LAMPIRAN
56
Lampiran 1. Prosedur Analisis Senyawa Aktif 1. Identifikasi Penentuan adanya Alkaloid a. 1 gram contoh digiling halus bersama-sama pasir sambil dibasahi 5 ml kloroform yang mengendung beberapa tetes amoniak (± 3 tetes). b. Ditambahkan lagi 5 ml kloroform dan beberapa tetes amoniak (± 5 tetes), kemudian disaring ke dalam tabung reaksi tertutup.
c. Ekstrak kloroform dalam tabung reaksi dikocok dengan 10 tetes H 2 SO 4 2 M, kemudian dipisahkan lapisan asamnya ke dalam tabung reaksi lain. d. Spot diteteskan pada spot plate dan ditambahkan 3 pereaksi Dragendorf, Mayer, dan Wagner yang akan menimbulkan warna berturut-turut: merah jingga, putih, dan coklat. 2. Identifikasi Adanya senyawa Flavonoid dan Senyawa Fenol Hidrokuinon a. 1 gram contoh ditambahkan methanol sampai semua sampel terendam dan dipanaskan. b. Larutan dipipet dan diteteskan pada 2 plat tetes masing-masing 5 tetes. Pada plet tetes pertama ditambahkan NaOH 10 %. c. Timbulnya warna merah menandakan adanya senyawa fenol hidrokuinon. Pada plat tetes yang kedua ditambahkan 1 tetes H 2 SO 4 pekat. Timbulnya warna merah menendakan adanya senyawa flavonooid. 3. Penentuan Adanya Triterpenoid/Steroid a. 1 gram contoh ditambahkan 12,5 ml etanol dan dipanaskan, lalu disaring. Filtrate diuapkan dan ditambahkan eter. b. Lapisan eter yang terbentuk dipipet dan diteteskan pada plat tetes, lalu ditambahkan pereaksi LB (3 tetes asetat anhidrat dan 1 tetes H 2 SO 4 pekat). c. Adanya triterpenoid ditandai dengan timbulnya warna merah dan ungu, sedangkan adanya steroid ditandai dengan timbulnya warna hijau. 4. Penentuan Flavonoid, Saponin, dan Tanin a. 1 gram sampel dimasukkan ke dalam gelas piala lalu ditambhakan 12 ml air panas dan dididihkan selama 5 menit. 3 ml larutan dimasukkan 57 ke dalam 2 tabung reaksi. b. Ke dalam tabung tabung reaksi pertama dimasukkan serbuk Mg dan 0,2 ml HCl pekat lalu ditambahkan amil alkohol.
Campuran dikocok dan
dibiarkan memisah. c. Adanya flavonoid ditandai ditandai adanya warna merah coklat pada lapisan amil alkohol. Pada tabung reaksi kedua dilakukan pengocokan secara vertical 10 detik dan dibiarkan 10 menit. Adanya saponin ditandai
dengan adanya busa yang stabil. Untuk tannin, sisa campuran dididihkan lagi 10 menit, lalu disaring. Filtrate ditambahkan beberapa ml larutan FeCl 3 1 %. Adanya tannin ditandai dengan adanya warna biru tua/hijau kehitaman.
58
Lampiran 2. Penetapan Besi (Fe) dan seng (Zn) dalam jamu galohgor dengan menggunakan AAS
Pereaksi
1. HCl 6 N, 3 N, dan 0,3 N 2. Lantanum klorida 10 % w/v 3. Aquades bebas ion 4. Kertas saring Whatman No. 541 yang telah dicuci dengan menggunakan HCl 3 N untuk menghilangkan tracemetal 5. Larutan stock standar, 1000 mg/L. Ditimbang sejumlah pereaksi “AR Grade” seperti yang tertera pada tabel 1. Garam dilarutkan dalam 25 ml HCl 3 N kemudian diencerkan dengan air. Tabel 1. Berat (gram) untuk membuat larutan standar logam Logam
Pereaksi
Berat pereaksi (g) per 250 ml larutan
Besi (Fe)
Fe 2 (SO 4 ) 3 (NH 4 ) 2 SO 4 .24H 2
2.158
O Seng (Zn)
ZnSO 4 .7H 2 O
1.100
6. Larutan standar Larutan stock standar diencerkan dengan air (jika persiapan sampel dilakukan dengan pengabuan basah) atau HCl 0,3 N (pengabuan kering) sampai konsentrasinya berada dalam kisaran kerja logam yang bersangkutan. Tabel 2. Kondisi yang direkomendasikan untuk analisis logam Unsur
Besi (Fe)
Panjang
Limit Deteksi
Kisaran kerja
gelombang (λ)
(µg logam ml)
(µg logam ml)
248.3
Seng (Zn) 213.9
0.03
0.05-5
0.004
0.1-2(1) 59
Peralatan 1. Spektrofotometer Absorbsi Atom (SAA) 2. Alat-alat gelas yang sebelumnya telah dicuci dengan HNO 3 encer. Cara Kerja 1. Ditimbang 5 gram sampel dan dimasukkan ke dalam labu kjehldahl, di dalam labu ditambahkan 10 ml H 2 SO 4 dan 10 ml HNO 3 dan batu didih.. kemudian dipanaskan perlahan-lahan sampai larutan berwarna gelap. 2. Campuran ditambahkan 1-2 ml HNO 3 , lalu pemanasan dilanjutkan sampai berwarna lebih gelap lagi. 3. Kemudian ditambahkan HNO 3 lalu dipanaskan kembali 5-10 menit sampai larutan tidak gelap lagi dan didinginkan. 4. Setelah itu ditambahkan 10 ml aquades dan dipanaskan sampai berasap, lalu larutan didinginkan dan ditambahkan 5 ml aquades, kemudian larutan dipanaskan kembali. 5. Larutan didinginkan dan diencerkan sampai volume tertentu. Larutan siap dibaca pada alat AAS.
