MASARYKOVA UNIVERZITA ANALYTICKÉ METODY PRO STUDIUM OBSAHU ESTROGENŮ V KREVNÍ PLAZMĚ

MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA CENTRUM PRO VÝZKUM TOXICKÝCH LÁTEK V PROSTŘEDÍ

ANALYTICKÉ METODY PRO STUDIUM OBSAHU ESTROGENŮ V KREVNÍ PLAZMĚ DIPLOMOVÁ PRÁCE Mirka Onderková

VEDOUCÍ DIPLOMOVÉ PRÁCE doc. RNDr. Zdeněk Šimek, CSc.

Brno, Česká Republika

rok 2013

Bibliografický záznam Autor:

Bc. Mirka Onderková Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí

Název práce:

Analytické metody pro studium obsahu estrogenů v krevní plazmě

Studijní program:

Chemie

Studijní obor:

Chemie životního prostředí

Vedoucí práce:

doc. RNDr. Zdeněk Šimek, CSc.

Akademický rok:

2012/2013

Počet stran:

78

Klíčová slova:

Estrogeny, steroidy, plazma, krevní sérum, tělní tekutiny, osud v prostředí, LC-MS, kapalinová chromatografie-hmotnostní spektrometrie.

Bibliografic Entry Autor:

Bc. Mirka Onderková Fakulty of Science, Masaryk university Research centre for toxic compound in the environment

Název práce:

Analytical methods for determination of estrogens in blood plasma

Studijní program:

Chemistry

Studijní obor:

Environmental chemistry

Vedoucí práce:

doc. RNDr. Zdeněk Šimek, CSc.

Akademický rok:

2012/2013

Počet stran:

78

Klíčová slova:

Estrogens, steroids, plasma, blood serum, body fluid, fate in environment, LC-MS, liquid chromatography-mass spectrometry.

Abstrakt: Cílem diplomové práce bylo zavést metodu stanovení estrogenů v krevním séru pomocí kapalinové chromatografie s hmotnostní detekcí do laboratorní praxe pracoviště RECETOX. Teoretická část je zaměřena na sledované estrogeny a jejich množství v tělních tekutinách, metody přípravy vzorků a matriční efekty. V praktické části jsou srovnány metody přípravy vzorků z hlediska výtěžnosti a vlivu matrice. Extrakce estrogenů na pevnou fází byla vybrána jako nejvhodnější. Tento postup přípravy vzorků byl ověřen na pěti typech krevního séra a byl vyhodnocen vliv matrice na stanovení estrogenů v séru z různých zdrojů. Limit detekce navržené metody pro všechny sledované estrogeny (E1, E2, E3, EE2) v krevním séru je přibližně 10 pg ml -1. V závěru práce jsou výsledky analýzy estrogenů krevního séra žen vyšetřovaných na onkologickém pracovišti. Obsah estronu v těchto vzorcích byl v rozmezí od 12 – 448 pg ml-1 a obsah βestradiolu v rozmezí 16 – 463 pg ml -1.

Abstract: The aim of this thesis was to introduce method for the determination of estrogens (E1, E2, E3, EE2) in the blood serum by liquid chromatography with mass spectrometry into praxis of laboratories of RECETOX. The theoretical part is focused on the estrogens and their quantity in body fluids, methods of sample preparation and matrix effects. In the experimental part of the methods of samples preparation are compared. Solid phase extraction of estrogens was selected as the most suitable one. The sample preparation procedure was tested on five types of blood serum and matrix effect was compared. The detection limit of proposed method in blood serum is approx. 10 pg ml -1. The method was aplied for analyzes of estrogens in blood serum of women on oncology. The content of estrone in investigated samples was in the range from 12 to 448 pg ml -1 and content of βestradiol in the range from 16 to 463 pg ml-1 .

Poděkování: V prvé řadě bych chtěla poděkovat panu doc. RNDr. Zdeňku Šimkovi CSc. za odborné vedení, pomoc a cenné rady při zpracování diplomové práce. Dále Mgr. Elišce Čechové za ochotu, poskytnutí užitečných informací a pomoc při měření vzorků, Mgr. Kláře Hilschrové, Ph.D. a doc. MUDr. Daliborovi Valíkovi, Ph.D. za poskytnuté vzorky. Poděkování také patří všem pracovníkům Centra pro výzkum toxických látek v prostředí za pomoc při práci v laboratoři.

Prohlášení: Prohlašuji, že jsem tuto práci vypracovala samostatně s použitím uvedené literatury a pod vedením vedoucího diplomové práce doc. RNDr. Zdeňka Šimka, CSCs.

V Brně dne

………………………. Bc. Mirka Onderková

Seznam použitých zkratek E1

estron

alpha E2

alpha-estradiol

beta E2

beta-estradiol

E3

estriol

EE2

ethynylestradiol

E2-D, EE2-D deuterovaný estradiol a ethynylestradiol ESI

ionizace elektrosprejem

APCI

chemická ionizace za atmosférického tlaku

LC-MS/MS

kapalinová chromatografie s tandemovou hmotnostní detekcí

SPE

extrakce na pevnou fázi

LLE

extrakce z kapaliny do kapaliny

RIA

radioimunologická stanovení

GC-MS/MS

plynová chromatografie s tandemovou hmotnostní detekcí

MSTFA

N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamid

HPLC

vysokoúčinná kapalinová chromatografie

LOD

limit detekce

DNS-Cl

dansylchlorid

RE

výtěžnost (recovery)

ME

matriční efekt

ACN

acetonitril

HCOOH

kyselina mravenčí

MeOH

metanol

MOU

Masarykův onkologický ústav

Obsah I.

Cíle diplomové práce ............................................................................................................ 9

II. Teoretická část..................................................................................................................... 10 1.

Úvod ...................................................................................................................................... 10

2.

Rozdělení steroidních látek .................................................................................................. 11

3.

Estrogeny, jejich struktura a fyzikálně-chemické vlastnosti .............................................. 13

4.

Hladiny steroidních látek v tělních tekutinách a jejich vliv na organismus ...................... 16 4.1

Koncentrace estrogenů v krevním séru ........................................................................ 16

4.2

Koncentrace estrogenů ve slinách ................................................................................. 18

4.3

Koncentrace estrogenů v moči ...................................................................................... 19

5.

Vstup steroidních látek do prostředí .................................................................................... 20

6.

Matrice a jejich vliv na stanovení estrogenů ....................................................................... 21 6.1

6.1.1

Matrice moči ........................................................................................................... 22

6.1.2

Matrice plazmy ....................................................................................................... 23

6.1.3

Matrice slin ............................................................................................................. 23

6.2 7.

Matrice estrogenů........................................................................................................... 21

Vliv matrice .................................................................................................................... 24

Analýza estrogenů v krevní plazmě ..................................................................................... 25 7.1

Krevní plazma ................................................................................................................ 25

7.2

Zpracování vzorků plazmy pro LC-MS-MS analýzu .................................................. 26

7.2.1

Ředění ..................................................................................................................... 26

7.2.2

Srážení proteinů ...................................................................................................... 26

7.2.3

LLE.......................................................................................................................... 26

7.2.4

SPE .......................................................................................................................... 27

7.3 Instrumentální metody pro stanovení steroidních látek v krevní plazmě a tělních tekutinách................................................................................................................................... 27

8.

7.3.1

Plynová chromatografie ......................................................................................... 29

7.3.2

Vysoce účinná kapalinová chromatografie ........................................................... 29

Vyhodnocení analytů ve vzorku .......................................................................................... 31 8.1

Výtěžnost metody – recovery ........................................................................................ 31

8.2

Vliv matrice .................................................................................................................... 31

8.2.1 8.3

Výpočet vlivu matrice ............................................................................................ 32

Linearita .......................................................................................................................... 32

Experimentální část ......................................................................................................... 33

III. 1.

Použité chemikálie ................................................................................................................ 33

2.

Použité laboratorní přístroje a vybavení .............................................................................. 33

3.

Vzorky séra ........................................................................................................................... 34 3.1

Koňské sérum ................................................................................................................. 34

3.2

Ovčí sérum ..................................................................................................................... 34

3.3

Telecí sérum ................................................................................................................... 34

3.4

Slepičí sérum .................................................................................................................. 35

3.5

Lidské sérum .................................................................................................................. 35

Zpracování vzorků plazmy pro LC-MS-MS analýzu ......................................................... 35

4.

4.1

Použité vzorky ................................................................................................................ 35

4.2

Srovnání extrakčních postupů a technik pro zpracování vzorků krevního séra ......... 36

4.2.1

Extrakce na pevnou fázi ......................................................................................... 36

4.2.2

Extrakce z kapaliny do kapaliny............................................................................ 36

4.2.3

Srážení proteinů ...................................................................................................... 37

Metoda stanovení LC-ESI+-MS-MS.................................................................................... 38

5.

5.1

Optimální podmínky LC-ESI+-MS-MS metody pro stanovení estrogenů [52]. ........ 38

5.1.1

Podmínky HPLC separace ..................................................................................... 38

5.1.2

Podmínky MS-MS detekce .................................................................................... 39

5.2

Derivatizace estrogenů................................................................................................... 39

5.3

Postup pro stanovení estrogenů v krevním séru........................................................... 40

5.4

Kalibrační závislosti ...................................................................................................... 40

5.5

Limity detekce ................................................................................................................ 45

6.

Zhodnocení vlivu matrice ..................................................................................................... 46

7.

Reálné vzorky........................................................................................................................ 58 7.1

Vzorky hovězího séra .................................................................................................... 59

7.2

Vzorky lidského séra ..................................................................................................... 60

7.2.1

Závěr a diskuze ................................................................................................................ 61

IV. V.

Postup přípravy vzorku .......................................................................................... 60

Použitá literatura ................................................................................................................ 62

VI.

Seznam tabulek ................................................................................................................ 67

VII.

Seznam obrázků ............................................................................................................... 68

VIII.

I.

Přílohová část ............................................................................................................... 70

I.

Cíle diplomové práce

TEORETICKÁ ČÁST     

Steroidní látky a jejich hladiny v tělních tekutinách. Vstup steroidních látek do prostředí. Příprava, zpracování a uchování krevních vzorků pro stanovení estrogenů. Instrumentální metody stanovení steroidních látek v krevním séru a tělních tekutinách. Popis matričních efektů.

EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST     

Optimalizace parametrů pro zvolené instrumentální metody v čistých roztocích. Porovnání doporučených způsobů zpracování vzorků séra. Optimalizace metody kalibrace pro stanovení estrogenů v séru. Vliv matrice séra na stanovení estrogenů. Aplikace na reálné vzorky séra.

9

II.

Teoretická část

1. Úvod Estrogeny jsou řazeny mezi steroidní látky a jejich název je odvozen z estrálního cyklu. Tyto ženské pohlavní hormony se tvoří ve vaječnících, kůře nadledvin, v tukové tkáni a placentě. Hlavním estrogenem, který se vyskytuje u žen je estradiol, dále estron a v menších koncentracích poté estriol. Přestože jsou estrogeny jedny z nejdůležitějších hormonů ovlivňujících reprodukční systém ženy, malé množství nalezneme i u mužů. Koncentrace estradiolu slouží k zjištění funkce vaječníků a ke sledování menopauzální hormonální terapie. Vyšetření, kde se zjišťují hladiny estronu nebo estradiolu se provádí v případě nalezení klinických symptomů, jako jsou: poruchy menstruačního cyklu, předčasné dozrávání pohlavních orgánů, nespavost a vynechání menstruačního krvácení. V průběhu těhotenství jsou sledovány hladiny estriolu z důvodu možného ohrožení plodu. Tato práce se zaměřuje na zavedení metody stanovení estrogenů v krevním séru do praxe laboratoří RECETOX. V teoretické části jsou uvedeny sledované estrogeny, jejich hladiny v tělních tekutinách a metody zpracování a stanovení estrogenů. Praktická část se zabývá srovnáním postupů přípravy vzorků a vlivem matrice na stanovení estrogenů v krevním séru. Pro ověření metody bylo zvoleno pět typů séra, s kterými byl hodnocen a porovnán vliv matrice. Metoda byla použita pro stanovení estradiolu ve vzorcích hovězího séra, které bylo přečištěno pomocí dialýzy a dialýzy s aktivním uhlím. V závěru práce jsou výsledky analýz krevního séra žen vyšetřovaných na onkologické pracovišti.

10

2. Rozdělení steroidních látek Steroidy obsahují velkou skupinu chemických látek, které zahrnují mnoho hormonů a vitamínů. Jsou to deriváty cyklopentanu-o-perhydrofenantrenu, přírodní fyziologicky účinné látky rostlinného a živočišného původu. Steroidní hormony zahrnují pět hlavních skupin progesterony, glukokortikoidy, mineralokortikoidy, androgeny a estrogeny jejichž předchůdcem je vysoce lipofilní cholesterol [1]. Progesteron stejně jako estradiol patří mezi nejvýznamnější ženský pohlavní hormon. Je vylučován jak pohlavními žlázami, tak placentou během těhotenství. Hlavní funkcí je příprava dělohy pro implantaci vajíčka a mléčné žlázy pro kojení [1]. Glukokortikoidy a mineralokortikoidy jsou vylučovány v kůře nadledvin a umožňují tělu přednostní využití energetické hodnoty bílkovin a tuků. Ovlivňují látkovou přeměnu, zvyšují glykémii a jsou důležité pro zvládnutí stresu [1]. Androgeny jsou mužské pohlavní hormony, jejichž nejznámějšími představiteli jsou testosteron a 5α-dihydrotestosteron. Ovlivňují růst a kvalitu kostí, paměť, tvorbu červených krvinek a další procesy v organismu. Vliv androgenů na muže není pouze pozitivní, protože mohou urychlit růst nádoru prostaty, ale nezpůsobují ho [2]. Estrogeny jsou vylučovány pomocí vaječníků, ale během těhotenství je větší část vylučována placentou. Mezi estrogenní hormony patří estradiol, estriol a estron, z nichž nejdůležitější je estradiol. Jsou důležité pro vývoj sekundárních pohlavních znaků u ženského těla a také ovlivňují periodický vývoj děložní sliznice. Před pubertou jsou estrogeny vylučovány v nepatrném množství, po té se produkce zvyšuje 20 krát i více. Hladina estrogenů u dospělé ženy kolísá s menstruačním cyklem, vrcholu dosahuje těsně před ovulací, menšího vrcholu pak uprostřed luteální fáze. Z celkových účinků vedou estrogeny k zadržení vody a sodíku, zvyšují obsah bílkovin a snižují množství cholesterolu v krvi [1].

