Masarykova univerzita, Lékařská fakulta Biologický ústav
Vyuţití metod molekulární biologie při detekci bakterií v biologických materiálech
Disertační práce
RNDr. Michal Slaný
Brno 2010 Disertační práce byla vypracována v doktorském studijním programu v Genetické laboratoři Centra kardiovaskulární a transplantační chirurgie Brno
1
Uchazeč: RNDr. Michal Slaný Výzkumný ústav veterinárního lékařství, v.v.i. Brno Odborné vedení uchazeče - školitel: MUDr. Tomáš Freiberger, Ph.D. Centrum kardiovaskulární a transplantační chirurgie Brno, Genetická laboratoř
2
Prohlášení Prohlašuji, ţe jsem tuto doktorskou disertační práci vypracoval samostatně pod vedením svého školitele a uvedl v ní všechny pouţité zdroje. V Brně dne: Michal Slaný
3
Poděkování Na tomto místě bych chtěl poděkovat svému školiteli MUDr. Tomáši Freibergerovi, Ph.D. za moţnost pracovat v laboratoři Centra kardiovaskulární a transplantační chirurgie na problematice molekulární detekce patogenů, za jeho vedení a odbornou pomoc, kterou mi poskytoval během mého studia. Poděkovat bych chtěl také Prof. MVDr. Ivo Pavlíkovi, CSc. za podporu a moţnost dokončit dizertační práci na mém současném pracovišti: Oddělení bezpečnosti potravin a krmiv, Výzkumný ústav veterinárního lékařství, v.v.i. Nakonec bych chtěl poděkovat mé manţelce, rodině a všem svým přátelům za podporu, porozumění a lásku, kterou mi poskytují.
4
Obsah 1. ÚVOD .........................................................................................................................7 1.1. BAKTERIE JAKO PŮVODCI ONEMOCNĚNÍ ..............................................7 1.1.1. Co jsou to bakterie ..............................................................................7 1.1.2. Antibiotika ..........................................................................................7 1.1.3. Infekční endokarditida ........................................................................8 1.1.4. Mykobakteriózy ...............................................................................11 1.2. MOŢNOSTI IDENTIFIKACE BAKTERIÍ ....................................................13 1.2.1. Biologický materiál pouţívaný při detekci bakterií ..........................13 1.2.2. Metody mikrobiologické identifikace ...............................................13 1.2.3. Aplikace molekulárních metod na detekci patogenů ........................14 1.2.3.1. Specifická detekce bakterií..........................................................14 1.2.3.2. Širokospektrá bakteriální detekce s následnou sekvenční analýzou ......................................................................................15 1.2.3.3. Vysokorozlišovací analýza teplotního tání (HRMA) ..................17 2. CÍLE PRÁCE ..........................................................................................................19 3. MATERIÁL A METODY......................................................................................20 3.1. MATERIÁL .....................................................................................................20 3.2. ZPRACOVÁNÍ VZORKŮ ..............................................................................21 3.3. DNA EXTRAKCE ..........................................................................................21 3.4. KONVENČNÍ ŠIROKOSPEKTRÁ 16S rRNA PCR ......................................21 3.4.1. Kultivačně nezávislá širokospektrá bakteriální detekce ...................21 3.4.2. Kultivačně závislá identifikace mykobakteriálních izolátů ..............22 3.5. 16S rRNA REAL TIME PCR S NÁSLEDNOU HRMA .................................22 3.5.1. Zavedení 16S rRNA real time PCR s následnou HRMA ..................22 3.5.2. Heteroduplexní analýza ....................................................................23 3.5.3. Limit detekce 16S rRNA HRMA ......................................................23 3.5.4. Klinická citlivost 16S rRNA HRMA .................................................23 3.6. SEKVENACE ..................................................................................................24 3.7. POČÍTAČOVÁ ANALÝZA SEKVENCÍ.......................................................24 4. VÝSLEDKY ............................................................................................................25
5
4.1. SPEKTRUM BAKTERIÁLNÍCH PATOGENŮ U PACIENTŮ S DIAGNOATIKOVANOU INFEKČNÍ ENDOKARDITIDOU ..............25 4.2. KONVENČNÍ ŠIROKOSPETRÁ 16S rRNA PCR A IDENTIFIKACE MYKOBAKTERIÁLNÍCH IZOLÁTŮ ......................................................26 4.3. 16S rRNA HRMA ............................................................................................29 4.3.1. Analytický limit detekce 16S rRNA HRMA .....................................29 4.3.2. Test klinické citlivosti 16S rRNA HRMA.........................................31 4.3.3. Analýza klinických izolátů ...............................................................32 4.3.4. Referenční kmeny rodu Staphylococcus. ..........................................34 4.3.4.1.Sekvenční analýza ..........................................................................34 4.3.4.2.16S rRNA HRMA a heteroduplexní analýza ..................................36 5. DISKUZE ................................................................................................................42 5.1. MOLEKULÁRNÍ DETEKCE GENU 16S rRNA ............................................42 5.1.1. Přístupy pouţívané při detekci a identifikaci 16S rRNA z biologických materiálů ...................................................................42 5.1.2. Omezení sekvenční analýzy..............................................................43 5.2. URČENÍ BAKTERIÁLNÍHO SPEKTRA U PACIENTŮ S INFEKČNÍ ENDOKARDITIDOU .................................................................................44 5.3. IDENTIFIKACE IZOLÁTŮ NETUBERKULÓZNÍCH MYKOBAKTERIÍ.......................................................................................44 5.4. 16S rRNA HRMA ............................................................................................45 5.4.1. Pouţití 16S rRNA HRMA na vybrané sbírkové kmeny rodu Staphylococcus..................................................................................46 5.4.2. Aplikovatelnost 16S rRNA HRMA na klinické vzorky ....................47 6. ZÁVĚR ....................................................................................................................49 7. SOUHRN .................................................................................................................51 8. SUMMARY .............................................................................................................53 9. SEZNAM ZKRATEK ............................................................................................55 10. LITERATURA ........................................................................................................57 Seznam příloh ................................................................................................................65
6
1. Úvod 1.1. BAKTERIE JAKO PŮVODCI ONEMOCNĚNÍ Ve středověku byly bakterie původci epidemií tyfu, moru nebo cholery. V dnešní době, kdy je jiţ zavedeno pouţívání antibiotik, byl výskyt těchto onemocnění minimalizován. Přesto bakterie zůstávají původci mnoha onemocnění u člověka.
1.1.1. Co jsou to bakterie Bakterie jsou mikroskopické, jednobuněčné organismy nacházející se ve vzduchu, vodě, půdě i potravě. Přeţívají na rostlinách, hmyzu, zvířatech a dokonce ve trávicím traktu člověka. Existuje několik tisíc druhů bakterií, ale pouze malá část z nich je původcem onemocnění u lidí a zvířat. Bakterie jsou často identifikovány podle jejich vzhledu, tvorby jejich buněčných stěn či schopnosti růst za rozličných podmínek. Bakterie vykazují rozlišné tvary: kulovité (např. rod Streptococcus a Staphylococcus), tyčinkovité (např. Escherichia coli, Bacillus subtilis) nebo spirálovité (např. Borrelia burgdorferii). Klasifikace bakterií je prováděna také na základě Gramova barvení. Buněčná stěna gram-negativních bakterií obsahuje zánětlivou lipopolysacharidovou (LPS) sloţku, která spouští imunitní odpověď v lidském těle. LPS je odpovědný za spuštění reakce imunitního systému, která vede k uvolnění cytokinu a dalších zánětlivých mediátorů. Bakteriální infekce můţe být způsobena širokým spektrem bakterií s různými projevy od slabé infekce aţ po ţivot ohroţující infekci (např. cholera, meningitida), kde je nutný okamţitý lékařský zásah. Člověk je za normálních podmínek chráněn před bakteriální infekcí imunitním systémem. Rizikovou skupinou jsou pro bakteriální infekce pacienti s chronickým onemocněním či se sníţenou funkcí imunitního systému (Kyaw a kol., 2005). Mezi běţné bakteriální infekce lze zahrnout pneumonie, otitidy, průjmová onemocnění, infekce urinárního traktu a koţní choroby (Kyaw a kol., 2005; Rautemaa a kol., 2007; Tsai a kol., 2008).
1.1.2. Antibiotika Nosným pilířem při léčbě bakteriální infekce jsou antibiotika (Gold a Moellering, Jr., 1996). Hlavním cílem těchto léků je usmrcení cizorodých bakterií bez poškození hostitele. Účinnost antibiotik závisí na mechanismu účinku, distribuci léku v organismu, místě infekce, stavu imunitního systému hostitele a faktorů rezistence bakterií (Archer a
7
Bosilevac, 2001). Antibiotika účinkují pomocí několika mechanismů. Některé inhibují tvorbu bakteriální buněčné stěny (např. vankomycin, penicilin) nebo zasahují do syntézy proteinů (např. erytromycin, tetracyklin nebo chloramfenikol). Další antibiotika cíleně inhibují bakteriální metabolismus, brání syntéze DNA (ciprofloxacin, rifampicin) nebo ovlivňují permeabilitu membrán (např. polymyxin b; Krasner, 2002). V počátcích jejich objevu byla antibiotika vysoce účinná proti bakteriálním infekcím. S průběhem času však mnoho bakterií získalo rezistenci proti běţně pouţívaným antibakteriálním přípravků. (Barie, 1998). Bakterie mohou být přirozeně odolné vůči různým skupinám antibiotik, nebo mohou získat odolnost v důsledku mezibakteriálního přenosu genů pro rezistenci (Domin, 1998). Nevhodná a zbytečně dlouhá léčba antibiotiky vedla k selekci většiny dnes rezistentních kmenů bakterií (van Der a Nord, 2000; Petrosillo a kol., 2002). Bakteriální kmeny rezistentní na antibiotika jsou celosvětovým problémem, objevují se v nemocnicích, zařízeních s dlouhodobou pečovatelskou sluţbou či v běţném ţivotě (Jacobs a kol., 1999; Levin a kol., 2003). Zvyšující se výskyt rezistentních mikroorganismu má za následek pouţívání větších dávek léků a prodlouţení antibakteriální terapie, coţ můţe vést k eliminaci přirozené bakteriální flory organismu a zvýšit tak náchylnost k infekci (Tasota a kol., 1998; Apfalter, 2003; Carson a Riley, 2003; Amsden, 2004). Běţným vedlejším efektem antibiotik je diarhea vedoucí ke ztrátě esenciálních vitamínů a minerálů, zvláště vitamínu K, hořčíku, zinku a tím oslabení organismu (Fontaine, 1996; Guerrant a kol., 2000).
1.1.3. Infekční endokarditida Příkladem bakteriálního onemocnění u člověka je infekční endokarditida (IE). Jedná se o zánětlivé onemocnění srdečních chlopní a vnitřní výstelky srdce (endokardu). K častým projevům onemocnění patří zvýšená teplota a srdeční šelest. IE je nepříliš frekventované, nicméně závaţné srdeční onemocnění, jehoţ incidence se v našich podmínkách pohybuje mezi 2 aţ 5 případy na 100 000 obyvatel a mortalita mezi 10 aţ 30 % (Benes a Kvasnicka, 2000). IE způsobují nejčastěji bakterie rodu Staphylococcus, Streptococcus nebo Enterococcus. Kromě nich za ni ale mohou odpovídat i další bakterie, viry či houby. Jedním ze základních předpokladů pro vznik zánětu je přítomnost tzv. vegetací na endokardu. Ty vznikají na místech oslabení nebo poškození srdeční výstelky. Zpočátku jsou tvořeny pouze shlukem krevních destiček.
8
V případě přítomnosti baktérií v krvi (bakteriémii) však tvoří ideální prostředí pro jejich uchycení a růst (Moreillon a kol., 2002). Z původně sterilní vegetace vzniká vegetace infikovaná. Bakteriémie vzniká při bakteriálních infekcích, ale i při běţných denních činnostech (např. důkladnější vyčištění zubů nebo ţvýkání tuhé potravy). Vysoce citlivá, specifická a rychlá diagnostika IE je důleţitá pro léčbu a prognózu pacienta. Nejčastěji pouţívaný diagnostický systém IE uţívaný v klinických laboratořích je dle Dukeho university (Durack a kol., 1994) zaloţený na hlavních a vedlejších kriteriích uvedených v Tabulce 1. Podle stanovených kriterií jsou pacienti s ohledem na patologické, echokardiografické, klinické a kultivační výsledky klasifikováni do následujících tří cílových skupin: definitivní, pravděpodobná a odmítnutá diagnóza IE. Pro diagnózu IE je třeba splnit alespoň jednu z následujících podmínek: 1. výskyt minimálně dvou hlavních kritérií; 2. výskyt jednoho hlavního a tří vedlejších kritérií; 3. výskyt pěti vedlejších kritérií
9
Tabulka 1. Duke kriteria pouţívaná pro klasifikaci infekční endokarditidy
Hlavní kriteria
Pozitivní hemokultura 1) Mikrob typický pro IE ve dvou separátních hemokulturách: Streptococcus. viridans, S. bovis, skupina HACEK* komunitní S. aureus, Enterococcus sp. bez nálezu primárního fokusu Známky postiţení 1) Echokardiogram svědčí pro IE:
endokardu
oscilující nitro-srdeční masa na chlopni nebo podpůrných strukturách, v cestě regurgitačních jetů nebo na implantovaném materiálu bez jiného známého morfologického podkladu nebo absces nová částečná dehiscence umělé chlopně 2) Nová valvulární regurgitace (ne pouze zhoršení stávající) Vedlejší kriteria
predisponující předpoklady v srdci nebo intravenózní narkomanie horečka: teplota >38°C valvulární jevy: větší arteriální embolizace, septické plicní infarkty, mykotické aneurysma, intrakraniální hemorhagie, conjunktivální hemorhagie a Janewayovy léze imunologické jevy: glomerulonefritida, Oslerovy uzlíky, Rothovy skvrny a revmatoidní faktor mikrobiologický průkaz: pozitivní hemokultura, která ale nesplňuje hlavní kritérium nebo sérologický průkaz aktivní infekce organizmem slučitelným s IE echokardiografický nález: slučitelný s IE, ale nesplňuje hlavní kritérium
*
Skupina HACEK: Haemophilus sp. Actinobacilius actinomycetemcomitans, Cardiobacterium hominis, Eikenella
corrodens a Kingella sp.
10
1.1.4. Mykobakteriózy Další skupinou bakterií vykazující často rezistenci ke klasické antibakteriální léčbě jsou mykobakterie. Mykobakterie jsou gram-negativní acidorezistentní tyčky. V současnosti bylo identifikováno 148 mykobakteriálních druhů (Kazda a kol., 2009). Do této skupiny se řadí původci váţných onemocnění u lidí, jako jsou Mycobacterium tuberculosis, M. bovis nebo M. leprae (de Kantor a kol., 2008; Motta a kol., 2008) a netuberkulózní (NTM) nebo podmíněně patogenní mykobakterie (PPM) vyskytující se hojně v prostředí. NTM jsou odpovědné za méně časté onemocnění u lidí a zvířat, obecně nazývané jako mykobakteriózy (Sack, 1990; Han a kol., 2007; Shitaye a kol., 2009). Většina NTM je pro člověka nepatogenní, s velmi nízkou virulencí. S ohledem na běţně pouţívanou klasifikaci dle Runyona, jsou NTM děleny podle rychlosti růstu a pigmentace. Rychle rostoucí NTM jsou charakteristické nárůstem viditelných kolonií na pevném médiu do 7 dnů, zatímco pomalu rostoucí NTM mohou růst týdny aţ měsíce (Runyon, 1959). Mezi rychle rostoucí mykobakterie se např. řadí: M. fortuitum, M. abscessus, M. chelonae, M. smegmatis, M. marinum nebo M. gordonae (Talati a kol., 2008). Rychle rostoucí mykobakterie jsou schopné vytvářet biofilm, coţ je pravděpodobně jejich hlavní formou přeţívání v prostředí (Schulze-Robbecke a kol., 1992). Tzv. pomalu rostoucí mykobakterie zastupuje
např. M. avium subsp.
paratuberculosis, M. kansasii, M. intracellulare, M. ulcerans nebo M. arupense (Cloud a kol., 2006; Tortoli, 2006). NTM se v poslední době dostávají do popředí klinického zájmu pro jejich pozvolna se zvyšující incidenci a specificky přístup k jejich diagnostice a léčbě. Získání infekce
probíhá
inhalačním
způsobem
prostřednictvím
infekčního
aerosolu,
deglutinační cestou přes ústní sliznici nebo kontaktní cestou, kdy u koţních forem vstupuji původci do podkoţí koţními oděrkami (Griffith a kol., 2007). Některé druhy NTM mohou vyvolat plicní i mimoplicní onemocněni jak u osob imunokompetentních, tak především u imunokompromitovaných. Nejčastěji se u nich jedná o sekundární imunodeficienci v důsledku infekce HIV, imunosupresivní léčby po transplantacích či při jiných systémových chorobách (Sack, 1990; Echevarria a kol., 1994; Tortoli, 2006). V těchto případech má NTM infekce agresivní průběh s diseminací loţisek a vysokým rizikem mortality. Onemocnění způsobované NTM lze pro přehled zařadit do čtyř skupin.