60
Lampiran 3. Pemeriksaan gambaran darah lengkap
Peralatan
: Partikel Counter merk ERMA INC model PCE-210
Cara Kerja
:
1. Darah sebanyak 350 µl dipipet lalu dimasukan ke dalam tabung 2. Tabung tersebut dimasukkan ke dalam alat partikel counter. Maka akan keluar hasil pemeriksaan gambaran darah lengkap.
61
Lampiran 4. Prosedur Penetapan Zn Serum
2 ml sampel serum dilarutkan dalam aquabides dengan perbandingan 1:1, aquabides yang digunakan tidak mengandung seng. Baca pada alat AAS pada panjang gelombang 213 nm, dan deret standar yang dilarutkan dalam 10 % gliserol. Kadar seng (Zn) adalah hasil baca sampel dikali faktor pengenceran.
62
Lampiran 5. Prosedur Analisis Serum Ferritin
Metode
: ELISA (Enzime-linked immunoassays)
Reagen
: Antibodi (DAKO) Ferritin-1 dan Ferritin-2
Cara Kerja
:
1. Penyiapan plate dan antibody-1, yaitu stock antibody-1 2,6 µl diencerkan dengan coating buffer (0,01 mol/l phosphate buffer, 0,15 mol/l NaCl) sebanyak 12 ml.
larutan antibody tersebut dimasukkan sebanyak 100
µl/well dalam plate untuk diinkubasi semalam pada refrigerator. 2. Plate dicuci dengan washing buffer (0,01 mol/l phosphate buffer, 0,5 mol/l NaCl, 0,1 % Tween 20), diulang sebanyak 4 kali yang didiamkan di antara waktu tersebut masing-masing selama 3 menit. 3. Siapkan sampel serum, larutan standard an control. Serum diencerkan (1:10) dengan washing buffer. Larutan control dibuat dari 15 µl liquicheck control dengan 150 µl washing buffer (1:10). Proses yang sama dilakukan untuk larutan standar (level 1 sampai 5). Larutan serum, control dan standar masing-masing dimasukkan sebanyak 100 µl/well dalam plate yang ditutup dengan parafilm, kemudian diinkubasi selama 2 jam pada suhu kamar. 4. Plate dicuci ulang dengan washing buffer sebanyak 4 kali yang didiamkan di antara waktu tersebut masing-masing selama 3 menit. 5. Antibodi-2 dimasukkan lalu diencerkan sebanyak 1,5 µl dengan coating buffer 12 ml, dan diambil sebanyak 100 µl/well dimasukkan ke dalam plate dan ditutup dengan parafilm, kemudian diinkubasi selama 1 jam pada suhu kamar. 6. Plate dicuci dengan washing buffer sebanyak 4 kali yang didiamkan di antara waktu tersebut masing-masing selama 3 menit. 7. Ditimbang O-phenyledediamine (OP) 8 mg di dalam asam sitrat 12 ml.
63
8. Plate dikeringkan, setelah itu ditambahkan 5 µl H 2 O 2 30 % pada larutan OP. 63 9. 100 ml larutan OP dimasukkan, kemudian ditunggu sampai warna kuning
muncul 10. Dimasukkan larutan H 2 SO 4 sebanyak 150 µl/well sehingga terjadi perubahan warna menjadi merah muda. 11. Plate dibaca pada Multiscan Ascent dengan panjang gelombang 450 nm.
