161,162,192
a
na
jedné
publikaci
zaměřené
na
identifikaci
nového
druhu
pseudomonády193. Vaněrková a kol. (2010)161 popsali kazuistiku IE způsobenou Cardiobacterium valvarum a zmínili užitečnost širokospektré PCR a sekvenování v detekci kultivačně náročných patogenů a v popisovaném případě i na špatnou odlišitelnost C. valvarum a C. hominis běžnými mikrobiologickými postupy. Slaný a kol. (2010)192 publikovali metodu rozlišení 12 stafylokoků pomocí HRMA. Přímou analýzou hodnot Tm a tvaru dMelt křivek bylo možné odlišit pouze dva druhy (S. capri a S. simulans), zbylé druhy byly zařazeny do tří skupin a odlišeny pomocí
heteroduplexní analýzy s E. coli,
S. pneumoniae a P. aeruginosa. Ve výsledku nebylo možné odlišit pouze dva druhy S. saprophyticus a S. xylosus. Ve spolupráci s Klinikou infekčních chorob ve Fakultní
nemocnici
Brno
(FN Brno)
byly
prezentovány
dvě
kazuistiky
meningoencefalitid
způsobených
Streptococcus
suis162.
poddiagnostikování
zmíněného
onemocnění
následovaná
Autoři
purulentních
naznačili
možnost
doporučením
doplnit
mikrobiologickou diagnostiku o vyšetření pomocí širokospektré PCR, pokud je u pacienta v anamnéze uveden kontakt s prasaty či syrovým vepřovým masem. Žaloudíková a kol. (2012)95 validovali specifickou detekci stafylokoků na peroperačně odebraných vzorcích srdečních tkání. Ze studie vyplývá přínos širokospektré PCR se sekvenováním a časová i finanční úspora specifické PCR pro diagnostiku IE, dále byl předložen návrh na doplnění PCR z chlopní do Duke-kritériií ke kultivaci tkání a histopatologii. Kosina a kol. (odesláno 66
do časopisu s IF)193 identifikovali nový druh pseudomonády, ale gen 16S rRNA (zvolen úsek dlouhý 1455 bp) nebyl vhodným pro identifikaci nového druhu, bylo možné pouze zařazení izolátů do rodu Pseudomonas sp. Nejlepších výsledků bylo dosaženo sekvenováním a analýzou genů rpoB a rpoD. Z důvodů
popisovaného
přínosu
molekulárně-biologické
diagnostiky
v uvedených
publikacích jsme se rozhodli pro optimalizaci real-time PCR, která umožňuje kromě samotné detekce bakteriálního agens i jeho kvantifikaci a následné určení patogena pomocí sekvenování. Na základě našich zkušeností i závěrů z literatury jsme se rozhodli pro oblasti V3 a V4 genu 16S rRNA, díky nimž je možné lépe rozlišit mezi jednotlivými druhy streptokoků a enterobakterií107 než je tomu u námi běžně používané metody end-point PCR zacílené do oblastí V8 a V9 genu 16S rRNA.
67
6
ZÁVĚR
V první části disertační práce byla optimalizována kvantitativní real-time PCR (UNF-qPCR) ve spojení s HRMA pro detekci kandid. Výsledkem byla jednoduchá, efektivní a rychlá metoda pro druhovou identifikaci izolátů kandid, jejíž pomocí bylo možné odlišit 23 druhů kandid a 4 druhy zařadit do dvou párů. Dle doposud publikovaných prací, je to nejširší druhové spektrum kandid a nejpočetnější soubor klinických izolátů testovaných pomocí HRMA. Čas potřebný pro zisk výsledku v překládané práci byl 6 hodin po dodání vzorku (izolátu) do laboratoře, což je ve srovnání s biochemickými metodami, které vyžadují 24 - 48 hodin, znatelná časová úspora. Uvedený postup by mohl být využitelný dokonce i pro detekci DNA kandid přímo z klinického materiálu, jak již bylo prokázáno jinými autory86,88,90. Aplikace uvedené HRMA přímo na klinický materiál by vedlo k ještě většímu zkrácení doby potřebné k získání výsledku, k validaci takového postupu jsou ale nutné další studie. HRMA může být nyní užitečná jako doplněk standardních diagnostických metod pro druhovou identifikaci izolátů kandid a to hlavně v případech, kdy je potřeba rozlišit fenotypově podobné druhy kandid nebo ty, které nejsou zahrnuty v komerčně dostupných testech. Ve druhé části předkládané práce byla pro širokospektrou detekci bakterií navržena a optimalizována kvantitativní real-time PCR (UNB-qPCR) ve spojení se sekvenováním. V analyzovaném souboru 28 pacientů s podezřením na infekční endokarditidu (IE) bylo pomocí UNB-qPCR detekováno 26 pozitivních a 2 negativní vzorky. Výsledky UNB-qPCR byly (kromě 1 vzorku vyhodnoceného jako s vysokou pravděpodobností falešně pozitivního) ve shodě s výsledky end-point PCR. Výhodou UNB-qPCR byla identifikace streptotoků do konkrétního druhu, kteří byli pomocí end-point PCR určeni pouze do příslušné skupiny. Výsledek detekce bakteriální DNA je možné touto metodou získat za 8,5 až 9 hodin od dodání klinického materiálu (chlopně) do laboratoře. Časově nejnáročnějším krokem je ošetření vzorku před samotnou izolací DNA pomocí komerčního kitu. S využitím UNB-qPCR je možné detekovat růstově náročné bakterie a ty, které nelze kultivovat z důvodu předchozí nebo trvající antibiotické terapie. Výhodou metody real-time PCR je její rychlost, senzitivita a možnost kvantifikace detekované DNA pomocí hodnot Ct a tím i přesnější srovnání s kontrolami real-time PCR.
68
7 1. 2. 3.
4.
5. 6. 7.
8.
9. 10.
11. 12.
13.
14.
15.
16.
17.
SOUPIS LITERATURY A PRAMENŮ Khot PD, Fredricks DN. PCR-based diagnosis of human fungal infections. Expert Rev Anti Infect Ther. Dec 2009;7(10):1201-1221. Nguyen MH Clancy C. Biomarkers for Diagnosis of Candidal Infections. Curr Fungal Infect Rep; 2012(6):56–62. De Pauw B, Walsh TJ, Donnelly JP, et al. Revised definitions of invasive fungal disease from the European Organization for Research and Treatment of Cancer/Invasive Fungal Infections Cooperative Group and the National Institute of Allergy and Infectious Diseases Mycoses Study Group (EORTC/MSG) Consensus Group. Clin Infect Dis. Jun 2008;46(12):1813-1821. Cuenca-Estrella M, Verweij PE, Arendrup MC, et al. ESCMID* guideline for the diagnosis and management of Candida diseases 2012: diagnostic procedures. Clin Microbiol Infect. Dec 2012;18 Suppl 7:9-18. Pappas P, Rex J, Sobel J, et al. Guidelines for treatment of candidiasis. Clin Infect Dis. Jan 15 2004 2004:161-189. Ostrosky-Zeichner L, Pappas PG. Invasive candidiasis in the intensive care unit. Crit Care Med. Mar 2006;34(3):857-863. Arendrup MC, Boekhout T, Akova M, et al. ESCMID and ECMM joint clinical guidelines for the diagnosis and management of rare invasive yeast infections. Clin Microbiol Infect. Apr 2014;20 Suppl 3:76-98. Sullivan DJ, Moran GP, Pinjon E, et al. Comparison of the epidemiology, drug resistance mechanisms, and virulence of Candida dubliniensis and Candida albicans. FEMS Yeast Res. Jan 2004;4(4-5):369-376. Valenza G, Valenza R, Brederlau J, Frosch M, Kurzai O. Identification of Candida fabianii as a cause of lethal septicaemia. Mycoses. Jul 2006;49(4):331-334. Hamal P, Ostransky J, Dendis M, et al. A case of endocarditis caused by the yeast Pichia fabianii with biofilm production and developed in vitro resistance to azoles in the course of antifungal treatment. Medical Mycology. 2008 2008;46(6):601-605. Wu Y, Wang J, Li W, et al. Pichia fabianii blood infection in a premature infant in China: case report. BMC Res Notes. 2013;6:77. Bhally HS, Jain S, Shields C, Halsey N, Cristofalo E, Merz WG. Infection in a neonate caused by Pichia fabianii: importance of molecular identification. Med Mycol. Mar 2006;44(2):185-187. Jensen RH, Arendrup MC. Candida palmioleophila: characterization of a previously overlooked pathogen and its unique susceptibility profile in comparison with five related species. J Clin Microbiol. Feb 2011;49(2):549-556. Beyda ND, Chuang SH, Alam MJ, et al. Treatment of Candida famata bloodstream infections: case series and review of the literature. J Antimicrob Chemother. Feb 2013;68(2):438-443. Sugita T, Takeo K, Ohkusu M, et al. Fluconazole-resistant pathogens Candida inconspicua and C. norvegensis: DNA sequence diversity of the rRNA intergenic spacer region, antifungal drug susceptibility, and extracellular enzyme production. Microbiol Immunol. 2004;48(10):761-766. Atkinson BJ, Lewis RE, Kontoyiannis DP. Candida lusitaniae fungemia in cancer patients: risk factors for amphotericin B failure and outcome. Med Mycol. Sep 2008;46(6):541-546. Mirhendi H, Bruun B, Schønheyder HC, et al. Molecular screening for Candida orthopsilosis and Candida metapsilosis among Danish Candida parapsilosis group 69
18.