11
1. Onemocnění plic Onemocnění plic je nejčastější formou onemocnění vyvolaného NTM a projevuje se ve čtyřech formách. Jde v první řadě o fibronodulární bronchiektázii, o rozpadové procesy podobné klasické tuberkulóze (kavitární forma), solitární noduly a nakonec o poměrně novou nozologickou jednotku připomínající hypersenzitivní pneumonitis, tzv. „hot tub lung“ (Stout, 2006). Fibronodulární bronchiektázie postihuje zejména starší ţeny, často nekuřačky, bez historie jiného plicního onemocnění. Kavitární forma se naopak vyskytuje častěji u muţů nad padesát let věku s historií kouření nebo se závislostí na alkoholu (Parrisch a kol., 2008). 2. Kožní léze Koţní léze se vyskytují zejména u pacientů s primárním onemocněním, oslabujícím jejich imunitu. Těmi jsou zejména Diabetes Mellitus, nádorová onemocnění, chronické renální selhání a HIV/AIDS. Infekce mívají charakter plaků, nodulárních změn, podkoţních abscesů nebo dokonce mohou připomínat koţní změny vyvolávané leprou (Lawn a kol., 2004; Adhikesavan a kol., 2008). Zajímavý je popis pseudotumoru vřetenovitých buněk kůţe vyvolaný infekcí M. intracellulare (Shiomi a kol., 2007).
3. Periférní lymfadenitidy Další formou onemocnění, vyvolaného NTM, jsou periferní lymfadenitidy, které postihují zejména děti (Primm a kol., 2004) a jsou nejčastěji způsobeny zástupci M. avium komplexu, M. scrofulaceum nebo M. haemophilum (Amir, 2010). 4. Systémová onemocnění Vzácnou formou NTM infekcí jsou systémová onemocnění, při nichţ dochází k rozšíření NTM z primárního vstupu infekce do dalších tkání a vnitřních orgánů. Tato onemocnění byla pozorována hlavně u imunosuprimovaných osob nebo pacientů s HIV/AIDS (Biet a kol., 2005). Systémové rozšíření NTM infekce bylo popsáno u zvířat, kde je častější (Slany a kol., 2010c).
12
1.2. MOŢNOSTI IDENTIFIKACE BAKTERIÍ Detekce bakteriálních patogenů je rutinně zavedena v klinických laboratořích. Včasná a přesná identifikace původce onemocnění je důleţitá pro cílenou antibakteriální terapii, zvláště v případě akutního ohroţení ţivota. V následujících podkapitolách budou podrobněji popsány moţnosti detekce bakterií z biologických materiálů.
1.2.1. Biologický materiál pouţívaný při detekci bakterií Při detekci bakterií lze pouţít různé spektrum biologického materiálu. U pacientů je potřeba pouţít specifický klinický materiál dáný druhem infekce, její lokalizací a případně metodickým omezením pouţité detekční metody. V klinické praxi běţně pouţívaný materiál zahrnuje např. krev, stolici, moč, likvor, tkáňové vzorky, punktáty nebo stěry z povrchů sliznic.
1.2.2. Metody mikrobiologické identifikace Mikrobiologická identifikace bakterií je zaloţena na kultivačních technikách v mediích o definovaném sloţení. Identifikace daného bakteriálního kmenu je poté zaloţena na růstu na specifickém médiu, morfologii kolonií a případně na jeho biochemických charakteristikách (např. rezistenci vůči antibiotikům, enzymatické aktivitě apod.). Pro demonstraci je zde uveden příklad kultivace NTM. Nutnost identifikovat tyto kauzální patogeny vyplývá z jejich variabilní odpovědi na mykobakteriální léčbu. Konvenční kultivační techniky pouţívají média na bázi vaječné sloţky nebo agaru, jako jsou Löwenstein-Jensen médium a agar dle Middlebrooka (Heifets, 1997). Doba kultivace některých mykobakterií je zdlouhavá, neboť kultivace trvají 3 aţ 8 týdnů. Tradičně jsou NTM klasifikovány podle jejich schopnosti produkovat pigmenty a rychlosti růstu na specifických mediích (Runyon, 1959). Pro podrobnou charakterizaci mykobakteriálních druhů jsou sledovány také jejich biochemické charakteristiky, jako je například redukce Fe3+ nebo NaNO3, aktivita arylsulfatázy a rezistence k isoniazidu, chinolonu, rifampicinu nebo streptomycinu (Heifets, 1997). Tradiční identifikace mykobakterií zaloţená na kultivačních, mikroskopických a biochemických testech můţe trvat několik týdnů a někdy se nemusí podařit daný mykobakteriální druh těmito metodami přesně identifikovat. Selhání kultivace bakterií z klinických vzorků můţe mít
13
několik důvodů. Prvním důvodem je nevhodné sloţení růstového média pro kultivace (danou bakterii není moţno za stávajících podmínek kultivovat). Druhým důvodem je pouţití antibiotické léčby u pacientů před odběrem vzorku, coţ můţe vést k negativním výsledkům v důsledku reziduální přítomnosti antibiotika, které zamezí růstu přítomného bakteriálního agens. Časová náročnost kultivací, nepřesná identifikace kauzálního agens v některých případech a příleţitostné selhání kultivace je jedním z hlavních důvodů, proč jsou do klinické praxe zaváděny metody molekulární biologie. Mikrobiologické techniky jsou stále zlatým standardem při identifikaci bakterií, neboť oproti molekulárním metodám detekujícím pouze nukleové kyseliny, jsou zatím pouze kultivační techniky schopny odlišit ţivé bakterie od mrtvých. Ovšem, v nedávno publikované práci byla zmíněna moţnost pouţítí molekulární metody na rozlišení ţivých a mrtvých buněk (Kralik a kol., 2010).
1.2.3. Aplikace molekulárních metod na detekci patogenů Detekce
bakteriálních
patogenů
v klinických,
enviromentálních
nebo
potravinových vzorcích často vyţaduje před vlastní detekcí zmnoţení bakteriálních buněk pomocí kultivace. Metody identifikace bakterií zaloţené na kultivaci mají několik nevýhod diskutovaných v kapitole 1.2.2. V posledním desetiletí bylo vyvinuto mnoho molekulárních metod řešících limitace klasických kultivací. Tyto metody umoţnily rychlou, přesnou a citlivou identifikaci mikroorganismů a doplnily nebo případně nahradily klasické přístupy bakteriální detekce. Pro účely detekce bakterií se mezi těmito metodami se ukázala jako vhodná polymerázová řetězová reakce (PCR), která mnohonásobně namnoţí vybranou specifickou oblast DNA. Mikrobiologové si uvědomili potenciál PCR pro zavedení nových přístupů vhodných pro studium bakteriálních komunit, detekci a identifikaci mikroorganismů v různých ekosystémech a fylogenetické studie. Oproti dlouho pouţívaným metodám kultivace nám techniky zaloţené na PCR umoţňují identifikaci mikroorganismů navzdory jejich špatné kultivovatelnosti.
1.2.3.1. Specifická detekce bakterií Molekulární diagnostika je cenným nástrojem i v klinické praxi (Fredricks a Relman, 1999). Vzrůstající mnoţství bakteriálních sekvencí ve veřejných databázích a
14
aplikace nástrojů bioinformatiky odhalily DNA lokusy unikátní pro jednotlivé bakteriální druhy, coţ umoţnilo vývoj vysoce specifických PCR metod pro jejich detekci. Příkladem takových jedinečných lokusů vyskytujících se pouze u bakterie M. avium subsp. paratuberculosis jsou IS900 a F57 (Slana a kol., 2008). Unikátní sekvence IS901 byla identifikována u M. avium subsp. avium, které je původcem Aviární tuberkulózy u ptáků a v některých případech můţe být také původcem plicní infekce u lidských pacientů (Kriz a kol., 2010). Výhodou tohoto přístupu pro detekci bakterií je specifita, rychlost a citlivost v porovnání s kultivacemi (Slana a kol., 2008).
1.2.3.2. Širokospektrá bakteriální detekce s následnou sekvenční analýzou Vyuţití unikátních sekvencí charakteristických pro určitý bakteriální druh není moţné ve všech případech, neboť u některých bakterií je mezidruhová shoda DNA sekvencí vysoká a takový unikátní lokus zatím nebyl identifikován. V takovém případě je moţno k detekci bakterií pouţít geny charakteristické pro všechna prokaryota a identifikaci provést pomocí sekvenční analýzy. Sekvenční analýza vyuţívá PCR amplifikace DNA, která je izolovaná z bakteriální kultury nebo přímo z biologických materiálů. Pouţití sekvenční analýzy na DNA izolovanou z klinických vzorků umoţnilo objevení nových patogenů (Woo a kol., 2008). Bylo publikováno velké mnoţství studií popisujících vyuţití sekvenční analýzy při detekci a následné typizaci bakteriální DNA (Woo a kol., 2008). Pro tyto účely se ukázaly vhodné lokusy 16S rRNA, transkripčně přepisovaná DNA spojka mezi geny 16S rRNA a 23S rRNA (ITS), recA nebo hsp65 (Telenti a kol., 1993; Harmsen a kol., 2003). Srovnání sekvencí genu 16S rRNA našlo široké uplatnění při odvození fylogenetických vztahů mezi prokaryoty (Woese, 1987; Chalker a Brownlie, 2004). Jednou z moţností je pouţití tzv. širokospektré PCR umoţňující amplifikaci variabilní oblasti 16S rRNA genu běţně sdíleného bakteriemi. Analýzou primárních sekvencí pomocí veřejně dostupných databází: (např. EZ Taxon: http://www.eztaxon-e.org/) je poté podle sekvenční shody identifikován příslušný bakteriální kmen (Goldenberger a kol., 1997; Naber a Erbel, 2003). Širokospektrá PCR můţe přinést dodatečné informace ke klasickým kultivacím při hledání patogenní bakterie způsobující např. IE, sepsi nebo další humánní onemocnění (Stein a Raoult, 1992; Muller a kol., 1997).
15
Identifikace bakteriálních patogenů pomocí sekvenční analýzy je omezena několika skutečnostmi. Analýza vzorků s polymikrobiálním vzorem můţe vést k úplnému selhání sekvenční analýzy v důsledku interference signálů pocházejících z jednotlivých bakteriálních DNA, nebo je identifikována pouze bakterie s majoritní účastí ve vzorku. Dalším omezením je zatím stále nedostatečná kvalita veřejných databází bakteriálních sekvencí v důsledku chybně charakterizovaných sekvencí nebo zastaralé nomenklatury. Typizace bakteriálního druhu je v některých případech nemoţná v důsledku vysoké mezidruhové sekvenční shody. Tuto skutečnost lze dokumentovat na příkladu mykobakteriálních druhů v M. tuberculosis komplexu (MTC), kdy sekvenční analýza není schopna rozlišit jednotlivé zástupce (Brosch a kol., 2002). Zástupci MTC (M. tuberculosis, M. africanum, M. canettii, M. microti, M. bovis, M. bovis BCG, M. pinnipedii a M. caprae) jsou charakterizováni 99,9% sekvenční shodou na úrovni nukleotidů a identitou 16S rRNA genu (Sreevatsan a kol., 1997). Pokud jsou výsledky sekvenční analýzy 16S rRNA získané pro identifikaci bakteriálního druhu nedostačující, je nutné pouţít cílový gen specifický pro daný mikroorganismus (Greub a kol., 2005). Pro identifikaci nebo rozlišení bakteriálních druhů mohou být kromě sekvenční analýzy pouţity i další metody uvedené v Tabulce 2.
Tabulka 2. Přehled některých pouţívaných metodik pro typizaci bakterií
Metoda
Reference
Analýza délky restrikčních fragmentů (RFLP)
Putignani a kol., 2008
Náhodně amplifikovaná polymorfní DNA (RAPD)
Singh a kol., 2006
Pulzní gelová elektroforéza
Roy a kol., 1996
Ribotypizace
Lancellotti a kol., 2008
Sekvenční analýza
Harris a Hartley, 2003
Specifická real time PCR
Rondini a kol., 2003
16
1.2.3.3. Vysokorozlišovací analýza teplotního tání (HRMA) Nedávno popsaná metoda se jeví jako moţná alternativa přinášející doplňující informace k analýze sekvencí genu 16S rRNA (Cheng a kol., 2006; Yang a kol., 2009; Chakravorty a kol., 2010). HRMA je jednoduchá a finančně nenáročná post-PCR technika pro vyhledávání sekvenčních variací v cílovém genu (Liew a kol., 2004; Reed a Wittwer, 2004; Graham a kol., 2005; Krypuy a kol., 2006). Proces HRMA je zaloţen na provedení PCR v přítomnosti DNA vazebné barvičky, která má schopnost rozlišit dvouřetězcovou DNA (dsDNA) od jednořetězcové DNA (ssDNA) změnou intenzity fluorescenčního signálu (Wittwer a kol., 2003). Jednonukleotidové změny jsou v cílové oblasti detekovány pomocí změny profilu tání DNA duplexů. Sledování je provedeno pomocí fluorescenční interkalační barvičky, která je postupně uvolňována z DNA duplexu vlivem teplotní denaturace (Obrázek 1). V případě alelicky specifické diskriminace vznikají také heteroduplexy, které je moţno rozlišit na základě změněného tvaru křivky tání DNA (Obrázek 2).
Obrázek 1. Model rozdílů saturace fluorescenčních barviček staré a nové generace. Převzato z Herrmann a kol., 2007.
Rozvoj v instrumentaci a pouţití plně saturující interkalační barvičky umoţnilo široké vyuţití HRMA (Herrmann a kol., 2007). Pouţití nové generace plně saturujících dsDNA vazebných značek (např. SYTO9, EvaGreenTM, LC Green) umoţňuje detekovat změny
sekvence
v celé
délce
amplifikovaného
úseku.
U neaturujících
se
17
fluorescenčních barviček staré generace (např. SYBR Green) byl pozorován tzv. „dye jumping“ u denaturované oblasti do oblasti duplexu, coţ můţe vést k variabilní nebo ţádné změně měřené fluorescence. Taková změna fluorescenčního signálu plně nepostihuje nukleotidové záměny ve studovaném lokusu DNA. Výhodou HRMA je, ţe analýza je prováděna hned po amplifikaci ve stejné reakční zkumavce. Je tedy minimalizováno riziko kontaminace PCR a není nutná separace PCR produktu, coţ zrychlí dobu analýzy (Wittwer a kol., 2003). HRMA je v klinických laboratořích zpravidla pouţívaná pro rychlou a levnou detekci variant genů pro dědičně podmíněná onemocnění (Sinthuwiwat a kol., 2008), ale existují indicie pro aplikaci této metodiky i na identifikaci bakterií (Cheng a kol., 2006; Fortini a kol., 2007).
dsDNA
Homozygot, nemutovaná varianta 62CC Heterozygotní mutace 62C>G Homozygotní mutace 62GG
Teplota tání heteroduplexu je menší neţ u homoduplexu
ssDNA
Obrázek 2. Křivka teplotní desaturace fluorescenční barvičky. HRMA analýza mutace lokalizované v exonu 1 genu hMLH1. Převzato z White a Potts, 2006.