11

Obrázek 1: Syntéza steroidů z cholesterolu [1]

12

3. Estrogeny, jejich struktura a fyzikálně-chemické vlastnosti Tabulka 1: Fyzikálně-chemické vlastnosti estrogenů

Název

Systematický název

Vzorec

Mr

Rozpustnost ve vodě mg l-1 při 20°C

α-estradiol (α-E2)

estra-1,3,5(10)-trien-3,17α-diol

C18H24O2

272,4

13

3,94

β-estradiol (β-E2)

estra-1,3,5(10)-trien-3,17β-diol

C18H24O2

272,4

13

3,94

C18H22O2

270,4

13

3,43

C18H24O3

288,4

13

2,81

C20H24O2

296,4

4,8

4,15

Estron (E1)

Estriol (E3)

Ethynylestradiol (EE2) a

3-hydroxy-13-methyl6,7,8,9,11,12,13,14,15,16dekahydrocyklopenta[a]fenanthren17-on 13-methyl6,7,8,9,11,12,14,15,16,17dekahydropenta[a]fenanthren3,16,17-triol (8R,9S,13S,14S,17R)-17-ethynyl13-methyl-7,8,9,11,12,14,15,16octahydro-6Hcyklopenta[a]fenanthren-3,17-diol

rozdělovací koeficient n-oktanol-voda

13

log Kow a

Tabulka 2: Fyzikálně-chemické vlastnosti estrogenů

Název

Koeficient sorpce na org.uhlík Koc

Relativní estrogenní potenciál

α-estradiol (α-E2)

3300

0,005

β-estradiol (β-E2)

3300

1

Estron (E1)

4882

0,38

Estriol (E3)

1944

0,0024

Ethynylestradiol (EE2)

4770

1,19

alpha E2

beta E2

EE2

E3

E1

Obrázek 2: Struktury estrogenů [4]

Estrogeny mají nízkou rozpustnost ve vodě, která se pohybuje od 0,3 do 13 mg l-1. Všechny steroidy mají nízké tlaky par a relativně vysoké hodnoty pKa (nad 10). Rozdělovací koeficient oktanol-voda je u syntetických steroidů vysoký. Estrogeny jsou látky lipofilní a dobře rozpustné v organických rozpouštědlech [3].

14

17α-estradiol Je přírodní izomer, který je oproti 17β-estradiolu méně aktivní, protože se váže méně na estrogenní receptory. Hraje také důležitou roli při léčbě nemocí, jako jsou například Alzheimerova choroba a Ischemická cévní mozková příhoda [8]. 17β-estradiol Je biologicky aktivní estrogen v lidských buňkách. Estradiol je převažujícím estrogenem u žen od první menstruace po menopauzu, ale je také přítomen u mužů, kde tvoří aktivní metabolit testosteronu. Hladiny estradiolu v krevním séru u mužů (14-55 pg ml-1) jsou srovnatelné s hladinami estradiolu u postmenopauzálních žen (< 35 pg ml-1) [6,7]. Estron Vzniká především z androstendionu, který je produkován z kůry nadledvin. U premenopauzálních žen je více než 50 % estronu vylučováno vaječníky. U dětí před pubertou, můžu a postmenopauzálních žen je hlavní část estronu syntetizována z periferních tkání přeměnou androstendionu. Estron je primární složkou několika farmaceutických přípravků [9]. Estriol Ve významnějším množství vzniká v průběhu těhotenství, protože je produkován placentou. Snižuje symptomy roztroušené sklerózy u těhotných žen, zmírňuje příznaky menopauzy, ale naopak se podílí na rozvoji rakoviny prsu [10]. Ethynylestradiol Bio-aktivní estrogen, který se používá téměř ve všech hormonálních antikoncepcích. V játrech zvyšuje aktivitu jaterních enzymů, v menší míře proteinových komplexů. Klinicky velmi významným a nezastupitelným je především jeho příznivý vliv na zvyšování sérové hladiny proteinu vázajícího sexuální hormony. V jedné antikoncepční pilulce je obsaženo 1550 mg ethynylestradiolu [5].

15

4. Hladiny steroidních látek v tělních tekutinách a jejich vliv na organismus 4.1

Koncentrace estrogenů v krevním séru

Tabulka 3: Koncentrace estronu a estradiolu v krevním séru u dětí [14] Děti Muži

Ženy

Věk

Koncentrace estronu (pg ml-1)

Koncentrace estradiolu (pg ml-1)

Věk



7,1

16a

13a

7,1

29a

20a

11,5

22a

16a

10,5

10 – 33

24a

13,6

10 – 25

26a

11,6

15 – 43

60a

15,1

10 – 46

38a

12,3

16 – 77

15 – 85

18

10 - 60

10 - 40

14,5

17 – 200

15 - 350

a

Tyto hodnoty byly odhadnuty, protože závisí na nástupu dítěte do puberty. Průměrný věk u dívek je 10,5 (±2) roky. Existují důkazy o tom, že k pubertě může dojít až o rok dříve u obézních dívek. U chlapců se puberta dostavuje v průměrném věku 11,5 (±2) roky. Referenční rozmezí pro děti jsou založeny na publikovaných údajích a korelačním testu [14].

Tabulka 4: Koncentrace estronu v krevním séru u dospělých [14] Dospělí muži Koncentrace estronu (pg ml-1)

10 - 60

Dospělé ženy


10 - 40

Premenopauzální ženy Postmenopauzální ženy

16



17 - 200

15 – 350

7 - 40

< 10

Hormony produkované v těle jsou obvykle považovány za přínosné. Jsou důležité pro vývoj ženského a mužského těla, regulaci krevního tlaku a také pro reprodukci. V některých případech, tytéž sloučeniny mohou působit jako karcinogeny nebo karcinogenní aktivátory. V těchto situacích hraje důležitou roli načasování uvolňování hormonů. Ze všech hormonů v těle, pouze aldosteron nezpůsobuje žádný typ rakoviny [11]. Vznik rakoviny je dán změnami v genotypu, které se projeví transformací normální buňky na maligní. Ukázalo se, že steroidní hormony jsou zodpovědné za vznik chromozomových abnormalit v tkáňových kulturách. Studie potvrdily, že estrogen může indukovat dva typy genetických změn, numerické chromozomové změny, které nepředstavují poškození DNA, a strukturální chromozomové aberace, které představují potenciální riziko. Estrogenní látky mohou procházet placentou nebo mohou přecházet z mateřského mléka do novorozence a být tak potenciálním rizikem vzniku různých abnormalit, v estrogen cílových tkáních u potomků obou pohlaví. Tyto abnormality zahrnují rakovinu prsu, endometriosu, a denokarcinom dělohy u samčího pohlaví, dále změny v pohlavní diferenciaci a u samčího pohlaví snížení počtu spermií, benigní hyperplasii prostaty, rakovinu prostaty a varlat a s tím spojené reproduktivní problémy [12]. M. J. Reed a spol. zkoumali možnosti zvýšení tkáňové expozice estrogenů u pacientů s karcinomem prsu. Hladiny estradiolu byly analyzovány v krevní plazmě u postmenopauzalních žen s benigním nebo maligním onemocněním prsu a tyto hodnoty byly srovnány s úrovní hladiny estradiolu zdravých žen po menopauze. Procento nevázaného estradiolu u pacientů s rakovinou prsu bylo nepatrně nižší než u zdravých žen a to může mít za následek zvýšení tkáňové expozice estrogenu. V tomto případě i malé zvýšení, může mít patrný dopad [13].

Tabulka 5: Koncentrace estronu a estradiolu v krevní plazmě [13] Estron (pg ml-1)

Estradiol (pg ml-1)

Zdravé ženy po menopauze

28,2 ± 11,2a

14,0 ± 6,0

Ženy s benigním onemocněním prsu

21,8 ± 5,4

11,4 ± 5,2

Ženy s rakovinou prsu

31,4 ± 13,4

13,5 ± 6,1

a

± S.D

17

4.2

Koncentrace estrogenů ve slinách

Sliny jsou vynikající médium pro měření biologicky aktivní frakce steroidních hormonů v krvi, protože se jedná o přírodní ultrafiltrát krve. Steroidy, které nejsou vázány na proteiny v krvi, volně pronikají do slin. Základní měření hladiny hormonů ve slinách poskytuje přesné posouzení a mohou být použity i k identifikaci a sledování klinických stavů. Ve srovnání s krevním sérem má testování pomocí slin několik výhod. Sběr slin je jednoduchý, neinvazivní, bezbolestný a bezpečný pro pacienta i lékaře [16].

Tabulka 6: Množství estrogenů ve slinách u žen [16] Ženy

Premenopauzalní ženy

období


folikulární fáze

0,5 – 5,0

menstruace

3,0 – 8,0

luteální fáze Postmenopauzalní ženy


Koncentrace estriolu (pg ml-1)

2,5 – 5,4

4,4 – 8,3

2,5 – 5,4

3,0 – 11,8

0,5 – 5,0 < 1,5

Tabulka 7: Množství estrogenů ve slinách u mužů [16] Muži Koncentrace estradiolu (pg ml-1)


Koncentrace estriolu (pg ml-1)

< 1,5

2,5 – 5,4

4,7 – 7,1

V tabulce č.6 a č.7 jsou uvedeny běžné fyziologické hodnoty, které se vyskytují u mužů a žen. Hormonální hladiny se mezi jednotlivci značně liší. Jak by se dalo očekávat, ženy mají vyšší hladiny estrogenů ve srovnání s muži. Obecně platí, že úroveň každého z hormonů výrazně klesá s věkem [16].

18

4.3

Koncentrace estrogenů v moči

Játra jsou klíčovým orgánem pro metabolismus a vylučování estrogenů. Metabolity estrogenů jsou konjugovány v játrech a ledvinách na glukuronidy a sulfáty. Asi 50% těchto konjugovaných derivátů je vylučováno močí. Dalších 50% podléhá enterhepatální cirkulaci. Konjugované estrogeny jsou vylučovány žlučí do střeva, kde jsou hydrolyzovány. Asi 80% estrogenů vyloučených žlučí se zpět absorbuje a vrací se do jater. Konjugované i nekonjugované formy cirkulují v krvi ve vázané a nevázané formě. Asi 38% estradiolu je vázáno na sexuální hormony vázající globulin, 60% na albumin a pouze 2% cirkuluje ve volné frakci. Zpracování estrogenů po perorálním podání ovlivňuje jaterní metabolismus dalších látek (sacharidy, tuky, proteiny). Estrogenní substituční léčba má prokázaný příznivý účinek v prevenci recidivující močové infekce u postmenopauzálních žen [57].

Tabulka 8: Denní vylučování estrogenních steroidů močí u žen [17] Ženy

Premenopauzalní ženy

období

Koncentrace estradiolu (µg/den)

Koncentrace estronu (µg/den)

Koncentrace estriolu (µg/den)

menstruace

3,5

4

1

těhotenství

259

600

6000

2,3

4

1

Postmenopauzalní ženy

Tabulka 9: Denní vylučování estrogenních steroidů močí u mužů [17] Muži Koncentrace estradiolu (µg/den)

Koncentrace estronu (µg/den)

Koncentrace estriolu (µg/den)

1,6

3,9

1,5

Z tabulky č.8 a č.9 vyplývá, že hormony estradiol, estron a estriol je vylučován jak ženami, tak muži. Pokud ženy užívají antikoncepci je s těmito hormony společně vylučován také ethynylestradiol. Množství hormonů u žen se mění v závislosti na několika faktorech jako je například těhotenství nebo menstruace [17].

19

5. Vstup steroidních látek do prostředí Ženy vylučují močí především estrogeny v biologicky neaktivní formě jako sírany a glukuronidové konjugáty. Tyto konjugáty se mohou štěpit, což má za následek opětovnou aktivaci estrogenů na aktivní formu. Jejich štěpení závisí na acidobazických vlastnostech matrice a bakteriálním působení. Estrogeny vylučované člověkem a zvířaty se do životního prostředí dostávají prostřednictvím odpadních vod a ostatních živočišných odpadů. Vyloučené estrogeny jsou propuštěny do kanalizačního systému, který vede do čistírny odpadních vod, kde mohou být odstraněny rozkladem nebo pomocí aktivovaného kalu. Pokud se tyto estrogenní látky dostanou do potoků, řek, atd. mohou se sorbovat na sedimentech a různých pevných částicích. Vstup estrogenů do prostředí je znázorněno na obrázku č.3 [18].

Obrázek 3: Možnosti kontaminace životního prostředí estrogeny [18]

20

6. Matrice a jejich vliv na stanovení estrogenů Matrice estrogenů Analýza estrogenů v lidském a zvířecím organismu se uskutečňuje v tělních tekutinách, a to především v séru, moči a slinách. Výběr matrice pro stanovení estrogenů se provádí podle kritérií: 6.1

a) množství matrice potřebné pro analýzu, b) možnosti odběru vzorku, c) toxicita činidel, manipulace a likvidace vzorků [15].

Tabulka 10: Výhody a nevýhody různých matric pro analýzu estrogenů [15]

Získání matrice

Rizika

Sérum

Moč

Sliny

Vyžaduje klinickou praxi - napíchnutí žíly, invazivní.

Neinvazivní sběr.

Neinvazivní sběr.

Je považováno za Nepovažují se za biologicky nebezpečné, biologicky nebezpečné, může obsahovat pokud nejsou patogeny (např. HIV). kontaminovány krví.

Nepovažují se za biologicky nebezpečné, pokud nejsou kontaminovány krví.

Stálé při pokojové teplotě, dlouhodobě se uchovávají zmražené při – 20 °C.

Skladování

Zmražené při – 70°C.

Stálá při pokojové teplotě, dlouhodobě se uchovává zmražená při – 20 °C.

Výhody

Aktivní forma hormonu.

Vyžaduje méně citlivý postup, je možné vzorkovat denně, snadné uchovávání.

Je možné vzorkovat denně, snadné uchovávání.

Nevýhody

Vyžaduje klinickou praxi k odběru, vzorek je nestabilní, musí se zpracovat před skladováním, nemožný denní odběr.

Variabilní obsah vody vyžaduje korekci.

Velmi malé množství ve vzorku. Je nutné použít citlivý test.

21

Tabulka 11: Metody izolace estrogenů používané pro různé typy matric Matrice

Použitá metoda

Moč

SPE Odstřeďování Rozředění Srážení bílkovin

Krev

Extrakce Povrchová úprava

Sliny

Úprava pH Povrchová úprava Chemické ošetření

Matrice moči Moč obsahuje mnoho složek, které jsou v různých koncentracích. Závisí na typu diety a také na příjmu tekutin daného jedince. Tabulka č.12 shrnuje látky, které jsou obsaženy v moči a přispívají vlivu matrice na stanovení estrogenů. Každý vzorek má jiné složení, koncentraci složek, pH, iontovou sílu, hustotu a viskozitu. Proto je obtížné vliv přítomných látek a fyzikálně-chemických faktorů eliminovat [44]. 6.1.1

Tabulka 12: Složky obsažené v moči, které přispívají k vlivům matrice při analýze biologických materiálů [44]

Ionty pH 4.5-8.0

Organické molekuly

Krystaly

Proteiny

Sodík, draslík, chlorid, vápník, hořčík, amonný iont, síran, fosfát.

Močovina, kreatin, kyselina močová, citráty, aminokyseliny, patogeny DNA, RNA.

Šťavelan vápenatý, fosforečnan vápenatý, kyselina močová.

Imunoglobulin, albumin.

22

6.1.2

Matrice plazmy Plazma obsahuje rozpuštěné bílkoviny, aminokyseliny, peptidy, glukózu, vitamíny, hormony a lipidy. Všechny tyto látky mají vliv na stanovení jednotlivých složek vzájemně. Sérový protein je hlavní složkou plazmy, který má koncentraci v rozmezí 0,60 – 0,83 g l-1. Plazmatické proteiny se dělí na albuminy, globuliny a fibrinogeny. Albumin je jeden z hlavních proteinů plazmy a tvoří přibližně 60% všech proteinů plazmy. Je důležitý pro transport látek v krvi, jako jsou mastné kyseliny, bilirubin, léky a hormony. Koncentrace albuminu se mohou lišit u jednotlivých jedinců, protože jsou ovlivněny množstvím příjmu tekutin a potravy, jakož i onemocněním ledvin a jater [45].

