Masarykova univerzita Lékařská fakulta
IMUNOHEMATOLOGICKÉ VYŠETŘENÍ PROTILÁTEK PROTI ERYTROCYTŮM Bakalářská práce v oboru zdravotní laborant
Vedoucí bakalářské práce:
Autor:
MUDr. Alena Vlachová
Jana Fabešová
Brno, duben 2012
Jméno a příjmení autora: Jana Fabešová Název bakalářské práce: Imunohematologické vyšetření protilátek proti erytrocytům Pracoviště: Transfuzní oddělení Fakultní nemocnice Královské Vinohrady, Praha Vedoucí bakalářské práce: MUDr. Alena Vlachová Rok obhajoby bakalářské práce: 2012 Souhrn: Vyšetření protilátek proti erytrocytům tvoří základ práce v imunohematologických laboratořích. Protilátky jsou vyšetřovány při předtransfuzním vyšetření, u gravidních žen, u osob s hematologickými chorobami, u potransfuzních reakcí a u dárců krve. V první části mé práce se zaměřuji na teoretické poznatky, na základní imunohematologické pojmy, na vztahy mezi antigenem a protilátkou. V další části podávám přehled hlavních skupinových systémů na erytrocytech člověka a možných protilátek. V praktické části se zabývám jednotlivými laboratorními postupy vyšetření protilátek na svém pracovišti – Transfuzním oddělení Fakultní nemocnice Královské Vinohrady v Praze, s přihlédnutím k nejnovějším poznatkům a doporučením Společnosti pro transfuzní lékařství ČLS JEP. V experimentální části své práce uvádím statistický přehled vyšetření protilátek proti erytrocytům v imunohematologické laboratoři TO FNKV za celý rok 2011 a vyhodnocuji výsledky vyšetření protilátek vzhledem k teoretickým poznatkům. Na konci práce popisuji tři zajímavé kazuistiky vyšetření protilátek.
Klíčová slova: protilátka, antigen, screening, NAT, enzym, erytrocyty
Souhlasím, aby má práce byla půjčována ke studijním účelům a byla citována dle platných norem.
Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vypracovala samostatně pod vedením MUDr. Vlachové Aleny a v seznamu literatury uvedla všechny použité literární a odborné zdroje.
V Brně dne: 20.4.2012
Touto cestou bych velmi ráda poděkovala vedoucí mé práce MUDr. Aleně Vlachové za její velkou pomoc, cenné rady, ochotu a čas při zpracování dané problematiky. Rovněž děkuji MUDr. Renatě Brudňákové za ochotu při vyhledávání zajímavých kazuistik. Taktéž děkuji svému příteli za velkou trpělivost.
Seznam symbolů a zkratek: AIHA– autoimunní hemolytická anémie AK – autokontrola APC – buňka předkládající antigen (antigen – presenting cell) BCR – receptor lymfocytů B pro antigen (B – cell receptor) ČLS JEP – Česká lékařská společnost Jana Evangelisty Purkyně Fab – variabilní oblast lehkých a těžkých řetězců Ig Fc – konstantní oblast těžkého řetězce Ig HLA – hlavní lidský (histokompatibilní) antigen (human leukocyte antigen) HON – hemolytické onemocnění novorozence Ig – imunoglobulin kDa – kilodalton – jednotka molekulové hmotnosti KS – krevní skupina LIS – laboratorní informační systém LISS – roztok o nízké iontové síle (Low Ionic Salt Solution) min – minuta NAT – nepřímý antiglobulinový test NK – lymfocyty – přirozený zabíječ (natural killers) NRL – Národní referenční laboratoř ot/min – počet otáček za minutu při centrifugaci PAT – přímý antiglobulinový test PEG – polyethylenglykol PN – pracovní návod SA – sloupcová aglutinace SOP – standardní operační postup TCR – receptor lymfocytů T pro antigen (T – cell receptor) Th – pomocný T – lymfocyt (helper T – cell) TO FNKV – Transfuzní oddělení Fakultní nemocnice Královské Vinohrady ÚPMD – Ústav pro péči o matku a dítě
Obsah 1 Úvod.........................................................................................................................................8 2 Teoretická část..........................................................................................................................9 2.1 Základní imunohematologické pojmy..............................................................................9 2.1.1 Antigen......................................................................................................................9 2.1.2 Hapten.......................................................................................................................9 2.1.3 Protilátky................................................................................................................10 2.1.3.1 Chemická struktura.........................................................................................10 2.1.3.2 Tvorba protilátek.............................................................................................11 2.1.3.3 Rozdělení protilátek........................................................................................12 2.1.3.4 Třídy imunoglobulinů.....................................................................................13 2.1.3.5 Kinetika protilátky..........................................................................................15 2.1.4 Komplement...........................................................................................................15 2.2 Reakce antigen – protilátka............................................................................................16 2.2.1 Aglutinace...............................................................................................................16 2.2.1.1 První fáze........................................................................................................17 2.2.1.2 Druhá fáze.......................................................................................................17 2.2.2 Precipitace...............................................................................................................19 2.2.2.1 Imunodifuze....................................................................................................19 2.2.2.2 Imunoelektroforéza.........................................................................................19 2.2.3 Hemolýza................................................................................................................20 2.2.4 Inhibice hemaglutinace...........................................................................................20 2.2.5 ELISA.....................................................................................................................20 2.3 Skupinové systémy erytrocytů.......................................................................................20 2.3.1 AB0 systém.............................................................................................................20 2.3.1.1 Geny systému AB0.........................................................................................21 2.3.1.2 Antigeny systému AB0...................................................................................22 2.3.1.3 Protilátky systému AB0..................................................................................23 2.3.1.4 Vylučovatelství................................................................................................24 2.3.1.5 Význam AB0 systému pro transfuzi...............................................................24 2.3.2 Rh systém...............................................................................................................25 2.3.2.1 Geny Rh systému............................................................................................26 2.3.2.2 Antigeny Rh systému......................................................................................26 2.3.2.3 Protilátky Rh systému.....................................................................................29 2.3.2.4 Význam Rh systému pro transfuzi..................................................................30 2.3.3 Kell systém.............................................................................................................31 2.3.3.1 Geny Kell systému..........................................................................................31 2.3.3.2 Antigeny Kell systému....................................................................................32 2.3.3.3 Protilátky Kell systému...................................................................................32 2.3.3.4 Význam antigenů Kell systému pro transfuzi.................................................32 2.3.4 Lewis systém..........................................................................................................33 2.3.4.1 Geny Lewis systému.......................................................................................33 2.3.4.2 Antigeny Lewis systému.................................................................................33 2.3.4.3 Protilátky Lewis systému................................................................................33 2.3.4.4 Význam antigenů Lewis systému pro transfuzi..............................................34 2.3.5 Kidd systém............................................................................................................34 2.3.6 Duffy systém...........................................................................................................35 2.3.7 Lutheran systém......................................................................................................35
2.3.8 MNSs systém..........................................................................................................36 2.3.9 P systém..................................................................................................................36 2.3.10 Ii systém................................................................................................................37 2.3.11 Ostatní skupinové systémy...................................................................................38 2.3.11.1 Xg systém......................................................................................................38 2.3.11.2 Sid systém.....................................................................................................38 2.3.11.3 Cartwrith systém...........................................................................................39 2.3.11.4 Colton systém................................................................................................39 2.3.11.5 Dombrock systém.........................................................................................39 2.3.11.6 Diego systém.................................................................................................39 2.3.11.7 Scianna systém..............................................................................................40 2.3.11.8 Antigeny Chido a Rodgers............................................................................40 2.3.12 Antigeny s vysokou frekvencí výskytu.................................................................40 2.3.13 Antigeny s nízkou frekvencí výskytu...................................................................40 3 Praktická část.........................................................................................................................41 3.1 Vyšetření aglutininů anti – A, anti – B...........................................................................43 3.1.1 Vyšetření aglutininů metodou SA v systému DG Gel Grifols................................43 3.1.2 Vyšetření aglutininů zkumavkovou metodou.........................................................44 3.1.3 Vyšetření aglutininů na mikrodeskách....................................................................44 3.2 Vyšetření volných imunních protilátek u novorozence metodou SA.............................44 3.3 Screening nepravidelných protilátek..............................................................................45 3.3.1 Vzorky, reagencie, techniky....................................................................................45 3.3.2 Techniky testů.........................................................................................................46 3.3.3 Aplikace testů na TO FNKV...................................................................................47 3.3.3.1 NAT a enzymatický test v systému Biorad.....................................................47 3.3.3.2 NAT a enzymatický test v systému DG Gel Grifols.......................................48 3.3.3.3 Solný a enzymatický test ve zkumavce s krvinkami Biorad...........................48 3.3.3.4 NAT ve zkumavce...........................................................................................48 3.3.3.5 Chladové protilátky v systému DG Gel Grifols a Biorad...............................49 3.4 Identifikace specifických protilátek...............................................................................49 3.4.1 Identifikace v systému DG Gel Grifols..................................................................51 3.4.2 Identifikace v systému Biorad................................................................................52 3.4.3 Vyšetření antigenů na erytrocytech.........................................................................53 3.5 Titrace specifických protilátek.......................................................................................53 3.5.1 Titrace v systému DG Gel Grifols a Biorad............................................................54 3.5.2 Titrace chladových protilátek.................................................................................55 3.6 Vysycování séra..............................................................................................................55 3.7 Absorpce a eluce protilátek............................................................................................57 3.7.1 Absorpce.................................................................................................................58 3.7.2 Eluce klasicky.........................................................................................................58 3.7.3 Eluce pomocí diagnostické soupravy Gamma ELU – KIT II.................................59 4 Experimentální data...............................................................................................................60 4.1 Statistické údaje..............................................................................................................60 4.2 Kazuistiky.......................................................................................................................65 4.2.1 Kazuistika 1............................................................................................................65 4.2.2 Kazuistika 2............................................................................................................65 4.2.3 Kazuistika 3............................................................................................................66 5 Závěr......................................................................................................................................67 6 Použitá literatura a odborné zdroje........................................................................................69
1 Úvod Cílem mé práce je snaha podat ucelený přehled imunohematologické problematiky jak z teoretického tak z praktického hlediska. Dané téma popisuji vzhledem k nejnovějším poznatkům a doporučením Společnosti pro transfuzní lékařství ČLS JEP. Jedním z cílů mé práce je dokázat, že výsledky vyšetření identifikace nepravidelných protilátek v praxi, tedy na mém pracovišti, odpovídají současným poznatkům, které budu popisovat v teoretické části. Vyšetření
protilátek
proti
erytrocytům
patří
mezi
základní
vyšetření
v
imunohematologických laboratořích. Výsledky vyšetření protilátek jsou důležité napříč medicínskými obory, např. všude tam, kde je potřeba transfuze krve, v prenatálních poradnách gravidních žen, u dárců krve a u hematologických pacientů, např. s diagnózou AIHA. Protilátky se vyšetřují u pacientů před transfuzí erytrocytárních přípravků se záměrem odhalit, zda pacient nemá protilátku, která by mohla vyvolat potransfuzní reakci, pokud by pacient dostal krev s antigenem, proti kterému je tato protilátka namířena. Pokud je základní vyšetření, tzv. screening protilátek pozitivní, je třeba zjistit, o jaký typ protilátky se jedná. U těhotných žen je velmi důležité vyšetřit, zda nemají specifickou protilátku, a tak minimalizovat možnost poškození plodu. Pokud je zjištěn typ protilátky, provede se titrace a zhodnocuje se riziko hemolytického onemocnění novorozence. Gravidní žena se dle významnosti zjištěné protilátky, ve spolupráci s gynekologem, předává na specializované pracoviště. U hematologických pacientů s diagnozou AIHA se protilátky vyšetřují s cílem odhalit, o jakou autoprotilátku se jedná, zda o tepelnou čí chladovou. V případě potřeby transfuze krve je nutné autoprotilátku tzv. vysytit, tzn. navázat ji na vhodné (buď vlastní, nebo dárcovské) enzymem opracované erytrocyty, a poté vyšetřit, zda pacient nemá aloprotilátku. U dárců krve je nutné protilátky vyšetřit, aby nedošlo k eventuálním potransfuzním reakcím u příjemců transfuzních přípravků obsahujících plazmu. V první části mé práce se zabývám teoretickými poznatky z oboru imunohematologie. Popisuji základní pojmy a vztahy mezi nimi. V další části poskytuji přehled nejdůležitějších skupinových systémů na erytrocytech a možných protilátek. V praktické části se zabývám jednotlivými metodami vyšetření protilátek. Ve statistickém souboru na konci práce sumarizuji rok 2011 z pohledu vyšetření protilátek v imunohematologické laboratoři TO FNKV. Ke konci praktické části popisuji tři zajímavé případy z hlediska vyšetření protilátek. V závěru hodnotím statistické výsledky vzhledem k popisovaným teoretickým poznatkům. 8
2 Teoretická část 2.1 Základní imunohematologické pojmy 2.1.1 Antigen V imunohematologii jsou hlavní krevně skupinové antigeny nazývány aglutinogeny. Z chemického hlediska je to složitá organická makromolekula, která je schopna vyvolat imunitní odpověď. Mezi antigeny patří různé chemické struktury, nejčastěji proteiny (glykoproteiny), lipidy (fosfolipidy, glykolipidy) a ze sacharidů polysacharidy. Aby byla vyvolána imunitní odpověď, musí být antigen buď rozpustný v tělních tekutinách, nebo se nacházet na povrchu buněk. Rovněž musí být pro organismus cizí a mít určitou velikost. „Určité části molekuly antigenu jsou antigennější než jiné části téže molekuly. Tyto oblasti vyvolávají tvorbu specifických protilátek a nazývají se antigenními determinantami“ (Smetana a kol.,1992). Antigeny krevních skupin se nachází na povrchu buněčné membrány a mají zde různé funkce: •
transportní kanály pro vodu, močovinu, ionty,
•
regulace systému komplementu,
•
enzymatická aktivita,
•
receptory pro bakterie a viry,
•
jsou nutné pro udržení morfologických vlastností erytrocytů. „Na erytrocytech vznikají antigeny krevních skupin během ontogeneze: přibližně po 5.
týdnu antigeny AB0, po 8. týdnu antigeny Rh systému“ (Tesařová a kol., 2008). 2.1.2 Hapten Pokud antigen nemá dostatečnou velikost, sice se může s protilátkou vázat, ale nevyvolá její tvorbu. Takovýto antigen se nazývá hapten. Může se stát plnohodnotným antigenem pouze po vazbě na větší molekulu, tzv. nosič.
9
2.1.3 Protilátky V imunohematologii jsou přirozené protilátky (anti – A, anti – B) nazývány aglutininy. Protilátky jsou tvořeny organismem v imunitní reakci na antigen. Vlivem působení protilátek dochází k neutralizaci, opsonizaci a aktivaci komplementu. Neutralizace znamená blokování aktivity toxinů, virů a dalších mikroorganismů a to tak, že se protilátka váže na ty epitopy, které jsou odpovědné za toxické účinky, vniknutí mikroorganismů do buněk, či jejich přilnutí k buňkám. To, že se protilátky váží, tzv. opsonizují, na povrch mikroorganismů a antigenů, umožňuje a zkvalitňuje jejich pohlcení fagocyty a atakování NK – lymfocyty. Aktivace komplementu klasickou cestou je způsobena vazbou protilátky na antigen. „To přispívá k opsonizaci, chemotaxi fagocytů a rozvoji zánětlivé reakce a u citlivých mikroorganismů může docházet až k osmotické lýze membranolytickým komplexem komplementu“ (Hořejší, Bartůňková, 2005). 2.1.3.1 Chemická struktura Protilátky jsou glykoproteiny a nachází se volně v séru, lymfě nebo na povrchu B lymfocytů. S antigenem se váží pomocí slabých nekovalentních vazeb. Při elektroforéze se pohybují v gamaglobulinové frakci. Protože souvisí s imunitní reakcí, jsou nazývány imunoglobuliny. Termín imunoglobulin = širší pojem pro protilátku bez specifity. Termín protilátka = specifický imunoglobulin pro určitý antigen. Každá molekula protilátky se skládá ze čtyř bílkovinných řetězců vzájemně spojených disulfidickými vazbami. Dva a dva jsou stejné. Jeden pár má označení H, nazývají se těžké, mají delší řetězec a větší hmotnost. Další dva jsou lehké, označují se L, mají kratší řetězec a menší hmotnost. Jsou uspořádány do písmene Y (obr. 1). Těžké a lehké řetězce se člení na podjednotky – domény. Lehké řetězce vytváří jednu variabilní a jednu konstantní doménu. Těžké řetězce vytváří jednu variabilní a tři nebo čtyři konstantní domény. Na rozvětvenou neboli variabilní část, zvané Fab, se váže antigen svou antigenní determinantou. Je tvořena fragmenty lehkých a těžkých řetězců. Sekvence aminokyselin určuje, který antigen se zde bude vázat. Koncová část se označuje jako konstantní oblast Fc. Je tvořena těžkými řetězci a váže se na buňky, mající pro ni receptor (buňky tkání, imunitního systému, komplementu). 10
Dle uspořádání aminokyselin se řetězce dělí na izotypy. Lehké řetězce jsou kappa a lambda, těžké řetězce alpha, delta, epsilon, gamma a mí. Řetězce se vzájemně kombinují. Oblast spojení těžkých řetězců disulfidickými můstky je nazývána pantová (otočná) a je citlivá k působení enzymů. V této části dochází ke štěpení protilátek (obr. 2). Papain ji štěpí na 3 fragmenty – dva Fab fragmenty a jeden Fc fragment. Pepsin oproti tomu štěpí protilátku na 2 fragmenty – dva spojené fragmenty Fab a torzo Fc části. Tato protilátka nemá biologické vlastnosti, protože jí chybí Fc část. Části imunoglobulinových molekul, lišící se strukturou vazebných míst ve variabilní části, se nazývají idiotopy. „Identické imunoglobulinové molekuly se vyznačují určitým společným idiotypem (souhrn idiotopů)“ (Hořejší, Bartůňková, 2005). Typy protilátek s geneticky daným odlišným uspořádáním v Fc oblasti těžkého řetězce se nazývají allotypy.