19. 20.
21. 22.
23.
24. 25.
26.
27.
28.
29.
30.
31. 32. 33.
34. 35.
blood culture isolates: proposal of a new RFLP profile for differentiation. J Med Microbiol. Apr 2010;59(Pt 4):414-420. Pfaller MA, Diekema DJ, Messer SA, et al. In vitro activities of voriconazole, posaconazole, and four licensed systemic antifungal agents against Candida species infrequently isolated from blood. J Clin Microbiol. Jan 2003;41(1):78-83. Bereczki L, Bartha N, Kocsubé S, et al. Fungaemia caused by Candida pulcherrima. Med Mycol. Jul 2012;50(5):522-524. Pappas PG, Alexander BD, Andes DR, et al. Invasive fungal infections among organ transplant recipients: results of the Transplant-Associated Infection Surveillance Network (TRANSNET). Clin Infect Dis. Apr 2010;50(8):1101-1111. Paya CV. Prevention of fungal infection in transplantation. Transpl Infect Dis. 2002;4 Suppl 3:46-51. Neofytos D, Fishman JA, Horn D, et al. Epidemiology and outcome of invasive fungal infections in solid organ transplant recipients. Transpl Infect Dis. Jun 2010;12(3):220229. Mai H, Champion L, Ouali N, et al. Candida albicans arteritis transmitted by conservative liquid after renal transplantation: a report of four cases and review of the literature. Transplantation. Nov 2006;82(9):1163-1167. Shoham S, Marr KA. Invasive fungal infections in solid organ transplant recipients. Future Microbiol. May 2012;7(5):639-655. Lau A, Halliday C, Chen SC, Playford EG, Stanley K, Sorrell TC. Comparison of whole blood, serum, and plasma for early detection of candidemia by multiplextandem PCR. J Clin Microbiol. Mar 2010;48(3):811-816. Bustin SA, Benes V, Garson JA, et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. Apr 2009;55(4):611-622. Maaroufi Y, Ahariz N, Husson M, Crokaert F. Comparison of different methods of isolation of DNA of commonly encountered Candida species and its quantitation by using a real-time PCR-based assay. J Clin Microbiol. Jul 2004;42(7):3159-3163. Metwally L, Fairley DJ, Coyle PV, et al. Improving molecular detection of Candida DNA in whole blood: comparison of seven fungal DNA extraction protocols using real-time PCR. J Med Microbiol. Mar 2008;57(Pt 3):296-303. Metwally L, Fairley DJ, Coyle PV, et al. Comparison of serum and whole-blood specimens for the detection of Candida DNA in critically ill, non-neutropenic patients. J Med Microbiol. Oct 2008;57(Pt 10):1269-1272. Kurtzman CP, Robnett CJ. Identification of clinically important ascomycetous yeasts based on nucleotide divergence in the 5' end of the large-subunit (26S) ribosomal DNA gene. J Clin Microbiol. May 1997;35(5):1216-1223. Atkins SD, Clark IM. Fungal molecular diagnostics: a mini review. J Appl Genet. 2004;45(1):3-15. Kan VL. Polymerase chain reaction for the diagnosis of candidemia. J Infect Dis. Sep 1993;168(3):779-783. Crampin AC, Matthews RC. Application of the polymerase chain reaction to the diagnosis of candidosis by amplification of an HSP 90 gene fragment. J Med Microbiol. Sep 1993;39(3):233-238. Jordan JA. PCR identification of four medically important Candida species by using a single primer pair. J Clin Microbiol. Dec 1994;32(12):2962-2967. Flahaut M, Sanglard D, Monod M, Bille J, Rossier M. Rapid detection of Candida albicans in clinical samples by DNA amplification of common regions from C. albicans-secreted aspartic proteinase genes. J Clin Microbiol. Feb 1998;36(2):39570
36.
37.
38. 39. 40.
41.
42.
43.
44.
45. 46.
47.
48.
49. 50.
51.
52.
53.
401. Miyakawa Y, Mabuchi T, Kagaya K, Fukazawa Y. Isolation and characterization of a species-specific DNA fragment for detection of Candida albicans by polymerase chain reaction. J Clin Microbiol. Apr 1992;30(4):894-900. Arancia S, Sandini S, Cassone A, De Bernardis F. Use of 65kDa mannoprotein gene primers in PCR methods for the identification of five medically important Candida species. Mol Cell Probes. Oct 2009;23(5):218-226. Avni T, Leibovici L, Paul M. PCR diagnosis of invasive candidiasis: systematic review and meta-analysis. J Clin Microbiol. Feb 2011;49(2):665-670. Ostrosky-Zeichner L. Invasive mycoses: diagnostic challenges. Am J Med. Jan 2012;125(1 Suppl):S14-24. Dendis M, Horvath R, Michalek J, et al. PCR-RFLP detection and species identification of fungal pathogens in patients with febrile neutropenia. Clinl Microb Infect. Dec 2003:1191-1202. Cornet M, Sendid B, Fradin C, Gaillardin C, Poulain D, Nguyen H. Molecular Identification of Closely Related Candida Species Using Two Ribosomal Intergenic Spacer Fingerprinting Methods. J Mol Diagn. Jan 2011;13(1):12-22. Ciardo DE, Schär G, Böttger EC, Altwegg M, Bosshard PP. Internal transcribed spacer sequencing versus biochemical profiling for identification of medically important yeasts. J Clin Microbiol. Jan 2006;44(1):77-84. Leaw SN, Chang HC, Sun HF, Barton R, Bouchara JP, Chang TC. Identification of medically important yeast species by sequence analysis of the internal transcribed spacer regions. J Clin Microbiol. Mar 2006;44(3):693-699. Borman A, Linton C, Oliver D, Palmer M, Szekely A, Johnson E. Rapid Molecular Identification of Pathogenic Yeasts by Pyrosequencing Analysis of 35 Nucleotides of Internal Transcribed Spacer 2. J Clin Microbiol. Oct 2010;48(10):3648-3653. Wilkening S, Tekkedil MM, Lin G, et al. Genotyping 1000 yeast strains by nextgeneration sequencing. BMC Genomics. 2013;14:90. Loeffler J, Henke N, Hebart H, et al. Quantification of fungal DNA by using fluorescence resonance energy transfer and the light cycler system. J Clin Microbiol. Feb 2000;38(2):586-590. Pryce TM, Kay ID, Palladino S, Heath CH. Real-time automated polymerase chain reaction (PCR) to detect Candida albicans and Aspergillus fumigatus DNA in whole blood from high-risk patients. Diagn Microbiol Infect Dis. Nov 2003;47(3):487-496. Klingspor L, Jalal S. Molecular detection and identification of Candida and Aspergillus spp. from clinical samples using real-time PCR. ClinMicrobiol Infect. Aug 2006;12(8):745-753. Fricke S, Fricke C, Schimmelpfennig C, et al. A real-time PCR assay for the differentiation of Candida species. J Appl Microbiol. Oct 2010;109(4):1150-1158. Ahmad S, Khan Z, Mustafa A, Khan Z. Seminested PCR for diagnosis of candidemia: Comparison with culture, antigen detection, and biochemical methods for species identification. J Clin Microbiol. Jul 2002;40(7):2483-2489. Lau A, Sorrell T, Chen S, Stanley K, Iredell J, Halliday C. Multiplex tandem PCR: a novel platform for rapid detection and identification of fungal pathogens from blood culture specimens. J Clin Microbiol. Sep 2008;46(9):3021-3027. Chang HC, Leaw SN, Huang AH, Wu TL, Chang TC. Rapid identification of yeasts in positive blood cultures by a multiplex PCR method. J Clin Microbiol. Oct 2001;39(10):3466-3471. Liguori G, Gallé F, Lucariello A, et al. Comparison between multiplex PCR and phenotypic systems for Candida spp. identification. New Microbiol. Jan 71
54.
