Lampiran 1 Prosedur Rotofor
Kalibrasi Membran Ion Membran ion terdiri dari membran kation yang berkorelasi dengan elektrolit H3PO4 0,1 N terpasang pada elektroda anoda sebagai pembawa ion positif, sedangkan membran anion berkorelasi dengan elektrolit NaOH 0,1 N terpasang pada elektroda katoda sebagai pembawa ion negatif. Membran ion tersebut sebelum digunakan harus direndam larutan elektrolit selama satu malam.
Pre-running Condition Pemanasan yang berlebihan dapat menyebabkan denaturasi protein dan merusak Rotor Chamber. Sebelum dan selama proses pemusatan berlangsung, mesin pendingin (cooler inflow) harus diaktifkan untuk mensirkulasikan air dengan suhu yang telah diatur pada 4 °C. Pengaturan suhu sebaiknya dilakukan 10-15 menit sebelum pemusatan untuk mengadaptasi alat sampai mencapai ekulibrium suhu dalam chamber. Lubang posterior pada Rotor kemudian diselotip untuk mencegah kebocoran selama pemasukan sampel. Sampel yang telah ditambahkan dengan 2% amfolit kemudian dimasukkan ke dalam lubang-lubang anterior pada Rotor dengan menggunakan syringe 15 ml, dan lubang anterior tersebut kemudian diselotip untuk mencegah kebocoran selama proses pemusatan berlangsung. Selama pemasukan sampel, harus diperhatikan kemungkinan timbulnya gelembung udara pada Rotor karena gelembung udara dapat menyebabkan lonjakan voltase selama proses sehingga sistem akan mati (safety shutdown).
Running Proses pemusatan menggunakan energi listrik dengan voltase tinggi, sehingga selama proses pemusatan harus selalu dipastikan tutup chamber terpasang agar voltase tidak terekspos ke luar dan bersifat membahayakan pemakai alat. Proses pemusatan akan berlangsung ketika tombol Rotor diatur pada kondisi ”RUN” dengan terminal Rotor tersambung dengan sumber listrik.
Daya yang digunakan pada Standard Rotofor Chamber selama proses adalah sebesar 15 Watt dan diatur konstan, sehingga penambahan kuat arus (mA) dan voltase (V) dapat disinkronisasi. Proses pemusatan umumnya berlangsung selama 3-5 jam, dengan maksimal 6 jam. Apabila pemusatan berlangsung lebih dari 6 jam, maka akan merusak gradien pH yang terbentuk.
Post-running Condition Prosedur untuk mengoleksi fraksi dimulai dengan pemasangan rak koleksi pada Harvesting Chamber. Rak kolekksi kemudian diisi dengan 20 tabung kultur (12 x 75 mm). Setelah pemasangan selesai, selanjutnya ke dalam terminal chamber, dihubungkan selang yang tersambung pada mesin vakum dengan tekanan 10-50 mmHg. Setelah proses pemusatan selesai, alat kemudian di set untuk posisi panen dengan menekan tombol ”HARVEST” pada Rotor Chamber. Alat akan memposisikan ke dalam kondisi panen, selanjutnya pin port untuk panen yang tersambung dengan Harvesting Chamber ditusukkan pada bagian lubang posterior Rotor, dan proses pemanenan akan berlangsung ketika mesin vakum dinyalakan. Sampel akan masuk ke dalam masing-masing tabung koleksi yang telah terpisah berdasarkan titik isolistriknya. Fraksi yang telah dikoleksi tersebut kemudian akan di analisa gradien pemisahannya dengan cara pengujian pH terhadap masing-masing fraksi. Hasil pemisahan yang lebih baik akan didapatkan apabila dilakukan refraksinasi terhadap fraksi yang dikoleksi dengan menggunakan Mini Rotofor Chamber. Pengujian terhadap kandungan protein di dalam fraksi dapat dilakukan dengan elektroforesis SDS-PAGE, metode dialisa, presipitasi garam dengan Ammonium Sulfat, dan teknik kromatografi.