Obr. 1: Struktura imunoglobulinu
Obr. 2: Štěpení protilátek
2.1.3.2 Tvorba protilátek Tvorba protilátek patří do specifické, humorální imunity. Protilátky jsou tvořeny organismem v imunitní reakci na antigen. Na povrchu B lymfocytů jsou antigenně specifické receptory pro antigen – BCR. „Komplex BCR se skládá z vlastního povrchového imunoglobulinu (rozeznává antigen) a asociovaných signalizačních molekul“ (Hořejší, Bartůňková, 2005). Po vazbě antigenu na BCR receptor dojde ke stimulaci B – lymfocytu. Antigen je pohlcen APC buňkou, např. 11
dendritickou buňkou a dojde k vystavení jeho peptidových fragmentů na molekulách HLA II. třídy. Tímto je aktivován T – lymfocyt, který má na svém povrchu TCR receptor. Úplná aktivace lymfocytu vyžaduje ještě další kostimulační a signalizační molekuly. Prezentace antigenu Th prekurzorům vede ke tvorbě klonů antigenně specifických Th 2 buněk. Tyto rozeznají B – lymfocyty, které jsou antigenně stimulované a poskytují jim signály (cytokiny), které způsobí pomnožení a diferenciaci na plazmatické buňky, které jsou konečným stádiem B – lymfocytů a produkují protilátky. 2.1.3.3 Rozdělení protilátek a) dle původu •
lidské
•
zvířecí (xenoséra)
•
rostlinné (lektiny) – rostlinné protilátky, sérologickými vlastnostmi se podobají živočišným antisérům
•
monoklonální – tyto protilátky jsou produktem jednoho klonu plazmatických buněk, jsou jednoho izotopu a mají jednu specifitu. In vivo vznikají monoklonální protilátky při plazmocytomu (myelomu). In vitro je možno tyto protilátky získat izolací klonů B – lymfocytů, které produkují požadovaný typ protilátky. B – lymfocyty žijí krátkou dobu, proto fúzují s myelomovými buňkami, které žijí neomezeně v tkáňové kultuře. Toto spojení se nazývá hybridom. Hybridní buňka roste v tkáňové kultuře a produkuje stejné protilátky jako původní B – lymfocyt.
b) dle specifity • specifické – reagují obvykle s jedním antigenem •
nespecifické (polyspecifické) – reagují se všemi či většinou antigenů
c) dle způsobu vzniku • přirozené pravidelné – vznikají přirozeně, bez setkání organismu s antigeny erytrocytů, např. anti – A, anti – B •
přirozené nepravidelné – vznikají u lidí, kterým chybí odpovídající antigen, např. anti – H, anti – P1, anti – A1
•
imunní– vznikají při těhotenství, transfuzi, transplantaci
•
autoprotilátky – proti vlastním antigenům; mnoho autoprotilátek nezpůsobuje žádné 12
klinické problémy, ale např. u autoimunní hemolytické anémie způsobují zkrácené přežívání erytrocytů; rozlišujeme AIHA s tepelnými protilátkami, AIHA s chladovými protilátkami a AIHA smíšeného typu, kdy se vyskytují současně chladové i tepelné autoprotilátky d) dle sérologické reakce • kompletní– takové protilátky, které krvinky aglutinují přímo, většinou třídy IgM •
inkompletní– většinou třídy IgG nebo IgA, k aglutinaci je třeba jim pomoci. „Jako pomocný prostředek se využívá snížení množství elektrolytů (např. NaCl) nebo zvýšení množství bílkovin (např. hovězí albumin), popř. umělých koloidů (např. dextran) v prostředí, ve kterém jsou krvinky resuspendovány. Jiným způsobem snižování negativního náboje krvinek, a tím přibližování krvinek je enzymové natrávení povrchu krvinek. Za přispění pomocné cesty se inkompletními protilátkami dá dosáhnout stejně silné aglutinace jako protilátkami kompletními“ (Hrubiško a kol., 1983). K průkazu inkompletních protilátek se také využívá protilátek proti lidským sérovým globulinům, tzv. AGH séra (serum antiglobulinum humanum), která reagují s protilátkami navázanými na krvinkách, a proto je shlukují. AGH sérum zavedl do praxe Coombs, je tedy nazýváno Coombsovo sérum a vyšetřovací testy Coombsovy antiglobulinové testy. Pro průkaz protilátek navázaných na krvinky „in vivo“ slouží přímý antiglobulinový test (PAT) a pro průkaz protilátek navázaných na krvinky „in vitro“ slouží nepřímý antiglobulinový test (NAT).
•
lysiny – po navázání na antigen váží na sebe komplement, aktivují ho a vyvolávají hemolýzu krvinek
e) dle optimální teploty při reakci •
chladové – teplota reakce 4 °C
•
tepelné – teplota reakce 37 °C
•
pokojové – teplota reakce 20 – 24 °C
2.1.3.4 Třídy imunoglobulinů Podle typu těžkého řetězce rozlišujeme IgA (alpha), IgM (mí), IgG (gama), IgD (delta), IgE (epsilon). Z lehkých řetězců převažují řetězce kappa nad lambda, v poměru 3 : 2. 13
Základní jednotkou je monomer – 2 těžké a 2 lehké řetězce. „Molekuly některých tříd imunoglobulinů (IgM, IgA) se skládají z několika základních jednotek, které jsou spojeny strukturně zcela odlišným řetězcem zvaným J“ (Hořejší, Bartůňková, 2005). a) IgM První typ imunoglobulinu, který tvoří zralý imunitní systém a je vytvářen na začátku primární imunitní odpovědi. Celkové množství v intravaskulárním poolu je 10 %. Molekulová hmotnost je 900 kDa, neproniká tedy placentou ani do tkání. Vyskytuje se jako pentamer spojený J řetězcem. Jako pentamer má 10 vazebných míst, ale pokud mají vazebná místa nízkou afinitu k antigenům, váže pouze 5 antigenů. IgM po navázání na antigen dobře váže komplement a aktivuje ho klasickou cestou. Je to kompletní protilátka, tzn., že krvinky aglutinuje přímo, protože maximální rozpětí jejich Fab zakončení je až 35 nm a krvinky resuspendovány ve fyziologickém roztoku jsou od sebe vzdáleny 20 – 30 nm, tudíž je tento imunoglobulin překlene. Mezi IgM patří přirozené protilátky anti – A, anti – B a chladové protilátky. b) IgG Tento imunoglobulin je typický při sekundární imunitní odpovědi. Tvoří 70 – 75 % celkových imunoglobulinů. Vyskytuje se intravaskulárně i extravaskulárně. Molekulová hmotnost je 155 kDa, proniká tedy placentou. Vyskytuje se jako monomer a má 2 vazebná místa pro antigen. „IgG molekuly je možné rozdělit na podtřídy IgG1, IgG2, IgG3, IgG4. Ty se liší pořadím aminokyselin H řetězce. Jejich rozdíly vedou k odlišným sérologickým vlastnostem protilátek: např. IgG1 a IgG3 dobře váže komplement, IgG2 nedostatečně, IgG4 vůbec ne“ (Tesařová a kol., 2005). Je to inkompletní protilátka, k viditelné aglutinaci potřebuje pomocné prostředky (viz kapitola 2.1.3.3., bod d), protože svými Fab zakončeními je schopna překlenout vzdálenost pouze 14 – 18 nm. c) IgA Je dalším typem imunoglobulinu vznikající v průběhu imunizace. Tvoří 15 –20 % celkových imunoglobulinů. Molekulová hmotnost je 160 – 1000 kDa a vyskytuje se ve dvou formách – sérové a slizniční, kde tvoří ochranu před mikroorganismy. Slizniční IgA je ve formě dimeru spojené J – řetězcem. Sérový může být jako monomer, dimer i trimer. Není to aglutinin, neváže komplement, ale působí jako opsonin.
14
d) IgD Koncentrace v séru je nízká, okolo 1 %, jeho molekulová hmotnost je 180 kDa. Ve formě monomeru se vyskytuje jako povrchový imunoglobulin na B lymfocytech, kde má funkci receptoru pro antigen. Přesná biologická funkce stále není známa. e) IgE Koncentrace v séru je pod 1 % a molekulová hmotnost je 190 kDa. „Uplatňuje se především v obranných reakcích proti mnohobuněčným parazitům na sliznicích a je hlavní příčinou alergických (atopických) reakcí. Vysokoafinitní receptory pro IgE se nacházejí na povrchu žírných buněk a bazofilů“ (Hořejší, Bartůňková, 2005). 2.1.3.5 Kinetika protilátky Kolem 4. dne po expozici antigenem dochází k primární imunitní odpovědi. Z B – lymfocytů se vytváří plazmatické buňky, které produkují protilátku IgM. Maximálního titru dosahuje 7. až 10. den, poté se snižuje. Kromě plazmatických buněk vznikají i paměťové buňky, které jsou zodpovědné za sekundární imunitní odpověď. Při ní se, po opakovaném styku s antigenem, zvyšuje produkce protilátky až tisíckrát. Jsou už specifické a typu IgG. 2.1.4 Komplement V imunohematologii je velmi důležitý, je vázán protilátkami IgG, IgM a jeho působením dochází k lýze buněk, tedy i erytrocytů. Protilátky IgA, IgD, IgE jej neváží. Je to komplex asi 30 sérových a membránových proteinů, hlavními složkami je 9 proteinů označovaných C1 – C9, z toho nejdůležitější je C3 složka a enzym C3 konvertáza. Vyskytují se běžně v séru v inaktivní formě a za vhodných podmínek se aktivují a rozbíhá se enzymatická kaskádovitá reakce, kdy jednotlivé meziprodukty reakce aktivují další složky. Existují dvě cesty aktivace komplementu – klasická a alternativní. Klasická cesta začíná vazbou C1 složky na komplex antigen – protilátka. Tato cesta vyžaduje přítomnost složek C4 a C2, jejichž fragmenty vytvoří klasickou C3 konvertázu. Druhá cesta aktivace – alternativní, tyto složky nevyžaduje, protože v séru je C3 proaktivátor (beta globulin), který reaguje s C3b, jenž je produkován neustále. Reakcí těchto a dalších pomocných složek vzniká C3 konvertáza, která štěpí další molekuly C3 na C3a C3b a spouští se kaskádovitá reakce, jejímž důsledkem je terminální produkt – soubor proteinů C5b, C6, C7, 15
C8, C9 (membranolytický komplex). Tento komplex perforuje membrány a dochází k osmotické lýze buněk. Meziprodukty enzymatického štěpení se účastní celé řady pochodů– opsonizace, chemotaxe a aktivace B – lymfocytů. Štěpení C3 je spontánním dějem a mohlo by tedy docházet k poškozovaní nejen cizorodých částic, ale i vlastních buněk. V organismu proto existují regulační mechanismy, tzv. inhibitory, které brání rozvoji kaskády samovolných reakcí. In vitro je možné aktivitu komplementu, který je nežádoucí při imunohematologických vyšetřeních, inaktivovat. Inaktivace se provádí zahříváním séra na 56 °C, stáním nebo přidáním citrátu sodného ke vzorku krve.
2.2 Reakce antigen – protilátka Protilátka a antigen se spolu váží slabými a nekovalentními vazbami, mezi ně patří vazby vodíkové, van der Waalsovy, hydrofobní a iontové. Vytvořený imunokomplex je reverzibilní. Na povrchu červených krvinek je negativní náboj, tzv. zeta potenciál, ten způsobuje, že se erytrocyty vzájemně odpuzují Afinita – vyjadřuje sílu interakce mezi jedním vazebným místem protilátky a jedním epitopem antigenu. Je přímo úměrná specifitě protilátky. Avidita – vyjadřuje sílu interakce mezi polyvalentní protilátkou a polyvalentním antigenem. Čím větší afinita, tím větší avidita. Desetivalentní molekuly IgM se váží na antigen s velkou aviditou, ale afinita jednotlivých vazebných míst k epitopům je nízká. Imunohematologické sérologické testy používané na vyšetření komplexů antigen – protilátka jsou aglutinace, testy na průkaz hemolyzinů, inhibice aglutinace, méně často precipitace a ELISA. 2.2.1 Aglutinace Tvoří základ imunohematologických vyšetření. Jsou používány při vyšetření krevních skupin, erytrocytárních antigenů, protilátek a předtransfuzních vyšetření. Aglutinace je shlukování krvinek v izotonickém roztoku NaCl, při reakci se vytváří prostorová mřížka, v níž jsou erytrocyty, nesoucí na svém povrchu příslušný antigen, spojovány se dvěma a více vazebnými místy protilátek. Erytrocyty nesou ve své membráně velký počet receptorů a aglutináty vznikají snadno. Aglutinační reakce má dvě fáze. 16
2.2.1.1 První fáze Dochází k navázání protilátky na erytrocyt = senzibilizace. Tato část reakce je rychlá, reverzibilní, neviditelná a je ovlivněna různými faktory. a) Poměr koncentrací antigenu a protilátky Při nadbytku protilátky dochází k falešně negativním reakcím, všechny antigenní determinanty jsou obsazené = fenomén prozóny. Tomuto je možné předejít ředěním séra a optimálním poměrem antigenu a protilátky. b) Teplota IgM protilátky optimálně reagují při teplotě od 4 – 27 °C. IgG protilátky při teplotě od 30 – 37°C. Jako klinicky významné se berou protilátky reagující při 37 °C. c) pH 6,5 – 7 d) Čas „Doba inkubace je čas potřebný k dosažení rovnováhy pro různé protilátky, závisí na třídě imunoglobulinu a schopnosti jeho připojení ke specifickému antigenu“ (Tesařová, 2008). 25 % protilátky se naváže na antigen v prvních 15 minutách a zbytek se naváže do 1 hodiny. e) Koncentrace NaCl Snížením koncentrace NaCl dochází ke snížení odpudivých sil mezi antigenem a protilátkou a dochází ke zlepšení vazby protilátky. 2.2.1.2 Druhá fáze Je pomalejší než první fáze. Protilátky spojují antigenní receptory a dochází k vytvoření agregátu erytrocytů – viditelná fáze. V suspenzi fyziologického roztoku se mezi krvinkami, díky elektrostaticky negativně nabitým antigenům, vytváří prostory cca 20 – 30 nm. Díky nim nedochází ke shlukování krvinek. Při reakci antigen – protilátka in vitro je třeba tento prostor překlenout. Toto není problém, pokud se jedná o kompletní protilátku IgM, která 17
má rozpětí svých Fab 35 nm. Inkompletní protilátky IgG nebo IgA, mající rozpětí 14 – 18 nm, se sice naváží na antigen, ale nevzniká viditelná reakce. Reakci je třeba „pomoci“: a) Proteolytickými enzymy Papain, bromelin a ficin se přidávají do reakce za účelem odstranění kyseliny sialové z povrchu erytrocytů kvůli snížení zeta potenciálu, a tedy zrušení negativního náboje, čímž je umožněno jejich větší vzájemné přiblížení. Erytrocyty, ošetřené enzymem, jsou také více aglutinabilní pro IgG molekuly. Při použití enzymu spočívá zvýšené riziko v poškození některých antigenů – M, N, S, s, Lua a Duffy. b) AGH sérem Antiglobulinum humanum = protilátka proti lidské protilátce. Detekují se inkompletní protilátky navázané na erytrocytech. Séra AGH jsou polyspecifická nebo monospecifická. Polyspecifická jsou směsí protilátek proti IgG a komplementu, monospecifická séra obsahují protilátky proti určitému imunoglobulinu nebo složce komplementu. c) Centrifugací Přispívá k vzájemnému přibližování krvinek a pevnější vazbě, zároveň urychluje reakci. d) Snížením negativního náboje krvinek Snížení se dosáhne pomocí zvýšeného množství bílkovin, umělých koloidů, např. dextranu. e) Roztokem LISS Roztok o nízké iontové síle, který zkracuje inkubační dobu, snižuje iontovou sílu prostředí a zvyšuje počet spojení protilátek. Protilátky o nízkém titru jsou v prostředí LISS lépe detekovány. f) Přidáním PEG – polyethylenglykol Jeho působením jsou z okolí erytrocytu odstraňovány molekuly vody a tím se lépe váží protilátky.