18
2. Cíle práce
Byly vytyčeny tři samostatné cíle související s detekcí bakterií v biologických materiálech: 1. Zjistit nejčastějšího bakteriálního původce infekční endokarditidy u klinických vzorků
analyzovaných
v letech
2003 aţ 2005
v laboratoři
Centra
kardiovaskulární a transplantační chirurgie Brno pomocí přímé detekce v biologickém materiálu bez nutnosti provést kultivaci. 2. Aplikovat konvenční širokospektrou 16S rRNA PCR s následnou sekvenční analýzou na identifikaci bakterií v izolátech získaných kultivací z biologických materiálů. 3. Zavést novou, potenciálně vyuţitelnou metodu molekulární detekce bakterií.
19
3. Materiál a metody 3.1. MATERIÁL V práci byly pouţity tkáňové vzorky 42 pacientů, kteří podstoupili náhradu srdeční chlopně v důsledku IE v letech 2003 aţ 2005 v Centru Transplantační a Kardiovaskulární chirurgie (CKTCH), referenční bakteriální kmeny (Česká sbírka mikroorganismů, Brno) a klinické izoláty (Mikrobiologický ústav Fakultní Nemocnice u Svaté Anny). Seznam referenčních kmenů a klinických izolátů je uveden v Tabulce 3. V rámci studie je dále zahrnuto celkem 272 mykobakteriálních izolátů nepatřících do M. tuberculosis a M. avium komplexů, pocházejících z humánního materiálu (n = 26; sputum nebo koţní biopsie), od zvířat (n = 64; tkáně a/nebo trus) a z prostředí (n = 182; půda, prach, organické zbytky, biofilm, moč, voda z povrchu a akvárií). Vzorky prostředí
byly
analyzovány
v rámci
ekologické
studie
prováděné
u zvířat
s mykobakteriální infekcí (skot, prasata, ptáci, malí suchozemští savci, sladkovodní a akvarijní ryby) na Oddělení bezpečnosti potravin a krmiv, VÚVeL, Brno. NTM, demonstrující patogenní vlastnosti u lidí, byly izolovány z humánního materiálu na Mikrobiologickém oddělení pro diagnostiku TBC na Zdravotním ústavu v Brně.
Tabulka 3. Referenční kmeny a klinické izoláty pouţité ve studii Referenční kmeny
Klinické izoláty
Staphylococcus aureus
CCM 7111
Enterobacter cloacae
Staphylococcus capitis
CCM 2735
Escherichia coli
Staphylococcus caprae
CCM 4546
Haemophylus influenzae
Staphylococcus epidermidis
CCM 2124
Pseudomonas aeroguinosa
Staphylococcus haemolyticus
CCM 2729
Staphylococcus aureus
Staphylococcus hominis
CCM 2732
Staphylococcus capitis
Staphylococcus intermedius
CCM 4710
Staphylococcus epidermidis
Staphylococcus saprophyticus
CCM 2727
Staphylococcus haemolyticus
Staphylococcus sciuri
CCM 7040
Staphylococcus hominis
Staphylococcus simulans
CCM 2724
Staphylococcus saprophyticus
Staphylococcus warneri
CCM 2731
Streptococcus agalactiae
Staphylococcus xylosus
CCM 2725
Streptococcus pneumonie
20
3.2. ZPRACOVÁNÍ VZORKŮ Vzorky chlopní pocházející od pacientů s diagnostikovanou IE byly pomocí sterilního skalpelu nařezány na kousky o velikosti cca 1-2 mm a poté pouţity pro extrakci DNA. Mykobakteriální klinické izoláty pocházející ze sputa nebo koţní biopsie byly kultivovány na Löwenstein-Jensen a Middlebrook 7H9 médiích (Difco Laboratories, Becton Dickinson, USA) obohacených směsí antibiotik (BD PANTA, Becton Dickinson, USA) při 37 °C. Pro kultivaci humánních izolátů na Zdravotním ústavu v Brně byl pouţit automatický systém Bactec MGIT 960 (Becton Dickinson, USA). Vzorky prostředí a zvířat byly homogenizovány a dekontaminovány dle procedury popsané jiţ dříve (Fischer a kol., 2000; Matlova a kol., 2003). Pro kultivaci NTM byly pouţity kultivační média dle Stonebrinka a Herrolda. Vzorky byly kultivovány v přítomnosti nebo absenci Mykobaktinu J (Allied Monitor, USA) při 25 °C a 37 °C.
3.3. DNA EXTRAKCE Extrakce genomové DNA z bakteriálních kultur byla provedena metodou tepelné lyze. Bakteriální kultura odebraná kličkou byla resuspendována ve 100 μl elučního pufru (50 mM Tris HCl, pH 8,5; 1 mM EDTA). Směs byla poté inkubována při 95 °C po dobu 15 minut a centrifugována při 3 500 × g po dobu 10 minut. Supernatant obsahující bakteriální DNA byl poté pouţit do PCR reakce. Na extrakci bakteriální DNA z plné krve, fyziologického roztoku nebo vzorků chlopní byl pouţit QIAmp DNA blood mini kit (QIAGEN, Německo). Standardní procedura izolace dle manuálu výrobce byla modifikována o preinkubaci peletu z centrifugované
krve
nebo
vzorku
homogenizované
chlopně
s lysozymem,
lysostaphinem nebo lytikázou rozrušujícími buněčnou stěnu bakterií (Grijalva a kol., 2003).
Koncentrace
extrahované
bakteriální
DNA
byla
měřena
pomocí
spektrofotometru Nanodrop (NanoDrop Technologies, USA).
3.4. KONVENČNÍ ŠIROKOSPEKTRÁ 16S rRNA PCR 3.4.1. Kultivačně nezávislá širokospektrá bakteriální detekce Konvenční PCR s cílovým místem v konzervativní V8-9 oblasti genu 16S rRNA byla
pouţita
pro
univerzální
bakteriální
detekci
ze
42
chlopní
pacientů
s diagnostikovanou IE. Amplifikace 372 párů bází dlouhé oblasti byla provedena
21
pomocí oligonukleotidů (primerů) UNB1 (5´- AAC TGG AGG AAG GTG GGG AT 3´) a UNB2 (5´- TGC GGT TGG ATC ACC TCC T - 3´). Vlastní bakteriální identifikace byla následně provedena pomocí sekvenční analýzy amplifikované oblasti genu 16S rRNA a porovnáním získané sekvence s veřejnou databází sekvencí (dále popsáno kapitole 3.6, 3.7).
3.4.2. Kultivačně závislá identifikace mykobakteriálních izolátů Všechny mykobakteriální izoláty (272) byly nejprve analyzovány konvenční PCR umoţňující identifikaci rodu Mycobacterium a rozlišující mezi zástupci komplexu M. avium, která byla popsaná jiţ dříve (Moravkova a kol., 2008). Mykobakteriální izoláty byly identifikovány pomocí konvenční 16S rRNA PCR s následnou sekvenční analýzou podle dříve popsané metody (Harmsen a kol., 2003). PCR produkt připravený pomocí primerů 16S27f (5´- AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG - 3´) a 16S907r (5´CCG TCA ATT CMT TTR AGT TT - 3´) specifických pro mykobakterie měl velikost 921 párů bází.
3.5. 16S rRNA REAL TIME PCR S NÁSLEDNOU HRMA 3.5.1. Zavedení 16S rRNA real time PCR s následnou HRMA Pro zavedení a validaci 16S rRNA real time PCR (qPCR) s následnou HRMA (dále jen 16S rRNA HRMA) byly pouţity bakteriální kmeny uvedené v kapitole 3.1. PCR reakce o celkovém objemu 30 l obsahovala reakční pufr; 1,5 U AmpliTaq Gold polymerázy (Applied Biosystems, Anglie); 15 pmol od kaţdého primeru (UNB1 a UNB2), 2 mM MgCl2, 10 mM dNTP, 1x EvaGreenTM assay (Biotium, USA) a 5 ng bakteriální genomové DNA. 16S rRNA HRMA byla provedena v real-time cykleru RotorGene 6000 (Corbet Research, Austrálie) v jedné reakční směsi. PCR reakce byla provedena podle následujícího profilu: počáteční aktivace polymerázy (95 °C/12 min); 45 cyklů zahrnujících denaturaci (95 °C/10 s), annealing (60 °C/15 s) a elongaci (72 °C/20 s). Profil teplotního tání byl měřen po počáteční inkubaci 70 °C/1 min v teplotních intervalech po 0,1 °C/2 s do 93 °C. Fluorescence barvičky EvaGreenTM byla detekována v kanálu pro barvičku FAM (465-510 nm). 16S rRNA HRMA profil byl vizualizován a vyhodnocen pomocí programu Rotor Gene analysis software verze 6 (Corbet Research). Všechny reakce byly provedeny v triplikátu.
22
3.5.2. Heteroduplexní analýza Moţnost zvýšit rozlišovací schopnost 16S rRNA HRMA profilů byla testována pomocí analýzy tvorby heteroduplexu. Pro naše účely byla připravena ekvimolární směs DNA testovaného vzorku DNA referenční, fylogeneticky nepříbuzné, bakterie (Escherichia coli, Streptococcus pneumoniae a Pseudomonas aeruginosa), která byla následně analyzována pomocí 16S rRNA HRMA. Kritériem pro výběr referenčního bakteriálního vzorku vhodného pro heteroduplexní analýzu byla teplota tání (Tm) jeho PCR produktu lišící se více neţ o 1°C od PCR produktů referenčních kmenů patřících do rodu Staphylococcus.
3.5.3. Analytický limit detekce 16S rRNA HRMA PCR produkt genu 16S rRNA (Staphylococcus aureus) získaný dle metody popsané v kapitole 3.4.1. byl klonován do plazmidového vektoru pCR2.1 za pouţití TOPO TA klonovacího kitu (Invitrogen, Německo). Takto připravený plazmidový konstrukt byl poté transformován do buněk E. coli TOP10F. Limit detekce pro zavedenou 16S rRNA HRMA byl testován s připraveným plazmidovým konstruktem pCR2.1_Sau-UNB lineárně ředěným v elučním pufru v rozmezí od 5 × 105 do 5 × 100 kopií na reakci. Všechny vzorky byly nasazeny v pěti nezávislých opakováních v triplikátu.
3.5.4. Klinická citlivost 16S rRNA HRMA Zjištění limitního mnoţství bakteriálních buněk detekovatelných v klinickém materiálu pomocí 16S rRNA HRMA bylo provedeno s plnou krví a fyziologickým roztokem, které byly uměle kontaminovány lineárně ředěnou kulturou Staphylococcus aureus v rozmezí od 106 do 103 CFU. Pouţitá bakteriální kultura byla kvantifikována dle křivek McFarlanda (McFarland, 1907). Izolace bakteriální DNA z uměle kontaminované krve a fyziologického roztoku byla provedena dle kapitoly 3.3 a následně byly vzorky podrobeny analýze pomocí 16S rRNA HRMA. Všechny izolace byly provedeny ve třech opakováních.
23
3.7. SEKVENACE Identita všech nemykobakteriálních druhů byla ověřena standardní sekvenční analýzou 16S rRNA genu v laboratoři Centra kardiovaskulární a transplantační chirurgie Brno. NTM izoláty byly podrobeny sekvenční analýze na Oddělení bezpečnosti potravin a krmiv, VÚVeL, Brno. Na identifikaci 50 ng přečištěného PCR produktu získaného z testovaných bakteriálních kmenů nebo klinických vzorků byl pouţit BigDye Terminator v1.1 cycle sequencing kit (Applied Biosystems). Sekvenační PCR byla v závislosti na pouţitém detekčním systému (viz kapitola 3.4.) provedena pomocí primerů 16S27f/ 16S907r nebo UNB1/ UNB2 dle návodu výrobce. Sekvenční produkt byl přečištěn pomocí etanolové precipitace, rozpuštěn v 10 μl HiDi-Formamidu a analyzován na genetickém analyzátoru ABI Prism 3100 (Applied Biosystems).
3.7. POČÍTAČOVÁ ANALÝZA SEKVENCÍ Částečné sekvence genu 16S rRNA získané sekvenční analýzou popsanou v kapitole
3.5. byly
(workbench.sdsc.edu/)
vzájemně nebo
srovnány
byly
pomocí
srovnány
algoritmu
s dostupnými
clustalW databázemi
(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/; rdna2.ridom.de/) za pouţití algoritmu blastn. Hranice 99 % sekvenční shody experimentální sekvence 16S rRNA s referenčními sekvencemi v databázích byla stanovena jako kritérium pro identifikaci detekovaného bakteriálního genomu.
24
4. Výsledky 4.1. SPEKTRUM BAKTERIÁLNÍCH PATOGENŮ U PACIENTŮ S DIAGNOATIKOVANOU INFEKČNÍ ENDOKARDITIDOU V letech 2003 aţ 2005 bylo vyšetřeno spektrum bakteriálních patogenů způsobujících IE u pacientů hospitalizovaných v CKTCH. Celkem bylo vyšetřeno 42 chlopní pocházejících od pacientů, kterým byla provedena náhrada srdeční chlopně v důsledku diagnostikované IE (Tabulka 4).
Tabulka 4. Bakteriální spektrum u případu s IE v letech 2003 aţ 2005 Detekovaný bakteriální patogena Abiotrophia elegans Actinobacillus actinomycetemcomitans Aerococcus urinae Bartonella sp. Corynebacterium diptheriae Enterococcus faecalis Gemella sp. Propionibacterium acnes Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus sp. S. aureus S. epidermidis Streptococcus sp.b -hemolytická skupina S. pyogenes, S. agalactiae Nehemolytická skupina S. suis S. bovis, S. macedonicus Viridující skupina S. anginosus, S. mitis Celkem a b
Počet případů 1 2 1 1 1 1 1 1 1 13 3
3 1 4 8 42
Identifikace provedena pomocí 16S rRNA sekvenční analýzy Klasifikace Streptococcus sp. byla prodedena dle publikace Facklam, 2002.
Identifikace byla zaloţena na sekvenční analýze pomocí veřejně dostupných databázi. Největší podíl na IE případech mají zástupci dvou rodů: Staphylococcus (38,1 %) a Streptococcus (38,1 %). Jako nejčastější původce IE byl identifikován
25
S. aureus (31,0 %). Zbytek případů byl způsoben méně častými bakteriemi, jako jsou Abiotrophia elegans,
Actinobacillus actinomycetemcomitans,
Bartonella sp.
nebo
Corynebacterium diptheriae. Za zmínku také stoji identifikace Aerococcus urinae, který byl popsán jako velmi vzácný patogen způsobující IE (Slany a kol., 2007; viz Příloha A).
4.2. KONVENČNÍ ŠIROKOSPETRÁ 16S rRNA PCR A IDENTIFIKACE MYKOBAKTERIÁLNÍCH IZOLÁTŮ Druhá část předkládané studie se zaměřila na kultivačně závislou identifikaci NTM izolátů pomocí sekvenční analýzy genu 16S rRNA.