Tabulka 13: Složky obsažené v matrici plazmy Látka

Množství

Voda

90%

Proteiny

~ 8%

Anorganické soli

0,9%

Organické látky (vitamíny, hormony, lipidy, atd.)

1,1%

6.1.3

Matrice slin Sliny jsou produktem slinných žláz u člověka a mnoha jiných živočichů. Jsou složeny z 99% vodou, ale rovněž obsahují enzymy, antiseptické látky a elektrolyty. pH slin se pohybuje v rozmezí 7-8 [44].

23

6.2

Vliv matrice

Důsledkem vlivu matrice jsou při analýze metodou LC/MS změny účinnosti ionizace způsobené přítomnosti látky vycházející z kolony společně s analyzovanou látkou. Změny ionizace jsou výsledkem soupeření netěkavých složek matrice a analytu. Je mnoho mechanismů, které způsobují změny ionizace, avšak ne všechny jsou zcela objasněny. Mechanismy ovlivnění ionizace se liší podle použité ionizační techniky. Předpokládá se, že hlavní příčina vychází z principu ionizace. Je dána změnou vlastností kapaliny, která vzniká při ionizaci, což způsobí přítomnost netěkavých nebo málo těkavých látek, které změní účinnost. Výsledkem může být změna v množství iontů v plynné fázi, které doputují do detektoru. Vliv matrice se projevuje jak potlačením, tak zvýšením ionizace. Potlačení ionizace může být způsobeno reakcí mezi analytem, metabolity nebo interním standardem. Zvýšení ionizace může být způsobeno fragmentací metabolitů ve zdroji nebo silnou vazbou analytu na biologickou matrici. Výsledkem těchto procesů může být zvýšení nebo snížení odezvy. Vliv matrice nelze předvídat. Ionizační technika za atmosférického tlaku (APCI) je vůči vlivům matrice méně odolná než ionizace eletrosprejem (ESI). ESI je významně ovlivněna látkami v širokém rozsahu jejich polarit, zatímco APCI je ovlivňována především hydrofobními komponentami [54]. Některé složky, které jsou obsaženy v mobilní fázi, mohou také mít vliv na ionizaci v iontovém zdroji. Jedná se o kyselinu trifluoroctovou přítomnou v mobilní fázi, přídavky směsi kyseliny propionové a izopropanolu za kolonou, ale také přidání kyseliny octové nebo propionové do mobilní fáze, která obsahuje kyselinu trifluoroctovou. Mezi další látky, které mají vliv na ionizaci, patří polymery obsažené v různých odběrových plastikových nádobách [54]. Velké rozdíly ve vlivu matrice jsou pozorovány při analýze vzorků připravených jednotlivými doporučovanými postupy. Při LC-ESI-MS-MS analýze vzorků připravených srážením proteinů acetonitrilem se vliv matrice projevuje nejvíce, díky nedostatečnému přečištění biologického materiálu. Tento způsob neodstraní dostatečně lipidy, fosfolipidy a mastné kyseliny. Ty mohou být příčinou snížení ionizace u látek, které mají krátký retenční čas. SPE umožňuje mnohem intenzivnější přečištění biologického materiálu. Komponenty v matrici, které jsou charakteristické pro jednotlivé biologické materiály, interferují v různých časech a v rozdílném rozsahu v průběhu analýzy. Při analýze moči nejvíce interferují anorganické soli, při analýze slin aminokyseliny, proteiny a mucin [54]. Složení matrice může ovlivnit kvantitativní i kvalitativní výsledek analýzy. Pro zhodnocení vlivu matrice se běžně využívají dvě metody: infuze standardu analyzované látky za kolonou nebo standardní přídavek po extrakci. Post-kolonovou infuzí se zjišťuje kvalitativní matricový efekt. Standardní přídavek po extrakci slouží ke kvantitativnímu hodnocení [54].

24

Vlivu matrice se nedá zcela předejít, ale lze jej potlačit použitím malých objemů, které se nastřikují na kolonu, naředěním a vhodnou úpravou vzorku, zvolením vhodných chromatografických podmínek, použitím interního standardu nebo metody standardního přídavku. Při použití interního standardu se předpokládá, že bude stejně ovlivněn matricí jako analyt [54].

7. Analýza estrogenů v krevní plazmě 7.1

Krevní plazma

Krevní plazma je nažloutlá kapalná složka, která tvoří přibližně 60 % objemu krve. Skládá se převážně z vody (90% obj.), zbytek tvoří plazmatické bílkoviny, glukóza, koagulační hormony, minerální ionty, hormony a oxid uhličitý [19,20]. Pro oddělení krevních elementů od plazmy je vhodná centrifugace při 1000 – 1500 g (g = násobek gravitačního zrychlení) po dobu 10ti minut při pokojové teplotě. Delší doba centrifugace nebo zvýšení počtu g vede často k částečné či úplné hemolýze. Plazma má být oddělená co nejdříve, nejpozději do 2 hodin od odběru. Avšak předčasné oddělení plazmy od krevních elementů (dříve než za cca 20 – 30 minut) může vést k dodatečné tvorbě fibrinu a dochází tak k pocentrifugační koagulaci. Z tohoto pohledu je plazma jako biologický materiál pro další analýzy vhodnější [19,20]. Transport materiálu by měl být šetrný, rychlý, při adekvátní teplotě a světelných podmínkách (kyselina listová a bilirubin jsou nestabilní na přímém světle). Pokud je vzorek krve transportován neprodleně po odběru do laboratoře, postačuje pro transport pokojová teplota. Při delším transportu je vhodnější posílat materiál v chladícím boxu apod. Pokud nelze dopravit krev do laboratoře do požadované doby, je vhodnější do laboratoře zaslat plazmu nebo sérum [19,20]. Mezi plazmou a sérem jsou určité rozdíly ve složení dané buď spotřebou analytů při srážení krve (fibrinogen, glukóza, trombocyty) nebo vznikajícím uvolněním z buněk (draselné ionty, fosfáty, laktát, amoniak). Krevní sérum na rozdíl od plazmy neobsahuje fibrinogen [19,20]. V případě odběru krve je nejprve oddělená plazma od krevních elementů. Teplota skladování biologického materiálu závisí na dvou faktorech, a to na stabilitě analytu a době provedení analýzy. Pokud je vzorek zpracován do 24 – 48 hodin maximálně do týdne, postačuje pro většinu analytů uchování při teplotě 4 °C. Pro dlouhodobé skladování proteinů je vhodná teplota – 20 °C popřípadě až – 80 °C. Při skladování je nutné, aby materiál byl dobře uzavřen a bylo zabráněno zahuštění vzorku odpařováním, mikrobiální kontaminaci, 25

vlivu světla a difúzi plynů a samozřejmě metabolismu krevních elementů. Chemická konzervace se pro plazmu užívá jen vzácně, spíše používáme konzervační činidla při skladování moče [19,20].

7.2

Zpracování vzorků plazmy pro LC-MS-MS analýzu

V biologických matricích může výsledek analýzy, citlivost a reprodukovatelnost ovlivnit mnoho komponent. Existuje několik laboratorních metod, které slouží k minimalizaci vlivu matrice. Mezi tyto metody patří extrakce na pevnou fázi (SPE), extrakce z kapaliny do kapaliny (LLE), srážení proteinů a ředění[44].

Ředění Vhodná příprava vzorků může pomoci odstranit nebo minimalizovat vlivy matrice. V některých případech je dostačující matrici zředit. Ředění se používá u analýz, kde nejsou velké požadavky na limity detekce. Je doporučováno ředění vodou 2x – 10x. [44] 7.2.1

Srážení proteinů Tato metoda patří mezi jednu z nejstarších a využívá se pro odstranění vysokých koncentrací proteinů před vlastní analýzou. Rychlý a jednoduchý postup oddělení bílkovin současně přispívá k uvolnění analytu z bílkovinné vazby. Naopak zde existuje riziko okluze sledované látky v bílkovinné sraženině a zkreslení analytických výsledků. Pro srážení se obvykle používá acetonitril v poměru k séru 2:1 [47]. 7.2.2

7.2.3

LLE Extrakce z kapaliny do kapaliny je běžně využívanou technikou, která se používá pro čištění vzorků s nižší molekulární hmotností, jako jsou drogy a hormony. Nevýhodou této metody je časová náročnost a také vyžaduje nakládání s velkým množstvím toxických rozpouštědel. Mezi nejpoužívanější rozpouštědla patří methyl-tercbutylether a ethylacetát, které se přidávají k séru v poměru 3:2 [44].

26

7.2.4

SPE Extrakce na pevnou fázi je další široce používaná metoda, která má oproti LLE několik výhod: a) b) c) d) e)

vyšší výtěžnost, lepší selektivita, specifičnost a reprodukovatelnost, menší objemy organického rozpouštědla, kratší doba přípravy vzorku, možnost automatizace [46].

Další důležitou výhodou SPE je výběr z široké škály sorbentů, které umožňují výběr různých typů interakcí pro čištění vzorků. Mezi nejpoužívanější patří křemičité sorbenty (silikagel) s funkčními skupinami oktyl (C8) a oktadecyl (C18).

7.3

Instrumentální metody pro stanovení steroidních látek v krevní plazmě a tělních tekutinách

Kvalitní stanovení estrogenů s vysokou citlivostí, specifičností a reprodukovatelností je nezbytné pro provádění sofistikovaných epidemiologických studií [21]. V klinické praxi se pro kvantifikaci steroidních látek nejčastěji používají radioimunologické metody (RIA), které jsou snadno proveditelné, mají vysokou citlivost a jsou časově nenáročné. Naopak nevýhodou imunochemických technik je reaktivita protilátek, které jsou podobné hormonům [22]. Mezi metody, které jsou také vhodné pro kvantifikaci a identifikaci steroidů patří plynová chromatografie, superkritická kapalinová chromatografie, sloupcová kapalinová chromatografie, planární chromatografie a také kapilární elektroforéza. Detekce separovaných složek se provádí přímo nebo nepřímo pomocí fotometrie, elektrochemie, fluorescence nebo hmotnostní spektrometrie. Rozmanitost steroidních struktur a jejich rozsah polarit představují problémy pro separaci a také analýzu steroidů v jednom vzorku pomocí klasické isokratické chromatografické metody. Proto je vhodné před analýzou provést derivatizaci vzorku nebo měnit složení mobilní fáze během separace, tvz. gradientová eluce [22]. V literatuře jsou uvedeny také voltametrické a polarografické metody pro velmi citlivé stanovení estrogenů v krvi. B.Salci a I.Biryol zkoumali β-estradiol pomocí skelných uhlíkových elektrod za použití cyklické voltametrie a diferenční pulsní voltametrie. Výsledky z této analýzy byly porovnány s výsledky z vysoce účinné kapalinové chromatografie a nebyly nalezeny žádné významné rozdíly [23].

27

Tabulka 14: Typy chromatografie a ionizace, použitá derivatizační činidla a dosažené LOD v krevním séru

Typ chromatografie

Typ ionizace

LOD pg ml-1 Derivatizace

LOD pmol l-1 Zdroj

Estradiol

Estron

Estradiol

Estron

0,6

-

2,3

-

[24]

4,0

4,0

14,7

14,8

[25]

Dansylchlori d (DC)

8,0

8,0

29,4

29,6

[26]

LC

Ionizace elektrosprejem (ESI)

Picolinoyl (P)

0,5

1,0

1,8

3,6

[27]

LC


Pyridyl-3sulfonyl (PS)

10,0

-

36,7

-

[28]

LC


N-methylnicotinyl (NMN)

0,4

0,4

1,6

1,3

[29]

GC

LC

LC

Negativní chemická ionizace (ECNCI) Chemická ionizace za atmosferic -kého tlaku Ionizace (APCI) elektrosprejem (ESI)

Pentaflourbe nzyl/ Trimethylsily l (PFB/TM S) Pentaflourbe nzyl (PFB)

Jak už bylo zmíněno, metody RIA jsou nejpoužívanější v klinické praxi, ale jejich nevýhodou je malá citlivost při nízkých koncentracích. Pro dosažení účinnější kvantitativní a kvalitativní analýzy se využívá kombinace technik. V případě měření více estrogenů v plazmě nebo séru se používá LC-MS-MS nebo GC-MS-MS metoda [30,31].

28

Plynová chromatografie Díky vysoké rozlišovací schopnosti, relativně snadnému použití se plynová chromatografie řadí mezi běžně používanou techniku pro stanovení steroidních látek. Metoda GC-MS-MS umožňuje analyzovat látky na úrovni femtogramu. Naopak nevýhodou této metody je časově náročná derivatizace, která se provádí pentaflourbenzylem popřípadně NMethyl-N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamidem (MSTFA). Dalším omezením této metody je převod na těkavé deriváty a potřeba většího množství vzorku, což může u některých analýz způsobit komplikace [31,48,49]. 7.3.1

Vysoce účinná kapalinová chromatografie HPLC je nejuniverzálnější separační technika pro analýzu steroidních látek. Tato technika může být použita pro preparativní, kvalitativní a kvantitativní analýzy. Pro separaci steroidních látek se ve většině případech, využívá reverzní chromatografie se stacionárními fázemi C8 nebo C18 [48]. 7.3.2

7.3.2.1 Derivatizace estrogenů pro LC-MS/MS a GC-MS/MS stanovení Derivatizace se provádí za účelem chemické přeměny molekul separované látky, umožnění vlastní analýzy nebo zlepšení vlastnosti analyzovaných látek (stabilita, těkavost, zvýšení ionizační účinnosti). V případě GC dochází k odstranění aktivních vodíkových atomů a zvyšuje se stabilita a těkavost separovaných látek. Optimální je odstranit všechny aktivní vodíky (-OH, -NH2 skupiny) v jednom reakčním kroku. Derivatizace v HPLC se provádí za účelem připojení určité funkční skupiny, která umožní detekci [32].