18
g) Chemickou modifikací IgG molekuly Po úpravě disulfidických vazeb v pantové oblasti protilátky, reaguje IgG v solném prostředí přímo. h) Pozitivně nabitými molekulami Pozitivně nabité molekuly neutralizují negativní náboj na krvinkách a uvolňují molekuly vody a tím usnadňují aglutinaci. 2.2.2 Precipitace Na rozdíl od aglutinace je při precipitaci antigen rozpustný a protilátky jsou namířeny proti bílkovinám nebo jiným rozpustným antigenům. Dochází k vytvoření nerozpustného precipitátu. Ve zkumavce je vidět jako sediment a na agaru jako interakční linie. Při reakci je nutné dodržet podmínky jako při aglutinaci, tzn. teplotu, pH, iontovou sílu, poměr koncentrací. Je žádoucí dosáhnout bodu ekvivalence, stavu, kdy je optimální poměr antigenu a protilátky, precipitát se pak tvoří nejrychleji. Precipitace je základem metod imunodifuze a imunoelektroforézy. V imunohematologii nachází precipitace využití při zjišťování skupinových vlastností A a B v různých tělních tekutinách, např. ve slinách sekretorů. 2.2.2.1 Imunodifuze Je založena na difuzi látek v prostředí koncentračního gradientu. Antigeny a protilátky difundují agarovým nebo agarozovým gelem a v místě, kde dosáne koncentrace antigenu a protilátky optimálního poměru, dojde k vytvoření precipitační linie. 2.2.2.2 Imunoelektroforéza Jedná se o kombinaci dvou metod. Nejdříve se provede elektroforéza séra, poté se do agarozového gelu vyřízne žlábek, naplní se antisérem proti hledanému antigenu a nechá se proběhnout imunodifuze. Důsledkem je vytvoření precipitační linie.
19
2.2.3 Hemolýza Hemolýzu vyvolávají pouze protilátky IgM a IgG. Protilátky se naváží na antigen, dojde k aktivaci komplementu klasickou cestou a konečným vyústěním je kaskádovitá reakce, na jejímž konci je proděravění membrány erytrocytu. Intracelulární hemoglobin je uvolněn do okolí a krvinka se rozpadne. Hemolýza je pozitivním výsledkem testu, protože prokazuje přítomnost protilátek, které aktivují komplement. Při reakci je důležitá teplota. Při jejím poklesu se hemolýza zpomaluje až nakonec ustává. Při 0 °C se komplement naváže, ale nedojde k aktivaci. Při teplotě nad 37 °C se hemolýza urychluje, ale se stoupající teplotou klesá stupeň lýzy. Při 56 °C je komplement inaktivován. Pro aktivaci komplementu jsou důležité Ca2+ ionty a pH okolo 7,0. Proto je komplement inaktivní v plazmě obsahující chelatační látky. 2.2.4 Inhibice hemaglutinace Inhibicí dříve zjištěné aglutinace se prokazuje přítomnost antigenu nebo protilátky. Na rozpustné antigeny ve slinách se naváží odpovídající protilátky a po přidání vhodných erytrocytů nedojde k aglutinaci, protože protilátka byla spotřebována vazbou na rozpustný antigen. 2.2.5 ELISA Rutinně se používá pouze omezeně. Lze jí prokázat jak antigeny tak protilátky. K detekci reakce se používá enzym, který je navázán na specifickou protilátku. Do reakce se přidá vhodný substrát, který je enzymem rozložen a vzniklá barevná reakce je detekována spektrofotometrem.
2.3 Skupinové systémy erytrocytů 2.3.1 AB0 systém AB0 systém a k němu patřící krevní skupiny jsou ze všech skupinových systémů nejstarší. Mají největší význam pro transfuziologii a proto se označují jako hlavní. AB0 20
systém je jediným systémem, ve kterém jsou přirozené pravidelné protilátky = aglutininy anti – A, anti – B. Protilátky se nachází v séru těch osob, které nemají příslušný antigen, neboli aglutinogen. Objev AB0 systému se datuje k roku 1901 a je spojen se jménem Karla Landsteinera. Ten předpokládal existenci tří krevních skupin – A, B, C. Teprve český vědec Jan Jánský objevil, že existují čtyři krevní skupiny A, B, 0, AB. Zastoupení antigenů a protilátek v AB0 systému sumarizuje tabulka 1 a výskyt krevních skupin tabulka 2.
Krevní skupina Antigeny na krvinkách Protilátky v séru / plazmě A
A
anti – B
B
B
anti – A
0
žádné
anti – A, anti – B
AB
A, B
žádné
Tab. 1: Krevní skupiny AB0, antigeny a protilátky
Krevní skupina
Výskyt
A1
32 %
A2
10 %
B
18 %
0
32 %
AB
8%
Tab. 2: Výskyt krevních skupin AB0 2.3.1.1 Geny systému AB0 V systému AB0 jsou tři základní alely: A, B, 0. Geny jsou umístěny na 9. chromozómu. Se systémem AB0 jsou spjaté další geny, nacházející se na 19. chromozómu. Jde o geny H, h a geny Se, se, které jsou spojené se sekretorstvím. Nositel genové kombinace SeSe a Sese vylučuje AB0 substance do tělních tekutin. Označuje se jako sekretor – 80 % populace. Homozygot sese je nonsekretor – 20 % populace. Alely A a B jsou vůči sobě kodominantní a dominantní nad alelou 0. Alely se homozygotně nebo heterozygotně kombinují a tak vznikají fenotypy A, B, 0, AB. Fenotyp A má genotyp AA nebo A0. Fenotyp B má genotyp BB nebo B0. Fenotyp 0 má genotyp 00. 21
Fenotyp AB má genotyp AB. 2.3.1.2 Antigeny systému AB0 Na membráně erytrocytů se v systému AB0 nachází tři antigeny – A, B, H. Z chemického hlediska jsou postranními řetězci polysacharidů. Antigeny nejsou přímým produktem genu, ale geny kódují vznik enzymu transferázy, který katalyzuje přenos specifického monosacharidu ke dvěma typům prekurzorové jednotky. Typ 1 se nachází v tělních tekutinách, tkáních a může být adsorbován na erytrocyty, typ 2 je převážně na erytrocytech. Alela A kóduje vznik enzymu, který přenáší N – acetylgalaktosamin. Alela B kóduje vznik enzymu specifického pro D – galaktozu. Gen H má vliv na enzym přenášejícím fukozu a funguje jako biosyntetický předstupeň. •
H – transferáza katalyzuje připojení fukozy k jednomu ze dvou typů prekurzorového řetězce a vytvoří se H substance, čímž vzniká krevní skupina 0.
•
A – transferáza připojuje N – acetyl – galaktosamin k H substanci a vzniká sacharid typický pro skupinu A.
•
B – transferáza připojuje D – galaktozu k H substanci a vzniká sacharid typický pro skupinu B. Gen 0 je němý a nemá transferázovou aktivitu. Nevzniká tedy žádný enzym a H
substance je nemodifikována. Gen h je amorfní, v homozygotní formě se nevytváří žádná H substance, tudíž se nepřipojují žádné cukry, nevzniká žádný antigen H, A, B. Tento fenotyp se označuje jako bombayský. V séru těchto lidí mohou být protilátky anti – A, anti – B, anti – H. Tito jedinci nesmí dostat transfuzi krevní skupiny 0, ale právě bombayský fenotyp. Prekurzorová substance H a antigeny A a B jsou prokazatelné již v 6. týdnu embryonálního života. Plné exprese dosahují mezi 1. až 2. rokem věku. a) Skupina A Skupina A se na základě kvalitativních a kvantitativních rozdílů mezi A antigeny a i vzhledem ke kvantitativnímu poměru k H antigenu, rozděluje na podskupiny. Nejčastější jsou A1 (78 %), A2 (21 %) a slabé podskupiny (A3, Ax, Aend, Am, Ay, Ael). Toto platí i pro skupinu
22
AB. V podskupině A1 je nejvíce antigenu A a skoro žádný antigen H. V dalších podskupinách je méně antigenu A, více antigenu H a může se vyskytovat protilátka anti – A 1. Rozdíl mezi podskupinami je i v kvalitativním rozdílu ve struktuře polysacharidu. Vyšetření podskupin spočívá ve vyšetření krvinek s lektinem anti – A1 nebo lektinem anti – H. Rovněž také v nálezu přirozených nepravidelných protilátek anti – A 1 a anti – H v séru a v průkazu substance A a H v sekretech vylučovatelů. b) Skupina B I ve skupině B jsou podskupiny, např. B3, Bx, Bm, Bel. B podskupiny jsou vzácnější než u A antigenu. Ze sérologických reakcí je typické, že se zeslabuje reakce s anti – B, přibývá reakce s anti – H a v séru se mohou se vyskytovat protilátky anti – B. 2.3.1.3 Protilátky systému AB0 a) Přirozené pravidelné V systému AB0 se vyskytují přirozené pravidelné protilátky anti – A a anti – B. Zastoupení u skupin ukazuje tabulka 1. Tyto protilátky nemá člověk vrozené, ale po narození se setkává s bakteriemi, které mají podobné imunoreaktivní části jako ABH molekuly. Imunitně dobře reagující jedinec si začne do 6. měsíce věku proti nim vytvářet protilátky, ne však proti vlastním antigenům. Vyšetření probíhá pomocí typových erytrocytů, nesoucích příslušné aglutinogeny. U dětí do 6 měsíců se vyšetření aglutininů neprovádí, mohou ještě interferovat AB0 protilátky získané od matky. Přirozené pravidelné protilátky jsou typu IgM a reagují při pokojové teplotě. Po imunizaci (u plodu, novorozence v průběhu těhotenství, po inkompatibilní transfuzi) se mohou vytvářet imunní protilátky IgG. b) Přirozené nepravidelné Někteří jedinci skupiny A1 nebo A1B mohou vytvářet přirozenou nepravidelnou protilátku anti – H. Stejně tak jedinci skupiny A 2 nebo A2B mohou vytvářet přirozenou nepravidelnou protilátku anti – A1 (tab. 3). Protilátky jsou většinou chladového typu.
23
Reakce s krvinkami
Krevní skupina A1 nebo A1B s Krevní skupina A2 nebo A2B s přirozenou nepravidelnou anti – H přirozenou nepravidelnou anti – A1
0
pozitivní
negativní
A1
negativní
pozitivní
A2
pozitivní
negativní
B
pozitivní
pozitivní
Tab. 3: Přirozené nepravidelné protilátky 2.3.1.4 Vylučovatelství Skupinové vlastnosti H, A, B se nenacházejí pouze na krvinkách, ale i v plazmě a v tělesných tekutinách (sliny, trávící šťávy). Izolované substance se nazývají Witebského skupinové substance. Vylučované vlastnosti jsou z chemického hlediska glykoproteiny a jsou rozpustné ve vodě. Lidé, kteří substance vylučují, jsou vylučovatelé = sekretoři a ti, co nevylučují jsou nevylučovatelé = nonsekretoři. Vylučovatelství je podmíněno geny Se a se. S vylučovatelstvím souvisí skupinový systém Lewis (Le). Vylučovatel má genotyp SeSe nebo Sese a jsou Le a negativní a Leb pozitivní i negativní. Nevylučovatel nese genotyp sese a je Le a negativní i pozitivní a Leb negativní. Vylučovatel vylučuje do svých tělních tekutin antigen H a pak antigen A nebo B dle své skupinové příslušnosti. Nevylučovatel nevylučuje žádný z A, B a H antigenů. Význam vylučovatelství pro imunohematologii je v možnosti vyšetření krevní skupiny ze slin (inhibice hemaglutinace) – využití v soudním lékařství. Skupinové vlastnosti lze prokázat i při 1000 násobném zředění slin a jsou odolné vůči teplotě i tlaku. 2.3.1.5 Význam AB0 systému pro transfuzi AB0 systém je z hlediska transfuze nejdůležitějším systémem, protože má pravidelné protilátky. Dárci krevní skupiny 0 jsou univerzální dárci erytrocytů a dárci krevní skupiny AB jsou univerzální příjemci erytrocytů. Preferuje se stejnoskupinová transfuze, ale z důvodu nedostatku krve je možné podat nestejnoskupinovou transfuzi dle daných pravidel (tab. 4, ). Při transfuzi plazmy jsou pravidla opačná (tab. 5). Univerzálním dárcem je nositel krevní skupiny AB, univerzálním příjemcem nositel krevní skupiny 0.
24
Pacient
Erytrocytární koncentrát
krevní skupiny A
krevní skupiny A, 0
krevní skupiny B
krevní skupiny B, 0
krevní skupiny 0
krevní skupiny 0
krevní skupiny AB
krevní skupiny AB, A, B, 0
Tab. 4: Varianty transfuze erytrocytů
Pacient
Plazma
– krevní skupiny A
– krevní skupiny A, AB
– krevní skupiny B
– krevní skupiny B, AB
– krevní skupiny 0
– krevní skupiny 0, A, B, AB
– krevní skupiny AB
– krevní skupiny AB
Tab. 5: Varianty transfuze plazmy Při transfuzi trombocytového koncentrátu platí pravidla jako při transfuzi plazmy. Při nedostatku trombocytárních přípravků dané krevní skupiny je možno podat trombocytový koncentrát krevní skupiny 0, jen pokud má dárce nízký titr aglutininů anti – A a anti – B. Další možností je transfuze trombocytů krevní skupiny 0 v náhradním roztoku. 2.3.2 Rh systém Druhým systémem, který je v imunohematologii velmi důležitý, je systém Rh. Jedná se o nejpolymorfnější a nejimunogenější krevní skupinový systém. Než byl objeven, byla většina potransfuzních reakcí a hemolytických onemocnění novorozenců způsobena právě Rh systémem. V roce 1939 byly objeveny neznámé protilátky u ženy, která porodila dítě, jenž zemřelo kvůli HON. V roce 1940 Landsteiner a Wiener imunizovali králíka červenými krvinkami opice Macacus Rhesus. Imunní protilátka aglutinovala erytrocyty 85 % lidí. Reagovala s antigeny na povrchu lidských erytrocytů i rhesus erytrocytů. Odtud označení Rh faktor. Byla zjištěna souvislost mezi tímto faktorem a protilátkami u lidí Rh negativních, kteří dostali Rh pozitivní krev. 25
Jedná o složitý systém, zvaný Rh komplex, z nichž nejdůležitější je antigen D. Pokud se tento antigen u člověka na krvinkách vyskytuje, označuje se jedinec jako Rh pozitivní (RhD + ) – 85 % populace bělochů. Pokud není, označuje se člověk jako Rh negativní (RhD – ) – 15 % populace bělochů. 2.3.2.1 Geny Rh systému Tento systém je kódován na 1. chromozomu, na třech těsně spjatých lokusech. Na prvním lokusu je gen C – alely C a c. Na druhém lokusu je gen D – alely D a d. Na třetím lokusu je gen E – alely E a e. Může se vyskytnout stav, kdy chybí jedna i více alel. V případě, že chybí všechny alely, jde o tzv. Rh null syndrom, který se může projevovat hemolytickou anémií. Na určitém lokusu mohou být vždy jen 2 alely ze 6, proto počet možných genových kombinací je 8: cde, Cde, cDe, cdE, Cde, cDE, CdE, CDE. 8 haplotypů je párováno do 36 genotypů. RH je označení pro geny kódující RhD nebo RhCE protein a RHAG je označení pro geny kódující glykoproteiny asociované s Rh – RhAG. 2.3.2.2 Antigeny Rh systému Nejprve byl rozpoznán antigen D, později byly zjištěny další antigeny – C, c, E, e. Antigeny nejsou stejnorodé, skládají se z více podjednotek nebo se na jejich místě může vyskytovat více alel příbuzně specifických. Např. na D alele – slabší alela D, na alele C – alela CW, CU, CX, na alele E – alela EW, EU. „V současnosti tvoří Rh systém nejméně 45 nezávislých antigenů“ (Tesařová a kol, 2008). Mezi hlavní patří C, C W, c, D, E, e. Alela d neprodukuje antigen, neexistuje. Netvoří se ani protilátka anti – d, ale písmeno d se používá k označní D – negativního jedince. Rh antigeny jsou kodominantní. Existují různé nomenklatury označování antigenů, genů Rh systému. Používá se CDE nomenklatura a nomenklatura dle Fishera a Wienera, založená na faktu, zda je jedinec Rh pozitivní nebo Rh negativní, tedy R a r. Následující tabulky ukazují četnosti jednotlivých antigenů, Rh komplexů a fenotypů v populaci [tab. 6 – Výskyt jednotlivých antigenů ve střední Evropě (Pecka, Malý, Dejmková, 1998), tab. 7 – Četnost Rh komplexu ve střední Evropě (Eckstein, 1994), tab. 8 – Výskyt fenotypů Rh systému (Eckstein, 1994)].