Lidské izoláty Analýza souboru 26 klinických izolátů odhalila 11 rozdílných NTM druhů (Tabulka 5, viz Příloha B). Nejčastější lidským izolátem bylo M. xenopi (38.5%). Zajímavý byl záchyt vzácně popisovaného původce mykobakterióz u lidí M. arupense (Tabulka 6, viz příloha B). Zvířecí izoláty V souboru 64 zvířecích izolátů bylo detekováno 17 rozdílných NTM (Tabulka 5). Nejčastějšími zvířecími izoláty byly: M. marinum (14.3%) a M. chelonae (14.3%). Výskyt NTM byl pozorován hlavně u prasat: M. chelonae, M. xenopi, M. kansasii, M. nonchromogenicum;
u ryb
M. insubricum,
M. marinum,
M. fortuitum,
M. peregrinum/septicum, M. szulgai, M. nonchromogenicum a u myší M. arupense, M. triviale, M. fortuitum, M. terrae a M. nonchromogenicum. Za zmínku stojí první izolace M. insubricum ze zvířete (Slany a kol., 2010b, viz Příloha C), který byl teprve nedávno popsán jako kauzální patogen u člověka spojený s infekcí dýchacích cest (Tortoli a kol., 2009). Izoláty z prostředí Soubor 182 izolátů z vody, půdy, prachu, biofilmů a organických zbytků byl zastoupen spektrem 24 rozdílných NTM (Tabulka 5). Nejčastější izoláty byly M. peregrinum/septicum (17.6%), M. gordonae (15.4%), M. chelonae (9.9%) and M. fortuitum (8.2%).
26
Tabulka 5. Identifikace 272 netuberkulózních mykobakterií (viz Slany a kol., 2010a) Druh
M. abscessus M. alvei M. arupense M. bohemicum M. celatum M. chelonae M. chitae M. confluentis M. engbaekii M. fortuitum M. gastri M. gordonae M. hiberniae M. insubricum M. interjectum M. intaracellulare M. kansasii M. kumamotonense M. malmoense M. marinum M. mucogenicum M. nebraskense M. neoaurum M. nonchromogenicum M. paraffinicum M. peregrinum/septicumd M. porcinum M. simie M. szulgai M. terrae M. triviale M. vaccae M. xenopi M. sp.e Celkem
Počet izolátů
Člověka
1 1 10 1 1 33 4 1 3 23 1 30 1 1 4 11 8 4 1 13 1 1 1 13 1 34 2 1 3 10 5 1 15 40 272
0 0 3 1 0 2 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 2 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 3 1 0 10 0 26
Původ izolátů Zvířeb 1 (plaz) 1 (pták) 2 (myš) 0 0 1 (skot); 9 (prase) 0 1 (medvěd) 0 2 (pták); 1 (myš); 5 (ryba) 0 1 (plţ) 0 1 (ryba) 0 0 1 (prase); 1 (plţ) 0 0 9 (ryba) 0 0 0 1 (myš); 2 (prase); 1(ryba) 1 (plţ) 2 (ryba) 0 0 1 (ryba) 1 (myš); 1 (plaz) 2 (myš) 0 4 (prase) 12 64
Prostředíc 0 0 5 0 1 18 3 0 3 15 1 28 1 0 4 11 3 4 0 0 1 1 0 9 0 32 2 1 2 5 2 1 1 28 182
a
Klinické izoláty získané ze sputa nebo koţní biopsie. Tkáně a trus jsou zahrnuty do zvířecích vzorků. c Voda, půda, prach, biofilm a organické zbytky jsou zahrnuty do vzorků prostředí. d Identické sekvence v analyzované oblasti genu 16S rRNA. e Izoláty identifikované pouze na úroveň rodu. Sekvenční data jsou pod úrovní definovaných kriterií. b
27
Tabulka 6. Identifikace Mycobacterium arupense v izolátech získaných ve třech klinických, dvou zvířecích a pěti environmentálních vzorcích (viz Slany a kol., 2010a)
Původ vzorků Hostitel nebo Zdroj (rok) místo Lidské sputum
Důvod kultivačního vyšetření (anamnestická data)
55/ţb (2008)
1
Abnormální rentgenový nález na plicích a bronchitida (otevřená pulmonální tuberkulóza v dětství)
66/mb (2008)
1
Abnormální rentgenový nález na plicích a pneumonie
77/ţb (2008, 2009)
1
Blízký kontakt s pacientem s otevřenou pulmonální tuberkulózou
1
Odchyt na farmě s prokázaným výskytem paratuberkulózy
Venkovní pole (2004)
1
Venkovní odchyt v dostatečné vzdálenosti od infikované farmy
Hlína z ohrady pro antilopu bongod (2007)
1
Ekologická studie v ZOO s případem plicní tuberkulózou antilopy bongod způsobenou M. a. hominissuis
Vzorek moči a vzorek hlíny z ohrady pro okapie (2007)
2
Okapid umístěné ve výběhu vedle infikované antilopy bongod
Zbytky krmení pro psa v ledničce (2007)
1
Pracovní pokoj školníka s otevřenou pulmonální tuberkulózou
Výstelka hnízda Orla mořskéhof (2007)
1
Ekologická studie přítomnosti mykobakterií přenášených sladkovodními rybami
Hrabošc (játra) Farma skotu (2004)
Prostředí
Počet Izolátůa
a
Všechny izoláty byly identifikovány po zváţení jejich biochemických vlastností, morfologie a dat získaných ze sekvenční analýzy genu 16S rRNA. b Věk/pohlaví: ţ (ţena), m (muţ) c Microtus arvalis d Tragelaphus eurycerus e Okapia johnstoni f Haliaeetus albicilla
28
4.3. 16S rRNA HRMA Technická omezení sekvenční analýzy pouţívané pro identifikaci bakterií nás vedla k hledání metody, která by mohla přinést dodatečné informace pouţitelné pro detekci a rozlišení bakterií. Jako moţná alternativa byla testována 16S rRNA HRMA.
4.3.1. Detekční limit 16S rRNA HRMA Limit detekce 16S rRNA qPCR pro zavedenou 16S rRNA HRMA byl testován s plazmidovým konstruktem pCR2.1_Sau lineárně ředěném v elučním pufru v rozmezí 5 × 105 aţ 5 × 100 kopií/ reakce (Tabulka 7, viz Příloha D). Reprodukovatelnost metody byla testována pomocí opakovaného měření vzorku v triplikátech. Limit detekce pro 16S rRNA qPCR byl experimentálně stanoven na 5 × 101 kopií plazmidu na reakci (Tabulka 7, Obrázek 3A). Účinnost amplifikace 16S rRNA qPCR byla vypočítána na 97,95 %. Hodnota udávající počet cyklů, kdy je pozorovatelný nárůst fluorescence nad úroveň pozadí (Ct; 34,81 ± 0,42) pro negativní kontrolu (NK) se pohybovala blízko detekčního limitu 16S rRNA qPCR. Tento dřívější nárůst fluorescence k celkovému fluorescenčnímu signálu pro NK můţe být vysvětlen příspěvkem PCR produktů, (vzniklých z primer-dimerů nebo kontaminující bakteriální DNA), neboť EvaGreenTM se váţe na celkovou dsDNA. Hraničně pozitivní vzorky mohou být ovšem odlišeny od NK pomocí analýzy teplotního tání (Obrázek 3B). S ohledem na experimentální data bylo stanoveno 5 × 102 kopií plazmidu na reakci jako hraniční hodnota pro správnou 16S rRNA HRMA detekci (Tabulka 7), neboť pod touto hodnotou dochází jiţ k deformaci křivek (Obrázek 3C).
29
Obrázek 3. 16S rRNA HRMA analýza lineárního ředění plazmidového konstruktu pCR2.1_Sau-UNB v rozmezí 5 × 105 (1) aţ 5 × 100 (6) kopií na reakci (viz Příloha D). Graf závislosti první derivace fluorescence na počtu cyklů (A). Závislost první derivace fluorescence (B) nebo normalizované fluorescence na teplotě (C).
30
Tabulka 7. Analytická citlivost 16S rRNA qPCR a 16S rRNA HRMA (viz Příloha D) Číslo vzorku
Standard *
Ct (cykly) #
Tm (°C) #
(kopie/reakci) 1
5 × 105
20,10 ± 0,34
87,45 ± 0,10
2
5 × 104
23,84 ± 0,24
87,53 ± 0,06
3
5 × 103
27,81 ± 0,24
87,48 ± 0,12
4
5 × 102
31,07 ± 0,40
87,60 ± 0,16
5
5 × 101
34,01 ± 0,26
87,59 ± 0,17
6
0
5 × 10
35,38 ± 0,46
ND
NK
0
34,81 ± 0,42
ND
NK – Negativní kontrola; ND – Nedetekováno; * - Plazmid pCR2.1 obsahující analyzovanou V8-9 oblast genu 16S rRNA; # - Průměrné hodnoty a standardní odchylka experimentálně získané pro počet cyklů (Ct), kdy je pozorovatelný nárůst fluorescence nad úroveň pozadí a teploty tání (Tm) PCR produktu. Hodnoty nebyly vypočítány pouze z triplikátu měřeném v jednom experimentu ale z pěti nezávisle provedených opakování
4.3.2. Test klinické citlivosti 16S rRNA HRMA Izolace DNA společně s 16S rRNA HRMA byly pouţity pro zjištění citlivosti detekce pro simulované klinické nastavení. Byla provedena analýza DNA izolované z krve nebo fyziologického roztoku, které byly uměle kontaminovány definovaným mnoţstvím buněk S. aureus v rozsahu 106 aţ 103 CFU. Vyvinutý systém byl schopen detekovat 104 CFU S. aureus v ml krve nebo fyziologického roztoku (Tabulka 8, příloha D). Data získaná z 16S rRNA HRMA pro uměle kontaminovanou krev vykazovala mírně vyšší hodnotu Ct v porovnání s fyziologickým roztokem. Krev je daleko komplexnější médium neţ fyziologický roztok a proto můţe během izolace bakteriální DNA z krve dojít k purifikaci moţných efektorů PCR. Při analýze krve je nutno počítat s interferencí lidské genomové DNA. Tato skutečnost pravděpodobně ovlivnila Ct hodnotu u izolační kontroly (IK) v porovnání s Ct hodnotou pro NK.
31
Tabulka 8. Testování klinické citlivosti 16S rRNA HRMA na uměle kontaminovaném materiálu s barvičkou EvaGreenTM (viz Příloha D)
Staphylococcus
Kontaminovaný
aureus
materiál
Ct (cykly) #
Tm (°C) #
(CFU/ml) 106
Krev
25,73 ± 0,74
87,54 ± 0,19
105
Krev
28,20 ± 0,70
87,57 ± 0,09
10
4
Krev
32,34 ± 0,27
87,53 ± 0,15
103
Krev
36,83 ± 0,50
ND
106
Fyziologický roztok
25,38 ± 0,50
87,90 ± 0,33
105
Fyziologický roztok
27,89 ± 0,40
87,92 ± 0,19
10
4
Fyziologický roztok
31,11 ± 0,22
87,97 ± 0,28
103
Fyziologický roztok
34,90 ± 0,94
ND
IK
-
37,25 ± 0,43
ND
NK
-
34,81 ± 0,42
ND
IK – Kontrola kontaminace během izolační procedury; NK – Negativní kontrola; ND –Nedetekováno; # - Průměrné hodnoty a standardní odchylka experimentálně získané pro počet cyklů (C t), kdy je pozorovatelný nárůst fluorescence nad úroveň pozadí a teploty tání (Tm) PCR produktu. Hodnoty nebyly vypočítány pouze z triplikátu ale ze dvou nezávisle provedených opakování experimentu.
4.3.3. Analýza klinických izolátů Spektrum různých bakteriálních izolátů z klinických vzorků bylo podrobeno 16S rRNA HRMA (Tabulka 9, Obrázek 4). Získané HRMA profily dokumentují, ţe metoda má dostatečnou rozlišovací schopnost pro námi vybrané bakteriální zástupce. Analýza klinických izolátů zástupců rodu Staphylococcus odhalila u S. epidermidis, S. haemolyticus a S. capitis dvě teplotní maxima (Tm1 a Tm2) během analýzy tání PCR produktu. Porovnáním hodnot Tm získaných pro různé bakteriální druhy (Tabulka 9) byly vytipováni kandidáti vhodní pro heteroduplexní analýzu sbírkových kultur rodu
32
Staphylococcus jako referenční bakterie. Byly vybrány fylogeneticky nepříbuzné bakterie Escherichia coli, Streptococcus pneumoniae a Pseudomonas aeroguinosa, které vykazovaly rozdíl v Tm větší neţ 1°C.
Obrázek 4. Srovnání 16S rRNA HRMA profilů u různých bakteriálních druhů: Staphylococcus aureus (1), Haemophylus influenzae (2), Escherichia coli (3), Streptococcus agalactiae (4), Pseudomonas aeruginosa (5), Streptococcus pneumoniae (6), Enterococcus faecalis (7). Graf závislosti normalizované fluorescence (A) nebo první derivace fluorescence (B) na teplotě.
33
Tabulka 9. 16S rRNA HRMA analýza vybraných klinických izolátů Tm1 (°C) #
Tm2 (°C) #
Enterobacter cloacae
88,77 ± 0,03
ND
Enterococcus faecalis
88.49 ± 0.13
89.70 ± 0.14
Escherichia coli
88,88 ± 0,04
ND
Haemophylus influenzae
88,10 ± 0,09
ND
Pseudomonas aeruginosa
89,26 ± 0,09
ND
Staphylococcus aureus
87,80 ± 0,12
ND
S. capitis
87,05 ± 0,06
88,02 ± 0,04
S. epidermidis
87,01 ± 0,26
87,94 ± 0,13
S. haemolyticus
87,29 ± 0,09
88,01 ± 0,06
S. hominis
87,82 ± 0,09
ND
S. saprophyticus
87,35 ± 0,17
ND
Streptococcus agalactiae
88,97 ± 0,27
ND
Streptococcus pneumonie
89,56 ± 0,06
ND
Klinické izoláty
ND – Nedetekováno; # - Průměrné hodnoty a standardní odchylka experimentálně získané pro teploty tání (T m1 a Tm2) PCR produktu. Hodnoty nebyly vypočítány pouze z triplikátu ale ze tří nezávisle provedených opakování experimentu.
4.3.4. Referenční kmeny rodu Staphylococcus 4.3.4.1. Sekvenční analýza Sekvenční analýza potvrdila uniformitu námi vybraných referenčních kmenů rodu Staphylococcus. Srovnání částečných sekvencí genu 16S rRNA pomocí algoritmu clustalW
odhalilo
přítomnost
délkového
polymorfizmu
v testované
skupině
(Obrázek 5). Další pozorovanou variabilitou byla přítomnost jedno-nukleotidových polymorfizmů (SNP) u S. epidermidis (C/T), S. capitis (G/A) a S. haemolyticus (C/T).
34
Obrázek 5. ClustalW srovnání amplikonů 16S rRNA genu u vybraných zástupců rodu Staphylococcus. Nukleotidové polymorfizmy označené písmenem X (čtverec) byly zjištěny pomocí sekvenční analýzy u S. epidermidis (C/T), S. capitis (G/A) a S. haemolyticus (C/T). Pomocí obdélníku je zvýrazněna oblast pro délkový polymorfizmus u testované skupiny (viz Příloha D)
Významné rozdíly v nukleotidovém sloţení studované oblasti byly pozorovány u S. caprae, S. sciuri a S. simulans (přítomnost více neţ tří unikátních nukleotidů). Primární struktura genu 16 rRNA u S. xylosus a S. saprophyticus byla identická, coţ vedlo k předpokladu, ţe tyto dva zástupce nebude moţno vzájemně rozlišit. Celkově lze říci, ţe oblast 16S rRNA genu vybraná pro analýzu je vhodná pro testování HRMA, neboť vykazuje dostatečnou variabilitu v primární sekvenci DNA.
35
4.3.4.2. 16S rRNA HRMA a heteroduplexní analýza 16S rRNA HRMA Bakteriální lyzáty získané z referenčních kmenů byly analyzovány pomocí 16S rRNA HRMA (Tabulka 10). Dle hodnot Tm a HRMA profilů bylo moţno odlišit přímo pouze S. caprae a S. simulans (Tabulka 10, Obrázek 6A). Tato skutečnost odpovídá předchozímu předpokladu zaloţenému na výsledcích sekvenční analýzy. Zbývající zástupci byli zařazeni do 3 skupin podle hodnot Tm a HRMA profilů (Tabulka 10,
Obrázek 6).