29

Tabulka 15: Derivatizační činidla pro LC-ESI-MS/MS

LOD (matrice)

Název činidla

Analyt

Matrice

Hydroxylamin

sukcinylaceton

moč

0,063 µmol.l-1

[33]

Cyklohexanedion

alifatický aldehyd

plazma

20 – 100 pg

[34]

dehydroepiandrosteron

sliny

25 pg.ml-1

[35]

endogenní estrogeny

moč

2 pg

[36]

17β-estradiol

sérum, plazma

0,6 pg

[37]

ethinylestradiol

plazma

2,5 pg.ml-1

[38]

1-hydroxypyren

moč

20 pg.ml-1

[39]

Kyselina pikolinová

7α-hydroxy-4cholesten-3-on

plazma

100 fg

[40]

Isonicotinyl azid (NA)

estron, estradiol

2 fmol

[41]

HCl-butanol

methylmalonová kyselina

sérum, plazma, moč

0,5 µmol.l-1

[42]

Anhydrid kyseliny pentafluoro propionové

diaminy

moč, plazma

0,2 – 0,3 fmol

[43]

2-hydrazino-1methyl-pyridin (HMP) Dansylchlorid (DNS-Cl)

30

Zdroj

8. Vyhodnocení analytů ve vzorku 8.1

Výtěžnost metody – recovery

Recovery neboli výtěžnost udává poměr množství (koncentrační) analytu získaného danou analytickou metodou (n II) k přijaté referenční hodnotě (n I):

(1)

Hodnota výtěžnosti se může vyjadřovat jako desetinný zlomek nebo v procentech (Re(%)=Re.100) [50]. Společnost Roche testovala vzorky v rámci imunologického testu pro in vitro kvantitativní stanovení estradiolu v lidském séru, plazmě a za přijatelné bylo považováno kritérium výtěžnosti v rozmezí 70 – 130% [54]. Nelson a spol. ve své studii udává hodnoty výtěžnosti pro analyty E1 a E2. Oba standardy byly ve ˃ 98 % čistotě a byly obsaženy v sérovém hovězím albuminu. Výtěžnosti známého množství analytu ve vzorku se pohybovaly v rozmezí od 78 % do 108 % u E1 a od 83 % do 110 % u E2. Testy prokázaly lineární a reprodukovatelné kalibrační křivky pro každý z estrogenů (r2 = 0,995 pro E1 a 0,996 pro E2) [51].

8.2

Vliv matrice

Vliv matrice na výsledek stanovení cílových analytů by měly být testován v rámci vývoje každé nové metody. Mezi nepoužívanější techniky pro zhodnocení vlivu matrice patří infúze roztoku analytu mezi chromatografickou kolonu a MS detektorem. Pozorovaná míra potlačení iontů se může měnit v závislosti na koncentraci analytu a nemusí se projevit hned z počátku analýzy, ale až v průběhu následných injekcí. Další často používanou technikou je testování poměru mezi naměřenými odezvami detektoru v pro cílené analyty, které byly přidávány do vzorku a odezvami detektoru pro roztoky standardů v čistém rozpouštědle [55,56].

31

Výpočet vlivu matrice Vlivy matrice lze vyjádřit dvěma způsoby. Tím prvním je postup navržený Matuszewskim, který matriční efekt (ME) hodnotí jako poměr signálu vzorku s přídavkem analytů po extrakci k čistému standardu [56]. Druhý způsob je dle Ch. Sandy a kol. podíl směrnic kalibračních křivek vzorku séra s přídavkem analytu k čistému standardním roztoku [60]. 8.2.1

(2)

(3)

Pokud je hodnota ME menší než 85% a větší než 115%, mají koelující látky signifikantní vliv na kvantitativní vyhodnocení.

Tabulka 16: Vliv matrice pro modelové analyty stanovované v lidské krevní plazmě [57]

Modelové analyty

A

B

C

8.3

Koncentrace (ng ml )

Srážení proteinů ME (%)

SPE-srážení proteinů ME (%)

5 50 500 5 50 500 5 50 500

127 112 99 125 112 97 133 108 96

125 111 90 87 74 87 82 117 94

-1

Linearita

Linearita je chápána jako přímková závislost mezi dvěma náhodnými proměnnými, tj. odezvou instrumentace (analytickým signálem) a koncentrací analytu. Těsnost vzájemné závislosti dvou náhodných proměnných charakterizuje korelační koeficient ®. Při ideální lineární závislosti nabývá korelační koeficient hodnoty +1. Čím více se v případě reálných kalibračních závislostí blíží jedné, tím je závislost obou proměnných těsnější [50].

32

III.

Experimentální část

1. Použité chemikálie              

acetonitril pro HPLC, čistota 99,9 % (Sigma Aldrich, Německo) kyselina mravenčí, čistota 98% (Sigma Aldrich, Německo) dansylchlorid (Sigma Aldrich, Německo) hydrogen uhličitan sodný (Sigma Aldrich, Německo) methanol, čistota 99,9% (Labscan, Polsko) aceton (Labscan, Polsko) dichlormethan (Labscan, Polsko) n-hexan (Labscan, Polsko) ethanol (absolutní, J. T. Baker, Polsko) methyl-tercbutylether (Sigma Aldrich, Španělsko) ethylacetát, čistota 99,8 % (Sigma Aldrich, Španělsko) redestilovaná voda (Osmonic 2, Česká Republika) standardy pH 4, 7, 9 + roztok pro uchovávání eletrod (Hamilton, Švýcarsko) standardy estrogenů: 17α-ethynylestradiol, čistota 98%, estriol, čistota 99,9% (Sigma Aldrich, Španělsko) 17β-estradiol, čistota 98% (Sigma Aldrich, Španělsko) estron, čistota 99,3% (Sigma Aldrich, Španělsko) 17α-estradiol, čistota 98% (Sigma Aldrich, Španělsko) 17α-ethynylestradiol-2,4,16,16-d4, čistota 98,3 % (CDNIsotopes, Kanada) 17β-estradiol-2,4,16,16-d4, čistota 98,3 % (CDN-Isotopes, Kanada)

2. Použité laboratorní přístroje a vybavení         

analytické váhy (Mettler-Toledo AE , Švýcarsko) pH metr pH 5500 (CyberScan, Eutech Instruments) magnetická míchačka IKA RCT basic (Labicom, ČR) evatherm (Labicom, ČR) skleněná elektroda Single Pore (Hamilton, USA) SPE Vacuum Manifold (J. T. Bakter Inc.) vakuová pumpa (GAST, USA) ultrazvuková lázeň (Bandelin electronic) automatické pipety Eppendorf 10-100 µl, 100-1000 µl, 0,5-5 ml 33

    

HPLC 1200 Agilent Technologies,, MS-MS Agilent Technologies 6410 Triple Quad (Agilent Technologies, Inc., CA, USA) LC kolona ACE 3 C18 (250mm x 4,6mm, 3 µm, Advanced Separation Technologies, UK) Centrifuga EBA 21 (Hettich, Německo) Vortex (VELP Scientifica, Itálie) Třepačka s krouživým pohybem GFL 3020 (Merci, ČR)

3. Vzorky séra 3.1 Koňské sérum H1270 Sigma Aldrich Původ: USA Použití: kultivace buněk Zpracování: sterilní filtrace

3.2 Ovčí sérum S2263 Sigma Aldrich Původ: USA Použití: kultivace buněk Zpracování: sterilní filtrace

3.3 Telecí sérum C8056 Sigma Aldrich Původ: USA Vzhled (barva a forma): žlutý, oranžový až světle hnědý roztok Množství proteinů: 45-75 mg ml-1 Použití: kultivace buněk Zpracování: sterilní filtrace

34

3.4 Slepičí sérum C5405 Sigma Aldrich Původ: USA Použití: buněčné kultury Zpracování: sterilní filtrace

3.5 Lidské sérum H4522 Sigma Aldrich Původ: lidská plazma od muže, USA Vzhled (barva a forma): bezbarvá až hnědožlutá tekutina Cholesterol: 110-210 mg dl-1 Triglycerid: 50-130 mg dl-1 Glukóza: 60-140 mg dl-1 Sodík: 100-200 mmol l-1 Množství proteinů: 4,0-9,0 g dl-1 Železo: 30-100 µg ml -1 pH: 7,0-9,0 Zpracování: sterilní filtrace

4. Zpracování vzorků plazmy pro LC-MS-MS analýzu 4.1

Použité vzorky

Pro ověření metody extrakce a LC-MS-MS bylo použito pět různých typů krevního séra, a to telecí, koňské, ovčí, slepičí a lidské. Všechna tato séra byla zakoupena od firmy Sigma Aldrich. Krom těchto vzorků bylo analyzováno hovězí sérum, které bylo přečištěno pomocí samotné dialýzy a poté dialýzy spojené s aktivním uhlím. Dále bylo analyzováno osm vzorků krevního séra žen z onkologického pracoviště. Tyto vzorky poskytl pan doc. MUDr. Dalibor Valík, Ph.D. z Masarykova onkologického ústavu. 35

4.2

Srovnání extrakčních postupů a technik pro zpracování vzorků krevního séra

Z doporučených extrakčních postupů a technik uvedených v literatuře byly testovány tři metody. Jednalo se o extrakci na pevnou fázi (SPE), extrakci z kapaliny do kapaliny (LLE) a srážení proteinů. Na závěr každého postupu byly vzorky sér zderivatizovány podle postupu uvedeném v kapitole 5.2. Ke srovnání byly použity hodnoty výtěžnosti a „matrix effect“ vypočteného podle rovnice (1) na str. 31 a (2) na str. 32.

Extrakce na pevnou fázi Pro zakoncentrování estrogenů a přečištění krevní plazmy pomocí SPE byl zvolen následující postup: 4.2.1

 

Typ SPE kolonky: Supelclean LC-18 Tubes, 6 ml (0,5 g) Kondicionace kolonky: 5 ml 100 % methanolu 5 ml 10 % methanolu ve vodě  Aplikace vzorku: 1 ml krevního séra obohaceného směsi estrogenů (3 ng ml -1)  Recovery standard: EE2-D (3 ng ml -1)  Promytí sorbentu: 5 ml 30 % methanolu ve vodě  Eluce analytu: 2 ml 100 % methanolu  Interní standard: E2-D (4 ng ml -1)

4.2.2

Extrakce z kapaliny do kapaliny Pro ověření této metody byl použit níže popsaný postup:      

Organické rozpouštědlo: methyl-tercbutylether, ethylacetát-hexan (3:2) Objem rozpouštědla: 6 ml Množství vzorku: 1 ml krevního séra obohaceného směsi estrogenů (3 ng ml -1) Recovery standard: EE2-D (3 ng ml -1) Vortex: 10 minut Interní standard: E2-D (4 ng ml -1)

36

4.2.3

Srážení proteinů Tento níže uvedený postup byl zvolen z důvodu velké koncentrace proteinů:      

Organické rozpouštědlo: acetonitril Objem rozpouštědla: 2 ml Množství vzorku: 1 ml krevního séra obohaceného směsi estrogenů (3 ng ml -1) Recovery standard: EE2-D (3 ng ml -1) Centrifugace: 6000 rpm po dobu 10-ti minut Interní standard: E2-D (4 ng ml -1)

Tabulka 17: Srovnání výtěžnosti a vlivu matrice (ME) jednotlivých technik

LLE (methyltercbutylether)

SPE RE (%) 77 88 88 106 85

E1 alpha E2 beta E2 EE2 E3

ME (%) 115 110 98 105 115

RE (%) 74 75 79 68 57

LLE (ethylacetáthexan)

ME (%) 71 70 76 77 106

RE (%) 105 93 90 87 84

ME (%) 53 55 55 61 101

Srážení proteinů RE (%) 79 84 71 73 62

ME (%) 112 112 112 113 119

Z údajů uvedených v tabulce č. 17 je zřejmé, že vliv matrice je nejmenší v případě zpracování vzorků metodou SPE. Obrázek 4: Srovnání výtěžnosti jednotlivých postupů 120 100

ME (%)

80

SPE LLE (methyl-tercbutylether)

60

LLE (ethylacetát-hexan) 40

Srážení proteinů

20 0 E1

alpha E2

beta E2

EE2

E3

37

Obrázek 5: Srovnání matričních efektů jednotlivých postupů 140

120

ME (%)

100 SPE

80

LLE (methyl-tercbutylether) 60

LLE (ethylacetát-hexan)

40

Srážení proteinů

20

0 E1

alpha E2

beta E2

EE2

E3

5. Metoda stanovení LC-ESI+-MS-MS Analýza vzorků byla prováděna kapalinovou chromatografií (HPLC Agilent 1200 Series) s hmotnostní detekcí (ESI-MS-MS Agilent Technologies 6410 Triple Quad). Pro separaci analytů byla zvolena kolona ACE 3 C 18 (150 mm x 4,6 mm, 3 µm). Metoda byla převzata z diplomové práce Elišky Čechové, kde byly optimalizovány podmínky separace a MS detekce pro roztoky standarů v čisém rozpouštědle (ACN). Optimální podmínky LC-ESI+-MS-MS metody pro stanovení estrogenů [52].

5.1 5.1.1   

 

Podmínky HPLC separace Stacionární fáze: ACE 3 C18 (150 mm x 4,6 mm, 3 µm) Mobilní fáze: A: 7 mmol l-1 HCOOH ve vodě B: ACN Gradient: 0 min: 60 % ACN 3,5 min: 60 % ACN 17 min: 92% ACN 18 min: 60 % ACN 25 min: 60 % ACN Teplota kolony: 25 °C Objem nástřiku: 10 µl

38

5.1.2    

Podmínky MS-MS detekce Průtok dusíku: 8 l min -1 Kapilární napětí: 4500 V Teplota sušícího plynu: 320 °C Tlak ve zamlžovači 50 psi

Tabulka 18: MRM přechody, napětí fragmentoru a kolizní energie analyzovaných estrogenů pro MS/MS detekci[52]

E1 E2 EE2 E3 IS: E2-D IS: EE2-D

Prekurzovaný ion [m/z]

Produkovaný ion [m/z]

Napětí fragmentoru [V]

Kolizní energie [V]

504 506 530 522 510 534

171 (156) 171 (156) 171 (156) 171 (156) 171 (156) 171 (156)

250 250 250 250 250 250

38 42 40 42 42 40

Derivatizace estrogenů Z důvodu snížení limitů detekce byla zvolena předkolonová derivatizace. Postup derivatizace byl převzat podle Lina a spol. [59] 5.2

1. 50 µl kalibračního standardu promícháno s 50 µl NaHCO3 (100 mmol l-1 v H2O, pH 10,5 upraveno pomocí NaOH). 2. Přidáno 50 µl dansylchloridu (1 mg ml-1 v acetonu). 3. Promíchání po dobu 1 minuty. 4. Směs je inkubována 3 minuty při 60 °C a poté ochlazena na laboratorní teplotu. 5. Roztok se odpaří pod mírným proudem dusíku do sucha a následně se doplní na 1 ml 60-ti % methanolem ve vodě. Obrázek 6: Schéma reakce 17β-estradiolu s dansylchloridem [53]

39

5.3

Postup pro stanovení estrogenů v krevním séru

Obrázek 7: Schéma postupu pro stanovení estrogenů v krevním séru

Vzorek plazmy

SPE

(1ml)

 Kondicionace  Nanesení vzorku  Promytí  Eluce

5.4

Derivatizace

LC-ESI-MS-MS

 Dansylchlorid

IS: EE2-D

Kalibrační závislosti

V případě, že jsou vzorky zpracovávány pomocí extrakce, je vhodné použití interního standardu, který minimalizuje rozdíly v účinnosti extrakce a ionizace. Byly srovnávány dva typy interních standardů, které se doporučují pro stanovení estrogenů, a to interní standard E2-D a EE2-D. Zhodnocení použitých standardů bylo provedeno pomocí kalibrační závislosti, kde na ose x jsou uvedeny koncentrace standardních roztoků a na ose y podíl ploch píků standardů a interního standardu. Z kalibračních závislostí grafů standardů v čistých roztocích č.8 až č.17 vyplývá, že vhodnější interní standard je EE2-D, protože poskytoval větší linearitu naměřených hodnot. Kalibrační roztoky byly připraveny ředěním ze zásobního roztoku směsi estrogenů v acetonitrilu o koncentraci 239,7 µg ml-1 . Byly připraveny koncentrace 80, 160, 240, 320, 400 a 480 pg ml-1 . Tyto roztoky byly naředěny vodou a to z důvodu srážení proteinů v reálných vzorcích v případě ředění acetonitrilem. Do každého z roztoků byl přidán interní standard EE2-D nebo E2-D o koncentraci 200 pg ml -1. Vzorky byly připraveny podle výše uvedeného postupu znázorněném v obr. č.7.