26
Antigen Rh e D c C E CW
Četnost 96,5 % 82,2 % 80,3 % 64,6 % 27,2 % 2,1 %
Tab. 6: Výskyt jednotlivých antigenů ve střední Evropě
CDE nomenklatura CDE cde cDE cDe Cde cdE CDE CdE
Wienerova nomenklatura R1 r R2 R0 r' r'' RZ ry
Četnost 40,52 % 39,17 % 14,16 % 2,69 % 0,94 % 0,62 % 0,23 % 0,01 %
Tab. 7: Četnost Rh komplexu ve střední Evropě
Fenotyp CcDee CCDee ccddee CcDEe ccDEe ccDEE ccDee Ccddee ccddEe CCDEe CcDEE CCddee CcddEe
Wienerova nomenklatura R1r R1R1 rr R1R2 R2r R2R2 R0 r'r r''r RZR1 RZR2 r'r' r'r''
Tab. 8: Výskyt fenotypů Rh systému
27
Výskyt 33,97 % 17,18 % 15,34 % 12,42 % 11,89 % 2,18 % 2,17 % 0,74 % 0,49 % 0,19 % 0,06 % 0,01 % 0,01 %
a) Antigen D „D antigen představuje soubor epitopů na povrchu extramembranozní části RhD proteinu“ (Tesařová, 2008). Pokud se D antigen vyskytuje, je jedinec D pozitivní / Rh pozitivní. Při chybění genu D u bělochů, chybí i D polypeptid a nejsou D – epitopy a jedinec je D negativní / Rh negativní. V současné době rozeznáváme 37 epitopů. Exprese antigenu D na erytrocytech varíruje od nejsilnějšího u D ke slabšímu u D weak a D variantního. Změna exprese antigenu může být kvantitativní a kvalitativní. Kvantitativní změna = Weak D – dříve označovaný jako D U. Vzniká bodovými mutacemi RHD genů, jejichž důsledkem jsou změny v intramembranózní části proteinu a následně nezabudování proteinu do Rh komplexu. Kvalitativní změna = Variant D. Změny jsou v extramembranózní části proteinu a jsou důsledkem přeskupení RHD nebo RHCE genů, bodových mutací, nonsence mutací a delecí nukleotidů. Následkem toho mohou chybět některé epitopy, mění se tvar proteinu a pro jedince s normálním antigenem se jeví jako cizí. Nejčastější a nejzávažnější variantou pro potransfuzní reakce a HON je DVI varianta. Pokud se člověk, který má D weak nebo D variant stane pacientem, transfundují se mu D negativní erytrocyty. Ale pokud by se takovýto člověk stal dárcem erytrocytů, musí být tento krevní přípravek považován za D pozitivní.
b) Antigeny C, c a E, e Jedná se o alelické páry genů. „Polymorfismus C, c je dán substitucí 4 aminokyselin proteinu RhCcEe, polymorfismus E, e je dán záměnou pouze jediné aminokyseliny“ (Tesařová, 2008). Slabé C se může vyskytovat u haplotypu DCE, C u u haplotypu Dce a EW u haplotypu DcE. Pokud jsou c a e, C a e, C a E, c a E tvořeny stejným RHCE genem, mohou vznikat společné CE antigeny. Ke společným antigenům patří antigeny ce (f), Ce, CE, cE. c) Antigeny VS a V Typická je nízká frekvence výskytu. Dochází k náhradě jedné aminokyseliny v transmembránové části a jsou spojovány se slabým e antigenem.
28
d) Antigen G Tento antigen se nachází na RhD i RhC proteinech. e) Antigeny CW a CX Vznikají konformačními změnami proteinu jako následek záměny jediného nukleotidu RHCE. Erytrocyty CW pozitivní jsou téměř vždy C pozitivní, ale antigen je na nich slabší. Vyskytuje se u haplotyů DCe, ale i dCe, dCE, DCE. CX je produkt Dce haplotypu. 2.3.2.3 Protilátky Rh systému Rh protilátky jsou zřídkakdy přirozené, nejčastěji bývají imunního typu IgG. A to následkem nevhodné transfuze nebo po těhotenství. Mohou být tedy příčinou časného i pozdního typu potransfuzní reakce a hemolytického onemocnění novorozence. Reagují v enzymatických testech a v NAT. Protilátky anti – e, anti – Ce, anti – f se mohou vyskytovat jako tepelné autoprotilátky při autoimunní hemolytické anémii. a) Anti – D Jde o nejčastější protilátku, je typu IgG. V současné době ztrácí význam z důvodu převodu identické krve a profylaxe matek a těhotných žen. Rh negativním ženám, které porodily Rh pozitivní dítě, se preventivně aplikuje anti – D protilátka. „Jde o klinicky navozenou supresi protilátkami zprostředkované imunitní odpovědi“ (Tesařová, 2008). Mechanismem suprese je maskování D antigenu protilátkou, destrukce opsonizovaných erytrocytů a zeslabení protilátkové odpovědi vlivem na antigen – specifické B lymfocyty. Profylaxe je podána i při potratech a invazivním gynekologickém vyšetření a úrazech břišní dutiny. Jde o to, aby erytrocyty RhD + plodu, které se při fetomaternálním krvácení dostanou do oběhu matky, nezpůsobily tvorbu imunní protilátky anti – D. b) Anti – C, CW Anti – C je zpravidla směs protilátek anti – CC W, často je provázena protilátkou anti – D. Vyskytuje se u Rh negativních osob, D pozitivní ji tvoří zřídka. Je to způsobeno tím, že C 29
je slabý antigen a díky obsahu G antigenu na erytrocytech jej jedinci D pozitivní a C negativní nerozeznávají jako cizí. Anti – CW je vzácná protilátka, která se vytvoří u osob se znakem C, které jsou C W negativní. c) Anti – E Po anti – D nejčastější protilátka, vyskytují se často společně. Může být i přirozená. d) Anti – c Často je provázena protilátkou anti – E. Vytváří se převážně u osob s fenotypem R 1R1 nebo r'r'. e) Anti – e Velmi vzácná protilátka, protože jedinců, kteří mají antigen e je 96,5% f) Anti – G „Protilátky se specifitou anti – C + D mohou obsahovat anti – G složku a mohou se vyskytovat jako anti – D + G, anti – C + D + G, anti – C + G. Anti – C + D u žen imunizovaných v graviditě (manžel je C negativní) má charakter protilátky anti – D + G. Podobně D negativní příjemce po transfuzi D negativní C pozitivní krve si vytvořil anti – C + G, imitující anti – C + D“ (Tesařová, 2008). 2.3.2.4 Význam Rh systému pro transfuzi D antigen je velmi silný. „Často stačí parenterální podání i 0,1 ml D pozitivní krve, aby vyvolal tvorbu protilátek“ (Eckstein, 1994). První podání D pozitivní krve není nebezpečné, protože ještě nejsou vytvořeny protilátky. Nebezpečná je až následná transfuze D pozitivní krve, kdy dojde k reakci antigenu s vytvořenou protilátkou. Pacient D pozitivní může dostat D negativní krev. Nejen D antigen je důležitý pro transfuzi. K imunizaci dochází u osob, které jsou v
30
některém znaku homozygotní – R1R1, R2R2. U některých pacientů, např. hematologických, se při transfuzi dodržuje kompatibilita i v celém Rh fenotypu. Pokud má pacient vytvořenou protilátku, musí vždy dostat krev bez tohoto antigenu, jinak hrozí hemolytická reakce. 2.3.3 Kell systém Jméno tomuto systému dala v roce 1945 těhotná žena, paní Kellacher, u níž byla poprvé popsána protilátka anti – K. Tento skupinový systém je složitější než se původně předpokládalo. Nejdříve byl objeven antigen Kell – K a následně bylo zjištěno, že k němu patří i antigen Cellano – k (opět odvozeno od jména těhotné ženy), který je vysokofrekventní. Posléze se přidaly další antigeny. 2.3.3.1 Geny Kell systému Genetické vztahy jsou komplikované a podobně jako u Rh systému se dědí jako komplex. Tento komplex genů leží na 7 chromozómu, má 3 lokusy. Na lokusu 1 jsou alely K a k, na lokusu 2 jsou alely Kp a a Kpb a na lokusu 3 alely Js a a Jsb. Na lokusu Kk je ještě alela K0, která se vyznačuje chyběním antigenů Kell a lze prokázat pouze Kx substanci. Podobně jako u Rh systému musí existovat 8 haplotypů. „Existuje tedy 8 haplotypů, z nichž však byly prokázány zatím jen 4: KKpbJsb, kKpbJsb, kKpaJsb, KKpbJsa“ (Pecka, 1998). Četnost výskytu fenotypů ukazuje tabulka 9 (Tesařová, 2008). Fenotyp K+k– K+k+ K–k+ Kp (a+b–) Kp (a+b+) Kp (a–b+) Js (a+b–) Js (a+b+) Js (a–b+) K0
Četnost 0,2 % 8,8 % 91,0 % vzácně 2,3 % 97,7 % 0% vzácně 100 % výjimečně
Tab. 9: Četnost výskytu fenotypů 31
2.3.3.2 Antigeny Kell systému Antigeny Kell jsou po antigenu D nejvíce imunogenní. Jsou tvořeny působením transferáz z prekurzorové substance Kx. Erytrocyty, kterým chybí substance Kx mají výrazně sníženou expresi antigenů Kell systému. To má vliv i na membránu erytrocytů a jejich přežívání. Pokud Kx chybí, přežívání je zkráceno a objevuje se akantocytóza, anizocytóza a hemolýza. Tato abnormalita se nazývá Mc Leod fenotyp. Vyskytuje se pouze u mužů, protože je vázán na chromozom X. Četnost výskytu antigenů ve střední Evropě ukazuje tabulka 10 (Eckstein, 1994). Antigen K k Kpa Kpb Jsa Jsb
Četnost 8% 92 % 0,02 % 99,98 % – 100 %
Tab. 10: Četnost výskytu antigenů ve střední Evropě 2.3.3.3 Protilátky Kell systému Přirozená protilátka anti – K, typu IgM, se vyskytuje vzácně. Je chladového typu a reaguje při 4 °C. Mnohem častěji se vyskytuje imunní protilátka typu IgG., která reaguje v NAT. Protilátka anti – k je velmi vzácná. Může se vytvořit u homozygotů fenotypu KK, kterých je pouze 0,2 %. 2.3.3.4 Význam antigenů Kell systému pro transfuzi Protože antigen Kell je velmi imunogenní, vyšetřuje se rutinně u dárců krve. U dětí, mladých lidí, žen ve fertilním věku, hematologických a dialyzovaných pacientů se transfunduje fenotypově identicky. Zajištění transfuze u pacienta s protilátkou anti – k je velmi obtížné, protože pouze 2 z 1000 lidí jsou Cellano negativní. 32
Kell antigen je důležitý i z důvodu HON. „Protilátky Kell systému suprimují erytropoezu fetu, proto může vzniknout těžší forma HON již při nižším množství přítomné protilátky, než u jiných typů inkompatibilit“ (Tesařová, 2008). 2.3.4 Lewis systém Není pravým krevním skupinovým systémem, protože jeho antigeny jsou rozpustné glykolipidy, které se na povrch erytrocytů navazují sekundárně z plazmy. „Asi 30 % Le substance se neadsorbuje a zůstává rozpuštěno v plazmě“ (Pecka, Malý, Dejmková, 1998). 2.3.4.1 Geny Lewis systému V tomto systému jsou typické interakce mezi geny Lewis, ABH a geny související s vyučovatelstvím Se, se. Všechny geny se nachází na chromozomu 19 a dědí se nezávisle. V systému Lewis jsou 2 alely – Le a le. Nejčastější fenotyp je Le (a–b+) – 72 %, následuje s 22 % fenotyp Le (a+b–) a se 6 % fenotyp Le (a–b–). 2.3.4.2 Antigeny Lewis systému V systému jsou 2 antigeny. V přítomnosti nonsekretorského genu se je produktem genu Le enzym, katalyzující tvorbu antigenu Le a. Výsledný fenotyp erytrocytů je Le (a+b–). V přítomnosti sekretorského genu Se a interakci Le genu a H genu dochází ke konverzi původní Lea substance na Leb substanci. Výsledný fenotyp erytrocytů je Le (a–b+). Pokud je u jedince homozygocie alely le, nevzniká Le substance a výsledný fenotyp je Le (a–b–). Lewis antigeny jsou tvořeny z prekurzorového řetězce, podobně jako ABH antigeny, pomocí transferáz. Antigeny nejsou přítomné ihned po narození, objevují se do 3 měsíců věku. Antigenní síla kolísá, např. při těhotenství mizí, vzniká získaný null fenotyp a může se vytvořit protilátka. 2.3.4.3 Protilátky Lewis systému Protilátky anti – Lea a anti – Leb jsou typu IgM, vzácně IgG, dobře reagují v solném prostředí při pokojové teplotě nebo v chladu. Většinou nejsou aktivní při 37 °C. 33
Anti – Lea může být i přirozeného původu, je tvořena člověkem s fenotypem Le (a– b–), nikoli s fenotypem Le (a–b+), protože antigen Le a sice není na erytrocytech, ale je v sekretech. Anti – Leb je také tvořena lidmi s fenotypem Le (a–b–) a výjimečně lidmi s fenotypem Le (a+b–). Je méně nebezpečná. 2.3.4.4 Význam antigenů Lewis systému pro transfuzi Velký problém s výběrem krve pro transfuzi nastane, pokud má pacient protilátku anti– Lea i anti– Leb, protože pouze 6 % lidí má fenotyp Le (a–b–). Význam pro HON není velký, protože protilátky typu IgM placentou neprojdou a novorozenci ještě nemají vytvořeny Le antigeny. 2.3.5 Kidd systém Geny systému Kidd jsou lokalizovány na 18. chromozómu a nachází se zde 3 alely – Jka, Jkb a němá alela Jk. Produkty genů, znaky Jk a a Jkb, jsou kodominantní a dominantní nad znakem Jk. Téměř 100 % středoevropské populace je nosičem alely Jk a nebo Jkb. Fenotyp Jk (a+b+) se vyskytuje ve 49 %, Jk (a+b–) ve 28 %, Jk (a–b+) ve 23% a fenotyp Jk (a–b–) vzácně. Antigeny systému Kidd jsou velmi imunogenní. „Nejsou destruované enzymy, naopak, v enzymatických testech reagují akcentovanou reakcí“ (Tesařová, 2008). Protilátky anti – Jka a anti – Jkb jsou málo časté. Pokud se vyskytnou, jsou imunní, většinou typu IgG a váží komplement. Typ IgM je málo častý. Reagují v NAT a dobře i v prostředí enzymatickém. V reakcích je zřetelný efekt dávky, tzn. protilátka reaguje silněji s homozygotními erytrocyty než s heterozygotními. Z hlediska potransfuzních reakcí jsou nebezpečné. V případě nálezu imunních protilátek je nutno dodržet fenotypicky kompatibilní transfuzi. „Kdyby nebyly tak vzácné a kdyby nejčastější protilátku anti – Jka mohlo tvořit asi 75 % všech příjemců krve, kteří antigen sami mají, bylo by nutné v systému Kidd dodržovat transfuzní kompatibilitu stejně jako v systému AB0 a Rh“ (Eckstein, 1994). U pacientů s diagnozou AIHA se doporučuje podávat fenotypicky shodný transfuzní přípravek.
34
2.3.6 Duffy systém Jméno tomuto systému dal polytransfundovaný pacient s hemofilií, p. Duffy, v jehož séru byla v roce 1950 objevena neznámá protilátka, poté nazvaná anti – Fya. Později byla objevena ještě protilátka anti – Fy b. U tohoto systému se vyskytují 4 alely umístěné na prvním chromozómu, jsou to Fy a, Fyb, Fyx a němá alela Fy. Kódované znaky Fya, Fyb, Fybw (produkt genu Fyx), jsou navzájem kodominantní a dominantní nad antigenem Fy. Antigen Fy funguje jako prekurzor, z kterého vznikají další antigeny. Pokud je jedinec homozygot v alele Fy, výsledný fenotyp je Fy (a– b–), který je vzácný. Nejčastějším fenotypem je Fy (a+b+) se 49 %, následuje Fy (a–b+) s 34 % a Fy (a+b–) se 17 %. Fenotyp s antigenem Fybw se vyskytuje málo – asi u 1 % populace. Antigeny jsou oproti systému Kidd destruované enzymy. Skupinový systém Duffy souvisí s onemocněním malárií. Středoevropská populace je téměř ve 100 % nosičem genu Fya nebo Fyb. Černošské obyvatelstvo je v 68 % nosičem němého genu Fy, v některých částech Afriky je to až 90 – 99 % obyvatel. Bylo zjištěno, že plazmodia, aby mohly způsobit malárii, potřebují pro vstup do erytrocytů antigen Fy. Černoši tento antigen nemají, proto jsou chráněni před touto nemocí. Protilátky jsou imunní, typu IgG, reagují v NAT a váží komplement. Častější je protilátka anti – Fya, vzniká po transfuzích nebo v těhotenství, ale HON je málo častý. Při nálezu protilátek je nutno transfundovat fenotypově identicky. 2.3.7 Lutheran systém Geny pro tento systém se nachází na chromozómu 19 a vyskytují se zde tři alely, Lu a, Lub a němá alela Lu. Kódující znaky Lua a Lub jsou, jako u předešlých systémů, kodominantní a dominantní nad Lu. Nejčastějším fenotypem je Lu (a–b+) s výskytem 92,35 %, dále Lu (a+b+) se 7,5 %, Lu (a+b–) pouze s 0,15 % a velmi vzácný Lu (a–b–). K tomuto systému patří až 17 vysokofrekventních antigenů. Neuplatňují se při HON, protože při narození je jejich antigenní síla slabá, ale s věkem zesilují. Protilátky jsou ojedinělé, častější protilátkou, vzhledem k antigennímu rozložení, je anti – Lua. Protilátky jsou typu IgM, mohou vázat komplement, častý je efekt dávky a silněji reagují při nižší teplotě než při 37 °C. Potransfuzní reakce nejsou časté.