55.
56.
57.
58.
59.
60.
61. 62.
63.
64. 65. 66.
67.
68. 69.
70.
2010;33(1):63-67. Shepard JR, Addison RM, Alexander BD, et al. Multicenter evaluation of the Candida albicans/Candida glabrata peptide nucleic acid fluorescent in situ hybridization method for simultaneous dual-color identification of C. albicans and C. glabrata directly from blood culture bottles. J Clin Microbiol. Jan 2008;46(1):50-55. Hall L, Le Febre KM, Deml SM, Wohlfiel SL, Wengenack NL. Evaluation of the Yeast Traffic Light PNA FISH probes for identification of Candida species from positive blood cultures. J Clin Microbiol. Apr 2012;50(4):1446-1448. Marklein G, Josten M, Klanke U, et al. Matrix-Assisted Laser Desorption IonizationTime of Flight Mass Spectrometry for Fast and Reliable Identification of Clinical Yeast Isolates. J ClinMicrobiol. Sep 2009;47(9):2912-2917. Cassagne C, Ranque S, Normand A, et al. Mould Routine Identification in the Clinical Laboratory by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry. Plos One. DEC 14 2011 2011;6(12). Quiles-Melero I, Garcia-Rodriguez J, Gomez-Lopez A, Mingorance J. Evaluation of matrix-assisted laser desorption/ionisation time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry for identification of Candida parapsilosis, C. orthopsilosis and C. metapsilosis. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. Jan 2012;31(1):67-71. Zhao Y, Park S, Kreiswirth BN, et al. Rapid real-time nucleic Acid sequence-based amplification-molecular beacon platform to detect fungal and bacterial bloodstream infections. J Clin Microbiol. Jul 2009;47(7):2067-2078. Kaleta E, Clark A, Johnson D, et al. Use of PCR Coupled with Electrospray Ionization Mass Spectrometry for Rapid Identification of Bacterial and Yeast Bloodstream Pathogens from Blood Culture Bottles. J Clin Microbiol. Jan 2011;49(1):345-353. Jordana-Lluch E, Carolan HE, Giménez M, et al. Rapid diagnosis of bloodstream infections with PCR followed by mass spectrometry. PLoS One. 2013;8(4):e62108. Jordana-Lluch E, Giménez M, Quesada MD, Ausina V, Martró E. Improving the diagnosis of bloodstream infections: PCR coupled with mass spectrometry. Biomed Res Int. 2014;2014:501214. Muir A, Forrest G, Clarkson J, Wheals A. Detection of Candida albicans DNA from blood samples using a novel electrochemical assay. J Med Microbiol. Apr 2011;60(Pt 4):467-471. Bisha B, Kim HJ, Brehm-Stecher BF. Improved DNA-FISH for cytometric detection of Candida spp. J Appl Microbiol. Jan 2011. Reed GH, Kent JO, Wittwer CT. High-resolution DNA melting analysis for simple and efficient molecular diagnostics. Pharmacogenomics. Jun 2007;8(6):597-608. Wittwer CT, Reed GH, Gundry CN, Vandersteen JG, Pryor RJ. High-resolution genotyping by amplicon melting analysis using LCGreen. Clin Chem. Jun 2003;49(6 Pt 1):853-860. Fortini D, Ciammaruconi A, De Santis R, et al. Optimization of high-resolution melting analysis for low-cost and rapid screening of allelic variants of Bacillus anthracis by multiple-locus variable-number tandem repeat analysis. Clin Chem. Jul 2007;53(7):1377-1380. Wittwer CT. High-resolution DNA melting analysis: advancements and limitations. Hum Mutat. Jun 2009;30(6):857-859. Martín-Núñez GM, Gómez-Zumaquero JM, Soriguer F, Morcillo S. High resolution melting curve analysis of DNA samples isolated by different DNA extraction methods. Clin Chim Acta. Jan 2012;413(1-2):331-333. Herrmann MG, Durtschi JD, Bromley LK, Wittwer CT, Voelkerding KV. Amplicon DNA melting analysis for mutation scanning and genotyping: cross-platform 72
71.
72.
73.
74.
75. 76. 77.
78.
79.
80.
81.
82.
83.
84. 85.
86.
87.
comparison of instruments and dyes. Clin Chem. Mar 2006;52(3):494-503. Herrmann MG, Durtschi JD, Wittwer CT, Voelkerding KV. Expanded instrument comparison of amplicon DNA melting analysis for mutation scanning and genotyping. Clin Chem. Aug 2007;53(8):1544-1548. Gudnason H, Dufva M, Bang DD, Wolff A. Comparison of multiple DNA dyes for real-time PCR: effects of dye concentration and sequence composition on DNA amplification and melting temperature. Nucleic Acids Res. 2007;35(19):e127. Monis PT, Giglio S, Saint CP. Comparison of SYTO9 and SYBR Green I for realtime polymerase chain reaction and investigation of the effect of dye concentration on amplification and DNA melting curve analysis. Anal Biochem. May 2005;340(1):2434. Taylor S SR, Kurtz R, Fisher C, Patel V, Bizouarn Frank. A Practical Guide to High Resolution Melt Analysis Genotyping. CA 94547. Bulletin 6004 ed: Bio-Rad Laboratories, Inc.; 2010. Tong SY, Giffard PM. Microbiological applications of high-resolution melting analysis. J Clin Microbiol. Nov 2012;50(11):3418-3421. Reed GH, Wittwer CT. Sensitivity and specificity of single-nucleotide polymorphism scanning by high-resolution melting analysis. Clin Chem. Oct 2004;50(10):1748-1754. Vossen RH, Aten E, Roos A, den Dunnen JT. High-resolution melting analysis (HRMA): more than just sequence variant screening. Hum Mutat. Jun 2009;30(6):860866. Cheng JC, Huang CL, Lin CC, et al. Rapid detection and identification of clinically important bacteria by high-resolution melting analysis after broad-range ribosomal RNA real-time PCR. Clin Chem. Nov 2006;52(11):1997-2004. Stephens AJ, Inman-Bamber J, Giffard PM, Huygens F. High-resolution melting analysis of the spa repeat region of Staphylococcus aureus. Clin Chem. Feb 2008;54(2):432-436. Won H, Rothman R, Ramachandran P, et al. Rapid identification of bacterial pathogens in positive blood culture bottles by use of a broad-based PCR assay coupled with high-resolution melt analysis. J Clin Microbiol. Sep 2010;48(9):3410-3413. Chakravorty S, Aladegbami B, Burday M, et al. Rapid universal identification of bacterial pathogens from clinical cultures by using a novel sloppy molecular beacon melting temperature signature technique. J Clin Microbiol. Jan 2010;48(1):258-267. Tajiri-Utagawa E, Hara M, Takahashi K, Watanabe M, Wakita T. Development of a rapid high-throughput method for high-resolution melting analysis for routine detection and genotyping of noroviruses. J Clin Microbiol. Feb 2009;47(2):435-440. Steer PA, Kirkpatrick NC, O'Rourke D, Noormohammadi AH. Classification of fowl adenovirus serotypes by use of high-resolution melting-curve analysis of the hexon gene region. J Clin Microbiol. Feb 2009;47(2):311-321. Plachy R, Hamal P, Raclavsky V. McRAPD as a new approach to rapid and accurate identification of pathogenic yeasts. J Microbiol Meth. Jan 2005;60(1):107-113. Trtkova J, Pavlicek P, Ruskova L, Hamal P, Koukalova D, Raclavsky V. Performance of optimized McRAPD in identification of 9 yeast species frequently isolated from patient samples: potential for automation. Bmc Microbiology. NOV 10 2009 2009;9. Mandviwala T, Shinde R, Kalra A, Sobel J, Akins R. High-Throughput Identification and Quantification of Candida Species Using High Resolution Derivative Melt Analysis of Panfungal Amplicons. J Mol Diagn. Jan 2010:91-101. Hrncirova K, Lengerova M, Kocmanova I, et al. Rapid Detection and Identification of Mucormycetes from Culture and Tissue Samples by Use of High-Resolution Melt Analysis. J Clin Microbiol. Sep 2010:3392-3394. 73
88.
89.
90.
91.
92.
93.
94.
95.