40

plocha píku std./plocha píku IS EE2-D

Obrázek 8: Kalibrační závislost pro E1 při použití IS EE2-D

E1 2,50 y = 0,0039x + 0,0587 R² = 0,9933

2,00 1,50 1,00 0,50 0,00 0

80

160

240

320

400

480

560

400

480

560

Koncentrace standardu

plocha píku std./plocha píku IS E2-D

Obrázek 9: Kalibrační závislost pro E1 při použití IS E2-D

E1 1,80 1,60 1,40 1,20 1,00 0,80 0,60 0,40 0,20 0,00

y = 0,0029x + 0,1575 R² = 0,8551

0

80

160

240

320


41


Obrázek 10: Kalibrační závislost pro alpha E2 při použití IS EE2-D

alpha E2 1,80 1,60 1,40 1,20 1,00 0,80 0,60 0,40 0,20 0,00

y = 0,0034x + 0,0056 R² = 0,9948

0

80

160

240

320

400

480

560

480

560



Obrázek 11: Kalibrační závislost pro alpha E2 při použití IS E2-D

alpha E2 2,00 1,80 1,60 1,40 1,20 1,00 0,80 0,60 0,40 0,20 0,00

y = 0,0033x - 0,0319 R² = 0,8838

0

80

160

240

320


42

400


Obrázek 12: Kalibrační závislost pro beta E2 při použití IS EE2-D

beta E2 1,80 1,60 1,40 1,20 1,00 0,80 0,60 0,40 0,20 0,00

y = 0,0035x - 0,0512 R² = 0,9935

0

80

160

240

320

400

480

560

480

560



Obrázek 13: Kalibrační závislost pro beta E2 při použití IS E2-D

beta E2 2,00 1,80 1,60 1,40 1,20 1,00 0,80 0,60 0,40 0,20 0,00

y = 0,0036x - 0,1548 R² = 0,9352

0

80

160

240

320


43

400


Obrázek 14: Kalibrační závislost pro E3 při použití IS EE2-D

E3 1,40 y = 0,0026x - 0,0478 R² = 0,996

1,20

1,00 0,80

0,60 0,40

0,20 0,00 0

80

160

240

320

400

480

560

400

480

560



Obrázek 15: Kalibrační závislost pro E3 při použití IS E2-D

E3 1,00 0,90 0,80 0,70 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00

y = 0,0019x + 0,0108 R² = 0,9557

0

80

160

240

320


44


Obrázek 16: Kalibrační závislost pro EE2 při použití IS EE2-D

EE2 1,80 1,60 1,40 1,20 1,00 0,80 0,60 0,40 0,20 0,00

y = 0,0031x - 0,0295 R² = 0,9906

0

80

160

240

320

400

480

560

480

560



Obrázek 17: Kalibrační závislost pro EE2 při použití IS E2-D

EE2 1,40

1,20 y = 0,0024x + 0,0513 R² = 0,9071

1,00

0,80 0,60 0,40 0,20 0,00 0

80

160

240

320

400


5.5

Limity detekce Limity detekce byly stanoveny jako koncentrace poskytující při LC-ESI-MS/MS odezvu (výška chromatografického píku odpovídající trojnásobku šumu základní linie. Pro roztoky standardů v čistém rozpouštědle byla vypočtena hodnota 5 pg ml -1 a pro vzorky krevního séra 8-10 pg ml-1 . Limity detekce byly ověřeny analýzou roztoků na úrovni koncentrací vypočítaných z odezev roztoků použitých pro konstrukci kalibračních křivek.

45

6. Zhodnocení vlivu matrice Pro zhodnocení vlivu matrice séra z různých zdrojů na analýzu estrogenů byly provedeny tři série analýz s pěti různými séry. Jednalo se o lidské, ovčí, slepičí, telecí a koňské sérum. V každé sérii byly vzorky séra obohaceny přídavkem směsi estrogenů o koncentraci 80, 160, 240, 320, 400 a 480 pg ml -1 v jiné fázi zpracování vzorku séra pro LCMS-MS analýzu. S každou sérií analýz byl analyzován blank, který byl připraven z 1 ml séra bez přídavku směsi estrogenů, a také byl do každého vzorku přidán interní standard o koncentraci 200 pg ml-1. Vliv matrice byl hodnocen podle metodiky Matuszewski a kol. [56] z poměru ploch píků analytů z analýz 1. a 2. série a metodou srovnání směrnic kalibračních křivek připravených z roztoků estrogenů v čistém rozpouštědle a kalibračních křivek v matrici krevního séra. V první sérii analýz se projeví vliv matrice na extrakci, derivatizaci a LC-MS analýzu, v druhé sérii analýz se projeví vliv matrice na derivatizaci a LC-MS analýzu a v případě třetí série pouze vliv matrice na LC-MS analýzu dansyl derivátů estrogenů. Postup přípravy vzorků je uveden v tabulce č. 19. Tabulka 19: Postup přípravy vzorků pro zhodnocení vlivu matrice a výtěžnosti SPE

1. Série (7 vzorků)

2. série (7 vzorků)

3. série (7 vzorků)

Vzorek plazmy (1 ml)



Přídavek 80, 160, 240, 320, 400 a 480 pg ml-1 směsi estrogenů

SPE

SPE

Přídavek EE2-D (200 pg ml -1)

Přídavek 80, 160, 240, 320, 400 a 480 pg ml-1 směsi estrogenů

Derivatizace

SPE

Přídavek EE2-D (200 pg ml -1)

Přídavek 80, 160, 240, 320, 400 a 480 pg ml-1 směsi dansyl-estrogenů

Derivatizace

Derivatizace

Přídavek dansyl-EE2-D (200 pg ml -1)

LC-MS-MS

LC-MS-MS

LC-MS-MS

46

Vliv matrice byl zhodnocen pomocí dvou typů výpočtů. První je vyjádření podílu směrnic kalibračních přímek a druhý poměr ploch jednotlivých estrogenů z LC-MS chromatogramů. Výpočty pomocí kalibračních křivek jsou vyjádřeny pomocí přepočtu ploch píků na interní standard, ale také bez započtení IS. Pokud je hodnota matričních efektů 100 %, znamená to, že matrice nemá žádný vliv na experiment. Interval ME pro hodnocení nízkého vlivu je 85-115%. Výtěžnost SPE extrakce byla vypočtena jako poměr ploch píku 1. a 2. série. (4)

(5) (6)

(7) (8)

47

Tabulka 20: Zhodnocení vlivu matrice pomocí směrnic kalibračních závislostí – ovčí sérum Ovčí sérum Přídavek standardů před derivatizací

E1 Alpha E2 Beta E2 E3 EE2

ME (%) s přepočtem na IS 174 171 186 192 155

ME (%) bez přepočtu na IS 11 11 12 12 10

Přídavek standardů po derivatizaci ME (%) s přepočtem na IS 249 256 254 262 226


Tabulka 21: Zhodnocení matričních efektů (poměr ploch píků) – ovčí sérum Ovčí sérum Přídavek standardů před derivatizací

Přídavek standardů po derivatizaci

E1

Alpha E2

Beta E2

E3

EE2

E1

Alpha E2

Beta E2

E3

EE2

Koncetrace (pg ml-1)

ME (%)

ME (%)

ME (%)

ME (%)

ME (%)

ME (%)

ME (%)

ME (%)

ME (%)

ME (%)

80

10 8 10 8 11 10

8 9 12 10 11 10

9 9 12 8 14 10

14 13 13 11 14 12

9 7 8 7 10 9

79 52 79 108 92 101

88 59 87 122 97 107

96 71 98 107 105 109

103 75 105 129 111 109

80 71 81 91 94 98

160 240 320 400 480

Tabulka 22: Zhodnocení výtěžností (poměr ploch píků) – ovčí sérum Ovčí sérum Koncetrace (pg ml-1) 80 160 240 320 400 480

E1

Alpha E2

Beta E2

E3

EE2

RE (%)

RE (%)

RE (%)

RE (%)

RE (%)

76 43 109 62 63

77 46 100 61 71

84 42 141 53 71

64 44 95 49 61

103 55 128 60 59

48

Obrázek 18: Porovnání zhodnocení matričních efektů – ovčí sérum 300 250

ME (%)

200

E1

alpha E2 150

beta E2 E3

100

EE2

50 0 1

2

3

4

5

6

1-směrnice kalibračních přímek s IS (přídavek před derivatizaci/standard) 2-směrnice kalibračních přímek bez IS (přídavek před derivatizaci/standard) 3-směrnice kalibračních přímek s IS (přídavek po derivatizaci/standard) 4-směrnice kalibračních přímek bez IS (přídavek po derivatizací/standard) 5-průměrná hodnota poměru ploch (přídavek před derivatizaci/standard) 6-průměrná hodnota poměru ploch (přídavek po derivatizaci/standard)

Obrázek 19: Porovnání průměrných hodnot výtěžností – ovčí sérum 80 70 60

ME (%)

50

40 30 20 10 0 E1

alpha E2

beta E2

49

E3

EE2

Tabulka 23: Zhodnocení vlivu matrice pomocí směrnic kalibračních závislostí – koňské sérum Koňské sérum Přídavek před derivatizací/standard




Přídavek po derivatizaci/standard ME (%) s přepočtem na IS 233 247 249 219 203


Tabulka 24: Zhodnocení matričních efektů (poměr ploch píků) – koňské sérum Koňské sérum Přídavek standardů před derivatizací


E1

Alpha E2

Beta E2

E3

EE2

E1

Alpha E2

Beta E2

E3

EE2


ME (%)

ME (%)

ME (%)

ME (%)

ME (%)

ME (%)

ME (%)

ME (%)

ME (%)

ME (%)

80

10 7 8 8 6 9

11 7 9 11 7 8

12 10 10 10 6 9

15 8 8 10 6 8

11 9 9 9 6 7

70 57 67 79 91 87

87 77 88 95 100 98

94 73 86 97 100 98

89 81 80 86 91 89

66 60 73 70 88 76

160 240 320 400 480

Tabulka 25: Zhodnocení výtěžností (poměr ploch píků) – koňské sérum Koňské sérum Koncetrace (pg ml-1) 80 160 240 320 400 480

E1

Alpha E2

Beta E2

E3

EE2

RE (%)

RE (%)

RE (%)

RE (%)

RE (%)

125 132 60 54 97 86

79 139 70 51 98 110

116 126 65 54 101 95

49 131 77 69 104 94

66 105 69 49 93 91

50

Obrázek 20: Porovnání zhodnocení matričních efektů – koňské sérum 300 250

ME (%)

200

E1

alpha E2 150

beta E2 E3

100

EE2

50 0 1

2

3

4

5

6


Obrázek 21: Porovnání průměrných hodnot výtěžností – koňské sérum 95

ME (%)

90

85

80

75

70 E1

alpha E2

beta E2

51

E3

EE2

Tabulka 26: Zhodnocení vlivu matrice pomocí směrnic kalibračních závislostí – telecí sérum Telecí sérum Přídavek před derivatizací/standard



Přídavek po derivatizaci/standard




Tabulka 27: Zhodnocení matričních efektů (poměr ploch píků) – telecí sérum Telecí sérum Přídavek standardů před derivatizací


E1

Alpha E2

Beta E2

E3

EE2

E1

Alpha E2

Beta E2

E3

EE2


ME (%)

ME (%)

ME (%)

ME (%)

ME (%)

ME (%)

ME (%)

ME (%)

ME (%)

ME (%)

80

43 22 19 38 37 41

33 21 18 36 37 38

52 25 36 40 37 42

36 23 17 30 30 32

42 24 22 37 38 39

80 68 94 107 104 92

80 71 83 98 98 88

94 80 100 98 104 91

86 83 87 93 98 90

72 76 93 102 106 85

160 240 320 400 480

Tabulka 28: Zhodnocení výtěžností (poměr ploch píků) – telecí sérum Telecí sérum Koncetrace (pg ml-1) 80 160 240 320 400 480

E1

Alpha E2

Beta E2

E3

EE2

RE (%)

RE (%)

RE (%)

RE (%)

RE (%)

53 100 134 78 77 56

84 100 148 82 77 56

44 100 91 74 74 57

48 100 134 75 72 58

42 100 126 77 76 56

52

Obrázek 22: Porovnání zhodnocení matričních efektů – telecí sérum 160

140 120 E1

ME (%)

100

alpha E2 80

beta E2

60

E3

40

EE2

20 0

1

2

3

4

5

6


Obrázek 23: Porovnání průměrných hodnot výtěžností – telecí sérum 100

90 80

ME (%)

70 60 50

40 30 20 10 0 E1

alpha E2

beta E2

53

E3

EE2

Tabulka 29: Zhodnocení vlivu matrice pomocí směrnic kalibračních závislostí – slepičí sérum Slepičí sérum Přídavek před derivatizací/standard



Přídavek po derivatizaci/standard




Tabulka 30: Zhodnocení matričních efektů (poměr ploch píků) – slepičí sérum Slepičí sérum Přídavek standardů před derivatizací


E1

Alpha E2

Beta E2

E3

EE2

E1

Alpha E2

Beta E2

E3

EE2


ME (%)

ME (%)

ME (%)

ME (%)

ME (%)

ME (%)

ME (%)

ME (%)

ME (%)

ME (%)

80

9 9 11 9

22 25 22 20 24 21

15 14 18 14 16 14

8 9 9 9 11 9

7 9 9 8 12 9

73 58 58 77 87 102

93 96 113 134 132 131

114 110 122 130 118 122

89 86 85 94 88 89

74 81 89 92 88 89

160 240 320 400 480

Tabulka 31: Zhodnocení výtěžností (poměr ploch píků) – slepičí sérum Slepičí sérum Koncetrace (pg ml-1) 80 160 240 320 400 480

E1

Alpha E2

Beta E2

E3

EE2

RE (%)

RE (%)

RE (%)

RE (%)

RE (%)

84 35 72

125 75 60 85 33 72

75 66 63 93 98 89

95 79 68 95 46 83

82 84 80 105 37 79

54

Obrázek 24: Porovnání zhodnocení matričních efektů – slepičí sérum 350 300

ME (%)

250

E1

200

alpha E2 beta E2

150

E3 100

EE2

50 0 1

2

3

4

5

6


Obrázek 25: Porovnání průměrných hodnot výtěžností – slepičí sérum 90 80 70

ME (%)

60 50 40

30 20 10

0 E1

alpha E2

beta E2

55

E3

EE2

Tabulka 32: Zhodnocení vlivu matrice pomocí směrnic kalibračních závislostí – lidské sérum Lidské sérum Spike před derivatizací/standard



Spike po derivatizaci/standard




Tabulka 33: Zhodnocení matričních efektů (poměr ploch píků) – lidské sérum Lidské sérum Přídavek standardů před derivatizací


E1

Alpha E2

Beta E2

E3

EE2

E1

Alpha E2

Beta E2

E3

EE2


ME (%)

ME (%)

