37
Lampiran 1. Prosedur Analisis Kadar Protein Tahap Oksidasi 1. Sampel ditimbang sebanyak 0.5 gram dan dimasukkan ke dalam labu Kjeldahl. 2. Katalis (K2SO4+CuSo4.5H2O) dengan rasio 9:1 ditimbang sebanyak 3 gram dan dimasukkan ke dalam labu Kjeldahl. 3. 10 ml H2SO4 pekat ditambahkan ke dalam labu Kjeldahl dan kemudian labu tersebut dipanaskan dalam rak oksidasi/digestion pada suhu 400oC selama 3-4 jam sampai terjadi perubahan warna cairan dalam labu menjadi hijau bening. 4. Larutan didinginkan lalu ditambahkan air destilasi 100 ml. Kemudian larutan dimasukkan ke dalam labu takar dan diencerkan dengan akuades sampai volume larutan mencapai 100 ml. Larutan sampel siap didestilasi. Tahap Destilasi 1. Beberapa tetes H2SO4 dimsukkan ke dalam labu, sebelumnya labu diisi setengahnya dengan akuades untuk menghindari kontaminasi oleh ammonia lingkungan. Kemudian didihkan selama 10 menit. 2. Erlenmeyer diisi 10 ml H2SO4 0.05 N dan ditambahkan 2 tetes indicator methyl red diletakkan di bawah pipa pembuangan kondensor dengan cara dimiringkan sehingga ujung pipa tenggelam dalam cairan. 3. 5 ml larutan sampel dimasukkan ke dalam tabung destilasi melalui corong yang kemudian dibilas dengan akuades dan ditambahkan 10 ml NaOH 30% lalu dimasukkan melalui corong tersebut dan ditutup. 4. Campuran alkaline dalam labu destilasi disuling menjadi uap air selama 10 menit terjadi pengembunan pada kondensor. 5. Labu erlenmeyer diturunkan hingga ujung pipa kondensor berada di leher labu, diatas permukaan larutan. Kondensor dibilas dengan akuades selama 1-2 menit. Tahap Titrasi 1. Larutan hasil destilasi ditritasi dengan larutan NaOH 0.05 N. 2. Volume hasil titrasi dicatat. 3. Prosedur yang sama juga dilakukan pada blanko.
38
Lanjutan Lampiran 1. Prosedur Analisis Kadar Protein Kadar Protein (%) = 0.0007 * x (Vb – Vs) x 6.25 ** x 20 x 100% S Keterangan : Vb = Volume hasil titrasi blanko (ml) Vs = Volume hasil titrasi sampel (ml) S = Bobot sampel (gram) * = Setiap ml 0.05 NaOH ekivalen dengan 0.0007 gram Nitrogen ** = Faktor Nitrogen
39
Lampiran 2. Prosedur Analisis Kadar Lemak Metode ekstraksi Soxhlet 1. Labu ekstraksi dipanaskan dalam oven pada suhu 110o dalam waktu 1 jam. Kemudian didiinginkan dalam desikator selama 30 menit dan ditimbang bobot labu tersebut (X1) 2. Sampel ditimbang sebanyak 3-5 gram (A), dan dimasukkan ke dalam selongsong tabung filter dan dimasukkan ke dalam soxhlet dan pemberat diletakkan di atasnya. 3. N-hexan 100-150 ml dimasukkan ke dalam soxhlet sampai selongsong terendam dan sisa N-hexan dimasukkan ke dalam labu. 4. Labu yang telah dihubungkan dengan soxhlet dipanaskan di atas water bath sampai cairan yang merendam sampel dalam soxhlet berwarna bening. 5. Labu dilepaskan dan tetap dipanaskan hingga N-hexan menguap. 6. Labu dan lemak yang tersisa dipanakan dalam oven selama 15-60 menit, kemudian didinginkan dalam desikator selama 15-30 menit dan ditimbang (X2) Metode Folch 1. Labu silinder dioven terlebih dahulu pada suhu 110oC selama 1 jam, didinginkan dalam desikaotr selama 30 menit kemudian ditimbang (X1). 2. Sampel ditimbang sebanyak 2-3 gram (A) dan dimasukkan ke dalam gelas homogenize dan ditambahkan larutan kloroform / methanol (20xA) , sebagian disisakan untuk membilas pada saat penyaringan. 3. Sampel dihomogenizer selama 5 menit setelah itu disraing dengan vacuum pump. 4. Sampel yang telah disaring tersebut dimasukkan dalamlabu pemisah yang telah diberi larutan MgCl2 0.03 N(0.2xC), kemudian dikocok dengan kuat minimal selama 1 menit kemudian ditutup dengan aluminium foil dan didiamkan selama 1 malam. 5. Lapisan bawa yang terdapat dalam labu pemisah disaring ke dalam labu silinder kemudian dievaporator sampai kering. Sisa kloroform / methanol yang terdpat dalam labu ditiup dengan menggunakan vacuum setelah itu ditimbang (X2) Kadar Lemak (%) = X2 –X1 x 100% A