96. 97.
98. 99.
100.
101.
102.
103.
Arancia S, Sandini S, De Bernardis F, Fortini D. Rapid, simple, and low-cost identification of Candida species using high-resolution melting analysis. Diagn Microbiol Infect Dis. Mar 2011;69(3):283-285. Somogyvari F, Horvath A, Serly J, Majoros H, Vagvolgyi C, Peto Z. Detection of Invasive Fungal Pathogens by Real-time PCR and High-resolution Melting Analysis. In Vivo. NOV-DEC 2012 2012;26(6):979-983. Goldschmidt P, Degorge S, Sarria P, et al. New Strategy for Rapid Diagnosis and Characterization of Fungal Infections: The Example of Corneal Scrapings. Plos One. Jul 2012;7(7). Decat E, Van Mechelen E, Saerens B, et al. Rapid and accurate identification of isolates of Candida species by melting peak and melting curve analysis of the internally transcribed spacer region 2 fragment (ITS2-MCA). Res Microbiol. 2013 Feb-Mar 2013;164(2):110-117. Alnuaimi AD, Wiesenfeld D, O'Brien-Simpson NM, Reynolds EC, Peng B, McCullough MJ. The development and validation of a rapid genetic method for species identification and genotyping of medically important fungal pathogens using high-resolution melting curve analysis. Mol Oral Microbiol. Jun 2014;29(3):117-130. Gauduchon V, Chalabreysse L, Etienne J, et al. Molecular diagnosis of infective endocarditis by PCR amplification and direct sequencing of DNA from valve tissue. J Clin Microbiol. Feb 2003;41(2):763-766. Marín M, Muñoz P, Sánchez M, et al. Molecular diagnosis of infective endocarditis by real-time broad-range polymerase chain reaction (PCR) and sequencing directly from heart valve tissue. Medicine (Baltimore). Jul 2007;86(4):195-202. Zaloudikova B, Nemcova E, Pol J, et al. Value of PCR in surgically treated patients with staphylococcal infective endocarditis: a 4-year retrospective study. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. Jun 2012;31(6):1187-1194. Li JS, Sexton DJ, Mick N, et al. Proposed modifications to the Duke criteria for the diagnosis of infective endocarditis. Clin Infect Dis. Apr 2000;30(4):633-638. Habib G, Hoen B, Tornos P, et al. Guidelines on the prevention, diagnosis, and treatment of infective endocarditis (new version 2009): the Task Force on the Prevention, Diagnosis, and Treatment of Infective Endocarditis of the European Society of Cardiology (ESC). Endorsed by the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ESCMID) and the International Society of Chemotherapy (ISC) for Infection and Cancer. Eur Heart J. Oct 2009;30(19):23692413. Watkin RW, Lang S, Lambert PA, Littler WA, Elliott TS. The microbial diagnosis of infective endocarditis. J Infect. Jul 2003;47(1):1-11. Käser M, Ruf MT, Hauser J, Marsollier L, Pluschke G. Optimized method for preparation of DNA from pathogenic and environmental mycobacteria. Appl Environ Microbiol. Jan 2009;75(2):414-418. Yang G, Erdman DE, Kodani M, Kools J, Bowen MD, Fields BS. Comparison of commercial systems for extraction of nucleic acids from DNA/RNA respiratory pathogens. J Virol Methods. Jan 2011;171(1):195-199. Hansen WL, Bruggeman CA, Wolffs PF. Pre-analytical sample treatment and DNA extraction protocols for the detection of bacterial pathogens from whole blood. Methods Mol Biol. 2013;943:81-90. Gosiewski T, Szała L, Pietrzyk A, Brzychczy-Włoch M, Heczko PB, Bulanda M. Comparison of methods for isolation of bacterial and fungal DNA from human blood. Curr Microbiol. Feb 2014;68(2):149-155. Westh H, Lisby G, Breysse F, et al. Multiplex real-time PCR and blood culture for 74
104.
105.
106. 107.
108. 109.
110.
111.
112. 113.
114.
115.
116.
117. 118.
119.
120.
identification of bloodstream pathogens in patients with suspected sepsis. Clin Microbiol Infect. Jun 2009;15(6):544-551. Mühl H, Kochem AJ, Disqué C, Sakka SG. Activity and DNA contamination of commercial polymerase chain reaction reagents for the universal 16S rDNA real-time polymerase chain reaction detection of bacterial pathogens in blood. Diagn Microbiol Infect Dis. Jan 2010;66(1):41-49. Mygind T, Østergaard L, Birkelund S, Lindholt JS, Christiansen G. Evaluation of five DNA extraction methods for purification of DNA from atherosclerotic tissue and estimation of prevalence of Chlamydia pneumoniae in tissue from a Danish population undergoing vascular repair. BMC Microbiol. Sep 2003;3:19. Baker GC, Smith JJ, Cowan DA. Review and re-analysis of domain-specific 16S primers. J Microbiol Methods. Dec 2003;55(3):541-555. Chakravorty S, Helb D, Burday M, Connell N, Alland D. A detailed analysis of 16S ribosomal RNA gene segments for the diagnosis of pathogenic bacteria. J Microbiol Methods. May 2007;69(2):330-339. Petti CA. Detection and identification of microorganisms by gene amplification and sequencing. Clin Infect Dis. Apr 2007;44(8):1108-1114. Okhravi N, Adamson P, Matheson MM, Towler HM, Lightman S. PCR-RFLPmediated detection and speciation of bacterial species causing endophthalmitis. Invest Ophthalmol Vis Sci. May 2000;41(6):1438-1447. Janda JM, Abbott SL. 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: pluses, perils, and pitfalls. J Clin Microbiol. Sep 2007;45(9):2761-2764. Woo PC, Lau SK, Teng JL, Tse H, Yuen KY. Then and now: use of 16S rDNA gene sequencing for bacterial identification and discovery of novel bacteria in clinical microbiology laboratories. Clin Microbiol Infect. Oct 2008;14(10):908-934. Benson DA, Cavanaugh M, Clark K, et al. GenBank. Nucleic Acids Res. Jan 2013;41(Database issue):D36-42. Woo PC, Teng JL, Yeung JM, Tse H, Lau SK, Yuen KY. Automated identification of medically important bacteria by 16S rRNA gene sequencing using a novel comprehensive database, 16SpathDB. J Clin Microbiol. May 2011;49(5):1799-1809. Teng JL, Ho TC, Yeung RS, et al. Evaluation of 16SpathDB 2.0, an automated 16S rRNA gene sequence database, using 689 complete bacterial genomes. Diagn Microbiol Infect Dis. Feb 2014;78(2):105-115. Drancourt M, Bollet C, Carlioz A, Martelin R, Gayral JP, Raoult D. 16S ribosomal DNA sequence analysis of a large collection of environmental and clinical unidentifiable bacterial isolates. J Clin Microbiol. Oct 2000;38(10):3623-3630. Petti CA BP, Brandt ME, Clarrudge II JE, Feldblyum TV, Foxall P, Furtado MR, Pace N, Procop G. Interpretive Criteria for Identification of Bacteria and Fungi by DNA Target Sequencing; Approved Guideline. CLSI Document MM18-A. Vol 28: Clinical and Laboratory Standards Institute; 2008. Bosshart F. CLSI Guideline Addresses Identification of Bacteria and Fungi Using DNA Target Sequencing. Labmedicine. 2010;41(2). Jalava J, Kotilainen P, Nikkari S, et al. Use of the polymerase chain reaction and DNA sequencing for detection of Bartonella quintana in the aortic valve of a patient with culture-negative infective endocarditis. Clin Infect Dis. Oct 1995;21(4):891-896. Goldenberger D, Künzli A, Vogt P, Zbinden R, Altwegg M. Molecular diagnosis of bacterial endocarditis by broad-range PCR amplification and direct sequencing. J Clin Microbiol. Nov 1997;35(11):2733-2739. Rothman RE, Majmudar MD, Kelen GD, et al. Detection of bacteremia in emergency 75
121.
122.
123. 124. 125.
126. 127.
128.
129.
130.
131.
132.
133.
134.
135.