35
2.3.8 MNSs systém Geny tohoto systému se nachází ve dvou lokusech na chromozómu 4. Na jednom lokusu jsou alely M a N, na druhém alely S a s. Produkty těchto genů jsou mezi sebou kodominantní, přičemž antigen S se častěji vyskytuje s antigenem M a antigen s spolu s antigenem N. Na MNSs lokusech se nachází také gen U, který je tvořen alelami U, u a jehož produkt patří mezi vysokofrekventní antigeny. Gen U ovlivňuje S s antigeny. Homozygoty uu lze nalézt mezi černochy, kteří netvoří antigen U, jsou Ss negativní a mohou tvořit protilátku anti – U. Výskyt fenotypů MNSs ukazuje tabulka 11 (Eckstein, 1994).
Fenotypy
Výskyt
MNSs
23,5 %
MNs
22,0 %
Ns
14,5 %
MSs
14,0 %
Ms
8,5 %
MS
6,0 %
NSs
6,0 %
MNS
5,0 %
NS
0,5 %
Tab. 11: Výskyt fenotypů MNSs Protilátky anti – M a anti – N jsou typu IgM, chladové a reagující při 4 – 18 °C. Anti – M se může výjimečně vyskytovat v séru jako přirozená nepravidelná protilátka. Pokud reaguje v NAT je třeba dodržovat fenotyp při transfuzích. Obě protilátky v enzymatických testech nereagují a HON vyvolávají vzácně. Protilátky anti – S a anti – s jsou imunní, typu IgG a reagují v NAT. Jsou klinicky významné a mohou vyvolat potransfuzní reakci či HON. V případě nálezu protilátek je třeba transfundovat fenotypově identicky. 2.3.9 P systém Tento skupinový systém je známý od roku 1927, kdy byl objeven Landsteinerem a 36
Levinem. Genetika je komplikovaná, jsou známy 3 geny. Na chromozomu 22 jsou lokusy pro geny P1 a Pk. Na chromozomu 6 jsou lokusy pro gen P. Celkem je známo 5 fenotypů – P 1, P2, P1k, P2k a p. Antigeny jsou 4 – P1, P, Pk a p. Antigeny mají stejnou prekurzorovou substanci Pk a vznikají adicí sacharidu k prekurzoru. „Antigen P1 se tvoří připojením D – galaktózy na prekurzorový řetězec typu II, který se nachází v membráně erytrocytu. V systému P se tento prekurzor nazývá paraglobosid“ (Sakalová, Lipšic, 1995). Antigen P je tvořen jiným oligosacharidem – globosidem. „Antigen p vzniká také z paraglobosidu připojením zbytku kyseliny sialové“ (Tesařová, 2008). Antigen P 1 je slabý u novorozenců a v dospělosti je variabilní. Vyskytuje se nejen na erytrocytech, ale i na jiných buňkách, tkáních a v sekretech. Antigen P se nachází u všech fenotypů kromě P k a p. Pokud je jedinec homozygot ve znaku p, nevytváří žádný antigen P. Sumarizace jednotlivých fenotypů, antigenů, jejich frekvencí a možných protilátek viz tabulka 12.
Fenotyp
Antigeny
Frekvence
Protilátky
P1
P1, P, Pk
79 %
žádné
P2
P, Pk
21 %
anti – P1
zřídka
anti – P
zřídka
anti – P1, anti – P
zřídka
anti – P1, anti – P, anti – Pk
k
P1
k
P1, P
P2
P
p
p
k
k
Tab. 12: Sumarizace systému P Nejčastěji se vyskytující protilátkou je anti – P1 u P2 fenotypu. Je přirozená, chladová, IgM a aktivuje komplement. Pokud je IgG, imunní a reaguje při vyšších teplotách, je vyžadována kompatibilní transfuze. Protilátky anti – P, anti – Pk a anti – p jsou vzácné. 2.3.10 Ii systém K tomuto systému patří dva antigeny I a i. „Je pravděpodobné, že antigeny nejsou produkované samostatnými geny I a i, ale že rozdíly v transferázách (jejich přítomnost nebo deficit) vedou k sekvenčním změnám jednoduchých sacharidů, ze kterých vznikají antigeny“ (Tesařová, 2008). Antigen i se nachází u novorozenců a dětí. Kolem 18. měsíce věku se mění větvením
37
původně přímého oligosacharidového řetězce na antigen I. Neznamená to ale, že dospělí lidé nemají žádný antigen i a stejně tak, že u novorozenců a dětí nenalezneme antigen I. U některých dospělých jedinců je možno výjimečně nalézt fenotyp ii, označují se jako i adult. Rozpustné glykoproteiny Ii se nachází v plazmě a v sekretech. Antigeny je možné nalézt i na leukocytech, trombocytech a buňkách jiných tkání. Protilátky anti – I a anti – i jsou chladového typu, IgM a váží komplement. Reagují i v enzymatickém testu. Lze je nalézt i ve zdravé populaci, velmi vzácně jako chladový autoaglutinin, převážně typu anti – I. Je typické, že nereaguje s pupečníkovými erytrocyty. Při teplotě pod 10 °C je klinicky nevýznamná. Pokud dojde ke zvýšení titru protilátky a rozšíření teplotního rozsahu, je tato protilátka příčinou autoimunní hemolytické anémie z chladových protilátek. Anti – i je vždy autoprotilátkového typu a je spojována s virovým onemocněním – EBV nebo CMV. U paroxysmální chladové hemoglobinurie je možno nalézt společnou protilátku anti – IH. 2.3.11 Ostatní skupinové systémy 2.3.11.1 Xg systém V systému se vyskytuje pouze antigen Xga. Gen je lokalizován na X chromozomu, proto jej otec předává pouze na své dcery. Antigen je tedy častější u žen (89 %) než u mužů (68 %). Protilátky jsou vzácné, inkompletní, reagují v NAT a váží komplement. Nebývají příčinou potransfuzních hemolytických reakcí a HON. 2.3.11.2 Sid systém Je známý pouze antigen Sda, kdy 91 % populace má tento znak. Ovšem ne od narození, ale začne se tvořit až ve stáří 10 týdnů. V těhotenství se může podobně jako antigeny Lewis ztrácet. Substance Sda je vylučována slinami a močí. Protilátka anti – Sda patří do IgM třídy a váže komplement. V malém procentu se vyskytuje i přirozeně. Jako autoprotilátka je nalézána u chladové AIHA. 38
Význam pro HON a potransfuzní komplikace není. 2.3.11.3 Cartwrith systém V tomto systému jsou známy antigeny Yta a Ytb, které jsou kodominantní. Yta je rozšířen u populace v 99 %, Ytb pouze u 8 %. Protilátky jsou významné pro HON a potransfuzní hemolytické reakce. Jsou imunní, typu IgG a reagují v NAT. 2.3.11.4 Colton systém Systém reprezentují antigeny Coa a Cob. Jsou kodominantní. Antigen Coa se vyskytuje téměř u 100 % bělošské populace a antigen Cob u 10 %. Protilátky jsou imunní povahy, typu IgG. Reagují v NAT i enzymatických testech. Byly nalezeny při těhotenství inkompatibilního plodu, mohou být příčinou HON. 2.3.11.5 Dombrock systém V systému jsou dva kodominantní antigeny Doa a Dob. Výskyt v populaci je v poměru 67 % : 83 %. Protilátky jsou imunní povahy, typu IgG. Reagují v enzymatických a NAT. Mohou způsobit hemolytickou potransfuzní reakci. 2.3.11.6 Diego systém V této skupině se nacházejí dva antigeny Di a a Dib, jsou kodominantní. Znak Dia se nenachází u bílé rasy, ale vyskytuje se u mongolské rasy, jihoamerických Indiánů, Číňanů a Japonců. Antigen Dib se nachází u bělochů téměř ve 100 %. Protilátka anti – Dia je inkompletní. Její reakce jsou různé, reaguje i při pokojové teplotě, ale převážně reaguje v prostředí enzymu a v NAT. Anti – Dib reaguje v NAT a enzymatických testech. Jako imunní protilátky mohou způsobovat hemolýzu při inkompatibilní transfuzi a u plodu při inkompatibilním těhotenství.
39
2.3.11.7 Scianna systém Nalezené znaky v tomto systému Sc1 a Sc2 jsou kodominantní. Většina populace má antigen Sc1. Protilátky jsou vzácné. 2.3.11.8 Antigeny Chido a Rodgers Tyto antigeny zaujímají zvláštní postavení. Nejsou totiž integrální součástí erytrocytární membrány, ale jsou součástí molekuly C4 složky komplementu, který se na erytrocyty váže. Protilátky mají tu vlastnost, že je možné je neutralizovat plazmou, která obsahuje C4 složku. 2.3.12 Antigeny s vysokou frekvencí výskytu Jsou nazývány jako obecné antigeny. V populaci se vyskytují ve více než 99,9 % případů. Protilátky jsou tedy vzácné, a pokud se vyskytnou, je možné najít kompatibilního dárce pouze v rámci rodiny. Protilátky patří většinou do třídy IgM, nezpůsobují HON, ale již způsobily potransfuzní reakce. Patří sem Augustine (Ata), Cromer (Cra), Gerbich (Ge), Gregory (Gya), Holey (Hy), Jacobs (Jra), Joseph (Joa), Langeris (Lan), Vel (Ve), Cost (Cs) a další. 2.3.13 Antigeny s nízkou frekvencí výskytu Označují se jako privátní antigeny. Četnost není vyšší než 1 : 1000. Nejznámější jsou Wright (Wra) a Swann (Swa). Protilátky jsou nalézány, jen pokud jej screeningové erytrocyty obsahují. Nejsou nebezpečím pro transfuze.
40
3 Praktická část
V této části popíši metody vyšetřování protilátek. Soustředím se na metodiky používané na TO FNKV. Popis metodik vychází z doporučení výrobce, platných SOP a PN TO FNKV s přihlédnutím k nejnovějším poznatkům a doporučením Společnosti pro transfuzní lékařství ČLS JEP. Mezi vyšetření protilátek patří: •
vyšetření aglutininů při stanovení krevní skupiny AB0
•
vyšetření volných imunních protilátek u novorozence
•
screening nepravidelných protilátek
•
identifikace specifických protilátek
•
titrace specifické protilátky
•
vysycování protilátek ze séra
•
eluce Na začátku mé praxe zdravotní laborantky probíhalo vyšetření protilátek výhradně ve
zkumavkách. „Za standardní metody jsou považovány: testy sloupcové aglutinace (dále jen SA), testy na pevné fázi. Na základě dlouhodobých výsledků externí kontroly kvality je zřejmé, že lepších výsledků než zkumavková metoda dosahují robustnější metodiky sloupcové aglutinace a pevné fáze a tudíž by měly být preferovány“ (Doporučení Společnosti pro transfuzní lékařství ČLS JEP, č. STL2011_07, 2011). Na TO FNKV je při vyšetření protilátek používána technika SA. Jsou používány 2 systémy – DiaMed (nyní Biorad) a DG Gel Diana (Grifols). Oproti vyšetření ve zkumavkách má SA velkou výhodu, především v citlivosti, úspoře času, nejsou nutné promývací kroky při NAT a hodnocení probíhá makroskopicky. Ovšem v určitých vzácných případech je doporučováno použití zkumavkových testů. SA je založena na detekci aglutinačních reakcí v gelových kartách. Každá karta se skládá z plastového nosiče, který obsahuje určitý počet mikrozkumavek. Mikrozkumavka se skládá z reagenční komůrky a sloupce, který je naplněn polymerizovanými mikročásticemi dextranu v pufrovaném médiu, které slouží jako filtr (obr. 3,4). Používané krvinky jsou resuspendovány v roztoku o nízké iontové síle (LISS v systému Biorad a DG Sol v systému Grifols). Během centrifugace jsou aglutináty červených krvinek, v závislosti na jejich velikosti, zadržovány na povrchu nebo uvniř gelu. Reakce je 41
poté odečítána jako pozitivní. Neaglutinované erytrocyty prochází až na dno mikrozkumavky a reakce je odečítána jako negativní. Hodnotí se síla reakce (tab. 13).
Negativní –
Proužek červených krvinek na spodu gelového sloupce, žádné viditelné aglutináty ve zbytku sloupce
+/–
Ojedinělé aglutináty malých rozměrů v dolní polovině gelového sloupce
1+
Aglutináty malých rozměrů v gelovém sloupci
2+
Aglutináty malých nebo středních rozměrů v gelovém sloupci
3+
Aglutináty středních rozměrů v horní polovině gelového sloupce
Pozitivní 4+ DP
Proužek aglutinovaných červených krvinek na vrcholu gelového sloupce Dvojí populace (dvojitý proužek červených krvinek na spodu a vrcholu gelového sloupce)
H
Hemolýza (narůžovělé zbarvení supernatantu a / nebo gelového sloupce)
Tab. 13: Odečítání výsledků sloupcové aglutinace (příbalový leták DG Gel Coombs Grifols)
Obr. 3: Karty Neutral
Obr. 4: Karty Coombs s AGH sérem
Nedílnou součástí práce v imunohematologické laboratoři TO FNKV je interní a externí kontrola kvality. U používaných diagnostických sér, krvinek, reagencií a karet pro SA se denně kontroluje vzhled, specifita a reaktivita. Jako kontrolní materiál se používá Pelicheck panel od firmy Exbio. Skládá se z kontrolních krvinek s určitými antigeny a diagnostických sér s určitými protilátkami. S kontrolami se pracuje dle návodu. Zařazení kontrol do rutinního provozu zajišťuje kvalitu používaných materiálů, laboratorních postupů a vydávaných závěrů vyšetření. Externí kontrola kvality je zajišťována 2x ročně firmou SEKK. Testují se neznámé vzorky, se kterými se pracuje jako při rutinním vyšetřování. Po úspěšném zvládnutí cyklu je vystaven certifikát a osvědčení o účasti v kontrolním cyklu. 42
3.1 Vyšetření aglutininů anti – A, anti – B Patří mezi základní vyšetření v imunohematologii. Aglutininy anti – A a anti –B jsou přirozené pravidelné protilátky v systému AB0. Vyšetření je vždy součástí vyšetření krevní skupiny. Vyšetřují
se
aglutinogeny na
erytrocytech
pomocí
firemně
vyráběných
monoklonálních diagnostických sér a aglutininy v plazmě / séru pomocí diagnostických (typových) krvinek 0, A1, A2, B. Krvinky skupiny 0 jsou zařazeny jako kontrola, normální reakce je negativní. Aglutinační reakce se hodnotí makroskopicky a výsledky vyšetření aglutinogenů a aglutininů musí souhlasit, jinak nelze vydat výsledek. Diskrepanci je nutné objasnit. Problémy při vyšetření aglutininů se objevují při přítomnosti: •
protilátek, které reagují s jinými antigeny než A1 a B, které se nachází na typových erytrocytech
•
autoprotilátek
•
přirozených nepravidelných protilátek anti – A1 nebo anti – H
•
abnormálních proteinů
•
zeslabených protilátek u dětí, starých lidí
•
protilátek proti určitým složkám v reagenciiích
•
jinoskupinové kompatibilní náhradě plazmy
•
nestejnoskupinové transpantaci kostní dřeně
V laboratořích TO FNKV se aglutininy u pacientů nejčastěji vyšetřují metodou SA v sytému DG Gel Grifols. U dárců krve se vyšetřují na mikrodeskách v poloautomatu Qasar IV. Aglutininy je možno vyšetřit i ve zkumavkách. 3.1.1 Vyšetření aglutininů metodou SA v systému DG Gel Grifols Používaná karta pro vyšetření aglutininů je DG Gel AB0 / Rh. Na každé kartě je 8 mikrozkumavek, které obsahují roztok gelu. Prvních 6 mikrozkumavek slouží pro vyšetření aglutinogenů, sedmá a osmá obsahuje roztok pufru bez protilátek a je určena k vyšetření aglutininů. Postup: 1. příprava a označení příslušného množství karet 43
2. v 1. – 6. mikrozkumavce jsou diagnostická séra na vyšetření krevní skupiny AB0 a D antigenu, přidává se suspenze vyšetřovaných krvinek 3. do 7. mikrozkumavky nakapeme 50 µl (1 kapka) typových erytrocytů A 1 a do 8. mikrozkumavky 50 µl (1 kapka) typových erytrocytů B 4. do 7. a 8. mikrozkumavky nakapeme 50 µl vyšetřovaného séra nebo plazmy 5. centrifugace 9 min/ 990 ot/min v centrifuze pro karty DG Gel 6. makroskopické odečtení výsledků 3.1.2 Vyšetření aglutininů zkumavkovou metodou Postup: 1. do 4 zkumavek nakapeme po 2 kapkách 2 % náplavu typových krvinek 0, A1, A2, B 2. do každé zkumavky nakapeme 2 kapky vyšetřovaného séra nebo plazmy 3. po protřepání se zkumavky centrifugují 1 min/ 1000 ot/min 4. aglutinace se hodnotí makroskopicky Reakci lze zesílit inkubací při chladničkové teplotě. 3.1.3 Vyšetření aglutininů na mikrodeskách Na TO FNKV se používá pro vyšetření dárců krve, ale i pacientů v rámci předoperačního a prenatálního vyšetření. Test se provádí na poloautomatu Qasar IV. Princip testu je stejný jako při vyšetření ve zkumavkách. Do příslušných jamek mikrodesky se nakape stejný poměr typových krvinek a séra nebo plazmy a po centrifugaci se makroskopicky hodnotí.