40
Lampiran 3. Prosedur Analisis Kadar Air 1. Cawan dipanaskan dalam oven pada suhu 100oC selama 1 jam dan kemudian dimasukkan dalam dessikator selama 30 menit dan ditimbang (X1) 2. Bahan ditimbang 2-3 gram (A) 3. Cawan dan bahan dipansakan dalam oven pada suhu 110oC selama 4 jam kemudian dimasukkan dalam desikator selam 30 menit dan ditimbang (X2) Kadar Air (%) = (X1+A)-X2 x 100% A
41
Lampiran 4. Prosedur Analisis Kadar Abu 1. Cawan dipanaskan dalam oven pada suhu 100oC selama 1 jam dan kemudian dimasukkan dalam desikator selama 30 menit dan ditimbang (X1) 2. Bahan ditimbang 2-3 gram (A) 3. Cawan dan bahan dipansakan dalam tanur pada suhu 600oC sampai mnejadi abu kemudian dimasukkan dalam desikator selam 30 menit dan ditimbang (X2) Kadar Abu (%) = X2 –X1 x 100%
42
Lampiran 5. Prosedur Analisis Kadar Serat Kasar 1. Kertas filter dipanaskan dalam oven selama 1 jam pada suhu 110oC setelah itu didinginkan dalam desikator selama 15 menit dan ditimbang (X1) 2. Sampel ditimbang sebnayak 0.5 gram (A) dimasukkan ke dalam Erlenmeyer 250 ml 3. H2SO4 0.3 N sebanyak 50 ml ditambahkan ke dalam Erlenmeyer kemudian dipanaskan di atas pembakar Bunsen selama 30 menit. Setelah itu NaOH 1.5 N sebanyak 25 ml ditambahkan ke dalam Erlenmeyer dan dipanskan kembali selama 30 menit. 4. Larutan dan bahan yang telah dipanaskan kemudian disraing dalam corong Buchner dan dihubungkan pada vacuum pump untuk mempercepat filtrasi. 5. Larutan dan bahan yang ada pada corong Buchner kemudaian dibilas secara berturut-turut dengan 50 ml air panas, 50 ml H2SO4 0.3 N, 50 ml air panas, dan 25 ml acetone. 6. Kertas saring dan isinya dimasukkan dalam cawan porselin, lalu dipanaskan dalam oven 105-110oC selama 1 jam kemudian didinginkan dalam desikator 515 menit dan ditimbang (X2). 7. Setelah itu dipanaskan dalam tanur 600oC hingga berwarna putih atau menjadi abu (± 4 jam). Kemudian dimasukkan dalam oven 105-110oC selama 15 menit, didinginkan dalam desikator selama 5-15 menit dan ditimbang (X3). Kadar Serat Kasar (%) = (X2 – X1 – X3) x 100% A
43
Lampiran 6. Metode Uji Aktifitas Enzim Aktifitas enzim selulase (Ghosse,1987) Penentuan nilai aktifitas enzim selulase dilakukan dengan pencampuran enzim sebanyak 0,5 ml dengan kertas saring 50 mg, buffer sitrat phosphate pH 4,8; 0,005 M sebanyak 1 ml. Selanjutnya dilakukan inkubasi pada suhu 50˚C selama 1 jam. Reaksi dihentikan dengan penambahan DNS (3,5 dinitro salicilyc acid) sebanyak 3 ml. Kemudian dipanaskan dalam air mendidih selama 5 menit. Setelah dingin disentrifugasi dengan kecepatan 3.000 rpm selama 15 menit. Selanjutnya dapat dilakuka pengukuran gula pereduksi yang dibebaskan (reducing sugar) menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 575 nm. Satu unit aktifitas enzim didefinisikan sebagai jumlah enzim yang menghasilkan 1µmol glukosa per menit. Uji aktifitas enzim amylase (Bergmeyer dan Grassi, 1983) Penentuan nilai aktifitas enzim amylase dilakukan dengan pencampuran enzim sebanyak 1 ml dengan 1% pati dalam buffer sitrat 0,005 M pH 5,7 sebanyak 1 ml. Selanjutnya dilakukan inkubasi pada suhu 37˚C selama 30 menit. Reaksi dihentikan dengan penambahan DNS (3,5 dinitro salicilyc acid) sebanyak 3 ml. Kemudian dipanaskan dalam air mendidih selama 5 menit. Setelah dingin disentrifugasi dengan kecepatan 3.000 rpm selama 15 menit. Selanjutnya dapat dilakuka pengukuran gula pereduksi yang dibebaskan (reducing sugar) menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 575 nm. Satu unit aktifitas enzim didefinisikan sebagai jumlah enzim yang menghasilkan 1µmol glukosa per menit. Uji aktifitas enzim protease (Bergmeyer dan Grassi, 1983) Prinsip penetapan metode Bergmeyer dan Grassi ini didasarkan bahwa kasein akan dihidrolisis oleh protease menjadi peptide dan asam amino. Asam amino dipisahkan dari substrat yang tersisa dengan penambahan TCA, sedangkan protein yang tidak terhidrolisis akan mengendap dengan adanya TCA. Asam amino yang