136.
department patients at risk for infective endocarditis using universal 16S rRNA primers in a decontaminated polymerase chain reaction assay. J Infect Dis. Dec 2002;186(11):1677-1681. Bosshard PP, Kronenberg A, Zbinden R, Ruef C, Böttger EC, Altwegg M. Etiologic diagnosis of infective endocarditis by broad-range polymerase chain reaction: a 3-year experience. Clin Infect Dis. Jul 2003;37(2):167-172. Grijalva M, Horváth R, Dendis M, Erný J, Benedík J. Molecular diagnosis of culture negative infective endocarditis: clinical validation in a group of surgically treated patients. Heart. Mar 2003;89(3):263-268. Lang S, Watkin RW, Lambert PA, Bonser RS, Littler WA, Elliott TS. Evaluation of PCR in the molecular diagnosis of endocarditis. J Infect. Apr 2004;48(3):269-275. Greub G, Lepidi H, Rovery C, et al. Diagnosis of infectious endocarditis in patients undergoing valve surgery. Am J Med. Mar 2005;118(3):230-238. Breitkopf C, Hammel D, Scheld HH, Peters G, Becker K. Impact of a molecular approach to improve the microbiological diagnosis of infective heart valve endocarditis. Circulation. Mar 2005;111(11):1415-1421. Rovery C, Greub G, Lepidi H, et al. PCR detection of bacteria on cardiac valves of patients with treated bacterial endocarditis. J Clin Microbiol. Jan 2005;43(1):163-167. Voldstedlund M, Nørum Pedersen L, Baandrup U, Klaaborg KE, Fuursted K. Broadrange PCR and sequencing in routine diagnosis of infective endocarditis. APMIS. Mar 2008;116(3):190-198. Nomura R, Nakano K, Nemoto H, et al. Molecular analyses of bacterial DNA in extirpated heart valves from patients with infective endocarditis. Oral Microbiol Immunol. Feb 2009;24(1):43-49. Vollmer T, Piper C, Horstkotte D, Körfer R, Kleesiek K, Dreier J. 23S rDNA realtime polymerase chain reaction of heart valves: a decisive tool in the diagnosis of infective endocarditis. Eur Heart J. May 2010;31(9):1105-1113. Fournier PE, Thuny F, Richet H, et al. Comprehensive diagnostic strategy for blood culture-negative endocarditis: a prospective study of 819 new cases. Clin Infect Dis. Jul 2010;51(2):131-140. Vondracek M, Sartipy U, Aufwerber E, Julander I, Lindblom D, Westling K. 16S rDNA sequencing of valve tissue improves microbiological diagnosis in surgically treated patients with infective endocarditis. J Infect. Jun 2011;62(6):472-478. Boussier R, Rogez S, François B, Denes E, Ploy MC, Garnier F. Two-step bacterial broad-range polymerase chain reaction analysis of heart valve tissue improves bacteriological diagnosis of infective endocarditis. Diagn Microbiol Infect Dis. Mar 2013;75(3):240-244. Kemp M, Bangsborg J, Kjerulf A, et al. Advantages and Limitations of Ribosomal RNA PCR and DNA Sequencing for Identification of Bacteria in Cardiac Valves of Danish Patients. Open Microbiol J. 2013;7:146-151. Jordan JA, Jones-Laughner J, Durso MB. Utility of pyrosequencing in identifying bacteria directly from positive blood culture bottles. J Clin Microbiol. Feb 2009;47(2):368-372. Malic S, Hill KE, Hayes A, Percival SL, Thomas DW, Williams DW. Detection and identification of specific bacteria in wound biofilms using peptide nucleic acid fluorescent in situ hybridization (PNA FISH). Microbiology. Aug 2009;155(Pt 8):2603-2611. Nadkarni MA, Martin FE, Jacques NA, Hunter N. Determination of bacterial load by real-time PCR using a broad-range (universal) probe and primers set. Microbiology. Jan 2002;148(Pt 1):257-266. 76
137.
138. 139.
140.
141. 142.
143.
144. 145. 146. 147. 148.
149. 150. 151.
152.
153. 154.
155.
Carroll NM, Jaeger EE, Choudhury S, et al. Detection of and discrimination between gram-positive and gram-negative bacteria in intraocular samples by using nested PCR. J Clin Microbiol. May 2000;38(5):1753-1757. Wilson WJ, Wiedmann M, Dillard HR, Batt CA. Identification of Erwinia stewartii by a ligase chain reaction assay. Appl Environ Microbiol. Jan 1994;60(1):278-284. Mahony JB, Song X, Chong S, Faught M, Salonga T, Kapala J. Evaluation of the NucliSens Basic Kit for detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae in genital tract specimens using nucleic acid sequence-based amplification of 16S rRNA. J Clin Microbiol. Apr 2001;39(4):1429-1435. Yam WC, Cheng VC, Hui WT, Wang LN, Seto WH, Yuen KY. Direct detection of Mycobacterium tuberculosis in clinical specimens using single-tube biotinylated nested polymerase chain reaction-enzyme linked immunoassay (PCR-ELISA). Diagn Microbiol Infect Dis. Apr 2004;48(4):271-275. Zhou J. Microarrays for bacterial detection and microbial community analysis. Curr Opin Microbiol. Jun 2003;6(3):288-294. Patel M, Gonzalez R, Halford C, et al. Target-specific capture enhances sensitivity of electrochemical detection of bacterial pathogens. J Clin Microbiol. Dec 2011;49(12):4293-4296. Dreier J, Vollmer T, Kleesiek K. Novel flow cytometry-based screening for bacterial contamination of donor platelet preparations compared with other rapid screening methods. Clin Chem. Aug 2009;55(8):1492-1502. Biswas S, Rolain JM. Use of MALDI-TOF mass spectrometry for identification of bacteria that are difficult to culture. J Microbiol Methods. Jan 2013;92(1):14-24. Keer JT. Quantitative Real-time PCR Analysis. http://www.genequantification.de/keer-qpcr-book-chapter-7.pdf. Kubista M, Andrade JM, Bengtsson M, et al. The real-time polymerase chain reaction. Mol Aspects Med. 2006 Apr-Jun 2006;27(2-3):95-125. Nolte FS. Novel internal controls for real-time PCR assays. Clin Chem. May 2004;50(5):801-802. Hoorfar J, Malorny B, Abdulmawjood A, Cook N, Wagner M, Fach P. Practical considerations in design of internal amplification controls for diagnostic PCR assays. J Clin Microbiol. May 2004;42(5):1863-1868. Sachadyn P, Kur J. The construction and use of a PCR internal control. Mol Cell Probes. Oct 1998;12(5):259-262. Brightwell G, Pearce M, Leslie D. Development of internal controls for PCR detection of Bacillus anthracis. Mol Cell Probes. Dec 1998;12(6):367-377. Abdulmawjood A, Roth S, Bülte M. Two methods for construction of internal amplification controls for the detection of Escherichia coli O157 by polymerase chain reaction. Mol Cell Probes. Oct 2002;16(5):335-339. Stöcher M, Leb V, Berg J. A convenient approach to the generation of multiple internal control DNA for a panel of real-time PCR assays. J Virol Methods. Mar 2003;108(1):1-8. Hoorfar J, Ahrens P, Rådström P. Automated 5' nuclease PCR assay for identification of Salmonella enterica. J Clin Microbiol. Sep 2000;38(9):3429-3435. Thompson JD, Higgins DG, Gibson TJ. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positionspecific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. Nov 1994;22(22):4673-4680. Higgins, DG, Bleasby, AJ and Fuchs, R: CLUSTAL V: improved software for multiple sequence alignment. Computer Applications in the Biosciences (CABIOS), 77
156
157.
158.
159.
160.
161.
162.
163. 164.
165.
166. 167. 168.
169.
170.
171.