ME (%)

ME (%)

ME (%)

ME (%)

ME (%)

ME (%)

ME (%)

ME (%)

80

43 35 18 39 33 27

37 21 25 25 30 27

51 28 19 37 33 28

65 53 37 49 54 35

25 32 19 26 24 22

70 69 90 119 99 101

75 96 98 132 120 116

82 106 119 120 119 112

91 120 128 144 131 137

52 61 61 65 68 64

160 240 320 400 480

Tabulka 34: Zhodnocení výtěžností (poměr ploch píků) – lidské sérum Lidské sérum Koncetrace (pg ml-1) 80 160 240 320 400 480

E1

Alpha E2

Beta E2

E3

EE2

RE (%)

RE (%)

RE (%)

RE (%)

RE (%)

43 45 83 66 62 68

40 82 69 71 47 53

43 72 117 54 59 58

25 24 36 30 25 28

83 48 101 74 58 54

56

Obrázek 26: Porovnání zhodnocení matričních efektů – lidské sérum 300 250

ME (%)

200

E1 alpha E2

150

beta E2

E3

100

EE2 50 0 1

2

3

4

5

6


Obrázek 27: Porovnání průměrných hodnot výtěžností – lidské sérum 80 70 60

ME (%)

50

40 30 20 10

0 E1

alpha E2

beta E2

57

E3

EE2

Hodnoty ME vypočítané z kalibračních závislostí jsou nejblíže požadované hodnotě 100%, jestliže se přidávají derivatizovné standardy po derivatizaci SPE extraktu a bez korekce na interní standard (skupina 4, obr. 18, 20, 22, 24, 26): u ovčího séra v rozmezí 85-152% , u koňského séra 85-105%, u telecího séra 72-106%, u slepičího séra 90-147% a u lidského séra 68-145%. Při výpočtu ME pomocí poměru ploch píků získaných analýzou vzorků obohacených derivatizovanými standardy po derivatizaci SPE extraktu (Matuszewski a kol. [56]) jsou průměrné hodnoty ME pro sledované estrogeny v rozmezí hodnot 85-105% u ovčího séra, 72-91% u koňského séra, 86-95% u telecího séra, 76-119% u slepičího séra a 62125% u lidského séra. Z uvedených výsledků je zřejmé, že oběma metodami výpočtu ME lze získat srovnatelné hodnoty ME, pouze pokud se použijí plochy píků bez korekce na interní standard a vyhodnocují se analýzy vzorků připravených přídavkem již derivatizovaných standardů po předchozí derivatizaci matrice. Z těchto výsledků plyne, že matrice vzorku pravděpodobně nemá vliv na finální LC/MS analýzu. Použití korekce na IS (EE2-D) (skupina 1 a 3, obr. 18, 20, 22, 24, 26) generuje pozitivní chybu v obou postupech přídavku standardu (před derivatizací extraktu a po derivatizaci extraktu). Z toho plyne, že použití EE2-D jako interního standardu nebude zcela vhodné pro analýzy estrogenů v testovaných vzorcích séra. Nejméně se tento efekt projevuje v případě telecí a lidské plazmy Příčinu tohoto jevu bude třeba objasnit v navazujících experimentech, aby bylo možné nalézt vhodnější interní standard. Velký rozptyl hodnot ME u vzorků lidského séra je třeba ověřit, spolu s experimenty s vhodnějším IS. Reakce derivatizace je pravděpodobně silně ovlivněna matricí, což se projevuje nízkými hodnotami ME u skupiny experimentů 2 a 5 (obr. 18, 20, 22, 24, 26) – kalibrace přídavkem standardů k extraktu před derivatizací bez korekce na IS. Výtěžnosti extrakce estrogenů z těchto typů plazmy byly v intervalech 52-68% u ovčího séra, 79-93% u koňského séra, 73-91% u telecího séra, 32-81% u slepičího séra a 2870% u lidského séra. Nízké hodnoty výtěžnosti E1 u slepičího séra a E3 u lidského séra je třeba ověřit opakovanými experimenty. Na základě získaných výsledků nejsou tyto nízké hodnoty věrohodně vysvětlitelné.

7. Reálné vzorky Pro ověření metody pro analýzu estrogenů v krevním séru byly testovány vzorky hovězího séra, které poskytla Mgr. Klára Hilscherová, Ph.D. Dále byly analyzovány vzorky lidské plazmy od doc.MUDr. Dalibora Valíka Ph.D. z Masarykova onkologického ústavu (MOU). Tyto vzorky byly od žen vyšetřovaných na MOU. Všechny vzorky byly zpracovány výše uvedenou metodou (SPE). 58

7.1

Vzorky hovězího séra

Byly analyzovány tři vzorky hovězího séra: nepřečištěné hovězí sérum, hovězí sérum po dialýze, hovězí sérum po dialýze a přídavku aktivního uhlí. U těchto vzorků byly stanoveny koncentrace alpha a beta estradiolu.

Tabulka 35: Naměřené koncentrace estrogenů u vzorků hovězí plazmy Vzorek Hovězí sérum Hovězí sérum po dialýze Hovězí plazma sérum po dialýze a přídavku aktivního uhlí

Alpha E2 (pg ml-1)

Beta E2 (pg ml-1)

3400 90

950 < LOQ

< LOQ

< LOQ

Obrázek 28: LC-MS chromatogram estrogenů hovězího séra

Z naměřených hodnot a LC-MS chromatogramů je zřejmé, že po přečištění se koncentrace estrogenů v krevním séru výrazně snížila. Vzorky čistého hovězího séra obsahovaly 3400 pg ml-1 alpha estradiolu a 950 pg ml-1 beta estradiolu. Po přečištění pomocí dialýzy se koncentrace estrogenů snížila u alpha estradiolu na 90 pg ml-1 a u beta estradiolu byl výšky detekovaných píků pod limitem detekce. Výšky píků alpha a beta estradiolu v chromatogramu po přečištění séra pomocí dialýzy a aktivního uhlí byly pod limitem detekce na úrovni šumu.

59

Vzorky lidského séra

7.2

Z Masarykova onkologického ústavu (MOU) bylo analyzováno celkem 8 vzorků krevního séra od postmenopauzálních žen vyšetřovaných na MOU s předpokládanými výraznými rozdíly především v koncentraci beta-estradiolu.

7.2.1      

Postup přípravy vzorku Množství vzorku: 1 ml Použitá metoda: SPE (podle postupu uvedeného v kapitole 3.2.1) Derivatizace: dansylchlorid (podle postupu uvedeného v kapitole 4.2) Interní standard: EE2-D (400 pg ml-1) Zkoncentrování: na 250 µl Analýza: LC-MS-MS

Tabulka 36: Naměřené koncentrace estrogenů u postmenopauzálních žen Vzorek

E1 (pg ml-1)

Alpha E2 (pg ml-1)

Beta E2 (pg ml-1)

E3 (pg ml-1)

EE2 (pg ml-1)

1 2 3 4 5 6 7 8

< limit detekce < limit detekce 11,72 < limit detekce 106,65 448,15 242,90 442,28

< limit detekce < limit detekce < limit detekce < limit detekce < limit detekce < limit detekce < limit detekce < limit detekce

15,9 22,3 29,5 24,6 243,1 379,3 369,3 463,2

25,4 29,0 36,1 29,3 32,9 27,2 24,6 25,8

16,2 15,8 22,2 18,2 19,9 18,9 15,4 15,7

Celkem bylo analyzováno osm vzorků, přičemž u poloviny dodaných vzorků byl předpoklad koncentrace estrogenů blízko limitům detekce testované metody a druhá polovina vzorků měla podle předpokladu obsahovat několikanásobně vyšší koncentrace estrogenů. Vzorky s očekávanou nízkou koncentrací estrogenů obsahovaly koncentrace estronu pod nebo na úrovni LOD, beta estradiolu v rozmezí 15,9-24,6 pg ml-1, estriolu 25,4-36,1 pg ml -1 a ethynylestradiolu 15,4-22,2 pg ml -1. Vzorky s očekávanou vysokou koncentrací estrogenů obsahovaly koncentrace estronu v rozmezí 106,7-448,2, beta estradiolu v rozmezí 243,1-463,2 pg ml-1, estriolu v rozmezí 24,6-32,9 pg ml-1 a ethynylestradiolu v rozmezí 15,4-19,9 pg ml-1. V analyzovaných vzorcích séra byly koncentrace alpha estradiolu pod limitem detekce, proto nejsou v tabulce uvedeny.

60

IV.

Závěr a diskuze

Cílem této diplomové práce bylo zavést do praxe laboratoří RECETOX LC-MS-MS stanovení estrogenů v krevním séru. Byly porovnány tři postupy zpracování vzorků séra (srážení proteinů, extrakce na pevnou fázi, extrakce z kapaliny do kapaliny), z nichž jako nejvhodnější po porovnání vlivu matrice (ME–matrix effect) a výtěžnosti (RE-recovery) byla vybrána extrakce na pevnou fázi (chromatografická stacionární fáze C18). Metoda extrakce z kapaliny do kapaliny neposkytla uspokojivé výsledky, zřejmě z důvodu nepřesného oddělení rozdělených fázi, které bylo při malém množství vzorku složité odebrat. Metoda srážení proteinů neposkytuje uspokojivé hodnoty výtěžnosti pravděpodobně v důsledku navázání analytů na sraženinu bílkovin. Pro detekci a kvantifikaci extrahovaných estrogenů byla zvolena předkolonová derivatizace dansylchloridem, která umožňuje dosáhnout výrazně nižších limitů detekce v porovnání s přímou detekcí bez derivatizace. Limity detekce byly stanoveny jako trojnásobek signálu šumu základní linie, což odpovídalo u standardu 5 pg ml -1 a u vzorků krevního séra 8-10 pg ml-1 podle druhu séra. Pro ověření použitelnosti této metody bylo analyzováno pět typů krevní plazmy (ovčí, koňská, slepičí, telecí a lidská). U těchto vzorků byl zhodnocen vliv matrice (ME-matrix effect) metodou podle Matuszewskeho a kol. [56] a metodou založenou na porovnání směrnic kalibračních křivek získaných analýzou standardů sledovaných estrogenů v čistém rozpouštědle a analýzou standardů přidaných do vzorků séra podle Ch. Sandy a kol. [60]. Takto získané výsledky potvrzují potřebu systematického studia vlivu matrice analyzovaných typů vzorků při vývoji či zavádění nových analytických postupů do laboratorní praxe a úpravu metody pro konkrétní typ matrice. Výsledky uvedené v této práci podporují předpoklad použití kalibrace pomocí tzv. „materiálů s podobnou matricí“ matrix-matched materials“ pro stanovení estrogenů v krevním séru. V rámci diplomové práce byly analyzovány vzorky hovězího séra, které bylo přečištěno pomocí dialýzy a pomocí dialýzy a přídavku aktivního uhlí. Po přečištění séra bylo zaznamenáno výrazné snížení koncentrace estrogenů a potvrzen předpoklad výrazného snížení estrogenů ze studované matrice oběma použitými způsoby. Metoda stanovení estrogenů byla testována také na vzorcích lidského séra z Masarykova onkologického ústavu. Tyto vzorky byly od postmenopauzálních žen vyšetřovaných na tomto ústavu. Koncentrace alpha estradiolu byly ve všech vzorcích pod limitem detekce. Při porovnání hladin estrogenů s obvyklými hodnotami zdravých jedinců získanými z odborných publikací jsou především hodnoty koncentrací estronu a beta estradiolu v polovině analyzovaných vzorků výrazně vyšší. Korelace mezi zjištěnými koncentracemi a relevantními informacemi o vzorcích nejsou v kompetenci pracoviště RECETOX a proto nejsou součástí této diplomové práce.

61

V.

Použitá literatura

[1] M. Kawata. Roles of steroid hormones and their receptors in structural organization in the nervous systém. Neurosci research 1995, 46, 1-46. [2] J. Trapman, A. O. Brinkmann. The androgen receptor in prostate cancer, Pathology research and Practice 1996, 192, 752-760. [3] F. Ingerslev.,Bent Halling-S.. Evaluation of analytical chemical methods for detection of estrogens in the environment. Working report 2003, 44, 5-48. [4] C.Cui, S.Ji and H.Ren. Envrironmental Monitoring and Assessment. Springer Netherlands 2006, 121, 407-417. [5] Jun-Beom Park. Effects of 17-α ethynyl estradiol on proliferation, differentiation & mineralization of osteoprecursor cell. Academic journal 2012, 136, 466-470. [6] Jiska S.Peper, Rachel M. Brouwer, Hugo G. Schnack, Caroline van Baal, Marieke van Leeuwen, Stephanie M. van den Berg, Henriette A. Delemarre-Van de Waal, Dorret I.Boomsma, Rene S.Kahn, Hilleke E. Hulshoff Pol. Sex steroids and brain structure in pubertal boys and girls. Psychoneuroendocrinology 2009, 34, 332-342. [7] H.E.Hulshoff, Cohen-Kettenis P., Van Haren, N.E.M., Peper J., Brans R.G.H., Cahn W., Schnack H.G., Gooren L.J.G., Kahn R.S.. European Journal of Endocrinology. 2006, 155, 107-114. [8] C. Dominique Toran-Allerand, Alexander A. Tinnikov, Ravinder J. Singh, and Imam S. Nethrapalli. 17α -Estradiol: A Brain-Active Estrogen?. Endocrinology 2005, 146, 3843-3850. [9] Grodin JM, Siiteri PK, MacDonald PC. Source of estrogen production in postmenopausal women. J. Clin Endocrinal Metab 1973, 26, 207. [10] Kathleen A. Head, N.D. Estriol: Safety and Efficacy. Altern Med rev. 1998, 32, 101-113. [11] Ray Sahelian, M.D.. Steroid Information, http://www.raysahelian.com [online]. [cit.2012-10-09].

Anabolic

and

Androgenic.

[12] Holoubek I., Čadová L.. Estrogeny v životním prostředí. Klinická onkologie 2000, 25-30. [13] M. J. Reed, R. W. Cheng, C. T. Noel, H. A. F. Dudley, V. H. T. James. Plasma Levels of Estrone, Estrone Sulfate, and Estradici and the Percentage of Unbound Estradici in Postmenopausal Women with and without Breast Disease. Cancer Research 1983, 43, 39403943. [14] Mayo Clinic, Mayo medical laboratories. Test ID: ESTF (estrone and estradiol). http://www.mayomedicallaboratories.com [online]. [cit.2012-10-10]. 62

[15] Astrid Bellem, BRT, Soumia Meiyappan, MSc, Sarah Romans, MD, FRANZP, and Gillian Einstein, PhD. Measuring Estrogens and Progestagens in Humans: AnOverview of Methods. The Journal for the study of Sex a Gender Differences 2011, 5, 283-299. [16] John Kells, Charles M. Dollbaum. Saliva test, part 1:clinical use, elements of testing, and guidelines for posttreatment interpretation. International Journal of Pharmaceuticals Compounding 2009, 13, 280-288. [17] Guang-Guo Yinga, Rai S. Kookanaa, Ying-Jun Ru. Occurrence and fate of hormone steroids in the environment. Environment International 2002, 28, 545-551. [18] F. Ingerslev, Bent Halling-Sorensen. Evaluation of analytical chemici methods for detection of estrogens in the environment. Working report 2003, 44, 5-51 [19] Thavasu, P.W.. Measuring cytokine levels in blood. Importance of anticoagulants, processing, and storage conditions. Journal of Immunological Methods 1992, 153, 115-124. [20] T.Zima, J.Racek, M.Dastych, M.Kreidlová, D.Springer, P.Kocna, M.Dražďáková, J.Štěpán, H.Marečková, B.Seifert, J.Laňková, C.Mucha, J.Vojtíšková. Doporučené diagnostické a terapeutické postupy pro všeobecné praktické lékaře. http:// http://www.cskb.cz [online]. [cit.2012-10-13]. [21] Santen RJ, Lee JS, Wang S, Demers LM, Mauras N, Wang H. Potential role of ultrasensitive estradiol assays in estimating the risk of breast cancer and fractures. Steroids 2008, 73, 1318–1321. [22] P.K.Zarzycki, K.M.Kulhanek, R.Smith, V.L.Clifton. Determination of steroids in human plasma using temperature - dependent inclusion chromatogramy for metabolit investigation. Journal of Chromatography A 2006, 1104, 203-208. [23] B.Salci, I.Biryol. Voltammetric investigation of Pharmaceuticals and Biomedical Analysis 2002, 28, 753-9.

beta-estradio.