64
Lampiran 6. Pemeriksaan Kadar Retinol Serum Metode
: Ekstraksi
Bahan
:
1. Serum 2. odium Dodecyl Sulphate (SDS) 3. Alkohol 4. Butylated hidroxytoluene (BHT) Cara Kerja
:
1. Dimasukkan serum plasma 100 µl dan ditambahkan 100 µl SDS dan dicampur sampai homogen. 2. Ditambahkan internal standar sebanyak 200 µl dan dicampur beberapa sampel dalam tabung tertutup pada mixer vortex selama 1 menit. 3. Ditambahkan 1000 µl heptane yang mengandung 0,5 g/L BHT 4. Dicampur secara merata dalam tabung tertutup pada mixer vortex 3 menit. 5. Disentrifuge selama 10 menit pada 1000 rpm (2500 x g) pada suhu 10 oC. 6. Dipindahkan 700 µl pada tabung ukuran 100 x 17 mm dari lapisan heptane paling atas dan keringkan dengan dialiri cairan nitrogen pada suhu 40 oC. 7. Setelah semuanya kering, disusun kembali dengan fase aktif 100 µl yang mengandung 0,01 g/L BHT. 8. Dicampur dalam mixer vortex selama 15 detik. 9. Dimasukkan sampel ke dalam botol kecil yang hampa udara dan ditempatkan sampling dalam korosel untuk dianalisis. 10. Dianalisis selama 24 jam dan disimpan di dalam ruang gelap pada suhu 4 o
C sampai semua sampel siap dianalisis.
11. Dimasukkan dalam HPLC dengan cara diinjeksikan sampel secara terpisah sebanyak 50 µl dengan fase aktif 100 x 4,6 mm yang mengandung 0,01 g/L BHT pada kolom cartridge 3 µl secara urut. 12. Dideteksi retinol pada 325 nm dan 292 nm dan baca output data kromatografi.
65
Lampiran 7 Metode Pengukuran
Parameter Kadar zat besi jamu
Metode Pengukuran : Diukur dengan menggunakan Atomic Absorption Spectrofotometry (AAS)
Kadar seng jamu
:
Diukur dengan menggunakan Atomic Absorption Spectrofotometry (AAS)
Kadar β-karoten jamu
:
Diukur dengan menggunakan High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
Kadar retinol serum
:
Diukur dengan menggunakan High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
Kadar β-karoten serum
:
Diukur dengan menggunakan High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
Kadar feritin serum
:
Diukur dengan menggunakan metode ELISA (Enzime-linked immunoassays)
Kadar seng serum
:
Diukur dengan menggunakan Atomic Absorption Spectrofotometry (AAS)
Jumlah eritrosit
:
Dihitung dengan menggunakan hemocitometer Neubauer dan larutan Larutan Hayem
Jumlah leukosit
:
Dihitung dengan menggunakan hemocitometer Neubauer dan larutan Larutan Turk
Diferensial Leukosit
:
Diperoleh dengan cara menghitung jenis-jenis sel leukosit dan persentase masing-masing jenis pada preparat
66
ulas darah. :
Kadar hemoglobin
Dihitung dengan menggunakan metode cynomet-hemoglobin
:
Kadar hematokrit
Dihitung dengan mikrohematokrit menggunakan tabung hematokrit
Volume rataan sel darah : Dihitung dengan membagi kadar merah
(Mean
Corpuscular Volume =
hematokrit dengan jumlah sel darah merah dengan rumus sebagai berikut
MCV)
:
Rataan
Dihitung dengan membagi konsentrasi
konsentrasi
hemoglobin dengan hematokrit dengan rumus
hemoglobin
sebagai berikut:
dalam
sel
darah
merah
(Mean Corpuscular Haemoglobin Concentration = MCHC)
Pengamatan
:
Diamati dengan membuat histopat kemudian
histopatologi
dihitung jumlah neutrofil dan makrofag serta
kulit.
kolagen yang terbentuk
67
Lampiran 8 Hasil uji beda limfosit antar kelompok perlakuan pada pengamatan hari ke-3
Group Statistics klp Limfosit
N
Mean
Std. Deviation
Std. Error Mean
"sampel"
2
1.5000
.70711
.50000
"kontrol"
2
5.5000
.70711
.50000
Independent Samples Test Levene's Test for Equality of Variances
t-test for Equality of Means 95% Confidence Interval of the Difference
Mean F Limfosit
Equal variances assumed Equal variances not assumed
Sig. .
t .
df
Sig. (2-tailed) Difference
Std. Error Difference
Lower
Upper
-5.657
2
.030
-4.00000
.70711
-7.04243
-.95757
-5.657
2.000
.030
-4.00000
.70711
-7.04243
-.95757
68
Lampiran 9 Alat-alat yang digunakan dalam pembuatan jamu galohgor
Steamer
Quencher
Chopper
Drum Dryer
Blender
Ayakan
Lampiran 10 Kandang pemeliharan tikus
69
Lampiran 11
Penyekokan jamu dengan menggunakan sonde (a) dan langkah-langkah pengambilan darah tikus (b)
70
(a)
(b)