1992;8(2):189-191. Dwight Z, Palais R, Wittwer CT. uMELT: prediction of high-resolution melting curves and dynamic melting profiles of PCR products in a rich web application. Bioinformatics. Apr 2011;27(7):1019-1020. Mohammadi T, Reesink HW, Vandenbroucke-Grauls CM, Savelkoul PH. Optimization of real-time PCR assay for rapid and sensitive detection of eubacterial 16S ribosomal DNA in platelet concentrates. J Clin Microbiol. Oct 2003;41(10):47964798. Kolek M, Zaloudikova B, Freiberger T, Brat R. [Aortic and mitral valve infective endocarditis caused by Tropheryma whipplei and with no gastrointestinal manifestations of Whipple's disease]. Klin Mikrobiol Infekc Lek. Oct 2007;13(5):213216. Freibergerova M, Parizkova R, Zaloudiková B, et al. [A sepsis caused by Capnocytophaga canimorsus: diagnostic and therapeutic options]. Klin Mikrobiol Infekc Lek. Jun 2007;13(3):115-118. Zaloudiková B, Kelbl M, Pasa L, Freiberger T. Genotypic versus phenotypic methods in the detection of Listeria monocytogenes prosthetic joint infection. J Med Microbiol. Jun 2009;58(Pt 6):829-831. Vanerkova M, Zaloudikova B, Nemcova E, et al. Detection of Cardiobacterium valvarum in a patient with aortic valve infective endocarditis by broad-range PCR. J Med Microbiol. Feb 2010;59(Pt 2):231-234. Pýchová M KM, Němcová E, Freiberger T, Husa P. Streptococcus suis: původce purulentních meningoenfefalitit nejen ve veterinární oblasti. Inter Med. 2011;13(1):43-45. Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. Oct 1990;215(3):403-410. Kim OS, Cho YJ, Lee K, et al. Introducing EzTaxon-e: a prokaryotic 16S rRNA gene sequence database with phylotypes that represent uncultured species. Int J Syst Evol Microbiol. Mar 2012;62(Pt 3):716-721. Park KS, Ki CS, Kang CI, et al. Evaluation of the GenBank, EzTaxon, and BIBI services for molecular identification of clinical blood culture isolates that were unidentifiable or misidentified by conventional methods. J Clin Microbiol. May 2012;50(5):1792-1795. Tamura K, Dudley J, Nei M, Kumar S. MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Mol Biol Evol. Aug 2007;24(8):1596-1599. Corporation I. Real-Time PCR: From Theory to Practise2008. Sedlacek I. Escherichia a Shigella – pro klinickou bakteriologii dva dlouho známé rody, přesto taxonomicky stále problematické. Zprávy Centra Epidemiologie a Mikrobiologie. 2011;20(3):100-103. Lockhart SR, Messer SA, Pfaller MA, Diekema DJ. Geographic distribution and antifungal susceptibility of the newly described species Candida orthopsilosis and Candida metapsilosis in comparison to the closely related species Candida parapsilosis. J Clin Microbiol. Aug 2008;46(8):2659-2664. Horká M, Růžička F, Kubesová A, Němcová E, Slais K. Separation of phenotypically indistinguishable Candida species, C. orthopsilosis, C. metapsilosis and C. parapsilosis, by capillary electromigration techniques. J Chromatogr A. Jun 2011;1218(25):3900-3907. Desnos-Ollivier M, Ragon M, Robert V, Raoux D, Gantier J, Dromer F. Debaryomyces hansenii (Candida famata), a rare human fungal pathogen often misidentified as Pichia guilliermondii (Candida guilliermondii). J Clin Microbiol. Oct 78
172.
173. 174.
175.
176. 177.
178.
179.
180.
181.
182.
183.
184.
185.
186. 187. 188. 189.
2008;46(10):3237-3242. Cantón E, Pemán J, Quindós G, et al. Prospective multicenter study of the epidemiology, molecular identification, and antifungal susceptibility of Candida parapsilosis, Candida orthopsilosis, and Candida metapsilosis isolated from patients with candidemia. Antimicrob Agents Chemother. Dec 2011;55(12):5590-5596. Staib P, Morschhäuser J. Chlamydospore formation on Staib agar as a species-specific characteristic of Candida dubliniensis. Mycoses. 1999;42(9-10):521-524. Pincus DH, Coleman DC, Pruitt WR, et al. Rapid identification of Candida dubliniensis with commercial yeast identification systems. J Clin Microbiol. Nov 1999;37(11):3533-3539. Ellepola AN, Hurst SF, Elie CM, Morrison CJ. Rapid and unequivocal differentiation of Candida dubliniensis from other Candida species using species-specific DNA probes: comparison with phenotypic identification methods. Oral Microbiol Immunol. Dec 2003;18(6):379-388. Gutiérrez J, Morales P, González MA, Quindós G. Candida dubliniensis, a new fungal pathogen. J Basic Microbiol. 2002;42(3):207-227. Chryssanthou E, Fernandez V, Petrini B. Performance of commercial latex agglutination tests for the differentiation of Candida dubliniensis and Candida albicans in routine diagnostics. APMIS. Nov 2007;115(11):1281-1284. Montero C, Shea Y, Jones P, et al. Evaluation of Pyrosequencing (R) technology for the identification of clinically relevant non-dematiaceous yeasts and related species. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. Sep 2008;27(9):821-830. Wu ZW, Robert V, Bai FY. Genetic diversity of the Pichia membranifaciens strains revealed from rRNA gene sequencing and electrophoretic karyotyping, and the proposal of Candida californica comb. nov. FEMS Yeast Res. Mar 2006;6(2):305-311. Boyanton BL, Luna RA, Fasciano LR, Menne KG, Versalovic J. DNA pyrosequencing-based identification of pathogenic Candida species by using the internal transcribed spacer 2 region. Arch Pathol Lab Med. Apr 2008;132(4):667-674. Costanzo MC, Arnaud MB, Skrzypek MS, et al. The Candida Genome Database: facilitating research on Candida albicans molecular biology. FEMS Yeast Res. Aug 2006;6(5):671-684. Nilsson RH, Ryberg M, Kristiansson E, Abarenkov K, Larsson KH, Kõljalg U. Taxonomic reliability of DNA sequences in public sequence databases: a fungal perspective. PLoS One. 2006;1:e59. Millar BC, Xu J, Moore JE. Risk assessment models and contamination management: implications for broad-range ribosomal DNA PCR as a diagnostic tool in medical bacteriology. J Clin Microbiol. May 2002;40(5):1575-1580. Corless CE, Guiver M, Borrow R, Edwards-Jones V, Kaczmarski EB, Fox AJ. Contamination and sensitivity issues with a real-time universal 16S rRNA PCR. J Clin Microbiol. May 2000;38(5):1747-1752. Heininger A, Binder M, Ellinger A, et al. Effect of comprehensive validation of the template isolation procedure on the reliability of bacteraemia detection by a 16S rRNA gene PCR. Clin Microbiol Infect. May 2004;10(5):452-458. Hartley JL, Rashtchian A. Dealing with contamination: enzymatic control of carryover contamination in PCR. PCR Methods Appl. Oct 1993;3(2):S10-14. Jinno Y, Yoshiura K, Niikawa N. Use of psoralen as extinguisher of contaminated DNA in PCR. Nucleic Acids Res. Nov 1990;18(22):6739. Hughes MS, Beck LA, Skuce RA. Identification and elimination of DNA sequences in Taq DNA polymerase. J Clin Microbiol. Aug 1994;32(8):2007-2008. Sharma JK, Gopalkrishna V, Das BC. A simple method for elimination of unspecific 79
190.
191. 192.
193.
amplifications in polymerase chain reaction. Nucleic Acids Res. Nov 1992;20(22):6117-6118. Ebnöther C, Altwegg M, Gottschalk J, Seebach JD, Kronenberg A. Aerococcus urinae endocarditis: case report and review of the literature. Infection. Oct 2002;30(5):310313. Zhang Q, Kwoh C, Attorri S, Clarridge JE. Aerococcus urinae in urinary tract infections. J Clin Microbiol. Apr 2000;38(4):1703-1705. Slany M, Vanerkova M, Nemcova E, Zaloudikova B, Ruzicka F, Freiberger T. Differentiation of Staphylococcus spp. by high-resolution melting analysis. Can J Microbiol. Dec 2010;56(12):1040-1049. Kosina M, Nemcova E, Holochova P, Svec P, Vavrova A, Sedo O, Lexa M, Sedlacek I. Pseudomonas karstica sp. nov. and Pseudomonas spelaei sp. nov., psychrotrophic species isolated from kalcite. (odesláno do časopisu s IF).