Skupina
A
zahrnující
S. capitis,
S. epidermidis,
S. haemolyticus a S. sciuri vykazovala dvě teplotní maxima (Tm1 a Tm2) během analýzy tání PCR produktu (Tabulka 10, Obrázek 6B). Zbytek zástupců rodu Staphylococcus, charakterizovaných pouze jedním teplotním maximem (Tm1), byl klasifikován do dalších dvou skupin: B) S. saprophyticus, S. warneri, S. xylosus a C) S. aureus, S. hominis, S. intermedius (Tabulka 10, Obrázek 6A).
Tabulka 10. 16S rRNA HRMA analýza vybraných referenčních kmenů rodu Staphylococcus (viz Příloha D)
Skupina
Tm1 (°C) #
Tm2 (°C) #
A
86,98 ± 0,04
87,91 ± 0,04
S. epidermidis
86,99 ± 0,24
87,85 ± 0,18
S. haemolyticus
87,20 ± 0,13
87,90 ± 0,05
S. sciuri
86,83 ± 0,05
87,57 ± 0,03
87,30 ± 0,12
ND
S. warneri
87,36 ± 0,05
ND
S. xylosus
87,32 ± 0,16
ND
87,68 ± 0,20
ND
S. hominis
87,77 ± 0,07
ND
S. intermedius
87,61 ± 0,07
ND
S. simulans
87,88 ± 0,04
ND
S. caprae
88,18 ± 0,06
ND
Referenční kmeny S. capitis
S. saprophyticus
S. aureus
B
C
ND - Nedetekováno; # - Průměrné hodnoty a standardní odchylka experimentálně získané pro teploty tání (T m1 a Tm2) PCR produktu. Hodnoty nebyly vypočítány pouze z triplikátu ale ze všech provedených opakování experimentu.
36
Obrázek 6. Klasifikace skupiny staphylococcus (viz Příloha D). Grafy závislosti normalizované fluorescence (A) nebo první derivace fluorescence (B) na teplotě. Pouze S. caprae a S. simulans mohou být přímo rozlišeny pomocí HRMA profilu (A). Zbytek byl rozdělen do dvou skupin s jedním teplotním maximem (A) a jedné skupiny reprezentované dvěma teplotními maximy (B).
Heteroduplexní analýza Moţnost dále rozlišit jednotlivé zástupce ve skupinách stanovených dle HRMA profilů (A: S. saprophyticus, S. warneri, S. xylosus; B: S. aureus, S. hominis, S. intermedius; C: S. capitis, S. epidermidis, S. haemolyticus a S. sciuri) byla testována pomocí heteroduplexní analýzy s referenčními bakteriálními kmeny: Escherichia coli (Tabulka 11, Obrázek 7, příloha D), Streptococcus pneumoniae (Tabulka 12) a Pseudomonas aeruginosa (Tabulka 12). Výsledky ukázaly, ţe 16S rRNA HRMA rozšířená o analýzu tvorby heteroduplexů má vyšší rozlišovací schopnost a je schopna 37
dále rozlišit testované zástupce rodu Staphylococcus. Pouţitý přístup nebyl schopen rozlišit pouze S. xylosus a S. saprophyticus, coţ je pochopitelné z důvodu identických sekvencí v analyzované oblasti genu 16S rRNA. Souhrnný postup pouţitý pro rozlišení jednotlivých zástupců v testované skupině je znázorněn na Obrázku 10. Bakteriální izoláty byly v prvním kroku analyzovány 16S rRNA HRMA. Podrobnějšího rozdělení bylo docíleno ve druhém kroku analýzou tvorby heteroduplexů připravených z ekvimolární směsi DNA testované bakteriální kultury a referenční
DNA fylogeneticky nepříbuzného bakteriálního kmene
(Escherichia coli, Streptococcus pneumoniae a Pseudomonas aeruginosa).
Tabulka 11. Analýza vybraných zástupců rodu Staphylococcus pomocí heteroduplexní analýzy s fylogeneticky nepříbuzným referenčním kmenem Escherichia coli (viz Příloha D). Referenční kmen Analyzované kmeny
E. coli Tm1 (°C)
#
Tm2 (°C) #
Tm3 (°C) #
S. capitis
87,03 ± 0,16
87,85 ± 0,21
88,55 ± 0,12
S. epidermidis
86,75 ± 0,13
87,88 ± 0,08
88,50 ± 0,19
S. haemolyticus
88,58 ± 0,11
ND
ND
S. sciuri
87,58 ± 0,11
88,52 ± 0,17
ND
S. saprophyticus
87,20 ± 0,13
87,50 ± 0,11
88,70 ± 0,08
S. warneri
87,52 ± 0,09
88,55 ± 0,18
ND
S. xylosus
87,10 ± 0,16
87,52 ± 0,21
88,72 ± 0,07
S. aureus
87,65 ± 0,16
88,68 ± 0,15
ND
S. hominis
87,82 ± 0,19
88,70 ± 0,17
ND
S. intermedius
87,78 ± 0,13
ND
ND
S. simulans
88,45 ± 0,09
ND
ND
S. caprae
88,22 ± 0,15
ND
ND
ND – Nedetekováno; # - Průměrné hodnoty a standardní odchylka experimentálně získané pro teploty tání (T m1, Tm2 a Tm3) PCR produktu. Hodnoty nebyly vypočítány pouze z triplikátu ale ze všech provedených opakování experimentu.
38
Obrázek 7. 16S rRNA HRMA profily získané z analýzy tvorby heteroduplexů mezi PCR produkty z DNA testovaných bakteriálních kmenů a Escherichia coli (viz Příloha D). Grafy závislosti normalizované fluorescence (A, C, E) nebo první derivace fluorescence (B, D, F) na teplotě, které představují samostatnou analýzu ve třech klasifikovaných skupinách: S. saprophyticus, S. xylosus a S. warneri (A, B); S. aureus, S. hominis a S. intermedius (C, D); a S. capitis, S. epidermidis, S. haemolyticus a S. sciuri (E, F).
39
40
Obrázek 10. Souhrnný postup rozlišení vybraných zástupců rodu Staphylococcus.
41
5. Diskuse 5.1. MOLEKULÁRNÍ DETEKCE GENU 16S rRNA Konvenční širokospektrá bakteriální detekce genu 16S rRNA je rutinně vyuţívaná jako doplňková metoda ke kultivačním technikám (Woo a kol., 2008). Rychlá a přesná molekulární identifikace původce bakteriálního onemocnění je důleţitá pro cílenou terapii, zvláště u infekcí způsobených vzácným nebo nekultivovatelným bakteriálním druhem.
5.1.1. Přístupy pouţívané při detekci a identifikaci 16S rRNA z biologických materiálů Obecně jsou pouţívána dvě schémata pro širokospektrou bakteriální detekci a identifikaci: První schéma, zaloţené na kultivačně nezávislé širokospektré detekci bakterií s vyuţitím sekvenční analýzy přímo v klinickém materiálu, je dokumentováno v kapitole 4.1. Výhodou tohoto přístupu je moţnost detekce bakterií v některých případech, kdy kultivace byla negativní (Slany a kol., 2007). Nevýhodou pouţití konvenční širokospektré 16S rRNA PCR pro detekci bakterií je její menší citlivost oproti kultivaci nebo specifické qPCR (Peters a kol., 2004; Reier-Nilsen a kol., 2009), coţ jí činí limitující pro detekci bakterií v klinickém materiálu s nízkým obsahem bakteriálního patogenu (např. krev). Při cíleném vyhledávání bakterií lze pouţít specifické PCR systémy zaloţené na detekci unikátních sekvencí charakteristických pro určitý bakteriální druh (Slana a kol., 2008), které jsou citlivější neţ kultivační techniky. Druhé schéma, vyuţívající izolace bakterií pomocí kultivačních technik a její následnou identifikaci pomocí sekvenční analýzy genu 16S rRNA, je dokumentováno v kapitole 4.2. Tento postup je výhodný v případě bakterií, u kterých je identifikace zaloţená na mikroskopických a biochemických charakteristikách náročná a zdlouhavá. Toto schéma je vhodné pouţít pro identifikaci bakterií při směsné infekci, kdy se nejprve
provede
subkultivace
morfologicky
odlišných
bakteriálních
kolonií
pocházejících z primární kultury a aţ poté je aplikována sekvenční analýza (Slany a kol., 2010c). Další výhodou je moţnost zpětné identifikace izolátů pomocí sekvenční analýzy genu 16S rRNA u izolátů získaných před charakterizací daného bakteriálního druhu (Springer a kol., 1996). Nevýhodou tohoto přístupu je jeho časová náročnost
42
v důsledku nutnosti provést bakteriální kultivaci. Jeho pouţití je moţné pouze v případě úspěšné kultivace.
5.1.2. Omezení sekvenční analýzy Pouţití sekvenční analýzy pro identifikaci bakterií má několik technických omezení, které je nutno zmínit. První komplikace můţe nastat v případě analýzy směsného vzorku z pacienta infikovaného více neţ jedním typem bakterie (Anand a kol., 2000). Směsný vzorek můţe být také vytvořen vnesením kontaminující DNA z bakteriálního genomu během izolace. Tato skutečnost lze ovšem vyřešit úpravou izolačního postupu. S ohledem na všudypřítomný výskyt bakterií je pochopitelné, ţe byl zaznamenán výskyt směsných vzorků. Přímá sekvenace je v takovém případě většinou neúspěšná a informace o přítomných sekvencích ve vzorku musí být poté získány nepřímo. Jednou z moţností je vytvoření knihovny 16S rRNA klonů (Heijs a kol., 2007). Souběţná PCR amplifikace směsi 16S rRNA genů pocházejících ze dvou nebo více bakteriálních genomů vede ke tvorbě heteroduplexních forem DNA, coţ v konečném důsledku vede k selhání sekvenace. Taková směs PCR produktů musí být, před vlastní sekvenací, nejprve rozdělena pomocí dodatečných separačních technik, jako jsou denaturační gradientova gelová elektroforéza nebo vysokotlaká kapalinová chromatografie (Muyzer a kol., 1993; Wolford a kol., 2000; Schabereiter-Gurtner a kol., 2001). Druhé omezení je spojeno s počítačovou analýzou sekvencí, která je vyuţívána pro klasifikaci detekované bakterie. Analýza sekvenčních dat zůstává stále uţitečným nástrojem pro ustanovení definitivní klasifikace bakteriálních druhů. Správné interpretaci
dat
často
brání
nedostatky
sekvencí
ve veřejných
databázích
(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/; rdna2.ridom.de/), které mohou obsahovat chybné, neúplné nebo špatně charakterizované sekvence. Přesná identifikace původce bakteriálního onemocnění pomocí sekvenční analýzy se často nepodaří v důsledku sekvenční homologie uvnitř bakteriálního rodu (např. skupina viridujících Streptokoků). Bakteriální klasifikace zaloţená na typizaci ribozomálních genů je povaţována za zlatý standard, ale stále nejsou sjednocena kritéria pro rozlišení zástupců uvnitř stejného bakteriálního rodu dle úrovně shodnosti sekvencí 16S rRNA. Drancourt a kol. (2000) navrhli hranici pro sekvenční podobnost 99 – 100 % v rámci stejného druhu a homologii v rozmezí 97 aţ 99 % pro zástupce stejného rodu. Toto nastavení má ovšem
43
omezení v případě, ţe je moţných více kandidátů, kteří vykazují vzájemnou homologii menší neţ 1 %. (Sreevatsan a kol., 1997). Sekvenční analýza má široké vyuţití při základním i klinickém výzkumu. Pouţití sekvenace vybraných genů pro rozlišení v rámci stejného druhu je pouţíváno nejen u bakterií, ale také plísní nebo virů (Dannaoui a kol., 2010).
5.2. URČENÍ BAKTERIÁLNÍHO SPEKTRA U PACIENTŮ S INFEKČNÍ ENDOKARDITIDOU Molekulární detekce bakterií přímo z biologického materiálu, bez nutnosti provést kultivaci, je dokumentována v první části práce na vyšetření 42 vzorků chlopní pocházejících od pacientů s diagnostikovanou IE. Vzorky zahrnuté ve studii byly nasbírány v letech 2003 aţ 2005 v genetické laboratoři CKTCH v Brně. Analýza odhalila jako nejčastějšího původce IE S. aureus (13 případů, 31 %), coţ je ve shodě s publikovanými údaji. Pro tohoto mikroba je uváděna úmrtnost na IE 40-50% (Heiro a kol., 2006). Za zmínku stoji kultivačně negativní záchyt A. urinae vzácně popisovaného jako původce IE (Slany a kol., 2007). Identifikace A. urinae pomocí sekvenční analýzy genu 16S rRNA byla v tomto případě jedinou efektivní metodou, neboť mikrobiologická detekce byla neúspěšná. A. urinae je popisován jako častý původce mírného zánětu močo-pohlavních cest (UTI) hlavně u muţů. Do dnešní doby bylo popsáno pouze 19 případů IE způsobených A. urinae (Allegre a kol., 2008; Kass a kol., 2008; Bruegger a kol., 2009; Ho a kol., 2010; de Jong a kol., 2010). Úmrtnost pacientů s IE způsobenou A. urinae je kolem 50 %. Většina případů byli starší muţi s UTI, coţ bylo predispozičním faktorem pro vývoj IE.
5.3. IDENTIFIKACE IZOLÁTŮ NETUBERKULÓZNÍCH MYKOBAKTERIÍ V druhé
části
práce
je
demonstrována
kultivačně
závislá
identifikace
mykobakteriálních izolátů pomocí sekvenční analýzy variabilní oblasti genu 16S rRNA (Slany a kol., 2010a). Růstové charakteristiky a biochemické testy pouţívané pro rozlišení mykobakteriálních izolátů na úroveň druhu jsou v důsledku pomalého mykobakteriálního růstu časově náročné. Morfologie a biochemický profil pouţitý pro identifikaci mykobakterií se můţe lišit v závislosti na růstových podmínkách. Tyto
44
odchylky mohou poté vést k nepřesné charakterizaci izolátu. Vzhledem k tomuto omezení je pro zpřesnění identifikace mykobakterií pouţívána analýza sekvencí 16S rRNA. Studie demonstruje pouţití molekulárně biologických technik zaloţených na analýze sekvencí tohoto genu. Tento přístup přinesl doplňující data k informacím získaným z klasických mikrobiologických technik, coţ umoţnilo přesnější identifikace mykobakterií.
V rámci
studie
nebylo
moţné
přesně
charakterizovat
40
mykobakteriálních izolátů, neboť sekvenční data nesplňovala stanovená kriteria pro přesnou identifikaci na úroveň mykobakteriálního druhu. Data získaná ze sekvenční analýzy souboru mykobakteriálních izolátů (Tabulka 4) nebyla vhodná pro rozlišení M. peregrinum od M. septicum, neboť tyto dva mykobakteriální druhy vykazují 100% sekvenční shodu v genu 16S rRNA. Přesnější mezidruhové rozlišení je v tomto případě moţné pomocí analýzy genu hsp65 (Telenti a kol., 1993) nebo lokusu ITS (Harmsen a kol., 2003). Za zmínku také stojí identifikace M. arupense v izolátech kultivovaných před jeho charakterizací v roce 2006 (Cloud a kol., 2006) a ve sputu 3 pacientů. Zatím bylo popsáno pouze pět případů izolace M. arupense z humánního materiálu (Cloud a kol., 2006; Masaki a kol., 2006; Tsai a kol., 2008; Neonakis a kol., 2010).