44
telah diisolasi dapat langsung diukur absorobansinya pada panjang gelombang 280 nm diwarnai terlebih dahulu dengan pereaksi folin ciocalteau agar dapat dilakukan pembacaan pada sinar tampak. Materi dan prosedur penggujian :
Materi Buffer phosphate (0,05 M; pH 8,0) Substrat kasein (20 mg/ml, pH 8,0) Enzim dalam CaCb (20 mmol/l) Tirosin standar 5 mmol/l Akuades inkubasi pada suhu 37˚C selama 10 menit TCA (0,1 M) Akuades
Blanko (ml) 1,00 1,00 -
2,00 -
Standar (ml) 1,00 1,00 0,20
2,00 -
Sampel (ml) 1,00 1,00 0,20 -
2,00 0,20
Enzim dalam CaCl2 (2 mmol/l) 0,20 0,20 Diamkan pada suhu 37˚C selama 10 menit, kemudian sentrifugase 3.500 rpm selama 10 menit Filtrat
1,50
1,50
1,50
Na2CO3 (0,4 M) 5,00 5,00 5,00 Folin Ciocalteau 1,00 1,00 1,00 Diamkan pada suhu 37˚C selama 20 menit, kemudian dibaca absorbansinya pada panjang gelombang 578 Setiap sampel yang dihitung aktifitasnya memiliki 3 nilai absorbansi, yaitu absorbansi blanko, standard dan sampel. Satu unit aktifitas menyatakan jumlah enzim yang dapat menghasilkan produk satu mikro mol per menit (Bergmeyer et al ., 1983). Aktifitas protease dihitung dengan : OD sampel – OD blanko U.ml = OD standard – OD blanko Keterangan : U = aktifitas dalam international unit per menit; OD = absorbansi
45
Uji aktifitas enzim lipase (Tiez and Feedreck dalam Barlongan, 1990) Substrat lipase stabil (minyal zaitun) 1,5 ml ditambahkan 0,1 ml Tris’HCl 0,1M sebagai buffer dengan pH 8,0. Kemudian ditambahkan 1,0 ml ekstrak enzim. Campuran homogenkan dan di inkubasi selama 6 jam pada suhu 37˚C. Reaksi dihentikan dengan menambahkan 3 ml etil alcohol 95%. Titrasi sampel dengan NaOH 0,001 N dengan menggunakan trymophthalein 0,9% (w/v) dalam etanol sebagai indicator. Prosedur yang sama dilakukan pada blanko. Satu unit aktifitas lipase didefinisikan sebagai volume NaOH 0,005 N yang dibutuhkan untuk menetralisir asam lemak yang dilepaskan selama 6 jam inkubasi substrat, setelah dikoreksi dengan blanko.
46 Lampiran 7. Prosedur Analisis Kecernaan 1. Timbang 0,1- 0,2 gram sampel/bahan, masukkan ke dalam labu kjedahl 2. Tambahkan 5 ml nitrit acid pekat ke dalam labu 3. Panaskan dengan hati-hati selama 30 menit sampai volume larutan menjadi ± 1 ml 4. Setelah dingin, tambahkan 3 ml perchoric acid pekat ke dalam labu kemudian panaskan kembali 5. Setelah asap putih terlihat dan larutan berubah dari hijau menjadi kuning atau oranye, campuran dipanaskan selama ±10 menit 6. Dinginkan, lalu encerkan sampai volume 100 ml. Nilai absorban larutan ditentukan oleh spektrofotometer dengan panjang gelombang 350 nm (Takeuchi, 1988)
47
Lampiran 8. Hasil Analisis Kecernaan Bungkil Kelapa dan Kromuim (Cr2O3) dan Pakan dan Feses Ikan Mas (Cyprinus carpio)
Kecernaan
Kromium
Perlakuan K1 K2 K3 Rerata A1 A2 A3 Rerata B1 B2 B3 Rerata
Total 68.33 68.68 65.03 67.35 67.97 67.11 63.86 66.32 63.10 63.61 63.86 63.52
Protein 77.85 77.65 75.29 76.93 79.70 77.81 75.61 77.71 74.65 76.29 75.59 75.51
DE 5761.01 5671.01 5071.01 5501.01 5580.66 5475.81 5170.43 5408.97 5040.01 5020.01 4620.01 4893.34
Keterangan : K = Pakan Acuan A = Bungkil kelapa dengan penambahan enzim B = Bungkil kelapa tanpa penambahan enzim
Energi 72.43 71.03 71.03 71.50 70.45 69.50 68.85 69.60 64.17 64.72 65.52 64.80
Pakan 0.675 0.563 0.472 0.57 0.487 0.492 0.51 0.50 0.582 0.561 0.431 0.52
Feses 1.802 1.812 1.601 1.74 1.530 1.490 1.450 1.49 1.420 1.440 1.450 1.44