3.2 Vyšetření volných imunních protilátek u novorozence metodou SA Při inkompatibilitě v ABO systému si v průběhu těhotenství může matka vytvářet imunní protilátky anti – A nebo anti – B typu IgG, které přechází do oběhu dítěte a vyvolávají HON. Vazba těchto protilátek na erytrocyty je slabší než u protilátek v Rh systému, takže přímý Coombsův test není vždy pozitivní. Proto je vhodné prokazovat volné imunní protilátky v séru novorozence testem NAT. Vyšetření probíhá na gelových kartách Biorad LISS / Coombs. Používá se kontrola s 0 krvinkami, která má být negativní. 44
Postup: 1. otevřeme 2 mikrozkumavky a popíšeme 2. nakapeme 50 µl 0,8 % náplavu erytrocytů A1 (B) podle KS novorozence 3. nakapeme 50 µl 0,8 % náplavu erytrocytů KS 0 jako kontroly 4. do obou nakapeme 25 µl séra novorozence 5. inkubace při 37 °C 15 minut; centrifugace 10 min/ 920 otáček 6. makroskopicky odečteme Je–li reakce s erytrocyty A1 (B) pozitivní, znamená to přítomnost volných protilátek anti – A nebo anti – B v séru novorozence.
3.3 Screening nepravidelných protilátek Screening nepravidelných protilátek je základní test a používá se k odhalení přítomnosti nebo nepřítomnosti antierytrocytárních protilátek u pacientů v rámci předtransfuzního, imunohematologického a prenatálního vyšetření, u vyšetření nežádoucí reakce po transfuzi a u dárců krve. Pokud je pozitivní screening protilátek, je nutno provést identifikaci protilátky. V případě pozitivity při předtransfuzním vyšetření je možné podat erytrocytární přípravek až po vyšetření identifikace s tím, že podávaný přípravek nesmí obsahovat antigen, proti němuž je protilátka namířena. Erytrocytární transfuzní přípravky musí být otypované na příslušné antigeny. 3.3.1 Vzorky, reagencie, techniky K vyšetření se používá plazma nebo sérum. Jako diagnostické krvinky slouží pro pacienty komerčně vyráběné tří nebo čtyřkrvinkové screeningové panely krevní skupiny 0 s takovou antigenní skladbou, která postihne nejdůležitější antigeny. Dle doporučení ČLS JEP je minimální zastoupení antigenů na diagnostických erytrocytech toto: C, C W, c, D, E, e, K, k, Fya, Fyb, Jka, Jkb, S, s, M, N, Lea. Antigeny Fya, Fyb, Jka, Jkb, S, s by měly být v homozygotním zastoupení. Jedny screeningové erytrocyty musí mít fenotyp R1R1 a jedny R2R2. Pouze pro vyšetření dárců krve je možné použít screeningové erytrocyty ve směsi. Na TO FNKV jsou používány screeningové krvinky ID DiaCell I + II + III, gelové karty LISS / Coombs, karty Neutral a kombinované karty Coombs / Neutral od firmy Biorad. Od firmy Grifols se používá Serascan Diana 4 a Serascan Diana 4 P (čtyři typy 45
screeningových krvinek) a gelové karty DG Gel Coombs a Neutral. Pro vyšetření dárců krve slouží směs krvinek I + II ID DiaCell (Biorad). Při prenatálním vyšetření je používána kombinovaná karta Biorad Coombs / Neutral. Standardně se screening nepravidelných protilátek provádí metodou SA, v případě indikace lékaře TO FNKV je prováděna i zkumavková technika. Systém Biorad je používán při vyšetření dárců krve, dále při předtransfuzním, prenatálním a imunohematologickém vyšetření. Systém DG Gel Grifols je používán pouze při imunohematologickém vyšetření a v indikovaných případech i při předtransfuzním vyšetření. 3.3.2 Techniky testů 1. NAT = nepřímý antiglobulinový test = nepřímý Coombsův test = AGH test Základní test sloužící k odhalení protilátek IgG a složek komplementu, které jsou „in vitro“
navázány
(nasenzibilizovány)
na
erytrocyty.
Diagnostické
erytrocyty
jsou
resuspendovány v roztoku o nízké iontové síle – LISS, DG Sol. Při zkumavkovém testu se nejdříve provede solný test při 37 °C, viz níže. Po dokonalém proprání erytrocytů ve fyziologickém roztoku, je do reakce přidáváno sérum AGH – sérum antiglobulinum humanum, sérum proti lidskému imunoglobulinu. Dokonalé proprání je důležité z důvodu odstranění sérových bílkovin. V reakci musí zůstat pouze „správné“ bílkoviny = protilátky navázané na krvinky. Pokud by nedošlo k odstranění bílkovin, hrozí falešně negativní reakce, protože AGH by reagovalo s těmito bílkovinami a ne s protilátkou navázanou na erytrocytech. U gelové techniky toto odpadá, protože sérum / plazma je do mikrozkumavky přidáváno až po náplavu erytrocytů, který vytváří nad gelem bariéru a brání neutralizaci AGH sérovými proteiny IgG. V první fázi reakce dojde k navázání IgG protilátky nebo složky komplementu na krvinky a ve druhé fázi AGH sérum vytvoří můstky mezi nasenzibilizovanými erytrocyty a dojde ke tvorbě aglutinátů. 2. Enzymatický test „Podle způsobu provedení se rozlišují enzymatické testy jednofázové (sérum – 46
enzymatické), v nichž se inkubuje současně roztok enzymu, suspenze krvinek a sérum, v němž hledáme protilátky a dvoufázové, při nichž jsou napřed zpracovány krvinky enzymem a teprve potom, po proprání, vystaveny účinku testovaného séra“ (Smetana a kol., 1992). Na TO FNKV je v jednofázovém testu používán bromelin, a to při vyšetření protilátek ve zkumavce a v systému Biorad. Enzym papain se používá ve dvoufázovém testu, který se provádí v systému DG Gel Grifols. Reakce probíhá při 37 °C. Při předtransfuzním vyšetření je test prováděn jako doplňkový a to výjimečně, v indikovaných případech, na základě doporučení lékaře TO FNKV nebo NRL pro imunohematologii. V rámci prenatálního vyšetření je na TO FNKV prováděn standardně. Enzymatický test je vzácně citlivější než NAT, např. u Rh protilátek. Testem se odhalí inkompletní protilátky IgG. 3. Solný test Test je prováděn při 37 °C – pro vyšetření tepelných protilátek a při 4°C – pro vyšetření chladových protilátek. Prokážeme jím kompletní protilátky IgM. 3.3.3 Aplikace testů na TO FNKV Reagencie a karty je nutno převést na pokojovou teplotu. 3.3.3.1 NAT a enzymatický test v systému Biorad Mikrozkumavky
LISS
/
Coombs
obsahují
polyspecifické
AGH
sérum.
Mikrozkumavky Neutral obsahují neutrální gel, jako enzym se používá bromelin. 1. otevření a popis tří mikrozkumavek na kartě LISS / Coombs a tří mikrozkumavek na kartě Neutral 2. do všech mikrozkumavek nakapeme 50 µl 1 % náplavu screeningových erytrocytů I, II, III 3. nakapeme 25 µl séra nebo plazmy do všech mikrozkumavek 4. do mikrozkumavek Neutral nakapeme 25 µl bromelinu 5. inkubace 15 minut při 37 °C; centrifugace 10 minut/ 92O ot/min 6. makroskopické zhodnocení výsledků 47
3.3.3.2 NAT a enzymatický test v systému DG Gel Grifols Mikrozkumavky
DG
Gel
Coombs
obsahují
polyspecifické
AGH
sérum.
Mikrozkumavky DG Gel Neutral obsahují neutrální gel, jako enzym se používá papain. Enzymové screeningové krvinky jsou napapainizované. 1. otevření a popis čtyř mikrozkumavek na kartě DG Gel Coombs a čtyř mikrozkumavek na kartě DG Gel Neutral 2. nakapeme 50 µl 1 % náplavu screeningových erytrocytů Serascan 4 do mikrozkumavek DG Gel Coombs a 50 µl 1 % náplavu screeningových erytrocytů Serascan 4 P do mikrozkumavek DG Gel Neutral 3. nakapeme 25 µl séra nebo plazmy do všech mikrozkumavek 4. inkubace 15 minut při 37 °C; centrifugace 9 minut/ 990 ot/min 5. makroskopické zhodnocení výsledků 3.3.3.3 Solný a enzymatický test ve zkumavce s krvinkami Biorad 1. připravíme si a popíšeme 3 zkumavky na solný test a 3 zkumavky na enzymatický test 2. do všech zkumavek nakapeme po 2 kapkách vyšetřovaného séra 3. do všech zkumavek nakapeme po 2 kapkách 3 % screeningových erytrocytů I, II, III 4. do zkumavek s označením enzymatický test přidáme po 1 kapce bromelinu 5. inkubujeme 1 hodinu při 37 °C; centrifugace 1 min/ 1000 ot/min 6. mikroskopicky odečteme 3.3.3.4 NAT ve zkumavce 1. po mikroskopickém zhodnocení solného testu obsah zkumavek 3x propereme – do zkumavek pod tlakem vstříkneme fyziologický roztok, centrifugujeme 1 min/ 2300 ot/min, odstraníme supernatant a celé ještě 2x opakujeme, na závěr dokonale odstraníme supernatant 2. do každé zkumavky přidáme 2 kapky AGH séra 3. centrifugace 1 min/ 1000 ot/min 4. mikroskopicky odečteme 5. při negativním výsledku následuje kontrola – přidáme 2 kapky nasenzibilizovaných 48
erytrocytů, očekáváme pozitivní reakci Kontrola prokazuje správnost provedení testu – správné proprání, přidání a funkčnost AGH séra. 3.3.3.5 Chladové protilátky v systému DG Gel Grifols a Biorad Reakce probíhá při 4°C, s tím, že reagencie i karty je třeba nejméně 30 minut předem chladit. Postup: 1. otevření a popis čtyř mikrozkumavek na kartě DG Gel Neutral a tří mikrozkumavek na kartě Neutral 2. nakapeme 50 µl 1 % náplavu screeningových erytrocytů Serascan 4 do mikrozkumavek DG Gel Grifols a 50 µl 1% náplavu screeningových erytrocytů I, II, III do mikrozkumavek Biorad 3. nakapeme 25 µl séra nebo plazmy do všech mikrozkumavek 4. inkubace 15 minut při 4°C; centrifugace 9 min/ 990 ot/min v centrifuze Grifols a 10 min/ 920 ot/min v centrifuze Biorad 5. makroskopické zhodnocení výsledků
3.4 Identifikace specifických protilátek Pokud je screening pozitivní, je pravděpodobně přítomna protilátka a měla by být určena její specifita a klinický význam. Sérum / plazma se testuje s panelem minimálně 8 erytrocytů KS 0, které umožní identifikovat klinicky významné protilátky, např. anti – D, anti – E, anti – c, anti – K, anti – Jk a, anti – e, anti – Fya. „Vypovídací schopnost identifikačního panelu je limitována danou kombinací antigenních profilů jednotlivých diagnostických erytrocytů. Samotný jeden panel nemusí být dostačující pro identifikaci některých častých kombinací protilátek, proto je doporučováno užívání jiného dalšího identifikačního panelu“ (Doporučení Společnosti pro transfuzní lékařství ČLS JEP, č. STL2011_07, 2011). Minimálně jednou má být v panelu zastoupen fenotyp R1R1, R1R1 s CW, R2R2, r'r, r''r a nejméně 2x fenotyp rr. Antigenní konfigurace diagnostických červených krvinek je uvedena v tabulce, která je součástí každého balení krvinek (specifické pro každou šarži). Technika identifikace má být taková, jakou byla protilátka zjištěna při screeningu. 49
Zařazuje se autokontrola – použití vlastních erytrocytů pacienta, k odlišení protilátky proti antigenu o vysoké frekvenci od nespecifické autoprotilátky. Specifita protilátky je potvrzena, pokud reaguje nejméně se 2 typy diagnostických erytrocytů a zároveň nereaguje nejméně se 2 typy erytrocytů, který daný antigen neobsahují. Je nutné se ujistit, že byly identifikovány všechny protilátky a to výběrem erytrocytů antigenně negativních pro zjištěnou protilátku. Při vyšetření a hodnocení výsledků je nutné myslet na efekt dávky u některých protilátek, např. anti – M, anti – Lu a anti – Jk. Použití chladového testu a diagnostických erytrocytů ošetřených enzymaticky, je vhodné u protilátek slabě reagující v NAT nebo u směsi protilátek. „Ačkoliv většina protilátek prokazatelných pouze enzymovou technikou nemá pravděpodobně klinický význam, neměl by být specifický nález ignorován“ (Doporučení Společnosti pro transfuzní lékařství ČLS JEP, č. STL2011_07, 2011). Pokud má pacient pozitivní PAT, výsledky nemusí být platné. Před identifikací protilátky je nutné vyšetřit Rh fenotyp pacienta. Při vyšetření se mohou vyskytnout komplikace – tepelné nebo chladové autoprotilátky a protilátky proti antigenům s vysokou a nízkou frekvencí výskytu. Při nálezu nespecifických autoprotilátek je nutné z důvodu odhalení eventuální přítomnosti aloprotilátek sérum vysytit pomocí absorpčních a elučních testů. Pokud je identifikována protilátka, je nutné vyšetřit erytrocyty pacienta na antigen, proti němuž je protilátka namířena. Při pozitivní reakci na antigen a pozitivitě testu senzibilizace in vivo (PAT), se jedná o autologní protilátku a/ nebo navázání imunoglobulinů na povrch erytrocytů (platí při vyšetřování antigenu NAT testy). Také může být nesprávně určena specifita protilátky. Na TO FNKV je používán panel 15 krvinek Identisera Diana / Identisera Diana P od firmy Grifols a doplňkově panel 11 krvinek ID – Panel od firmy Biorad (obr. 5, 6, 7, 8). V systému Grifols jsou krvinky již papainizované, v systému Biorad je při enzymatickém testu do reakce přidáván bromelin. Provádí se technikou SA. Vyšetření je možno provádět i ve zkumavce.