5.4. 16S rRNA HRMA Moţností, která by v budoucnu mohla částečně vyřešit omezení spojená se sekvenční analýzou diskutovaná v kapitole 5.1.2., je pouţití 16S rRNA HRMA pro odhalení směsného bakteriálního vzoru v klinickém materiálu, případně doplnění dalších informací k datům ze sekvenční analýzy (Wittwer a kol., 2003). Zavedený systém zaloţený na 16S rRNA HRMA vykazoval reprodukovatelné výsledky. Systém lze pouţít jako klasickou 16S rRNA qPCR s limitem detekce 5 × 101 kopií detekovaného genu na reakci. Detekční limit pro 16S rRNA HRMA je vyšší, neboť metoda vyţaduje nárůst fluorescenčního signálu během PCR nad úroveň pozadí do 31 cyklu, coţ koresponduje s 30 cykly uváděnými v literatuře (Herrmann a kol., 2007). Toto omezení zatím neumoţňuje pouţit 16S rRNA HRMA na klinické vzorky (např. krev, likvor), které obsahují po izolaci DNA méně neţ 5 × 102 kopií genu 16S rRNA ve vzorku pouţitém na jednu qPCR reakci. To odpovídalo podle našich výsledků mnoţství 104 CFU/ml v klinickém materiálu. Teoreticky je moţno citlivost
45
metody zvýšit zařazením preamplifikačního kroku před vlastní PCR reakci (Labrenz a kol., 2004; Ricci a kol., 2007). Ačkoliv stěţejní část práce byla cílena na analýzu sbírkových kultur rodu Staphylococccus, byla provedena 16S rRNA HRMA u spektra různých bakteriálních druhů, neboť bylo nutné vybrat referenční fylogeneticky nepříbuzné bakterie pro heteroduplexní analýzu.
5.4.1. Pouţití 16S rRNA HRMA na vybrané sbírkové kmeny rodu Staphylococcus Databázové srovnání experimentálně zjištěných sekvencí u 12 zástupců rodu Staphylococcus odhalilo variabilitu dostatečnou pro otestování hypotézy, ţe 16S rRNA HRMA můţe být pouţitá pro rozlišení testovaných bakteriálních kmenů. Přímé rozlišení přímo pomocí 16S rRNA HRMA profilů bylo moţné pouze v případě S. caprae a S. simulans. Tito dva zástupci se liší od zbytku skupiny přítomností více neţ tří unikátních nukleotidů tvořících tří-vazebné vodíkové můstky (G, C) v primární struktuře DNA, coţ pravděpodobně přispělo ke zvýšení teploty tání PCR produktu. S. epidermidis, S. haemolyticus, S. sciuri a S. capitis vykazovaly dvě teplotní maxima během analýzy tání PCR produktu. Přítomnost směsného bakteriálního vzorku v referenčních kmenech byla vyloučena posouzením kvality sekvenčních dat. V případě S. capitis, S. epidermidis a S. haemolyticus předpokládáme přítomnost dvou 16S rRNA forem pocházejících z jedné bakteriální buňky. Náš předpoklad vychází se zjištění, ţe tyto dvě teplotní maxima vyskytující se během HRMA jsou spojena s přítomností SNP v analyzované oblasti 16S rRNA (Obrázek 5). Přítomnost SNPs v rrn operonu (gen 16S rRNA) vedla k atypickým vzorům během restrikční analýzy 16S rRNA PCR produktů, jak bylo popsáno jiţ dříve (Alperi a kol., 2008). HRMA profil pro S. sciuri vykazoval také přítomnost dvou teplotních domén během analýzy tání PCR produktu, ačkoliv u S. sciuri nebyla prokázána přítomnost SNP v analyzované oblasti 16S rRNA. Moţným vysvětlením pro tuto skutečnost je dvoustupňový proces tání PCR produktu v důsledku přítomnosti dvou teplotních domén. Přítomnost několika domén během analýzy teplotního tání DNA fragmentů byla také jiţ popsána (Beers a kol., 1967; Rasmussen a kol., 2007). Literární zdroje uvádějí několik důleţitých postřehů o procesu tání DNA molekul: 1) jedná se o kooperativní
46
proces (Poland, 1974); 2) závisí na nukleotidovém sloţení DNA sekvence a specifickém umístění nukleotidů v této sekvenci (Blake a Delcourt, 1998); 3) je podmíněný také vlivem lokálních efektů na DNA molekule (Tostesen a kol., 2003; Zeng a kol., 2003). Můţeme předpokládat, ţe přítomnost a umístění pěti jedinečných nukleotidů v PCR produktu (S. sciuri, Obrázek 5) splnilo poţadavky pro vytvoření dvou domén pro teplotní tání. Dostatečná variabilita analyzovaných sekvencí společně s přítomností délkového polymorfizmu genu 16S rRNA a přítomností SNP v první skupině obohatily rozlišovací schopnost 16S rRNA HRMA systému. Moţnost dále rozlišit jednotlivé zástupce v hypotetických skupinách stanovených dle HRMA profilů byla demonstrována pomocí heteroduplexní analýzy s bakteriálními kmeny E. coli, S. pneumoniae a P. aeruginosa. Výsledky ukázaly, ţe 16S rRNA HRMA rozšířená o tento postup má vyšší rozlišovací schopnost a je schopna dále rozlišit vybrané zástupce rodu Staphylococcus. Pouţitý přístup nebyl schopen rozlišit pouze S. xylosus a S. saprophyticus, coţ je pochopitelné z důvodu identických sekvencí v analyzované oblasti 16S rRNA genu. Srovnáním dat získaných z analýzy referenčních kmenů (Kapitola 4.3.4.) a klinických izolátů (Kapitola 4.3.3.) nebyly pozorovány výrazné rozdíly HRMA u profilů vybraných zástupců rodu Staphylococcus.
5.4.2. Aplikovatelnost 16S rRNA HRMA na klinické vzorky Nevýhodou HRMA je, ţe stále postrádá dostatečný matematický model pro analýzu tvorby heteroduplexu. Budoucí moţnost vyuţít HRMA pro identifikaci různých bakteriálních
druhů
vyţaduje
rozsáhlou
databázi
heteroduplexních
profilů
charakteristických pro různé kombinace bakteriálních směsí, coţ je zatím hlavním limitujícím faktorem pro její pouţití. Metoda má také omezení při testování klinických vzorků, neboť pro heteroduplexní analýzu je nutné připravit směs testované a referenční DNA ve stejném poměru. Pokud daný systém není schopen rozlišit velmi podobné bakteriální druhy, je zde stále moţnost vybrat jiný gen nebo ribozonální oblast vykazující vyšší variabilitu DNA sekvence. HRMA je schopna rozlišit malé rozdíly mezi sekvencemi DNA, coţ ji činí vyuţitelnou jako dodatečný nástroj pro předběţnou selekci bakterií. Podle HRMA profilu v analyzovaném vzorku je moţno určit přítomnost dvou a více bakteriálních druhů, coţ nám umoţní eliminovat někdy zbytečné
47
pouţití sekvenční analýzy. Aplikovatelnost metody na klinické vzorky je v důsledku poţadavků na kvalitu a mnoţství analyzované DNA stále nejasná. V důsledku sekvenční intradruhové variability je metoda vhodná spíše pro potřeby rozlišení kmenů rodu Staphylococcus v epidemiologických studiích, neţ pro identifikaci bakterií.
48
6. Závěr Plnění vytyčených cílu v rámci předkládané práce přineslo poznatky, které jsou shrnuty a popsány dále: 1. Zjistit
nejčastějšího
bakteriálního
původce
IE
u
klinických
vzorků
analyzovaných v letech 2003 aţ 2005 v laboratoři Centra kardiovaskulární a transplantační chirurgie Brno pomocí přímé detekce v biologickém materiálu bez nutnosti provést kultivaci. V této části práce je dokumentována molekulárně biologická detekce bakterií přímo z biologického materiálu, která doplňuje klasicky pouţívané mikrobiologické techniky. Byla úspěšně provedena analýza a identifikace bakteriálních patogenů ze 42 vzorků chlopní získaných v letech 2003 aţ 2005 od pacientů, kteří podstoupili náhradu srdeční chlopně v důsledku IE. Jako nejčastější původce IE ve studovaném souboru pacientů byl identifikován S. aureus, coţ koresponduje s daty uváděnými v literatuře. Pouţití tohoto přístupu pro detekci bakterií má své opodstatnění v klinických laboratořích zvláště v případě negativního výsledků hemokultivací, kdy je nutno rychle identifikovat původce bakteriálního onemocnění za účelem včasné a cílené antibakteriální léčby. Jako příklad lze uvést detekci Aerococcus urinae v případě kultivačně negativní chlopňe s IE. 2. Aplikace konvenční širokospektré 16S rRNA PCR s následnou sekvenční analýzou na identifikaci bakterií v izolátech získaných kultivací z biologických materiálů. Konvenční
širokospektrá
16S rRNA PCR
s následnou
sekvenční
analýzou pouţitá v této práci umoţnila identifikaci bakterií, jejichţ kultivace je zdlouhavá a identifikace klasickými postupy obtíţná a nejednoznačná. Výhodou této identifikace je její rychlost a přesnost v porovnání s klasicky pouţívanou mikroskopickou a biochemickou charakterizací.
49
Pomocí tohoto přístupu byla provedena analýza a identifikace izolátů netuberkulózních mykobakterií. Molekulárně biologická metodika, zaloţená na analýze sekvencí 16S rRNA, přinesla dodatečné informace k datům získaným z klasických mikrobiologických technik a tím umoţnila přesnější identifikaci mykobakteriálních izolátů. 3. Zavedení nové, potenciálně vyuţitelné metody molekulární detekce bakterií, její validace a moţnost aplikace na klinické vzorky. Jako moţný kandidát pro detekci a identifikaci bakterií byla vybrána a validována Vysokorozlišovací analýza teplotního tání PCR produktů (HRMA). Vyvinutý systém vykazoval reprodukovatelné výsledky. Systém lze pouţít jako klasickou real time kvantitativní PCR s limitem detekce 5×101 kopií na reakci. Vyvinutá 16S rRNA HRMA byla úspěšně pouţita na rozlišení vybraných zástupců rodu Staphylococcus. Aplikace HRMA do klinické praxe je zatím omezena detekčním limitem metody
u
klinických
vzorků.
Při
stávajícím
nastavení
je
16S rRNA HRMA vhodná pouze pro analýzu bakteriálních kultur a silně pozitivních vzorku (chlopeň s IE, punktát), neboť limit detekce v biologickém materiálu byl stanoven 104 CFU na ml plné krve nebo fyziologického roztoku. Metoda je vhodná spíše pro potřeby rozlišení kmenů, neţ pro identifikaci bakterií.
50
7. Souhrn PCR je schopná detekovat specifickou DNA sekvenci bakteriálního genomu. PCR je obecně dostatečně citlivá metoda, kdy teoreticky i z jedné kopie bakteriálního genomu je moţno pomocí PCR vytvořit dostatečné mnoţství specifického produktu, který jsme schopni zachytit. Detekční metoda musí být schopna dostatečně včas detekovat bakterii v klinickém vzorku pacienta. Rychlost získání výsledků detekce je důleţitá z hlediska včasného nasazení antimikrobiální terapie. Metoda musí být laboratorně nenáročná, schopná zpracovávat současně více vzorků. Po zhodnocení výhod a nevýhod pro klinickou rutinní diagnostiku bakterií byla zvolena konvenční širokospektrá 16S rRNA PCR s následnou sekvenční analýzou. Obecně jsou pouţívána dvě schémata pro bakteriální detekci pomocí zvoleného přístupu. První schéma je zaloţené na sekvenční analýze genu 16S rRNA v DNA vzorku izolovaného přímo z biologického materiálu, coţ vede k výraznému sníţení celkové doby analýzy vzorku. Druhé schéma je zaloţené na přípravě bakteriálního izolátu pomocí kultivačních technik a jeho následné identifikaci pomocí sekvenční analýzy 16S rRNA. Výhodou tohoto přístupu je moţnost zpětné identifikace izolátů získaných před charakterizací daného bakteriálního druhu. Disertační práce si kladla tři cíle: 1) Zjistit nejčastějšího bakteriálního původce infekční endokarditidy u klinických vzorků analyzovaných v letech 2003 aţ 2005 v laboratoři Centra kardiovaskulární a transplantační chirurgie Brno pomocí přímé detekce v biologickém materiálu bez nutnosti provést kultivaci; 2) Aplikovat konvenční širokospektrou 16S rRNA PCR s následnou sekvenční analýzou na identifikaci bakterií v izolátech získaných kultivací z biologických materiálů; a 3) Zavést novou, potenciálně vyuţitelnou, metodu molekulární detekce bakterií. Bakteriální detekce přímo z biologického materiálu byla aplikována v první části práce, kdy byla analyzována skupina 42 pacientů s diagnostikovanou IE odhalila jako nejčastějšího původce onemocnění Staphylococcus aureus. Výhody molekulární detekce podle tohoto schéma dokumentuje záchyt kultivačně negativního případu Aerococcus urinae. V rámci
druhého
cíle
byl
vyšetřen
soubor
272
netuberkulózních
mykobakteriálních izolátů pocházejících ze vzorků lidí, zvířat a prostředí. Výhody pouţití sekvenční analýzy genu 16S rRNA aplikované na bakteriální kultury jsou
51
dokumentovány na zpětné identifikaci izolátů Mycobacterium arupense získaných před jeho charakterizací v roce 2006. Pouţití sekvenční analýzy pro identifikaci bakterií není vţdy úspěšné, proto byla jako moţná alternativa řešící tyto situace vybrána a zavedena širokospektrá 16S rRNA real time PCR s následnou vysokorozlišovací analýzou teploty taní (HRMA). Cílem studie bylo otestovat moţnost pouţít HRMA pro rozlišení vybraných zástupců rodu Staphylococcus i v případě, ţe rozdíl v analyzované sekvenci genu 16S rRNA je minimální. Bakteriální DNA izolovaná z vybraných 12 sbírkových kmenů zástupců rodu Staphylococcus byla analyzována pomocí 16S rRNA HRMA za pouţití fluorescenční barvičky EvaGreenTM. Získané 16S rRNA HRMA profily slouţily k rozlišení testované skupiny. Vyvinutý systém byl schopen rozlišit 10 referenčních kmenů. Z toho dva kmeny bylo moţno rozlišit přímo pomocí 16S rRNA HRMA profilů. Zbytek sbírkových kmenů byl rozlišen pomocí 16S rRNA HRMA profilů získaných z tvorby heteroduplexů mezi PCR produktem z testovaného kmene a PCR produktem z referenčního fylogeneticky nepříbuzného kmene. Analýzou klinických izolátů byla získána obdobná data. Vyvinutý systém je zatím v důsledku technického omezení moţno aplikovat pouze na bakteriální kultury, případné na biologický materiál (krev, punktát) obsahující více neţ 104 CFU/ml ve vzorku pouţitém pro izolaci DNA a následnou 16S rRNA HRMA. V důsledku sekvenční intradruhové variability je metoda vhodná spíše pro potřeby rozlišení kmenů, neţ pro identifikaci bakterií.
52
8. Summary Polymerase chain reaction (PCR) is used to identify sequences of bacterial genome in clinical samples. PCR is generally a sensitive method. Theoretically, from one copy of the bacterial genome, a sufficient number of specific products can be make, which can be detected. The detection method must be able to detect the bacterium in a clinical sample of patients sufficiently early. Quick obtaining of results is important for early administration of the preemptive therapy. The method must be easy to execute and able to process several samples at the same time. After an evaluation of advantages and disadvantages of the tested methods from the point of view of clinical routine diagnostics we selected conventional broad range 16S rRNA PCR followed with sequence analysis. Generally, two schemes for bacterial detection according selected approach are used. Fist one is based upon sequence analysis of bacterial isolate obtained by classical microbiological techniques. An advantage of this approach is possibility for rapid recognition and classification of previously undescribed pathogens. Second scheme is applied for universal bacterial 16S rRNA detection directly in biological material and without a need for cultivation. The doctoral thesis proposed three goals: 1) to find out the most frequent bacterial pathogen in IE cases collected from years 2003 to 2005 at Centre for Cardiovascular Surgery and Transplantations by use of direct detection in biological matrices without a need for bacterial cultivation; 2) to apply conventional broad range 16S rRNA PCR followed with sequence analysis for identification of bacterial isolates obtained by cultivation from biological material; 3) to select a new potentially suitable method from bacterial detection. Broad range detection of 16S rRNA gene was successfully applied. Bacterial detection directly from biological material was applied in second part of the thesis. Forty-two patients with diagnosed definite Infective Endocarditis were analyzed. The most frequent causal agent was identified Staphylococcus aureus. The advantage of molecular detection according to this scheme is supported by cultivation negative case of Aerococcus urinae. According to the first scheme 272 non-tuberculous mycobacterial isolates derived from humans, animals and environment were analyzed. Advantage of this approach is documented by identification of Mycobacterium arupense in isolates obtained before its discovery and characterization.