Journal

of

[24] Santen R.J., Lee J.S., Wang S., Demers L.M., Mauras N., Wang H.. Potential role of ultrasensitive estradiol assays in estimating the risk of breast cancer and fractures. Steroids 2008, 73, 1318–1321. [25] Penning T.M., Lee S.H., Jin Y., Gutierrez A., Blair I.A.. Liquid-chromatography mass spectrometry (LC-MS) of steroid hormone metabolites and its applications. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology 2010, 121, 546-555. [26] Xu X., Roman J.M., Issaq H.J., Keefer L.K., Veenstra T.D., Ziegler R.G.. Quantitative measurement of endogenous estrogens and estrogen metabolites in human serum by liquid chromatography-tandem mass spektrometry. Anal.chem. 2007, 79, 7813–7821.

63

[27] Yamashita K., Okuyama M., Watanabe Y., Honma S., Kobayashi S., Numazawa M.. Highly sensitive determination of estrone and estradiol in human serum by liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spektrometry. Steroids 2007, 72, 819– 827. [28] Xu L., Spink D.C.. Analysis of steroidal estrogens as pyridine-3-sulfonyl derivatives by liquid chromatography electrospray tandem mass spektrometry. Anal. Biochem. 2008, 375, 105–114. [29] Yang W.C., Regnier F.E., Sliva D., Adamec J.. Stable isotope-coded quaternization for comparative quantification of estrogen metabolites by high-performance liquid chromatography-electrospray ionization mass spektrometry. Journal of Chromatography B 2008, 870, 233–240. [30] H.Schweingruber, B.C. Cha, E. Chan, K. Wang, T. F. Scientific, S. Jose. Determination of Estradiol in Plasma with Negative Chemical Ionization GC-MS/MS on TSQ Quantum GC. Thermo Fisher Scientific 2007, 388, 1-2. [31] I.A.Blair. Analysis of Estrogens in Serum and Plasma from Postmenopausal Women: Past Present, and Future. Steroids 2010, 75, 297-306. [32] T. Osama Y. Al-Dirbashi, T. Fukushima. Derivatization reagents in liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry for biomedical analysis. Drug Discov. Ther. 2007, 1, 108-118. [33] Mohamed S., Rashed, Lujane Y., Al-Ahaidib, Osama Y., Al-Disbashi, Mohammad Al Amoudi, Moeen M.A., Al-Sayed, Zuhair Rahbeeni, Zuhair Al-Hassnan, Abeer Al-Dbaas, Mohamed Al-Owain, Michelle Ni. Tandem mass spectrometric assay of succinylacetone in urine for the diagnosis of hepatorenal tyrosinemia. Analytical Biochemistry 2005, 339, 310317. [34] O’Brien-Coker I.C., Mallet G.P.A.I.. Aldehyde analysis by high performance liquid chromatography/tandem mass spektrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry 2001, 15, 920-928. [35] Higashi T., Shibayama Y., Shimada K.. Determination of salivary dehydroepiandrosterone using liquid chromatography-tandem mass spektrometry combined with charged derivatization. Journal of Chromatography B 2007, 846, 195-201. [36] Xu X., Veenstra T.D., Fox S.D., Roman J.M. Issaq H.J., Falk R., Saavedra J.E., Keefer L.K., Ziegler R.. Measuring fifteen endogenous estrogens simultaneously in human urine by high-performance liquid chromatography-mass spektrometry. Anal.chem. 2005, 77, 66466654.

64

[37] Tai A.A.C., Welch M.J.. Development and evalution of a reference measurement procedure for the determination of estradiol - 17β in human serum using isotope-dilution liquid chromatography-tandem mass spektrometry. Anal.chem. 2005, 77, 6359-6363. [38] Li W., Li Y.H., Li A.C., Zhou S., Naidong W.. Simultaneous determination of norethindrone and ethinyl estradiol in human plasma by high-performance liquid chromatography with tandem mass spektrometry-experiences on developing a highly selective method using derivatization reagent for enhancing sensitivity. Journal of chromatography B 2005, 825, 223-232. [39] Li Y., Li A.C., Shi H., Zhou S., Shou W.Z., Jiang X., Naidong W., Lauterbach J.H.. The use of chemical derivatization to enhance liquid chromatography/tandem mass spectrometric determination of 1-hydroxypyrene, a biomarker for polycyclic aromatic hydrocarbons in human urine. Rapid Communications in Mass Spectrometry 2005, 19, 3331-3338. [40] Honda A., Yamashita K., Numazawa M., Ikegami T., Doy M., Matsuzaki Y., Miyazaki H.. Highly sensitive quantification of 7α-hydroxy-4-cholesten-3-one in human serum by LCESI-MS/MS. Journal of Lipid Research 2007, 48, 458-464. [41] Higashi T., Nishio T., Hayashi N., Shimada K.. Alternative procedure for charged derivatization to enhance detection responses of steroids in electrospray ionization-MS. Chemical and Pharmaceutical Bulletin 2007, 55, 662-665. [42] Kushnir N.M., Komaromy-Hiller G., Shushan B., Urry F.M., Roberts W.. Analysis of dicarboxylic acids by tandem mass spectrometry. High-throughput quantitative measurement of methylmalonic acid in serum, plasma, and urine. Clinical chemistry 2001, 47, 1993-2002. [43] Marad A., Karisson D., Dalene M., Skarping G.. Determination of amines as pentafluoropropionic anhydride derivatives in biological samples using liquid chromatography and tandem mass spektrometry. Analyst 2004, 129, 522-528. [44] May L. Chiu, Walson Lawi, Steven T. Snyder,Pak Kin Wong, Joseph C. Liao, Vincent Gau. Matrix Effects - A Challenge Toward Automation of Molecular Analysis. Journal of Laboratory Automation 2010, 15, 233-243. [45] Terence G. Hall, Inese Smukste, Karen R. Bresciano, Yunxia Wang, David McKearn, Ronald E. Savage. Identifying and Overcoming Matrix Effects in Drug Discovery and Development. Intech Europe 2012, 18, 389-420. [46] S. Vijayaraj, N. Reddy Kumari. Sample preparation in bio analytical methods-A review. 2013, 1, 1-7. [47] Stefanie Krepenhofer, Bruno Casetta, Michael Jarvis, Michal Weinstock. Analysis of Estrogens in Plasma Samples by LC-MS/MS, with a Reduced Sample Preparation Using

65

SelexION Ion Mobility Technology To Remove Interferences. Endocrine reviews 2012, 33, 1-37. [48] Patrik Appelblad, Knut Irgum,. Separation and detection of neuroactive steroids from biological matrices. Journal of chromatography A 2002, 955, 151-182. [49] D. T. Harwood, D. J. Handelsman. Development and validation of a sensitive liquid chromatography–tandem mass spectrometry assay to simultaneously measure androgens and estrogens in serum without derivatization. Clinica Chimica Acta 2009, 409, 78-84. [50] Eckschalger K., Horsák I., Kodejš Z.. Vyhodnocování analytických výsledků a metod, SNTL. 1980. [51] R.E. Nelson, S.K.Grebe, D.J.O´Kane, R.J.Singh. Liquid chromatography – Tandem mass Spectrometry assay for simultaneous measurement of estradiol and estrone in human plasma. Clin.chem. 2004, 50, 373-384. [52] E. Čechová. Stanovení estrogenů v odpadních vodách. Diplomová práce 2012. [53] K. Asano, T. Saito, Y. Suzuki, H. Tamura, H. Wada. Fluorescent substance for use as a cell-discriminating agent. 1990. [53] E. Klapková, R. Uřinovská, R. Průša. Vliv matricových efektů při vývoji a validaci metod pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie ve spojení s hmotností spektrometrií. Klin. Biochem. Metab. 2011, 19 (40), 5-8. [54] Roche Diagnostics GmbH. Estradiol II. Roche 2012, 04. [55] Thomas M. Annesley. Ion Suppression in Mass Spectrometry. Clinical chemistry 2003, 1041-1044. [56] Matuszewski B.K., Constanzer M. L., Chavez-Eng C.M.. Strategies for the Assessment of Matrix Effect in Quantitative Bioanalytical Methods Based on HPLC-MS/MS. Analytical chemistry 2003, 75, 3019-3030. [57] V. Pucci, S. Di Palma, A. Alfieri, F. Bonelli and E. Monteagudo. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2009, 50, 867-871. [58] D.Cibula. Hormonální substituční léčba. Farmakoterapie 2001, 5. [59] Y. H. Lin, C. H. Chen, G. S. Wang. Rapid Communications in Mass Spectrometry 2007, 21, 1973-1983. [60] Ch. Sandy, Ch.-K. Meng, C. Marvin. Optimizing the Performance of the Agilent GC/MS/MS Pesticide Analyzer. Agilent Technologies 2012

66

VI.

Seznam tabulek

Tabulka 1: Fyzikálně-chemické vlastnosti estrogenů ................................................................. 13 Tabulka 2: Fyzikálně-chemické vlastnosti estrogenů ................................................................. 14 Tabulka 3: Koncentrace estronu a estradiolu v krevním séru u dětí [14] .................................. 16 Tabulka 4: Koncentrace estronu v krevním séru u dospělých [14] ............................................ 16 Tabulka 5: Koncentrace estronu a estradiolu v krevní plazmě [13]........................................... 17 Tabulka 6: Množství estrogenů ve slinách u žen [16] ................................................................ 18 Tabulka 7: Množství estrogenů ve slinách u mužů [16] ............................................................. 18 Tabulka 8: Denní vylučování estrogenních steroidů močí u žen [17] ....................................... 19 Tabulka 9: Denní vylučování estrogenních steroidů močí u mužů [17] .................................... 19 Tabulka 10: Výhody a nevýhody různých matric pro analýzu estrogenů [15] ......................... 21 Tabulka 11: Metody izolace estrogenů používané pro různé typy matric ................................. 22 Tabulka 12: Složky obsažené v moči, které přispívají k vlivům matrice při analýze biologických materiálů [44].......................................................................................................... 22 Tabulka 13: Složky obsažené v matrici plazmy .......................................................................... 23 Tabulka 14: Typy chromatografie a ionizace, použitá derivatizační činidla a dosažené LOD v krevním séru ............................................................................................................................... 28 Tabulka 15: Derivatizační činidla pro LC-ESI-MS/MS ............................................................. 30 Tabulka 16: Vliv matrice pro modelové analyty stanovované v lidské krevní plazmě [57] .... 32 Tabulka 17: Srovnání výtěžnosti a vlivu matrice (ME) jednotlivých technik........................... 37 Tabulka 18: MRM přechody, napětí fragmentoru a kolizní energie analyzovaných estrogenů pro MS/MS detekci[52] ................................................................................................................ 39 Tabulka 19: Postup přípravy vzorků pro zhodnocení vlivu matrice a výtěžnosti SPE ............. 46 Tabulka 20: Zhodnocení vlivu matrice pomocí směrnic kalibračních závislostí – ovčí sérum 48 Tabulka 21: Zhodnocení matričních efektů (poměr ploch píků) – ovčí sérum ........................ 48 Tabulka 22: Zhodnocení výtěžností (poměr ploch píků) – ovčí sérum ..................................... 48 Tabulka 23: Zhodnocení vlivu matrice pomocí směrnic kalibračních závislostí – koňské sérum ........................................................................................................................................................ 50 Tabulka 24: Zhodnocení matričních efektů (poměr ploch píků) – koňské sérum ................... 50 Tabulka 25: Zhodnocení výtěžností (poměr ploch píků) – koňské sérum................................. 50 Tabulka 26: Zhodnocení vlivu matrice pomocí směrnic kalibračních závislostí – telecí sérum ........................................................................................................................................................ 52 Tabulka 27: Zhodnocení matričních efektů (poměr ploch píků) – telecí sérum ...................... 52 Tabulka 28: Zhodnocení výtěžností (poměr ploch píků) – telecí sérum ................................... 52 Tabulka 29: Zhodnocení vlivu matrice pomocí směrnic kalibračních závislostí – slepičí sérum ........................................................................................................................................................ 54 Tabulka 30: Zhodnocení matričních efektů (poměr ploch píků) – slepičí sérum .................... 54 Tabulka 31: Zhodnocení výtěžností (poměr ploch píků) – slepičí sérum ................................. 54 Tabulka 32: Zhodnocení vlivu matrice pomocí směrnic kalibračních závislostí – lidské sérum ........................................................................................................................................................ 56 Tabulka 33: Zhodnocení matričních efektů (poměr ploch píků) – lidské sérum ..................... 56 Tabulka 34: Zhodnocení výtěžností (poměr ploch píků) – lidské sérum .................................. 56 67

Tabulka 35: Naměřené koncentrace estrogenů u vzorků hovězí plazmy .................................. 59 Tabulka 36: Naměřené koncentrace estrogenů u postmenopauzálních žen .............................. 60

VII.