50
Obr. 5: Diagnostické erytrocyty pro identifikaci
Obr. 6: Identifikace protilátek
Obr. 7: Výsledek identifikace
Obr. 8: Odečet identifikace
3.4.1 Identifikace v systému DG Gel Grifols Identifikace se provádí, zpravidla, v nepřímém antiglobulinovém testu, enzymatickém testu s papainem a solném testu při 4°C. Postup: 1. popis 16 mikrozkumavek na kartě DG Gel Coombs a 16 mikrozkumavek na kartě DG Gel Neutral 2. otevření dvou mikrozkumavek s popisem AK 3. do obou mikrozkumavek AK nakapeme 50 µl 1 % náplavu vlastních erytrocytů 51
4. přidáme 25 µl papainu 5. inkubace 10 minut/ 37 °C 6. otevření zbývajících mikrozkumavek 7. nakapeme 50 µl 1 % náplavu panelových erytrocytů Identisera Diana do karty DG Gel Coombs 8. nakapeme 50 µl 1 % náplavu panelových erytrocytů Identisera Diana P do karty DG Gel Neutral 9. nakapeme 25 µl séra nebo plazmy do všech mikrozkumavek 10. inkubace 15 minut při 37 °C; centrifugace 9 minut/ 990 ot/min 11. makroskopické zhodnocení výsledků Postup při identifikaci chladových protilátek: Reakce probíhá při 4 °C, s tím, že reagencie i karty je třeba nejméně 30 minut chladit. 1. popis a otevření 16 mikrozkumavek na na kartě DG Gel Neutral 2. do mikrozkumavky s popisem AK nakapeme 50 µl 1 % náplavu vlastních erytrocytů 3. do zbývajících 15 nakapeme 50 µl 1 % náplavu panelových erytrocytů Identisera Diana 4. nakapeme 25 µl séra nebo plazmy do všech mikrozkumavek 5. inkubace 15 minut při 4 °C; centrifugace 9 minut/ 990 ot/min 6. makroskopické zhodnocení výsledků 3.4.2 Identifikace v systému Biorad 1. popis a otevření 12 mikrozkumavek na kartě LISS / Coombs a 12 mikrozkumavek na kartě Neutral 2. do obou mikrozkumavek s popisem AK nakapeme 50 µl 1 % náplavu vlastních erytrocytů 3. nakapeme 50 µl 1 % náplavu erytrocytů ID Panel do zbývajících mikrozkumavek 4. do mikrozkumavek na kartách Neutral nakapeme 25 µl bromelinu 5. nakapeme 25 µl séra nebo plazmy do všech mikrozkumavek 6. inkubace 15 minut při 37 °C 7. centrifugace 10 minut/ 920 ot/min 8. makroskopické zhodnocení výsledků
52
Postup při identifikaci chladových protilátek: Reakce probíhá při 4 °C, s tím, že reagencie i karty je třeba nejméně 30 minut chladit. 1. popis a otevření 12 mikrozkumavek na kartě Neutral 2. do mikrozkumavky s popisem AK nakapeme 50 µl 1 % náplavu vlastních erytrocytů 3. do zbývajících 11 nakapeme 50 µl 1 % náplavu erytrocytů ID Panel 4. nakapeme 25 µl séra nebo plazmy do všech mikrozkumavek 5. inkubace 15 minut při 4 °C 6. centrifugace 10 minut/ 920 ot/min 7. makroskopické zhodnocení výsledků 3.4.3 Vyšetření antigenů na erytrocytech V případě, že identifikujeme specifickou protilátku, je nutno vyšetřit příslušný antigen. K vyšetření antigenů se používají různé metody (metoda SA nebo zkumavková metoda), různé testy (NAT, enzymatický test s bromelinem nebo solný test) a různé typy diagnostických sér (séra monoklonální s kompletní nebo inkompletní protilátkou a polyklonální séra lidská nebo zvířecí). Vyšetření konkrétního antigenu se provádí metodou, testem a diagnostikem vhodným pro vyšetření daného antigenu, vždy dle návodu doporučeného výrobcem.
3.5 Titrace specifických protilátek Titr specifických protilátek se stanovuje u těhotných žen, u kterých byla zjištěna klinicky významná protilátka v testu NAT (tab. 14). Toto vyšetření umožňuje určit těhotné ženy rizikové z hlediska HON. Titrace se provádí buď metodou SA, nebo zkumavkovou a testem NAT. „Ve světě není shoda v tom, zda k titrování použít diagnostické erytrocyty s heterozygotním či homozygotním zastoupením daného antigenu. Při použití obou typů se výše titru liší“ (Doporučení Společnosti pro transfuzní lékařství ČLS JEP, č. STL2010_06, 2010). K titraci anti – D se používají krvinky R 2R2. K titraci anti – c, anti – E, anti – C a anti – e erytrocyty s heterozygotním zastoupením antigenů. Nejsou–li dostupné, tak v případě anti – c a anti – E krvinky R2R2. V případě anti – C a anti – e krvinky R 1R1. U protilátek jiných specifit než Rh se doporučuje heterozygotní zastoupení antigenu na krvince. 53
Klinicky významná protilátka
Titr v NAT SA
Titr v NAT zkumavkově
anti – D, anti – C, anti – E
rovno nebo > 128 rovno nebo > 32
anti – K
rovno nebo > 4
rovno nebo > 4
ostatní protilátky v systému Fy, JK, M, S, s rovno nebo > 128 rovno nebo > 64 Tab. 14: Významné titry u klinicky významných protilátek „Pro sledování dynamiky titru je vhodné vyšetřovaný vzorek zamrazit pro další kontrolu (skladovat při teplotě minimálně –18 až –20 °C). Následující titrování by se mělo provádět paralelně ze vzorku předchozího a současného“ (Doporučení Společnosti pro transfuzní lékařství ČLS JEP, č. STL2010_06, 2010). Změna titru o více něž dva stupně se považuje za signifikantní. Náhlý pokles o více než 3 stupně, může být známkou těžkého poškození plodu i intrauterinní smrti plodu. Zhotovíme si titrační řadu – připravíme si a popíšeme řadu zkumavek, dle předpokládaného titru aloprotilátky (1 : 1, 1 : 2, 1 : 4, 1 : 8, 1 : 16, 1 : 32...). Do první a druhé zkumavky nakapeme 100 µl séra, do druhé a do dalších nakapeme 100 µl fyziologického roztoku. Od druhé zkumavky titrujeme – nasajeme 100 µl séra a přeneseme do třetí zkumavky. Promícháme a pokračujeme až do poslední zkumavky. Titruje se v tom systému, ve které byla zjištěna pozitivita. 3.5.1 Titrace v systému DG Gel Grifols a Biorad 1. otevřeme a popíšeme příslušný počet mikrozkumavek na kartách DG Gel Coombs a LISS / Coombs 2. nakapeme 50 µl 1 % náplavu příslušné vybrané krvinky z panelu Identisera Diana a z panelu ID Panel 3. přidáme 25 µl roztitrovaného vyšetřovaného séra do každé mikrozkumavky (vždy podle titru ředění do příslušné mikrozkumavky) 4. inkubace 15 minut při 37 °C 5. centrifugace 9 minut/ 990 otáček/min v centrifuze Grifols a 10 minut/ 920 otáček/min v centrifuze Biorad 6. makroskopické zhodnocení výsledků
54
3.5.2 Titrace chladových protilátek Titrace chladových aglutininů se provádí výjimečně. Zvýšený titr chladových aglutininů je průvodní laboratorní nález u pacientů s diagnozou AIHA s chladovými protilátkami, ale může se vyskytnout i u pacientů s maligními lymfomy nebo po prodělaných virových infekcích. Chladové aglutininy jsou protilátky třídy IgM, váží komplement. Reagují optimálně s erytrocyty při teplotách nižších než je tělesná teplota, s optimem při 4 °C. Specifita je nejčastěji anti – I. V závislosti na titru protilátky, její teplotní šíři, afinitě k erytrocytům a schopnosti vázat komplement dochází nejen k intravaskulární aglutinaci erytrocytů v ochlazených částech těla, ale může dojít i k intravaskulární hemolýze různého stupně. Titr chladových protilátek je jedním z parametrů, ke kterému ošetřující lékař přihlíží při léčbě pacienta. Krevní vzorek po dodání do laboratoře se inkubuje 15 – 20 minut v termostatu při 37 °C a poté se centrifuguje v kyvetách s vodou teplou 37 °C. Odsátí séra se provádí za tepla. Chladové aglutininy se vyšetřují metodou titrace vyšetřovaného séra proti vlastním erytrocytům pacienta, erytrocytům skupiny 0 Rh (D) pozitivním a 0 Rh (D) negativním zdravých jedinců (dárců krve). Vyšetření se provádí zkumavkovou metodou při 4 °C. Pozitivní reakce se projeví aglutinací erytrocytů patrnou makroskopicky. Nepřítomnost aglutinace znamená negativní výsledek. Za patologický se považuje titr > 1 : 64.
3.6 Vysycování séra K tomuto kroku se přistupuje nejčastěji v případě laboratorního potvrzení diagnózy AIHA (pozitivní PAT a pozitivita s celým panelem diagnostických erytrocytů včetně vlastních krvinek) (obr. 9, 10). Vysycování umožňuje eliminaci autoprotilátek ze séra pacienta s diagnozou AIHA nebo izolaci žádoucí protilátky ze směsi protilátek. Zásadním předpokladem je výběr erytrocytů, kdy v případě eliminace autoprotilátky ze séra používáme vlastní erytrocyty pacienta, nebo vhodné dárcovské erytrocyty (antigenní složení co nejvíce shodné s pacientem). V případě vysycení aloprotilátky používáme diagnostické erytrocyty nebo vhodné dárcovské erytrocyty s antigenem reagujícím s protilátkou, kterou chceme vysytit.
55
Obr. 9: Diagnóza AIHA – karty Neutral
Obr. 10: Karty Coombs
Jde o opakovanou inkubaci séra s předem zpracovanými a cíleně vybranými erytrocyty, za následného vzniku komplexu antigen – protilátka, která je tímto ze séra odstraňována. Z důvodu lepší senzibilizace erytrocytů protilátkami se erytrocyty pomocí enzymu ficinu natráví. Dále se používá polyethylenglykol (PEG) ke zvýšení reaktivity antigen – protilátka. K vysycování se používá sražená krev pacienta (sérum) a 30 ml nesražené krve pacienta nebo vhodná dárcovská krev. Postup: 1. označíme si potřebné množství zkumavek 2. přípravíme si ficinované erytrocyty • do každé zkumavky dáme 5 ml erytrocytů, 3x promytých ve fyziologickém roztoku • přidáme 4 ml fyziologického roztoku • přidáme 0,5 ml ficinu • smícháme, zkumavky protřepeme a inkubujeme 15 minut při 37 °C 3. centrifugace 2 minuty při 2000 ot/min 4. erytrocyty následně 1x propereme ve fyziologickém roztoku 5. smícháme 1 díl séra pacienta + 1 díl PEG + 0,5 dílu ficinovaných erytrocytů 6. inkubace 15 minut při 37 °C 7. centrifugace 2 minuty při 3400 ot/min 8. přeneseme supernatant (sérum s PEG) z první zkumavky do další zkumavky s předem připravenými ficinovanými erytrocyty (0,5 dílu) 9. opakujeme bod 6 až 8, až do vysycení séra 56
Z vysyceného séra provedeme kontrolní vyšetření screeningu nepravidelných protilátek, který se z původního pozitivního změní na negativní. V případě přetrvávající pozitivity, provádíme identifikaci protilátek na panelu diagnostických erytrocytů. S vysyceným sérem je následně možné provádět předtransfuzní vyšetření – testy kompatibility. Vysycené sérum má stabilitu 1 týden / 2–6 °C.
3.7 Absorpce a eluce protilátek Absorpce je reakce, při které v důsledku vazby protilátky s příslušným antigenem následně dochází ke snížení titru protilátky nebo jejímu vymizení. Absorpční test umožňuje prokázat i slabé aglutinogeny, které se nedaří prokazovat v přímých testech. Používá se k určení krevní skupiny z hemolytické krve, ze skvrny krve na písku, skle, látce a k určení skupiny se slabými antigeny. Principem absorpce je spotřeba protilátky. Krvinky s předpokládaným aglutinogenem se smísí s diagnostickým sérem obsahujícím specifické protilátky ve známém titru. Po absorpci se opakuje vyšetření titru protilátky. Podle rozdílu titrů usuzujeme na přítomnost či chybění hledaného aglutinogenu. Eluce využívá skutečnosti, že vazba antigen – protilátka je reversibilní. Cílem eluce je uvolnění protilátky vázané na erytrocyty při zachování jejích sérologických vlastností. Používá se k izolaci specifických protilátek ze směsi a k průkazu protilátek u některých onemocnění (AIHA, HON), kdy protilátky senzibilizují erytrocyty již in vivo, dále např. při nutnosti fenotypizace nasenzibilizovaných erytrocytů. Může se provádět klasickým testem nebo pomocí komerčního elučního kitu (souprava Gamma ELU – KIT II). U klasického elučního testu dochází k uvolnění vazby antigen – protilátka změnou podmínek termodynamické reakce (vystavení komplexu antigen – protilátka teplotě 56 °C po předchozím promytí senzibilizovaných erytrocytů ledovým fyziologickým roztokem). Komerční eluční kit Gamma ELU – KIT II je založen na reakci s kyselým roztokem EDTA / glycin (ke zrušení vazebné kapacity protilátky s antigenem dochází změnou pH). V obou případech přejde protilátka do eluátu, se kterým pracujeme jako s vyšetřovaným sérem.
57
3.7.1 Absorpce 1. k 1 ml upraveného diagnostického séra anti – A a anti – B o titru 1 : 64 přidáme stejné objemové množství 3x promytých erytrocytů 2. pokud se jedná o skvrnu na látce, dáme ji přímo do diagnostického séra, stejně tak suché erytrocyty, např. seškrábané ze skla; podle typu vyšetřovaného materiálu lze metodu upravovat, například při předpokládaném velice slabém antigenu dáme dvoj – i vícenásobek množství diagnostického séra 3. absorpce 30 minut při 18 °C za občasného protřepávání (při předpokládaném slabém antigenu se doba absorpce prodlužuje) 4. centrifugace 2 minuty při 2000 ot/min 5. supernatant odsajeme do označené zkumavky a titrujeme proti typovým erytrocytům A1 a B 6. inkubace 15 minut při 18 ° C; centrifugace 2 minuty při 2000 ot/min 7. makroskopické odečtení Souběžně provádíme kontrolní vyšetření titru neabsorbovaných anti – A a anti – B diagnostických sér. Srovnáním titru absorbovaného séra a neabsorbovaného séra hodnotíme vyšetření. 3.7.2 Eluce klasicky 1. vyšetřované erytrocyty, u kterých prokážeme senzibilizaci přímým antiglobulinovým testem 3x promyjeme v nadbytku ledového fyziologického roztoku a odsajeme supernatant 2. k sedimentu erytrocytů přidáme stejné objemové množství fyziologického roztoku, protřepeme a inkubujeme ve vodní lázni 56 °C 5 až 10 minut za stálého protřepávání 3. centrifugujeme v předehřátých kyvetách 4. eluát okamžitě odsajeme do označené zkumavky 5. v eluátu prokazujeme uvolněnou protilátku pomocí panelu typových erytrocytů v testu enzymatickém a v NAT 6. o dokonalém provedení eluce se přesvědčíme přímým antiglobulinovým testem, pokud zůstává pozitivní, je nutné eluci opakovat
58
3.7.3 Eluce pomocí diagnostické soupravy Gamma ELU – KIT II 1. vyšetřované erytrocyty 1x proprané ve fyziologickém roztoku se opakovaně properou promývacím roztokem 2. proprané erytrocyty jsou následně resuspendovány v elučním roztoku 3. po disociaci protilátek se provede centrifugace a supernatant s protilátkami se oddělí od erytrocytů 4. pomocí pufru s barevným indikátorem se provede neutralizace acidity elučního roztoku 5. čistý eluát získaný po následné centrifugaci může být testován komerčními metodami detekce protilátek Erytrocyty po eluci nejsou vhodné k typování jednotlivých antigenů.
59
4 Experimentální data V této části bych ráda poskytla statistický soubor vyšetření identifikace protilátek v imunohematologické laboratoři na mém pracovišti Transfuzním oddělení Fakultní nemocnice Královské Vinohrady v Praze za celý rok 2011. Data jsem čerpala z LIS, dokumentace a mých vlastních zkušeností v průběhu celého roku. V imunohematologické laboratoři je prováděna identifikace protilátek, které jsou zjištěny při screeningu protilátek při předtransfuzním vyšetření a v případě pozitivity screeningu protilátek u dárců krve. Dále velkou část práce této laboratoře zaujímá vyšetřování pacientů z lůžkového hematologického oddělení při FNKV. Rovněž jsou zasílány vzorky k vyšetření v rámci prenatální péče z Ústavu pro péči o matku a dítě, ústavní gynekologie a od privátních gynekologů. Náplní práce je i vyšetření potransfuzních reakcí. Jednotlivé testy, metody a postupy jsem popsala v praktické části. První volbou při identifikaci protilátek je vyšetřování v systému DG Gel Grifols. V případě nejasností a diskrepantních výsledků je provedena identifikace i v systému Biorad. V případě pozitivity s celým panelem erytrocytů včetně vlastních krvinek a nutnosti podání transfuze erytrocytů, je třeba sérum vysytit, aby byla odhalena eventuální aloprotilátka. Nález s pozitivitou celého panelu v enzymatickém a NAT testu a s pozitivitou při vyšetření kvalitativního a kvantitativního přímého Coombsova testu je uzavřena jako diagnóza AIHA. V systému Grifols se v enzymatickém testu pracuje s napapainizovanými krvinkami a v systému Biorad se přidává do testu bromelin. Při hodnocení výsledků identifikace protilátek je nutné pamatovat na efekt dávky. Velmi často se stává, že protilátka, např. anti – M reaguje v panelu jen s homozygotními krvinkami a s heterozygotními je negativní.
4.1 Statistické údaje V roce 2011 bylo v imunohematologické laboratoři provedeno celkem 1242 identifikací protilátek. 1. Z tohoto počtu bylo 279 vyhodnoceno jako normální imunohematologický nález. 2. Z tohoto počtu bylo 963 vyšetřeno jako patologický imunohematologický nález. •
Z těchto 963 vyšetření bylo 600 identifikováno jako specifická protilátka. •
Z těchto 600 bylo 288 identifikováno v rámci prenatální péče (do tohoto 60
počtu jsou zahrnuta i opakovaná vyšetření těhotných žen), z toho 157 případů připadá na imunní protilátku anti – D. Z tohoto počtu u 124 výsledků nebyla tato protilátka vytvořena imunním procesem, ale po podání profylaxe – imunního anti – D séra (tab. 15). •
Z těchto 600 připadlo 312 specifických protilátek na ostatní pacienty, mezi nimiž jsou zahrnuti i 4 dárci krve. U těchto dárců se jednalo o protilátky anti – E, anti – M, anti – D a anti – Wr a (touto protilátkou se bude zabývat jedna z kazuistik) (tab. 16).