53
The use of sequence analysis for bacterial identification is problematic from time to time. Broad range 16S rRNA real time PCR followed with high resolution melting analysis (HRMA) was designed for rapid and accurate identification of Staphylococcus spp. The aim of this study was to test a potential of HRMA to distinguish particular bacterial species within Staphylococcus spp. even if using broad-range PCR within the 16 rRNA where sequence differences are minimal. Genomic DNA samples isolated from 12 reference staphylococcal strains were subjected to a real-time amplification of the 16S rRNA gene in the presence of fluorescent dye EvaGreenTM, and followed by HRMA. Melting profiles were used as molecular fingerprints for bacterial species identification. Evaluated system was reproducible and able to distinguish 10 reference strains. Two strains were identified directly using melting profiles, other 10 strains were determined via high-resolution plots obtained by heteroduplex formation between PCR products of the tested strain and reference phylogenetically unrelated strain.
54
Seznam zkratek
A. urinae
Aerococcus urinae
CFU
Colony Forming Units, buňky, z kterých vzniknou jednotlivé kolonie
Ct
Cyklus s pozorovatelným nárůstem fluorescence nad úroveň pozadí během real time PCR měření
DNA
DeoxyriboNucleic Acid, deoxyribonukleová kyselina
dNTP
Deoxynukleotidtrifosfáty
dsDNA
double-stranded DNA, dvouřetězcová DNA
EDTA
Ethylendiamintetraoctová kyselina
F57
Specifický DNA fragment pro M. avium subsp. paratuberculosis
HIV
Human Immunodefficiency Virus
HRMA
High Resolution Melting Analysis, vysokorozlišovací analýza teploty taní
IE
Infekční Endokarditida
IK
Izolační Kontrola
IS900
Insertion Sequence 900, inzerční sekvence 900 unikátní pro M. avium subsp. paratuberculosis
IS901
Insertion Sequence 901, inzerční sekvence 901 unikátní pro M. avium subsp. avium
ITS
16S-23S rRNA Intergenic Transcribed Spacer region, transkripčně přepisovaná DNA spojka mezi geny 16S rRNA a 23S rRNA
LPS
Lipopolysacharid
M.
Mycobacterium
MTC
Mycobacterium tuberculosis komplex
NK
Negativní Kontrola
NTM
NeTuberkulózní Mykobakterie
PCR
Polymerase Chain Reaction, polymerázová řetězová reakce
pCR2.1_Sau
Plazmidový konstrukt nesoucí analyzovanou oblast genu 16S rRNA
PPM
Podmíněně Patogenní Mykobakterie
qPCR
Real time PCR
55
16S rRNA
16S ribosomal RNA, gen pro 16S ribozonální RNA
SNP
Single Nucleotide Polymorphism, jednobodová záměna nukleotidu
sp.
Species, druh
ssDNA
single-stranded DNA, jednořetězcová DNA
S.
Staphylococcus
Tm
Teplota, při níţ je denaturovaná polovina PCR produktu
UTI
Urinary Tract Infections, infekce močo-pohlavních cest
56
10. Literatura
Adhikesavan LG, Harrington TM (2008): Local and disseminated infections caused by Mycobacterium marinum - An unusual cause of subcutaneous nodules. JCR J.Clin.Rheumatol., 14, 156-160. Allegre S, Miendje D, V, Beyer I, Pepersack T, Cherifi S (2008): Aerococcus urinae endocarditis: first case report in Belgium and review of the literature. Rev.Med.Brux., 29, 568-571. Alperi A, Figueras MJ, Inza I, Martinez-Murcia AJ (2008): Analysis of 16S rRNA gene mutations in a subset of Aeromonas strains and their impact in species delineation. Int.Microbiol., 11, 185-194. Amir J (2010): Non-Tuberculous Mycobacterial Lymphadenitis in Children: Diagnosis and Management. Israel Med.Ass.J., 12, 49-52. Amsden GW (2004): Pneumococcal resistance in perspective: how well are we combating it? Pediatr.Infect.Dis.J., 23, 125-128. Anand AR, Therese KL, Madhavan HN (2000): Spectrum of aetiological agents of postoperative endophthalmitis and antibiotic susceptibility of bacterial isolates. Indian J.Ophthalmol., 48, 123-128. Apfalter P (2003): MRSA/MRSE-VISA/GISA/VRSA-PRP-VRE: current gram positive problem bacteria and mechanism of resistance, prevalence and clinical consequences. Wien.Med.Wochenschr., 153, 144-147. Archer GL, Bosilevac JM (2001): Signaling antibiotic resistance in staphylococci. Science, 291, 1915-1916. Barie PS (1998): Antibiotic-resistant gram-positive cocci: implications for surgical practice. World J.Surg., 22, 118-126. Beers W, Cerami A, Reich E (1967): An Experimental Model for Internal Denaturation of Linear DNA Molecules. Proc.Nat.Acad.Sci.USA, 58, 1624-1631. Beneš J, Kvasnička A (2000): Infekční endokarditida. Cor.Vasa. 42, 21-28. Biet F, Boschiroli ML, Thorel MF, Guilloteau LA (2005) : Zoonotic aspects of Mycobacterium bovis and Mycobacterium avium-intracellulare complex (MAC). Vet.Res., 36, 411-436. Blake RD, Delcourt SG (1998): Thermal stability of DNA. Nuc.Ac.Res., 26, 33233332. Brosch R, Gordon SV, Marmiesse M, Brodin P, Buchrieser C, Eiglmeier K, Garnier T, Gutierrez C, Hewinson G, Kremer K, Parsons LM, Pym AS, Samper S, van Soolingen D, Cole ST (2002): A new evolutionary scenario for the Mycobacterium tuberculosis complex. Proc.Nat.Acad.Sci.USA, 99, 3684-3689. 57
Bruegger D, Beiras-Fernandez A, Weis F, Weis M, Kur F (2009): Extracorporeal support in a patient with cardiogenic shock due to Aerococcus urinae endocarditis. J.Heart Valve Dis., 18, 418-420. Carson CF, Riley TV (2003): Non-antibiotic therapies for infectious diseases. Commun.Dis.Intell., 27 Suppl, 143-146. Chakravorty S, Aladegbami B, Burday M, Levi M, Marras SA, Shah D, El Hajj HH, Kramer FR, Alland D (2010): Rapid universal identification of bacterial pathogens from clinical cultures by using a novel sloppy molecular beacon melting temperature signature technique. J.Clin.Microbiol., 48, 258-267. Chalker VJ, Brownlie J (2004): Taxonomy of the canine Mollicutes by 16S rRNA gene and 16S/23S rRNA intergenic spacer region sequence comparison. Int.J.Syst.Evol.Microbiol., 54, 537-542. Cheng JC, Huang CL, Lin CC, Chen CC, Chang YC, Chang SS, Tseng CP (2006): Rapid detection and identification of clinically important bacteria by highresolution melting analysis after broad-range ribosomal RNA real-time PCR. Clin.Chem., 52, 1997-2004. Cloud JL, Meyer JJ, Pounder JI, Jost KC, Sweeney A, Carroll KC, Woods GL (2006): Mycobacterium arupense sp nov., a non-chromogenic bacterium isolated from clinical specimens. Int.J.Syst.Evol.Microbiol., 56, 1413-1418. Dannaoui E, Schwarz P, Slany M, Loeffler J, Jorde AT, Cuenca-Estrella M, Hauser PM, Shrief R, Huerre M, Freiberger T, Gaustad P, Rodriguez-Tudela JL, Bille J, Denning DW, Bretagne S, Lortholary O (2010): Molecular detection and identification of zygomycetes species from paraffin-embedded tissues in a murine model of disseminated zygomycosis: a collaborative European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ESCMID) Fungal Infection Study Group (EFISG) evaluation. J.Clin.Microbiol., 48, 2043-2046. de Jong MF, Soetekouw R, ten Kate RW, Veenendaal D (2010): Aerococcus urinae: severe and fatal bloodstream infections and endocarditis. J.Clin.Microbiol., 48, 3445-3447. de Kantor IN, Ambroggi M, Poggi S, Morcillo N, Silva Telles MA, Osorio RM, Garzon Torres MC, Llerena PC, Ribon W, Garcia V, Kuffo D, Asencios L, Vasquez Campos LM, Rivas C, de Waard JH (2008): Human Mycobacterium bovis infection in ten Latin American countries. In: Tuberculosis, Edinburg, 88, 358365. Domin MA (1998): Highly virulent pathogens-a post antibiotic era? Br.J.Theat.Nurs., 8, 14-18. Drancourt M, Bollet C, Carlioz A, Martelin R, Gayral JP, Raoult D (2000): 16S ribosomal DNA sequence analysis of a large collection of environmental and clinical unidentifiable bacterial isolates. J.Clin.Microbiol., 38, 3623-3630.
58
Durack DT, Lukes AS, Bright DK (1994): New criteria for diagnosis of infective endocarditis: utilization of specific echocardiographic findings. Duke Endocarditis Service. Am.J.Med., 96, 200-209. Echevarria MP, Martin G, Perez J, Urkijo JC (1994): Pulmonary infection by Mycobacterium kansasii. Presentation of 27 cases (1988-1992). Enferm.Infecc.Microbiol.Clin., 12, 280-284. Facklam R (2002): What Happened to the Streptococci: Overview of Taxonomic and Nomenclature Changes. Clin.Microbiol.Rev., 15, 613-630. Fischer O, Matlova L, Bartl J, Dvorska L, Melicharek I, Pavlik I (2000): Findings of mycobacteria in insectivores and small rodents. Fol.Microbiol., 45, 147-152. Fontaine O (1996): Dealing with diarrhoea. Child Health Dialogue, 5. Fortini D, Ciammaruconi A, De Santis R, Fasanella A, Battisti A, D'Amelio R, Lista F, Cassone A, Carattoli A (2007): Optimization of high-resolution melting analysis for low-cost and rapid screening of allelic variants of Bacillus anthracis by multiple-locus variable-number tandem repeat analysis. Clin.Chem., 53, 13771380. Fredricks DN, Relman DA (1999): Application of polymerase chain reaction to the diagnosis of infectious diseases. Clin.Infect.Dis., 29, 475-486. Gold HS, Moellering RC, Jr. (1996): Antimicrobial-drug resistance. N.Engl.J.Med., 335, 1445-1453. Goldenberger D, Kunzli A, Vogt P, Zbinden R, Altwegg M (1997): Molecular diagnosis of bacterial endocarditis by broad-range PCR amplification and direct sequencing. J.Clin.Microbiol., 35, 2733-2739. Graham R, Liew M, Meadows C, Lyon E, Wittwer CT (2005): Distinguishing different DNA heterozygotes by high-resolution melting. Clin.Chem., 51, 1295-1298. Greub G, Lepidi H, Rovery C, Casalta JP, Habib G, Collard F, Fournier PE, Raoult D (2005): Diagnosis of infectious endocarditis in patients undergoing valve surgery. Am.J.Med., 118, 230-238. Griffith DE, Aksamit T, Brown-Elliott BA, Catanzaro A, Daley C, Gordin F, Holland SM, Horsburgh R, Huitt G, Iademarco MF, Iseman M, Olivier K, Ruoss S, von Reyn CF, Wallace RJ, Winthrop K (2007): An official ATS/IDSA statement: Diagnosis, treatment, and prevention of nontuberculous mycobacterial diseases. Am.J.Resp.Crit.Care Med., 175, 367-416. Grijalva M, Horvath R, Dendis M, Erny J, Benedik J (2003): Molecular diagnosis of culture negative infective endocarditis: clinical validation in a group of surgically treated patients. Heart, 89, 263-268. Guerrant RL, Lima AA, Davidson F (2000): Micronutrients and infection: interactions and implications with enteric and other infections and future priorities. J Infect.Dis., 182 Suppl 1, 134-138.
59
Han XY, De I, Jacobson KL (2007): Rapidly growing mycobacteria: clinical and microbiologic studies of 115 cases. Am.J.Clin.Pathol., 128, 612-621. Harmsen D, Dostal S, Roth A, Niemann S, Rothganger J, Sammeth M, Albert J, Frosch M, Richter E (2003): RIDOM: Comprehensive and public sequence database for identification of Mycobacterium species. BMC Infect.Dis., 3. Harris KA, Hartley JC (2003): Development of broad-range 16S rDNA PCR for use in the routine diagnostic clinical microbiology service. J.Med.Microbiol., 52, 685691. Heifets L (1997): Mycobacteriology laboratory. Clin.Chest Med., 18, 35-53. Heijs SK, Haese RR, van der Wielen PW, Forney LJ, van Elsas JD (2007): Use of 16S rRNA gene based clone libraries to assess microbial communities potentially involved in anaerobic methane oxidation in a Mediterranean cold seep. Microb.Ecol., 53, 384-398. Heiro M, Helenius H, Makila S, Hohenthal U, Savunen T, Engblom E, Nikoskelainen J, Kotilainen P (2006): Infective endocarditis in a Finnish teaching hospital: a study on 326 episodes treated during 1980-2004. Heart, 92, 1457-1462. Herrmann MG, Durtschi JD, Wittwer CT, Voelkerding KV (2007): Expanded instrument comparison of amplicon DNA melting analysis for mutation scanning and genotyping. Clin.Chem., 53, 1544-1548. Ho E, Coveliers J, Amsel BJ, Stockman B, Walpot J, Ieven M, Rodrigus I (2010): A case of endocarditis due to Aerococcus urinae. J.Heart Valve Dis., 19, 264-266. Jacobs MR, Bajaksouzian S, Zilles A, Lin G, Pankuch GA, Appelbaum PC (1999): Susceptibilities of Streptococcus pneumoniae and Haemophilus influenzae to 10 oral antimicrobial agents based on pharmacodynamic parameters: 1997 U.S. Surveillance study. Antimicrob.Agents Chemother., 43, 1901-1908. Kass M, Toye B, Veinot JP (2008): Fatal infective endocarditis due to Aerococcus urinae-case report and review of literature. Cardiovas.Pathol., 17, 410-412. Kazda J, Pavlik I, Falkinham J, Hruska K (2009): The ecology of mycobacteria: impact on animal’s and human’s health. 2nd Edn., Springer, 520 pp. Kralik P, Nocker A, Pavlik I (2010): Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis viability determination using F57 quantitative PCR in combination with propidium monoazide treatment. Int.J.Food Microbiol., 141 Suppl 1, 80-86. Krasner RI (2002): The microbial challenge. Human–microbe Interactions. ASM Press, 433 pp. Kriz P, Slany M, Shitaye JE, Pavlik I (2010): Avian mycobacteriosis in humans remains a threat in the Czech Republic. Klin.Mikrobiol.Infekc.Lek., 16, 10-17.