Elektronické zdroje: http://www.bioradiations.com/focus-on-applications/35-article/75-hrm https://www.dna.utah.edu/Image/Hi_Res%20Melting_Normalized.JPG http://www.ridom-rdna.de http://www.sepsitest-blast.de/en/index.html http://www.gene-quantification.de/keer-qpcr-book-chapter-7.pdf http://www.sci.muni.cz/ccm/ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ http://workbench.sdsc.edu/ http://www.premierbiosoft.com/netprimer/, Premier Biosoft http://eu.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast http://www.cbs.knaw.nl/Collections/; http://www.sepsitest-blast.de/en/index.html http://147.8.74.24/16SpathDB/main.php http://eztaxon-e.ezbiocloud.net https://www.dna.utah.edu/umelt/um.php http://www.candidagenome.org http://www.cbs.knaw.nl/Collections
80
8
SEZNAM ZKRATEK
ATB
antibiotika
BCCM/MUCL (Belgian Co-ordinated Collections of Micro-organisms) Belgická sbírka mikroorganismů CBS
(The Fungal Biodiversity Centre) Databáze centra biodiverzity hub
CCM
Česká sbírka mikroorganizmů
CCY
Sbírka kvasinek ve Slovenské Republice
CE-IVD
označení opravňující používání přípravku v Evropě pro in vitro diagnostiku
CFU
(Colony Forming Unit) kolonii tvořící jednotka
CGD
(Candida Genome Database) Databáze genomů kandid
CKTCH Brno
Centrum kardiovaskulární a transplantační chirurgie Brno
CLSI
(Clinical and Laboratory Standrards Institute) Institut pro klinické a laboratorní standardy
Ct
(Treshold Cycle) cyklus, kdy je možné detekovat nárůst fluorescence vzorku
DGGE
(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) elektroforéza v gradientovém denaturačním gelu
dMelt křivky
derivované křivky tání
DNA
deoxyribonukleová kyselina
DNA-FISH
(DNA-Fluorescent in-situ Hybridisation) fluorescenční in situ hybridizace založená na DNA
dsDNA
dvouřetězcová DNA
dUTP
2´-deoxyuridin-5´-trifosfátu
end-point PCR
PCR, jejíž produkty je třeba nanést na agarózový gel, aby bylo možné zjistit výsledek reakce
EORTC/MSG
(European Organisation for Research and Treatment of Cancer/Mycoses Study Group) Evropská organizace pro výzkum a léčbu rakoviny/skupina pro výzkum mykóz
ESCMID
(European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases) Evropská společnost klinické mikrobiologie a infekčních nemocí
FISH
(Fluorescent in situ Hybridisation) fluorescenční in situ hybridizace
FN Brno
Fakultní nemocnice Brno
FNUSA
Fakultní nemocnice u svaté Anny
GAPDH
glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenáza 81
HI
histopatologie
HK
hemokultura
HPLC
(High-Performance Liquid Chromatography) vysokoúčinná kapalinová chromatografie
HRMA
(High Resolution Melting Analysis) analýza teploty tání za vysokého rozlišení
IAC
interní amplifikační kontrola
IE
infekční endokarditida
IK
kontrola izolačního procesu
IKO
invazivní kandidové onemocnění
IMO
invazivní mykotické onemocnění
ITS
(Intragenic Transcribed Spacer Region) transkripčně přepisovaná oblast mezi geny 16S rRNA a 23S rRNA
JIP
jednotka intenzivní péče
KO
kandidové onemocnění
LCR
(Ligase Chain Reaction) ligázová řetězová reakce
LNA
(Locked Nucleic Acid) uměle syntetizované analogy nukleových kyselin
MALDI-TOF
(Matrix-Assisted
Laser
Desorption/ionization
Time
of
Flight)
typ
hmotnostní spektrometrie MDG
methyl-a-D-glukozid
MI
mikroskopie
MIQE
(Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments) minimální informace pro publikaci metod založených na kvantitativních PCR v reálném čase
MM
Master Mix, základ polymerázové řetězové reakce
MO
mykotické onemocnění
MOP
8-methoxypsoralen
MT-PCR
(Multiplex-Tandem PCR) dvoukroková nested-PCR (komerční název EasyPlexTM)
multiplex-PCR
mnohočetná PCR tj. paralelní amplifikace více oblastí DNA
NASBA
(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) isotermální amplifikace spojená s reverzní transkripcí a umožňující detekci převážně RNA
nested-PCR
"uhnízděná" PCR tj. varianta dvou po sobě jdoucích PCR
NK
negativní kontrola 82
NPV
negativní prediktivní hodnota
PCR
(Polymerase Chain Reaction) polymerázová řetězová reakce
PCR-ELISA
(Polymerase Chain Reaction-Enzyme Linked Immunosorbent Assay) spojení PCR s detekcí produktu pomocí protilátek
PCR-ESI/MS
(PCR - Electrospray Ionization Mass Spectrometry) typ hmotnostní spektrometrie
PK
pozitivní kontrola
PK-SA
pozitivní kontrola pro reakci UNB-qPCR
PK-UNF
pozitivní kontrola pro reakci UNF-qPCR
PNA
(Peptide Nucleic Acid) peptidová nukleová kyselina, uměle syntetizovaný analog nukleových kyselin
PNA-FISH
(Peptide Nucleic Acid Fluorescent in situ Hybridization) PNA-fluorescenční in situ hybridizace
Real-time PCR
PCR sledovaná v reálném čase
RFLP
(Restriction Fragment Length Polymorphism) délkový polymorfismus restrikčních fragmentů
RNA
ribonukleová kyselina
SD
směrodatná odchylka
SDA
(Strand-Displacement Amplification) isotermální amplifikace nukleových kyselin
semi-nested PCR částečně "uhnízděná" PCR SOT
transplantace solidního orgánu
SOP
standardní operační postup
SSCP
(Single-Strand Conformation Polymorphism) polymorfismus konformace jednořetězcové DNA
ssDNA
jednořetězcová DNA
STKN
koaguláza-negativní stafylokok
Tm
teplota tání, při níž je denaturovaná polovina produktu PCR
TNK
kontrola dekontaminačního procesu
TRE
D-trehalóza
UNB-qPCR
širokospektrá kvantitativní PCR v reálném čase pro detekci bakterií
UNF-qPCR
širokospektrá kvantitativní PCR v reálném čase pro detekci hub
UNG
uracil-N-glykosyláza
XYL
D-xylóza 83
9
SEZNAM OBRÁZKŮ
Obrázek 1: Nesaturující a saturující barviva ........................................................................... 17 Obrázek 2: Křivka tání (po normalizaci dat) .......................................................................... 18 Obrázek 3: Schéma real-time PCR pro kvantitativní detekci ................................................. 23 Obrázek 4: Mechanismus značek nejčastěji používaných pro real-time PCR........................ 24 Obrázek 5: Nekompetitivní uspořádání IAC a cílové DNA v PCR ........................................ 25 Obrázek 6: Část in silico analýzy sekvencí různých rodů a druhů hub z databáze Genbank pomocí ClustalW .............................................................................................................. 37 Obrázek 7: Část in silico analýzy sekvencí různých druhů kandid z databáze Genbank pomocí ClustalW. ............................................................................................................. 38 Obrázek 8: Analýza sekvecence C. orthopsilosis pomocí uMeltsm v2.0.2 ............................. 38 Obrázek 9: Zobrazení první derivace fluorescence na teplotě (dMelt křivky) u referenčních kmenů Candida sp. v duplikátech u kandid s jedním vrcholem tání (Tm vrchol) ........... 41 Obrázek 10: Zobrazení první derivace fluorescence na teplotě (dMelt křivky) u referenčních kmenů Candida sp. v duplikátech u kandid se dvěma vrcholy tání ................................. 42 Obrázek 11: Normalizovaných teplotně upravené křivky odlišností vztažené ke kontrolnímu vzorku C. krusei u třech dvojic referenčních kmenů kandid. ........................................... 43 Obrázek 12: Křivky první derivace fluorescence na teplotě (dMelt křivky) u dvou neodlišitelných dvojic referenčních kmenů kandid .......................................................... 44 Obrázek 13: Sbírkové kmeny kandid po amplifikaci UNF-qPCR.......................................... 44 Obrázek 14: Heterogenity v devíti klinických izolátech C. metapsilosis oproti referenční sekvenci ozn. K24 ............................................................................................................ 48 Obrázek 15: Analytická senzitivita duplexní reakce UNB-qPCR – zobrazeno na 2% agarózovém gelu barveném ethidium bromidem ............................................................. 50 84
Obrázek 16: Příklad amplifikace CCM kmenů UNB-qPCR – ověření specifického nasedání primerů ............................................................................................................................. 51
85
10 SEZNAM TABULEK