Lampiran 2 Persiapan Running SDS-PAGE
Pembuatan larutan buffer Larutan buffer yang digunakan dalam proses elektroforesis adalah tris HCl 1,5 M pH 8,8; tris HCl 0,5 M pH 6,8; dan running buffer. Tris HCl 1,5 M pH 8,8 dibuat dengan mencampur tris base 54,45 gr dan aquadest 150 ml. Setelah homogen, pH-nya diatur hingga mencapai 8,8 dengan penambahan NaOH atau HCl dan selanjutnya ditambah aquades sampai volumenya 300 ml. Tris HCl 0,5 M pH 6,8 dibuat dengan campuran tris base sebanyak 6 gr, dan aquades 60 ml yang jika telah homogen, maka pH-nya diatur hingga mencapai 6,8 dengan penambahan NaOH atau HCl. Kemudian aquades ditambahkan sampai volumenya 100 ml. Langkah pertama yang dilakukan untuk pembuatan running buffer adalah pembuatan stock buffer. Stock buffer dibuat dengan campuran tris base 1,5 gr; glisin 7,2 gr; dan SDS 0,5 gr. Setelah itu, campuran dihomogenkan dan untuk membuat running buffer 10x yang siap dipakai, maka 100 ml stock buffer ditambah dengan 400 ml aquades. Larutan tersebut kemudian diatur pH-nya dengan menambah NaOH atau HCl sampai pH mencapai 8,3.
Pembuatan gel elektroforesis (SDS-PAGE) Gel untuk elektroforesis terdiri dari dua yaitu separating gel dan stacking gel. Separating gel dibuat dengan mencampurkan 4 ml poliakrilamid; 3,35 ml aquades; 2,5 ml tris HCl pH 8,6; 0,1 ml SDS 10%; 5 µl TEMED dan 50 µl amonium persulfat 10%. Semua bahan tersebut dihomogenkan dalam gelas piala, kemudian dimasukkan sedikit demi sedikit ke dalam lempeng kaca pembentuk gel sampai memenuhi tiga perempat lempeng kaca tersebut. Separating gel dibuat terlebih dahulu dibandingkan stacking gel. Setelah separating gel mulai memadat, kemudian stacking gel dimasukkan dan sisir untuk membuat sumur dipasang. Selanjutnya dibiarkan beberapa lama hingga gel memadat. Stacking gel dibuat dengan campuran 0,65 ml poliakrilamid; 3,05 ml aquades; 1,25 ml tris HCl pH 6,8; 50 µl SDS 10%; 5 µl TEMED dan 25 µl amonium persulfat 10%. Apabila gel telah memadat, maka sisir dilepas dan lempeng kaca dimasukkan ke dalam chamber alat elektroforesis.
Proses running SDS-PAGE Chamber yang telah dipasang lempeng kaca diisi dengan running buffer 10X sampai kira-kira bagian bawah gel terendam minimal setinggi 1 cm. Bagian atas chamber juga diisi dengan running buffer 10X. Setelah itu, sampel dimasukkan ke dalam masing-masing sumur gel. Sampel tersebut terdiri dari 30 µl loading buffer dan 15 µl supernatan. Chamber ditutup dan kabel dipasang, kemudian alat diatur dengan kuat arus listrik 35 mA dan tegangan sebesar 110 V, serta waktu 180 menit. Setelah selesai, gel dilepas dari lempeng kaca secara perlahan agar tidak rusak dan gel diwarnai dengan pewarnaan coomasie brilliant blue R.
Pewarnaan silver untuk SDS-PAGE Larutan pewarna harus dibuat segar tidak lebih dari 24 jam agar memberikan hasil terbaik. Proses pewarnaan meliputi tahapan sebagai berikut: a. Proses fiksasi dilakukan selama 30 menit. Larutan fiksasi dibuat dengan mencampurkan 100 ml etanol absolute dengan 25 ml asam asetat glasial, lalu ditambah aquades hingga volume mencapai 250 ml. b. Proses sensitisasi dilakukan selama 30 menit sambil digoyangkan secara perlahan-lahan. Cara membuat larutan ini adalah mencampur 75 ml etanol absolute dengan 1,25 ml glutardialdehid, 10 ml sodium tiosulfat, dan
10 ml sodium asetat, lalu ditambah aquades hingga volume
mencapai 250 ml. c. Gel dicuci dengan aquades selama 5 menit dengan 3 kali pengulangan. d. Proses pewarnaan dilakukan selama 20 menit sambil menggoyangkan wadahnya secara perlahan-lahan. Pembuatannya adalah mencampur 25 ml larutan silver nitrat dengan 0,1 ml formaldehid, lalu aquades ditambahkan hingga volume mencapai 250 ml. e. Gel dicuci kembali dengan aquades selama 1 menit sebanyak 2 kali pengulangan. f.
Proses developing dilakukan selama 2 menit, hingga larutan developing tampak berwarna coklat. Proses ini menggunakan campuran sodium karbonat dengan 0,05 ml formaldehid, lalu ditambah dengan aquades hingga volume mencapai 250 ml. Campuran dikocok secara perlahan hingga bening.
g. Proses stopping selama 10 menit menggunakan EDTA-Na2.2H2O (3.65 g) ditambah dengan aquades hingga volume mencapai 250 ml. h. Proses terakhir gel dicuci dengan aquades selama 5 menit dengan 3 kali pengulangan.