60
Krypuy M, Newnham GM, Thomas DM, Conron M, Dobrovic A (2006): High resolution melting analysis for the rapid and sensitive detection of mutations in clinical samples: KRAS codon 12 and 13 mutations in non-small cell lung cancer. BMC Cancer, 6, 295. Kyaw MH, Rose CE, Jr., Fry AM, Singleton JA, Moore Z, Zell ER, Whitney CG (2005): The influence of chronic illnesses on the incidence of invasive pneumococcal disease in adults. J.Infect.Dis., 192, 377-386. Labrenz M, Brettar I, Christen R, Flavier S, Botel J, Hofle MG (2004): Development and application of a real-time PCR approach for quantification of uncultured bacteria in the central Baltic Sea. Appl.Environ.Microbiol., 70, 4971-4979. Lancellotti M, Pace F, Stehling EG, Villares MC, Brocchi M, Silveira WD (2008): Ribotyping, biotyping and capsular typing of Haemophilus influenzae strains isolated from patients in Campinas, southeast Brazil. Braz.J.Infect.Dis., 12, 430437. Lawn SD, Bicanic TA, Macallan DC (2004): Pyomyositis and cutaneous abscesses due to Mycobacterium avium: an immune reconstitution manifestation in a patient with AIDS. Clin.Infect.Dis., 38, 461-463. Levin AS, Levy CE, Manrique AE, Medeiros EA, Costa SF (2003): Severe nosocomial infections with imipenem-resistant Acinetobacter baumannii treated with ampicillin/sulbactam. Int.J.Antimicrob.Agents, 21, 58-62. Liew M, Pryor R, Palais R, Meadows C, Erali M, Lyon E, Wittwer C (2004): Genotyping of single-nucleotide polymorphisms by high-resolution melting of small amplicons. Clin.Chem., 50, 1156-1164. Masaki T, Ohkusu K, Hata H, Fujiwara N, Iihara H, Yamada-Noda M, Nhung PH, Hayashi M, Asano Y, Kawamura Y, Ezaki T (2006): Mycobacterium kumamotonense Sp. Nov. recovered from clinical specimen and the first isolation report of Mycobacterium arupense in Japan: Novel slowly growing, nonchromogenic clinical isolates related to Mycobacterium terrae complex. Microbiol.Immunol., 50, 889-897. Matlova L, Dvorska L, Bartl J, Bartos M, Ayele WY, Alexa M, Pavlik I (2003): Mycobacteria isolated from the environment of pig farms in the Czech Republic during the years 1996 to 2002. Vet.Med.-Czech. 48, 343-357. McFarland J (1907): Nephelometer: an instrument for estimating the number of bacteria in suspensions used for calculating the opsonic index and for vaccines. J.Am.Med.Ass., 14, 1176-1178. Moravkova M, Hlozek P, Beran V, Pavlik I, Preziuso S, Cuteri V, Bartos M (2008): Strategy for the detection and differentiation of Mycobacterium avium species in isolates and heavily infected tissues. Res.Vet.Sci., 85, 257-264. Moreillon P, Que YA, Bayer AS (2002): Pathogenesis of streptococcal and staphylococcal endocarditis. Infect.Dis.Clin.North Am., 16, 297-318.
61
Motta AC, Komesu MC, Silva CH, Arruda D, Simao JC, Zenha EM, Furini RB, Foss NT (2008): Leprosy-specific oral lesions: a report of three cases. Med.Oral Patol.Oral Cir.Bucal., 13, 479-482. Muller C, Petermann D, Stain C, Riemer H, Vogelsang H, Schnider P, Zeiler K, Wrba F (1997): Whipple's disease: comparison of histology with diagnosis based on polymerase chain reaction in four consecutive cases. Gut, 40, 425-427. Muyzer G, de Waal EC, Uitterlinden AG (1993): Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA. Appl.Environ.Microbiol., 59, 695-700. Naber CK, Erbel R (2003): Diagnosis of culture negative endocarditis: novel strategies to prove the suspect guilty. Heart, 89, 241-243. Neonakis IK, Gitti Z, Kontos F, Baritaki S, Petinaki E, Baritaki M, Liakou V, Zerva L, Spandidos DA (2010): Mycobacterium arupense pulmonary infection: antibiotic resistance and restriction fragment length polymorphism analysis. Ind.J.Med.Microbiol., 28, 173-176. Parrish SC, Myers J, Lazarus A (2008): Nontuberculous mycobacterial pulmonary infections in non-HIV patients. Postgrad Med., 120, 78-86. Peters RPH, van Agtmael MA, Danner SA, Savelkoul PHM, Vandenbroucke-Grauls CMJE (2004): New developments in the diagnosis of bloodstream infections. Lancet Infect.Dis., 4, 751-760. Petrosillo N, Pantosti A, Bordi E, Spano A, Del Grosso M, Tallarida B, Ippolito G (2002): Prevalence, determinants, and molecular epidemiology of Streptococcus pneumoniae isolates colonizing the nasopharynx of healthy children in Rome. Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis., 21, 181-188. Poland D (1974): Recursion Relation Generation of Probability Profiles for SpecificSequence Macromolecules with Long-Range Correlations. Biopolymers, 13, 1859-1871. Putignani L, Sessa R, Petrucca A, Manfredini C, Coltella L, Menichella D, Nicoletti M, Russo C, Cipriani P (2008): Genotyping of different Pseudomonas aeruginosa morphotypes arising from the lower respiratory tract of a patient taken to an Intensive Care Unit. Int.J.Immunopathol.Pharmacol., 21, 941-947. Rasmussen JP, Saint CP, Monis PT (2007): Use of DNA melting simulation software for in silico diagnostic assay design: targeting regions with complex melting curves and confirmation by real-time PCR using intercalating dyes. BMC Bioinform., 8, Rautemaa R, Lauhio A, Cullinan MP, Seymour GJ (2007): Oral infections and systemic disease-an emerging problem in medicine. Clin.Microbiol.Infect., 13, 10411047.
62
Reed GH, Wittwer CT (2004): Sensitivity and specificity of single-nucleotide polymorphism scanning by high-resolution melting analysis. Clin.Chem., 50, 1748-1754. Reier-Nilsen T, Farstad T, Nakstad B, Lauvrak V, Steinbakk M (2009): Comparison of broad range 16S rDNA PCR and conventional blood culture for diagnosis of sepsis in the newborn: a case control study. BMC Pediatrics, 9, Ricci G, Da Silva ID, Sano A, Borra RC, Franco M (2007): Detection of Paracoccidioides brasiliensis by PCR in biopsies from patients with paracoccidioidomycosis: correlation with the histopathological pattern. Pathologica, 99, 41-45. Rondini S, Mensah-Quainoo E, Troll H, Bodmer T, Pluschke G (2003): Development and application of real-time PCR assay for quantification of Mycobacterium ulcerans DNA. J.Clin.Microbiol., 41, 4231-4237. Roy D, Ward P, Champagne G (1996): Differentiation of bifidobacteria by use of pulsed-field gel electrophoresis and polymerase chain reaction. Int.J.Food Microbiol., 29, 11-29. Runyon EH (1959): Anonymous mycobacteria in pulmonary disease. Med.Clin.North Am., 43, 273-290. Sack JB (1990): Disseminated infection due to Mycobacterium fortuitum in a patient with AIDS. Rev.Infect.Dis., 12, 961-963. Schabereiter-Gurtner C, Maca S, Rolleke S, Nigl K, Lukas J, Hirschl A, Lubitz W, Barisani-Asenbauer T (2001): 16S rDNA-based identification of bacteria from conjunctival swabs by PCR and DGGE fingerprinting. Incest.Ophthalmol.Vis.Sci., 42, 1164-1171. Schulze-Robbecke R, Janning B, Fischeder R (1992): Occurrence of mycobacteria in biofilm samples. Tuber.Lung Dis., 73, 141-144. Shiomi T, Yamamoto T, Manabe T. (2007): Mycobacterial spindle cell pseudotumor of the skin. J.Cutan.Pathol., 34, 346-351. Shitaye EJ, Grymova V, Grym M, Halouzka R, Horvathova A, Moravkova M, Beran V, Svobodova J, Dvorska-Bartosova L, Pavlik I (2009): Mycobacterium avium subsp. hominissuis infection in a pet parrot. Emerg.Infect.Dis., 15, 617-619. Singh JP, Verma R, Chaudhuri P (2006): Random amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis of Mycobacterium tuberculosis strains in India. J.Vet.Sci., 7, 181-187. Sinthuwiwat T, Poowasanpetch P, Wongngamrungroj A, Promso S, Auewarakul C, Mooney S, Tocharoentanaphol C (2008): High-resolution melting curve analysis for genotyping of common SNP in MTHFR gene using fixed-cell suspension. Mol.Cell Probes, 22, 329-332.
63
Slana I, Kralik P, Kralova A, Pavlik I (2008): On-farm spread of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in raw milk studied by IS900 and F57 competitive real time quantitative PCR and culture examination. Int.J.Food Microbiol., 128, 250257. Slany M, Freiberger T, Pavlik P, Cerny J (2007): Culture-negative infective endocarditis caused by Aerococcus urinae. J.Valve Dis., 16, 203-205. Slany M, Svobodova J, Ettlova A, Slana I, Mrlik V, Pavlik I (2010a): Mycobacterium arupense among the isolates of non-tuberculous mycobacteria from human, animal and environmental samples. Vet.Med.-Czech 55, 369-376. Slany M, Mrlik V, Kriz P, Pavlik I (2010b): First isolation of a newly described Mycobacterium insubricum from freshwater fish. Vet.Microbiol., 144, 254-255. Slany M, Knotek Z, Skoric M, Knotkova Z, Svobodova J, Mrlik V, Moravkova M, Pavlik I (2010c): Systemic mixed infection in a brown caiman (Caiman crocodilus fuscus) caused by Mycobacterium szulgai and M. chelonae: a case report. Vet.Med.-Czech 55, 91-96. Springer B, Stockman L, Teschner K, Roberts GD, Bottger EC (1996): Two-laboratory collaborative study on identification of mycobacteria: molecular versus phenotypic methods. J.Clin.Microbiol., 34, 296-303. Sreevatsan S, Pan X, Stockbauer KE, Connell ND, Kreiswirth BN, Whittam TS, Musser JM (1997): Restricted structural gene polymorphism in the Mycobacterium tuberculosis complex indicates evolutionarily recent global dissemination. Proc.Natl.Acad.Sci.Am, 94, 9869-9874. Stein A, Raoult D (1992): Detection of Coxiella-Burnetii by DNA Amplification Using Polymerase Chain-Reaction. J.Clin.Microbiol., 30, 2462-2466. Stout JE (2006): Evaluation and management of patients with pulmonary nontuberculous mycobacterial infections. Expert Rev.Anti.Infect.Ther., 4, 981993. Talati NJ, Rouphael N, Kuppalli K, Franco-Paredes C (2008): Spectrum of CNS disease caused by rapidly growing mycobacteria. Lancet Infect.Dis., 8, 390-398. Tasota FJ, Fisher EM, Coulson CF, Hoffman LA (1998): Protecting ICU patients from nosocomial infections: practical measures for favorable outcomes. Crit.Care Nurse, 18, 54-65. Telenti A, Marchesi F, Balz M, Bally F, Bottger EC, Bodmer T (1993): Rapid identification of mycobacteria to the species level by polymerase chain reaction and restriction enzyme analysis. J.Clin.Microbiol., 31, 175-178. Tortoli E (2006): The new mycobacteria: an update. FEMS Immunol.Med.Microbiol., 48, 159-178. Tortoli E, Baruzzo S, Heijdra Y, Klenk HP, Lauria S, Mariottini A, van Ingen J (2009): Mycobacterium insubricum sp. nov. Int.J.Syst.Evol.Microbiol., 59, 1518-1523.
64
Tostesen E, Liu F, Jenssen TK, Hovig E (2003): Speed-up of DNA melting algorithm with complete nearest neighbor properties. Biopolymers, 70, 364-376. Tsai TF, Lai CC, Tsai IC, Chang CH, Hsiao CH, Hsueh PR (2008): Tenosynovitis caused by Mycobacterium arupense in a patient with diabetes mellitus. Clin.Infect.Dis., 47, 861-863. van Der WD, Nord CE (2000): Development and persistence of multi-resistance to antibiotics in bacteria; an analysis and a new approach to this urgent problem. Int.J.Antimicrob.Agents, 16, 191-197. Wittwer CT, Reed GH, Gundry CN, Vandersteen JG, Pryor RJ (2003): High-resolution genotyping by amplicon melting analysis using LCGreen. Clin.Chem., 49, 853860. Woese CR (1987): Bacterial evolution. Microbiol.Rev., 51, 221-271. Wolford JK, Blunt D, Ballecer C, Prochazka M (2000): High-throughput SNP detection by using DNA pooling and denaturing high performance liquid chromatography (DHPLC). Human Genetics, 107, 483-487. Woo PC, Lau SK, Teng JL, Tse H, Yuen KY (2008): Then and now: use of 16S rDNA gene sequencing for bacterial identification and discovery of novel bacteria in clinical microbiology laboratories. Clin.Microbiol.Infect., 14, 908-934. Yang S, Ramachandran P, Rothman R, Hsieh YH, Hardick A, Won H, Kecojevic A, Jackman J, Gaydos C (2009): Rapid Identification of Biothreat and Other Clinically Relevant Bacterial Species by Use of Universal PCR Coupled with High-Resolution Melting Analysis. J.Clin.Microbiol., 47, 2252-2255. Zeng Y, Montrichok A, Zocchi G (2003): Length and statistical weight of bubbles in DNA melting. Phys.Rev.Lett., 91,
65
Seznam příloh
A. Slany M, Freiberger T, Pavlik P, Cerny J (2007): Culture-negative infective endocarditis caused by Aerococcus urinae. J.Valve Dis., 16, 203-205. B. Slany M, Svobodova J, Ettlova A, Slana I, Mrlik V, Pavlik I (2010a): Mycobacterium arupense among the isolates of non-tuberculous mycobacteria from human, animal and environmental samples. Vet.Med.-Czech 55:369-376. C. Slany M, Mrlik V, Kriz P, Pavlik I (2010b): First isolation of a newly described Mycobacterium insubricum from freshwater fish. Vet.Microbiol., 144, 254-255. D. Slany M, Vanerkova M, Nemcova E, Zaloudikova B, Ruzicka F, Freiberger T (2010): Differentiation of Staphylococcus spp By High-Resolution Melting Analysis. Can.J.Microbiol. (Accepted 30.9.2010). E. Další publikace související s tématem dizertační práce
66
Příloha A
67
Příloha B
68
Příloha C
69
Příloha D
70
Příloha E
71
Další publikace související s tématem dizertační práce
Dannaoui E, Schwarz P, Slany M, Loeffler J, Jorde AT, Cuenca-Estrella M, Hauser PM, Shrief R, Huerre M, Freiberger T, Gaustad P, Rodriguez-Tudela JL, Bille J, Denning DW, Bretagne S, Lortholary O (2010): Molecular detection and identification of zygomycetes species from paraffin-embedded tissues in a murine model of disseminated zygomycosis: a collaborative European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ESCMID) Fungal Infection Study Group (EFISG) evaluation. J.Clin.Microbiol., 48, 2043-2046. Kriz P, Slany M, Shitaye JE, Pavlik I (2010): Avian mycobacteriosis in humans remains a threat in the Czech Republic. Klin.Mikrobiol.Infekc.Lek., 16, 10-17. Slany M, Knotek Z, Skoric M, Knotkova Z, Svobodova J, Mrlik V, Moravkova M, Pavlik I (2010c): Systemic mixed infection in a brown caiman (Caiman crocodilus fuscus) caused by Mycobacterium szulgai and M. chelonae: a case report. Vet.Med.-Czech 55:91-96.
Abstrakta v impaktovaných časopisech Slany M, Zaloudikova B, Freiberger T, Cerny J (2007): High-resolution melting analysis a new promising tool in detection of bacterial pathogens. Clin.Res.Cardiol., 96, 412-412. Zaloudikova B, Slany M, Freiberger T (2007): Use of denaturing gradient gel electrophoresis for polymicrobial sample analysis. Int.J.Antimicrobial.Agents, 29 Suppl, 393-394.
72