•
Z těchto 963 vyšetření nebyla u 363 specifická protilátka identifikována. Ve 303 případech se jednalo o nespecifické pozitivity a v 60 případech byla zjištěna AIHA (tab. 17 , tab. 18). •
Z těchto 363 případů připadlo 154 nespecifických nálezů na gravidní pacientky, z toho ve 125 případech šlo o nespecifitu v enzymatickém testu, ve 27 případech šlo o jiné nespecifity a u 2 gravidních byla zjištěna diagnóza AIHA.
•
Z těchto 363 případů připadlo 209 nespecifických nálezů na ostatní pacienty, z toho u 117 případů šlo o nespecifitu v enzymatickém testu, ve 34 případech šlo o jiné nespecifity, u 58 pacientů byla zjištěna diagnóza AIHA.
V následujících tabulkách uvádím přehled výsledků a počty jednotlivých specifických protilátek, dále rozlišuji, ve kterých testech byla pozitivita a uvádím počty vyšetření. Provedla jsem rozdělení na vyšetření těhotných žen a ostatních pacientů. U gravidních žen s protilátkou anti – D poskytuji rozdělení na gravidní, kterým byla aplikována jako prevence imunní anti – D a gravidní bez této profylaxe. U těhotných žen taktéž uvádím hodnotu maximálního titru protilátky, který byl vyšetřen, přičemž titrace u každé těhotné ženy byly prováděny opakovaně dle Doporučení Společnosti pro transfuzní lékařství ČLS JEP. V tabulkách nespecifických nálezů rovněž uvádím testy, ve kterých byla nalezena pozitivita.
61
Testy Protilátka
4 °C + E + NAT
anti – D (po aplikaci)
E+ NAT
4 °C + 4 °C + E NAT NAT
E
73
51
4 °C
Titr protilátky
CELKEM 124
anti – D (bez aplikace)
11
18
4
1:8000
33
anti – E
10
14
9
1:32
33
anti – C
6
9
1
1:64
16
anti – CW
1
2
4
1:1024
7
anti – K
6
7
1:256
13
anti – k
1
1:1
1
anti – Fya
13
1:16
13
11
1:8
33
anti – M
22
anti – Lea anti – Leb
8
8
1
anti – Jka
1
2
1
anti – P1
1 1
anti – H
1
2 1
1
Tab. 15: Specifické protilátky u těhotných žen vyšetřovaných na TO FNKV v roce 2011 Vysvětlivky: •
E – enzymatický test; 4 °C – solný test při 4 °C; NAT – nepřímý antiglobulinový test.
•
Titry protilátek jsou uvedeny v NAT.
•
U pacientky s protilátkou anti – CW byl zaznamenán titr 1 : 1024, pouze při jednom vyšetření, jinak byl titr opakovaně 1 : 256, přičemž otec tohoto dítěte byl C W negativní a dítě po porodu nejevilo známky HON. Jednalo se v.s. o protilátky z dřívějších těhotenství.
•
Protilátky systému Lewis se neuplatňují v HON, proto titrace neprováděna.
•
Protilátka anti – Jka byla zjištěna z prvního vzorku a další vzorek k titraci nebyl nikdy zaslán.
•
Titrace protilátky anti – k pokračovala i v roce 2012, poslední titr byl 1 : 4. 62
Testy Protilátka
4 °C + E + NAT E + NAT 4 °C + NAT 4 °C + E NAT
E
4 °C
CELKEM
anti – D
5
39
1
6
51
anti – E
11
32
3
24
70
2
2
7
26
5
19
4
16
anti – e anti – C
1
anti – CW anti – c anti – K
17 13
1
11
8
26
1 1 1
12
47
anti – Fy
13
13
anti – Fyb
1
1
a
anti – M
10
anti – Lea 4
3
1
1
2
anti – Leb 1 anti – Jka
10
2
anti – Jkb anti – Lua
4
17
7
15
4
5
1
13
1
1
1
1
anti – Kpa
2
2
anti – Wra
1
1
anti – S
7
7
anti – P1
1
1
2
1
5
Tab. 16: Specifické protilátky u ostatních pacientů vyšetřovaných na TO FNKV v roce 2011
63
Testy Pacienti
4 °C + E + NAT
E+ NAT
4 °C + E
gravidní ženy
3
15
3
ostatní pacienti
6
67
6
4 °C + NAT
1
NAT
CELKEM
E
8
125
154
12
117
209
Tab. 17: Nespecifické protilátky u pacientů vyšetřovaných na TO FNKV v roce 2011
Testy Pacienti s diagnózou AIHA
CELKEM 4 °C + E + NAT E + NAT 4 °C + E
gravidní ženy 1
1
ostatní pacienti
43
4
NAT
E 2
2
1
8
58
Tab. 18: Pacienti s diagnózou AIHA vyšetřovaných na TO FNKV v roce 2011
Vysycování autoprotilátek ze séra bylo nutno provést u 32 pacientů. Z tohoto počtu se během roku vysycovalo 2x u těhotné ženy. U některých pacientů se provádělo vysycení autoprotilátky pouze jednou z důvodů odhalení eventuální specifické aloprotilátky, ale vzhledem k jejich klinickému stavu (relativně příznivý krevní obraz) nebylo nutno vysycování opakovat. U pacientů, kteří opakovaně anemizovali, se však k zajištění kompatibilních transfuzí muselo během roku vysycovat několikrát, v jednom případě až 6x. Průměrný počet absorpcí u jednoho pacienta v jednom dni byl 7.
64
4.2 Kazuistiky Na závěr této části popíši 3 zajímavé případy vyšetření nepravidelných protilátek. 4.2.1 Kazuistika 1 Dne 25.8.2011 byl v rámci povinného vyšetření dárců krve proveden screening protilátek v NAT dárci XY metodou SA. Výsledek se směsí krvinek Biorad I + II byl pozitivní na 3 +. Opakované vyšetření mělo stejný výsledek. Poté byl proveden screening protilátek s tříkrvinkovými diagnostickými erytrocyty Biorad I + II + III v enzymatickém testu s bromelinem a v NAT. Výsledek byl negativní. Následně byla provedena identifikace protilátky ve dvou systémech Biorad a DG Gel Grifols. Výsledek byl opět negativní. Poté byl proveden screening protilátek s jednotlivými diagnostickými erytrocyty Biorad I a Biorad II, používanými do směsi na vyšetření dárců krve. Vyšetření s erytrocyty I bylo pozitivní, což ukazovalo na pravděpodobnou přítomnost protilátky proti antigenu s nízkou frekvencí. Vzorek dárce byl odeslán do NRL pro imunohematologii MUDr. Písačkovi. Zde byla zjištěna protilátka proti antigenu s nízkou frekvencí anti – Wr a. Byla provedena podrobná transfuzní anamnéza – v dospělosti nedostal transfuzi a případnou transfuzi v dětství si nepamatuje. Dárce byl obeznámen s problematikou a byl vyřazen z dárcovství krve. V případě potřeby transfuze krve by u něj nebyl problém, protože antigen Wra je málo frekventní. 4.2.2 Kazuistika 2 Dne 19.10.2011 byla v imunohematologické laboratoři vyšetřena gravidní žena s krevní skupinou A Rh negativní, která ve spádové laboratoři, v rámci prenatálního vyšetření v prvním trimestru gravidity, měla pozitivní screening nepravidelných protilátek. Byla provedena identifikace protilátek. V enzymatickém testu byla zjištěna pozitivita na 4 + s D pozitivními erytrocyty a v testu NAT pozitivita na 3 + až 4 + také s D pozitivními erytrocyty. Výsledkem byla tedy protilátka anti – D. Zarážející u této pacientky byl údaj o provedené profylaxi anti – D, a to dokonce 2x během tohoto těhotenství, vždy při malém invazivním výkonu. Jednalo se o jednoznačnou chybu ošetřujícího lékaře, neboť již byl znám výsledek pozitivního screeningu protilátek a v tomto případě se s aplikací anti – D mělo počkat až do 65
výsledku identifikace protilátek. Profylaxe by pak byla kontraindikovaná. Následně byla provedena titrace této protilátky, s hodnotou titru 1 : 64 v NAT. Protože se jednalo o významný titr, byly další titrace prováděny v intervalech po 3, později po 2, pak po 1 týdnu. Během těchto titrací došlo k výraznému vzestupu titru až na konečný titr 1 : 1024. Těhotná byla pravidelně sledována a monitorována na specializovaném pracovišti ÚPMD. Dne 19.1.2012 byl proveden porod císařským řezem. Dle nám dostupných informací mělo dítě pouze lehkou anemii a hyperbilirubinémii, která byla zvládnuta kontinuální fototerapií v trvání 5 dnů. Výměnná transfuze krve nemusela být provedena. K imunizaci došlo pravděpodobně při předešlém těhotenství, ale bližší okolnosti týkající se tehdejší eventuální profylaxe anti – D se nepodařily zjistit. 4.2.3 Kazuistika 3 Dne 21.11.2011 byl z pracoviště ÚPMD na naše oddělení odeslán vzorek gravidní pacientky s krevní skupinou A Rh negativní, která měla vyšetřen pozitivní screening nepravidelných protilátek. Byla provedena identifikace protilátek. V enzymatickém testu byla odečtena pozitivita na 3+ až 4+ s D pozitivními krvinkami. V testu NAT byla zjištěna pozitivní reakce na 2+ až 3 – 4+ s kk erytrocyty a s erytrocyty Kk pouze stopově. Byla tedy zjištěna protilátka proti antigenu s vysokou frekvencí anti – k, reagující v NAT a protilátka anti – D velmi slabě reagující v NAT (prokázáno pomocí dárcovských krvinek 0 Rh pozitivních s fenotypem KK) a silně v enzymatickém testu. Zároveň byly vyšetřeny antigeny Kell systému, pacientka byla K + k –, to znamená homozygot v systému Kell. Udávaná četnost tohoto fenotypu je 0,2 %! Z anamnézy bylo zjištěno, že pacientce byl 5.10.2011 aplikován jako prevence imunizace imunoglobulin anti – D a v roce 2006 dostala transfuzi krve. Byla provedena titrace protilátky anti – k s výsledkem 1 : 1. Pacientce byl titr vyšetřován každé 2 týdny. Poslední titr byl 1 : 4. Síla pozitivity s D krvinkami v enzymatickém testu postupně klesala až na hodnotu 1 + při posledním vyšetření 5.3.2012. S blížícím se termínem porodu bylo nutné zajistit minimálně 4 jednotky erytrocytárního přípravku KS A nebo 0 Rh negativní fenotypu KK. Nakonec se podařilo zajistit 3 jednotky z registru dárců TO FNKV a jedna jednotka z Transfuzního oddělení Fakultní nemocnice v Krči. Pacientka porodila zdravé dítě bez nutnosti substituce krve. 66
5 Závěr Ve své práci jsem se snažila poskytnout přehled aktuálních dostupných poznatků z oblasti vyšetřování antierytrocytárních protilátek. Během doby, kdy jsem shromažďovala teoretické podklady, jsem poznala, jak obsáhlé je téma protilátek v imunohematologii. Problém je o to složitější, že v současné době neexistuje nová souhrnná publikace v českém jazyce, která by obsahovala nejnovější poznatky. Aktuální informace jsem čerpala zejména z Doporučení Společnosti pro transfuzní lékařství ČLS JEP. Při statistickém zpracovávání výsledků vyšetření antierytrocytárních protilátek a jejich hodnocení jsem došla k těmto závěrům. •
Potvrdilo se, že systém Rh je skutečně nejvíce imunogenní. Nejčastějšími protilátkami, vyšetřenými na TO FNKV za rok 2011 bylo anti – E (103x), anti – D (84x), anti – C (42x), anti – C W (26x), anti – c (16x). Naproti tomu protilátka anti – e byla zjištěna jen ve 2 případech, což potvrzuje, že antigen e se vyskytuje v populaci v 96,5 %. Prameny, ze kterých jsem čerpala teoretické údaje, uvádějí, že protilátka anti – D je nejčastější - z mých statistických výsledků toto nevyplývá. Čemu to napovídá? Při transfuzích krve se dodržuje D kompatibilita a provádí se profylaxe Rh (D) negativních žen nejen po porodu Rh(D) pozitivního dítěte, ale i při invazivních zákrocích během těhotenství.
•
Rh protilátky vždy reagují v enzymatických testech.
•
Druhým nejvíce imunogenním antigenem je Kell (60x).
•
Protilátky systému Duffy nereagují v enzymatickém testu.
•
Protilátka anti – H je chladová.
•
Protilátka anti – M může být jak chladového, tak tepelného typu, ale nereaguje v enzymatických testech.
•
Protilátky Kidd systému (15x) jsou vzácné a dobře reagují v enzymu, anti – Jka, která má být častější, byla prokázána ve 14 případech.
•
Na základě mých pozorování jsem konstatovala, že v enzymatických testech se enzym papain jevil jako citlivější, byly v něm však také častější nespecifické pozitivity.
•
Titry protilátek u některých těhotných přesáhly uváděnou hranici klinické významnosti, přesto novorozenci neměli příznaky HON.
•
Silnější reakce s homozygotními krvinkami (tzv. efekt dávky) jsem pozorovala u 67
protilátek anti – Jka, a anti – M. •
AIHA, laboratorně potvrzená u těhotných, souvisela s jejich hlavní diagnózou lupus erythematodes. Vysycením autoprotilátky před porodem jsme měli připravené sérum pro zajištění kompatibilních krví v případě potřeby. Domnívám se, že hlavní cíl mé práce jsem splnila. Na základě statistických údajů
vyšetření identifikace protilátek mohu říci, že získané výsledky až na malé výjimky odpovídají teoretickým poznatkům.
68
6 Použitá literatura a odborné zdroje
•
ECKSTEIN, Reinhold. Imunohematologie a transfuzní lékařství. Východočeská tiskárna, s.r.o., Pardubice, 1994, 1.vydání, 173 s
•
HOŘEJŠÍ, Václav a Jiřina BARTŮŇKOVÁ. Základy imunologie. 3. vyd. Praha: Triton, 2005, 279 s. ISBN 80-7254-686-4
•
HRUBIŠKO, Mikuláš a kol. Hematologie a krevní transfuze II., Krevní transfuze. Praha: Avicenum, zdravotnické nakladatelství, 1983. 206 s
•
LITZMAN Jiří; FREIBERGER Tomáš, KRÁL Vlastimil, THON Vojtěch. Základy vyšetření v klinické imunologii. 2. dotisk 1. vyd. Brno: Masarykova univerzita, 2011. 53 s. ISBN 978-80-210-4227-8
•
PECKA Miroslav, MALÝ Jaroslav, DEJMKOVÁ Jana. Přehled laboratorní hematologie III, Hemostáza a Imunohematologie. Praha: Galén, 1998, 152 s. ISBN 80-85824-89-2
•
SAKALOVÁ Adriena, LIPŠIC Tomáš kol. Hematológia a transfuziológia: teória a cvičenia.Martin: Osveta, 1995. 527 s. ISBN 80-217-0444-6
•
SMETANA, Karel a kol. Hematologie a transfuziologie. 1. vyd. Brno: Institut pro další vzdělávání pracovníků ve zdravotnictví v Brně, 1992, 162 s. ISBN 80-7013-1128
•
TESAŘOVÁ, E. et.al. Studijní materiál pro program bakalářského studia imunohematologie a transfuzní služby, Transfuzní oddělení a krevní banka FN Brno, 2008, 112 s
•
WHITLOCK Sheryl. Immunohematology for medical laboratory technicians, Cengage Learning,
2009,
292
s,
dostupné
na
internetové
adrese:
http://books.google.cz/books/about/Immunohematology_for_Medical_Laboratory.htm l?id=oJYPTufyDvwC&redir_esc=y •
Biorad, Návody na vyšetření diagnostických gelových karet, diagnostických erytrocytů a ředících roztoků
•
Diagnostic
Grifols,
Návody
na
vyšetření
diagnostických
diagnostických erytrocytů a ředících roztoků •
Standardní operační postupy a pracovní návody TO FNKV
•
Laboratorní informační systém, fa. Steiner, TO FNKV
69
gelových
karet,
•
Dop_STL2011_07
Imunohematologie.
Dostupné
na
World
Wide
Web:
http://www.transfuznispolecnost.cz/dokumenty.php#postupy •
Dop_STL2010_06 Imunohem. vyš. v těhot. a po porodu V3. Dostupné na World Wide Web:http://www.transfuznispolecnost.cz/dokumenty.php#postupy
•
Dop_STL2011_08 Předtransfuzní vyšetření. Dostupné na World Wide Web: http://www.transfuznispolecnost.cz/dokumenty.php#postupy
•
http://faculty.matcmadison.edu/mljensen/BloodBank/lectures/i_and_p_blood_group_s ystems.htm
•
http://lup.lub.lu.se/luur/download? func=downloadFile&recordOId=548167&fileOId=548168
70