Seznam obrázků

Obrázek 1: Syntéza steroidů z cholesterolu [1] ........................................................................... 12 Obrázek 2: Struktury estrogenů [4] .............................................................................................. 14 Obrázek 3: Možnosti kontaminace životního prostředí estrogeny [18] ..................................... 20 Obrázek 4: Srovnání výtěžnosti jednotlivých postupů ............................................................... 37 Obrázek 5: Srovnání matričních efektů jednotlivých postupů ................................................... 38 Obrázek 6: Schéma reakce 17β-estradiolu s dansylchloridem [53] ........................................... 39 Obrázek 7: Schéma postupu pro stanovení estrogenů v krevním séru ...................................... 40 Obrázek 8: Kalibrační závislost pro E1 při použití IS EE2-D.................................................... 41 Obrázek 9: Kalibrační závislost pro E1 při použití IS E2-D ...................................................... 41 Obrázek 10: Kalibrační závislost pro alpha E2 při použití IS EE2-D ....................................... 42 Obrázek 11: Kalibrační závislost pro alpha E2 při použití IS E2-D .......................................... 42 Obrázek 12: Kalibrační závislost pro beta E2 při použití IS EE2-D ......................................... 43 Obrázek 13: Kalibrační závislost pro beta E2 při použití IS E2-D ............................................ 43 Obrázek 14: Kalibrační závislost pro E3 při použití IS EE2-D ................................................. 44 Obrázek 15: Kalibrační závislost pro E3 při použití IS E2-D .................................................... 44 Obrázek 16: Kalibrační závislost pro EE2 při použití IS EE2-D ............................................... 45 Obrázek 17: Kalibrační závislost pro EE2 při použití IS E2-D ................................................. 45 Obrázek 18: Porovnání zhodnocení matričních efektů – ovčí sérum ........................................ 49 Obrázek 19: Porovnání průměrných hodnot výtěžností – ovčí sérum ....................................... 49 Obrázek 20: Porovnání zhodnocení matričních efektů – koňské sérum .................................... 51 Obrázek 21: Porovnání průměrných hodnot výtěžností – koňské sérum .................................. 51 Obrázek 22: Porovnání zhodnocení matričních efektů – telecí sérum ...................................... 53 Obrázek 23: Porovnání průměrných hodnot výtěžností – telecí sérum ..................................... 53 Obrázek 24: Porovnání zhodnocení matričních efektů – slepičí sérum..................................... 55 Obrázek 25: Porovnání průměrných hodnot výtěžností – slepičí sérum ................................... 55 Obrázek 26: Porovnání zhodnocení matričních efektů – lidské sérum...................................... 57 Obrázek 27: Porovnání průměrných hodnot výtěžností – lidské sérum .................................... 57 Obrázek 28: LC-MS chromatogram estrogenů hovězího séra ................................................... 59 Obrázek 29: Kalibrační závislost pro E1 při použití IS EE2-D – ovčí sérum ........................... 70 Obrázek 30: Kalibrační závislost pro alpha E2 při použití IS EE2-D – ovčí sérum ................. 70 Obrázek 31: Kalibrační závislost pro beta E2 při použití IS EE2-D – ovčí sérum ................... 71 Obrázek 32: Kalibrační závislost pro E3 při použití IS EE2-D – ovčí sérum ........................... 71 Obrázek 33: Kalibrační závislost pro EE2 při použití IS EE2-D – ovčí sérum ........................ 71 Obrázek 34: Kalibrační závislost pro E1 při použití IS EE2-D – koňské sérum ...................... 72 Obrázek 35: Kalibrační závislost pro alpha E2 při použití IS EE2-D – koňské sérum ............ 72 Obrázek 36: Kalibrační závislost pro beta E2 při použití IS EE2-D – koňské sérum .............. 72 68

Obrázek 37: Kalibrační závislost pro E3 při použití IS EE2-D – koňské sérum ...................... 73 Obrázek 38: Kalibrační závislost pro EE2 při použití IS EE2-D – koňské sérum .................... 73 Obrázek 39: Kalibrační závislost pro E1 při použití IS EE2-D – telecí sérum ......................... 73 Obrázek 40: Kalibrační závislost pro alpha E2 při použití IS EE2-D – telecí sérum ............... 74 Obrázek 41: Kalibrační závislost pro beta E2 při použití IS EE2-D – telecí sérum ................. 74 Obrázek 42: Kalibrační závislost pro E3 při použití IS EE2-D – telecí sérum ......................... 74 Obrázek 43: Kalibrační závislost pro EE2 při použití IS EE2-D – telecí sérum ...................... 75 Obrázek 44: Kalibrační závislost pro E1 při použití IS EE2-D – slepičí sérum ....................... 75 Obrázek 45: Kalibrační závislost pro alpha E2 při použití IS EE2-D – slepičí sérum ............. 75 Obrázek 46: Kalibrační závislost pro alpha E2 při použití IS EE2-D – slepičí sérum ............. 76 Obrázek 47: Kalibrační závislost pro E3 při použití IS EE2-D – slepičí sérum ....................... 76 Obrázek 48: Kalibrační závislost pro EE2 při použití IS EE2-D – slepičí sérum..................... 76 Obrázek 49: Kalibrační závislost pro E1 při použití IS EE2-D – lidské sérum ........................ 77 Obrázek 50: Kalibrační závislost pro alpha E2 při použití IS EE2-D – lidské sérum .............. 77 Obrázek 51: Kalibrační závislost pro beta E2 při použití IS EE2-D – lidské sérum ................ 77 Obrázek 52: Kalibrační závislost pro E3 při použití IS EE2-D – lidské sérum ........................ 78 Obrázek 53: Kalibrační závislost pro alpha EE2 při použití IS EE2-D – lidské sérum ........... 78

69

VIII.

Přílohová část

Obrázek 29: Kalibrační závislost pro E1 při použití IS EE2-D – ovčí sérum

Plocha píku estrogenu/plocha píku IS EE2-D

E1 - ovčí sérum 6 1. y = 0,0057x + 0,396 R² = 0,9778

5

4

2. y = 0,0068x + 0,2823 R² = 0,9643

3

1.série 2.série

2

3.série

3. y = 0,0097x + 0,1534 R² = 0,9746

1

0 0

80

160

240

320

400

480

560

Koncentrace estrogenu

Obrázek 30: Kalibrační závislost pro alpha E2 při použití IS EE2-D – ovčí sérum


alpha E2 - ovčí sérum 5 1. y = 0,0052x + 0,3102 R² = 0,9481 2. y = 0,0058x + 0,3037 R² = 0,8762

4 3

1.série

2

2.série

1

3. y = 0,0087x + 0,151 R² = 0,97

0 0

80

160

240

320

400


70

480

560

3.série

Obrázek 31: Kalibrační závislost pro beta E2 při použití IS EE2-D – ovčí sérum


beta E2 - ovčí sérum 5 4

1. y = 0,0055x + 0,2895 R² = 0,9437

3

2. y = 0,0065x + 0,1009 R² = 0,9882 1.série

2

2.série

1

3. y = 0,0089x + 0,1262 R² = 0,9883

3.série

0 0

80

160

240

320

400

480

560


Obrázek 32: Kalibrační závislost pro E3 při použití IS EE2-D – ovčí sérum


E3 - ovčí sérum 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0

1. y = 0,0032x + 0,5505 R² = 0,9121 2. y = 0,0048x + 0,0908 R² = 0,9676

1.série 2.série 3. y = 0,007x + 0,1451 R² = 0,9819

0

80

160

240

320

400

480

3.série

560


Obrázek 33: Kalibrační závislost pro EE2 při použití IS EE2-D – ovčí sérum


EE2 - ovčí sérum 4

3

1. y = 0,0036x + 0,4076 R² = 0,8781

2

2. y = 0,005x + 0,2979 R² = 0,9518

1.série 2.série

1

3. y = 0,0068x + 0,1676 R² = 0,9564

0 0

80

160

240

320

400

480


71

560

3.série

Obrázek 34: Kalibrační závislost pro E1 při použití IS EE2-D – koňské sérum


E1 - koňské sérum 5

1. y = 0,0063x + 0,5814 R² = 0,825

4 3

2. y = 0,0081x - 0,0074 R² = 0,9186

1.série

2

2.série

1

3. y = 0,0091x - 0,051 R² = 0,9924

0 0

80

160

240

320

400

480

3.série

560


Obrázek 35: Kalibrační závislost pro alpha E2 při použití IS EE2-D – koňské sérum


alpha E2 - koňské sérum 5

1. y = 0,0073x + 0,1748 R² = 0,9167 2. y = 0,0067x + 0,174 R² = 0,9024

4

3

1.série

2

2.série 3. y = 0,0084x + 0,1183 R² = 0,9756

1 0 0

80

160

240

320

400

480

3.série

560


Obrázek 36: Kalibrační závislost pro beta E2 při použití IS EE2-D – koňské sérum


beta E2 - koňské sérum 5

1. y = 0,0062x + 0,5801 R² = 0,8159

4

2. y = 0,0069x + 0,1886 R² = 0,9605

3

1.série

2

2.série

1

3. y = 0,0087x - 0,0371 R² = 0,978

0 0

80

160

240

320

400

480


72

560

3.série

Obrázek 37: Kalibrační závislost pro E3 při použití IS EE2-D – koňské sérum


E3 - koňské sérum 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0

1. y = 0,0053x + 0,1093 R² = 0,7809 2. y = 0,0046x + 0,1278 R² = 0,9466

1.série 2.série 3. y = 0,0057x + 0,0524 R² = 0,9834

0

80

160

240

320

400

480

3.série

560


Obrázek 38: Kalibrační závislost pro EE2 při použití IS EE2-D – koňské sérum


EE2 - koňské sérum 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0

1. y = 0,0054x + 0,1839 R² = 0,8408 2. y = 0,0053x + 0,2281 R² = 0,887

1.série 2.série 3. y = 0,0063x - 0,0158 R² = 0,9937

0

80

160

240

320

400

480

3.série

560


Obrázek 39: Kalibrační závislost pro E1 při použití IS EE2-D – telecí sérum


E1 - telecí sérum 4

1. y = 0,007x + 0,0812 R² = 0,8816 2. y = 0,0057x + 0,2099 R² = 0,9318

3 2

1.série 2.série

1

3. y = 0,0057x + 0,0379 R² = 0,9744

0 0

80

160

240

320

400

480


73

560

3.série

Obrázek 40: Kalibrační závislost pro alpha E2 při použití IS EE2-D – telecí sérum


alpha E2 - telecí sérum 3,5

1. y = 0,0056x + 0,1331 R² = 0,8241

3 2,5

2. y = 0,0049x + 0,0208 R² = 0,9708

2

1.série

1,5

2.série

1 3. y = 0,0046x - 0,0075 R² = 0,9904

0,5 0 0

80

160

240

320

400

480

3.série

560


Obrázek 41: Kalibrační závislost pro beta E2 při použití IS EE2-D – telecí sérum


beta E2 - telecí sérum 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0

1. y = 0,0061x + 0,0153 R² = 0,9249 2. y = 0,0047x + 0,3869 R² = 0,7524

1.série 2.série 3. y = 0,0048x + 0,0093 R² = 0,9824

0

80

160

240

320

400

480

3.série

560


Obrázek 42: Kalibrační závislost pro E3 při použití IS EE2-D – telecí sérum


E3 - telecí sérum 2

1,5

1. y = 0,0036x - 0,0293 R² = 0,9233

1

2. y = 0,0029x + 0,0636 R² = 0,9478

1.série 2.série

0,5

3. y = 0,0035x - 0,0327 R² = 0,9889

0

0

80

160

240

320

400


74

480

560

3.série

Obrázek 43: Kalibrační závislost pro EE2 při použití IS EE2-D – telecí sérum


EE2 - telecí sérum 3

1. y = 0,0055x - 0,0155 R² = 0,8807 2. y = 0,0043x + 0,1637 R² = 0,9349

2,5

2 1,5

1.série

1

2.série 3. y = 0,0043x - 0,0116 R² = 0,9699

0,5 0 0

80

160

240

320

400

480

3.série

560


Obrázek 44: Kalibrační závislost pro E1 při použití IS EE2-D – slepičí sérum


E1 - slepičí sérum 5

1. y = 0,0053x + 0,4568 R² = 0,5122 2. y = 0,0089x - 0,7015 R² = 0,8573

4

3

1.série

2

2.série

1

3. y = 0,0095x - 0,5485 R² = 0,9285

0 0

80

160

240

320

400

480

3.série

560


Obrázek 45: Kalibrační závislost pro alpha E2 při použití IS EE2-D – slepičí sérum


alpha E2 - slepičí sérum 6

1. y = 0,007x + 0,5059 R² = 0,8502

5 4

2. y = 0,0106x + 0,4907 R² = 0,9646

3

1.série

2

2.série 3. y = 0,0109x - 0,3886 R² = 0,9912

1 0 0

80

160

240

320

400

480


75

560

3.série

Obrázek 46: Kalibrační závislost pro alpha E2 při použití IS EE2-D – slepičí sérum


beta E2 - slepičí sérum 5

1. y = 0,0099x - 0,1565 R² = 0,9392 2. y = 0,0073x + 0,4372 R² = 0,924

4 3

1.série

2

2.série

1

3. y = 0,0096x - 0,1585 R² = 0,9859

0 0

80

160

240

320

400

480

3.série

560


Obrázek 47: Kalibrační závislost pro E3 při použití IS EE2-D – slepičí sérum


E3 - slepičí sérum 3

1. y = 0,0046x + 0,1187 R² = 0,8949 2. y = 0,0038x + 0,318 R² = 0,9373

2,5 2 1,5

1.série

1

2.série 3. y = 0,0052x - 0,0779 R² = 0,9869

0,5 0 0

80

160

240

320

400

480

3.série

560


Obrázek 48: Kalibrační závislost pro EE2 při použití IS EE2-D – slepičí sérum


EE2 - slepičí sérum 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0

1. y = 0,0049x + 0,2578 R² = 0,9527 2. y = 0,0046x + 0,3362 R² = 0,9671

1.série 2.série 3. y = 0,0063x - 0,1079 R² = 0,9823

0

80

160

240

320

400


76

480

560

3.série

Obrázek 49: Kalibrační závislost pro E1 při použití IS EE2-D – lidské sérum


E1 - lidské sérum 6

1. y = 0,0118x - 0,4633 R² = 0,9231

5

4

2. y = 0,0057x + 0,3512 R² = 0,7329

3

1.série

2

2.série 3. y = 0,0073x + 0,153 R² = 0,9609

1 0 0

80

160

240

320

400

480

3.série

560


Obrázek 50: Kalibrační závislost pro alpha E2 při použití IS EE2-D – lidské sérum


alpha E2 - lidské sérum 4

1. y = 0,0069x - 0,0377 R² = 0,9799 2. y = 0,0053x + 0,1033 R² = 0,9156

3 2

1.série 2.série

1

3. y = 0,0074x - 0,1222 R² = 0,9907

0 0

80

160

240

320

400

480

3.série

560


Obrázek 51: Kalibrační závislost pro beta E2 při použití IS EE2-D – lidské sérum


beta E2 - lidské sérum 5 1. y = 0,0085x - 0,0867 R² = 0,9248 2. y = 0,0058x - 0,0262 R² = 0,843

4 3

1.série

2

2.série

1

3. y = 0,007x + 0,1126 R² = 0,9892

0 0

80

160

240

320

400

480


77

560

3.série

Obrázek 52: Kalibrační závislost pro E3 při použití IS EE2-D – lidské sérum


E3 - lidské sérum 2,5

1. y = 0,0041x - 0,0265 R² = 0,829 2. y = 0,0037x + 0,2885 R² = 0,7462

2 1,5

1.série

1

2.série

0,5

3. y = 0,0034x + 0,105 R² = 0,9964

0 0

80

160

240

320

400

480

3.série

560


Obrázek 53: Kalibrační závislost pro alpha EE2 při použití IS EE2-D – lidské sérum


EE2 - lidské sérum 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0

1. y = 0,0053x + 0,1588 R² = 0,9568 2. y = 0,0052x + 0,5272 R² = 0,9199

1.série 2.série 3. y = 0,0063x + 0,0293 R² = 0,9903

0

80

160

240

320

400


78

480

560

3.série

MASARYKOVA UNIVERZITA ANALYTICKÉ METODY PRO STUDIUM OBSAHU ESTROGENŮ V KREVNÍ PLAZMĚ

Recommend Documents