Tabulka 1: Doporučení pro diagnostiku IKO dle ESCMID. .................................................. 12 Tabulka 2: Výběr vzácně se vyskytujících kandid ................................................................. 13 Tabulka 3: Počet (%) případů IMO u pacientů po SOT ......................................................... 14 Tabulka 4: Referenčních kmeny kandid ................................................................................. 27 Tabulka 5: Referenční bakteriální kmeny ............................................................................... 28 Tabulka 6: Referenční kmeny pro HRMA.............................................................................. 40 Tabulka 7: Klinické izoláty kandid identifikované pomocí fenotypových metod (CANDIDAtest 21 a API ID 32C), HRMA a sekvenování.............................................. 46 Tabulka 8: Výsledek dekontaminace Taqman Gene Expression Master Mixu (Life Technologies, USA) pro detekci bakterií ......................................................................... 49 Tabulka 9: Analytická senzitivita duplexní reakce UNB-qPCR............................................. 50 Tabulka 10: Identifikace sbírkových kmenů bakterií pomocí čtyř veřejně dostupných databází sekvencí genu 16S rRNA s využitím sekvencí vymezených UNB-qPCR.....52-53 Tabulka 11: Identifikace 21 sbírkových kmenů do druhu, vzhledem ke sbírkovému zařazení, pomocí čtyř databází......................................................................................................... 54 Tabulka 12: Senzitivita a specificita UNB-qPCR pro vybrané hodnoty hranic rozdílu Ct vzorku a příslušné IK........................................................................................................ 54 Tabulka 13: Porovnání výsledků HK před léčbou, kultivací chlopní po operaci a výsledků detekce bakteriální DNA v chlopních 28 pacientů s podezřením na IE ......................57-58
86
11 SEZNAM PŘÍLOH Příloha 1: Němcová E, Černochová M, Růžička F, Mališová B, Freiberger T, Němec P: Rapid identification of medically important Candida isolates using high resolution melting analysis (odesláno do časopisu s IF) Příloha 2: Žaloudíková B, Němcová E, Pol J, Šorm Z, Wurmová Ś, Novotná K, Vaněrková M, Holá V, Růžička F, Dušek L, Němec P, Freiberger T: Value of PCR in surgically treated patients with staphylococcal infective endocarditis: A 4-year retrospective study. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2012; 31(6):1187-94. Příloha 3: Pýchová M, Konrádová M, Němcová E, Freiberger T, Husa P: Streptococcus suis: původce purulentních meningoencefalitid nejen ve veterinární oblasti. Interní Med 2011; 13(1): 43-45. Příloha 4: Horká M, Růžička F, Kubesová A, Němcová E, Šlais K: Separation of phenotypically indistinguishable Candida species, C. orthopsilosis, C. metapsilosis and C. parapsilosis, by capillary electromigration techniques. J Chromatogr A 2011; 1218(25): 3900-3907. Příloha 5: Vaněrková M, Žaloudíková B, Němcová E, Juranková J, Pol J, Černý J, Němec P, Freiberger T: Detection of Cardiobacterium valvarum in a patient with aortic valve infective endocarditis by broad-range PCR. J Med Microbiol 2010; 59(Pt 2): 231-4. Příloha 6: Slaný M, Vaněrková M, Němcová E, Žaloudíková B, Růžička F, Freiberger T: Differentiation of Staphylococcus spp. by High-Resolution Melting Analysis. Can J Microbiol 2010; 56(12): 1040-49.
87
12 SEZNAM ODBORNÝCH PUBLIKACÍ AUTORA 12.1 Seznam publikací a spoluautorských prací 1) Němcová E, Černochová M, Růžička F, Mališová B, Freiberger T, Němec P: Rapid identification of medically important Candida isolates using high resolution melting analysis (odesláno do časopisu s IF) 2) Žaloudíková B, Němcová E, Pol J, Šorm Z, Wurmová Ś, Novotná K, Vaněrková M, Holá V, Růžička F, Dušek L, Němec P, Freiberger T: Value of PCR in surgically treated patients with staphylococcal infective endocarditis: A 4-year retrospective study. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2012; 31(6):1187-94. 3) Pýchová M, Konrádová M, Němcová E, Freiberger T, Husa P: Streptococcus suis: původce purulentních meningoencefalitid nejen ve veterinární oblasti. Interní Med 2011; 13(1): 43-45. 4) Horká M, Růžička F, Kubesová A, Němcová E, Šlais K: Separation of phenotypically indistinguishable Candida species, C. orthopsilosis, C. metapsilosis and C. parapsilosis, by capillary electromigration techniques. J Chromatogr A 2011; 1218(25): 3900-3907. 5) Vaněrková M, Žaloudíková B, Němcová E, Juranková J, Pol J, Černý J, Němec P, Freiberger T: Detection of Cardiobacterium valvarum in a patient with aortic valve infective endocarditis by broad-range PCR. J Med Microbiol 2010; 59(Pt 2): 231-4. 6) Slaný M, Vaněrková M, Němcová E, Žaloudíková B, Růžička F, Freiberger T: Differentiation of Staphylococcus spp. by High-Resolution Melting Analysis. Can J Microbiol 2010; 56(12): 1040-49. 7) Kosina M, Němcová E, Holochová P, Švec P, Vávrová A, Šedo O, Lexa M, Sedláček I: Pseudomonas karstica sp. nov. and Pseudomonas spelaei sp. nov., psychrotrophic species isolated from kalcite (odesláno do časopisu s IF)
12.2 Seznam vybraných konferenčních abstrakt 1) Němcová E, Černochová M, Růžička F, Mališová B, Vaněrková M, Šuranská H, Němec P, Freiberger T: High resolution melting analysis for rapid identification of twenty-five 88
Candida species from culture; In 24nd European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Barcelona, 2014. 2) Černochová M, Němcová E, Vaněrková M, Šuranská H, Pol J, Němec P, Freiberger T: Spectrum of pathogens in surgically treated infective endokarditis patiens with focus on fastidious and non-cultivable bacteria; In 24nd European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Barcelona, 2014. 3) Němcová E, Černochová M, Růžička F, Mališová B, Vaněrková M, Němec P, Freiberger T: Rapid identification of phenotypic similar Candida species from culture using high resolution melting analysis. Mycoses 2013; 56 (S3), 134-135. 4) Mališová B, Černochová M, Kubasová T, Němcová E, Tejkalová R, Pol J, Němec P, Freiberger T: Streptococcus pneumoniae infective endocarditis: species identification by 16S rDNA sequencing; In 23nd European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Berlin, 2013. 5) Němcová E, Mališová B, Štechová M, Freibergerová M, Pařízková R, Juránková J, Freiberger T: Spectrum of pathogens identified by molecular methods in patients with acute bacterial meningitis. Clin Microbiol Infect 2012, 18(S3), p. 362. 6) Němcová E, Krulová B, Žaloudíková B, Pol J, Němec P, Freiberger T: Evaluation of realtime broad-range PCR assay for rapid detection of eubacterial 16S rRNA in heart valve tissue. Int J Antimicrob Agents 2009; 33(S2): S24. 7) Freiberger T, Němcová E, Žaloudíková B, Krulová B, Pol J, Šorm Z, Kolek M, Novotná K, Němec P: Spectrum of pathogens in surgically treated infective endocarditis patiens. Clin Microbiol Infect 2009; 15(S4): S279.
89
13 SOUHRN POZNATKŮ DISERTAČNÍ PRÁCE
Na základě analýzy 25 referenčních kmenů a 143 klinických izolátů kandid byla validována metoda kvantitativní real-time PCR (UNF-qPCR) s následnou analýzou tání s vysokým rozlišením (HRMA), pomocí níž bylo identifikováno 23 z 27 analyzovaných druhů kandid, přičemž zbylé 4 druhy byly zařazeny do dvou skupin. Jde dosud o nejširší druhové zastoupení a největší počet izolátů kandid testovaný pomocí HRMA (Němcová a kol., odesláno do časopisu s IF). Dále
byla
optimalizovaná
kvantitativní
duplexní
real-time
PCR
(UNB-qPCR)
pro širokospektrou detekci bakterií. Metoda byla validována pomocí 21 referenčních kmenů bakterií. Výsledky analýz klinického materiálu (chlopní) od 28 pacientů s podezřením na infekční endokarditidu (IE) a 20 kontrolních vzorků pomocí UNB-qPCR byly porovnatelné
s výstupy
z
námi
běžně
používané
širokospektré
end-point
PCR.
Mezi nejčastějšími původci IE ve vyšetřovaném souboru byly rody Staphylococcus sp. (10/28) a Streptococcus sp. (10/28). Dále byly identifikovány: E. faecalis (2/28), H. parainfluenzae (2/28) a A. urinae (1/28). Dva klinické vzorky byly pomocí UNB-qPCR negativní a jeden nebylo možné dourčit. Studie potvrdila, že metoda UNB-qPCR může být vhodným doplňkem klasických kultivačních technik při vyšetření srdeční tkáně u pacientů s IE, zejména v případech kultivačně náročných patogenů nebo probíhající antibiotické terapie. Metodu je potřeba validovat na větším souboru pacientů.
……………………………………. prof. MUDr. Miroslav Votava, CSc.
………………………………… MUDr. Tomáš Freiberger, Ph.D.
90
PŘÍLOHY
